KR20140039240A - 재조합 dsbc를 발현하는 세균 숙주 균주 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 그람 음성 세균 세포를 제공한다.

Description

재조합 DSBC를 발현하는 세균 숙주 균주{BACTERIAL HOST STRAIN EXPRESSING RECOMBINANT DSBC}
본 발명은 재조합 세균 숙주 균주, 특히 이. 콜라이(E. coli)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 세포에서 관심 있는 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
세균 세포, 예컨대, 이. 콜라이는 글리코실화를 필요로 하지 않는 재조합 단백질의 제조를 위해 통상적으로 사용된다. 특히 플라스미드를 통한 유전자 삽입을 허용하는 숙주 세포로서 세균 세포의 다재다능한 성질로 인해 재조합 단백질의 제조를 위해 세균 세포, 예컨대, 이. 콜라이를 사용하는 데에 있어서 많은 장점들이 있다. 이. 콜라이는 인간 인슐린을 비롯한 많은 재조합 단백질들의 제조를 위해 사용되고 있다.
재조합 단백질의 제조를 위한 세균 세포의 사용에 있어서 많은 `장점들이 있음에도 불구하고, 약한 세포 건강 표현형을 비롯한 상당한 한계점이 여전히 존재한다.
따라서, 재조합 단백질의 제조를 위한 유리한 수단을 제공하는 신규 세균 균주를 제공할 필요성이 여전히 존재한다.
체액 면역 및 세포 매개 면역의 발생은 활성화된 헬퍼(helper) T 세포와 항원 제시 세포("APC") 및 이펙터(effector) T 세포의 상호작용에 의해 조정된다. 헬퍼 T 세포의 활성화는 항원 특이적 T 세포 수용체("TCR")와 그의 동족 펩티드-MHC 리간드의 상호작용에 의존할 뿐만 아니라, 다수의 세포 부착 및 보조자극 분자들에 의한 배위 결합 및 활성화도 요구한다.
CD40에 결합하는 천연 수용체는 활성화 의존적인 일시적으로 제한된 방식으로 CD4+ T 세포의 표면 상에서 발현되는 핵심 보조자극 분자인 CD40 리간드(CD40-L = CD154)이다. 활성화 후, CD154는 CD8+ T 세포, 호중구, 비만 세포, 호산구, 천연 살해 세포, B 세포, 대식세포, 수지상 세포 및 혈소판의 하위세트 상에서도 발현된다. CD40은 B 세포 및 다른 항원 제시 세포를 비롯한 많은 유형의 세포들의 표면 상에서 항시적으로 넓게 발현된다.
CD154의 관여 후 CD40을 통한 신호전달은 CD40 수용체 보유 세포의 활성화 및 최적 CD4+ T 세포 프라이밍을 초래하는 일련의 세포내 사건들을 개시한다. 보다 구체적으로, CD154와 CD40의 결합은 항체 분비 세포 및 기억 B 세포로의 B 세포의 분화를 촉진한다.
체액 면역 반응 및 세포 매개 면역 반응 둘다의 기능을 조절하는 데에 있어서 CD154의 중추적인 역할은 치료적 면역조절을 위한 이 경로의 억제제의 사용에 있어서 큰 관심을 불러 일으켰다. 따라서, 항-CD154 항체는 다른 치료 단백질 또는 유전자 치료, 알레르겐, 자가면역 및 이식에 대한 매우 다양한 면역 반응 모델에서 유리한 것으로 밝혀져 있다(예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,474,771호 및 국제 특허출원 공보 제WO 2008/118356호 참조).
치료적 적용에 적합한, CD40과 CD154의 상호작용을 방해하는 다량의 항체 또는 항체 단편을 효율적으로 및 비용 효과적으로 제조할 필요성이 당분야에 존재한다.
발명의 요약
본 발명은
a) DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드; 및
b) CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 재조합 그람 음성 세균 세포를 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명은
a) DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하고;
b) 야생형 세포에 비해 감소된 Tsp 단백질 활성을 갖고;
c) CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것
을 특징으로 하는 재조합 그람 음성 세균 세포를 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 세포는 예를 들면, 감소된 활성 Tsp 표현형을 억제할 수 있는 야생형 spr 유전자 또는 돌연변이된 spr 유전자를 포함한다.
본 발명에 따른 그람 음성 세균 세포는 유리한 생장 및 단백질 생성 표현형을 보여준다.
보다 구체적으로, 본 발명은 히스티딘(His) 태그를 포함하는 DsbC 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 그람 음성 세균 세포를 제공하고, 이때 바람직하게는 상기 DsbC 폴리펩티드는 서열 his-his-his-his-his-his(6x 히스티딘)을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 서열번호 45 또는 서열번호 51에 따른 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 그람 음성 세균 세포를 제공한다.
본 발명은 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 발현 벡터도 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 히스티딘(His) 태그를 포함하는 DsbC 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공하고, 이때 바람직하게는 상기 DsbC 폴리펩티드는 서열 his-his-his-his-his-his(6x 히스티딘)을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 서열번호 45 또는 서열번호 51에 따른 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은
a) CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현하기에 효과적인 조건 하에서 배양 배지에서 상기 정의된 재조합 그람 음성 세균 세포를 배양하는 단계; 및
b) 상기 재조합 그람 음성 세균 세포의 주변세포질 및/또는 배양 배지로부터 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계
를 포함하는, CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법도 제공한다.
도 1은 본 발명의 실시양태에 따른 세포의 제조에 사용되는 벡터의 구축을 보여준다.
도 2는 시스테인 잔기를 통해 라이실-말레이미드 연결제(linker)에 공유연결된 변형된 Fab' 단편을 포함하는 화합물의 구조를 보여주고, 이때 라이실 잔기 상의 각각의 아미노 기는 그 자신에 공유부착된 메톡시 PEG 잔기를 갖고, 이때 n은 약 420 내지 450이다.
도 3은 항-CD154 Fab' 발현 균주 W3110의 생장 프로파일 및 항-CD154 Fab' 및 재조합 DsbC 발현 균주 MXE016(W3110 ΔTsp, spr C94A)의 생장 프로파일을 보여준다. 재조합 DsbC를 발현하는 MXE016 균주는 W3110 균주에 비해 초기 회분 배양기에서 개선된 생장 프로파일 및 생장 속도를 나타낸다는 것을 알 수 있다.
도 4는 대조군 균주 W3110에 비해 재조합 DsbC를 발현하는 MXE016 균주의 주변세포질(폐쇄된 부호) 및 상청액(개방된 부호)으로부터의 총 Fab' 수율(g/ℓ)을 보여준다. DsbC 발현 균주는 W3110에 비해 더 높은 주변세포질 Fab' 발현을 보여준다. 더욱이, DsbC를 발현하는 MXE016 균주는 균주 W3110에 비해 동등한 세포외 Fab' 수준을 보여준다.
도 5는 발효 추출의 역상 HPLC 분석의 결과를 보여준다. 항-CD154 Fab'를 발현하는 야생형 균주 W3110은 고도의 분해된 카파 경쇄(경쇄[LC] 단편)를 나타낸다. 대조적으로, 재조합 DsbC 및 항-CD154 Fab'를 발현하는 균주 MXE016(W3110 ΔTsp, spr C94A)은 Tsp 단백질분해효소 활성의 부재로 인해 임의의 경쇄 단편을 거의 나타내지 않는다.
도 6은 균주 W3110에서의 발효, 및 재조합 DsbC를 발현하는 균주 MXE016(W3110 ΔTsp, spr C94A)에서의 발효로부터 항-CD154 Fab'의 회수(g/ℓ)를 보여준다. 재조합 DsbC를 발현하는 균주 MXE016(W3110 ΔTsp, spr C94A)으로부터의 회수는 실질적으로 더 높고 실질적으로 더 적은 세포외 Fab'를 나타내는데, 이 성질은 세포외 Fab'가 세포 용해 위험의 마커이고 세포외 Fab가 주변세포질 Fab'를 위해 이용되는 과정과 동일한 과정의 이용을 통해 용이하게 회수되지 않기 때문에 유리하다.
도 7은 (a) 균주 W3110 세포 및 (b) 재조합 DsbC를 발현하는 균주 MXE016(W3110 ΔTsp, spr C94A) 세포(두 경우 (a) 및 (b)에서 항-CD154 Fab'(g/ℓ)를 발현함)의 생존력을 보여준다. 재조합 DsbC를 발현하는 균주 MXE016 세포(W3110 ΔTsp, spr C94A)는 보다 높은 생존력을 나타낸다.
도 8은 항-CD154 Fab'를 발현하는 MXE016 균주의 발효로부터의 총 Fab' 수율(g/ℓ)을 보여준다. 우측 막대는 재조합 DsbC를 추가로 발현하는 MXE016 균주를 나타낸다. 재조합 DsbC를 발현하는 MXE016 균주는 보다 높은 수율을 나타낸다.
도 9는 돌연변이된 ptr 유전자 내의 영역의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
도 10은 돌연변이된 Tsp 유전자 내의 영역의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
도 11은 돌연변이된 DegP 유전자 내의 영역의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 항-CD154 항체의 CDRH1의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 2는 항-CD154 항체의 CDRH2의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 3은 항-CD154 항체의 CDRH3의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 4는 항-CD154 항체의 CDRL1의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 5는 항-CD154 항체의 CDRL2의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 6은 항-CD154 항체의 CDRL3의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 7은 항-CD154 항체(342)의 가변 경쇄(gL4)의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 8은 항-CD154 항체(342)의 가변 경쇄(gL4)의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 9는 항-CD154 항체(342)의 가변 중쇄(gH1)의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 10은 항-CD154 항체(342)의 가변 중쇄(gH1)의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 11은 항-CD154 항체 단편의 경쇄(gL4)의 가변 및 불변 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 12는 항-CD154 항체 단편의 경쇄(gL4)의 가변 및 불변 영역을 포함하는 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 13은 힌지 영역에서 결실을 갖는 가변 및 CH1 영역을 포함하는 항-CD154 항체의 중쇄 단편의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 14는 힌지 영역에서 결실을 갖는 가변 및 CH1 영역을 포함하는 항-CD154 항체의 중쇄 단편의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 15는 가변, CH1 및 힌지 영역을 포함하는 항-CD154 항체의 중쇄 단편의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 16은 가변, CH1 및 힌지 영역을 포함하는 항-CD154 항체의 중쇄 단편의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 17은 신호 펩티드(아미노산 1 내지 22)를 포함하는 항-CD154 항체(342)의 카파 경쇄의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 18은 신호 펩티드(아미노산 1 내지 22)를 포함하는 항-CD154 항체(342)의 카파 경쇄의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 19는 비글리코실화된 IgG4 항-CD154 항체의 전체 중쇄의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 20은 비글리코실화된 IgG4 항-CD154 항체의 전체 중쇄의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 21은 gL4 및 gH1(힌지 없음)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 보여준다.
서열번호 22는 gL4 및 gH1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 보여준다.
서열번호 23은 야생형 이. 콜라이 spr(진뱅크 접수번호 D86610)에 대한 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 24는 야생형 이. 콜라이 spr(진뱅크 접수번호 D86610)에 대한 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 25는 신호 서열을 갖는 야생형 이. 콜라이 Tsp(진뱅크 접수번호 M75634)에 대한 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 26은 신호 서열을 갖는 야생형 이. 콜라이 Tsp(진뱅크 접수번호 M75634)에 대한 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 27은 야생형 이. 콜라이 DsbC(NCBI 기준 서열 AP_003452)에 대한 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 28은 넉아웃 돌연변이된 Tsp 유전자에 대한 폴리뉴클레오티드 서열을 보여준다.
서열번호 29는 야생형 이. 콜라이 DegP에 대한 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 30은 야생형 이. 콜라이 DegP에 대한 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 31은 점 돌연변이 S210A 및 AseI 제한 마커를 포함하는 DegP에 대한 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 32는 점 돌연변이 S210A 및 AseI 제한 마커를 포함하는 DegP에 대한 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 33 내지 36은 각각 이시스트론성(dicistronic) 유전자간 서열(IGS) IGS1, IGS2, IGS3 및 IGS4를 보여준다.
서열번호 37은 야생형 이. 콜라이 OmpT에 대한 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 38은 야생형 이. 콜라이 OmpT에 대한 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 39는 넉아웃 돌연변이된 이. 콜라이 OmpT에 대한 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 40은 넉아웃 돌연변이된 이. 콜라이 OmpT에 대한 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 41은 점 돌연변이 D210A 및 H212A를 포함하는 돌연변이된 이. 콜라이 OmpT의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 42는 점 돌연변이 D210A 및 H212A를 포함하는 이. 콜라이 OmpT의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 43은 야생형 이. 콜라이 DsbC의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 44는 야생형 이. 콜라이 DsbC의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 45는 EcoRI 제한 부위를 결여하고 His 태그를 갖는 이. 콜라이 DsbC의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 46은 EcoRI 제한 부위를 결여하고 His 태그를 갖는 이. 콜라이 DsbC의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 47은 프라이머 6283 Tsp 3'의 폴리뉴클레오티드 서열을 보여준다.
서열번호 48은 프라이머 6283 Tsp 5'의 폴리뉴클레오티드 서열을 보여준다.
서열번호 49는 야생형 이. 콜라이 ptr(진뱅크 접수번호 X06227에 따른 단백질분해효소 III)의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 50은 야생형 이. 콜라이 ptr(진뱅크 접수번호 X06227에 따른 단백질분해효소 III)의 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 51은 His 태그를 갖는 야생형 이. 콜라이 DsbC의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다.
서열번호 52는 His 태그를 갖는 야생형 이. 콜라이 DsbC의 아미노산 서열을 보여준다.
(Prc로서도 공지되어 있는) Tsp는 60 kDa의 주변세포질 단백질분해효소이다. Tsp의 첫 번째로 공지된 기질은 페니실린 결합 단백질-3(PBP3)이었지만(Determination of the cleavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3 of Escherichia coli (Hara et al. 4799-813; Nagasawa et al. 5890-93)), Tsp는 파지 꼬리 단백질도 절단할 수 있다는 것이 추후 발견되어, 꼬리 특이적 단백질분해효소(Tsp)로서 개명되었다(돌연변이가 prc 유전자의 절편을 Kanr 마커를 포함하는 단편으로 치환시킴으로써 생성된 prc 결실 균주(KS1000)를 기술하는 문헌(Silber, Keiler, and Sauer 295-99; Silber and Sauer 237-40)).
Tsp(prc) 활성의 감소는 관심 있는 단백질의 단백질분해를 감소시키는 데에 바람직하다. Fab 단백질분해는 불순물, 예컨대, 경쇄 불순물로서 지칭될 수 있는 단편의 존재로서 표시될 수 있다.
그러나, 단백질분해효소 prc를 결여하는 세포는 낮은 삼투압농도에서 감열성 생장을 보여준다는 것이 발견되었다. 하라(Hara)와 그의 동료들은 유전자외 억제자(spr) 돌연변이를 함유하는 내열성 복귀돌연변이체(revertant)를 단리하였다(Hara et al. 63-72). Spr은 18 kDa의 막 결합된 주변세포질 단백질분해효소이고, spr의 기질은 Tsp, 및 세포 분열 동안 세포벽 가수분해에 관여하는 외막 내의 펩티도글리칸이다. spr 유전자는 유니프롯(UniProt)KB/스위스-프롯(Swiss-Prot) P0AFV4(SPR_ECOLI)로서 표기된다.
단백질 이황화 이성질화효소는 단백질이 폴딩될 때 단백질 내의 시스테인 잔기들 사이의 이황화 결합의 형성 및 파괴를 촉매작용하는 효소이다. 숙주 세포에서의 단백질 발현을 개선하기 위해 이황화 결합의 형성을 촉매작용하는 단백질을 동시발현시키는 것은 공지되어 있다. 국제 특허출원 공보 제WO 98/56930호는 세균 세포에서 이종 이황화 결합 함유 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 원핵 이황화 이성질화효소, 예컨대, DsbC 또는 DsbG를 진핵 폴리펩티드와 동시발현시키는 방법을 개시한다. 미국 특허 제6,673,569호는 외래 단백질의 제조에 사용되는 DsbA, DsbB, DsbC 및 DsbD 각각을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 인공 오페론을 개시한다. 유럽 특허 제0786009호는 세균에서 이종 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 이종 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현을 유도하기 전에 DsbA 또는 DsbC를 코딩하는 핵산의 발현을 유도하는 방법을 개시한다.
DsbC는 이. 콜라이에서 이황화 결합의 형성을 촉매작용하는, 이. 콜라이의 주변세포질에서 발견되는 원핵 단백질이다. DsbC는 (신호 펩티드를 포함하는) 236의 아미노산 서열 길이 및 25.6 KDa의 분자량을 갖는다(유니프롯 번호 P0AEG6). DsbC는 1994년에 처음으로 확인되었다(Missiakas, Georgopoulos, and Raina 2013-20; Shevchik, Condemine, and Robert-Baudouy 2007-12).
놀랍게도, 그람 음성 세균 세포에서 DsbC의 과다발현은 단백질분해효소 Tsp를 결여하는 세포의 배양 동안 용해를 감소시킨다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 관심 있는 단백질의 제조에 유리한 성질을 갖는 신규 균주를 제공한다.
유전 변형의 상기 특정 조합을 갖는 그람 음성 세균 세포는 유리한 생장 및 단백질 생성 표현형을 보여준다.
한 실시양태에서, 상기 세포의 게놈은 바람직하게는 야생형 세포에 비해 Tsp 단백질 활성을 감소시키기 위해 요구되는 변형을 제외하고 야생형 세균 세포와 동일한 유전자형을 갖는다.
추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 세포는 야생형 세포에 비해 감소된 Tsp 단백질 활성을 갖고 DsbC 및 변경된 spr 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이 실시양태에서, 상기 세포의 게놈은 바람직하게는 돌연변이된 spr 유전자, 및 야생형 세포에 비해 Tsp 단백질의 감소된 또는 부재하는 발현을 유발하는 변형을 제외하고 야생형 세균 세포와 동일한 유전자형을 갖는다.
문맥이 달리 표시하지 않은 한, 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. "펩티드"는 20개 이하의 아미노산을 지칭하기 위한 것이다.
문맥이 달리 표시하지 않은 한, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 유전자, DNA, cDNA, RNA, mRNA, 및 이들의 유사체(잠겨진 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), 모르폴리노 핵산, 글리콜 핵산(GNA) 및 쓰레오스 핵산(TNA) 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음)를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 본 명세서의 내용에서 용어 "포함하는"은 "비롯한"으로서 해석되어야 한다.
본 발명의 내용에서 비돌연변이된 세포 또는 대조군 세포는 본 발명의 재조합 그람 음성 세포와 동일한 유형의 세포를 의미하고, 이때 상기 세포는 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 보유하도록 변형되어 있지 않다. 예를 들면, 비돌연변이된 세포는 야생형 세포일 수 있고, 임의의 재조합 폴리뉴클레오티드(들)를 도입하기 위한 변형 전의 본 발명의 세포와 동일한 숙주 세포 집단으로부터 유래될 수 있다.
표현 "세포", "세포주", "세포 배양물" 및 "균주"는 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 내용에서 용어 "동일한 유전자형을 갖는"은 세포가 본 발명을 특징짓는 요소, 예를 들면, DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및 임의적으로 Tsp 단백질의 감소된 또는 부재하는 발현을 유발하는 변형, 및 임의적으로 돌연변이된 spr 유전자가 내부에 도입되어 있다는 점을 제외하고 야생형 세포와 비교될 때 동일한 또는 실질적으로 동일한 핵산 서열(들)을 포함한다는 것을 의미한다. 이 실시양태에서, 본 발명에 따른 세포는 그의 게놈에 대한 추가 비천연 발생 또는 유전적으로 조작된 변화를 포함하지 않는다.
DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 세포의 게놈 내로 삽입되는 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 세포는 DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및 임의적으로 Tsp 단백질의 감소된 또는 부재하는 발현 또는 감소된 단백질분해효소 활성을 갖는 Tsp 단백질의 발현을 유발하는 변형, 및 임의적으로 야생형에 비해 감소된 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 돌연변이된 spr 유전자를 제외하고 발생할 수 있는 임의의 천연 발생 돌연변이를 고려하여 야생형과 비교될 때 실질적으로 동일한 게놈 서열을 가질 수 있다. DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 세포의 게놈 내로 삽입되는 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 세포는 DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 제외하고 야생형과 비교될 때 정확히 동일한 게놈 서열을 가질 수 있다.
DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포 내로 형질전환되었고/되었거나 숙주 세포의 게놈 내로 삽입된 적합한 발현 벡터 상에 존재할 수 있다. DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포의 게놈 내로 삽입되는 실시양태에서, 본 발명의 세포는 DsbC를 코딩하는 삽입된 폴리뉴클레오티드로 인해 야생형 세포와 상이하다. 이 실시양태에서, 숙주 세포의 게놈은 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제외하고 야생형 세포 게놈과 비교될 때 동일한 유전자형을 가질 수 있다.
바람직하게는, DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포에서 발현 벡터 내에 존재함으로써 숙주 세포의 게놈에 대한 최소한의 파괴를 야기한다.
CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 세포 내로 형질전환되었고/되었거나 숙주 세포의 게놈 내로 삽입된 적합한 발현 벡터 내에 함유될 수 있다. CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주의 게놈 내로 삽입되는 실시양태에서, 본 발명의 세포는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 삽입된 폴리뉴클레오티드(들)로 인해 야생형과 상이하다. 이 실시양태에서, 숙주 세포의 게놈은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)를 제외하고 야생형 세포 게놈과 비교될 때 동일한 유전자형을 가질 수 있다. 바람직하게는, 관심 있는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포에서 발현 벡터 내에 존재함으로써 숙주 세포의 게놈에 대한 최소한의 파괴를 야기한다.
한 실시양태에서, DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 숙주의 게놈 내로 삽입된다. 이 실시양태에서, 본 발명의 세포는 DsbC를 코딩하는 삽입된 재조합 폴리뉴클레오티드 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및 임의적으로 Tsp 단백질의 감소된 또는 부재하는 발현 또는 감소된 단백질분해효소 활성을 갖는 Tsp 단백질의 발현을 유발하는 변형, 및 임의적으로 야생형에 비해 감소된 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 돌연변이된 spr 유전자로 인해 야생형 세포와 상이하다. 이 실시양태에서, 숙주 세포의 게놈은 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 제외하고 야생형 세포 게놈과 비교될 때 동일한 유전자형을 가질 수 있다.
바람직한 실시양태에서, DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포에서 동일한 또는 상이한 발현 벡터에 존재함으로써 숙주 세포의 게놈에 대한 최소한의 파괴를 야기한다. 이 실시양태에서, 세포의 게놈은 야생형 세포의 게놈과 비교될 때 실질적으로 동일할 수 있거나 정확히 동일할 수 있다.
