CN109219662A - 改进的发酵工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生产重组目标蛋白(POI)的方法，包括步骤(a)在细胞培养基中培养细胞，通过向所述细胞培养物中加入包含至少一种基质的给料来表达所述POI，(b)在诱导阶段和/或POI产生阶段期间，基于计算、设定和任选地控制细胞的比基质摄取速率q_S来应用给料策略，其中q_S设定为接近细胞培养物的维持率，和(c)从细胞培养物中分离所述POI。

Description

改进的发酵工艺

技术领域

本发明涉及使用新型的给料策略生产高产率的重组蛋白的发酵方法。

背景技术

生物技术和生物工程在现代工业和健康领域中发挥着越来越重要的作用。许多新的重要的活性药物成分是重组治疗性蛋白。通过很好地控制基因修饰的微生物中的生物技术工艺，这些重组治疗性蛋白在基因修饰的微生物中形成。

生物过程开发旨在识别和理解工艺参数与产品质量和数量之间的相互作用。由于生物过程开发的时间有限，并且生物过程的多变量研究是时间、成本和劳动密集型任务，因此需要策略来加速工艺开发并缩短生物技术产品的上市时间。

除了诸如pH值和温度的技术参数外，营养物的供应是影响细胞生理的主要参数。

在整个诱导阶段，这种给料策略可以是(a)技术上控制的，例如，预先限定的给料曲线：体积恒定或体积变化。尽管作为工艺参数的给料速率在技术上控制到恒定的水平，但生理上仍然是不受控制的。在这种没有任何反馈控制的系统中，并没有可能的响应以改变细胞培养物的生理状态，即作为诱导重组蛋白质生产的结果。(b)或者，可以生理上控制给料策略，这意味着目标细胞(the cells of interest)的生理状态的定量。

与技术相反，基于历史或文献数据作为固定产率模型，生理控制通常解释生理状态和/或相关变化。或者，用实时测量(例如溶解氧的浓度、介电常数、光密度、废气浓度)来调整反应生理中的给料策略。

更具体地，生理的给料策略解释了反应器中生物质的量。因此，生理的给料策略依赖于在单个固定时间点估计反应器中的生物质或在整个诱导阶段及时解决。这种生物质估计是用于计算和控制技术上不可直接估计的生理细胞培养物变量的基础。到目前为止，这些给料策略主要集中在比细胞生长速率(specific cell growth rate)μ(Gnothet al.,2008a,Ramirez et al.,1994)。生物质比基质摄取速率(biomass-specific substrateuptake rate)q_S很少受到控制(Sagmeister et al.,2013)。无论目标生理变量如何，生产率或最大比滴度(specific titer)与C-源供应在整个诱导阶段的相互关系都是非常令人感兴趣的。

Ramirez等(1994)表明，重组大肠杆菌生产青霉素酰基转移酶的典型Luedeking-Piret动力学，q_P与μ以及q_S呈正相关。平均地，在相应的实验中μ和q_S在这种情况下通过恒定产率系数Y_X/S(0.56g/g)相互关联。这表明，在这种特别的重组蛋白表达系统中，平均q_S不影响平均生物质产率。总之，在这种情况下，更高的μ以及更高的q_S导致更高的q_P。

Dietzsch等(2011年)用生物体巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)描述了通过控制q_S影响q_P的可能性。此项工作也表明了高q_S值对重组蛋白生产的积极作用。Dietzsch等还表明，除了q_S水平外，q_S随时间变化的轨线对生产率有显著的影响。还报道了逐步增加给料模式的积极影响。通过费力的离线取样来进行生物质测量。

Wechselberger等(2012)描述了高q_S值对大肠杆菌中重组蛋白的生产率的积极影响。Wechselberger等还表明，q_Sinit的影响可以充分解释体积恒定的给料曲线的影响。由此，基于生物质比基质摄取速率q_S([g/g/h])，在诱导点计算体积恒定的给料速率。数据分析表明，通过将体积恒定的给料速率初始缩放至预定的q_S值，q_S与比产物活性(specificproduct activity)之间明显的比例相关性。

WO2013/006479公开了一种对细胞生长具有更大的控制的培养哺乳动物细胞的方法，以实现高产物滴度细胞培养物。通过用含有确定的L-天冬酰胺浓度的无血清灌注培养基灌注，在生产阶段诱导细胞生长停滞。每天取样以评估培养物。Yang JD等描述了一种控制的给料灌注工艺，该工艺导致增加的单克隆抗体生产率。通过补充消耗的成分同时将关键的生产代谢物的营养物维持在低水平以使毒性代谢物的形成最小化来实现受控制的给料(Yang JD et al.,Biotechnology and Bioengineering 2000，69(1)：74-82)。JourdierE.等描述了里氏木霉(Trichoderma reesei)在乳糖上生产纤维素酶的简单动力学模型。该模型允许在工业限制下模拟和比较不同的培养策略(Jourdier E.et al.,ChemicalEngineering Transactions 2012：313-318)。Butler M描述了在不同的动物细胞培养物中(例如中国仓鼠卵巢(CHO)、小鼠骨髓瘤(NS0)、婴儿主肾(BHK)、人胚肾(HEK-293)或人视网膜来源的(PER-C6)细胞)中生产生物药剂的成就和前景(Butler M.，AppliedMicrobiology and Biotechnology 2005，68(3)：283-291)。

如所引用的实例所示，在文献中主要发现的信息是关于最大比活性和给料至培养物的营养物的正相关性。对于每种给料控制均是如此，通过μ-控制或通过q_S-控制。

期望提供一种用于产生最大量的活性蛋白的高效的生物工艺的改进的方法。因此，本发明的目的是提供一种用于发酵产物的改进的方法，其使用最大比滴度和基质可利用性令人惊讶的负相关性。

发明内容

通过所要求保护的主题来解决本发明的目的。

根据本发明，提供了一种生产重组目标蛋白(POI)的方法，包括：(a)在细胞培养基中培养细胞，通过向所述细胞培养物中加入包含至少一种基质的给料来表达所述POI，(b)在诱导阶段和/或POI产生阶段期间，基于计算、设定和任选地控制细胞的比基质摄取率q_S来应用给料策略，其中q_S设定为接近细胞培养物的维持率；和(c)从细胞培养物中分离所述POI。

根据一个具体的实施例，将比基质摄取速率q_S设定在细胞培养物的维持率的范围内，例如0.03-0.15g/g/h，优选地为0.05-0.12g/g/h，更优选地为0.08-0.12g/g/h，最优选地q_S约为0.12g/g/h。

根据一个具体的实施例，在设定为确定值后，控制或不控制比基质摄取速率q_S。

根据一个具体的实施例，在所述目标蛋白的产生阶段至少50％的时间内，将比基质摄取速率q_S控制在恒定值(+/-15％)，其中q_S为0.03g/g/h、0.04g/g/h、0.05g/g/h、0.06g/g/h、0.07g/g/h、0.08g/g/h、0.09g/g/h、0.1g/g/h、0.11g/g/h、0.12g/g/h、0.13g/g/h、0.14g/g/h、或0.15g/g/h，最优选地为0.12g/g/h。

根据一个具体的实施例，通过调节给料速率设定至少一次比基质摄取速率q_S，或在所述目标蛋白的产生阶段至少50％的时间内控制比基质摄取速率q_S，其中q_S在0.15至0.05g/g/h的范围内，优选地从0.15减少至等于或小于0.12g/g/h，从0.15减少至0.10g/g/h，从0.15减少至0.07g/g/h，从0.15减少至0.05g/g/h，从0.12减少至0.1g/g/h，从0.12减少至0.07g/g/h，从0.12减少至0.05g/g/h，从0.1减少至0.07g/g/h，从0.1减少至0.05g/g/h，或从0.1减少至0.03g/g/h。

根据一个具体的实施例，通过调节给料速率至少设定一次比基质摄取速率q_S，或在所述重组蛋白质的产生阶段至少50％的时间内控制在0.03至0.15g/g/h的范围内，优选地从0.03增加至等于或大于0.12g/g/h，从0.03增加至0.10g/g/h，从0.03增加至0.07g/g/h，从0.05增加至0.15g/g/h，优选地从0.05增加至等于或大于0.12g/g/h，从0.05增加至0.10g/g/h，从0.05增加至0.07g/g/h，从0.07增加至0.12g/g/h，从0.07增加至0.10g/g/h，从0.10增加至0.12g/g/h，或从0.10增加至0.15g/g/h。

根据一个具体的实施例，比基质摄取速率q_S是恒定的，在所述目标蛋白的产生阶段至少50％、至少75％、至少80％或至少95％的时间内减少或增加。

根据一个具体的实施例，比基质给料速率q_S在基质给料情况下是正的并且对应于科学上建立的比基质摄取速率q_S，其通常是负的。

根据一个具体的实施例，通过相应地调节给料速率来控制或设定至少一次比基质摄取速率q_S。

根据一个具体的实施例，在诱导阶段/产生阶段开始时计算比基质摄取速率q_S。根据一个具体的实施例，确定一次生物质或通过实时生物质估计和/或测量来确定生物质。

根据一个具体的实施例，使用软传感器或硬传感器进行实时生物质测量。

根据另一个具体的实施例，至少一种基质是碳水化合物。

根据一个具体的实施例，碳水化合物是己糖，例如葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖或甘露糖；二糖，例如蔗糖；醇，例如甘油或乙醇；或其混合物。

根据一个具体的实施例，基质是葡萄糖或甘油(glycerol)(甘氨酸(gly))。

具体地，给料是化学上确定的。

可以以液体形式或以其它形式(例如固体，例如片剂或其它缓释方式，或气体，例如，二氧化碳)将给料加入培养基中。

根据一个具体的实施例，细胞选自由真核细胞或原核细胞组成的组。

根据一个具体的实施例，真核细胞选自由哺乳动物、昆虫、酵母、丝状真菌和植物细胞组成的组，优选地为酵母细胞，最优选地为赤酵母(Pichia pastoris)、巴斯德毕赤酵母(Komagataella pastoris)、巴斯德毕赤酵母(K.phaffii)或巴斯德毕赤酵母(K.pseudopastoris)。

