CN104560857B - 一种茹氏短芽孢杆菌及其构建方法和在处理高浓度氨氮污水中的应用 - Google Patents

一种茹氏短芽孢杆菌及其构建方法和在处理高浓度氨氮污水中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种茹氏短芽孢杆菌及其构建方法和在处理高浓度氨氮污水中的应用。茹氏短芽孢杆菌是表达AMO基因的重组硝化细菌(具有高效去除氨氮的性能)，拉丁文学名为Brevibacillus reuszeri，命名为Biodehiammonia菌株；保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏时间：2014年12月29日，保藏编号CGMCC No.10254。茹氏短芽孢杆菌中插入外源基因的核苷酸序列如序列编号1所示，茹氏短芽孢杆菌的AMO氨基酸序列如序列编号2所示，茹氏短芽孢杆菌的AMO基因前带有分泌型信号肽，其中信号肽的氨基酸序列如编号3所示。该茹氏短芽孢杆菌与膜生物反应器联合用于污水的处理，能取得良好的效果。

Description

一种茹氏短芽孢杆菌及其构建方法和在处理高浓度氨氮污水 中的应用
发明领域
本发明涉及表达外源基因的重组硝化细菌菌剂及其构建方法和在污水处理中的应用，具体地说，涉及表达亚硝酸盐还原酶的茹氏短芽孢杆菌。
背景技术
本发明中提到的膜生物反应系统是流动的需氧的膜生物反应系统(fluidizedbed membrance bioreactor,AFMBR)，茹氏短芽孢杆菌是在低温条件下具有高效去除氨氮的Biodehiammtrogen工程菌。
生物脱氮法是现代工业污水处理中普遍采用的一种方法，其中由硝化细菌完成的硝化反应是将氨氮从污水中去除最为关键的一步。自然状况下的化能无机自养硝化细菌具有生长速率低、生物量小和对环境因子敏感等生理特点，使得污水处理厂的脱氮效果很不稳定。
目前，工业污水处理广泛采用生物脱氮A/O氧系统，即废水在好氧条件下,通过硝化作用使氨氮转化成硝态氮，再在缺氧条件下，通过反硝化作用使硝态氮转化为氮气释放，从而将氮从污水中去除。可见由硝化细菌进行的硝化反应是将氨氮从污水中去除的第一步，也是最为关键的一步。当污水在生物硝化池内循环流动时，其中的氨氮复合物就被附着在池内生物膜上或悬浮于污水中的硝化细菌转化成硝酸盐而得以固定。
污水除氮的第一步就是在亚硝化细菌的作用下将铵离子转化为羟氨，这一步是氨化作用的最关键一步，在这一步中，发挥催化作用的是氨单加氧酶。氨单加氧酶和羟胺氧化酶就是异养硝化菌代谢过程中的关键酶AMO是胞内酶，AMO主要催化NH3氧化形成羟胺(NH2OH)，羟胺氧化酶则负责催化上一步的NH2OH转化为NO2 -。至今国内外还没有通过基因克隆的方法得到异养硝化菌氨单加氧酶基因的全基因序列.含铜，对硫脲等金属螯合剂敏感。
目前，全球淡水资源短缺，水环境的质量持续恶化，污水回用是解决水资源危机，满足日益严格的水环境要求的有效方法。膜分离技术在水处理过程中具有高效、节能、环保以及过程简单、易于控制等特性，得到了广泛的应用与发展，随着科学技术如新月异的发展，膜生物反应器(Membrane Bioreactor，MBR)越来越广泛地应用于污水处理中，到2011年底，全世界投入运行及在建的MBR系统已超过15000套。
MBR可以达到与活性污泥系统相似的处理目标，例如有机物的去除。硝化、反硝化以及化学或者生物除磷。作为摸分离技术与生物技术有机结合的污水处理新工艺，MBR由于其出水水质优良稳定，装置占地面积小等显著优点，使其在城市污水、工业废水、垃圾渗滤液的处理和回用方面表现出良好的竞争力，并在全球范围受到高度重视，是公认的21世纪最具有吸引力和竞争力的污水处理与回用技术。我国对MBR的应用与研究起步相对较晚，但是发展很快。本设计使用MBR/活性污泥混合系统结合基因工程菌增强对污水的处理的效果。
综上所述，通过本发明构建的茹氏短芽孢杆菌使MBR/活性污泥混合系统增强了高浓度氨氮污水的处理效果。
发明内容
鉴于以上问题，本发明的目的是提供一种茹氏短芽孢杆菌及其构建方法和在处理高浓度氨氮污水处理中的应用。具体技术方案如下：