한 실시양태에서, 감소된 Tsp 활성 및 임의적으로 spr 유전자 또는 이의 돌연변이체를 갖는 재조합 이. 콜라이 세포가 제공되고, 이때 Tsp 활성에 대한 변형 및 spr 유전자 내의 임의의 돌연변이는 세포 게놈에서의 변화를 통해 달성된다. 이 실시양태에 따른 세포는 DsbC 및 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 결합 단편을 코딩하는 벡터, 예컨대, 플라스미드 벡터로 형질전환될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 벡터 또는 플라스미드는 세포의 게놈 내로 삽입되지 않는다.
본 발명의 내용에서 용어 "야생형"은 자연에서 발생할 수 있거나 환경으로부터 단리될 수 있고 임의의 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 유전적으로 조작된 돌연변이를 보유하지 않는 그람 음성 세균 세포의 균주를 의미한다. 이. 콜라이의 야생형 균주의 한 예는 K-12 균주 및 이의 계통 균주 W3110이다. 이. 콜라이 균주 K-12는 지금까지 90년 동안 배양되어 왔다(Bachmann 525-57). 이. 콜라이 균주 K-12 및 이의 계통 균주, 예컨대, W3110은 당분야에서 잘 공지되어 있다. 균주 W3110은 예를 들면, 카달로그 번호 27325 하에 어메리칸 티슈 컬쳐 콜렉션(ATCC)으로부터 입수될 수 있다. W3110은 하기 유전형을 갖는다: F-, λ-, IN(rrnD-rrnE)1, rph-1.
본 발명자들은 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는, CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하기에 적합한 재조합 그람 음성 세균 세포를 제공한다.
본 발명에 따른 세포는 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "재조합 폴리펩티드"는 재조합 DNA 기술의 이용을 통해 구축되거나 제조된 단백질을 지칭한다. DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 야생형 세균 세포에서 발견되는 DsbC를 코딩하는 내생성 폴리뉴클레오티드와 동일할 수 있다. 대안적으로, DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 제한 부위, 예컨대, EcoRI 부위 및/또는 his 태그가 DsbC 단백질로부터 제거되도록 변경되어 있는, 야생형 DsbC 폴리뉴클레오티드의 돌연변이된 버전이다. 본 발명에서 사용되는 변형된 DsbC 폴리뉴클레오티드의 한 예는 서열번호 46에 제시된 his 태깅된 DsbC 서열을 코딩하는 서열번호 45에 제시되어 있다.
DsbC는 아미노산 -CXXC-를 포함하는 활성 부위의 존재를 특징으로 하고, 이때 XX는 아미노산 GY를 나타낸다. DsbC의 변이체는 각각의 X가 독립적으로 선택된 아미노산을 나타내는(단, XX는 GY를 나타내지 않음) DsbC를 포함한다. XX의 예로는 NY, SF, TF, MF, GF, HH, VH, SH, RF, FA, GA, MA, GI 또는 AV가 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 숙주 세포는 예를 들면, 활성 부위가 특히 전술된 바와 같이 변경되어 있는 DsbC의 변이체를 포함한다.
한 실시양태에서, DsbC의 변이체는 예를 들면, 시험관내 어세이에서 측정되었을 때 적어도 야생형 단백질의 생물학적 활성을 갖는다.
한 실시양태에서, DsbC의 변이체는 예를 들면, 시험관내 어세이에서 측정되었을 때 야생형 단백질보다 더 높은 생물학적 활성을 갖는다.
한 실시양태에서, DsbC의 변이체는 활성 부위 -CXXC-에서 변경을 갖고, 이때 XX는 NY, SF, TF, MF, GF, HH, VH 또는 SH를 나타낸다.
한 실시양태에서, DsbC는 야생형이다.
본 발명자들은 세균 세포에서 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현의 선택이 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하는 개선된 숙주 세포를 제공한다는 것을 확인하였다. 본 발명에 의해 제공된 세포는 야생형 세균 세포에 비해 개선된 세포 건강 및 생장 표현형을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 개선된 세포 건강은 본 발명에 따른 특징을 보유하지 않는 세포에 비해 하나 이상의 개선된 성질, 예를 들면, 생장기에서의 세포 용해 또는 세포에서 이종 단백질의 발현을 유도한 후 세포 용해에 대한 보다 낮은 경향 또는 당업자에게 공지되어 있는 다른 유리한 성질을 지칭하기 위한 것이다.
본 발명에 따른 세포는 야생형 세균 세포에 비해 개선된 단백질, 예컨대, 항체 또는 항체 단편 생성 수율을 나타낸다. 개선된 단백질 수율은 세포로부터의 단백질 생성 속도 및/또는 단백질 생성 지속시간일 수 있다. 개선된 단백질 수율은 주변세포질 단백질 수율 및/또는 상청액 단백질 수율일 수 있다. 재조합 세균 세포는 단백질, 예컨대, 항체 또는 이의 단편의 보다 빠른 생성 속도를 가질 수 있으므로, 동일한 양의 관심 있는 단백질이 비돌연변이된 세균 세포에 비해 보다 짧은 시간 이내에 생성될 수 있다. 관심 있는 단백질의 보다 빠른 생성 속도는 세포의 초기 생장기에 걸쳐, 예를 들면, 단백질 발현의 유도 후 처음 5시간, 10시간, 20시간 또는 30시간에 걸쳐 특히 상당할 수 있다.
본 발명에 따른 세포는 바람직하게는 주변세포질 및/또는 배지에서 대략 1.0 g/ℓ, 1.5 g/ℓ, 1.8 g/ℓ, 2.0 g/ℓ, 2.4 g/ℓ, 2.5 g/ℓ, 3.0 g/ℓ, 3.5 g/ℓ 또는 4.0 g/ℓ의 수율로 항체를 발현한다.
유리하게는, 감소된 Tsp 단백질 활성 및/또는 DsbC의 동시발현은 본원에서 경쇄 단편(LC)으로서 지칭되는 바람직하지 않은 불순물의 발생을 감소시킨다(예를 들면, 도 5 참조).
당업자는 발효 방법, ELISA 및 단백질 G HPLC를 비롯한 당분야에서 잘 공지되어 있는 방법을 이용하여 후보 세포 클론이 원하는 수율의 관심 있는 단백질을 갖는지를 알아보기 위해 상기 후보 세포 클론을 용이하게 시험할 수 있을 것이다. 적합한 발효 방법은 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌(Humphreys et al. 193-202; Backlund et al. 358-65)에 기재되어 있다. 당업자는 당분야에서 잘 공지되어 있는 방법, 예컨대, 단백질 G HPLC, 원이색법, NMR, X-선 결정학 및 에피토프 친화성 측정 방법을 이용하여 분비된 단백질이 정확히 폴딩되는지를 알아보기 위해 상기 분비된 단백질을 용이하게 시험할 수도 있을 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 세포는 상응하는 야생형 세포, 예컨대, 이. 콜라이 W3110 K-12 균주에 비해 하기 하나 이상의 추가 단백질도 발현하거나 과다발현한다:
Figure pct00001
단백질 폴딩을 용이하게 할 수 있는 하나 이상의 단백질, 예컨대, FkpA, Skp, SurA, PPiA 및 PPiD;
Figure pct00002
단백질 분비 또는 전위를 용이하게 할 수 있는 하나 이상의 단백질, 예컨대, SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY 및 Lep; 및/또는
Figure pct00003
이황화 결합 형성을 용이하게 할 수 있는 하나 이상의 단백질, 예컨대, DsbA, DsbB, DsbD, DsbG.
상기 단백질들 중 하나 이상의 단백질은 세포의 게놈 내로 도입될 수 있고/있거나 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 세포는 하기 추가 단백질들 중 하나 이상의 추가 단백질을 발현하지 않거나 상응하는 야생형 세포, 예컨대, 이. 콜라이 W3110 K-12 균주의 수준보다 50%, 75% 또는 90% 이상 더 낮은 수준으로 발현한다:
Figure pct00004
단백질 폴딩을 용이하게 할 수 있는 하나 이상의 단백질, 예컨대, FkpA, Skp, SurA, PPiA 및 PPiD;
Figure pct00005
단백질 분비 또는 전위를 용이하게 할 수 있는 하나 이상의 단백질, 예컨대, SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY 및 Lep; 및
Figure pct00006
이황화 결합 형성을 용이하게 할 수 있는 하나 이상의 단백질, 예컨대, DsbA, DsbB, DsbD, DsbG.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 세포는 FkpA, Skp 및 이들의 조합물로부터 선택된 하나 이상의 추가 단백질도 발현한다.
한 실시양태에서, 상기 세포는 하기 돌연변이된 유전자들 중 하나 이상의 유전자를 추가로 포함한다:
a) 돌연변이된 spr 유전자;
b) 돌연변이된 Tsp 유전자로서, 감소된 단백질분해효소 활성을 갖는 Tsp 단백질을 코딩하거나 넉아웃 돌연변이된 Tsp 유전자인 돌연변이된 Tsp 유전자;
c) 돌연변이된 DegP 유전자로서, 샤페론(chaperone) 활성 및 감소된 단백질분해효소 활성을 갖는 DegP 단백질을 코딩하는 돌연변이된 DegP 유전자;
d) 돌연변이된 ptr 유전자로서, 감소된 단백질분해효소 활성을 갖는 단백질분해효소 III 단백질을 코딩하거나 넉아웃 돌연변이된 ptr 유전자인 돌연변이된 ptr 유전자; 및
e) 돌연변이된 OmpT 유전자로서, 예를 들면, 서열번호 42에 제시된 바와 같은, 감소된 단백질분해효소 활성을 갖는 OmpT 단백질을 코딩하거나 예를 들면, 서열번호 40에 제시된 바와 같은 넉아웃 돌연변이된 OmpT 유전자인 돌연변이된 OmpT 유전자.
본 발명의 기본 실시양태에서, 그람 음성 세균 세포는 넉아웃 돌연변이된 Tsp 유전자를 보유하지 않는다(예컨대, 염색체 Tsp에서 결핍되어 있지 않다).
후자 돌연변이는 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 단편의 생성에 있어서 특히 중요한데, 이는 Tsp 단백질분해효소 활성이 엘보우(elbow) 영역에서 항체 생성물의 절단을 초래함으로써 부산물을 상당한 양으로 발생시키고 원하는 생성물의 수율을 감소시킬 수 있기 때문이다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 세포는 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하고, 이때 상기 돌연변이된 Tsp 유전자는 감소된 단백질분해효소 활성을 갖는 Tsp 단백질을 코딩하거나 넉아웃 돌연변이된 Tsp 유전자이고, CD154에 대해 특이적인 항체 또는 단편 이외에 DsbC 단백질도 코딩한다.
본 발명의 실시양태에서, 상기 세포는 돌연변이된 spr 유전자를 포함한다. spr 단백질은 이. 콜라이 막 결합된 주변세포질 단백질분해효소이다.
Spr 단백질의 야생형 아미노산 서열은 N-말단에서 신호 서열(유니프롯 접수번호 P0AFV4에 따라 아미노산 1 내지 26)을 갖는 서열번호 24에 제시되어 있다. 본 발명에서 Spr 단백질 서열의 아미노산 넘버링은 신호 서열을 포함한다. 따라서, Spr 단백질의 아미노산 1은 서열번호 24에 제시된 제1 아미노산(Met)이다.
본 발명에 따른 세포가 돌연변이된 spr 유전자를 포함하는 실시양태에서, 돌연변이된 spr 유전자는 바람직하게는 세포의 염색체 spr 유전자이다. 돌연변이된 spr 유전자는 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포와 관련된 불리한 표현형을 억제할 수 있는 Spr 단백질을 코딩한다. 돌연변이된 Tsp 유전자를 보유하는 세포는 우수한 세포 생장 속도를 가질 수 있으나, 이들 세포의 한 한계점은 특히 높은 세포 밀도에서 그들의 용해하는 경향이다. 따라서, 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포의 표현형은 특히 높은 세포 밀도에서 용해하는 경향이다.
돌연변이된 Tsp 유전자를 보유하는 세포는 낮은 삼투압농도에서 감열성 생장을 보여준다. 그러나, 본 발명의 세포에 의해 보유된 spr 돌연변이는 감소된 Tsp 활성을 갖는 세포 내로 도입되었을 때 낮은 삼투압농도에서의 감열성 생장이라는 이 표현형을 억제하고, 상기 세포는 특히 높은 세포 밀도에서 감소된 용해를 나타낸다. 세포의 이 "감열성 생장" 표현형은 진탕 플라스크 또는 높은 세포 밀도 발효 기법 동안 당업자에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 세포 용해의 억제는 Tsp 돌연변이체 및 야생형 spr을 보유하는 세포와 비교될 때 spr 돌연변이체를 보유하고 감소된 Tsp 활성을 갖는 세포에 의해 나타나는 개선된 생장 속도 및/또는 재조합 단백질 생성, 특히 주변세포질에서의 개선된 재조합 단백질 생성으로부터 분명하다.
본 발명에 따른 세포는 바람직하게는 N31, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, H145, G147, H157 및 W174로부터 선택된 하나 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147, H157 및 W174로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 변화를 갖는 spr 단백질을 코딩하는 돌연변이체 spr 유전자를 포함한다. 바람직하게는, 돌연변이체 spr 유전자는 N31, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, H145, G147 및 H157로부터 선택된 하나 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147 및 H157로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 변화를 갖는 spr 단백질을 코딩한다. 이 실시양태에서, spr 단백질은 바람직하게는 임의의 추가 아미노산 변화를 갖지 않는다. 바람직하게는, 돌연변이체 spr 유전자는 N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 및 G147로부터 선택된 하나 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 S95, V98, Y115, D133, V135 및 G147로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 변화를 갖는 spr 단백질을 코딩한다. 이 실시양태에서, spr 단백질은 바람직하게는 임의의 추가 아미노산 변화를 갖지 않는다.
본 발명자들은 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포의 생장 표현형을 억제할 수 있는 spr 변화를 확인하였다.
본 발명자들은 놀랍게도 재조합 DsbC 유전자 및 돌연변이된 spr 유전자를 보유하고 야생형 세포에 비해 감소된 Tsp 단백질 활성을 갖는 세포가 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포에 비해 증가된 세포 생장 속도 및 증가된 세포 생존 지속시간을 나타낸다는 것도 발견하였다. 특히, 재조합 DsbC 유전자 및 spr 단백질의 변화를 보유하고 감소된 Tsp 단백질 활성을 갖는 세포는 돌연변이된 Tsp 유전자를 보유하는 세포에 비해 배양 동안 감소된 세포 용해를 나타낸다.
상기 spr 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산의 변화는 상기 아미노산을 코딩하는 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드에 대한 임의의 적합한 미스센스(missense) 돌연변이의 결과일 수 있다. 상기 돌연변이는 아미노산 잔기를 임의의 적합한 아미노산으로 변화시키고, 이것은 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포의 표현형을 억제할 수 있는 돌연변이된 spr 단백질을 초래한다. 미스센스 돌연변이는 아미노산을, 야생형 아미노산에 비해 상이한 크기 및/또는 상이한 화학적 성질을 갖는 아미노산으로 변화시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 변화는 C94, H145 및 H157의 아미노산 잔기들로 구성된 촉매 트라이어드(catalytic triad)의 1개, 2개 또는 3개 아미노산 잔기에 대한 변화이다(Aramini et al. 9715-17).
따라서, 돌연변이된 spr 유전자는 하기 돌연변이를 포함할 수 있다:
Figure pct00007
아미노산 C94에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00008
아미노산 H145에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00009
아미노산 H157에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00010
아미노산 C94 및 H145에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00011
아미노산 C94 및 H157에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00012
아미노산 H145 및 H157에 영향을 미치는 돌연변이; 또는
Figure pct00013
아미노산 C94, H145 및 H157에 영향을 미치는 돌연변이.
이 실시양태에서, spr 단백질은 바람직하게는 임의의 추가 아미노산 변화를 갖지 않는다.
C94, H145 및 H157 중 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기는 임의의 적합한 아미노산으로 변화될 수 있고, 이것은 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포의 표현형을 억제할 수 있는 spr 단백질을 발생시킨다. 예를 들면, C94, H145 및 H157 중 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기는 작은 아미노산, 예컨대, Gly 또는 Ala으로 변화될 수 있다. 따라서, spr 단백질은 C94A(즉, 위치 94에서 시스테인이 알라닌으로 변화됨), H145A(즉, 위치 145에서 히스티딘이 알라닌으로 변화됨) 및 H157A(즉, 위치 157에서 히스티딘이 알라닌으로 변화됨)를 발생시키는 돌연변이들 중 1개, 2개 또는 3개의 돌연변이를 가질 수 있다. 바람직하게는, spr 유전자는 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포의 표현형을 억제할 수 있는 spr 단백질을 생성하는 것으로 발견된 H145A를 유발하는 미스센스 돌연변이를 포함한다.
본원에서 치환 돌연변이체에 대한 표기는 문자에 이어서 숫자에 이어서 문자로 구성된다. 첫 번째 문자는 야생형 단백질 내의 아미노산을 표기한다. 숫자는 아미노산 치환이 만들어지는 아미노산 위치를 지칭하고, 두 번째 문자는 야생형 아미노산을 치환시키는 데에 사용된 아미노산을 표기한다.
바람직한 실시양태에서, 돌연변이체 spr 단백질은 N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 및 G147로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 변화, 바람직하게는 S95, V98, Y115, D133, V135 및 G147로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 변화를 포함한다. 이 실시양태에서, spr 단백질은 바람직하게는 임의의 추가 돌연변이를 갖지 않는다. 따라서, 돌연변이된 spr 유전자는 하기 돌연변이를 포함할 수 있다:
Figure pct00014
아미노산 N31에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00015
아미노산 R62에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00016
아미노산 I70에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00017
아미노산 Q73에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00018
아미노산 S95에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00019
아미노산 V98에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00020
아미노산 Q99에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00021
아미노산 R100에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00022
아미노산 L108에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00023
아미노산 Y115에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00024
아미노산 D133에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00025
아미노산 V135에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00026
아미노산 L136에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00027
아미노산 G140에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00028
아미노산 R144에 영향을 미치는 돌연변이; 또는
Figure pct00029
아미노산 G147에 영향을 미치는 돌연변이.
한 실시양태에서, 돌연변이체 spr 유전자는 하기 아미노산들에 영향을 미치는 다수의 돌연변이들을 포함한다:
Figure pct00030
S95 및 Y115;
Figure pct00031
N31, Q73, R100 및 G140;
Figure pct00032
Q73, R100 및 G140;
Figure pct00033
R100 및 G140;
Figure pct00034
Q73 및 G140;
Figure pct00035
Q73 및 R100;
Figure pct00036
R62, Q99 및 R144; 또는
Figure pct00037
Q99 및 R144.
아미노산 N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 및 G147 중 하나 이상의 아미노산은 임의의 적합한 아미노산으로 변화될 수 있고, 이것은 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포의 표현형을 억제할 수 있는 spr 단백질을 발생시킨다. 예를 들면, N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140 및 R144 중 하나 이상의 아미노산은 작은 아미노산, 예컨대, Gly 또는 Ala으로 변화될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, spr 단백질은 하기 변화들 중 하나 이상의 변화를 포함한다: N31Y, R62C, I70T, Q73R, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D 또는 V135G, L136P, G140C, R144C 및 G147C. 바람직하게는, spr 단백질은 하기 변화들 중 하나 이상의 변화를 포함한다: S95F, V98E, Y115F, D133A, V135D 또는 V135G 및 G147C. 이 실시양태에서, spr 단백질은 바람직하게는 임의의 추가 아미노산 변화를 갖지 않는다.
한 실시양태에서, spr 단백질은 N31Y, R62C, I70T, Q73R, C94A, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D 또는 V135G, L136P, G140C, R144C 및 G147C로부터 선택된 1개의 아미노산 변화, 특히 C94A만을 갖는다. 이 실시양태에서, spr 단백질은 바람직하게는 임의의 추가 아미노산 변화를 갖지 않는다.
추가 실시양태에서, spr 단백질은 하기 변화들로부터 선택된 다수의 변화들을 갖는다:
Figure pct00038
S95F 및 Y115F
Figure pct00039
N31Y, Q73R, R100G 및 G140C;
Figure pct00040
Q73R, R100G 및 G140C;
Figure pct00041
R100G 및 G140C;
Figure pct00042
Q73R 및 G140C;
Figure pct00043
Q73R 및 R100G;
Figure pct00044
R62C, Q99P 및 R144C; 또는
Figure pct00045
Q99P 및 R144C.
바람직하게는, 돌연변이체 spr 유전자는 C94A, D133A, H145A 및 H157A로부터 선택된 아미노산 변화, 특히 C94A를 갖는 spr 단백질을 코딩한다.
추가 실시양태에서, 돌연변이된 spr 유전자는 아미노산 변화 W174R을 갖는 spr 단백질을 코딩한다. 대안적 실시양태에서, spr 단백질은 아미노산 변화 W174R을 갖지 않는다.
본 발명에 따른 세포는 야생형 세포에 비해 감소된 Tsp 단백질 활성을 갖는다. 표현 "야생형 세포에 비해 감소된 Tsp 단백질 활성"은 세포의 Tsp 활성이 야생형 세포의 Tsp 활성에 비해 감소되어 있다는 것을 의미한다. 세포는 Tsp의 활성을 감소시키기에 적합한 임의의 수단에 의해 변형될 수 있다.
한 실시양태에서, 감소된 Tsp 활성은 Tsp를 코딩하는 내생성 폴리뉴클레오티드 및/또는 관련된 조절 발현 서열의 변형으로부터 비롯된다. 상기 변형은 Tsp 유전자 전사 및 번역을 감소시키거나 정지시킬 수 있거나 야생형 Tsp 단백질에 비해 감소된 단백질분해효소 활성을 갖는 발현된 Tsp 단백질을 제공할 수 있다.
한 실시양태에서, 관련된 조절 발현 서열은 Tsp 발현을 감소시키도록 변형된다. 예를 들면, Tsp 유전자를 위한 프로모터는 상기 유전자의 발현을 방해하도록 돌연변이될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 세포는 감소된 단백질분해효소 활성을 갖는 Tsp 단백질을 코딩하는 돌연변이된 Tsp 유전자 또는 넉아웃 돌연변이된 Tsp 유전자를 보유한다. 바람직하게는, 염색체 Tsp 유전자가 돌연변이된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "Tsp 유전자"는 페니실린 결합 단백질-3(PBP3) 및 파지 꼬리 단백질에 작용할 수 있는 주변세포질 단백질분해효소인 (Prc로서도 공지되어 있는) 단백질분해효소 Tsp를 코딩하는 유전자를 의미한다. 야생형 Tsp 유전자의 서열은 서열번호 25에 제시되어 있고, 야생형 Tsp 단백질의 서열은 서열번호 26에 제시되어 있다.
달리 표시되어 있지 않은 한, 돌연변이된 Tsp 유전자 또는 Tsp를 코딩하는 돌연변이된 Tsp 유전자의 언급은 감소된 단백질분해효소 활성을 갖는 Tsp 단백질을 코딩하는 돌연변이된 Tsp 유전자 또는 넉아웃 돌연변이된 Tsp 유전자를 지칭한다.