在实施例中，细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是，例如人或啮齿动物或牛细胞系或细胞株。这种细胞、细胞系或细胞株的实例是，例如小鼠骨髓瘤(NSO)-细胞系、中国仓鼠卵巢(CHO)-细胞系、HT1080、H9、HepG2、MCF7、MDBK Jurkat、NIH3T3、PC12、BHK(幼仓鼠肾细胞)、VERO、SP2/0、YB2/0、Y0、C127、L细胞、COS(例如COS1和COS7)、QC1-3、HEK-293、VERO、PER.C6、HeLA、EBl、EB2、EB3、溶瘤或杂交瘤细胞系。优选地，哺乳动物细胞是CHO-细胞系。在一个实施例中，细胞是CHO细胞。在一个实施例中，细胞是CHO-K1细胞、CHO-K1 SV细胞、DG44CHO细胞、DUXB11CHO细胞、CHOS、CHO GS敲除细胞(knock-outcell)、CHO FUT8GS敲除细胞、CHOZN或CHO来源的细胞。CHO GS敲除细胞(例如，GSKO细胞)是，例如CHO-K1 SV GS敲除细胞。CHO FUT8敲除细胞是，例如CHOK1 SV(龙沙生物制剂有限公司(Lonza Biologics,Inc.))。真核细胞也可以是禽细胞、细胞系或细胞株，例如细胞，EB14、EB24、EB26、EB66或EBvl3。

在一个实施例中，真核细胞是干细胞。干细胞可以是，例如多功能干细胞，包括胚胎干细胞(ESC)、成体干细胞、诱导多功能干细胞(iPSC)、组织特异性干细胞(例如，造血干细胞)和间充质干细胞(MSC)。

在一个实施例中，细胞是本文所述的任何细胞的分化形式。在一个实施例中，细胞是源自培养物中的任何原代细胞的细胞。

在一个实施例中，细胞是肝细胞，例如人肝细胞、动物肝细胞或肝脏非实质细胞。例如，细胞可以是血小板代谢的合格的人肝细胞(plateable metabolism qualifiedhuman hepatocyte)、血小板诱导的合格的人肝细胞(plateable induction qualifiedhuman hepatocyte)、血小板的Qualyst Transporter Certified^TM人肝细胞、悬浮合格的人肝细胞(包括10-供体和20-供体合并的肝细胞)、人肝可扑弗氏细胞、人肝星状细胞、狗肝细胞(包括单一和合并的比格(Beagle)肝细胞)、小鼠肝细胞(包括CD-1和C57BI/6肝细胞)、大鼠肝细胞(包括斯普拉格-杜勒鼠(Sprague-Dawley)、Wistar Han和Wistar肝细胞)、猴肝细胞(包括食蟹猕猴(Cynomolgus)或恒河猴(Rhesus monkey)肝细胞)、猫肝细胞(包括家养短毛猫肝细胞)和兔肝细胞(包括新西兰白兔肝细胞)。示例性肝细胞可以从美国北卡罗来纳州戴维斯推进研究三角中心有限责任公司三角研究实验室27709(Triangle ResearchLabs，LLC，6Davis Drive Research Triangle Park，North Carolina，USA 27709)商购获得。

在一个实施例中，真核细胞是低等真核细胞，例如酵母细胞(例如毕赤酵母属(例如巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)和安格斯毕赤酵母(Pichia angusta))、巴斯德毕赤酵母属(Komagataellagenus)(例如巴斯德毕赤酵母(Komagataella pastoris)、巴斯德毕赤酵母(Komagataellapseudopastoris)或巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii))、酿酒酵母属(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、啤酒酵母(cerevisae)，克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum))、克鲁维酵母属(例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus))、假丝酵母属(例如产朊假丝酵母(Candida utilis)、可可假丝酵母(Candida cacaoi)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii))、白地霉属(例如发酵地霉(Geotrichum fermentans))、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。优选的是巴斯德毕赤酵母。巴斯德毕赤酵母菌株的实例是X33、GS115、KM71、KM71H和CBS7435。

在一个实施例中，真核细胞是真菌细胞(例如曲霉属(例如黑曲霉、烟曲霉、米曲霉、小巢状曲菌)、枝顶孢属(例如嗜热枝顶孢)、毛壳菌属(例如嗜热毛壳菌)、金孢子菌属(如嗜热金孢子菌)、虫草属(例如蛹虫草)、棒囊壳属、栉霉属(Ctenomyces)、镰刀霉(Fusarium)(例如尖孢镰刀菌(F.oxysporum))、小丛壳属(如禾谷球孢菌(G.graminicola))、肉座菌属(例如红褐肉座菌)、稻瘟病菌(如稻瘟菌)、毁丝霉属(例如嗜热毁丝霉)、丛赤壳属(例如血赤壳)、链孢霉菌(例如粗糙链孢菌)、青霉菌、侧孢霉属(例如嗜热侧孢霉)、梭孢壳属(例如太瑞斯梭孢壳霉(T.terrestris)、异宗梭孢壳菌(T.heterothallica))、木霉属(例如里氏木霉)或轮枝菌属(例如由大黄轮枝菌))。

在一个实施例中，真核细胞是昆虫细胞(例如，Sf9、Mimic^TMSf9、Sf21、High Five^TM(BT1-TN-5B1-4)或BT1-Ea88细胞)、藻类细胞(例如，双眉藻属、硅藻纲要(Bacillariophyceae)、杜氏藻属、小球藻属、衣藻属、蓝藻属(蓝藻细菌)、微绿球藻属、螺旋藻属或棕鞭藻属)或植物细胞(例如单子叶植物(例如玉米、水稻、小麦或狗尾草)或双子叶植物(例如，木薯、马铃薯、大豆、番茄、烟草、苜蓿、小立碗藓(Physcomitrella patens)或拟南芥)。

在一个实施例中，细胞是细菌或原核细胞。

在实施例中，原核细胞是革兰氏阳性细胞，例如芽孢杆菌、链霉菌属链球菌、葡萄球菌或乳酸菌。可以使用的芽孢杆菌是，例如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌。在实施例中，细胞是枯草芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌3NA和枯草芽孢杆菌168。芽孢杆菌获得自，例如哥伦布OH43210-1214西12大道556,484生物科学芽孢杆菌遗传库中心(Bacillus Genetic Stock Center，Biological Sciences 556,484West 12^thAvenue，Columbus OH 43210-1214)。

在一个实施例中，原核细胞是革兰氏阴性细胞，例如沙门氏菌属或大肠杆菌，例如TG1、TG2、W3110、DH1、DHB4、DH5a、HMS174、HMS174(DE3)、NM533、C600、HB101、JM109、MC4100、XL1-Blue和Origami，以及来自大肠杆菌B-菌株的那些，例如BL-21或BL21(DE3)，所有这些都是商购获得的。

根据一个具体的实施例，原核细胞选自由大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和假单胞菌组成的组。

根据一个特别优选的实施例，原核细胞是大肠杆菌。

合适的宿主细胞是商购获得的，例如，来自培养物保藏中心，例如DSMZ(Deutsche德国微生物保藏(Sammlung von Mikroorganismen)和德国布伦瑞克细菌培养股份有限公司，(Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany))或美国模式菌种保藏中心(ATCC)。

在实施例中，培养的细胞用于生产肽或目标蛋白(POI)，例如抗体，例如单克隆抗体和/或重组蛋白，用于治疗用途。在实施例中，培养的细胞生产氨基酸、脂肪酸或其它有用的生化中间体或代谢物。例如，在实施例中，可以生产分子量为约4000道尔顿至大于约140000道尔顿的分子。在实施例中，这些分子可以有一系列的复杂性并且可以包括翻译后修饰(包括糖基化)。

根据一个具体的实施例，大多数重组蛋白位于细胞质、周质或细胞外，优选地位于周质。

根据一个具体的实施例，目标蛋白(POI)是重组蛋白。

具体地，POI是真核蛋白，优选地为哺乳动物蛋白。

根据本发明生产的POI可以是多聚体蛋白，优选二聚体或四聚体。

根据本发明的一个方面，POI是重组或异源蛋白，优选地选自治疗性蛋白，包括抗体或其片段、酶和肽、蛋白质抗生素、毒素融合蛋白、碳水化合物-蛋白缀合物、结构蛋白、调节蛋白、疫苗和疫苗类蛋白(vaccine like proteins)或颗粒、加工酶、生长因子、激素和细胞因子或重组蛋白的代谢产物。

具体的目标蛋白是抗原结合分子，例如抗体或其片段。具体的POI是抗体，例如单克隆抗体(mAb)、免疫球蛋白(Ig)或免疫球蛋白G类(IgG)、重链抗体(HcAb)或其片段，如片段-抗原结合(Fab)、Fd、单链可变片段(scFv)或其工程化变体(engineered variants)，例如Fv二聚体(双特异抗体)、Fv三聚体(三特异抗体)、Fv四聚体或微抗体和单结构域抗体，例如VH或VHH或V-NAR。

