JP6974341B2 - 改善された発酵プロセス - Google Patents

Description

発明の分野

[0001]本発明は、新規フィード戦略を用いて高収量の組み換えタンパク質を産生するための発酵方法に関する。

[0002]生物工学およびバイオエンジニアリングが近代産業および健康分野において果たす役割は増加しつつある。新規の重要な活性薬物成分の多くは、組み換え治療タンパク質である。それらは、十分に制御された生物工学プロセスにおいて、遺伝子改変微生物において形成される。

[0003]バイオプロセスの開発は、プロセスパラメータと産物の品質および量との間の相互作用を特定および理解することを目的としている。バイオプロセスの開発時間が限られていること、ならびにバイオプロセスの多変量研究が、時間、費用、および労力のかかる作業であることから、プロセスの開発を加速させて、生物工学産物の販売までに要する時間を低減させることが必要である。

[0004]ｐＨ値および温度などの技術的パラメータの他に、栄養素の供給は、細胞の生理学に影響を及ぼす主なパラメータである。

[0005]誘導相全体を通してのこのフィード戦略は、（ａ）技術的に制御された、例えば、既定のフィードプロファイル、すなわち容積を一定にするか、または容積を変化させることであり得る。プロセスパラメータとしてのフィード速度は、技術的には一定レベルに制御されるが、生理学は制御されないままである。いかなるフィードバック制御もないそのような系では、細胞培養の変化している生理状態、すなわち組み換えタンパク質の産生を誘導した結果としての細胞培養の変化している生理状態に対して応答することができない。（ｂ）あるいは、フィード戦略を生理的に制御することができ、このことは対象の細胞の生理状態を定量することを意味する。

[0006]技術的制御に対し、生理的制御は、一般的に固定収量モデルとしての歴史的または文献的データのいずれかに基づいて、生理状態および／または相関する変化に対処する。あるいは、リアルタイム計測、例えば、溶存酸素濃度、誘電率、吸光度、オフガス濃度を用いて、応答の生理学においてフィード戦略を適合させる。

[0007]より具体的には、生理的フィード戦略は、リアクターにおけるバイオマスの量に対処する。その結果、生理的フィード戦略は、固定された単一の時点での、または誘導相全体を通して時間分解した、リアクター中のバイオマスを評価することに依存する。このバイオマス評価は、直接評価できない生理的な細胞培養変数を計算および技術的に制御するための基礎である。現在まで、これらのフィード戦略は、主に固有の細胞増殖速度μ（Ｇｎｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００８ａ，Ｒａｍｉｒｅｚ ｅｔ ａｌ．１９９４）に重点を置いている。バイオマスに固有の基質取り込み速度ｑ_Ｓが制御されることは非常にまれである（Ｓａｇｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。標的化生理変数によらず、誘導相全体を通しての生産性または固有の最大タイターとＣ−源供給との相関関係は、非常に重要である。

[0008]Ｒａｍｉｒｅｚら（１９９４）は、組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によるペニシリンアシラーゼ産生に関して典型的なＬｕｅｄｅｋｉｎｇ−Ｐｉｒｅｔ速度論を示し、ｑ_Ｐとμならびにｑ_Ｓが正に相関することを示した。それぞれの実験に関して平均すると、μとｑ_Ｓは、この例において０．５６ｇ／ｇの一定の収量計数Ｙ_Ｘ／Ｓによって相関関係を有する。このことは、この固有の組み換えタンパク質発現系において、平均値ｑ_Ｓは、平均値バイオマス収量に影響を及ぼさないことを示している。結論すると、この例では、μが高ければならびにｑ_Ｓが高ければ、より高いｑ_Ｐが得られた。

[0009]ｑ_Ｓを制御することによってｑ_Ｐに影響を及ぼす可能性は、Ｄｉｅｔｚｓｃｈら（２０１１）によって、生物ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）に関して記載されている。同様に、この研究は、組み換えタンパク質の産生に及ぼす高いｑ_Ｓ値の正の効果を示している。Ｄｉｅｔｚｓｃｈらは、ｑ_Ｓのレベルの他に、ｑ_Ｓの経時的な軌跡が生産性に対して有意な影響を及ぼすことをさらに示した。段階的に増加させるフィードパターンの正の影響も同様に報告された。この論文では、バイオマス測定は、手間のかかるオフラインサンプリングによって行われた。

[0010]Ｗｅｃｈｓｅｌｂｅｒｇｅｒら（２０１２）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組み換えタンパク質の生産性に対して高いｑ_Ｓ値が正の影響及ぼすことを記載している。Ｗｅｃｈｓｅｌｂｅｒｇｅｒらはまた、容積一定フィードプロファイルの影響を、ｑ_{Ｓｉｎｉｔ}の影響によって完全に説明できることも示した。この研究において、容積一定フィード速度は、［ｇ／ｇ／ｈ］で表すバイオマス固有の基質取り込み速度ｑｓに基づいて誘導時点で計算している。容積一定フィード速度を最初に既定のｑ_Ｓ値に調整することによるデータ解析により、ｑ_Ｓと固有の産物の活性との間の明確な比例相関が示された。

[0011]国際公開第２０１３／００６４７９号は、高い産物タイターの細胞培養を得るために、細胞増殖に対してより大きい制御を行って哺乳類細胞を培養する方法を開示する。定義されたＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地による灌流によって、産生相において細胞の増殖停止を誘導する。培養を評価するために、試料を毎日採取した。Ｙａｎｇ ＪＤらは、モノクローナル抗体の生産性の増強が得られる、フィードを制御した灌流プロセスを記載している。フィードの制御は、毒性代謝物の形成を最小限にするために、重要な代謝物産生栄養素を低レベルで維持しながら、枯渇した構成要素を補充することによって得られる（Ｙａｎｇ ＪＤ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２０００，６９（１）：７４−８２）。Ｊｏｕｒｄｉｅｒ Ｅ．らは、ラクトース上でのトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）によるセルラーゼ産生の単純な速度論モデルを記述している。モデルは、産業上の制約下で異なる培養戦略を模倣および比較することを可能にする（Ｊｏｕｒｄｉｅｒ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２０１２：３１３−３１８）。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、マウス骨髄腫（ＮＳ０）、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）、ヒト胎児腎（ＨＥＫ２９３）、またはヒト網膜由来（ＰＥＲ−Ｃ６）細胞などの、異なる動物細胞培養における生物薬剤の産生の達成および見通しは、Ｂｕｔｌｅｒ Ｍ（Ｂｕｔｌｅｒ Ｍ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５，６８（３）：２８３−２９１）によって記載されている。