본 발명의 내용에서 표현 "감소된 단백질분해효소 활성을 갖는 Tsp 단백질을 코딩하는 돌연변이된 Tsp 유전자"는 돌연변이된 Tsp 유전자가 야생형 비돌연변이된 Tsp 유전자에 비해 전체 단백질분해효소 활성을 갖지 않는다는 것을 의미한다.
바람직하게는, 돌연변이된 Tsp 유전자는 야생형 비돌연변이된 Tsp 단백질의 단백질분해효소 활성의 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하의 단백질분해효소 활성을 갖는 Tsp 단백질을 코딩한다. 보다 바람직하게는, 돌연변이된 Tsp 유전자는 단백질분해효소 활성을 갖지 않는 Tsp 단백질을 코딩한다. 이 실시양태에서, 세포는 염색체 Tsp에서 결핍되어 있지 않다. 즉, Tsp 유전자 서열은 임의의 형태의 Tsp 단백질의 발현을 방해하도록 결실되어 있거나 돌연변이되어 있지 않다.
감소된 단백질분해효소 활성을 갖는 단백질을 생성하기 위해 임의의 적합한 돌연변이를 Tsp 유전자 내로 도입할 수 있다. 당업자는 그람 음성 세균으로부터 발현된 Tsp 단백질의 단백질분해효소 활성을 당분야의 임의의 적합한 방법, 예컨대, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌(Keiler and Sauer 28864-68))에 기재된 방법(이때, Tsp의 단백질분해효소 활성이 시험되었음)으로 용이하게 시험할 수 있다.
잔기 S430, D441 및 K455를 포함하는 활성 부위, 및 Tsp의 구조를 유지하는 데에 있어서 중요한 잔기 G375, G376, E433 및 T452를 갖는 Tsp는 상기 문헌(Keiler et al.)에 보고되어 있다. 상기 문헌(Keiler et al.)은 아미노산 변화 S430A, D441A, K455A, K455H, K455R, G375A, G376A, E433A 및 T452A를 유발하는 돌연변이된 Tsp 유전자가 검출가능한 단백질분해효소 활성을 갖지 않는다는 발견을 보고한다. S430C를 유발하는 돌연변이된 Tsp 유전자가 야생형 활성의 약 5% 내지 10%의 활성을 나타내었다는 것도 보고되어 있다. 따라서, 감소된 단백질분해효소 활성을 갖는 단백질을 생성하기 위한 Tsp 돌연변이는 잔기 S430, D441, K455, G375, G376, E433 및 T452 중 하나 이상의 잔기의 변화를 유발하는 돌연변이, 예컨대, 미스센스 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 감소된 단백질분해효소 활성을 갖는 단백질을 생성하기 위한 Tsp 돌연변이는 활성 부위 잔기 S430, D441 및 K455 중 1개, 2개 또는 모든 3개의 잔기에 영향을 미치는 돌연변이, 예컨대, 미스센스 돌연변이를 포함할 수 있다.
따라서, 돌연변이된 Tsp 유전자는 하기 돌연변이를 포함할 수 있다:
Figure pct00046
아미노산 S430에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00047
아미노산 D441에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00048
아미노산 K455에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00049
아미노산 S430 및 D441에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00050
아미노산 S430 및 K455에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00051
아미노산 D441 및 K455에 영향을 미치는 돌연변이; 또는
Figure pct00052
아미노산 S430, D441 및 K455에 영향을 미치는 돌연변이.
잔기 S430, D441, K455, G375, G376, E433 및 T452 중 하나 이상의 잔기는 임의의 적합한 아미노산으로 변화될 수 있고, 이것은 감소된 단백질분해효소 활성을 갖는 단백질을 발생시킨다. 적합한 변화의 예는 S430A, S430C, D441A, K455A, K455H, K455R, G375A, G376A, E433A 및 T452A이다. 돌연변이된 Tsp 유전자는 활성 부위 잔기의 변화를 유발하는 1개, 2개 또는 3개의 돌연변이를 포함할 수 있고, 예를 들면, 상기 유전자는 하기 돌연변이를 포함할 수 있다:
Figure pct00053
S430A 또는 S430C;
Figure pct00054
D441A; 및/또는
Figure pct00055
K455A 또는 K455H 또는 K455R.
바람직하게는, Tsp 유전자는 S430A 또는 S430C를 유발하는 돌연변이를 갖는다.
본 발명의 내용에서 표현 "넉아웃 돌연변이된 Tsp 유전자"는 Tsp 유전자가 야생형 유전자에 의해 코딩된 Tsp 단백질의 발현을 방해하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하여 Tsp 단백질에서 결핍되어 있는 세포를 제공한다는 것을 의미한다. 넉아웃 유전자는 부분적으로 또는 완전히 전사될 수 있지만 코딩된 단백질로 번역될 수 없다. 넉아웃 돌연변이된 Tsp 유전자는 단백질의 발현을 야기하지 않도록 임의의 적합한 방식, 예를 들면, 하나 이상의 결실, 삽입, 점, 미스센스, 넌센스(nonsense) 및 프레임변동(frameshift) 돌연변이에 의해 돌연변이될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는 외래 DNA 서열, 예컨대, 항생제 내성 마커를 유전자 코딩 서열 내로 삽입함으로써 넉아웃될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, Tsp 유전자는 외래 DNA 서열, 예컨대, 항생제 내성 마커를 유전자 코딩 서열 내로 삽입함으로써 돌연변이되지 않는다. 한 실시양태에서, Tsp 유전자는 유전자 개시 코돈에 대한 돌연변이 및/또는 유전자 개시 코돈의 하류와 유전자 정지 코돈의 상류 사이에 위치하여 Tsp 단백질의 발현을 방해하는 하나 이상의 정지 코돈을 포함한다. 개시 코돈에 대한 돌연변이는 개시 코돈의 1개, 2개 또는 모든 3개의 뉴클레오티드의 미스센스 돌연변이일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 개시 코돈은 삽입 또는 결실 프레임변동 돌연변이에 의해 돌연변이될 수 있다. Tsp 유전자는 코딩 서열의 5' 말단에서 2개의 ATG 코돈을 포함하고, 상기 ATC 코돈 중 하나 또는 둘다가 미스센스 돌연변이에 의해 돌연변이될 수 있다. Tsp 유전자는 도 10에 나타낸 바와 같이 두 번째 ATG 코돈(코돈 3)에서 TCG로 돌연변이될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, Tsp 유전자는 유전자 개시 코돈의 하류와 유전자 정지 코돈의 상류 사이에 위치하는 하나 이상의 정지 코돈을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 넉아웃 돌연변이된 Tsp 유전자는 개시 코돈에 대한 미스센스 돌연변이 및 하나 이상의 삽입된 정지 코돈 둘다를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, Tsp 유전자는 도 10에 나타낸 바와 같이 5번째 코돈으로부터 "T"를 결실시켜 코돈 11 및 16에서 정지 코돈을 발생시키는 프레임변동을 야기하도록 돌연변이된다. 바람직한 실시양태에서, Tsp 유전자는 도 10에 나타낸 바와 같이 AseI 제한 부위를 삽입하여 코돈 21에서 세 번째 프레임내(in-frame) 정지 코돈을 생성하도록 돌연변이된다.
바람직한 실시양태에서, 넉아웃 돌연변이된 Tsp 유전자는 개시 코돈의 상류에서 6개의 뉴클레오티드 ATGAAT를 포함하는 서열번호 25의 DNA 서열을 갖는다. 서열번호 25의 넉아웃 돌연변이된 Tsp 서열에서 만들어진 돌연변이는 도 10에 제시되어 있다. 한 실시양태에서, 돌연변이된 Tsp 유전자는 서열번호 25의 뉴클레오티드 7 내지 2048의 DNA 서열을 갖는다.
본 발명의 실시양태에서, 세포는 돌연변이된 DegP 유전자를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "DegP"는 샤페론 및 단백질분해효소로서 이중 기능을 갖는 (HtrA로서도 공지되어 있는) DegP 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 야생형 DegP의 서열은 서열번호 29에 제시되어 있고, 비돌연변이된 DegP 단백질의 서열은 서열번호 30에 제시되어 있다.
저온에서 DegP는 샤페론으로서 기능하고 고온에서 DegP는 단백질분해효소로서 기능하는 것을 선호한다.
세포가 DegP 돌연변이를 포함하는 실시양태에서, 세포 내의 DegP 돌연변이는 샤페론 활성을 갖지만 전체 단백질분해효소 활성을 갖지 않는 DegP 단백질을 코딩하는 돌연변이된 DegP 유전자를 제공한다.
본 발명의 내용에서 표현 "샤페론 활성을 갖는"은 돌연변이된 DegP 단백질이 야생형 비돌연변이된 DegP 단백질과 비교될 때 동일한 또는 실질적으로 동일한 샤페론 활성을 갖는다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 돌연변이된 DegP 유전자는 야생형 비돌연변이된 DegP 단백질의 샤페론 활성의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 샤페론 활성을 갖는 DegP 단백질을 코딩한다. 보다 바람직하게는, 돌연변이된 DegP 유전자는 야생형 DegP와 비교될 때 동일한 샤페론 활성을 갖는 DegP 단백질을 코딩한다.
본 발명의 내용에서 표현 "감소된 단백질분해효소 활성을 갖는"은 돌연변이된 DegP 단백질이 야생형 비돌연변이된 DegP 단백질에 비해 전체 단백질분해효소 활성을 갖지 않는다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 돌연변이된 DegP 유전자는 야생형 비돌연변이된 DegP 단백질의 단백질분해효소 활성의 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하의 단백질분해효소 활성을 갖는 DegP 단백질을 코딩한다. 보다 바람직하게는, 돌연변이된 DegP 유전자는 단백질분해효소 활성을 갖지 않는 DegP 단백질을 코딩한다. 세포는 염색체 DegP에서 결핍되어 있지 않다. 즉, DegP 유전자 서열은 임의의 형태의 DegP 단백질의 발현을 방해하도록 결실되어 있거나 돌연변이되어 있지 않다.
샤페론 활성 및 감소된 단백질분해효소 활성을 갖는 단백질을 생성하기 위해 임의의 적합한 돌연변이를 DegP 유전자 내로 도입할 수 있다. 당업자는 그람 음성 세균으로부터 발현된 DegP 단백질의 단백질분해효소 및 샤페론 활성을 임의의 적합한 방법(예를 들면, 이때 DegP의 단백질분해효소 및 샤페론 활성은 DegP의 천연 기질인 MalS에 대해 시험되었음)으로 용이하게 시험할 수 있다.
DegP는 세린 단백질분해효소이고 His105, Asp135 및 Ser210의 아미노산 잔기들로 구성된 촉매 트라이어드로 구성된 활성 중심을 갖는다. 샤페론 활성 및 감소된 단백질분해효소 활성을 갖는 단백질을 생성하기 위한 DegP 돌연변이는 His105, Asp135 및 Ser210 중 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기에 영향을 미치는 돌연변이, 예컨대, 미스센스 돌연변이를 포함할 수 있다.
따라서, 돌연변이된 DegP 유전자는 하기 돌연변이를 포함할 수 있다:
Figure pct00056
아미노산 His105에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00057
아미노산에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00058
아미노산에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00059
아미노산 His105 및 Asp135에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00060
아미노산 His105 및 Ser210에 영향을 미치는 돌연변이;
Figure pct00061
아미노산 Asp135 및 Ser210에 영향을 미치는 돌연변이; 또는
Figure pct00062
아미노산 His105, Asp135 및 Ser210에 영향을 미치는 돌연변이.
His105, Asp135 및 Ser210 중 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기는 임의의 적합한 아미노산으로 변화될 수 있고, 이것은 샤페론 활성 및 감소된 단백질분해효소 활성을 갖는 단백질을 발생시킨다. 예를 들면, His105, Asp135 및 Ser210 중 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기는 작은 아미노산, 예컨대, Gly 또는 Ala으로 변화될 수 있다. 추가 적합한 돌연변이는 His105, Asp135 및 Ser210 중 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기를 반대 성질을 갖는 아미노산으로 변화시키는 것, 예컨대, Asp135를 Lys 또는 Arg으로 변화시키는 것, 극성 His105를 비극성 아미노산, 예컨대, Gly, Ala, Val 또는 Leu으로 변화시키는 것, 작은 친수성 Ser210을 큰 또는 소수성 잔기, 예컨대, Val, Leu, Phe 또는 Tyr으로 변화시키는 것이다. 바람직하게는, DegP 유전자는 도 11에 나타낸 바와 같이 샤페론 활성을 갖지만 단백질분해효소 활성을 갖지 않는 단백질을 생성하는 것으로 발견된 변경 S210A를 포함한다.
DegP는 단백질-단백질 상호작용을 매개하는 2개의 PDZ 도메인, 즉 PDZ1(잔기 260 내지 358) 및 PDZ2(잔기 359 내지 448)를 갖는다. 본 발명의 한 실시양태에서, DegP 유전자는 PDZ1 도메인 및/또는 PDZ2 도메인을 결실하도록 돌연변이된다. PDZ1 및 PDZ2의 결실은 DegP 단백질의 단백질분해효소 활성을 완전히 상실시키고 야생형 DegP 단백질에 비해 샤페론 활성을 낮추지만, PDZ1 또는 PDZ2의 결실은 야생형 DegP 단백질에 비해 5% 단백질분해효소 활성 및 유사한 샤페론 활성을 초래한다.
돌연변이된 DegP 유전자는 예를 들면, 도 11에 나타낸 바와 같이 확인 및 스크리닝 방법에서 도움을 주기 위해 침묵 비천연 발생 제한 부위, 예컨대, AseI도 포함할 수 있다.
점 돌연변이 S210A 및 AseI 제한 마커 부위를 포함하는 돌연변이된 DegP 유전자의 바람직한 서열은 서열번호 31에 제공되어 있고, 코딩된 단백질 서열은 서열번호 27에 제시되어 있다. 서열번호 32의 돌연변이된 DegP 서열에서 만들어진 돌연변이는 도 11에 제시되어 있다.
세포가 샤페론 활성 및 감소된 단백질분해효소 활성을 갖는 DegP 단백질을 코딩하는 돌연변이된 DegP 유전자를 포함하는 본 발명의 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공된 세포들 중 하나 이상의 세포는 DegP 유전자가 DegP를 넉아웃시켜 DegP 발현을 방해하도록, 예컨대, 염색체 결핍 DegP로 돌연변이되어 있는 돌연변이된 세포에 비해 상대적으로 개선된 수율의 정확히 폴딩된 단백질을 그 자신으로부터 제공할 수 있다. DegP 발현을 방해하는 넉아웃 돌연변이된 DegP 유전자를 포함하는 세포에서는 DegP의 샤페론 활성이 완전히 상실되는 반면, 본 발명에 따른 세포에서는 DegP의 샤페론 활성이 보유되지만 전체 단백질분해효소 활성은 상실된다. 이들 실시양태들에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 세포는 단백질의 단백질분해를 방해하도록 보다 낮은 단백질분해효소 활성을 갖지만 숙주 세포에서 단백질의 정확한 폴딩 및 수송을 가능하게 하도록 샤페론 활성을 유지한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 그람 음성 세균 세포는 넉아웃 돌연변이된 OmpT 유전자를 보유하지 않는다(예컨대, 서열번호 39의 염색체 OmpT에서 결핍되어 있지 않다).
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 그람 음성 세균 세포는 넉아웃 돌연변이된 DegP 유전자를 보유하지 않는다(예컨대, 염색체 DegP에서 결핍되어 있지 않다). 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 그람 음성 세균 세포는 돌연변이된 DegP 유전자를 보유하지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 그람 음성 세균 세포는 넉아웃 돌연변이된 ptr 유전자를 보유하지 않는다(예컨대, 염색체 ptr에서 결핍되어 있지 않다).
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 그람 음성 세균 세포는 돌연변이된 spr 유전자를 보유하지 않는다.
임의의 적합한 그람 음성 세균이 본 발명의 재조합 세포의 제조를 위한 모세포로서 사용될 수 있다. 적합한 그람 음성 세균은 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 에르위니아 카로토보라(Erwinia carotovora), 쉬겔라(Shigella), 크렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 레기오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 악시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii) 및 이. 콜라이를 포함한다. 바람직하게는, 모세포는 이. 콜라이이다. 이. 콜라이의 임의의 적합한 균주가 본 발명에 사용될 수 있으나, 바람직하게는 야생형 W3110 균주, 예컨대, K-12 W3110이 사용된다.
이전에 생성되어 재조합 단백질의 발현에 사용된 균주들과 관련된 결점은 세포 대사 및 DNA 복제에 관여하는 유전자, 예를 들면, 이. 콜라이 균주에서 phoA, fhuA, lac, rec, gal, ara, arg, thi 및 pro의 돌연변이의 사용을 포함한다. 이들 돌연변이들은 세포 생장, 안정성, 주변세포질 누출, 재조합 단백질 발현 수율 및 독성에 대한 영향을 비롯한 많은 유해한 영향을 숙주 세포에 미칠 수 있다. 이들 게놈 돌연변이들 중 하나 이상의 게놈 돌연변이를 갖는 균주, 특히 많은 수의 이들 돌연변이들을 갖는 균주는 산업적 단백질 제조에 적합하지 않은 수준까지 세균 생장 속도를 감소시키는 적합도의 상실을 나타낼 수 있다. 또한, 상기 게놈 돌연변이들 중 임의의 게놈 돌연변이는 예측불가능한 유해한 방식으로 시스(cis) 및/또는 트랜스(trans)로 다른 유전자에 영향을 미쳐 균주의 표현형, 적합도 및 단백질 프로파일을 변경시킬 수 있다. 또한, 고도로 돌연변이된 세포의 사용은 상업적 용도, 특히 치료제를 위한 재조합 단백질의 제조에 일반적으로 적합하지 않은데, 이는 이러한 균주가 일반적으로 결함이 있는 대사 경로를 가짐으로써 최소 또는 화학적으로 정의된 배지에서 잘 생장할 수 없거나 전혀 생장할 수 없기 때문이다.
바람직한 실시양태에서, 세포는 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 최소한의 돌연변이만을 보유하고, 임의적으로 감소된 Tsp 단백질분해효소 활성을 초래하는 돌연변이 및 임의적으로 spr 유전자 또는 이의 돌연변이체를 보유한다.
DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 세포의 게놈 내로 삽입되는 한 실시양태에서, DsbC 및/또는 항체를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위해 세포의 게놈에 대한 최소한의 돌연변이만을 만든다. DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 동일한 또는 상이한 발현 벡터에 존재하는 추가 실시양태에서, 게놈은 바람직하게는 야생형 세포 게놈과 동일한 유전자형을 갖는다.
한 실시양태에서, 세포는 세포의 생장 및/또는 관심 있는 단백질을 발현하는 능력에 유해한 영향을 미칠 수 있는 임의의 다른 돌연변이를 보유하지 않는다. 따라서, 본 발명의 재조합 숙주 세포들 중 하나 이상의 재조합 숙주 세포는 게놈 서열에 대한 유전적으로 조작된 돌연변이를 포함하는 세포에 비해 개선된 단백질 발현 및/또는 개선된 생장 특성을 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 제공된 세포는 세포 게놈에 대한 파괴를 포함하는 세포에 비해 치료 단백질의 생성에 사용되기에 더 적합하다.
바람직한 실시양태에서, 상기 세포는 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및 임의적으로 감소된 Tsp 단백질분해효소 활성을 초래하는 돌연변이, 및 임의적으로 spr 유전자 또는 이의 돌연변이체를 제외하고 야생형 이. 콜라이와 동일한 유전자형을 갖는다.
한 실시양태에서, DsbC 및 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하는 데에 적합한 플라스미드와 함께 사용되기 위한 세포로서, 감소된 Tsp 활성 및 spr 유전자 또는 이의 돌연변이체를 제외하고 이. 콜라이 균주 W3110과 동일한 유전자형을 갖는 세포가 제공된다.
보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 세포는 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 제외하고 이. 콜라이 균주 W3110과 동일한 유전자형을 갖는다.
본 발명에 의해 제공된 세포는 CD154에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 항체 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "포함하는 세포"는 관심 있는 물질이 세포의 게놈 내로 도입되어 있는 경우 또는 세포가 상기 물질을 함유하고 일반적으로 발현하기 위한 벡터, 예컨대, 플라스미드를 함유하는 경우를 지칭하기 위한 것이다.
항체 또는 항체 단편은 다가, 다중특이적, 인간화된, 전체 인간 또는 키메라 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 임의의 종으로부터 유래될 수 있으나, 바람직하게는 단일클론 항체, 인간 항체 또는 인간화된 단편으로부터 유래된다. 항체 단편은 임의의 클래스(예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD 또는 IgA) 또는 면역글로불린 분자의 하위클래스로부터 유래될 수 있고 예를 들면, 마우스, 래트, 상어, 토끼, 돼지, 햄스터, 낙타, 라마, 염소 또는 인간을 비롯한 임의의 종으로부터 수득될 수 있다. 항체 단편의 부분은 하나 초과의 종으로부터 수득될 수 있다(예를 들면, 항체 단편은 키메라 항체 단편일 수 있다). 한 예에서, 불변 영역은 한 종으로부터 수득되고, 가변 영역은 또 다른 종으로부터 수득된다.
항체 단편은 국제 특허출원 공보 제WO 2009/040562호에 기재된 바와 같이 VH, VL, VHH, Fab, 변형된 Fab, Fab', F(ab')2 또는 Fv 단편; 경쇄 또는 중쇄 단량체 또는 이량체; 다이아바디(diabody); 트라이아바디(triabody); 테트라바디(tetrabody); 미니바디(minibody); 도메인 항체 또는 단일 쇄 항체, 예를 들면, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인들이 펩티드 연결제에 의해 연결되어 있는 단일 쇄 Fv; Fab-Fv; 또는 이중 특이성 항체, 예컨대, Fab-dAb일 수 있다. 유사하게, 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 적절한 경우 다른 항체 도메인과 조합될 수 있다. 항체 단편은 당분야에서 공지되어 있다(Holliger and Hudson 1126-36).
CD154에 특이적으로 결합하는 항체는 바람직하게는 국제 특허출원 공보 제WO 2008/118356호(이의 내용은 본원에 참고로 도입됨)에 기재된 항체 342이거나 국제 특허출원 공보 제WO 2008/118356호에 기재된 항체 342의 CDR들 또는 가변 중쇄 및 경쇄 영역을 포함한다. CD154에 특이적으로 결합하는 항체 단편은 바람직하게는 국제 특허출원 공보 제WO 2008/118356호에 기재된 항체 342로부터 유래되고/되거나, 상기 항체의 CDR들 또는 가변 중쇄 및 경쇄 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 중쇄를 포함하고, 이때 가변 도메인은 3개의 CDR들을 포함하고, 이때 상기 CDR들은 CDRH1에 대한 서열번호 1, CDRH2에 대한 서열번호 2 및 CDRH3에 대한 서열번호 3으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 경쇄를 포함하고, 이때 가변 도메인은 3개의 CDR들을 포함하고, 이때 상기 CDR들은 CDRL1에 대한 서열번호 4, CDRL2에 대한 서열번호 5 및 CDRL3에 대한 서열번호 6으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 CDRH1에 대한 서열번호 1의 서열, CDRH2에 대한 서열번호 2의 서열 및 CDRH3에 대한 서열번호 3의 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 CDRL1에 대한 서열번호 4의 서열, CDRL2에 대한 서열번호 5의 서열 및 CDRL3에 대한 서열번호 6의 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 CDRH1에 대한 서열번호 1의 서열, CDRH2에 대한 서열번호 2의 서열 및 CDRH3에 대한 서열번호 3의 서열을 포함하는 중쇄, 및 CDRL1에 대한 서열번호 4의 서열, CDRL2에 대한 서열번호 5의 서열 및 CDRL3에 대한 서열번호 6의 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
항체는 바람직하게는 CDR 이식된 항체 분자이고, 전형적으로 가변 도메인은 인간 수용자 골격 영역 및 비인간 공여자 CDR들을 포함한다.