根据一个特别优选的实施例，重组蛋白是免疫球蛋白，优选地为抗体或抗体片段，最优选地为Fab或scFv抗体。

在其它实施例中，目标蛋白(POI)是，例如BOTOX、肉毒杆菌、肉毒毒素制剂、益普生肉毒杆菌素(Dysport)(或其它肉毒杆菌神经毒素的血清型)、葡糖苷酶α、达托霉素、YH-16、绒毛膜促性腺激素α，非格司亭、西曲瑞克、白细胞介素-2、阿地白介素、替西白介素(teceleulin)、地尼白介素、干扰素α-n3(注射)、干扰素α-nl、DL-8234、干扰素、三得利(γ-1a)、干扰素γ、胸腺素α1、他索纳明、DigiFab、ViperaTAb、EchiTAb、CroFab、奈西立肽、阿巴西普、阿法赛特、利比、艾投特明α(eptoterminalfa)、特立帕肽(骨质疏松症)、注射用降钙素(骨病)、降钙素(鼻，骨质疏松症)、依那西普、谷他血红蛋白250(牛)(hemoglobinglutamer 250(bovine))、屈特尔康金α(drotrecogin alpha)、胶原酶、卡培立肽、重组人表皮生长因子(局部凝胶，伤口愈合)、DWP401、达贝泊汀α(darbepoetin alpha)、依泊汀ω(epoetin omega)、依泊丁β、依泊丁α、地西卢定、来匹芦定、比伐卢定、诺那凝血素α、凝血因子Ⅸ粉针剂(Mononine)、依他凝血素α(活化)、重组因子VIII+VWF、浓缩的重组抗血友病因子、重组因子VIII、因子VIII(重组)、血源性凝血因子(Alphanate)、辛凝血素α(octocogalpha)、因子VIII、帕利夫明、印地激酶(indikinase)、替奈普酶、阿替普酶、帕米普酶、瑞替普酶、那替普酶、孟替普酶、促滤泡素α、rFSH、hpFSH、米卡芬净、非格司亭、来格司亭、那托司亭、舍莫瑞林、胰高血糖素、艾塞那肽、普兰林肽、伊米苷酶(iniglucerase)、加硫酶、留可曲平(leucotropin)、莫拉司亭(molgramostirn)、醋酸曲普瑞林、组氨瑞林(皮下植入物，Hydron)、地洛瑞林、组氨瑞林、那法瑞林、亮丙瑞林缓释库(缓释给药系统)、亮丙瑞林植入物(DUROS)、戈舍瑞林、尤得盼(Eutropin)、KP-102程序(KP-102 program)、促生长激素、美卡舍明(生长障碍)、恩夫韦替(enlfavirtide)、Org-33408、甘精胰岛素、赖谷胰岛素、胰岛素(吸入)、赖脯胰岛素、地特胰岛素、胰岛素(口腔，RapidMist)、美卡舍明-林菲培、阿那白滞素、基因重组IL-2、99mTc-阿西肽(apcitide)注射液、麦罗匹德(myelopid)、重组干扰素β-1b、醋酸格拉替雷、格旁(Gepon)、沙格司亭、奥普瑞白介素、人白细胞衍生的α干扰素、倍尔来福(Bilive)、胰岛素(重组)、重组人胰岛素、门冬胰岛素、美卡舍明(mecasenin)、干扰素α-2a、干扰素-α2、阿尔法弗隆(Alfaferone)、复合α干扰素、干扰素α、阿温耐克斯重组人黄体生成素(Avonex'recombinant human luteinizing hormone)、脱氧核糖核酸酶、曲弗明、齐考诺肽、他替瑞林、地博特明α(diboterminalfa)、阿托西班、贝卡普勒明、依替巴肽、扎马拉(Zemaira)、CTC-111、夏伐克-B(Shanvac-B)、HPV疫苗(四价)、奥曲肽、兰瑞肽、安瑟斯替(ancestirn)、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、拉罗尼酶、蓝铜胜肽(外用凝胶)、拉布立酶、兰尼单抗、干扰素γ-1b、佩乐能、曲可明(Tricomin)、重组屋尘螨过敏脱敏注射液、重组人甲状旁腺激素(PTH)1-84(sc，骨质疏松症)、依泊汀δ、转基因抗凝血酶III、格兰蒂曲平(Granditropin)、透明质酸酶、重组胰岛素、干扰素-α(口服含片)、GEM-21S、伐普肽、艾度硫酸酯酶(idursulfase)、奥马曲拉(omnapatrilat)、重组血清白蛋白、赛妥珠单抗、羧肽酶(glucarpidase)、人重组C1酯酶抑制剂(血管神经性水肿)、拉诺替普酶、重组人生长激素、恩夫韦肽(无针注射，生物喷射器200(Biojector 2000))、VGV-1、干扰素(α)、芦西纳坦(lucinactant)、阿肽地尔(吸入，肺部疾病)、艾替班特、艾卡拉肽(ecallantide)、奥米加南、奥罗格雷(Aurograb)、醋酸培西加南、ADI-PEG-20、LDI-200、地加瑞克、贝辛白介素(cintredelinbesudotox)、Favld、MDX-1379、ISAtx-247、利拉鲁肽、特立帕肽(骨质疏松症)、替法可近、AA4500、T4N5脂质体洗剂、卡妥索单抗、DWP413、ART-123、克里萨林(Chrysalin)、去氨普酶、安地普酶、绒促卵泡素α(corifollitropinalpha)、TH-9507、替度鲁肽、戴麦德(Diamyd)、DWP-412、生长激素(缓释注射)、重组G-CSF、胰岛素(吸入，AIR)、胰岛素(吸入，Technosphere)、胰岛素(吸入，AERx)、RGN-303、DiaPep277、干扰素β(丙型肝炎病毒感染)(HCV))、干扰素α-n3(口服)、贝拉西普(belatacept)、透皮胰岛素贴剂、AMG-531、MBP-8298、Xerecept、奥培巴坎、AIDSVAX、GV-1001、LymphoScan、豹蛙酶、利普散(Lipoxysan)、卢舒普肽、MP52(β-磷酸三钙载体、骨再生)、黑色素瘤疫苗、西普乐克-T(sipuleucel-T)、CTP-37、印瑟吉(Insegia)、维特斯朋(vitespen)、人凝血酶(冷冻，手术出血)、凝血酶、TransMID、蛇毒纤溶酶(alfimeprase)、普瑞凯希、特利加压素(静脉注射，肝肾综合征)、EUR-1008M、重组FGF-I(注射，血管疾病)、BDM-E、罗替格普肽(rotigaptide)、ETC-216、P-113、MBI-594AN、耐久霉素(吸入，囊性纤维化)、SCV-07、OPI-45、内皮抑素、血管抑制素、ABT-510、鲍曼-伯克抑制剂浓缩物(Bowman Birk Inhibitor Concentrate)、XMP-629、99mTc-Hynic-磷脂结合蛋白V、卡哈拉德F(kahalalide F)、CTCE-9908、替维瑞克(延长释放)、奥扎里克(ozarelix)、罗米德普(rornidepsin)、BAY-504798、白细胞介素4、PRX-321、佩斯坎(Pepscan)、埃布他德金(iboctadekin)、rh乳铁蛋白、TRU-015、IL-21、ATN-161、西仑吉肽、白蛋白干扰素、Biphasix、IRX-2、ω干扰素、PCK-3145、CAP-232、帕西瑞肽、huN901-DMI、卵巢癌免疫治疗疫苗、SB-249553、Oncovax-CL、OncoVax-P、BLP-25、CerVax-16、多表位肽黑色素瘤疫苗(MART-1，gp100，酪氨酸酶)、奈米非肽、rAAT(吸入)、rAAT(皮肤病学)、CGRP(吸入，哮喘)、培那西普(pegsunercept)、胸腺素β4、普利德普(plitidepsin)、GTP-200、雷莫拉宁、GRASPA、OBI-1、AC-100、鲑鱼降钙素(口服，艾力更(eligen))、降钙素(口服，骨质疏松症)、艾沙瑞林、卡普瑞林、卡德法(Cardeva)、维拉弗明(velafermin)、131I-TM-601、KK-220、T-10、乌拉立肽、地来司他(depelestat)、赫马肽(hematide)、克里萨林(Chrysalin)(局部)、rNAPc2、重组因子V111(聚乙二醇化脂质体)、bFGF、聚乙二醇化重组葡萄球菌激酶变体、V-10153、SonoLysis Prolyse、NeuroVax、CZEN-002、胰岛细胞新生疗法(islet cellneogenesis therapy)、rGLP-1、BIM-51077、LY-548806、艾塞那肽(控制释放，微球体(Medisorb))、AVE-0010、GA-GCB、阿伏瑞林、ACM-9604、乙酸利那洛肽(linaclotideacetate)、CETi-1、赫莫斯盘(Hemospan)、VAL(可注射的)、速效胰岛素(可注射的、Viadel)、鼻内胰岛素、胰岛素(吸入)、胰岛素(口服、艾力更(eligen))、重组甲硫氨酸人瘦素、皮崔金拉(pitrakinra)(皮下注射，湿疹)、皮崔金拉(吸入干粉，哮喘)、白细胞介素注射剂、RG-1068、MM-093、NBI-6024、AT-001、PI-0824、Org-39141、Cpn10(自身免疫疾病/炎症)、ta乳铁传递蛋白(talactoferrin)(局部)、rEV-131(眼科)、rEV-131(呼吸系统疾病)、口服重组人胰岛素(糖尿病)、RPI-78M、奥普瑞白介素(口服)、CYT-99007CTLA4-Ig、DTY-001、伐拉司特(valategrast)、干扰素α-n3(局部)、IRX-3、RDP-58、涛弗隆(Tauferon)、胆盐刺激脂肪酶、梅里斯普酶(Merispase)、碱性磷酸酶、EP-2104R、美拉诺坦-II(Melanotan-II)、布雷默浪丹、ATL-104、重组人微纤溶酶、AX-200、SEMAX、ACV-1、Xen-2174、CJC-1008、强啡肽A、SI-6603、LAB GHRH、AER-002、BGC-728、疟疾疫苗(病毒体，PeviPRO)、ALTU-135、细小病毒B19疫苗、流感疫苗(重组神经氨酸酶)、疟疾/HBV疫苗、炭疽疫苗、Vacc-5q、Vacc-4x、HIV疫苗(口服)、HPV疫苗、达特类毒素(Tat Toxoid)、YSPSL、CHS-13340、PTH(1-34)脂质体乳膏(Novasome)、奥斯布尔(Ostabolin-C)、PTH类似物(局部，牛皮癣)、MBRI-93.02、MTB72F疫苗(结核病)、MVA-Ag85A疫苗(结核病)、FARA04、BA-210、重组鼠疫FIV疫苗、AG-702、OxSODrol、rBetV1、Der-p1/Der-p2/Der-p7过敏原靶向疫苗(尘螨过敏)、PR1肽抗原(白血病)、突变体ras疫苗、HPV-16E7脂肽疫苗、迷路(labyrinthin)疫苗(腺癌)、CML疫苗、WT1-肽疫苗(癌症)、IDD-5、CDX-110、明曲斯(Pentrys)、诺雷林(Norelin)、CytoFab、P-9808、VT-111、艾罗卡肽(icrocaptide)、替柏明(telbermin)(皮肤病、糖尿病足溃疡)、芦平曲韦、雷替库罗(reticulose)、rGRF、HA、α-半乳糖苷酶A、ACE-011、ALTU-140、CGX-1160、血管紧张素治疗性疫苗、D-4F、ETC-642、APP-018、rhMBL、SCV-07(口服，结核)、DRF-7295、ABT-828、ErbB2比免疫毒素(抗癌)、DT3SSIL-3、TST-10088、PRO-1762、库姆波托(Combotox)、缩胆囊素-B/胃泌素受体结合肽、111In-hEGF、AE-37、曲妥珠单抗(trasnizumab)-DM1、拮抗剂G、IL-12(重组)、PM-02734、IMP-321、rhIGF-BP3、BLX-883、CUV-1647(局部)、基于L-19的放射免疫治疗剂(癌症)、Re-188-P-2045、AMG-386、DC/1540/KLH疫苗(癌症)、VX-001、AVE-9633、AC-9301、NY-ESO-1疫苗(肽)、NA17.A2肽、黑素瘤疫苗(脉冲抗原治疗药)、前列腺癌疫苗、CBP-501、重组人乳铁蛋白(干眼症)、FX-06、AP-214、WAP-8294A(可注射的)、ACP-HIP、SUN-11031、肽YY[3-36](肥胖，鼻内)、FGLL、阿塞西普、BR3-Fc、BN-003、BA-058、人甲状旁腺激素1-34(鼻，骨质疏松症)、F-18-CCR1、AT-1100(乳糜泻/糖尿病)、JPD-003、PTH(7-34)脂质体乳膏(Novasome)、耐久霉素(眼科，干眼症)、CAB-2、CTCE-0214、Glyco聚乙二醇化促红细胞生成素、EPO-Fc、CNTO-528、AMG-114、JR-013、因子XIII、氨基康定、PN-951、716155、SUN-E7001、TH-0318、BAY-73-7977、替维瑞克(立即释放)、EP-51216、hGH(控制释放，Biosphere)、OGP-I、西夫韦肽、TV4710、ALG-889、Org-41259、rhCC10、F-991、胸腺五肽(肺病)、r(m)CRP、肝脏选择性胰岛素(hepatoselective insulin)、速碧林、L19-IL-2融合蛋白、弹性蛋白酶抑制剂、NMK-150、ALTU-139、EN-122004、rhTPO、血小板生成素受体激动剂(血小板减少症)、AL-108、AL-208、神经生长因子拮抗剂(疼痛)、SLV-317、CGX-1007、INNO-105、口服特立帕肽(eligen)、GEM-OS1、AC-162352、PRX-302、LFn-p24融合疫苗(Therapore)、EP-1043、小儿肺炎(S pneumoniae pediatric)疫苗、疟疾疫苗、脑膜炎奈瑟菌B组疫苗、新生儿B族链球菌疫苗、炭疽疫苗、HCV疫苗(gpE1+gpE2+MF-59)、中耳炎治疗、HCV疫苗(核心抗原+ISCOMATRIX)、hPTH(1-34)(透皮，ViaDerm)、768974、SYN-101、PGN-0052、阿维库明(aviscumnine)、BIM-23190、结核疫苗、多表位酪氨酸酶肽、癌症疫苗、恩卡斯替母(enkastim)、APC-8024、GI-5005、ACC-001、TTS-CD3、血管靶向TNF(实体瘤)、去氨加压素(口腔控制释放)、奥那西普或TP-9201。