一种茹氏短芽孢杆菌，所述茹氏短芽孢杆菌是Biodeammonianitrogen工程菌，拉丁文学名为Brevibacillus reuszeri，命名为Biodehiammonia菌株；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间：2014年12月29日，保藏编号CGMCC No.10254。
所述茹氏短芽孢杆菌中转化的外源基因的核苷酸序列如序列编号1所示。
所述茹氏短芽孢杆菌的氨单加氧酶基因(ammonia monooxygenase，简称AMO)的氨基酸序列如序列编号2所示。
所述茹氏短芽孢杆菌的氨单加氧酶基因前带有分泌型信号肽，其中信号肽的氨基酸序列如编号3所示。
上述任一所述的茹氏短芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)利用细菌分离技术分离具有氨氮去除效果的硝化细菌基因组；
(2)利用PCR技术克隆氨单加氧酶基因，与pSIM6载体连接后重组至硝化细菌基因组特定位点中；
(3)利用基因工程技术筛选出表达氨单加氧酶基因的硝化细菌；
(4)在高浓度氨氮条件下驯化可高效处理氨氮的基因工程菌，得到高浓度氨氮硝化工程菌；
(5)利用发酵技术将所述高浓度氨氮硝化工程菌进行扩增，得到所述茹氏短芽孢杆菌。
上述任一所述的茹氏短芽孢杆菌的应用，将膜生物反应系统与所述茹氏短芽孢杆菌联合，在不同条件下去除污水中的高浓度氨氮；
所述膜生物反应系统为流动的需氧膜生物反应系统，膜的材质为树脂；
所述高浓度氨氮在所述污水中的氨氮含量是2000～5000mg/L。
所述污水中COD的去除率为97.22～99.72％。
所述污水中氨氮去除率为97.88～99.84％。
所述污水包括生活污水、工业废水、垃圾渗滤液。
本发明通过应用基因工程操作技术，获得了高效去除氨氮的硝化细菌，即上述茹氏短芽孢杆菌。实验表明表达外源基因重组到细菌基因组中，没有影响硝化细菌的增值。高浓度氨氮污水处理实验研究结果表明，本发明的硝化细菌可以有效去除工业废水、垃圾渗滤液中的高浓度氨氮，达到国家要求标准，说明其可作为理想高浓度氨氮去除菌剂。
附图说明
图1是重组载体构建图、重组基因检测、表达以及硝化细菌的生长曲线图；其中，A为重组载体构建、重组基因检测、表达图，B-E为硝化细菌生长曲线图；
图2是MBR与活性污泥系统并联合基因工程硝化细菌在高浓度氨氮条件下处理工业污水的效果图；其中，A为茹氏短芽孢杆菌对氨氮的去除效果图，B为茹氏短芽孢杆菌剂对COD的去除效果图；
图3是MBR与活性污泥系统并联合基因工程硝化细菌(茹氏短芽孢杆菌)在高浓度氨氮下处理垃圾渗滤液效果图；其中，A为基因工程菌剂对氨氮的去除效果图，B为基因工程菌剂对COD的去除效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 载体构建图、重组基因检测、表达以及硝化细菌的生长曲线图
1、重组载体构建图：利用PCR技术将AMO基因插入rpSIM6载体中，构建rpSIM6-AMO重组质粒。构建示意图如图1的A图所示。
2、rpSIM6-AMO重组质粒转入硝化细菌中。酶切检测重组载体构建是否成功，PCR技术检测AMO基因是否重组硝化细菌基因组中。SDS-PAGE检测AMO基因的表达。结果如图1的B-D图所示。
3、OD法测定重组硝化细菌的生长曲线。结果如图1的E图所示。
从结果中可以看出，与对照组相比，重组病毒的生长没有因为重组质粒的导入而受到影响。外源基因AMO在硝化细菌中的得到了有效的表达。
实施例2 重组硝化细菌工厂污水(工业废水)的处理效果
将发酵后冻干的重组硝化细菌菌剂(30kg)加入到MBR/活性污泥污水处理系统中(300吨)，对照组为不加重组硝化细菌菌剂的MBR/活性污泥污水处理系统(n＝3)。实验开始时，各个污水处理系统停止进入原水，开始进入清水，72小时后开始进入工业污水。测定各个污水处理系统的COD及氨氮含量。
从图2中可以得出加入重组硝化细菌菌剂增强了MBR/活性污泥对工业废水的处理效果。
实施例3 重组硝化细菌对垃圾渗滤液的处理效果
将发酵后冻干的重组硝化细菌菌剂(20kg)加入到MBR/活性污泥污水处理系统中(200吨)，对照组为不加重组硝化细菌菌剂的MBR/活性污泥污水处理系统(n＝3)。加入菌剂后减少处理系统的出水和进水量，48小时后恢复原出水量，每48小时测定各个污水处理系统的COD及氨氮含量。
从图3中可以得出加入重组硝化细菌菌剂增强了MBR/活性污泥对垃圾渗滤液的处理效果。