바람직하게는, 항체는 경쇄 가변 도메인(서열번호 7) 및 중쇄 가변 도메인(서열번호 9)을 포함한다.
바람직하게는, 항체는 Fab 단편이다. 바람직하게는, Fab 단편은 서열번호 14로서 제공된 서열을 포함하거나 이 서열로 구성된 중쇄, 및 서열번호 12로서 제공된 서열을 포함하거나 이 서열로 구성된 경쇄를 갖는다. 서열번호 14 및 서열번호 12에 제공된 아미노산 서열들은 바람직하게는 각각 서열번호 13 및 서열번호 11에 제공된 뉴클레오티드 서열들에 의해 코딩된다.
대안적으로, 항체 단편은 변형된 Fab 단편인 것이 바람직하고, 이때 변형은 이펙터 또는 레포터 분자의 부착을 가능하게 하는 하나 이상의 아미노산을 그의 중쇄의 C 말단에 추가하는 것이다. 바람직하게는, 추가 아미노산은 이펙터 또는 레포터 분자가 당분야에서 공지되어 있는 바와 같이 부착될 수 있는 1개 또는 2개의 시스테인 잔기를 함유하는 변형된 힌지 영역을 형성한다(예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 국제 특허출원 공보 제WO 98/25971호 참조).
본 발명에 따른 세포는 항체를 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 바람직하게는, DNA 서열은 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩한다.
한 바람직한 실시양태에서, DNA 서열은 경쇄를 코딩하고 본원에 제시된 서열을 포함한다.
DNA 서열은 예를 들면, 화학적 프로세싱에 의해 생성된 합성 DNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
항체의 불변 영역 도메인은 존재하는 경우 항체 분자의 제안된 기능, 특히 요구될 수 있는 이펙터 기능을 고려하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특히, 인간 IgG 불변 영역 도메인, 특히 항체 분자가 치료 용도를 위한 것이고 항체 이펙터 기능이 요구되는 경우 IgG1 및 IgG3 동종형의 불변 영역 도메인이 사용될 수 있다. 대안적으로, 항체 분자가 치료 목적을 위한 것이고 항체 이펙터 기능이 요구되지 않는 경우, 예를 들면, 단순히 CD154 활성을 차단하기 위한 것인 경우 IgG2 및 IgG4 동종형이 사용될 수 있다.
항체는 염증 질환 및 장애, 면역 질환 및 장애, 섬유증 장애 및 암을 비롯한 질환 또는 장애의 치료에 유용할 수 있다.
용어 "염증 질환" 또는 "자가면역 장애" 및 "면역 질환 또는 장애"는 류마티스성 관절염, 건선 관절염, 강직척추염, 소아 관절염, 스틸병, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 쇼그렌 증후군, 굿파스처 증후군, 애디슨병, ANCA 관련 혈관염 및 베게너 육아종증을 비롯한 혈관염, 일차 담관간경화증, 경화담관염, 자가면역 간염, 류마티스성 다발근육통, 귈랭-바레 증후군, 항인지질 증후군, 특발성 혈소판감소증, 자가면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 심상성천포창, 피부근육염, 수포성유천포창, 헤노흐-쇤라인(Henoch-Schoenlein) 자색반, 머클 웰스병, 건선, 크론병, 궤양성 결장염, SLE(전신홍반루푸스), 복강 질환, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 다발성 경화증, 혈관염, I형 진성당뇨병, 이식 및 이식편-대-숙주 질환을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "섬유증 장애"는 종종 회복 또는 반응 과정으로서, 장기 또는 조직에서 과도한 섬유 결합 조직의 형성 또는 발달을 특징으로 하는 장애를 지칭한다. 섬유증 장애는 단일 장기, 예컨대, 폐(예를 들면, 한정 없이, 특발성 폐 섬유증, 간질성 폐 질환), 간, 장, 신장, 심장 또는 피부에 영향을 미칠 수 있거나 다수의 장기들에 영향을 미칠 수 있다(예를 들면, 한정 없이, 전신 경화증). 용어 섬유증 장애는 피부의 흉터형성과도 관련되어 있다. 피부의 흉터는 켈로이드 흉터, 예를 들면, 한정 없이, 피부 화상 후 발생하는 구축 흉터, 비후 흉터 및 여드름 흉터를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 숙주 세포는 관심 있는 하나 이상의 추가 단백질을 코딩하는 추가 폴리뉴클레오티드도 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 그람 음성 세균 세포는 임의의 적합한 수단에 의해 제조될 수 있다.
당업자는 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 데에 이용될 수 있는 적합한 기법을 알고 있다. DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및/또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 벡터, 예컨대, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌(Link, Phillips, and Church 6228-37)에 기재된 pKO3의 사용을 통해 세포의 게놈 내로 도입될 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및/또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 발현 카세트 내에 도입되지 않은 상태로 존재할 수 있다. 한 실시양태에서, DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 운반하기 위해 전형적으로 DsbC를 코딩하는 단백질 코딩 서열, 항체를 코딩하는 하나 이상의 단백질 코딩 서열 및 하나 이상의 조절 발현 서열을 포함하는 발현 카세트가 본 발명에서 사용된다. 하나 이상의 조절 발현 서열은 프로모터를 포함할 수 있다. 하나 이상의 조절 발현 서열은 3' 비번역 영역, 예컨대, 종결 서열도 포함할 수 있다. 적합한 프로모터는 하기에 보다 상세히 논의되어 있다.
한 실시양태에서, DsbC 및/또는 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 유전자는 숙주 세포의 게놈 내로 도입되어 안정한 세포주를 생성한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 세포는 하나 이상의 발현 벡터, 예컨대, 플라스미드를 포함한다. 상기 벡터는 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 숙주 세포는 바람직하게는 전술된 바와 같이 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 바람직하게는, 상기 발현 벡터는 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 발현 벡터는 이. 콜라이 발현 벡터이다.
한 실시양태에서, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 별도의 발현 벡터 내로 삽입된다.
중쇄 및 경쇄 둘다를 포함하는 생성물의 제조를 위해, 세포주는 2개의 벡터, 즉 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 제1 벡터 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 제2 벡터로 형질전환될 수 있다. 대안적으로, 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터인 단일 벡터가 사용될 수 있다.
대안적으로, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 한 벡터 내로 삽입된다. 바람직하게는, 상기 벡터는 항체의 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다.
본 발명은 DsbC 및 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터도 제공한다. 상기 발현 벡터는 DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 다중시스트론성 벡터이다.
다중시스트론성 벡터는 벡터 내로의 폴리뉴클레오티드 서열들의 반복된 순차적 클로닝을 가능하게 하는 유리한 클로닝 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 방법은 한 쌍의 제한 부위의 상용가능한 코헤시브(cohesive) 말단, 예컨대, AseI 및 NdeI 제한 부위의 "AT" 말단을 사용한다. 코딩 서열을 포함하고 상용가능한 코헤시브 말단, 예컨대, AseI-NdeI 단편을 갖는 폴리뉴클레오티드는 벡터 내의 제한 부위, 예컨대, NdeI 내로 클로닝될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입은 5' 제한 부위를 파괴하지만, 상용가능한 코헤시브 말단을 포함하는 추가 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입하는 데에 사용될 수 있는 새로운 3' 제한 부위, 예컨대, NdeI을 생성한다. 그 후, 상기 과정은 추가 서열을 삽입하기 위해 반복될 수 있다. 벡터 내로 삽입된 각각의 폴리뉴클레오티드 서열은 스크리닝을 위한 SspI 부위, 샤인 달가노(Shine Dalgarno) 리보좀 결합 서열, A 풍부 스페이서 및 개시 코돈을 코딩하는 NdeI 부위를 포함할 수 있는 비코딩 서열을 정지 코돈의 3' 방향에서 포함한다.
항체의 경쇄(LC) 및 항체의 중쇄(HC)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, DsbC 폴리뉴클레오티드 서열 및 추가 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터의 생성의 도식적 표현은 도 1에 제시되어 있다.
본 발명에 따른 세포는 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함한다.
세포가 하기 하나 이상의 추가 단백질도 발현하는 실시양태에서, 하나 이상의 추가 단백질은 DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드와 동일한 벡터 내로 삽입된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있다:
Figure pct00063
단백질 폴딩을 용이하게 할 수 있는 하나 이상의 단백질, 예컨대, FkpA, Skp, SurA, PPiA 및 PPiD;
Figure pct00064
단백질 분비 또는 전위를 용이하게 할 수 있는 하나 이상의 단백질, 예컨대, SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY 및 Lep; 및/또는
Figure pct00065
이황화 결합 형성을 용이하게 할 수 있는 하나 이상의 단백질, 예컨대, DsbA, DsbB, DsbD, DsbG. 대안적으로, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 별도의 벡터 내로 삽입될 수 있다.
발현 벡터는 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 발현 카세트를 적합한 벡터 내로 삽입함으로써 제조될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 유도하기 위한 조절 발현 서열이 발현 벡터 내에 함유될 수 있으므로, 발현 벡터를 완성하기 위해 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역만이 요구될 수 있다.
DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포에 적합한 프로모터의 조절 하에 세포에서 발현되도록 복제가능한 벡터, 전형적으로 자가 복제 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다. 이 목적을 위한 많은 벡터들이 당분야에서 공지되어 있고, 적절한 벡터의 선택은 핵산의 크기 및 특히 세포 유형에 의존할 수 있다.
숙주 세포를 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드로 형질전환시키는 데에 사용될 수 있는 발현 벡터의 예로는 하기 벡터들이 있다:
Figure pct00066
플라스미드, 예컨대, pBR322 또는 pACYC184, 및/또는
Figure pct00067
바이러스 벡터, 예컨대, 세균 파지
Figure pct00068
전위가능한 유전 요소, 예컨대, 트랜스포존(transposon).
이러한 발현 벡터는 통상적으로 플라스미드 DNA 복제 기점, 항생제 선택 마커, 다중클로닝 부위에 의해 분리된 프로모터 및 전사 종결요소(발현 카세트) 및 리보좀 결합 부위를 코딩하는 DNA 서열을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 프로모터는 관련 폴리뉴클레오티드에 직접적으로 연결될 수 있거나, 대안적으로 관련 폴리펩티드가 삽입되어 있는 경우 관련 프로모터가 상기 관련 폴리펩티드에 작용할 수 있도록 적절한 위치, 예를 들면, 벡터 내에 위치할 수 있다. 한 실시양태에서, 프로모터는 그 자신이 작용하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 부분 앞에 위치한다(예를 들면, 관련 프로모터는 폴리뉴클레오티드의 각각의 코딩 부분 앞에 위치한다). 본원에서 사용된 바와 같이, "앞에"는 프로모터가 코딩 폴리뉴클레오티드 부분에 대하여 5 프라임 말단에 위치한다는 것을 함축하기 위한 것이다.
프로모터는 숙주 세포에 대한 내생성 또는 외생성 프로모터일 수 있다. 적합한 프로모터는 lac, tac, trp, phoA, Ipp, Arab, tet 및 T7을 포함한다.
사용된 하나 이상의 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 한 벡터 내에 삽입되는 실시양태에서, DsbC 및 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열들은 단일 프로모터 또는 별도의 프로모터의 조절 하에 놓일 수 있다. DsbC 및 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열들이 별도의 프로모터의 조절 하에 놓이는 실시양태에서, 상기 프로모터는 독립적으로 유도성 프로모터일 수 있다.
세균 시스템에서 사용되는 프로모터는 일반적으로 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인 달가노(S.D.) 서열도 함유한다. 상기 프로모터는 제한효소 분해에 의해 세균 공급원 DNA로부터 제거되어 원하는 DNA를 함유하는 벡터 내로 삽입될 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 국제 특허출원 공보 제WO 03/048208호 또는 제WO 2007/039714호(이들의 내용은 전체적으로 본원에 참고로 도입됨)에 기재된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하기 위한 이시스트론성 메시지(message)도 포함한다. 바람직하게는, 상류 시스트론은 항체의 경쇄를 코딩하는 DNA를 함유하고, 하류 시스트론은 상응하는 중쇄를 코딩하는 DNA를 함유하고, 이시스트론성 유전자간 서열(IGS)은 바람직하게는 IGS1(서열번호 33), IGS2(서열번호 34), IGS3(서열번호 35) 및 IGS4(서열번호 36)로부터 선택된 서열을 포함한다.
바람직하게는, 발현 벡터는 전술된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 및 중쇄를 생성하기 위한 삼시스트론성 메시지, 및 바람직하게는 his 태그를 포함하는 재조합 DsbC를 생성하기 위한 메시지를 포함한다.
종결요소는 숙주 세포에 대한 내생성 또는 외생성 종결요소일 수 있다. 적합한 종결요소는 rrnB이다.
프로모터 및 종결요소를 비롯한 추가 적합한 전사 조절제 및 단백질 표적화 방법은 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌(Makrides 512-38)에서 찾을 수 있다.
발현 벡터 내로 삽입된 DsbC 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 DsbC 신호 서열 및 DsbC 코딩 서열을 코딩하는 핵산을 포함한다. DsbC 단백질은 다른 신호 펩티드, 예를 들면, 하기 단백질들의 신호 펩티드와의 유전적 융합에 의해 주변세포질로 향할 수도 있다: OmpA, MalB, PelB, PhoA, PhoS, LppA, DsbA. 벡터는 바람직하게는 상기 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제될 수 있게 하는, 바람직하게는 숙주 염색체와 무관하게 복제될 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 세균들에 대해 잘 공지되어 있다.
한 실시양태에서, DsbC 및/또는 관심 있는 단백질은 N 말단 및/또는 C 말단에서 히스티딘 태그를 포함한다.
항체 분자는 적합한 신호 서열에 의해 세포로부터 분비될 수 있거나 주변세포질로 표적화될 수 있다. 대안적으로, 항체 분자는 세포의 세포질 내에서 축적될 수 있다. 바람직하게는, 항체 분자는 주변세포질로 표적화된다.
항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또 다른 폴리펩티드, 바람직하게는 신호 서열 또는 성숙 폴리펩티드의 N 말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드와의 융합체로서 발현될 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 신호 서열이어야 한다. 천연 또는 진핵 폴리펩티드 신호 서열을 인식하여 프로세싱하지 못하는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 원핵 신호 서열로 치환된다. 적합한 신호 서열은 OmpA, PhoA, LamB, PelB, DsbA 및 DsbC를 포함한다. 세포가 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 항체의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 실시양태에서, 각각의 폴리뉴클레오티드는 신호 서열, 예컨대, OmpA를 포함할 수 있다.
상기 나열된 성분들 중 하나 이상의 성분을 함유하는 적합한 벡터의 구축은 표준 결찰(ligation) 기법을 이용한다. 단리된 플라스미드 또는 DNA 단편은 절단되고, 다듬어지고, 요구된 플라스미드를 발생시키기 위해 필요한 형태로 재결찰된다. 벡터를 구축할 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 방법 및 배양 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
표준 분자생물학 기법을 이용하여 항체를 코딩하는 DNA 서열을 제조할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 합성 기법을 이용하여 원하는 DNA 서열을 완전히 또는 부분적으로 합성할 수 있다. 적절한 경우 부위 지정된 돌연변이유발 및 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기법을 이용할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 대하여 본원에 기재된 본 발명의 실시양태는, 관련 양태가 본 발명의 대안적 양태에 적용될 수 있는 한, 본 발명의 대안적 실시양태, 예를 들면, 벡터, 발현 카세트, 및/또는 이들에서 사용된 성분을 포함하는 숙주 세포에 동등하게 적용된다.
본 발명은 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법으로서,
CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현하기에 효과적인 조건 하에서 상기 정의된 바와 같은 재조합 그람 음성 세균 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 재조합 그람 음성 세균 세포의 주변세포질 및/또는 배양 배지로부터 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계
를 포함하는 방법도 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법에서 사용되는 그람 음성 세균 세포 및 항체는 상기 상세히 기재되어 있다.
DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 당분야에서 공지되어 있는 임의의 적합한 수단의 사용을 통해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 전형적으로 DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포 내로 형질전환되는 동일한 또는 별도의 발현 벡터의 부분으로서 도입된다.
DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 염화루비듐, PEG 또는 전기천공을 사용하는 표준 기법의 이용을 통해 세포 내로 형질전환될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 관심 있는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 성공적으로 형질전환된 안정한 세포의 선택을 용이하게 하기 위해 선택 시스템도 사용할 수 있다. 선택 시스템은 전형적으로 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 동시형질전환을 사용한다. 한 실시양태에서, 세포 내로 형질전환된 각각의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 따라서, DsbC 및 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 마커를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 형질전환은 함께 일어나고, 선택 시스템은 원하는 단백질을 생성하는 세포를 선택하는 데에 사용될 수 있다.
하나 이상의 마커를 발현할 수 있는 세포는 그 내부에 도입된 선택 시스템(예를 들면, 항생제 내성)의 폴리펩티드/유전자 또는 폴리펩티드 성분에 의해 부여된 성질 때문에 일부 인공적으로 부과된 조건, 예를 들면, 독소 또는 항생제의 첨가 하에서 생존/생장/증식할 수 있다. 하나 이상의 마커를 발현할 수 없는 세포는 인공적으로 부과된 조건 하에서 생존/생장/증식할 수 없다. 인공적으로 부과된 조건은 요구되는 경우 다소 강력하도록 선택될 수 있다.
임의의 적합한 선택 시스템이 본 발명에서 사용될 수 있다. 전형적으로, 선택 시스템은 공지된 항생제에 대한 내성을 제공하는 하나 이상의 유전자, 예를 들면, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 카나마이신 또는 앰피실린 내성 유전자를 벡터 내에 포함시키는 것에 기초할 수 있다. 관련 항생제의 존재 하에서 생장하는 세포는 항생제에 대한 내성을 제공하는 유전자 및 원하는 단백질 둘다를 발현하기 때문에 선택될 수 있다.
항체 및/또는 DsbC를 발현하기 위해 유도성 발현 시스템 또는 항시적 프로모터가 본 발명에서 사용될 수 있다. 적합한 유도성 발현 시스템 및 항시적 프로모터는 당분야에서 잘 공지되어 있다.
DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 동일한 또는 별도의 유도성 프로모터의 조절 하에 있는 한 실시양태에서, 유도제를 배양 배지에 첨가함으로써 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들) 및 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도한다.
임의의 적합한 배지가 형질전환된 세포를 배양하는 데에 사용될 수 있다. 배지는 성공적으로 형질전환된 세포만이 상기 배지에서 생장할 수 있도록 특정 선택 시스템에 맞게 개조될 수 있다(예를 들면, 배지는 항생제를 포함할 수 있다).
배지로부터 수득된 세포는 요구되는 경우 추가 스크리닝 및/또는 정제로 처리될 수 있다. 상기 방법은 요구되는 경우 관심 있는 단백질을 추출하고 정제하는 하나 이상의 단계를 추가로 포함할 수 있다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 세포질, 주변세포질 또는 상청액을 비롯한 균주로부터 회수되고 정제될 수 있다. 적합한 방법은 면역친화성 또는 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 소수성 상호작용 크로마토그래피; 실리카 상에서의 크로마토그래피; 이온 교환 수지, 예컨대, S-세파로스 및 DEAE 상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; 황산암모늄 침전; 및 겔 여과를 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 DsbC로부터 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 통상적인 항체 정제 절차, 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 단백질 G 크로마토그래피, 단백질 L 크로마토그래피, 티오친화성(thiophilic) 혼합 모드 수지, His 태그, FLAG 태그, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 친화성 크로마토그래피, 황산암모늄, 에탄올 또는 PEG 분획화/침전, 이온 교환 막, 팽창 층 흡착 크로마토그래피(EBA) 또는 모의 이동 층 크로마토그래피에 의해 배양 배지 및/또는 세포질 추출물 및/또는 주변세포질 추출물로부터 적합하게 분리될 수 있다.
상기 방법은 관심 있는 단백질의 발현 양을 측정하고 높은 발현 수준의 관심 있는 단백질을 갖는 세포를 선택하는 추가 단계도 포함할 수 있다.
본원에 기재된 하나 이상의 방법 단계는 적합한 용기, 예컨대, 생물반응기에서 함께 수행될 수 있다.
발현 후, 항체는 예를 들면, 또 다른 물질, 예컨대, 이펙터 분자에의 접합에 의해 더 프로세싱될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 이펙터 분자를 항체에 부착시키는 추가 단계를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 이펙터 분자는 예를 들면, 항신생물성 약제, 약물, 독소(예컨대, 세균 또는 식물 유래의 효소 활성 독소 및 이의 단편, 예를 들면, 리신 및 이의 단편), 생물학적 활성 단백질, 예를 들면, 효소, 다른 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 천연 발생 중합체, 핵산 및 이의 단편, 예를 들면, DNA, RNA 및 이들의 단편, 방사성핵종, 특히 방사성 요오다이드, 방사성 동위원소, 킬레이팅된 금속, 나노입자 및 레포터 기, 예컨대, 형광 화합물, 또는 NMR 또는 ESR 분광법에 의해 검출될 수 있는 화합물을 포함한다. 이펙터 분자는 임의의 적합한 방법에 의해 항체 또는 이의 단편에 부착될 수 있다(예를 들면, 항체 단편은 국제 특허출원 공보 제WO 2005/003171호 또는 제WO 2005/003170호(이들의 내용은 전체적으로 본원에 참고로 도입됨)에 기재된 바와 같이 하나 이상의 이펙터 분자에 부착되도록 변형될 수 있다). 국제 특허출원 공보 제WO 2005/003171호 또는 제WO 2005/003170호는 적합한 이펙터 분자도 기술한다.
항체는 공유가교 구조에 의해 그 자신에 부착된, 중금속 원자의 킬레이팅을 위한 거대환, 또는 독소, 예컨대, 리신을 가질 수 있다. 대안적으로, 재조합 DNA 기술의 절차를 이용하여, 완전한 면역글로불린 분자의 Fc 단편(CH2, CH3 및 힌지 도메인), CH2 및 CH3 도메인, 또는 CH3 도메인이 기능성 비면역글로불린 단백질, 예컨대, 효소 또는 독소 분자로 치환되어 있거나 펩티드 연결에 의해 상기 기능성 비면역글로불린 단백질에 부착되어 있는 항체 분자를 제조할 수 있다. 항체가 이펙터 또는 레포터 분자의 부착을 가능하게 하도록 그의 중쇄의 C 말단에서 하나 이상의 아미노산을 갖는 변형된 Fab 단편인 실시양태에서, 추가 아미노산은 바람직하게는 이펙터 또는 레포터 분자가 부착될 수 있는 1개 또는 2개의 시스테인 잔기를 함유하는 변형된 힌지 영역을 형성한다.