[0012]以下の実施例に引用されているように、主に文献において、固有の最大活性と培養への栄養素のフィードとの間の正の相関関係に関する情報が見出されている。このことは、μ制御またはｑ_Ｓ制御のいずれかによるあらゆるフィード制御に当てはまる。

[0013]最大量の活性なタンパク質を生じる非常に効率的なバイオプロセスに関して改善された方法を提供することが望ましい。したがって、本発明の目的は、固有の最大タイターと基質利用能との驚くべき負の相関を用いて発酵産物に関する改善された方法を提供することである。

[0014]目的は、特許請求の範囲の主題によって扱われる。

[0015]本発明に従って、組み換えた対象のタンパク質（ＰＯＩ）を作製する方法であって、（ａ）細胞培養培地中で細胞を培養し、少なくとも１つの基質を含むフィードを前記細胞培養物中に添加することにより前記ＰＯＩを発現させること、
（ｂ）ＰＯＩの誘導相および／または産生相の間に、細胞の固有の基質取り込み速度ｑ_Ｓを、計算し、設定し、および、任意に制御するフィード戦略を適用することであって、ここでｑ_Ｓは細胞培養物の維持速度に近似して設定され；および（ｃ）前記ＰＯＩを細胞培養物から単離すること、を含む方法が提供される。

[0016]特定の態様に従って、固有の基質取り込み速度ｑ_Ｓは、細胞培養物のほぼ維持速度の範囲内であるように、例えば０．０３〜０．１５ｇ／ｇ／ｈ、好ましくは０．０５〜０．１２ｇ／ｇ／ｈ、より好ましくは０．０８〜０．１２ｇ／ｇ／ｈの範囲内であり、最も好ましくは、ｑ_Ｓは約０．１２／ｇ／ｇ／ｈであるように設定される。

[0017]特定の態様に従って、固有の基質取り込み速度ｑ_Ｓは、測定された値に設定した後、制御されているか、または制御されていない。

[0018]特定の態様に従って、固有の基質取り込み速度ｑ_Ｓは、前記対象のタンパク質の産生相の少なくとも５０％の時間の間、一定の値（±１５％）に制御され、ｑ_Ｓは、約０．０３ｇ／ｇ／ｈ、０．０４ｇ／ｇ／ｈ、０．０５ｇ／ｇ／ｈ、０．０６ｇ／ｇ／ｈ、０．０７ｇ／ｇ／ｈ、０．０８ｇ／ｇ／ｈ、０．０９ｇ／ｇ／ｈ、０．１ｇ／ｇ／ｈ、０．１１ｇ／ｇ／ｈ、０．１２ｇ／ｇ／ｈ、０．１３ｇ／ｇ／ｈ、０．１４ｇ／ｇ／ｈ、または０．１５ｇ／ｇｈであり、最も好ましくは０．１２ｇ／ｇ／ｈである。

[0019]特定の態様に従って、固有の基質取り込み速度ｑ_Ｓは、前記対象のタンパク質の産生相の少なくとも５０％の時間の間、フィード速度を調整することにより少なくとも１回設定されるか、または制御され、ｑ_Ｓは、０．１５から０．０５ｇ／ｇ／ｈの範囲内であり、好ましくは０．１５から０．１２ｇ／ｇ／ｈ以下に、０．１５から０．１０ｇ／ｇ／ｈに、０．１５から０．０７ｇ／ｇ／ｈに、０．１５から０．０５ｇ／ｇ／ｈに、０．１２から０．１ｇ／ｇ／ｈに、０．１２から０．０７ｇ／ｇ／ｈに、０．１２から０．０５ｇ／ｇ／ｈに、０．１０から０．０７ｇ／ｇ／ｈに、０．１から０．０５ｇ／ｇ／ｈに、または０．１から０．０３ｇ／ｇ／ｈに減少する。

[0020]特定の態様に従って、固有の基質取り込み速度ｑ_Ｓは、前記組み換えタンパク質の産生相の少なくとも５０％の時間の間、０．０３から０．１５ｇ／ｇ／ｈの範囲内に、フィード速度を調整することにより少なくとも１回設定されるかまたは制御され、好ましくは０．０３から０．１２ｇ／ｇ／ｈ以上に、０．０３から０．１０ｇ／ｇ／ｈに、０．０３から０．０７ｇ／ｇ／ｈに、０．０５から０．１５ｇ／ｇ／ｈに増加し、好ましくは０．０５から０．１２ｇ／ｇ／ｈ以上に、０．０５から０．１０ｇ／ｇ／ｈに、０．０５から０．０７ｇ／ｇ／ｈに、０．０７から０．１２ｇ／ｇ／ｈに、０．０７から０．１０ｇ／ｇ／ｈに、０．１０から０．１２ｇ／ｇ／ｈに、または０．１０から０．１５ｇ／ｇ／ｈに増加する。

[0021]特定の態様において、固有の基質取り込み速度ｑ_Ｓは、前記対象のタンパク質の産生相の少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９５％の間に、一定であるように、減少するように、または増加するように制御されている。

[0022]特定の態様に従って、固有の基質フィード速度ｑ_Ｓは、基質フィードの場合は正であり、通常負である科学的に確立された固有の基質取り込み速度ｑ_Ｓに対応する。