在一些实施例中，POI是阿达木单抗(HUMIRA)、英夫利昔单抗(REMICADE^TM)、利妥昔单抗(RITUXAN^TM/MAB THERA^TM)、依那西普(ENBREL^TM)、贝伐单抗(AVASTIN^TM)、曲妥单抗(HERCEPTIN^TM)、培非司亭(pegrilgrastim)(NEULASTA^TM)或任何其它合适的POI，包括生物仿制药和生物仿生药(biobetters)。

其它合适的POI是下表1和US2016/0097074中列出的那些。

表1

在一些实施例中，POI是表2所示的激素、血液凝结(blood clotting)/凝血(coagulation)因子、细胞因子/生长因子、抗体分子、融合蛋白、蛋白疫苗或肽。

表2：示例性POI

在一些实施例中，POI是多特异性蛋白，例如表3所示的双特异性抗体。

表3：POI的双特异性形式

本文所述的装置、设施和方法适用于培养任何所需的细胞系，包括原核和/或真核细胞系。此外，在实施例中，装置、设施和方法适用于培养任何细胞类型，包括悬浮细胞或贴壁依赖性(贴壁)细胞，并且适用于生产操作，所述生产操作配置为生产药物和生物制药产品，例如多肽产品(目标蛋白(POI))、核酸产物(例如DNA或RNA)或细胞和/或病毒，例如用于细胞和/或病毒治疗的那些。

在实施例中，细胞表达或生产产物，例如重组治疗性或诊断性产物。如下文更详细描述的，由细胞生产的产物的实例包括但不限于POI，例如本文所示的POI，包括抗体分子(例如，单克隆抗体、双特异性抗体)、抗体模拟物(与抗原特异性结合但与抗体在结构上不相关性的多肽分子，例如DARPin、亲合体、非免疫球蛋白的配体(adnectin)或IgNAR)、融合蛋白(例如，Fc融合蛋白、嵌合细胞因子)、其它重组蛋白(例如，糖基化蛋白、酶、激素)或病毒治疗剂(例如，用于基因治疗和病毒免疫治疗的抗癌溶瘤病毒、病毒载体)、细胞治疗剂(例如，多功能干细胞、间充质干细胞和成体干细胞)、疫苗或脂质包封的颗粒(例如，外来体、病毒类颗粒)、RNA(例如siRNA)或DNA(例如质粒DNA)、抗生素或氨基酸。在实施例中，所述的装置、设施和方法可用于生产生物仿制药。

如上所述，在实施例中，所述的装置、设施和方法允许生产真核细胞，例如哺乳动物细胞或低等真核细胞，例如酵母细胞或丝状真菌细胞；或原核细胞，例如革兰氏阳性细胞或革兰氏阴性细胞和/或真核或原核细胞的产物，例如POI，包括蛋白质、肽或抗生素、氨基酸、核酸(例如DNA或RNA)，由所述细胞以大规模的方式合成。除非本文另有说明，否则所述的装置、设施和方法可以包括任何所需的体积或生产能力，包括但不限于实验室规模、中试规模和全生产规模能力。

此外，除非本文另有说明，否则所述的装置、设施和方法可包括任何合适的反应器，包括但不限于搅拌罐、空气提升泵(airlift)、纤维、微纤维、中空纤维、陶瓷基质、流化床、固定床和/或喷射床生物反应器。本文所用的“反应器”可以包括发酵罐或发酵单元或任何其它反应容器，术语“反应器”与“发酵罐”可以互换使用。例如，在一些方面，示例性生物反应器单元可以执行以下中的一个或多个或全部：进料营养物和/或碳源、注入合适的气体(例如氧气)、发酵或细胞培养基的进口和出口流量、分离气相和液相、维持温度、维持氧气和CO₂水平、维持pH水平、搅动(例如，搅拌)和/或清洁/消毒。示例性反应器单元，例如发酵单元，在单元内可以包括多个反应器，例如该单元可以具有1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100或更多个生物反应器，在每个单元和/或设施中可以包括多个反应单元，每个单元在设施中具有一个或的多个反应器。在各个实施例中，生物反应器可以适用于分批、半分批补料、分批补料、灌注和/或连续发酵过程。可以使用任何合适的反应器直径。在实施例中，生物反应器的体积可以为约100mL至约50000L。非限制性实例包括100mL、250mL、500mL、750mL、1L、2L、3L、4L、5L、6L、7L、8L、9L、10L、15L、20L、25L、30L、40L、50L、60L、70L、80L、90L、100L、150L、200L、250L、300L、350L、400L、450L、500L、550L、600L、650L、700L、750L、800L、850L、900L、950L、1000L、1500L、2000L、2500L、3000L、3500L、4000L、4500L、5000L、6000L、7000L、8000L、9000L、10000L、15000L、20000L和/或50000L的体积。另外，合适的反应器可以是多次使用的、单次使用的、一次性的或非一次性的，并且可以由任何合适的材料形成，包括金属合金，例如不锈钢(例如316L或任何其它合适的不锈钢)和铬镍铁合金、塑料和/或玻璃。

在实施例中，除非本文另有说明，否则本文所述的装置、设施和方法还可以包括未提及的任何合适的单元操作和/或设备，例如用于分离、纯化以及分离此类产物的的操作和/或设备。可以使用任何合适的设施和环境，例如传统的杆式设施、模块化、移动和临时设施或任何其它合适的结构、设施和/或布局。例如，在一些实施例中，可以使用模块化洁净室。另外，除非另有说明，否则本文所述的装置、系统和方法可以在单个位置或设施中容纳(housed)和/或执行，或者在分开的或多个位置和/或设施处容纳和/或执行。

作为非限制性实例并且并非限制本发明，美国公开号2013/0280797、2012/0077429、2011/0280797、2009/0305626和美国专利号8,298,054、7,629,167和5,656,491描述了可能适合的示例性设施、设备和/或系统，其全部内容通过引用并入本文。

附图说明

图2A：在诱导点具有不同的预诱导比生长速率和不同的生物质浓度的示例性给料曲线；

图2B缩放和居中的多元线性回归模型：x_EFB诱导时的生物质[g/L]和μFB预诱导比生长速率[1/h]作为线性项包括在内。最大比滴度作为响应。

图3A和3B缩放和居中的多元线性回归模型。

图3C：具有缩放和居中值的主要成分分析。

图4A：最大比滴度[g/g]与诱导阶段的平均比生长速率[1/h]的相关性。

图4B：最大比滴度[g/g]与预诱导结束时计算的比基质摄取速率q_Sinit[g/g/h]的相关性。

图4C：统计回归分析：将比生长速率[1/h]与作为响应的最大比滴度相关。

图4D：统计回归分析：将预诱导阶段结束时计算的比基质摄取速率q_Sinit[g/g/h]与作为响应的最大比滴度相关。

图5A：绘制了比滴度、比生产率qp[g/g/h]、给料速率[g/h]、比生长速率μ[1/h]和比基质摄取速率q_S[g/g/h]随诱导后的时间[h]变化的轨迹线。

图5B：绘制了比滴度、比生产率qp[g/g/h]、给料速率[g/h]、比生长速率μ[1/h]和比基质摄取速率q_S[g/g/h]随dSn累积的给料基质与诱导时生物质的量[g/g]的归一化的轨迹线。

图5C：统计回归分析：将直到最大的比滴度的时间h_max[h]与作为响应的最大比滴度相关。

图5D：统计回归分析：将dSn累积的给料基质与诱导时生物质的量[g/g]的归一化与作为响应的最大比滴度相关(公式4)。

图6A示出了初始基质摄取速率与最大比滴度的相关性。

图6B示出了平均基质摄取速率与最大比滴度的相关性。

图6C-E：在进行的实验中(n＝12)观察的和诱导的变化的比较，qs_init-恒定表示用恒定q_Sinit进行的实验组；qs_init变化表示进行的实验组以研究不同的体积恒定给料方案的影响；图6C示出了q_sinit[g/g/h]的诱导变化；图6D示出了q_S[g/g/h]的计算变化；图6示出了最大比滴度[g/g]的最终变化；

图6F：平均比基质摄取速率对最大比滴度的影响的统计分析。

图6G：初始比基质摄取(公式3)速率对最大比滴度的影响的统计分析。

具体实施方式

提供了通过培养细胞来改进目标蛋白的生产的方法，其中给料策略基于比基质摄取。该方法涉及计算、设定和任选地控制比基质摄取速率q_S。

就生理的给料策略而言，考虑生理改进了重组产物的制备。因此，基于至少一次或及时解决的生物质估计来计算给料策略。这种方法有助于改进一种或多种目标蛋白的比活性和/或提高一种或多种目标蛋白的生产率。