바람직한 이펙터 기는 변형된 Fab 단편에 부착되어 생체내에서 그의 반감기를 증가시킬 수 있는 중합체 분자이다.
일반적으로, 중합체 분자는 합성 또는 천연 발생 중합체, 예를 들면, 임의적으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체, 또는 분지된 또는 비분지된 다당류, 예를 들면, 동종 또는 이종 다당류일 수 있다.
상기 언급된 합성 중합체 상에 존재할 수 있는 구체적인 임의적 치환기는 하나 이상의 하이드록시, 메틸 또는 메톡시 기를 포함한다. 합성 중합체의 구체적인 예로는 임의적으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜), 폴리(비닐알코올) 또는 이들의 유도체, 특히 임의적으로 치환된 폴리(에틸렌글리콜), 예컨대, 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이들의 유도체가 있다. 구체적인 천연 발생 중합체는 락토스, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐 또는 이들의 유도체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "유도체"는 반응성 유도체, 예를 들면, 티올 선택적 반응성 기, 예컨대, 말레이미드 등을 포함하기 위한 것이다. 반응성 기는 직접적으로 또는 연결제 절편을 통해 중합체에 연결될 수 있다. 이러한 기의 잔기는 몇몇 경우 항체 단편과 중합체 사이의 연결 기로서 생성물의 부분을 형성할 것이라는 것이 인식될 것이다.
중합체의 크기는 원하는 경우 변경될 수 있으나, 일반적으로 500 Da 내지 50000 Da, 바람직하게는 5000 Da 내지 40000 Da, 보다 바람직하게는 25000 Da 내지 40000 Da의 평균 분자량 범위 내에 있을 것이다. 중합체 크기는 특히 생성물의 의도된 용도에 기초하여 선택될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 생성물이 순환계를 떠나 조직을 침투하기 위한 것, 예를 들면, 염증의 치료에 사용되기 위한 것인 경우, 예를 들면, 약 5000 Da의 분자량을 갖는 저분자량 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 생성물이 순환계에 남는 적용의 경우, 예를 들면, 25000 Da 내지 40000 Da 범위 내의 분자량을 갖는 고분자량 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다.
특히 바람직한 중합체는 폴리알킬렌 중합체, 예컨대, 폴리(에틸렌글리콜) 또는 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이들의 유도체, 특히 약 25000 Da 내지 약 40000 Da 범위 내의 분자량을 갖는 폴리알킬렌 중합체를 포함한다.
변형된 항체 단편에 부착된 각각의 중합체 분자는 상기 단편 내에 위치하는 시스테인 잔기의 황 원자에 공유연결될 수 있다. 공유연결은 일반적으로 이황화 결합 또는 특히 황-탄소 결합일 것이다.
원하는 경우, 항체 단편은 그 자신에 부착된 하나 이상의 이펙터 또는 레포터 분자를 가질 수 있다. 이펙터 또는 레포터 분자는 단편 내에 위치하는 임의의 이용가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용기, 예를 들면, 임의의 자유 아미노, 이미노, 하이드록실 또는 카복실 기를 통해 항체 단편에 부착될 수 있다. 하나 이상의 이펙터 또는 레포터 분자가 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 C 말단에 또는 C 말단 쪽에 존재하는 아미노산에 부착될 수 있다.
활성화된 중합체는 전술된 바와 같은 중합체 변형된 항체 단편의 제조에 있어서 출발 물질로서 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 티올 반응성 기, 예컨대, α-할로카복실산 또는 에스테르, 예를 들면, 요오도아세트아미드, 이미드, 예를 들면, 말레이미드, 비닐 설폰 또는 다이설파이드를 함유하는 임의의 중합체일 수 있다. 이러한 출발 물질은 (예를 들면, 쉐어워터 폴리머스 인코포레이티드(Shearwater Polymers Inc.)(미국 알라바마주 헌츠빌 소재)로부터) 상업적으로 입수될 수 있거나 통상적인 화학적 절차의 이용을 통해 상업적으로 입수가능한 출발 물질로부터 제조될 수 있다.
이펙터 또는 레포터 분자에 연결된 항체 단편을 수득하기를 원하는 경우, 이것은 적절한 경우 활성화된 중합체와 반응시키기 전 또는 후에 항체 단편을 직접적으로 또는 커플링제를 통해 이펙터 또는 레포터 분자에 연결하는 표준 화학적 또는 재조합 DNA 절차에 의해 제조될 수 있다. 구체적인 화학적 절차는 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO 93/62331호 및 제WO 92/22583호에 기재된 화학적 절차를 포함한다. 대안적으로, 이펙터 또는 레포터 분자가 단백질 또는 폴리펩티드인 경우, 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO 86/01533호 및 유럽 특허출원 제0392745호에 기재된 바와 같이 재조합 DNA 절차를 이용하여 상기 연결을 달성할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법에 의해 제공된 변형된 Fab 단편은 유럽 특허출원 제0948544호에 개시된 방법에 따라 PEG화된다(즉, 그 자신에 공유부착된 PEG(폴리(에틸렌글리콜))을 갖는다). 바람직하게는, 항체는 도 2에 나타낸 바와 같은 PEG화된 변형된 Fab 단편이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 변형된 Fab 단편은 중쇄의 변경된 힌지 영역의 C 말단에 존재하는 시스테인 잔기들 중 하나에 부착된 라이실-말레이미드 유도체 기를 갖고, 이때 라이실 잔기의 2개 아미노 기 각각은 그 자신에 공유연결된 약 20000 Da의 분자량을 갖는 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 가지므로, 상기 메톡시폴리(에틸렌글리콜)의 총 평균 분자량은 약 40000 Da이고, 보다 바람직하게는 라이실-말레이미드 유도체 기는 [1-[[[2-[[3-(2,5-다이옥소-1-피롤리디닐)-1-옥소프로필]아미노]에틸]아미노]-카보닐]-1,5-펜탄다이일]비스(이미노카보닐)이다. 라이신 잔기는 말레이미드 기에 공유연결된다. 대략 20000 Da의 분자량을 갖는 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 중합체가 라이신 잔기 상의 아민 기 각각에 부착된다. 따라서, 전체 이펙터 분자량의 총 분자량은 대략 40000 Da이다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 라이실-말레이미드 기를 중쇄의 C 말단에 존재하는 시스테인 잔기들 중 하나에 부착시키는 단계를 포함하고, 이때 라이실 잔기의 각각의 아미노 기는 그 자신에 공유연결된 약 20000 Da의 분자량을 갖는 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 갖는다.
한 실시양태에서, 아미노산 태그를 C 말단 또는 N 말단에 추가함으로써 오염 숙주 단백질의 물성을 변경한다. 바람직한 실시양태에서, 변경되는 물성은 등전점이고, 아미노산 태그는 C 말단에 부착된 폴리아스파르트산 태그이다. 한 실시양태에서, 상기 태그의 추가에 의해 변경된 이. 콜라이 단백질은 다이펩티드 결합 단백질(DppA), 말토스 결합 단백질(MBP), 티오레독신 및 포스페이트 결합 단백질(PhoS/PstS)이다. 한 특정 실시양태에서, 6개의 아스파르트산 잔기를 함유하는 폴리아스파르트산 태그(폴리D)를 C 말단에 추가함으로써 이. 콜라이 포스페이트 결합 단백질(PhoS/PstS)의 pI를 7.2에서 5.1로 감소시킨다.
오염 이. 콜라이 단백질의 물성을 변경시키기 위해 단독으로 또는 N 또는 C 말단 태그의 추가와 함께 이용되는 상기 오염 이. 콜라이 단백질의 특정 잔기의 변형도 바람직하다. 이러한 변화는 단백질의 크기를 변경시키기 위한 삽입 또는 결실, 또는 pI 또는 소수성을 변경시키기 위한 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 이들 잔기들은 단백질의 표면 상에 위치한다. 바람직한 실시양태에서, PhoS 단백질의 표면 잔기가 상기 단백질의 pI를 감소시키기 위해 변경된다. 바람직하게는, 기능성 PhoS 단백질을 유지하기 위해 포스페이트 결합에 중요한 것으로 시사되어 있는 잔기(미국 특허 제5,304,472호 참조)는 피해야 한다.
실시예
세포주
모든 실험들을 위해, 이. 콜라이 세포주 W3110을 모 야생형 세포주로서 사용하였다.
하기 돌연변이를 보유하는 세포주를 생성하였다:
a. 돌연변이된 Tsp 유전자;
b. 돌연변이된 Tsp 유전자 및 재조합 DsbC를 보유함;
c. 돌연변이된 Tsp 유전자 및 돌연변이된 spr 유전자; 또는
d. 돌연변이된 Tsp 및 유전자 돌연변이된 spr 유전자, 및 재조합 DsbC를 보유함.
실시예 1 - 돌연변이된 Tsp 유전자를 보유하는 세포주 MXE001 (Δ Tsp )의 발생
MXE001 균주를 다음과 같이 발생시켰다:
Tsp 카세트를 SalI 및 NotI 제한 단편으로서 유사하게 제한된 pKO3 플라스미드 내로 이동시켰다. 상기 pKO3 플라스미드는 염색체 도입 사건을 촉진하고 선택하기 위해 클로람페니콜 마커와 함께 pSC101 복제 기점(RepA)의 감열성 돌연변이체를 사용한다. 레반수크라제(evansucrase)를 코딩하는 sacB 유전자는 수크로스 상에서 생장하는 이. 콜라이에게 치명적이므로 (클로람페니콜 마커 및 pSC101 기점과 함께) 붕괴 및 플라스미드 제거(curing) 사건을 촉진하고 선택하는 데에 사용된다. 이 방법은 이미 기재되어 있다(Hamilton et al. 4617-22; Blomfield et al. 1447-57). pKO3 시스템은 삽입된 유전자를 제외하고 숙주 게놈으로부터 모든 선택 마커를 제거한다.
하기 플라스미드를 구축하였다:
EcoRI 및 AseI 제한 마커를 포함하는 서열번호 28에 제시된 바와 같은 넉아웃 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 pMXE191
그 다음, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌(Miller and Nickoloff 105-13)에서 발견된 방법을 이용하여 제조한 전기형질전환능(electro-competent) 이. 콜라이 W3110 세포 내로 상기 플라스미드를 형질전환시켰다.
1일째 날: 2500 V, 25 μF 및 200 Ω에서 전기천공을 수행하기 전에 40 ㎕의 이. 콜라이 세포를 냉각된 바이오라드 0.2 cm 전기천공 큐벳 내에서 (10 pg) 1 ㎕의 pKO3 DNA와 혼합하였다. 1000 ㎕의 2xPY를 즉시 첨가하고 30℃의 항온처리기 내에서 250 rpm으로 1시간 동안 진탕함으로써 세포를 회수하였다. 세포를 2xPY로 연속적으로 1/10 희석한 후, 100 ㎕의 분취액을 30℃ 및 43℃에서 미리 가온된 20 ㎍/㎖의 클로람페니콜을 함유하는 2xPY 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 30℃ 및 43℃에서 밤새 항온처리하였다.
2일째 날: 30℃에서 생장된 콜로니의 수는 전기천공의 효율의 추정치를 제공하였지만, 43℃에서 생존하여 생장된 콜로니는 잠재적인 도입 사건을 나타낸다. 43℃ 플레이트로부터 단일 콜로니를 골라내어 10 ㎖의 2xPY에 재현탁하였다. 100 ㎕의 이 현탁액을 30℃로 미리 가온된 5%(중량/부피) 수크로스를 함유하는 2xPY 한천 플레이트 상에 플레이팅하여 단일 콜로니를 발생시켰다. 플레이트를 30℃에서 밤새 항온처리하였다.
3일째 날: 여기서 콜로니는 잠재적인 동시적 붕괴 및 플라스미드 제거 사건을 나타낸다. 상기 붕괴 및 제거 사건이 생장기 초기에 발생하였다면, 대부분의 콜로니 덩어리는 클론일 것이다. 단일 콜로니를 골라내고 복제물을 20 ㎍/㎖의 클로람페니콜 또는 5%(중량/부피) 수크로스를 함유하는 2xPY 한천 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 30℃에서 밤새 항온처리하였다.
4일째 날: 수크로스 상에서 생장하고 클로람페니콜 상에서 사멸한 콜로니는 잠재적인 염색체 치환 및 플라스미드 제거 사건을 나타낸다. 이들을 골라내고 돌연변이 특이적 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR로 스크리닝하였다. 정확한 크기의 양성 PCR 밴드를 발생시킨 콜로니를 스트리킹하여 5%(중량/부피) 수크로스를 함유하는 2xPY 한천 상에서 단일 콜로니를 생성하였고, 플레이트를 30℃에서 밤새 항온처리하였다.
5일째 날: PCR 양성, 클로람페니콜 민감성 및 수크로스 내성 이. 콜라이의 단일 콜로니를 사용하여 글리세롤 스톡(stock) 화학적 형질전환능 세포를 만들고 5' 및 3' 플랭킹 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR 반응을 위한 PCR 주형으로서 사용하여, Taq 중합효소를 사용하는 직접적인 DNA 서열결정을 위한 PCR 생성물을 발생시켰다.
올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 비천연 발생 AseI 제한 부위를 포함하는 Tsp 유전자(서열번호 28)의 영역을 PCR로 증폭함으로써 돌연변이된 Tsp 유전자를 보유하는 게놈 DNA의 성공적인 변형을 확인하기 위해 세포주 MXE001을 시험하였다. 그 다음, AseI 제한효소와 함께 항온처리하기 전 및 후에 DNA의 증폭된 영역을 겔 전기영동으로 분석하여, 돌연변이된 유전자 내의 비천연 발생 AseI 제한 부위의 존재를 확인하였다. 이 방법을 다음과 같이 수행하였다:
PCR을 이용하여 하기 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써, MXE001 및 W3110으로부터 제조된 이. 콜라이 세포 용해물로부터의 게놈 DNA를 증폭하였다:
6284 Tsp 3' 5'-GCATCATAATTTTCTTTTTACCTC-3'(서열번호 47)
6283 Tsp 5' 5'-GGGAAATGAACCTGAGCAAAACGC-3'(서열번호 48)
상기 용해물은 세포의 단일 콜로니를 20 ㎕의 1 x PCR 완충제에서 95℃에서 10분 동안 가열함으로써 제조하였다. 혼합물을 실온까지 냉각시킨 후 13,200 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 "세포 용해물"로서 표지하였다.
Tsp 올리고뉴클레오티드 쌍을 사용하여 각각의 균주를 증폭하였다.
표준 PCR 절차를 이용하여 DNA를 증폭하였다.
5 ㎕ 완충제 x10(로슈(Roche))
1 ㎕ dNTP 혼합물(로슈, 10 mM 혼합물)
1.5 ㎕ 5' 올리고뉴클레오티드(5 pmol)
1.5 ㎕ 3' 올리고뉴클레오티드(5 pmol)
2 ㎕ 세포 용해물
0.5 ㎕ Taq DNA 중합효소(로슈, 5 U/㎕)
38.5 ㎕ H2O
PCR 주기
94℃ 1분
94℃ 1분
55℃ 1분(30주기 동안 반복됨)
72℃ 1분
72℃ 10분
일단 반응이 완결되면, AseI로 분해하기 위해 25 ㎕를 새로운 마이크로원심분리 튜브로 옮겼다. 19 ㎕의 H2O, 5 ㎕의 완충제 3(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)®) 및 1 ㎕의 AseI(뉴 잉글랜드 바이오랩스®)을 25 ㎕의 PCR 반응물에 첨가하고 혼합하고 37℃에서 2시간 동안 항온처리하였다.
5 ㎕의 적재 완충제(x6)를 남은 PCR 반응물에 첨가하고 20 ㎕를 0.8% TAE 200 ㎖ 아가로스 겔(인비트로겐(Invitrogen)®) 플러스 에티듐 브로마이드(5 ㎕의 10 mg/㎖ 스톡) 상에 적재하고 100 V에서 1시간 동안 런닝시켰다. 10 ㎕의 크기 마커(퍼펙트(Perfect) DNA 마커 0.1 내지 12 Kb, 노바겐(Novagen)®)를 마지막 레인에 적재하였다.
일단 AseI 분해가 완결되면, 10 ㎕의 적재 완충제(x6)를 첨가하고 20 ㎕를 0.8% TAE 아가로스 겔(인비트로겐®) 플러스 에티듐 브로마이드(5 ㎕의 10 mg/㎖ 스톡) 상에 적재하고 100 V에서 1시간 동안 런닝시켰다. 10 ㎕의 크기 마커(퍼펙트 DNA 마커 0.1 내지 12 Kb, 노바겐®)를 마지막 레인에 적재하였다. UV 투과조명기를 이용하여 상기 두 겔을 가시화하였다.
증폭된 게놈 단편은 Tsp에 대한 2.8 Kb의 정확한 크기 밴드를 보여주었다. AseI로 분해한 후, 이것은 도입된 AseI 부위가 Tsp 결핍 균주 MXE001에 존재하지만 W3110 대조군에는 존재하지 않는다는 것을 확인시켜주었다.
MXE001: Tsp 프라이머 세트를 사용하여 게놈 DNA를 증폭하고 생성된 DNA를 AseI로 분해하여 2.2 및 0.6 Kbps 밴드를 생성하였다.
W3110 PCR 증폭된 DNA는 AseI 제한효소에 의해 분해되지 않았다.
실시예 2 - 돌연변이된 spr 유전자를 보유하는 세포주 및 돌연변이된 Tsp 유전자 및 돌연변이된 spr 유전자를 보유하는 세포주의 발생
spr 돌연변이를 발생시키고 보완 어세이를 이용하여 선택하였다.
1000 bp 당 1개 내지 2개의 돌연변이를 도입하는 클론텍(Clontech)® 무작위 돌연변이유발 다양성 PCR 키트를 사용하여 spr 유전자(서열번호 23)를 돌연변이시켰다. 돌연변이된 spr PCR DNA를 spr 돌연변이체와 함께 (국제 특허출원 공보 제WO 01/94585호에 기재된 바와 같이) CDP870 Fab'를 발현하는 유도성 발현 벡터[pTTO CDP870] 내로 클로닝하였다. 그 다음, 이 결찰물을 문헌(Miller and Nickoloff 105-13)에서 발견된 방법의 이용을 통해 제조된 Tsp의 결실 변이체(ΔTsp)를 포함하는 이. 콜라이 균주(디자인된 MXE001) 내로 전기형질전환시켰다. 하기 프로토콜을 이용하였다: 40 ㎕의 전기형질전환능 MXE001 및 2.5 ㎕의 결찰물(100 pg의 DNA)을 0.2 cm 전기천공 큐벳에 첨가하고, 하기 조건과 함께 바이오라드® 진펄서 엑스셀(Genepulser Xcell)®을 이용하여 전기형질전환을 수행하였다: 2500 V, 25 μF 및 200 Ω. 전기형질전환 후, 1 ㎖의 S.OC. 배지(인비트로겐® 카달로그: 18045-088)(37℃까지 미리 가온됨)를 첨가하고 세포를 회수하기 위해 약하게 교반하면서 37℃에서 1시간 동안 방치하였다.
세포를 저장성 한천[5 g/ℓ 효모 추출물, 2.5 g/ℓ 트립톤, 15 g/ℓ 한천(모두 딥코(Difco)® 제품)] 상에 플레이팅하고 40℃에서 항온처리하였다. 콜로니를 형성한 세포를 43℃에서 HLB 상에 다시 플레이팅함으로써 MXE001 균주에 대해 고온에서 낮은 삼투 조건 하에서 생장하는 능력의 회복을 확인하였다. 선택된 클론으로부터 플라스미드 DNA를 제조하고 서열결정하여 spr 돌연변이를 확인하였다.
이 방법을 이용하여, ΔTsp 표현형을 보완하는, spr 단백질 내의 하기 8개 단일 돌연변이, 1개 이중 돌연변이 및 2개 다중 돌연변이를 단리하였다:
1. V98E
2. D133A
3. V135D
4. V135G
5. G147C
6. S95F 및 Y115F
7. I70T
8. N31T, Q73R, R100G, G140C
9. R62C, Q99P, R144C
10. L108S
11. L136P
상기 확인된 개별 돌연변이 1 내지 5, 및 spr의 3개 촉매 트라이어드 돌연변이(C94A, H145A, H157A) 및 W174R은 spr 돌연변이된 균주 또는 실시예 1의 MXE001 균주를 생성하여 조합된 ΔTsp/돌연변이체 spr 균주를 제조하기 위해 야생형 W3110 이. 콜라이 균주(유전형: F- LAM- IN(rrnD-rrnE)1 rph1(ATCC 카달로그 번호 27325))를 사용하여 신규 균주를 발생시키는 데에 사용되었다.
MXE001의 발생에 대해 실시예 1에 기재된 바와 같이 pKO3 상동성 재조합/치환 플라스미드(상기 문헌(Link et al.))를 사용하는 유전자 치환 벡터 시스템을 사용하여 하기 돌연변이체 이. 콜라이 세포 균주를 발생시켰다.
Figure pct00069
돌연변이체 spr 도입 카세트를 SalI 및 NotI 제한 단편으로서 유사하게 제한된 pKO3 플라스미드 내로 이동시켰다.
모든 실험들을 위해, 이 콜라이 세포주 W3110을 야생형 세포주로서 사용하였고, 이. 콜라이 세포주 W3110 ΔTsp, spr C94A(MX016)를 사용하였다.
실시예 3 - 항- CD154 Fab' 및 DsbC 발현을 위한 플라스미드의 발생
항-CD154 Fab의 중쇄 및 경쇄 서열(각각 서열번호 13 및 서열번호 11) 및 DsbC를 코딩하는 서열(서열번호 27)을 함유하는 플라스미드를 구축하였다.
통상적인 제한 클로닝 방법을 이용하여 항-CD154 Fab 및 DsbC(주변세포질 폴리펩티드)에 대한 발현 벡터인 플라스미드 pMXE351(pTTOD_DsbC)을 구축하였다. 플라스미드 pMXE351은 하기 특징을 함유하였다: 강한 tac 프로모터 및 lac 오퍼레이터 서열. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 플라스미드는 Fab' 중쇄의 코딩 영역 다음의 유일한 EcoRI 제한 부위에 이어서 비코딩 서열 및 그 다음 유일한 NdeI 제한 부위를 함유하였다. 주형으로서 W3110 미정제 염색체 DNA를 사용하여 DsbC 유전자를 PCR 클로닝하였다. PCR 생성물이 5' EcoRI 부위에 이어서 강한 리보좀 결합 부위, 이어서 천연 개시 코돈, C 말단 His 태그로 종결하는 DsbC의 신호 서열 및 성숙 서열, 및 최종적으로 비코딩 NdeI 부위를 코딩하도록 PCR 중첩 연장으로 야생형 DsbC 서열로부터 EcoRI 부위를 제거하였다. EcoRI-NdeI PCR 단편을 제한절단하고, 모든 3개의 폴리펩티드들, 즉 Fab' 경쇄, Fab' 중쇄 및 DsbC가 단일 다중시스트론성 mRNA 상에 코딩되도록 발현 벡터 내로 결찰시켰다.