[0023]特定の態様に従って、固有の基質取り込み速度ｑ_Ｓは、制御されるか、またはそれに従ってフィード速度を調整することによって少なくとも１回設定される。

[0024]特定の態様に従って、固有の基質取り込み速度ｑ_Ｓの計算は、誘導相／産生相の開始時に行われる。特定の態様に従って、バイオマスは、１回、またはリアルタイムバイオマス評価もしくは計測によって測定される。

[0025]特定の態様に従って、リアルタイムバイオマス計測は、ソフトセンサーまたはハードセンサーを用いて行われる。

[0026]さらに特定の態様に従って、少なくとも１つの基質は炭水化物である。

[0027]特定の態様に従って、炭水化物は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラムノース、もしくはマンノースなどの六炭糖、サッカロースなどの二糖、グリセロールもしくはエタノールなどのアルコール、またはその組合せである。

[0028]特定の態様に従って、基質は、グルコールまたはグリセロール（Ｇｌｙ）である。

[0029]具体的には、フィードは、既知組成である。

[0030]フィードは、液体形態で、またはそれ以外では固体、例えばタブレット、もしくは他の持続放出手段、もしくは気体、例えば二酸化炭素などの代替の形態で培養培地に添加されてもよい。

[0031]特定の態様に従って、細胞は、真核細胞または原核細胞からなる群から選択される。

[0032]特定の態様に従って、真核細胞は、哺乳類、昆虫、酵母、糸状菌、および植物細胞からなる群から選択され、好ましくは酵母細胞、最も好ましくは、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｒｉｓ）、コマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｒｉｓ）、Ｋ・ファフィー（Ｋ ｐｈａｆｆｉｉ）、またはＫ・シュードパストリス（Ｋ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）である。

[0033]一態様において、細胞は、真核細胞、例えば哺乳類細胞である。哺乳類細胞は、例えば、ヒトまたは齧歯類、またはウシの細胞株または細胞系であり得る。そのような細胞、細胞株、または細胞系の例は、例えばマウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫ Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えばＣＯＳ１およびＣＯＳ７、ＱＣ１−３、ＨＥＫ−２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬＡ、ＥＢｌ、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解性またはハイブリドーマ細胞株である。好ましくは、哺乳類細胞は、ＣＨＯ細胞株である。一態様において、細胞はＣＨＯ細胞である。一態様において、細胞はＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１ ＳＶ細胞、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１ ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ ＦＵＴ８ ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ、またはＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳＫＯ細胞）は、例えばＣＨＯ−Ｋ１ ＳＶ ＧＳノックアウト細胞である。ＣＨＯ ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えばＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃ．）である。真核細胞はまた、鳥類の細胞、細胞株、または細胞系、例えばＥＢｘ（登録商標）細胞、ＥＢ１４、ＥＢ２４、ＥＢ２６、ＥＢ６６、またはＥＢｖｌ３でもあり得る。

[0034]一態様において、真核細胞は幹細胞である。幹細胞は、例えば、胚幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、組織特異的幹細胞（例えば、造血幹細胞）、および間葉幹細胞（ＭＳＣ）を含む、多能性幹細胞であり得る。

[0035]一態様において、細胞は、本明細書に記載の細胞のいずれかの分化型である。一態様において、細胞は、任意の初代培養細胞に由来する細胞である。

[0036]一態様において、細胞は、ヒト肝細胞、動物肝細胞、または非実質細胞などの肝細胞である。例えば、細胞は、付着可能代謝機能維持（ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｑｕａｌｉｆｉｅｄ）ヒト肝細胞、付着可能誘導機能維持（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｑｕａｌｉｆｉｅｄ）ヒト肝細胞、付着可能Ｑｕａｌｙｓｔ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ（商標）ヒト肝細胞、浮遊機能維持ヒト肝細胞（ドナー１０人およびドナー２０人のプールした肝細胞を含む）、ヒト肝クッパー細胞、ヒト肝星細胞、イヌ肝細胞（単一およびプールしたビーグル犬肝細胞を含む）、マウス肝細胞（ＣＤ−１およびＣ５７Ｂｌ／６肝細胞を含む）、ラット肝細胞（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎ、およびＷｉｓｔａｒ系の肝細胞を含む）、サル肝細胞（カニクイザルまたはアカゲザル肝細胞を含む）、ネコ肝細胞（国内短毛種の肝細胞を含む）、およびウサギ肝細胞（ニュージーランドホワイトの肝細胞を含む）であり得る。例としての肝細胞は、Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，ＬＬＣ，６ Ｄａｖｉｓ Ｄｒｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡ ２７７０９から市販されている。

[0037]一態様において、真核細胞は、例えば、酵母細胞（例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、およびピキア・アンガスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ））、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属（例えばコマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、コマガタエラ・シュードパストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）、またはコマガタエラ・ファフィー（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ））、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ））、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ））、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属（例えば、カンジダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｃａｏｉ）、カンジダ・ボイジニイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ））、ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属（例えば、ゲオトリクム・ファーメンタンス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ））、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、またはシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）などの下等真核細胞である。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）種が好ましい。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株の例は、Ｘ３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ、およびＣＢＳ７４３５である。