令人惊讶地，这种方法导致一种或多种目标蛋白的比活性和/或产率或滴度增加，特别是在基质可用性低的情况下。

在整个说明书中使用的具体术语具有以下含义。

术语“培养”细胞是指在适合细胞存活和/或生长和/或增殖的条件下使细胞与细胞培养基接触。

本文所用的术语“培养物”和“细胞培养物”是指在适于细胞群存活和/或生长的条件下悬浮在细胞培养基中的细胞群。如本文所用，这些术语可以指这样的组合，其包含细胞群(例如，宿主细胞培养物)和培养基，其中细胞群悬浮在培养基中。

本文所用的术语“细胞培养基”是指用于细胞维持、生长、繁殖或扩增的营养液。对于具体的细胞培养用途，可以将细胞培养基优化，包括例如，配制促进细胞生长的细胞培养生长培养基或配制促进重组蛋白生产的细胞培养生产培养基。术语营养素、成分和组分在本文中可互换使用，其是指构成细胞培养基的成分。

关于细胞培养基的术语“化学上确定的”，例如分批补料过程中的给料培养基，是指适于生产细胞系的体外细胞培养物的生长培养基，其中所有的化学成分和肽是已知的。通常，化学上确定的培养基完全不含动物来源的成分，并且代表纯净且一致的细胞培养环境。

本文所用的术语“给料”或“给料培养基”是指：给料或给料培养基包含基质或碳源，其可以是化学上确定的或复合培养基或其混合物。给料或给料培养基可以包含调节控制序列(例如启动子)的诱导剂(inductor)或诱导物(inducer)。

本文使用的术语“诱导剂(inductor)”或“诱导物(inducer)”是指能够诱导POI表达的物质。可以将诱导剂或诱导物作为给料的一部分加入到细胞培养物中或单独加入到细胞培养物中。在消耗诱导表达系统的情况下，缺乏这种诱导剂或“诱导物”会触发POI表达。

本文所用的术语“诱导”是指在相应的生物过程中的时间点，在该时间点通过补充诱导物或通过消耗某种化学化合物来改变代谢以促进POI表达。

本文所用的术语“诱导阶段”是指预诱导后细胞培养的时间段，在诱导期间细胞生产重组蛋白或POI。

本文所用的细胞培养的“产生阶段”是指这样的时间段，在此期间细胞生长达到稳定或维持在接近恒定的水平。在产生阶段，对数细胞生长已经结束，主要是生产POI。在此时间段，通常对培养基进行补充以支持持续的蛋白质生产并实现所需的POI。

本文所用的术语“宿主”或“细胞”或“细胞系”是指建立的特定细胞类型的克隆，所述特定细胞类型已经获得长时间增殖的能力。术语“宿主细胞系”是指细胞系，用于表达内源或重组基因或代谢途径的产物以生产多肽或由此类多肽介导的细胞代谢物。“生产宿主细胞系”或“生产细胞系”通常理解为即将用于在生物反应器中培养的细胞系，以获得生产过程的产物，例如POI。术语“真核宿主”或“真核细胞”或“真核细胞系”是指任何真核细胞或生物体，术语“原核宿主”或“原核细胞”或“原核细胞系”是指任何原核细胞或生物体，可以对其中的每种进行培养以生产目标蛋白(POI)或宿主细胞代谢物。众所周知，该术语不包括人。

术语“表达”或“表达系统”或“表达盒”是指核酸分子，其包括或包含编码POI的所需编码序列以及可操作连接的控制序列，使得用这些序列转化或转染的宿主能够生产编码的蛋白质，例如POI或宿主细胞代谢物。优选地，细胞包括编码重组目标蛋白(POI)的核酸。优选地，控制序列是启动子。优选地，启动子是可调节的启动子，例如诱导型启动子。优选地，可调节的或诱导型启动子选自由糖诱导型启动子或消耗诱导型启动子(depletioninducible promoter)组成的组。糖诱导型启动子可以是鼠李糖启动子(rhaBAD，WO2006061174A2)、蜜二糖启动子(WO2006061173A2)、阿拉伯糖启动子、乳糖启动子或甘露糖启动子(WO2011018376A1)。消耗诱导型启动子可以是，例如磷酸盐消耗诱导型启动子，例如phoA(EP0177343)；或碳源消耗诱导型启动子，例如pG1、pG3、pG4、pG6、pG7或pG8(WO2013050551A1)。或者，启动子可以是组成型启动子(例如pCS1(WO2014139608A1))、AOX启动子、T5启动子、T7启动子或IPTG诱导型启动子。表达系统或表达盒还可以包括编码信号肽的信号序列或分泌序列，以允许释放或分泌POI。优选的信号序列是大肠杆菌ompA、pelB、lamB、malE、phoA、bla、OppA、TreA、MppA或BglX，或毕赤酵母属(Pichia)或巴斯德毕赤酵母(Komagataella)α交配因子或EPX-L(WO2014067926)。为了实现转化，表达系统可以包含在载体中；然而，也可以将相关的DNA整合到宿主染色体中。表达可以指分泌或非分泌的表达产物，包括多肽或代谢物。

根据其它具体的实施例，启动子和/或信号序列不与编码重组蛋白或POI的基因天然地相关，其中重组蛋白或POI是异源蛋白，优选地选自治疗性蛋白，包括免疫球蛋白，例如抗体或其片段、酶和肽、蛋白质抗生素、毒素融合蛋白、碳水化合物-蛋白缀合物、结构蛋白、调节蛋白、疫苗和疫苗类蛋白或颗粒、加工酶、生长因子、激素和细胞因子或POI的代谢物。

具体地，重组蛋白或POI是真核蛋白，优选哺乳动物蛋白。根据本发明生产的重组蛋白或POI可以是多聚体蛋白，优选二聚体或四聚体。根据本发明的一个方面，重组蛋白或POI是异源蛋白，优选地选自治疗性蛋白，包括免疫球蛋白，例如抗体或其片段、酶和肽、蛋白质抗生素、毒素融合蛋白、碳水化合物-蛋白缀合物、结构蛋白质、调节蛋白、疫苗和疫苗类蛋白或颗粒、加工酶、生长因子、激素和细胞因子或重组蛋白的代谢产物。具体的重组蛋白或POI是抗原结合分子，例如抗体或其片段。具体的重组蛋白或POI是抗体，例如单克隆抗体(mAb)、免疫球蛋白(Ig)或免疫球蛋白G类(IgG)、重链抗体(HcAb)或其片段，例如片段-抗原结合(Fab)、Fd、单链可变片段(scFv)或其工程化变体，例如Fv二聚体(双特异抗体)、Fv三聚体(三特异抗体)，Fv四聚体或微抗体和单结构域抗体，例如VH或VHH或V-NAR。

本文所用的术语“预诱导阶段”是指在诱导阶段之前细胞培养的时间段，即在加入诱导剂或诱导物之前细胞培养的时间段。

本文所用的术语“基质”或“碳源”是指可代谢的碳基质，通常是碳水化合物，适合作为微生物的碳源。基质或碳源可以是适用于细胞培养的任何类型的有机碳。根据一个具体的实施例，碳源是碳水化合物或糖(例如己糖，如葡萄糖、果糖、半乳糖或甘露糖；二糖，如蔗糖)、醇(如甘油或乙醇)或其混合物。根据另一个具体的实施例，基质或碳源是葡萄糖或甘油或其混合物。基质或碳源也称为初级碳源，即用于生物质生产或合成代谢，因为其是比其它次级基质或碳源优先代谢的碳源，而细胞不太优选地代谢所述次级基质或碳源。优先代谢的基质或碳源不同于可以作为诱导物的碳源(次级碳源)，所述诱导物用于碳源诱导型启动子，例如诱导AOX启动子的甲醇、诱导甘露糖启动子的甘露糖、诱导鼠李糖启动子的鼠李糖、诱导蜜二糖启动子的蜜二糖或诱导阿拉伯糖启动子的阿拉伯糖。

本文使用的“基质给料速率”是指基质，例如碳源(c-源)，速率以g/L/h或c-mol/L/h或ml/L/h给料，即每发酵体积和时间单位的碳源量。换句话说，基质给料速率是维持细胞代谢所需的碳源量。优选地，部分地或在整个分批补料阶段期间连续应用基质给料速率。

本文所用的术语“给料策略”是指在整个诱导阶段向生物反应器中的微生物确定地供应基质的方法。

本文所用的术语“计算”是指在不同的时间点估计基质摄取速率，其通常通过应用离线生物质测量来进行。

本文所用的术语“设定”是指根据至少一次生物质估计基于q_S调节基质给料速率设定点或曲线。

本文所用的术语“至少”是指这样的情况，其中具体值等同于所述具体值或比所述具体值更大。例如，“至少1”应理解为等同于“1或更大”，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15……等。

本文所用的术语“控制”是指有规律的重复计算基质摄取速率并且随后(重新)调整给料速率。这通常通过实时估计/测量生物质来完成，实时估计/测量生物质有助于计算比基质摄取速率和随后的自动调整给料速率。

本文所用的术语“生物质估计”应指基于在线或离线确定或估计生物反应器中的生物质含量来定量生物质。

本文所用的术语细胞的“维持率”或“细胞维持率”是指细胞对生理功能的管理/维持所需求的能量，包括例如维持细胞膜上的浓度梯度、DNA修复或RNA合成。在维持率时，没有或几乎没有净生物质合成产生或甚至略微减少，并且比生长速率μ约为零(0)或低于0。本文所用的术语“接近于维持率”包括如上限定的维持率以及比所述维持率高约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、或约10％、或约5％、或约3％或约2％的值。在略高于维持率的条件下，细胞生物质合成可以发生，并且比生长速率μ接近0，或高于或略高于0。在优选的实施例中，比维持率略高的μ值在0.0001-0.0004/h、0.0005-0.0009/h、0.001-0.004/h、0.005-0.009/h、0.01-0.04/h、0.05-0.09/h或0.1-0.2/h的范围内，优选地在0.005-0.015/h的范围内，最优选地在0.008-0.0012的范围内。

本文使用的术语“软传感器”是指通过对容易获得的工艺数据进行数学处理，来授权访问重要的非测量工艺变量的处理分析装置。与硬型传感器相比，软传感器通常具有降低的成本，并且不会破坏系统的无菌屏障。