Fab 경쇄 및 중쇄 유전자, 및 DsbC 유전자는 단일 다중시스트론성 메시지로서 전사되었다. 이. 콜라이 OmpA 단백질의 신호 펩티드를 코딩하는 DNA를 경쇄 및 중쇄 유전자 서열들 둘다의 5' 말단에 융합시켜 폴리펩티드가 이. 콜라이 주변세포질로 전위되게 하였다. 이중 전사 종결요소 rrnB t1t2를 사용하여 전사를 종결시켰다. lacIq 유전자는 항시적으로 발현되는 Lac I 억제인자(represssor) 단백질을 코딩하였다. 이것은 탈억제가 알로락토스 또는 IPTG의 존재에 의해 유도될 때까지 tac 프로모터로부터의 전사를 억제하였다. 사용된 복제 기점은 낮은 카피 수를 유지하는 p15A이었다. 상기 플라스미드는 항생제 선택을 위한 테트라사이클린 내성 유전자를 함유하였다.
실시예 4 - 이. 콜라이 W3110 및 MXE016(이. 콜라이 W3110 Δ Tsp , spr C94A )에서의 항- CD154 Fab' 및 DsbC 의 발현
이. 콜라이 W3110 Δ Tsp , spr C94A 에서의 항- CD154 Fab' 및 DsbC 의 발현
이. 콜라이 W3110 ΔTsp, spr C94A 세포 균주(MXE016)를 실시예 3에서 발생된 플라스미드 pMXE351로 형질전환시켰다. 문헌(Chung, Niemela, and Miller 2172-75)에서 발견된 방법을 이용하여 상기 균주의 형질전환을 수행하였다.
이. 콜라이 W3110에서의 항-CD154 Fab'의 발현
통상적인 제한 클로닝 방법을 이용하여 구축한 항-CD154 Fab'에 대한 발현 벡터인 플라스미드 pTTOD를 사용하여 이. 콜라이 W3110 세포 균주를 형질전환시켰다. 플라스미드 pTTOD는 하기 특징을 함유하였다: 강한 tac 프로모터 및 lac 오퍼레이터 서열. Fab 경쇄 및 중쇄 유전자는 단일 이시스트론성 메시지로서 전사되었다. 이. 콜라이 OmpA 단백질의 신호 펩티드를 코딩하는 DNA를 경쇄 및 중쇄 유전자 서열들 둘다의 5' 말단에 융합시켜 폴리펩티드가 이. 콜라이 주변세포질로 전위되게 하였다. 이중 전사 종결요소 rrnB t1t2를 사용하여 전사를 종결시켰다. lacIq 유전자는 항시적으로 발현되는 Lac I 억제인자 단백질을 코딩하였다. 이것은 탈억제가 알로락토스 또는 IPTG의 존재에 의해 유도될 때까지 tac 프로모터로부터의 전사를 억제하였다. 사용된 복제 기점은 낮은 카피 수를 유지하는 p15A이었다. 상기 플라스미드는 항생제 선택을 위한 테트라사이클린 내성 유전자를 함유하였다. 문헌(Chung, Niemela, and Miller 2172-75)에서 발견된 방법을 이용하여 상기 균주의 형질전환을 수행하였다.
실시예 5 - 고밀도 발효를 이용한 돌연변이된 이. 콜라이 균주의 생장 및 돌연변이된 이. 콜라이 균주에서의 항-CD154 Fab'의 발현
생장과 항-CD154 Fab'의 발현을 비교하는 발효 실험에서 실시예 4에서 제조된 균주를 시험하였다:
생장 배지, 접종물 및 발효 단계. 세포 은행의 바이알로부터 접종물을 준비하고 생산 발효기의 시딩 전에 여러 예비배양 단계(플라스크 및 반응기)를 통해 증폭함으로써 발효 과정을 개시한다. 생산 발효기에서, 세포를 정의된 배지에서 회분식 및 유가배양식으로 고밀도까지 생장시킨다. 원하는 세포 밀도에 도달될 때, IPTG를 첨가하여 Fab'의 발현을 유도한다. Fab' 발현은 이. 콜라이 주변세포질 공간으로 표적화되는데, 이때 Fab'는 유도기 과정 전체에 걸쳐 축적된다. 발현 및 세포 생장을 조절하기 위해 유도기 동안 탄소원 공급물을 적용한다. 최적 배양 조건 내에서 배양을 유지하기 위해 온도, 용존 산소(pO2) 및 pH를 조절한다.
생체물질( biomass ) 농도 및 생장 속도의 측정. 600 nm에서 배양물의 광학 밀도를 측정함으로써 생체물질 농도를 결정하였다.
주변세포질 추출. 원심분리로 배양 샘플로부터 세포를 수집하였다. 추가 분석을 위해 상청액 분획을 (-20℃에서) 보관하였다. 세포 펠렛 분획을 추출 완충제(100 mM 트리스-HCl, 10 mM EDTA; pH 7.4)에 원래 배양 부피까지 재현탁하였다. 60℃에서 대략 10시간 내지 16시간 동안 유도한 후, 원심분리로 추출물을 정화하였고 상청액 분획을 즉석에서 사용하였거나 분석을 위해 (-20℃에서) 보관하였다.
Fab' 정량. 단백질 G HPLC를 이용하여 주변세포질 추출물 및 배양물 상청액 중의 Fab' 농도를 측정하였다. 하이트랩(HiTrap)® 단백질-G HP 1 ㎖ 컬럼(지이-헬쓰케어(GE-Healthcare)® 또는 등가물)을 2 ㎖/분의 속도로 분석물(대략 중성 pH, 30℃, 0.2 ㎛ 필터로 여과됨)로 적재하고, 상기 컬럼을 20 mM 인산염 및 50 mM NaCl(pH 7.4)으로 세척한 후, 50 mM 글리신/HCl(pH 2.7)의 주입을 이용하여 Fab'를 용출하였다. 용출된 Fab'를 아질런트(Agilent)® 1100 또는 1200 HPLC 시스템 상에서 A280으로 측정하고 공지된 농도의 정제된 Fab' 단백질의 표준 곡선을 참조하여 정량하였다.
실시예 6 - 돌연변이된 이. 콜라이 균주의 발효 추출물 중의 경쇄 단편의 수준
실시예 2에 제공된 발효를 주변세포질 추출물 중의 항-CD154 Fab'의 경쇄 단편 수준에 대해 시험하였다.
경쇄 단편 정량. Fab' 및 Fab' 단백질분해 단편의 수준의 정량적 평가를 고온 역상 HPLC로 달성하였다. 80℃의 온도에서 포로쉘(Poroshell)® 300SB-C8 역상 컬럼(아질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies)®, 제품 번호 660750-906) 상에서 분리를 수행한다. 평형화 용매는 HPLC 물 및 0.1%(부피/부피) TFA이고, 용출 용매는 80:20(부피/부피) 1-프로판올:아세토니트릴 및 0.03%(부피/부피) TFA이다. 4.4분 이내에 16% 내지 38% 용매 B의 선형 구배를 이용하여 분리를 2.0 ㎖/분의 유속으로 수행한다. 214 nm에서 UV 흡광도로 검출하였다. 데이터를 수동 적분으로 프로세싱하였고, Fab 단백질분해 단편의 양을 온전한 Fab 피크에 비해 상대적인 % 피크 면적으로서 표현하였다.
본 발명은 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명의 방법에 의해 제조된 항체를 포함하는 치료 또는 진단 조성물도 제공한다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 항체를 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 혼합하는 단계를 포함하는, 치료 또는 진단 조성물의 제조 방법도 제공한다.
본 발명이 바람직한 실시양태에 대하여 구체적으로 제시되고 기재되어 있지만, 당업자는 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항에서의 다양한 변화를 만들 수 있다는 것을 이해할 것이다.
Figure pct00070
Figure pct00071
SEQUENCE LISTING <110> UCB Pharma, S.A. <120> BACTERIAL HOST STRAIN EXPRESSING RECOMBINANT ANTIBODY FRAGMENT <130> G0157 WO <150> EP11173880.3 <151> 2011-07-13 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 342 CDR-H1 <400> 1 Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr His Val His 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 342 CDR-H2 <400> 2 Val Ile Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 342 CDR-H3 <400> 3 Gln Leu Thr His Tyr Tyr Val Leu Ala Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 342 CDR-L1 <400> 4 Arg Ala Ser Glu Asp Leu Tyr Tyr Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 342 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gaa atc aaa cgt acg gta gcg 396 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 gcc cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct 444 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag 492 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc 540 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc 588 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 160 165 170 175 agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc 636 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tca cca gta aca aaa 684 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 agt ttt aat aga ggg gag 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atg cca agc ctt gca ccg atg ctc gaa aag gtg 144 Thr Thr Ala Gln Gln Met Pro Ser Leu Ala Pro Met Leu Glu Lys Val 35 40 45 atg cct tca gtg gtc agc att aac gta gaa ggt agc aca acc gtt aat 192 Met Pro Ser Val Val Ser Ile Asn Val Glu Gly Ser Thr Thr Val Asn 50 55 60 acg ccg cgt atg ccg cgt aat ttc cag cag ttc ttc ggt gat gat tct 240 Thr Pro Arg Met Pro Arg Asn Phe Gln Gln Phe Phe Gly Asp Asp Ser 65 70 75 80 ccg ttc tgc cag gaa ggt tct ccg ttc cag agc tct ccg ttc tgc cag 288 Pro Phe Cys Gln Glu Gly Ser Pro Phe Gln Ser Ser Pro Phe Cys Gln 85 90 95 ggt ggc cag ggc ggt aat ggt ggc ggc cag caa cag aaa ttc atg gcg 336 Gly Gly Gln Gly Gly Asn Gly Gly Gly Gln Gln Gln Lys Phe Met Ala 100 105 110 ctg ggt tcc ggc gtc atc att gat gcc gat aaa ggc tat gtc gtc acc 384 Leu Gly Ser Gly Val Ile Ile Asp Ala Asp Lys Gly Tyr Val Val Thr 115 120 125 aac aac cac gtt gtt gat aac gcg acg gtc att aaa gtt caa ctg agc 432 Asn Asn His Val Val Asp Asn Ala Thr Val Ile Lys Val Gln Leu Ser 130 135 140 gat ggc cgt aag ttc gac gcg aag atg gtt ggc aaa gat ccg cgc tct 480 Asp Gly Arg Lys Phe Asp Ala Lys Met Val Gly Lys Asp Pro Arg Ser 145 150 155 160 gat atc gcg ctg atc caa atc cag aac ccg aaa aac ctg acc gca att 528 Asp Ile Ala Leu Ile Gln Ile Gln Asn Pro Lys Asn Leu Thr Ala Ile 165 170 175 aag atg gcg gat tct gat gca ctg cgc gtg ggt gat tac acc gta gcg 576 Lys Met Ala Asp Ser Asp Ala Leu Arg Val Gly Asp Tyr Thr Val Ala 180 185 190 att ggt aac ccg ttt ggt ctg ggc gag acg gta act tcc ggg att gtc 624 Ile Gly Asn Pro Phe Gly Leu Gly Glu Thr Val Thr Ser Gly Ile Val 195 200 205 tct gcg ctg ggg cgt agc ggc ctg aat gcc gaa aac tac gaa aac ttc 672 Ser Ala Leu Gly Arg Ser Gly Leu Asn Ala Glu Asn Tyr Glu Asn Phe 210 215 220 atc cag acc gat gca gcg att aat cgt ggt aac gcc ggt ggt gcg ctg 720 Ile Gln Thr Asp Ala Ala Ile Asn Arg Gly Asn Ala Gly Gly Ala Leu 225 230 235 240 gtt aac ctg aac ggc gaa ctg atc ggt atc aac acc gcg atc ctc gca 768 Val Asn Leu Asn Gly Glu Leu Ile Gly Ile Asn Thr Ala Ile Leu Ala 245 250 255 ccg gac ggc ggc aac atc ggt atc ggt ttt gct atc ccg agt aac atg 816 Pro Asp Gly Gly Asn Ile Gly Ile Gly Phe Ala Ile Pro Ser Asn Met 260 265 270 gtg aaa aac ctg acc tcg cag atg gtg gaa tac ggc cag gtg aaa cgc 864 Val Lys Asn Leu Thr Ser Gln Met Val Glu Tyr Gly Gln Val Lys Arg 275 280 285 ggt gag ctg ggt att atg ggg act gag ctg aac tcc gaa ctg gcg aaa 912 Gly Glu Leu Gly Ile Met Gly Thr Glu Leu Asn Ser Glu Leu Ala Lys 290 295 300 gcg atg aaa gtt gac gcc cag cgc ggt gct ttc gta agc cag gtt ctg 960 Ala Met Lys Val Asp Ala Gln Arg Gly Ala Phe Val Ser Gln Val Leu 305 310 315 320 cct aat tcc tcc gct gca aaa gcg ggc att aaa gcg ggt gat gtg atc 1008 Pro Asn Ser Ser Ala Ala Lys Ala Gly Ile Lys Ala Gly Asp Val Ile 325 330 335 acc tca ctg aac ggt aag ccg atc agc agc ttt gcc gca ctg cgt gct 1056 Thr Ser Leu Asn Gly Lys Pro Ile Ser Ser Phe Ala Ala Leu Arg Ala 340 345 350 cag gtg ggt act atg ccg gta ggc agc aaa ctg acc ctg ggc tta ctg 1104 Gln Val Gly Thr Met Pro Val Gly Ser Lys Leu Thr Leu Gly Leu Leu 355 360 365 cgc gac ggt aag cag gtt aac gtg aac ctg gaa ctg cag cag agc agc 1152 Arg Asp Gly Lys Gln Val Asn Val Asn Leu Glu Leu Gln Gln Ser Ser 370 375 380 cag aat cag gtt gat tcc agc tcc atc ttc aac ggc att gaa ggc gct 1200 Gln Asn Gln Val Asp Ser Ser Ser Ile Phe Asn Gly Ile Glu Gly Ala 385 390 395 400 gag atg agc aac aaa ggc aaa gat cag ggc gtg gta gtg aac aac gtg 1248 Glu Met Ser Asn Lys Gly Lys Asp Gln Gly Val Val Val Asn Asn Val 405 410 415 aaa acg ggc act ccg gct gcg cag atc ggc ctg aag aaa ggt gat gtg 1296 Lys Thr Gly Thr Pro Ala Ala Gln Ile Gly Leu Lys Lys Gly Asp Val 420 425 430 att att ggc gcg aac cag cag gca gtg aaa aac atc gct gaa ctg cgt 1344 Ile Ile Gly Ala Asn Gln Gln Ala Val Lys Asn Ile Ala Glu Leu Arg 435 440 445 aaa gtt ctc gac agc aaa ccg tct gtg ctg gca ctc aac att cag cgc 1392 Lys Val Leu Asp Ser Lys Pro Ser Val Leu Ala Leu Asn Ile Gln Arg 450 455 460 ggc gac agc acc atc tac ctg tta atg cag taa 1425 Gly Asp Ser Thr Ile Tyr Leu Leu Met Gln 465 470 <210> 32 <211> 474 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Met Lys Lys Thr Thr Leu Ala Leu Ser Ala Leu Ala Leu Ser Leu Gly 1 5 10 15 Leu Ala Leu Ser Pro Leu Ser Ala Thr Ala Ala Glu Thr Ser Ser Ala 20 25 30 Thr Thr Ala Gln Gln Met Pro Ser Leu Ala Pro Met Leu Glu Lys Val 35 40 45 Met Pro Ser Val Val Ser Ile Asn Val Glu Gly Ser Thr Thr Val Asn 50 55 60 Thr Pro Arg Met Pro Arg Asn Phe Gln Gln Phe Phe Gly Asp Asp Ser 65 70 75 80 Pro Phe Cys Gln Glu Gly Ser Pro Phe Gln Ser Ser Pro Phe Cys Gln 85 90 95 Gly Gly Gln Gly Gly Asn Gly Gly Gly Gln Gln Gln Lys Phe Met Ala 100 105 110 Leu Gly Ser Gly Val Ile Ile Asp Ala Asp Lys Gly Tyr Val Val Thr 115 120 125 Asn Asn His Val Val Asp Asn Ala Thr Val Ile Lys Val Gln Leu Ser 130 135 140 Asp Gly Arg Lys Phe Asp Ala Lys Met Val Gly Lys Asp Pro Arg Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Leu Ile Gln Ile Gln Asn Pro Lys Asn Leu Thr Ala Ile 165 170 175 Lys Met Ala Asp Ser Asp Ala Leu Arg Val Gly Asp Tyr Thr Val Ala 180 185 190 Ile Gly Asn Pro Phe Gly Leu Gly Glu Thr Val Thr Ser Gly Ile Val 195 200 205 Ser Ala Leu Gly Arg Ser Gly Leu Asn Ala Glu Asn Tyr Glu Asn Phe 210 215 220 Ile Gln Thr Asp Ala Ala Ile Asn Arg Gly Asn Ala Gly Gly Ala Leu 225 230 235 240 Val Asn Leu Asn Gly Glu Leu Ile Gly Ile Asn Thr Ala Ile Leu Ala 245 250 255 Pro Asp Gly Gly Asn Ile Gly Ile Gly Phe Ala Ile Pro Ser Asn Met 260 265 270 Val Lys Asn Leu Thr Ser Gln Met Val Glu Tyr Gly Gln Val Lys Arg 275 280 285 Gly Glu Leu Gly Ile Met Gly Thr Glu Leu Asn Ser Glu Leu Ala Lys 290 295 300 Ala Met Lys Val Asp Ala Gln Arg Gly Ala Phe Val Ser Gln Val Leu 305 310 315 320 Pro Asn Ser Ser Ala Ala Lys Ala Gly Ile Lys Ala Gly Asp Val Ile 325 330 335 Thr Ser Leu Asn Gly Lys Pro Ile Ser Ser Phe Ala Ala Leu Arg Ala 340 345 350 Gln Val Gly Thr Met Pro Val Gly Ser Lys Leu Thr Leu Gly Leu Leu 355 360 365 Arg Asp Gly Lys Gln Val Asn Val Asn Leu Glu Leu Gln Gln Ser Ser 370 375 380 Gln Asn Gln Val Asp Ser Ser Ser Ile Phe Asn Gly Ile Glu Gly Ala 385 390 395 400 Glu Met Ser Asn 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tgacgaggat tatataatga 60 agaaaactgc tatagcaatt g 81 <210> 37 <211> 954 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(954) <400> 37 atg cgg gcg aaa ctt ctg gga ata gtc ctg aca acc cct att gcg atc 48 Met Arg Ala Lys Leu Leu Gly Ile Val Leu Thr Thr Pro Ile Ala Ile 1 5 10 15 agc tct ttt gct tct acc gag act tta tcg ttt act cct gac aac ata 96 Ser Ser Phe Ala Ser Thr Glu Thr Leu Ser Phe Thr Pro Asp Asn Ile 20 25 30 aat gcg gac att agt ctt gga act ctg agc gga aaa aca aaa gag cgt 144 Asn Ala Asp Ile Ser Leu Gly Thr Leu Ser Gly Lys Thr Lys Glu Arg 35 40 45 gtt tat cta gcc gaa gaa gga ggc cga aaa gtc agt caa ctc gac tgg 192 Val Tyr Leu Ala Glu Glu Gly Gly Arg Lys Val Ser Gln Leu Asp Trp 50 55 60 aaa ttc aat aac gct gca att att aaa ggt gca att aat tgg gat ttg 240 Lys Phe Asn Asn Ala Ala Ile Ile Lys Gly Ala Ile Asn Trp Asp Leu 65 70 75 80 atg ccc cag ata tct atc ggg gct gct ggc tgg aca act ctc ggc agc 288 Met Pro Gln Ile Ser Ile Gly Ala Ala Gly Trp Thr Thr Leu Gly Ser 85 90 95 cga 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ggt tat tac gtc aca cct aac gca aaa gtt tat gtt gaa ggc gca 816 Ala Gly Tyr Tyr Val Thr Pro Asn Ala Lys Val Tyr Val Glu Gly Ala 260 265 270 tgg aat cgg gtt acg aat aaa aaa ggt aat act tca ctt tat gat cac 864 Trp Asn Arg Val Thr Asn Lys Lys Gly Asn Thr Ser Leu Tyr Asp His 275 280 285 aat aat aac act tca gac tac agc aaa aat gga gca ggt ata gaa aac 912 Asn Asn Asn Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Asn Gly Ala Gly Ile Glu Asn 290 295 300 tat aac ttc atc act act gct ggt ctt aag tac aca ttt taa 954 Tyr Asn Phe Ile Thr Thr Ala Gly Leu Lys Tyr Thr Phe 305 310 315 <210> 40 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 40 Ile Arg Ala Lys Leu Leu Gly Ile Val Leu Thr Thr Pro Ile Ala Ile 1 5 10 15 Ser Ser Phe Ala Ser Thr Glu Thr Leu Ser Phe Thr Pro Asp Asn Ile 20 25 30 Asn Ala Asp Ile Ser Leu Gly Thr Leu Ser Gly Lys Thr Lys Glu Arg 35 40 45 Val Tyr Leu Ala Glu Glu Gly Gly Arg Lys Val Ser Gln Leu Asp Trp 50 55 60 Lys Phe Asn Asn Ala Ala Ile Ile Lys Gly Ala Ile Asn Trp Asp 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Lys Gly Ala Ile Asn Trp Asp Leu 65 70 75 80 atg ccc cag ata tct atc ggg gct gct ggc tgg aca act ctc ggc agc 288 Met Pro Gln Ile Ser Ile Gly Ala Ala Gly Trp Thr Thr Leu Gly Ser 85 90 95 cga ggt ggc aat atg gtc gat cag gac tgg atg gat tcc agt aac ccc 336 Arg Gly Gly Asn Met Val Asp Gln Asp Trp Met Asp Ser Ser Asn Pro 100 105 110 gga acc tgg acg gat gaa agt aga cac cct gat aca caa ctc aat tat 384 Gly Thr Trp Thr Asp Glu Ser Arg His Pro Asp Thr Gln Leu Asn Tyr 115 120 125 gcc aac gaa ttt gat ctg aat atc aaa ggc tgg ctc ctc aac gaa ccc 432 Ala Asn Glu Phe Asp Leu Asn Ile Lys Gly Trp Leu Leu Asn Glu Pro 130 135 140 aat tac cgc ctg gga ctc atg gcc gga tat cag gaa agc cgt tat agc 480 Asn Tyr Arg Leu Gly Leu Met Ala Gly Tyr Gln Glu Ser Arg Tyr Ser 145 150 155 160 ttt aca gcc aga ggt ggt tcc tat atc tac agt tct gag gag gga ttc 528 Phe Thr Ala Arg Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Ser Ser Glu Glu Gly Phe 165 170 175 aga gat gat atc ggc tcc ttc ccg aat gga gaa aga gca atc ggc tac 576 Arg Asp Asp Ile Gly Ser Phe Pro Asn Gly Glu Arg Ala Ile Gly Tyr 180 185 190 aaa caa cgt ttt aaa atg ccc tac att ggc ttg act gga agt tat cgt 624 Lys Gln Arg Phe Lys Met Pro Tyr Ile Gly Leu Thr Gly Ser Tyr Arg 195 200 205 tat gaa gat ttt gaa ctc ggt ggc aca ttt aaa tac agc ggc tgg gtg 672 Tyr Glu Asp Phe Glu Leu Gly Gly Thr Phe Lys Tyr Ser Gly Trp Val 210 215 220 gaa tca tct gat aac gct gaa gct tat gac ccg gga aaa aga atc act 720 Glu Ser Ser Asp Asn Ala Glu Ala Tyr Asp Pro Gly Lys Arg Ile Thr 225 230 235 240 tat cgc agt aag gtc aaa gac caa aat tac tat tct gtt gca gtc aat 768 Tyr Arg Ser Lys Val Lys Asp Gln Asn Tyr Tyr Ser Val Ala Val Asn 245 250 255 gca ggt tat tac gtc aca cct aac gca aaa gtt tat gtt gaa ggc gca 816 Ala Gly Tyr Tyr Val Thr Pro Asn Ala Lys Val Tyr Val Glu Gly Ala 260 265 270 