[0038]一態様において、真核細胞は、真菌細胞（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（Ａ ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）、Ａ フミガーツス（Ａ． ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、Ａ オリザエ（Ａ． ｏｒｚｙａｅ）、Ａ ニジュラ（Ａ． ｎｉｄｕｌａ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）（Ａ サーモフィルム（Ａ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）など、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）（Ｃ サーモフィルム（Ｃ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）など）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）（Ｃ サーモフィル（Ｃ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）など）、コルジセプス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）（Ｃ ミリタリス（Ｃ． ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）など）、コリナスクス（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クテノミセス（Ｃｔｅｎｏｍｙｃｅｓ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）（Ｆ オキシスポルム（Ｆ． ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）など）、グロメレラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ）（Ｇ グラミニコラ（Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）など）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）（Ｈ ジェコリナ（Ｈ． ｊｅｃｏｒｉｎａ）など）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）（Ｍ オリザエ（Ｍ． ｏｒｚｙａｅ）など）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）（Ｍ サーモフィル（Ｍ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）など）、ネクトリア（Ｎｅｃｔｒｉａ）（Ｎ ヘマトコッカ（Ｎ ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃａ）など）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）（Ｎ クラッサ（Ｎ ｃｒａｓｓａ）など）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）（Ｓ サーモフィル（Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）など）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）（Ｔ テレストリス（Ｔ． ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、Ｔ ヘテロタリカ（Ｔ ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａ）など）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（Ｔ リーセイ（Ｔ ｒｅｅｓｅｉ）など）、またはバーチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）（Ｖ ダリア（Ｖ ｄａｈｌｉａ）など）である。

[0039]一態様において、真核細胞は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｍｉｍｉｃ（商標）Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）（ＢＴ１−ＴＮ−５Ｂ１−４）、またはＢＴ１−Ｅａ８８細胞）、藻類細胞（例えば、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）、珪藻類（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、ダナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、藍藻（Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）（シアノバクテリア）、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、またはオクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ））、または植物細胞（例えば、単子葉植物（例えば、トウモロコシ、コメ、コムギ、またはセタリア）、または双子葉植物（例えば、キャッサバ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、タバコ、アルファルファ、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）、またはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の細胞）である。

[0040]一態様において、細胞は細菌または原核細胞である。

[0041]一態様において、原核細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、またはラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）などのグラム陽性菌である。用いることができるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、納豆菌（Ｂ．ｎａｔｔｏ）、またはＢ メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）である。態様において、細胞は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）３ＮＡ、および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８である。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５６、４８４ Ｗｅｓｔ １２ｔｈ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ ＯＨ ４３２１０−１２１４から得ることができる。

[0042]一態様において、原核細胞は、グラム陰性の細胞、例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、例えばＴＧ１、ＴＧ２、Ｗ３１１０、ＤＨ１、ＤＨＢ４、ＤＨ５ａ、ＨＭＳ １７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＮＭ５３３、Ｃ６００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＭＣ４１００、ＸＬ１−ＢｌｕｅおよびＯｒｉｇａｍｉ、ならびに大腸菌（Ｅ ｃｏｌｉ）Ｂ株に由来する細胞、例えばＢＬ−２１またはＢＬ２１（ＤＥ３）であり、その全てが市販されている。

[0043]特定の態様に従って、原核細胞は、大腸菌（Ｅ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびシュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）からなる群から選択される。

[0044]特に好ましい態様に従って、原核細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。

[0045]適した宿主細胞は、例えばＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ａｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から市販されている。

[0046]一態様において、培養細胞を用いて、対象のペプチドまたはタンパク質（ＰＯＩ）、例えば抗体、例えばモノクローナル抗体、および／または治療に使用するための組み換えタンパク質を産生する。一態様において、培養細胞は、アミノ酸、脂肪酸、または他の有用な生化学中間体または代謝物を産生する。例えば、態様において、約４０００ダルトン〜約１４０，０００ダルトン超の分子量を有する分子を産生することができる。態様において、これらの分子は、様々な複雑度を有し、グリコシル化を含む翻訳後改変を含み得る。

[0047]特定の態様に従って、組み換えタンパク質の大部分は、細胞質、ペリプラズム、または細胞外に位置し、好ましくはペリプラズムに位置する。

[0048]特定の態様に従って、対象のタンパク質（ＰＯＩ）は、組み換えタンパク質である。

[0049]具体的には、ＰＯＩは、真核細胞タンパク質、好ましくは哺乳類タンパク質である。

[0050]本発明に従って産生されたＰＯＩは、多量体タンパク質、好ましくは二量体または四量体であり得る。

[0051]本発明の一側面に従って、ＰＯＩは、好ましくは抗体またはそのフラグメント、酵素、およびペプチド、タンパク質抗体、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン、およびワクチン様タンパク質または粒子、プロセス酵素、増殖因子、ホルモン、およびサイトカイン、または組み換えタンパク質の代謝物を含む、治療タンパク質から選択される、組み換えまたは非相同タンパク質である。

[0052]特定の対象のタンパク質は、抗体またはそのフラグメントなどの抗原結合分子である。特定のＰＯＩは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、免疫グロブリン（Ｉｇ）、または免疫グロブリンクラスＧ（ＩｇＧ）、重鎖抗体（ＨｃＡｂ）またはそのフラグメント、例えば抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、Ｆｄ、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、もしくは操作されたその変種、例えばＦｖ二量体（ダイアボディ）、Ｆｖ三量体（トリアボディ）、Ｆｖ四量体、もしくはミニボディ、およびＶＨもしくはＶＨＨもしくはＶ−ＮＡＲなどのシングルドメイン抗体などである。