本文所用的术语“硬传感器”是指用于测量重要的工艺变量(例如肉汤(broth)浊度、肉汤荧光或介电常数)的处理装置。

除非在上下文中具体说明或显而易见，否则本文所用的术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可以理解为在规定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％的范围内。

生物质-比基质摄取速率q_S直接与细胞培养物的生理状态相关联，因此高度影响生物质-比生产率q_P。为了控制参数q_S从而控制比生产率q_P，必须知道发酵罐中给定时间点的生物质浓度。

本文所用的术语“实时生物质估计”是指基于生物质的估计在运行过程中进行实时生物质估计。由蛋白质过表达引起的能量代谢的诱导改变导致产率系数的变化(Jenzsch,Simutis et al.2006,Schaepe,Kuprijanov et al.2014)。因此，已经报道了用于实时生物质估计的各种方法(Riesenberg,Schulz et al.1991,de Assis and Filho2000,Jobe,Herwig et al.2003,Jenzsch,Gnoth et al.2006,Jenzsch,Simutis etal.2006,Passrinha,Bonifacio et al.2009,Dabros,Schuler et al.2010)。根据生物质估计的基本原理可以对这些实时方法进行分类：硬型传感器(Dabros,Dennewald etal.2009)和基于模型(Jenzsch,Simutis et al.2006,Jenzsch,Gnoth et al.2006)。基于模型的方法的实例是使用软传感器(Wechselberger 2013)。软传感器背后的核心思想是使用相对容易访问的在线日期来估计重要的工艺变量。

术语“q_Sinit”是指比基质摄取速率，通过设定给料速率在诱导点达到比基质摄取速率。本文所用的术语“q_S”是指在工艺阶段中适时变比的基质摄取速率的平均值。

与现有技术的知识相反，本发明首次说明了第一个令人惊讶的发现，即异常低的(未控制的和控制的)q_S值导致重组表达的蛋白的生产率增加。第二个令人惊讶的发现是，在产生阶段期间，将生理参数比基质摄取速率q_S主动控制在恒定的低水平时，重组蛋白的滴度可以增加至50％。

此外，可利用硬件探针，其允许在建立工艺和生物体-比校准后，实时在线测量生物质。这些商购获得的生物质测量基于例如电容测量(例如阿贝仪器，汉密尔顿(AberInstruments，Hamilton))或光密度(例如梅特勒托莱多(Mettler Toledo))。

如上所述，生物质测量是计算生理参数生物质生长速率μ和基质消耗速率q_S的基础。对于生产率的可转移表达，生物质值也是必要的：

(1)μ＝1/X*dX/dt

(2)q_S＝1/X*dS/dt

(3)q_P＝1/X*dP/dt

μ生物质生长速率[1/h]

X生物质浓度[g/L]

q_S生物质-比基质摄取速率[g/g/h]

S基质浓度[g/L]

q_P生物质-比生产率[g/g/h]

P产物浓度[g/L]

t培养时间[h]

在分批补料发酵中，给料基质立即被细胞消耗。因此，基质摄取速率等于生物质-比基质给料速率，因此可以从给料料泵的泵速和当前生物质浓度中去除。这两个值，生长速率和基质摄取速率都与生物质-基质产率系数Y_X/S相关联：

(4)Y_X/S＝μ/q_S

Y_X/S生物质-基质产率系数[g/g]

从公式4得出，如果已知产率系数Y_X/S，则μ可以直接转换为q_S，反之亦然。如果Y_X/S不是恒量，则这种转换很复杂。如果重组表达的蛋白对细胞的代谢状态有显著影响，则在生产期间观察到Y_X/S值的变化。对于许多蛋白来说均是如此，因为它们的表达给细胞蛋白合成和能量代谢带来了代谢负担。

通过将微生物生长μ描述为正好是细胞的基质摄取q_S的结果，可以概括μ和q_S之间的生理差异。控制细胞生理的主要参数(除环境因素外)是营养素的可利用性。只有当营养素时可利用时，细胞才能转化它们，用于细胞分裂、(重组)蛋白质生产或维持。这种相关性如公式5所述：

(5)q_S＝1/Y_X/S*μ+1/Y_P/S*q_P+m*X

Y_P/S产物-基质产率系数[g/g]

m维持系数[1/h]

从这个观点来看，控制上游参数q_S更有意义，而非控制“征兆(symptom)”μ。

如公式4和5所述，μ和q_S之间的相关性由μ＝Y_X/S*q_S给出。对于未诱导的大肠杆菌细胞，产率系数Y_X/S通常为0.4-0.5g/g，但是当诱导POI表达时，产率系数Y_X/S可以明显降低。对于许多重组蛋白，蛋白表达对细胞造成高的代谢负担，即蛋白合成网络和二级过程(例如折叠或水解)消耗大量能量。此外，重组产物甚至可能对细胞有毒并完全阻碍细胞生长(Y_X/S～0)。

μ控制的另一个缺点是技术缺点。比较公式1和2可以看出，μ的计算考虑了两次生物质X的易错测量(与q_S计算中的1X值相比)。尽管存在这种缺点，μ控制通常用于发酵过程，例如Gnoth et al.,2008a中所述。

据我们所知，在文献中没有发现这样的报道，即表明在非常低的营养素供应下生产率提高。甚至在如此低的营养供应下，其仅确保细胞以其维持率或接近本文所定义的其维持率存活。因此，如果给料策略是简单的技术(例如泵速)或生理方法都是无关紧要的，该生理方法使给料策略基于生理变量q_S或甚至μ。

本发明也第一次应用了实时生物质估计，目的是将q_S控制在最佳的水平用于高重组蛋白生产。与现有技术的知识相比，所进行的实验导致第一个令人惊讶的发现，即在整个诱导阶段期间，当主动控制比基质摄取速率q_S的生理变量时，重组蛋白(例如免疫球蛋白(例如，FAb))的滴度可以增加至50％。

据我们所知，到目前为止，还没有人表明在如此低水平的q_S下，仅通过生理处理控制能触发细胞生产率如此显著的增加。有利的q_S控制的第一个发现通常独立于实际的q_S水平。具体地，如果主动地设定q_S值(优选地，在诱导阶段开始时)至适当的水平并且任选地控制。在诱导阶段，主动地设定比摄取速率并且任选地控制在细胞维持率的范围内，或略高于如上文限定的细胞维持率。

第二个令人惊讶的发现是，异常低的(未控制的和控制的)q_S值通常导致细胞(例如原核细胞，例如大肠杆菌细胞)中重组表达的蛋白(例如抗体片段(Fab))的生产率增加。

据我们所知，并没有报道过给料和q_P之间的相关性，其中已经发现非常低的基质摄取速率q_S对于高q_P是最佳的。因此，我们的发明，其要求最佳的基质给料处于细胞维持非常低水平的范围(其中μ～0且q_S为～0.03-0.15g/g/h)，这是令人惊讶和新的。

因此，令人惊讶地，当与通过常规参数(例如比生长速率μ)控制的细胞培养比较时，将比基质摄取速率q_S设定并任选地还控制在细胞维持率的范围或约比细胞维持率高50％、45％、40％、35％、30％、30％、25％、20％、15％、10％或5％的范围内会导致生产率提高至少约25％、30％、35％、40％、45％或至少约50％。

以下项目进一步提供了本发明的具体方面以及实践本文提供的教导的具体实施例。

1.一种用于生产重组目标蛋白(POI)的方法，包括：

(a)在细胞培养基中培养细胞，通过向所述细胞培养物中加入包含至少一种基质的给料来表达所述POI，

(b)在诱导阶段和/或POI产生阶段期间，基于计算、设定和任选地控制细胞的比基质摄取速率q_S来应用给料策略，其中q_S设定为接近细胞培养物的维持率，和

(c)从细胞培养物中分离所述POI。

2.根据项目1所述的方法，其中q_S在0.03-0.15g/g/h的范围内，优选地在0.05-0.12g/g/h的范围内，更优选地在0.08-0.12g/g/h的范围内，最优选地，q_S为约0.12g/g/h。

3.根据项目1或2所述的方法，其中控制或不控制q_S。

4.根据项目3所述的方法，其中将q_S控制为恒定的，在所述POI的产生阶段期间至少75％、至少80％或至少95％的时间内减少或增加。

5.根据项目3或4所述的方法，其中在所述POI的产生阶段期间至少50％的时间内将q_S控制在恒定值(+/-15％)。

6.根据项目5所述的方法，其中q_S为约0.03g/g/h、0.04g/g/h、0.05g/g/h、0.06g/g/h、0.07g/g/h、0.08g/g/h、0.09g/g/h、0.1g/g/h、0.11g/g/h、0.12g/g/h、0.13g/g/h、0.14g/g/h或0.15g/g/h，最优选的q_S为约0.12g/g/h。

7.根据项目3所述的方法，其中在所述POI的产生阶段期间至少50％的时间内控制和降低q_S。

8.根据项目6所述的方法，其中q_S从0.15减少至0.05g/g/h，优选地从0.15减少至等于或小于0.12g/g/h，从0.15减少至0.10g/g/h，从0.15减少至0.07g/g/h，从0.15减少至0.05g/g/h，从0.12减少至0.1g/g/h，从0.12减少至0.07g/g/h，从0.12减少至0.05g/g/h，从0.1减少至0.07g/g/h，从0.1减少至0.05g/g/h，或从0.1减少至0.03g/g/h。

9.根据前述项目中任一项所述的方法，其中通过调节给料速率来控制q_S。

10.根据前述项目中任一项所述的方法，其中通过反馈控制的比基质摄取速率来控制q_S。

11.根据前述项目中任一项所述的方法，其中通过定量生物质来生理地控制所述给料策略。

12.根据项目11所述的方法，其中通过生物质估计/测量来确定生物质。

13.根据项目12所述的方法，其中通过实时生物质估计/测量来确定生物质。

14.根据项目13所述的方法，其中使用软传感器或硬传感器进行实时生物质测量。

15.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述基质是葡萄糖或甘油。

16.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述细胞选自由真核细胞或原核细胞组成的组。

17.根据项目16所述的方法，其中所述真核细胞选自由哺乳动物、昆虫、酵母、丝状真菌和植物细胞组成的组，优选地为酵母细胞，最优选地为毕赤酵母(Pichia pastoris)、巴斯德毕赤酵母(Komagataella pastoris)、巴斯德毕赤酵母(K.phaffii)或巴斯德毕赤酵母(K.pseudopastoris)。

18.根据项目16所述的方法，其中所述原核细胞选自由大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和假单胞菌组成的组。