tgg aat cgg gtt acg aat aaa aaa ggt aat act tca ctt tat gat cac 864 Trp Asn Arg Val Thr Asn Lys Lys Gly Asn Thr Ser Leu Tyr Asp His 275 280 285 aat aat aac act tca gac tac agc aaa aat gga gca ggt ata gaa aac 912 Asn Asn Asn Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Asn Gly Ala Gly Ile Glu Asn 290 295 300 tat aac ttc atc act act gct ggt ctt aag tac aca ttt taa 954 Tyr Asn Phe Ile Thr Thr Ala Gly Leu Lys Tyr Thr Phe 305 310 315 <210> 42 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 42 Met Arg Ala Lys Leu Leu Gly Ile Val Leu Thr Thr Pro Ile Ala Ile 1 5 10 15 Ser Ser Phe Ala Ser Thr Glu Thr Leu Ser Phe Thr Pro Asp Asn Ile 20 25 30 Asn Ala Asp Ile Ser Leu Gly Thr Leu Ser Gly Lys Thr Lys Glu Arg 35 40 45 Val Tyr Leu Ala Glu Glu Gly Gly Arg Lys Val Ser Gln Leu Asp Trp 50 55 60 Lys Phe Asn Asn Ala Ala Ile Ile Lys Gly Ala Ile Asn Trp Asp Leu 65 70 75 80 Met Pro Gln Ile Ser Ile Gly Ala Ala Gly Trp Thr Thr Leu Gly Ser 85 90 95 Arg Gly Gly Asn Met Val Asp Gln Asp Trp Met Asp Ser Ser Asn Pro 100 105 110 Gly Thr Trp Thr Asp Glu Ser Arg His Pro Asp Thr Gln Leu Asn Tyr 115 120 125 Ala Asn Glu Phe Asp Leu Asn Ile Lys Gly Trp Leu Leu Asn Glu Pro 130 135 140 Asn Tyr Arg Leu Gly Leu Met Ala Gly Tyr Gln Glu Ser Arg Tyr Ser 145 150 155 160 Phe Thr Ala Arg Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Ser Ser Glu Glu Gly Phe 165 170 175 Arg Asp Asp Ile Gly Ser Phe Pro Asn Gly Glu Arg Ala Ile Gly Tyr 180 185 190 Lys Gln Arg Phe Lys Met Pro Tyr Ile Gly Leu Thr Gly Ser Tyr Arg 195 200 205 Tyr Glu Asp Phe Glu Leu Gly Gly Thr Phe Lys Tyr Ser Gly Trp Val 210 215 220 Glu Ser Ser Asp Asn Ala Glu Ala Tyr Asp Pro Gly Lys Arg Ile Thr 225 230 235 240 Tyr Arg Ser Lys Val Lys Asp Gln Asn Tyr Tyr Ser Val Ala Val Asn 245 250 255 Ala Gly Tyr Tyr Val Thr Pro Asn Ala Lys Val Tyr Val Glu Gly Ala 260 265 270 Trp Asn Arg Val Thr Asn Lys Lys Gly Asn Thr Ser Leu Tyr Asp His 275 280 285 Asn Asn Asn Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Asn Gly Ala Gly Ile Glu Asn 290 295 300 Tyr Asn Phe Ile Thr Thr Ala Gly Leu Lys Tyr Thr Phe 305 310 315 <210> 43 <211> 711 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(711) <400> 43 atg aag aaa ggt ttt atg ttg ttt act ttg tta gcg gcg ttt tca ggc 48 Met Lys Lys Gly Phe Met Leu Phe Thr Leu Leu Ala Ala Phe Ser Gly 1 5 10 15 ttt gct cag gct gat gac gcg gca att caa caa acg tta gcc aaa atg 96 Phe Ala Gln Ala Asp Asp Ala Ala Ile Gln Gln Thr Leu Ala Lys Met 20 25 30 ggc atc aaa agc agc gat att cag ccc gcg cct gta gct ggc atg aag 144 Gly Ile Lys Ser Ser Asp Ile Gln Pro Ala Pro Val Ala Gly Met Lys 35 40 45 aca gtt ctg act aac agc ggc gtg ttg tac atc acc gat gat ggt aaa 192 Thr Val Leu Thr Asn Ser Gly Val Leu Tyr Ile Thr Asp Asp Gly Lys 50 55 60 cat atc att cag ggg cca atg tat gac gtt agt ggc acg gct ccg gtc 240 His Ile Ile Gln Gly Pro Met Tyr Asp Val Ser Gly Thr Ala Pro Val 65 70 75 80 aat gtc acc aat aag atg ctg tta aag cag ttg aat gcg ctt gaa aaa 288 Asn Val Thr Asn Lys Met Leu Leu Lys Gln Leu Asn Ala Leu Glu Lys 85 90 95 gag atg atc gtt tat aaa gcg ccg cag gaa aaa cac gtc atc acc gtg 336 Glu Met Ile Val Tyr Lys Ala Pro Gln Glu Lys His Val Ile Thr Val 100 105 110 ttt act gat att acc tgt ggt tac tgc cac aaa ctg cat gag caa atg 384 Phe Thr Asp Ile Thr Cys Gly Tyr Cys His Lys Leu His Glu Gln Met 115 120 125 gca gac tac aac gcg ctg ggg atc acc gtg cgt tat ctt gct ttc ccg 432 Ala Asp Tyr Asn Ala Leu Gly Ile Thr Val Arg Tyr Leu Ala Phe Pro 130 135 140 cgc cag ggg ctg gac agc gat gca gag aaa gaa atg aaa gct atc tgg 480 Arg Gln Gly Leu Asp Ser Asp Ala Glu Lys Glu Met Lys Ala Ile Trp 145 150 155 160 tgt gcg aaa gat aaa aac aaa gcg ttt gat gat gtg atg gca ggt aaa 528 Cys Ala Lys Asp Lys Asn Lys Ala Phe Asp Asp Val Met Ala Gly Lys 165 170 175 agc gtc gca cca gcc agt tgc gac gtg gat att gcc gac cat tac gca 576 Ser Val Ala Pro Ala Ser Cys Asp Val Asp Ile Ala Asp His Tyr Ala 180 185 190 ctt ggc gtc cag ctt ggc gtt agc ggt act ccg gca gtt gtg ctg agc 624 Leu Gly Val Gln Leu Gly Val Ser Gly Thr Pro Ala Val Val Leu Ser 195 200 205 aat ggc aca ctt gtt ccg ggt tac cag ccg ccg aaa gag atg aaa gaa 672 Asn Gly Thr Leu Val Pro Gly Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Met Lys Glu 210 215 220 ttt ctc gac gaa cac caa aaa atg acc agc ggt aaa taa 711 Phe Leu Asp Glu His Gln Lys Met Thr Ser Gly Lys 225 230 235 <210> 44 <211> 236 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 44 Met Lys Lys Gly Phe Met Leu Phe Thr Leu Leu Ala Ala Phe Ser Gly 1 5 10 15 Phe Ala Gln Ala Asp Asp Ala Ala Ile Gln Gln Thr Leu Ala Lys Met 20 25 30 Gly Ile Lys Ser Ser Asp Ile Gln Pro Ala Pro Val Ala Gly Met Lys 35 40 45 Thr Val Leu Thr Asn Ser Gly Val Leu Tyr Ile Thr Asp Asp Gly Lys 50 55 60 His Ile Ile Gln Gly Pro Met Tyr Asp Val Ser Gly Thr Ala Pro Val 65 70 75 80 Asn Val Thr Asn Lys Met Leu Leu Lys Gln Leu Asn Ala Leu Glu Lys 85 90 95 Glu Met Ile Val Tyr Lys Ala Pro Gln Glu Lys His Val Ile Thr Val 100 105 110 Phe Thr Asp Ile Thr Cys Gly Tyr Cys His Lys Leu His Glu Gln Met 115 120 125 Ala Asp Tyr Asn Ala Leu Gly Ile Thr Val Arg Tyr Leu Ala Phe Pro 130 135 140 Arg Gln Gly Leu Asp Ser Asp Ala Glu Lys Glu Met Lys Ala Ile Trp 145 150 155 160 Cys Ala Lys Asp Lys Asn Lys Ala Phe Asp Asp Val Met Ala Gly Lys 165 170 175 Ser Val Ala Pro Ala Ser Cys Asp Val Asp Ile Ala Asp His Tyr Ala 180 185 190 Leu Gly Val Gln Leu Gly Val Ser Gly Thr Pro Ala Val Val Leu Ser 195 200 205 Asn Gly Thr Leu Val Pro Gly Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Met Lys Glu 210 215 220 Phe Leu Asp Glu His Gln Lys Met Thr Ser Gly Lys 225 230 235 <210> 45 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DsbC comprising his-tag and lacking an EcoRI restriction site <220> <221> CDS <222> (1)..(729) <400> 45 atg aag aaa ggt ttt atg ttg ttt act ttg tta gcg gcg ttt tca ggc 48 Met Lys Lys Gly Phe Met Leu Phe Thr Leu Leu Ala Ala Phe Ser Gly 1 5 10 15 ttt gct cag gct gat gac gcg gca att caa caa acg tta gcc aaa atg 96 Phe Ala Gln Ala Asp Asp Ala Ala Ile Gln Gln Thr Leu Ala Lys Met 20 25 30 ggc atc aaa agc agc gat att cag ccc gcg cct gta gct ggc atg aag 144 Gly Ile Lys Ser Ser Asp Ile Gln Pro Ala Pro Val Ala Gly Met Lys 35 40 45 aca gtt ctg act aac agc ggc gtg ttg tac atc acc gat gat ggt aaa 192 Thr Val Leu Thr Asn Ser Gly Val Leu Tyr Ile Thr Asp Asp Gly Lys 50 55 60 cat atc att cag ggg cca atg tat gac gtt agt ggc acg gct ccg gtc 240 His Ile Ile Gln Gly Pro Met Tyr Asp Val Ser Gly Thr Ala Pro Val 65 70 75 80 aat gtc acc aat aag atg ctg tta aag cag ttg aat gcg ctt gaa aaa 288 Asn Val Thr Asn Lys Met Leu Leu Lys Gln Leu Asn Ala Leu Glu Lys 85 90 95 gag atg atc gtt tat aaa gcg ccg cag gaa aaa cac gtc atc acc gtg 336 Glu Met Ile Val Tyr Lys Ala Pro Gln Glu Lys His Val Ile Thr Val 100 105 110 ttt act gat att acc tgt ggt tac tgc cac aaa ctg cat gag caa atg 384 Phe Thr Asp Ile Thr Cys Gly Tyr Cys His Lys Leu His Glu Gln Met 115 120 125 gca gac tac aac gcg ctg ggg atc acc gtg cgt tat ctt gct ttc ccg 432 Ala Asp Tyr Asn Ala Leu Gly Ile Thr Val Arg Tyr Leu Ala Phe Pro 130 135 140 cgc cag ggg ctg gac agc gat gca gag aaa gaa atg aaa gct atc tgg 480 Arg Gln Gly Leu Asp Ser Asp Ala Glu Lys Glu Met Lys Ala Ile Trp 145 150 155 160 tgt gcg aaa gat aaa aac aaa gcg ttt gat gat gtg atg gca ggt aaa 528 Cys Ala Lys Asp Lys Asn Lys Ala Phe Asp Asp Val Met Ala Gly Lys 165 170 175 agc gtc gca cca gcc agt tgc gac gtg gat att gcc gac cat tac gca 576 Ser Val Ala 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Asn Lys Met Leu Leu Lys Gln Leu Asn Ala Leu Glu Lys 85 90 95 Glu Met Ile Val Tyr Lys Ala Pro Gln Glu Lys His Val Ile Thr Val 100 105 110 Phe Thr Asp Ile Thr Cys Gly Tyr Cys His Lys Leu His Glu Gln Met 115 120 125 Ala Asp Tyr Asn Ala Leu Gly Ile Thr Val Arg Tyr Leu Ala Phe Pro 130 135 140 Arg Gln Gly Leu Asp Ser Asp Ala Glu Lys Glu Met Lys Ala Ile Trp 145 150 155 160 Cys Ala Lys Asp Lys Asn Lys Ala Phe Asp Asp Val Met Ala Gly Lys 165 170 175 Ser Val Ala Pro Ala Ser Cys Asp Val Asp Ile Ala Asp His Tyr Ala 180 185 190 Leu Gly Val Gln Leu Gly Val Ser Gly Thr Pro Ala Val Val Leu Ser 195 200 205 Asn Gly Thr Leu Val Pro Gly Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Met Lys Glu 210 215 220 Phe Leu Asp Glu His Gln Lys Met Thr Ser Gly Lys His His His His 225 230 235 240 His His <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 6283 Tsp 3' <400> 47 gcatcataat tttcttttta cctc 24 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 6283 Tsp 5' <400> 48 gggaaatgaa cctgagcaaa acgc 24 <210> 49 <211> 3120 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (206)..(3091) <223> preprotease III (AA -23 to 939) <220> <221> sig_peptide <222> (206)..(274) <220> <221> mat_peptide <222> (275)..(3091) <223> protease III (AA 1 - 939) <300> <308> GenBank / X06227 <309> 2005-04-18 <313> (1)..(3120) <400> 49 ttaccgctgt ttcgctttaa tcagtcatga gtgctgtata aaaattgcgc aatctatccg 60 cttactttat gatgcgcacc agtcacggac tgatggttat ataaacatag gctgactcct 120 gcagcacaag attaaattct ggcagatgat ttgcgttaac gtgttgaatc tggacagaaa 180 attaagttga ttatgaggtc cgtga atg ccc cgc agc acc tgg ttc aaa gca 232 Met Pro Arg Ser Thr Trp Phe Lys Ala -20 -15 tta ttg ttg tta gtt gcc ctt tgg gca ccc tta agt cag gca gaa acg 280 Leu Leu Leu Leu Val Ala Leu Trp Ala Pro Leu Ser Gln Ala Glu Thr -10 -5 -1 1 gga tgg cag ccg att cag gaa acc atc cgt aaa agt gat aaa gat aac 328 Gly Trp Gln Pro Ile Gln Glu Thr Ile Arg Lys Ser Asp Lys Asp Asn 5 10 15 cgc cag tat cag gct ata cgt ctg gat aac ggt atg gtg gtc ttg ctg 376 Arg Gln Tyr Gln Ala Ile Arg Leu Asp Asn Gly Met Val Val Leu Leu 20 25 30 gtt tct gat ccg cag gca gtt aaa tcg ctc tcg gcg ctg gtg gtg ccc 424 Val Ser Asp Pro Gln Ala Val Lys Ser Leu Ser Ala Leu Val Val Pro 35 40 45 50 gtt ggg tcg ctg gaa gat ccc gag gcg tac cag ggg ctg gca cat tac 472 Val Gly Ser Leu Glu Asp Pro Glu Ala Tyr Gln Gly Leu Ala His Tyr 55 60 65 ctt gaa cat atg agt ctg atg ggg tcg aaa aag tac ccg cag gct gac 520 Leu Glu His Met Ser Leu Met Gly Ser Lys Lys Tyr Pro Gln Ala Asp 70 75 80 agt ctg gcc gaa tat ctc aaa atg cac ggc ggt agt cac aat gcc agc 568 Ser Leu Ala Glu Tyr Leu Lys Met His Gly Gly Ser His Asn Ala Ser 85 90 95 act gcg ccg tat cgc acg gct ttc tat ctg gaa gtt gag aac gac gcc 616 Thr Ala Pro Tyr Arg Thr Ala Phe Tyr Leu Glu Val Glu Asn Asp Ala 100 105 110 ttg cct ggt gcg gta gac cgc ctg gcc gat gct att gct gaa cct ttg 664 Leu Pro Gly Ala Val Asp Arg Leu Ala Asp Ala Ile Ala Glu Pro Leu 115 120 125 130 ctc gac aag aaa tat gcc gaa cgt gag cgt aat gcg gtg aac gct gaa 712 Leu Asp Lys Lys Tyr Ala Glu Arg Glu Arg Asn Ala Val Asn Ala Glu 135 140 145 tta acc atg gcg cgt acg cgt gac ggg atg cgc atg gca cag gtc agc 760 Leu Thr Met Ala Arg Thr Arg Asp Gly Met Arg Met Ala Gln Val Ser 150 155 160 gca gaa acc att aac ccg gca cac ccc ggt tca aag ttt tct ggt ggt 808 Ala Glu Thr Ile Asn Pro Ala His Pro Gly Ser Lys Phe Ser Gly Gly 165 170 175 aac ctc gaa act tta agc gac aaa cct ggt aat ccg gtg cag cag gcg 856 Asn Leu Glu Thr Leu Ser Asp Lys Pro Gly Asn Pro Val Gln Gln Ala 180 185 190 ctg aaa gat ttc cac gag aag tac tat tcc gcc aat ttg atg aag gcg 904 Leu Lys Asp Phe His Glu Lys Tyr Tyr Ser Ala Asn Leu Met Lys Ala 195 200 205 210 gtt att tac agt aat aaa ccg ctg ccg gag ttg gca aaa atg gcg gcg 952 Val Ile Tyr Ser Asn Lys Pro Leu Pro Glu Leu Ala Lys Met Ala Ala 215 220 225 gac acc ttt ggt cgc gtg ccg aac aaa gag agc aaa aaa ccg gaa atc 1000 Asp Thr Phe Gly Arg Val Pro Asn Lys Glu Ser Lys Lys Pro Glu Ile 230 235 240 acc gtg ccg gta gtc acc gac gcg caa aag ggc att atc att cat tac 1048 Thr Val Pro Val Val Thr Asp Ala Gln Lys Gly Ile Ile Ile His Tyr 245 250 255 gtc cct gcg ctg ccg cgt aaa gtg ttg cgc gtt gag ttt cgc atc gat 1096 Val Pro Ala Leu Pro Arg Lys Val Leu Arg Val Glu Phe Arg Ile Asp 260 265 270 aac aac tca gcg aag ttc cgt agt aaa acc gat gaa ttg att acc tat 1144 Asn Asn Ser Ala Lys Phe Arg Ser Lys Thr Asp Glu Leu Ile Thr Tyr 275 280 285 290 ctg att ggc aat cgc agc cca ggt aca ctt tct gac tgg ctg caa aag 1192 Leu Ile Gly Asn Arg Ser Pro Gly Thr Leu Ser Asp Trp Leu Gln Lys 295 300 305 cag gga tta gtt gag ggc att agc gcc aac tcc gat cct atc gtc aac 1240 Gln Gly Leu Val Glu Gly Ile Ser Ala Asn Ser Asp Pro Ile Val Asn 310 315 320 ggc aac agc ggc gta tta gcg atc tct gcg tct tta acc gat aaa ggc 1288 Gly Asn Ser Gly Val Leu Ala Ile Ser Ala Ser Leu Thr Asp Lys Gly 325 330 335 ctg gct aat cgc gat cag gtt gtg gcg gca att ttt agc tat ctc aat 1336 Leu Ala Asn Arg Asp Gln Val Val Ala Ala Ile Phe Ser Tyr Leu Asn 340 345 350 ctg tta cgt gaa aaa ggc att gat aaa caa tac ttc gat gaa ctg gcg 1384 Leu Leu Arg Glu Lys Gly Ile Asp Lys Gln Tyr Phe Asp Glu Leu Ala 355 360 365 370 aat gtg ctg gat atc gac ttc cgt tat ccg tcg atc acc cgt gat atg 1432 Asn Val Leu Asp Ile Asp Phe Arg Tyr Pro Ser Ile Thr Arg Asp Met 375 380 385 gat tac gtc gaa tgg ctg gca gat acc atg att cgc gtt cct gtt gag 1480 Asp Tyr Val Glu Trp Leu Ala Asp Thr Met Ile Arg Val Pro Val Glu 390 395 400 cat acg ctg gat gca gtc aat att gcc gat cgg tac gat gct aaa gca 1528 His Thr Leu Asp Ala Val Asn Ile Ala Asp Arg Tyr Asp Ala Lys Ala 405 410 415 gta aag gaa cgt ctg gcg atg atg acg ccg cag aat gcg cgt atc tgg 1576 Val Lys Glu Arg Leu Ala Met Met Thr Pro Gln Asn Ala Arg Ile Trp 420 425 430 tat atc agc ccg aaa gag ccg cac aac aaa acg gct tac ttt gtc gat 1624 Tyr Ile Ser Pro Lys Glu Pro His Asn Lys Thr Ala Tyr Phe Val Asp 435 440 445 450 gcg ccg tat cag gtc gat aaa atc agc gca caa act ttc gcc gac tgg 1672 Ala Pro Tyr Gln Val Asp Lys Ile Ser Ala Gln Thr Phe Ala Asp Trp 455 460 465 cag aaa aaa gcc gcc gac att gcg ctc tct ttg cca gag ctt aac cct 1720 Gln Lys Lys Ala Ala Asp Ile Ala Leu Ser Leu Pro Glu Leu Asn Pro 470 475 480 tat att cct gat gat ttc tcg ctg att aag tca gag aag aaa tac gac 1768 Tyr Ile Pro Asp Asp Phe Ser Leu Ile Lys Ser Glu Lys Lys Tyr Asp 485 490 495 cat cca gag ctg att gtt gat gag tcg aat ctg cgc gtg gtg tat gcg 1816 His Pro Glu Leu Ile Val Asp Glu Ser Asn Leu Arg Val Val Tyr Ala 500 505 510 cca agc cgt tat ttt gcc agc gag ccc aaa gct gat gtc agc ctg att 1864 Pro Ser Arg Tyr Phe Ala Ser Glu Pro Lys Ala Asp Val Ser Leu Ile 515 520 525 530 ttg cgt aat ccg aaa gcc atg gac agc gcc cgc aat cag gtg atg ttt 1912 Leu Arg Asn Pro Lys Ala Met Asp Ser Ala Arg Asn Gln Val Met Phe 535 540 545 gcg ctc aat gat tat ctc gca ggg ctg gcg ctt gat cag tta agc aac 1960 Ala Leu Asn Asp Tyr Leu Ala Gly Leu Ala Leu Asp Gln Leu Ser Asn 550 555 560 cag gcg tcg gtt ggt ggc ata agt ttt tcc acc aac gct aac aac ggc 2008 Gln Ala Ser Val Gly Gly Ile Ser Phe Ser Thr Asn Ala Asn Asn Gly 565 570 575 ctt atg gtt aat gct aat ggt tac acc cag cgt ctg ccg cag ctg ttc 2056 Leu Met Val Asn Ala Asn Gly Tyr Thr Gln Arg Leu Pro Gln Leu Phe 580 585 590 cag gca ttg ctc gag ggg tac ttt agc tat acc gct acg gaa gat cag 2104 Gln Ala Leu Leu Glu Gly Tyr Phe Ser Tyr Thr Ala Thr Glu Asp Gln 595 600 605 610 ctt gag cag gcg aag tcc tgg tat aac cag atg atg gat tcc gca gaa 2152 Leu Glu Gln Ala Lys Ser Trp Tyr Asn Gln