[0053]特に好ましい態様に従って、組み換えタンパク質は、免疫グロブリン、好ましくは抗体または抗体フラグメント、最も好ましくはＦａｂまたはｓｃＦｖ抗体である。

[0054]さらなる態様において、対象のタンパク質（ＰＯＩ）は、例えばＢＯＴＯＸ、Ｍｙｏｂｌｏｃ、Ｎｅｕｒｏｂｌｏｃ、Ｄｙｓｐｏｒｔ（またはボツリヌス神経毒素の他の血清型）、アルグルコシダーゼアルファ、ダプトマイシン、ＹＨ−１６、絨毛ゴナドトロピンアルファ、フィルグラスチム、セトロレリクス、インターロイキン−２、アルデスロイキン、テセロイキン（ｔｅｃｅｌｅｕｌｉｎ）、デニロイキンディフティトックス、インターフェロンアルファ−ｎ３（注射剤）、インターフェロンアルファ−ｎ１、ＤＬ−８２３４、インターフェロン、Ｓｕｎｔｏｒｙ（ガンマ−１ａ）、インターフェロンガンマ、サイモシンアルファ１、タソネルミン、ＤｉｇｉＦａｂ、ＶｉｐｅｒａＴＡｂ、ＥｃｈｉＴＡｂ、ＣｒｏＦａｂ、ネシリチド、アバタセプト、アレファセプト、レビフ、エプトテルミンアルファ、テリパラチド（骨粗鬆症）、カルシトニン注射剤（骨疾患）、カルシトニン（鼻、骨粗鬆症）、エタネルセプト、ヘモグロビングルタマー２５０（ウシ）、ドロトレコギンアルファ、コラゲナーゼ、カルペリチド、組み換えヒト上皮増殖因子（局所ゲル、創傷治癒）、ＤＷＰ４０１、ダルベポエチンアルファ、エポエチンオメガ、エポエチンベータ、エポエチンアルファ、デシルジン、レピルジン、ビバリルジン、ノナコグアルファ、モノニン、エプタコグアルファ（活性型）、組み換え第ＶＩＩＩ因子＋ＶＷＦ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ、組み換え第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子（組み換え）、Ａｌｐｈａｎａｔｅ、オクトコグアルファ、第ＶＩＩＩ因子、パリフェルミン、インジキナーゼ、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ、モンテプラーゼ、フォリトロピンアルファ、ｒＦＳＨ、ｈｐＦＳＨ、ミカファンギン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、サーモレリン、グルカゴン、エキセナチド、プラムリンチド、イニグルセラーゼ、ガルスルファーゼ、Ｌｅｕｃｏｔｒｏｐｉｎ、モルグラモスチム（ｍｏｌｇｒａｍｏｓｔｉｒｎ）、酢酸トリプトレリン、ヒストレリン（皮下インプラント、Ｈｙｄｒｏｎ）、デスロレリン、ヒストレリン、ナファレリン、リュープロリド徐放デポー剤（ＡＴＲＩＧＥＬ）、リュープロリドインプラント（ＤＵＲＯＳ）、ゴセレリン、Ｅｕｔｒｏｐｉｎ、ＫＰ−１０２プログラム、ソマトロピン、メカセルミン（成長不全）、エンフルビルチド（ｅｎｌｆａｖｉｒｔｉｄｅ）、Ｏｒｇ−３３４０８、インスリングラルギン、インスリングルリシン、インスリン（吸入）、インスリンリスプロ、インスリンデテミル、インスリン（頬側投与、ＲａｐｉｄＭｉｓｔ）、メカセルミンリンファベート、アナキンラ、セルモロイキン、９９ ｍＴｃ−アプシチド注射剤、ミエロピド、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ、酢酸グラチラマー、Ｇｅｐｏｎ、サルグラモスチム、オプレルベキン、ヒト白血球由来アルファインターフェロン、Ｂｉｌｉｖｅ、インスリン（組み換え）、組み換えヒトインスリン、インスリンアスパート、メカセニン、Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ、インターフェロンアルファ２、Ａｌｆａｆｅｒｏｎｅ、インターフェロンアルファコン−１、インターフェロンアルファ、Ａｖｏｎｅｘ組み換えヒト黄体形成ホルモン、ドルナーゼアルファ、トラフェルミン、ジコノチド、タルチレリン、ジボテルミンアルファ、アトシバン、ベカプレルミン、エプチフィバチド、Ｚｅｍａｉｒａ、ＣＴＣ−１１１、Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ、ＨＰＶワクチン（四価）、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチム（ａｎｃｅｓｔｉｒｎ）、アガルシダーゼベータ、アガルシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、酢酸プレザチド銅（局所ゲル）、ラスブリカーゼ、ラニビズマブ、Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ、ＰＥＧ−イントロン、トリコミン、組み換えハウスダストダニアレルギー脱感作注射剤、組み換えヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）１−８４（皮下、骨粗鬆症）、エポエチンデルタ、トランスジェニックアンチトロンビンＩＩＩ、グランジトロピン、ビトラーゼ、組み換えインスリン、インターフェロンアルファ（経口ロゼンジ）、ＧＥＭ−２１Ｓ、バプレオチド、イデュルスルファーゼ、オマパトリラト（ｏｍｎａｐａｔｒｉｌａｔ）、組み換え血清アルブミン、セルトリズマブペゴル、グルカルピダーゼ、ヒト組み換えＣ１エラスターゼ阻害剤（血管浮腫）、ラノテプラーゼ、組み換えヒト成長ホルモン、エンフュービルタイド（無針注射剤、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ ２０００）、ＶＧＶ−１、インターフェロン（アルファ）、ルシナクタント、アビプタジル（吸入、肺疾患）、イカチバント、エカランチド、オミガナン、Ａｕｒｏｇｒａｂ、酢酸ペキシガナン、ＡＤＩ−ＰＥＧ−２０、ＬＤＩ−２００、デガレリクス、シントレデリン・ベスドトクス（ｃｉｎｔｒｅｄｅｌｉｎｂｅｓｕｄｏｔｏｘ）、Ｆａｖｌｄ、ＭＤＸ−１３７９、ＩＳＡｔｘ−２４７、リラグルチド、テリパラチド（骨粗鬆症）、チファコギン、ＡＡ４５００、Ｔ４Ｎ５リポソームローション、カツマキソマブ、ＤＷＰ４１３、ＡＲＴ−１２３、クリサリン、デスモテプラーゼ、アメジプラーゼ、コリフォリトロピンアルファ、ＴＨ−９５０７、テデュグルチド、Ｄｉａｍｙｄ、ＤＷＰ−４１２、成長ホルモン（徐放性注射剤）、組み換えＧ−ＣＳＦ、インスリン（吸入、ＡＩＲ）、インスリン（吸入、Ｔｅｃｈｎｏｓｐｈａｒｅ）、インスリン（吸入、ＡＥＲｘ）、ＲＧＮ−３０３、ＤｉａＰｅｐ２７７、インターフェロンベータ（Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症）、インターフェロンアルファ−ｎ３（経口）、ベラタセプト、経皮インスリンパッチ、ＡＭＧ−５３１、ＭＢＰ−８２９８、Ｘｅｒｅｃｅｐｔ、オペバカン、ＡＩＤＳＶＡＸ、ＧＶ−１００１、ＬｙｍｐｈｏＳｃａｎ、ランピルナーゼ、Ｌｉｐｏｘｙｓａｎ、ルスプルチド、ＭＰ５２（ベータ−リン酸三カルシウム担体、骨再生）、黒色腫ワクチン、シプリューセル−Ｔ、ＣＴＰ−３７、Ｉｎｓｅｇｉａ、ビテスペン、ヒトトロンビン（凍結、外科出血用）、トロンビン、ＴｒａｎｓＭＩＤ、アルフィメプラーゼ、Ｐｕｒｉｃａｓｅ、テルリプレシン（静脈内、肝腎症候群）、ＥＵＲ−１００８Ｍ、組み換えＦＧＦ−Ｉ（注射剤、血管疾患）、ＢＤＭ−Ｅ、ロチガプチド、ＥＴＣ−２１６、Ｐ−１１３、ＭＢＩ−５９４ＡＮ、デュラマイシン（吸入、嚢胞性線維症）、ＳＣＶ−０７、ＯＰＩ−４５、エンドスタチン、アンギオスタチン、ＡＢＴ−５１０、ボーマンバーク阻害剤濃縮物、ＸＭＰ−６２９、９９ ｍＴｃ−Ｈｙｎｉｃ−アネキシンＶ、カハラリドＦ、ＣＴＣＥ−９９０８、テベレリクス（持続放出）、オザレリクス、ロミデプシン（ｒｏｒｎｉｄｅｐｓｉｎ）、ＢＡＹ−５０４７９８、インターロイキン４、ＰＲＸ−３２１、Ｐｅｐｓｃａｎ、イボクタデキン、ｒｈラクトフェリン、ＴＲＵ−０１５、ＩＬ−２１、ＡＴＮ−１６１、シレンギチド、Ａｌｂｕｆｅｒｏｎ、Ｂｉｐｈａｓｉｘ、ＩＲＸ−２、オメガインターフェロン、ＰＣＫ−３１４５、ＣＡＰ−２３２、パシレオチド、ｈｕＮ９０１−ＤＭＩ、卵巣がん免疫療法ワクチン、ＳＢ−２４９５５３、Ｏｎｃｏｖａｘ−ＣＬ、ＯｎｃｏＶａｘ−Ｐ、ＢＬＰ−２５、ＣｅｒＶａｘ−１６、マルチエピトープペプチド黒色腫ワクチン（ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ）、ネミフィチド、ｒＡＡＴ（吸入）、ｒＡＡＴ（皮膚科）、ＣＧＲＰ（吸入、喘息）、ペグスネルセプト、サイモシンベータ４、プリチデプシン、ＧＴＰ−２００、ラモプラニン、ＧＲＡＳＰＡ、ＯＢＩ−１、ＡＣ−１００、サケカルシトニン（経口、ｅｌｉｇｅｎ）、カルシトニン（経口、骨粗鬆症）、エキサモレリン、カプロモレリン、Ｃａｒｄｅｖａ、ベラフェルミン、１３１Ｉ−ＴＭ−６０１、ＫＫ−２２０、Ｔ−１０、ウラリチド、デペレスタット、ヘマチド、Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ（局所）、ｒＮＡＰｃ２、組み換え第ＶＩＩＩ因子（ＰＥＧ化リポソーム）、ｂＦＧＦ、ＰＥＧ化組み換えスタフィロキナーゼ変種、Ｖ−１０１５３、ＳｏｎｏＬｙｓｉｓ Ｐｒｏｌｙｓｅ、ＮｅｕｒｏＶａｘ、ＣＺＥＮ−００２、膵島細胞新生治療、ｒＧＬＰ−１、ＢＩＭ−５１０７７、ＬＹ−５４８８０６、エキセナチド（制御放出、Ｍｅｄｉｓｏｒｂ）、ＡＶＥ−００１０、ＧＡ−ＧＣＢ、アボレリン、ＡＣＭ−９６０４、酢酸リナクロチド、ＣＥＴｉ−１、Ｈｅｍｏｓｐａｎ、ＶＡＬ（注射剤）、速効型インスリン（注射剤、Ｖｉａｄｅｌ）、鼻腔内インスリン、インスリン（吸入）、インスリン（経口、ｅｌｉｇｅｎ）、組み換えメチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ皮下注射剤、湿疹）、ピトラキンラ（吸入ドライパウダー、喘息）、Ｍｕｌｔｉｋｉｎｅ、ＲＧ−１０６８、ＭＭ−０９３、ＮＢＩ−６０２４、ＡＴ−００１、ＰＩ−０８２４、Ｏｒｇ−３９１４１、Ｃｐｎ１０（自己免疫疾患／炎症）、タラクトフェリン（局所）、ｒＥＶ−１３１（眼科）、ｒＥＶ−１３１（呼吸器疾患）、経口組み換えヒトインスリン（糖尿病）、ＲＰＩ−７８Ｍ、オプレルベキン（経口）、ＣＹＴ−９９００７ ＣＴＬＡ４−ｌｇ、ＤＴＹ−００１、バラテグラスト、インターフェロンアルファ−ｎ３（局所）、ＩＲＸ−３、ＲＤＰ−５８、Ｔａｕｆｅｒｏｎ、胆汁酸刺激リパーゼ、Ｍｅｒｉｓｐａｓｅ、アラニン（ａｌａｌｉｎｅ）ホスファターゼ、ＥＰ−２１０４Ｒ、Ｍｅｌａｎｏｔａｎ−ＩＩ、ブレメラノチド、ＡＴＬ−１０４、組み換えヒトミクロプラスミン、ＡＸ−２００、ＳＥＭＡＸ、ＡＣＶ−１、Ｘｅｎ−２１７４、ＣＪＣ−１００８、ダイノルフィンＡ、ＳＩ−６６０３、ＬＡＢ ＧＨＲＨ、ＡＥＲ−００２、ＢＧＣ−７２８、マラリアワクチン（ビロソーム、ＰｅｖｉＰＲＯ）、ＡＬＴＵ−１３５、パルボウイルスＢ１９ワクチン、インフルエンザワクチン（組み換えノイラミニダーゼ）、マラリア／ＨＢＶワクチン、炭疽ワクチン、Ｖａｃｃ−５ｑ、Ｖａｃｃ−４ｘ、ＨＩＶワクチン（経口）、ＨＰＶワクチン、Ｔａｔトキソイド、ＹＳＰＳＬ、ＣＨＳ−１３３４０、ＰＴＨ（１−３４）リポソームクリーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、Ｏｓｔａｂｏｌｉｎ−Ｃ、ＰＴＨアナログ（局所、乾癬）、ＭＢＲＩ−９３．