19.根据项目所述18的方法，其中所述原核细胞是大肠杆菌。

20.根据项目所述16的方法，其中大部分POI位于细胞质、周质或细胞外。

21.根据前述项目中任一项所述的方法，其中使用表达系统或表达盒表达所述POI，所述表达系统或表达盒包括与编码POI的核酸可操作地连接的可调节的启动子。

22.根据项目21所述的方法，其中所述可调节的启动子是诱导型启动子或消耗诱导型启动子。

23.根据项目21或22所述的方法，其中所述诱导型启动子是鼠李糖启动子、蜜二糖启动子、甘露糖启动子、阿拉伯糖启动子、T5启动子、T7启动子、乳糖启动子或IPTG诱导型启动子。

24.根据项目23所述的方法，其中鼠李糖启动子是rhaBAD。

25.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述POI是异源蛋白，优选地选自治疗性蛋白、酶和肽、蛋白质抗生素、毒素融合蛋白、碳水化合物-蛋白缀合物、结构蛋白、调节蛋白、疫苗和疫苗类蛋白或颗粒、加工酶、生长因子、激素和细胞因子或POI的代谢产物。

26.根据项目25所述的方法，其中所述治疗性蛋白是抗原结合分子，优选地为免疫球蛋白，更优选低为抗体或抗体片段，最优选地为Fab或scFv抗体。

27.根据前述项目中任一项所述的工艺，其中原核细胞是大肠杆菌并且启动子是rhaBAD。

28.一种用于生产重组目标蛋白(POI)的方法，包括：

(a)在细胞培养基中培养细胞，通过向所述细胞培养物中加入包含至少一种基质的给料来表达所述POI，和

(b)将q_S设定为略高于细胞培养物的维持率；和

(c)从细胞培养物中分离所述POI。

根据项目28所述的工艺，其中q_S在0.03-0.15g/g/h的范围内，优选地在0.05-0.12g/g/h的范围内，更优选地在0.08-0.12g/g/h的范围内，最优选地，q_S为约0.12g/g/h。

实例

以下详细说明的实例用于帮助理解本发明，而非意图也不应解释为以任何方式限制本发明的范围。实例不包括常规方法的详细描述，例如克隆、转染和在微生物宿主细胞中表达蛋白质的方法的基本方面。这些方法是本领域技术人员所熟知的。

实例

已经选择双因素筛选设计(DoE)用于研究预诱导比生长速率和诱导点的生物质浓度的影响。为了解释不同生物质浓度的差异，将诱导期间的体积恒定给料速率基于相同的比基质摄取(q_Sinit参见公式3)和(图2)。

为了增加可转移性，研究的目的是观察到的工艺参数与最大比滴度的相关性的生理原因解释。根据相应的DoE的数据，通过主要成分分析的帮助识别最有前景的生理描述符(descriptor)。使用信息挖掘方法，生理应与最大比滴度相关联，以选择后续研究的因素。

因此，生理由单个数值描述，对应于限定的工艺阶段内的时间依赖性生理变量的平均值-生理描述符。

材料和方法

使用改良的K12大肠杆菌菌株作为模型表达系统。该菌株的特征是鼠李糖诱导型表达系统(rhaBAD启动子；WO2006061174A2)。重组蛋白产物是Fab抗体。由于该菌株不能利用鼠李糖作为碳源，因此一次性加入诱导物就足够了。

对于发酵，使用预先确定(predefined)的培养基(Wilms,Hauck et al.2001)。

在DASGIP多生物反应器系统中进行分批补料实验，多生物反应器系统由四个玻璃生物反应器组成，每个玻璃生物反应器的工作体积为2L(Eppendorf，Hamburg，Germany)。反应器配有挡板和三个圆盘叶轮搅拌器。使用DASGIP控制软件v4.5修订版230(DASGIPcontrol software v4.5 revision 230)控制工艺参数：pH(哈密尔顿，雷诺，美国)(Hamilton，Reno，USA)和pO₂(梅特勒-托利多，格里芬湖，瑞士，模块DASGIP PH₄PO₄)(Mettler Toledo，Greifensee，Swizerland；module DASGIP PH₄PO₄)、温度和搅拌器速度(模块DASGIP TC4SC4)和换气(模块DASGIP MX4/4)。通过泵模块DASGIP MP8加入12.5％的NH₄OH碱液实现pH控制。使用相同的泵模块加入给料。将反应器在121℃下灭菌20分钟。通过气体分析仪(模块DASGIP GA4)，分别使用非色散红外和二氧化锆检测原理来确定废气中的CO₂、O₂浓度。通过气体混合模块DASGIP GA4控制气流。

将预培养物从冷冻原液接种到摇瓶中(100mL，在1L烧瓶中)。在30℃和200rpm下培养大约17小时后，使用预培养物体积当量2.5％的分批体积接种分批培养基。接种分批培养基(20g/L C-源)后，分批培养基中的C-源在12小时内消耗。根据公式1和公式2，预诱导给料策略基于指数给料前馈曲线(exponential feed forward profile)。在分批补料后，用鼠李糖诱导培养物。在预诱导结束时根据公式3(Wechselberger et al.,2012)计算诱给料速率，体积给料速率在整个诱导阶段保持恒定。通过向空气中补充纯氧，将溶解的氧气水平(DO₂)控制在25％以上(在35℃1bar接种之前设定为100％)。通过加入12.5％的NH₄OH将pH保持恒定在7，NH₄OH也用作氮源。整个过程的温度设定为35℃。

公式6

F_(t)＝F₀*e^(μ*t)

公式7

F₀＝(x₀*V₀*μ)/(c_给料*Y_xs)

公式8

F_ind＝(x_EFB*V_EFB*q_Sinit)/(c_给料)

在105℃干燥72小时后，通过重力测量定量生物质干细胞重量浓度。通过光度学原理(OD600nm)测量初始生物质浓度，其是用于计算F₀(公式7)所需的。将样品稀释至OD测量的线性范围<0.8，因此通过使用建立的线性回归将其转化为生物质浓度。

将离线样品离心(4300rcf，10min)并用蒸馏水洗涤沉淀，然后储存在-20℃下。将冷冻的沉淀重悬于100mM三异丙基乙磺酰(Tris)、10mM Na-EDTA，pH7.4至终体积20mL，并在1400±100bar下均质6次(Avestin EmulsiFlex，Ottawa，Canada)。

通过使用pH梯度的工业蛋白G亲和色谱法测量产物量。由于只有正确折叠的产物受到限制，因此测量产物量也被视为测量产物质量。

使用Matlab 2012 b(矩阵实验室，纳蒂克，马萨诸塞州，美国)(Mathworks，Natick，Massachusetts，USA)计算代谢速率和产率系数。软件用于计算比速率和产率系数，如Wechselberger等所述(2012，公式8和9)。

由于常规的DoE估计基于各个因素的设定点，因此没有将通常的处理偏差考虑在潜在的设定点偏差触发的潜在掩蔽效应中。为了确保对因素相关性最真实的响应，我们使用实际的梅特工艺变量(met process variable)作为输入而非其单纯的设定点。

对于线性相关性(co-linearity)，用Datalab Version 3.5(由Epina http:// datalab.epina.at/发布)测试变量，通过统计软件MODDE(Umetrics，Sweden)拟合并分析多元线性回归模型。

结果

为了阐明预诱导比生长速率和生物质浓度对诱导阶段生产率的影响，在实验设计后进行了七次发酵(图2A)。选择筛选设计，由此研究了0.08-0.16[1/h]的预诱导比生长速率和20.7-44.6[g/L]的诱导的生物质。为了避免诱导阶段的影响，计算体积恒定给料曲线并且基于相同的q_Sinit，q_Sinit在所有实验中基于公式8计算(0.22+/-0.027[g/g/h])。

为了估计H0假设：“预诱导阶段独立于诱导阶段”，进行了统计学测试。

根据统计分析(图2B)，发现预诱导阶段(μFB)的比生长速率(μ)和诱导时(x_EFB？)的生物质(BM)均未明显影响诱导阶段期间Fab抗体(SCF)的最大比滴度(p＝0.685；α＝0.1)。因此，预诱导阶段和诱导阶段后没有相关性的H0是可以接受的。

根据Wechselberger等(2012)的工作，对于该表达系统，没有检测到预诱导和诱导阶段的相关性。

为了研究预诱导阶段对诱导阶段中的生理的可能影响，将所有在线和离线数据处理成如上所述的比速率和产率系数。

诱导阶段中的平均比生长速率的生理描述符用作两个因素的响应：预诱导比生长速率(μFB)和预诱导结束时的生物质浓度(x_EFB)(图3A)。进一步否定假设的预诱导阶段和诱导阶段的相关性的是这样的发现，即两个主要的生理描述符，即生物质产率系数(Yx/s)(图3A)和诱导阶段的比生长速率(μind)(图3B)与预诱导阶段期间的比生长速率(μFB)和预诱导阶段结束时的生物质浓度(x_EFB)不相关。除了诱导阶段生产率外，诱导阶段生理描述符也不受预诱导比生长速率和生物质浓度的明显影响。然而，虽然最初的实验设计(DoE)因素不明显(图2)，但观察到最大比产物滴度方差的变化(图6A)。这提出了生理解释的问题。

由于观察到的Fab抗体的比滴度的变化(0.0137+/-0.0255[g/g](参见图6A)，为了鉴定生理原因，全面的生物过程分析是至关重要的。因此，使用主要成分分析(图3C)分析了所选择的工艺参数和生理描述符中包含的所有变化。

图3C显示了缩放和居中值的主要成分分析：μ比生长速率[1/h]；μ_FB预诱导阶段期间的比生长速率[1/h]；BM_EFB预诱导阶段结束时的生物质浓度[g/L]；q_S比基质摄取速率[g/g/h]；PSPel最大比滴度[g/g]；时间_max(time_max)直至最大比滴度的时间[h]；dSn_max直至最大比滴度的标准化基质代谢的量[g/g]；q_CO2比二氧化碳排泄率[g/g/h]；qpp比生产率[g/g/h]；Y_CO2s每种基质的二氧化碳产率[g/g]；Ypps每种基质的的产物产率[g/g]；Y_X/S生物质产率[g/g]。

PCA表明比生长速率μ与最大比产物滴度的负相关性(图3C)。然而，在预诱导阶段结束时的生物质BM_EFB和预诱导比生长速率μ_FB这两种预诱导描述符对最大比滴度的影响似乎是微不足道的。生理参数的分析强烈地表明，比生长速率是最大比滴度PSPel改变的原因。