Claims (9)

1.一种茹氏短芽孢杆菌，其特征在于，所述茹氏短芽孢杆菌是Biodeammonianitrogen工程菌，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.10254。
2.根据权利要求1所述的茹氏短芽孢杆菌，其特征在于，所述茹氏短芽孢杆菌中转化的外源基因的核苷酸序列如序列编号1所示。
3.根据权利要求1或2所述的茹氏短芽孢杆菌，其特征在于，所述茹氏短芽孢杆菌的氨单加氧酶基因的氨基酸序列如序列编号2所示。
4.根据权利要求3所述的茹氏短芽孢杆菌，其特征在于，所述茹氏短芽孢杆菌的氨单加氧酶基因前带有分泌型信号肽，其中信号肽的氨基酸序列如编号3所示。
5.权利要求1至4任一所述的茹氏短芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)利用细菌分离技术分离具有氨氮去除效果的硝化细菌基因组；
(2)利用PCR技术克隆氨单加氧酶基因，与pSIM6载体连接后重组至硝化细菌基因组特定位点中；
(3)利用基因工程技术筛选出表达氨单加氧酶基因的硝化细菌；
(4)在高浓度氨氮条件下驯化可高效处理氨氮的基因工程菌，得到高浓度氨氮硝化工程菌；
(5)利用发酵技术将所述高浓度氨氮硝化工程菌进行扩增，得到所述茹氏短芽孢杆菌。
6.权利要求1至4任一所述的茹氏短芽孢杆菌的应用，其特征在于，将膜生物反应系统与所述茹氏短芽孢杆菌联合，在不同条件下去除污水中的高浓度氨氮；
所述膜生物反应系统为流动的需氧膜生物反应系统，膜的材质为树脂；
所述高浓度氨氮在所述污水中的含量是2000～5000mg/L。
7.根据权利要求6所述的茹氏短芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述污水中COD的去除率为97.22～99.72％。
8.根据权利要求6所述的茹氏短芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述污水中氨氮去除率为97.88～99.84％。
9.根据权利要求6～8任一所述的茹氏短芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述污水包括生活污水、工业废水、垃圾渗滤液。
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