０２、ＭＴＢ７２Ｆワクチン（結核）、ＭＶＡ−Ａｇ８５Ａワクチン（結核）、ＦＡＲＡ０４、ＢＡ−２１０、組み換えペストＦＩＶワクチン、ＡＧ−７０２、ＯｘＳＯＤｒｏｌ、ｒＢｅｔＶ１、Ｄｅｒ−ｐ１／Ｄｅｒ−ｐ２／Ｄｅｒ−ｐ７アレルゲン標的化ワクチン（チリダニアレルギー）、ＰＲ１ペプチド抗原（白血病）、変異体ｒａｓワクチン、ＨＰＶ−１６ Ｅ７リポペプチドワクチン、迷路障害ワクチン（腺癌）、ＣＭＬワクチン、ＷＴ１−ペプチドワクチン（がん）、ＩＤＤ−５、ＣＤＸ−１１０、Ｐｅｎｔｒｙｓ、Ｎｏｒｅｌｉｎ、ＣｙｔｏＦａｂ、Ｐ−９８０８、ＶＴ−１１１、イクロカプチド、テルベルミン（皮膚科、糖尿病性の足潰瘍）、ルピントリビル、レティキュロース、ｒＧＲＦ、ＨＡ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、ＡＣＥ−０１１、ＡＬＴＵ−１４０、ＣＧＸ−１１６０、アンジオテンシン治療ワクチン、Ｄ−４Ｆ、ＥＴＣ−６４２、ＡＰＰ−０１８、ｒｈＭＢＬ、ＳＣＶ−０７（経口、結核）、ＤＲＦ−７２９５、ＡＢＴ−８２８、ＥｒｂＢ２特異的イムノトキシン（抗がん）、ＤＴ３ＳＳＩＬ−３、ＴＳＴ−１００８８、ＰＲＯ−１７６２、Ｃｏｍｂｏｔｏｘ、コレシストキニン−Ｂ／ガストリン受容体結合ペプチド、１１１Ｉｎ−ｈＥＧＦ、ＡＥ−３７、トラスニズマブ−ＤＭ１、アンタゴニストＧ、ＩＬ−１２（組み換え）、ＰＭ−０２７３４、ＩＭＰ−３２１、ｒｈＩＧＦ−ＢＰ３、ＢＬＸ−８８３、ＣＵＶ−１６４７（局所）、Ｌ−１９ベースの放射免疫療法（がん）、Ｒｅ−１８８−Ｐ−２０４５、ＡＭＧ−３８６、ＤＣ／１５４０／ＫＬＨワクチン（がん）、ＶＸ−００１、ＡＶＥ−９６３３、ＡＣ−９３０１、ＮＹ−ＥＳＯ−１ワクチン（ペプチド）、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド、黒色腫ワクチン（パルス抗原治療）、前立腺がんワクチン、ＣＢＰ−５０１、組み換えヒトラクトフェリン（ドライアイ）、ＦＸ−０６、ＡＰ−２１４、ＷＡＰ−８２９４Ａ（注射剤）、ＡＣＰ−ＨＩＰ、ＳＵＮ−１１０３１、ペプチドＹＹ［３−３６］（肥満、鼻腔内）、ＦＧＬＬ、アタシセプト、ＢＲ３−Ｆｃ、ＢＮ−００３
、ＢＡ−０５８、ヒト副甲状腺ホルモン１−３４（鼻、骨粗鬆症）、Ｆ−１８−ＣＣＲ１、ＡＴ−１１００（セリアック病／糖尿病）、ＪＰＤ−００３、ＰＴＨ（７−３４）リポソームクリーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、デュラマイシン（眼科、ドライアイ）、ＣＡＢ−２、ＣＴＣＥ−０２１４、糖ＰＥＧ化エリスロポエチン、ＥＰＯ−Ｆｃ、ＣＮＴＯ−５２８、ＡＭＧ−１１４、ＪＲ−０１３、第ＸＩＩＩ因子、アミノカンジン、ＰＮ−９５１、７１６１５５、ＳＵＮ−Ｅ７００１、ＴＨ−０３１８、ＢＡＹ−７３−７９７７、テベレリクス（即時放出）、ＥＰ−５１２１６、ｈＧＨ（制御放出、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｅ）、ＯＧＰ−Ｉ、シフュビルタイド、ＴＶ４７１０、ＡＬＧ−８８９、Ｏｒｇ−４１２５９、ｒｈＣＣ１０、Ｆ−９９１、サイモペンチン（肺疾患）、ｒ（ｍ）ＣＲＰ、肝選択性インスリン、スバリン、Ｌ１９−ＩＬ−２融合タンパク質、エラフィン、ＮＭＫ−１５０、ＡＬＴＵ−１３９、ＥＮ−１２２００４、ｒｈＴＰＯ、トロンボポエチン受容体アゴニスト（血小板減少障害）、ＡＬ−１０８、ＡＬ−２０８、神経生長因子アンタゴニスト（疼痛）、ＳＬＶ−３１７、ＣＧＸ−１００７、ＩＮＮＯ−１０５、経口テリパラチド（ｅｌｉｇｅｎ）、ＧＥＭ−ＯＳ１、ＡＣ−１６２３５２、ＰＲＸ−３０２、ＬＦｎ−ｐ２４融合ワクチン（Ｔｈｅｒａｐｏｒｅ）、ＥＰ−１０４３、肺炎球菌（Ｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）小児用ワクチン、マラリアワクチン、Ｂ群髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ワクチン、新生児Ｂ群連鎖球菌ワクチン、炭疽ワクチン、ＨＣＶワクチン（ｇｐＥ１＋ｇｐＥ２＋ＭＦ−５９）、中耳炎治療、ＨＣＶワクチン（コア抗原＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）、ｈＰＴＨ（１−３４）（経皮、ＶｉａＤｅｒｍ）、７６８９７４、ＳＹＮ−１０１、ＰＧＮ−００５２、アビスクミン（ａｖｉｓｃｕｍｎｉｎｅ）、ＢＩＭ−２３１９０、結核ワクチン、マルチエピトープチロシナーゼペプチド、がんワクチン、エンカスチム、ＡＰＣ−８０２４、ＧＩ−５００５、ＡＣＣ−００１、ＴＴＳ−ＣＤ３、血管標的化ＴＮＦ（固形腫瘍）、デスモプレシン（頬側、制御放出）、オネルセプト、またはＴＰ−９２０１である。