为了进一步的生物过程开发，基于经验数据而非理论风险评估，信息挖掘方法有助于因素选择。结果是，在随后的DoE内指示调整μ。但是，为了高度转移的并且简单化的生物过程，将给料策略限制为恒定的体积流速。计算适当的给料流速需要知道诱导点处相应的生物质浓度。使用μ作为计算基础然后基于q_Sinit进行计算，生物质估计的误差传播风险更大。线性DoE(n＝5)包括两个q_Sinit水平(0.088-0.323[g/g/h])并具有两个中心点。

如图4B所示，观察到最大比滴度q_Sinit水平的负相关性。q_Sinit是最大比滴度的重要因素，置信水平为0.95，R2 0.863/Q2 0.652。达到最低q_Sinit时发现最高的比滴度。

为了影响比生长速率，根据公式8调节给料速率来调整q_Sinit。基于给料速率的研究策略提出了这样的问题，即基质或时间是否是大肠杆菌年龄相关的维度。由于给料速率的强烈影响，滴度的差异可能是由更高的生产率或更高效的产物生产造成的。对于这个原因，我们在x轴上用累积的给料基质的量代替时间(图5B)。归一化是必要的，因为当基于q_Sinit计算时(公式8)，预诱导结束时不同的生物质量意味着不同的给料速率。因此，为了转移性，将给料基质的量相对于预诱导阶段结束时的生物质的量归一化，得到变量dSn[g/g]公式9。

公式9

ΔSn(t)＝(S_t-S_EFB)/BM_EFB

绘制比滴度随时间的变化(图5A)使得达到最大比滴度的时间点的差异可视化。在低q_Sinit实验中，达到最大比滴度比在高q_Sinit实验中晚得多。有趣的是，绘制最大比滴度随dSn的变化(图5B)使得产物形成轨迹线对齐，并且可以在相似的dSn(3.1+/-0.336g/g)找到最大比滴度。

作为q_S的生理描述符的计算在限定的工艺阶段内进行。在该贡献内，计算窗口基于累积的基质摄取dSn。感兴趣的工艺阶段对应于dSn为3.6g/g，其用于计算每个生理描述符。因此，“q_S”是指在dSn为3.6g/g时计算的诱导阶段中的平均q_S。

为了统计分析，比较了达到Fab抗体(SCF)的最大比滴度的时间点(图5C)和归一化的给料基质(dSn)(图5D)。线性回归形式的分析证实，在达到最大比滴度的时间点方面，实验明显不同(R2＝0.639；Q2＝0.505)(图5C)。相反，发现直至最大比滴度时归一化的给料量(dSn)差别不明显(R2＝0.042；Q2＝0.196)(图5D)。差别不明显的给料基质的量dSn达到最大比滴度。虽然最大比滴度的水平取决于q_Sinit(图4B)，但消耗相同量的给料(dSn)直至达到明显不同的最大比滴度。这项发现表明，大肠杆菌使用相同量的给料基质，但产物形成效率不同。因此，差别不明显的基质的量导致不同量的产物，特征在于每种基质的产物产率[g/g]明显不同(F＝16/R2＝0.62)。这些发现表明，dSn是最大比滴度的有力的预测因素，可用于在生物工艺中安排(计时)采样工作。

就信息挖掘而言，基于所有数据所进行的实验用于重新评估先前的发现(图6A/B)。图6C-E使得估计平均和初始基质摄取率的差异引起读者的注意。

考虑到通过调整最有影响的变量来优化生物工艺的意图，观察到变化的增加(图6C qs_init变化相比qs_init恒定)在最大比滴度中不太明显(图6E qs_init变化相比qs_init恒定)。由于生物质增加，体积恒定给料曲线的性质(图5A)造成每个细胞可利用的基质量和时间下降(q_S)。最初，q_Sinit的变化导致每个细胞可利用的基质量强烈地偏离。但随着实时q_S轨迹线快速收敛，qs的这种差异很快消失。尽管q_Sinit的初始差异很大，但生理描述符q_S在整个实验的差异很小(图6C/D)。基于q_Sinit的工艺开发方法受到最大基质摄取速率的严格限制，因为必须避免基质积累。为了直接控制潜在的生理描述符，由此q_S显得更有前景，但需要先进的生物工艺控制方法来进行实时生物质估计。但该方法提供了最大比滴度更直接的调整，最大比滴度与最大比滴度引起的潜在的更高的变化范围相关联。

讨论：

没有显示预诱导阶段和诱导阶段的明显相关性。通过反复测试与两种不同表达系统的相关性，研究结果的范围扩展到平台(platform)知识。发现的更大范围具有以下结果：它减少了平台内任何未来实验设计中的因素数量，从而加速了生物工艺开发(上市时间)。

基于平台具体的先验知识，即预诱导阶段对诱导阶段没有明显影响，可以仅通过平台技术的限制来省略研究预诱导阶段的影响的实验。将发现的相关性反馈到随后的实验设计中，增加了选择最有影响力的因素用于进一步研究的可能性。

在工业背景中，一旦达到最大比滴度，就停止发酵并收获。在生物工艺开发过程中，PAT主动采样应有助于整个工艺的理解，在生物工艺优化中，采样应更侧重于预期最大比滴度的过程域(process area)。因此，重要的是分析和预测诱导阶段中何时出现最大比滴度。

易于访问但功能强大的预测因子dSn将有助于将投入的精力集中在实际相关区域的采样方面。在最高比滴度区域中增加的时间分辨率也将有助于高效率的工艺优化。由于生物工艺开发的未来存在于小规模的生物反应器中，因此本文提出的预测最高滴度的简单方法变得更加令人感兴趣。在连续时间分辨采样受到例如人力资源和/或大多数以及对于所有有限体积的小规模平行生物反应器的限制的情况下，采样点的选择非常重要并且通过根据dSn采样而极大地减轻。

证明基于q_Sinit的生物工艺开发策略是有益的。然而，基于恒定体积给料速率q_Sinit的给料策略强烈地受限于必须防止代谢物积累的生理限制。在这方面，恒定q_S的动态适应性给料速率赋予了更多的工艺技术自由度。

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Claims (29)

1.一种生产重组目标蛋白(POI)的方法，包括：

(a)在细胞培养基中培养细胞，通过向所述细胞培养物中加入包含至少一种基质的给料来表达所述POI，

(b)在诱导阶段和/或POI产生阶段期间，基于计算、设定和任选地控制细胞的比基质摄取速率q_S来应用给料策略，其中q_S设定为接近细胞培养物的维持率，和

(c)从细胞培养物中分离所述POI。

2.根据权利要求1所述的方法，其中q_S在0.03-0.15g/g/h的范围内，优选地在0.05-0.12g/g/h的范围内，更优选地在0.08-0.12g/g/h的范围内，最优选地，q_S为约0.12g/g/h。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中控制或不控制q_S。

4.根据权利要求3所述的方法，其中将q_S控制为恒定的，在所述POI的产生阶段期间至少75％、至少80％或至少95％的时间内减少或增加。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中在所述POI的产生阶段期间至少50％的时间内将q_S控制在恒定值(+/-15％)。

6.根据权利要求5所述的方法，其中q_S为约0.03g/g/h、0.04g/g/h、0.05g/g/h、0.06g/g/h、0.07g/g/h、0.08g/g/h、0.09g/g/h、0.1g/g/h、0.11g/g/h、0.12g/g/h、0.13g/g/h、0.14g/g/h或0.15g/g/h，最优选地，q_S为约0.12g/g/h。

7.根据权利要求3所述的方法，其中在所述POI的产生阶段期间至少50％的时间内控制和降低q_S。

8.根据权利要求6所述的方法，其中q_S从0.15减少至0.05g/g/h，优选地从0.15减少至等于或小于0.12g/g/h，从0.15减少至0.10g/g/h，从0.15减少至0.07g/g/h，从0.15减少至0.05g/g/h，从0.12减少至0.1g/g/h，从0.12减少至0.07g/g/h，从0.12减少至0.05g/g/h，从0.1减少至0.07g/g/h，从0.1减少至0.05g/g/h，或从0.1减少至0.03g/g/h。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过调节给料速率来控制qS。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过反馈控制的比基质摄取速率来控制q_S。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过定量生物质来生理地控制所述给料策略。

12.根据权利要求11所述的方法，其中通过生物质估计/测量来确定生物质。

13.根据权利要求12所述的方法，其中通过实时生物质估计/测量来确定生物质。

14.根据权利要求13所述的方法，其中使用软传感器或硬传感器进行实时生物质测量。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基质是葡萄糖或甘油。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞选自由真核细胞或原核细胞组成的组。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述真核细胞选自由哺乳动物、昆虫、酵母、丝状真菌和植物细胞组成的组，优选地为酵母细胞，最优选地为毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母(Komagataella pastoris)、巴斯德毕赤酵母(K.phaffii)或巴斯德毕赤酵母(K.pseudopastoris)。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述原核细胞选自由大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和假单胞菌组成的组。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述原核细胞是大肠杆菌。

20.根据权利要求16所述的方法，其中大部分POI位于细胞质、周质或细胞外。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用表达系统或表达盒表达所述POI，所述表达系统或表达盒包括与编码POI的核酸可操作地连接的可调节的启动子。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述可调节的启动子是诱导型启动子或消耗诱导型启动子。

23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述诱导型启动子是鼠李糖启动子、蜜二糖启动子、甘露糖启动子、阿拉伯糖启动子、T5启动子、T7启动子、乳糖启动子或IPTG诱导型启动子。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述鼠李糖启动子是rhaBAD。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述POI是异源蛋白，优选地选自治疗性蛋白、酶和肽、蛋白质抗生素、毒素融合蛋白、碳水化合物-蛋白缀合物、结构蛋白、调节蛋白、疫苗和疫苗类蛋白或颗粒、加工酶、生长因子、激素和细胞因子或POI的代谢产物。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述治疗性蛋白是抗原结合分子，优选地为免疫球蛋白，更优选地为抗体或抗体片段，最优选地为Fab或scFv抗体。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述原核细胞是大肠杆菌，并且所述启动子是rhaBAD。

28.一种用于生产重组目标蛋白(POI)的方法，包括：

(a)在细胞培养基中培养细胞，通过向所述细胞培养物中加入包含至少一种基质的给料来表达所述POI，

(b)将q_S设定为略高于细胞培养物的维持率；和

(c)从细胞培养物中分离所述POI。

29.根据权利要求28所述的方法，其中q_S在0.03-0.15g/g/h的范围内，优选地为在0.05-0.12g/g/h的范围内，更优选地在0.08-0.12g/g/h的范围内，最优选地，q_S为约0.12g/g/h。