Met Met Asp Ser Ala Glu 615 620 625 aag ggt aaa gcg ttt gag cag gcg att atg ccc gcg cag atg ctc tcg 2200 Lys Gly Lys Ala Phe Glu Gln Ala Ile Met Pro Ala Gln Met Leu Ser 630 635 640 caa gtg ccg tac ttc tcg cga gat gaa cgg cgt aaa att ttg ccc tcc 2248 Gln Val Pro Tyr Phe Ser Arg Asp Glu Arg Arg Lys Ile Leu Pro Ser 645 650 655 att acg ttg aaa gag gtg ctg gcc tat cgc gac gcc tta aaa tca ggg 2296 Ile Thr Leu Lys Glu Val Leu Ala Tyr Arg Asp Ala Leu Lys Ser Gly 660 665 670 gct cga cca gag ttt atg gtt atc ggc aac atg acc gag gcc cag gca 2344 Ala Arg Pro Glu Phe Met Val Ile Gly Asn Met Thr Glu Ala Gln Ala 675 680 685 690 aca acg ctg gca cgc gat gtg caa aaa cag ttg ggc gct gat ggt tca 2392 Thr Thr Leu Ala Arg Asp Val Gln Lys Gln Leu Gly Ala Asp Gly Ser 695 700 705 gag tgg tgt cga aac aaa gat gta gtg gtc gat aaa aaa caa tcc gtc 2440 Glu Trp Cys Arg Asn Lys Asp Val Val Val Asp Lys Lys Gln Ser Val 710 715 720 atc ttt gaa aaa gcc ggt aac agc acc gac tcc gca ctg gca gcg gta 2488 Ile Phe Glu Lys Ala Gly Asn Ser Thr Asp Ser Ala Leu Ala Ala Val 725 730 735 ttt gta ccg act ggc tac gat gaa tac acc agc tca gcc tat agc tct 2536 Phe Val Pro Thr Gly Tyr Asp Glu Tyr Thr Ser Ser Ala Tyr Ser Ser 740 745 750 ctg ttg ggg cag atc gta cag ccg tgg ttc tac aat cag ttg cgt acc 2584 Leu Leu Gly Gln Ile Val Gln Pro Trp Phe Tyr Asn Gln Leu Arg Thr 755 760 765 770 gaa gaa caa ttg ggc tat gcc gtg ttt gcg ttt cca atg agc gtg ggg 2632 Glu Glu Gln Leu Gly Tyr Ala Val Phe Ala Phe Pro Met Ser Val Gly 775 780 785 cgt cag tgg ggc atg ggc ttc ctt ttg caa agc aat gat aaa cag cct 2680 Arg Gln Trp Gly Met Gly Phe Leu Leu Gln Ser Asn Asp Lys Gln Pro 790 795 800 tca ttc ttg tgg gag cgt tac aag gcg ttt ttc cca acc gca gag gca 2728 Ser Phe Leu Trp Glu Arg Tyr Lys Ala Phe Phe Pro Thr Ala Glu Ala 805 810 815 aaa ttg cga gcg atg aag cca gat gag ttt gcg caa atc cag cag gcg 2776 Lys Leu Arg Ala Met Lys Pro Asp Glu Phe Ala Gln Ile Gln Gln Ala 820 825 830 gta att acc cag atg ctg cag gca ccg caa acg ctc ggc gaa gaa gca 2824 Val Ile Thr Gln Met Leu Gln Ala Pro Gln Thr Leu Gly Glu Glu Ala 835 840 845 850 tcg aag tta agt aaa gat ttc gat cgc ggc aat atg cgc ttc gat tcg 2872 Ser Lys Leu Ser Lys Asp Phe Asp Arg Gly Asn Met Arg Phe Asp Ser 855 860 865 cgt gat aaa atc gtg gcc cag ata aaa ctg ctg acg ccg caa aaa ctt 2920 Arg Asp Lys Ile Val Ala Gln Ile Lys Leu Leu Thr Pro Gln Lys Leu 870 875 880 gct gat ttc ttc cat cag gcg gtg gtc gag ccg caa ggc atg gct att 2968 Ala Asp Phe Phe His Gln Ala Val Val Glu Pro Gln Gly Met Ala Ile 885 890 895 ctg tcg cag att tcc ggc agc cag aac ggg aaa gcc gaa tat gta cac 3016 Leu Ser Gln Ile Ser Gly Ser Gln Asn Gly Lys Ala Glu Tyr Val His 900 905 910 cct gaa ggc tgg aaa gtg tgg gag aac gtc agc gcg ttg cag caa aca 3064 Pro Glu Gly Trp Lys Val Trp Glu Asn Val Ser Ala Leu Gln Gln Thr 915 920 925 930 atg ccc ctg atg agt gaa aag aat gag tgatgtcgcc gagacactag 3111 Met Pro Leu Met Ser Glu Lys Asn Glu 935 atcctttgc 3120 <210> 50 <211> 962 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 50 Met Pro Arg Ser Thr Trp Phe Lys Ala Leu Leu Leu Leu Val Ala Leu -20 -15 -10 Trp Ala Pro Leu Ser Gln Ala Glu Thr Gly Trp Gln Pro Ile Gln Glu -5 -1 1 5 Thr Ile Arg Lys Ser Asp Lys Asp Asn Arg Gln Tyr Gln Ala Ile Arg 10 15 20 25 Leu Asp Asn Gly Met Val Val Leu Leu Val Ser Asp Pro Gln Ala Val 30 35 40 Lys Ser Leu Ser Ala Leu Val Val Pro Val Gly Ser Leu Glu Asp Pro 45 50 55 Glu Ala Tyr Gln Gly Leu Ala His Tyr Leu Glu His Met Ser Leu Met 60 65 70 Gly Ser Lys Lys Tyr Pro Gln Ala Asp Ser Leu Ala Glu Tyr Leu Lys 75 80 85 Met His Gly Gly Ser His Asn Ala Ser Thr Ala Pro Tyr Arg Thr Ala 90 95 100 105 Phe Tyr Leu Glu Val Glu Asn Asp Ala Leu Pro Gly Ala Val Asp Arg 110 115 120 Leu Ala Asp Ala Ile Ala Glu Pro Leu Leu Asp Lys Lys Tyr Ala Glu 125 130 135 Arg Glu Arg Asn Ala Val Asn Ala Glu Leu Thr Met Ala Arg Thr Arg 140 145 150 Asp Gly Met Arg Met Ala Gln Val Ser Ala Glu Thr Ile Asn Pro Ala 155 160 165 His Pro Gly Ser Lys Phe Ser Gly Gly Asn Leu Glu Thr Leu Ser Asp 170 175 180 185 Lys Pro Gly Asn Pro Val Gln Gln Ala Leu Lys Asp Phe His Glu Lys 190 195 200 Tyr Tyr Ser Ala Asn Leu Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Asn Lys Pro 205 210 215 Leu Pro Glu Leu Ala Lys Met Ala Ala Asp Thr Phe Gly Arg Val Pro 220 225 230 Asn Lys Glu Ser Lys Lys Pro Glu Ile Thr Val Pro Val Val Thr Asp 235 240 245 Ala Gln Lys Gly Ile Ile Ile His Tyr Val Pro Ala Leu Pro Arg Lys 250 255 260 265 Val Leu Arg Val Glu Phe Arg Ile Asp Asn Asn Ser Ala Lys Phe Arg 270 275 280 Ser Lys Thr Asp Glu Leu Ile Thr Tyr Leu Ile Gly Asn Arg Ser Pro 285 290 295 Gly Thr Leu Ser Asp Trp Leu Gln Lys Gln Gly Leu Val Glu Gly Ile 300 305 310 Ser Ala Asn Ser Asp Pro Ile Val Asn Gly Asn Ser Gly Val Leu Ala 315 320 325 Ile Ser Ala Ser Leu Thr Asp Lys Gly Leu Ala Asn Arg Asp Gln Val 330 335 340 345 Val Ala Ala Ile Phe Ser Tyr Leu Asn Leu Leu Arg Glu Lys Gly Ile 350 355 360 Asp Lys Gln Tyr Phe Asp Glu Leu Ala Asn Val Leu Asp Ile Asp Phe 365 370 375 Arg Tyr Pro Ser Ile Thr Arg Asp Met Asp Tyr Val Glu Trp Leu Ala 380 385 390 Asp Thr Met Ile Arg Val Pro Val Glu His Thr Leu Asp Ala Val Asn 395 400 405 Ile Ala Asp Arg Tyr Asp Ala Lys Ala Val Lys Glu Arg Leu Ala Met 410 415 420 425 Met Thr Pro Gln Asn Ala Arg Ile Trp Tyr Ile Ser Pro Lys Glu Pro 430 435 440 His Asn Lys Thr Ala Tyr Phe Val Asp Ala Pro Tyr Gln Val Asp Lys 445 450 455 Ile Ser Ala Gln Thr Phe Ala Asp Trp Gln Lys Lys Ala Ala Asp Ile 460 465 470 Ala Leu Ser Leu Pro Glu Leu Asn Pro Tyr Ile Pro Asp Asp Phe Ser 475 480 485 Leu Ile Lys Ser Glu Lys Lys Tyr Asp His Pro Glu Leu Ile Val Asp 490 495 500 505 Glu Ser Asn Leu Arg Val Val Tyr Ala Pro Ser Arg Tyr Phe Ala Ser 510 515 520 Glu Pro Lys Ala Asp Val Ser Leu Ile Leu Arg Asn Pro Lys Ala Met 525 530 535 Asp Ser Ala Arg Asn Gln Val Met Phe Ala Leu Asn Asp Tyr Leu Ala 540 545 550 Gly Leu Ala Leu Asp Gln Leu Ser Asn Gln Ala Ser Val Gly Gly Ile 555 560 565 Ser Phe Ser Thr Asn Ala Asn Asn Gly Leu Met Val Asn Ala Asn Gly 570 575 580 585 Tyr Thr Gln Arg Leu Pro Gln Leu Phe Gln Ala Leu Leu Glu Gly Tyr 590 595 600 Phe Ser Tyr Thr Ala Thr Glu Asp Gln Leu Glu Gln Ala Lys Ser Trp 605 610 615 Tyr Asn Gln Met Met Asp Ser Ala Glu Lys Gly Lys Ala Phe Glu Gln 620 625 630 Ala Ile Met Pro Ala Gln Met Leu Ser Gln Val Pro Tyr Phe Ser Arg 635 640 645 Asp Glu Arg Arg Lys Ile Leu Pro Ser Ile Thr Leu Lys Glu Val Leu 650 655 660 665 Ala Tyr Arg Asp Ala Leu Lys Ser Gly Ala Arg Pro Glu Phe Met Val 670 675 680 Ile Gly Asn Met Thr Glu Ala Gln Ala Thr Thr Leu Ala Arg Asp Val 685 690 695 Gln Lys Gln Leu Gly Ala Asp Gly Ser Glu Trp Cys Arg Asn Lys Asp 700 705 710 Val Val Val Asp Lys Lys Gln Ser Val Ile Phe Glu Lys Ala Gly Asn 715 720 725 Ser Thr Asp Ser Ala Leu Ala Ala Val Phe Val Pro Thr Gly Tyr Asp 730 735 740 745 Glu Tyr Thr Ser Ser Ala Tyr Ser Ser Leu Leu Gly Gln Ile Val Gln 750 755 760 Pro Trp Phe Tyr Asn Gln Leu Arg Thr Glu Glu Gln Leu Gly Tyr Ala 765 770 775 Val Phe Ala Phe Pro Met Ser Val Gly Arg Gln Trp Gly Met Gly Phe 780 785 790 Leu Leu Gln Ser Asn Asp Lys Gln Pro Ser Phe Leu Trp Glu Arg Tyr 795 800 805 Lys Ala Phe Phe Pro Thr Ala Glu Ala Lys Leu Arg Ala Met Lys Pro 810 815 820 825 Asp Glu Phe Ala Gln Ile Gln Gln Ala Val Ile Thr Gln Met Leu Gln 830 835 840 Ala Pro Gln Thr Leu Gly Glu Glu Ala Ser Lys Leu Ser Lys Asp Phe 845 850 855 Asp Arg Gly Asn Met Arg Phe Asp Ser Arg Asp Lys Ile Val Ala Gln 860 865 870 Ile Lys Leu Leu Thr Pro Gln Lys Leu Ala Asp Phe Phe His Gln Ala 875 880 885 Val Val Glu Pro Gln Gly Met Ala Ile Leu Ser Gln Ile Ser Gly Ser 890 895 900 905 Gln Asn Gly Lys Ala Glu Tyr Val His Pro Glu Gly Trp Lys Val Trp 910 915 920 Glu Asn Val Ser Ala Leu Gln Gln Thr Met Pro Leu Met Ser Glu Lys 925 930 935 Asn Glu <210> 51 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> wild-type DsbC comprising his-tag <220> <221> CDS <222> (1)..(729) <400> 51 atg aag aaa ggt ttt atg ttg ttt act ttg tta gcg gcg ttt tca ggc 48 Met Lys Lys Gly Phe Met Leu Phe Thr Leu Leu Ala Ala Phe Ser Gly 1 5 10 15 ttt gct cag gct gat gac gcg gca att caa caa acg tta gcc aaa atg 96 Phe Ala Gln Ala Asp Asp Ala Ala Ile Gln Gln Thr Leu Ala Lys Met 20 25 30 ggc atc aaa agc agc gat att cag ccc gcg cct gta gct ggc atg aag 144 Gly Ile Lys Ser Ser Asp Ile Gln Pro Ala Pro Val Ala Gly Met Lys 35 40 45 aca gtt ctg act aac agc ggc gtg ttg tac atc acc gat gat ggt aaa 192 Thr Val Leu Thr Asn Ser Gly Val Leu Tyr Ile Thr Asp Asp Gly Lys 50 55 60 cat atc att cag ggg cca atg tat gac gtt agt ggc acg gct ccg gtc 240 His Ile Ile Gln Gly Pro Met Tyr Asp Val Ser Gly Thr Ala Pro Val 65 70 75 80 aat gtc acc aat aag atg ctg tta aag cag ttg aat gcg ctt gaa aaa 288 Asn Val Thr Asn Lys Met Leu Leu Lys Gln Leu Asn Ala Leu Glu Lys 85 90 95 gag atg atc gtt tat aaa gcg ccg cag gaa aaa cac gtc atc acc gtg 336 Glu Met Ile Val Tyr Lys Ala Pro Gln Glu Lys His Val Ile Thr Val 100 105 110 ttt act gat att acc tgt ggt tac tgc cac aaa ctg cat gag caa atg 384 Phe Thr Asp Ile Thr Cys Gly Tyr Cys His Lys Leu His Glu Gln Met 115 120 125 gca gac tac aac gcg ctg ggg atc acc gtg cgt tat ctt gct ttc ccg 432 Ala Asp Tyr Asn Ala Leu Gly Ile Thr Val Arg Tyr Leu Ala Phe Pro 130 135 140 cgc cag ggg ctg gac agc gat gca gag aaa gaa atg aaa gct atc tgg 480 Arg Gln Gly Leu Asp Ser Asp Ala Glu Lys Glu Met Lys Ala Ile Trp 145 150 155 160 tgt gcg aaa gat aaa aac aaa gcg ttt gat gat gtg atg gca ggt aaa 528 Cys Ala Lys Asp Lys Asn Lys Ala Phe Asp Asp Val Met Ala Gly Lys 165 170 175 agc gtc gca cca gcc agt tgc gac gtg gat att gcc gac cat tac gca 576 Ser Val Ala Pro Ala Ser Cys Asp Val Asp Ile Ala Asp His Tyr Ala 180 185 190 ctt ggc gtc cag ctt ggc gtt agc ggt act ccg gca gtt gtg ctg agc 624 Leu Gly Val Gln Leu Gly Val Ser Gly Thr Pro Ala Val Val Leu Ser 195 200 205 aat ggc aca ctt gtt ccg ggt tac cag ccg ccg aaa gag atg aaa gaa 672 Asn Gly Thr Leu Val Pro Gly Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Met Lys Glu 210 215 220 ttc ctc gac gaa cac caa aaa atg acc agc ggt aaa cac cat cac cat 720 Phe Leu Asp Glu His Gln Lys Met Thr Ser Gly Lys His His His His 225 230 235 240 cac cac taa 729 His His <210> 52 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 52 Met Lys Lys Gly Phe Met Leu Phe Thr Leu Leu Ala Ala Phe Ser Gly 1 5 10 15 Phe Ala Gln Ala Asp Asp Ala Ala Ile Gln Gln Thr Leu Ala Lys Met 20 25 30 Gly Ile Lys Ser Ser Asp Ile Gln Pro Ala Pro Val Ala Gly Met Lys 35 40 45 Thr Val Leu Thr Asn Ser Gly Val Leu Tyr Ile Thr Asp Asp Gly Lys 50 55 60 His Ile Ile Gln Gly Pro Met Tyr Asp Val Ser Gly Thr Ala Pro Val 65 70 75 80 Asn Val Thr Asn Lys Met Leu Leu Lys Gln Leu Asn Ala Leu Glu Lys 85 90 95 Glu Met Ile Val Tyr Lys Ala Pro Gln Glu Lys His Val Ile Thr Val 100 105 110 Phe Thr Asp Ile Thr Cys Gly Tyr Cys His Lys Leu His Glu Gln Met 115 120 125 Ala Asp Tyr Asn Ala Leu Gly Ile Thr Val Arg Tyr Leu Ala Phe Pro 130 135 140 Arg Gln Gly Leu Asp Ser Asp Ala Glu Lys Glu Met Lys Ala Ile Trp 145 150 155 160 Cys Ala Lys Asp Lys Asn Lys Ala Phe Asp Asp Val Met Ala Gly Lys 165 170 175 Ser Val Ala Pro Ala Ser Cys Asp Val Asp Ile Ala Asp His Tyr Ala 180 185 190 Leu Gly Val Gln Leu Gly Val Ser Gly Thr Pro Ala Val Val Leu Ser 195 200 205 Asn Gly Thr Leu Val Pro Gly Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Met Lys Glu 210 215 220 Phe Leu Asp Glu His Gln Lys Met Thr Ser Gly Lys His His His His 225 230 235 240 His His

Claims (22)

  1. a) DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터; 및
    b) CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 재조합 그람 음성 세균 세포.
  2. 제1항에 있어서, DsbC가 N 말단 또는 C 말단에서 히스티딘 태그를 포함하는 것인 재조합 그람 음성 세균 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 발현 벡터가 서열번호 45 또는 서열번호 51에 제공된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 재조합 그람 음성 세균 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 CDRH1에 대한 서열번호 1, CDRH2에 대한 서열번호 2 및 CDRH3에 대한 서열번호 3에 제공된 서열을 갖는 3개의 CDR들을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 CDRL1에 대한 서열번호 4, CDRL2에 대한 서열번호 5 및 CDRL3에 대한 서열번호 6에 제공된 서열을 갖는 3개의 CDR들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 재조합 그람 음성 세균 세포.
  5. 제4항에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 서열번호 8에 제공된 경쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 10에 제공된 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 코딩하는 것인 재조합 그람 음성 세균 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 Fab 또는 Fab' 단편인 재조합 그람 음성 세균 세포.
  7. 제6항에 있어서, Fab 또는 Fab' 단편이 서열번호 12에 제공된 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 14 또는 서열번호 16에 제공된 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 것인 재조합 그람 음성 세균 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 벡터 및 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 발현 벡터를 포함하는 것인 재조합 그람 음성 세균 세포.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 재조합 그람 음성 세균 세포.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 세포에 비해 감소된 Tsp 단백질 활성을 갖고 변경된 spr 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 재조합 그람 음성 세균 세포.
  11. 제10항에 있어서, Tsp를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 넉아웃 돌연변이를 포함하고, 변경된 spr 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 아미노산 C94에 영향을 미치는 돌연변이를 포함하는 것인 재조합 그람 음성 세균 세포.
  12. 제11항에 있어서, 변경된 spr 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 내의 돌연변이가 위치 94에서 아미노산 시스테인을 알라닌으로 변화시키는(C94A) 것인 재조합 그람 음성 세균 세포.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 제외하고 야생형 세균 세포와 동일한 유전자형을 갖는 것인 재조합 그람 음성 세균 세포.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 이. 콜라이(E. coli)인 재조합 그람 음성 세균 세포.
  15. DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하기 위한 이시스트론성 메시지(dicistronic message)를 포함하는 발현 벡터로서, 이때 상류 시스트론이 항체의 경쇄를 코딩하는 DNA를 함유하고, 하류 시스트론이 상응하는 중쇄를 코딩하는 DNA를 함유하고, 상기 이시스트론성 메시지가 IGS1(서열번호 33), IGS2(서열번호 34), IGS3(서열번호 35) 및 IGS4(서열번호 36)로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  16. 제15항에 있어서, CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인 발현 벡터.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, DsbC가 제2항 또는 제3항에서 정의된 바와 같은 것인 발현 벡터.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 재조합 그람 음성 세균 세포.
  19. CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법으로서,
    a) CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현하기에 효과적인 조건 하에서 제1항 내지 제14항 및 제18항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 재조합 그람 음성 세균 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    b) 상기 재조합 그람 음성 세균 세포의 주변세포질 및/또는 배양 배지로부터 CD154에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계
    를 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 이펙터(effector) 분자를 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 C 말단에 또는 C 말단 쪽에 존재하는 아미노산에 부착시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 이펙터 분자가 폴리(에틸렌글리콜) 또는 메톡시폴리(에틸렌글리콜)을 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 라이실-말레이미드 기를 중쇄의 C 말단에 존재하는 시스테인 잔기들 중 하나에 부착시키는 단계를 포함하고, 이때 라이실 잔기의 각각의 아미노 기가 그 자신에 공유연결된 약 20,000 Da의 분자량을 갖는 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 갖는 것인 방법.
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