[0055]一部の態様において、ＰＯＩは、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ）、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）／ＭＡＢ ＴＨＥＲＡ（商標））、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標））、ペグリルグラスチム（ＮＥＵＬＡＳＴＡ（商標））、またはバイオシミラーおよびバイオベターを含む他の任意の適したＰＯＩである。

[0056]バイオシミラーおよびバイオベターを含む他の適したＰＯＩは、以下の表１および米国特許出願公開第２０１６／００９７０７４号に記載のＰＯＩである。

[0057]一部の態様において、ＰＯＩは、表２に示されるホルモン、凝血／凝固因子、サイトカイン／増殖因子、抗体分子、融合タンパク質、タンパク質ワクチン、またはペプチドである。

[0058]一部の態様において、ＰＯＩは多特異性タンパク質、例えば表３に示される二特異性抗体である。

[0059]本明細書に記載の装置、設備、および方法は、原核および／または真核細胞株を含む任意の所望の細胞株の培養に用いるためにおよび培養と共に用いるために適している。さらに、態様において、装置、設備、および方法は、浮遊細胞、または接着依存（接着）細胞を含む任意の細胞タイプを培養するために適しており、薬剤および生物薬剤産物、例えばポリペプチド産物（対象のタンパク質（ＰＯＩ））、核酸産物（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、または細胞および／もしくはウイルス治療に用いられるものなどの細胞および／もしくはウイルスなどを産生するように構成された産生操作にとって適している。

[0060]態様において、細胞は、組み換えた治療産物または診断産物などの産物を発現または産生する。以下により詳細に記載するように、細胞によって産生される産物の例には、抗体分子（例えば、モノクローナル抗体、二特異性抗体）、抗体模倣体（抗原に特異的に結合するが、抗体に構造的に関連しないポリペプチド分子、例えばＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、アドネクチン、またはＩｇＮＡＲなど）、融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質、キメラサイトカイン）、他の組み換えタンパク質（例えば、グリコシル化タンパク質、酵素、ホルモン）、またはウイルス治療剤（例えば、抗がん腫瘍溶解ウイルス、遺伝子治療およびウイルス免疫療法のためのウイルスベクター）、細胞治療剤（例えば、多能性幹細胞、間葉幹細胞、および成体幹細胞）、ワクチンまたは脂質封入粒子（例えば、エクソソーム、ウイルス様粒子）、ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡなど）、またはＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡなど）、抗生物質、またはアミノ酸を含む、本明細書に例示されるものなどのＰＯＩを含むがこれらに限定されない。態様において、装置、設備、および方法は、バイオシミラーを産生するために用いることができる。

[0061]言及したように、態様において、装置、設備、および方法は、真核細胞、例えば哺乳類細胞、または例えば酵母細胞もしくは糸状菌細胞などの下等真核細胞、またはグラム陽性もしくはグラム陰性細胞の産生、および／または真核もしくは原核細胞の産物、例えば、前記細胞によって大量に合成されたタンパク質、ペプチド、もしくは抗体、アミノ酸、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を含むＰＯＩの産生を可能にする。本明細書において特に明記していない限り、装置、設備、および方法は、実験室規模、試験規模、および実生産規模の生産力を含むがこれらに限定されない任意の所望の量または生産力を含み得る。

[0062]その上、および本明細書において特に明記していない限り、装置、設備、および方法は、攪拌タンク、エアリフト、ファイバー、マイクロファイバー、中空ファイバー、セラミックマトリクス、流動床、固定床、および／または噴流層バイオリアクターを含むがこれらに限定されない任意の適したリアクターを含み得る。本明細書において用いられる「リアクター」は、発酵器もしくは発酵ユニット、または他の任意の発酵容器を含むことができ、用語「リアクター」は、「発酵器」と互換的に用いられる。例えば、一部の側面において、例としてのバイオリアクターユニットは、以下の１つまたは複数、または全てを行うことができる：栄養素および／または炭素源のフィード、適したガス（例えば、酸素）の注入、発酵または細胞培養培地の流入量および流出量、ガス相と液相の分離、温度の維持、酸素およびＣＯ２レベルの維持、ｐＨレベルの維持、かき混ぜ（例えば、攪拌）、および／または洗浄／滅菌。例としてのリアクターユニット、例えば発酵ユニットは、ユニット内に複数のリアクターを含んでもよく、例えばユニットは、それぞれのユニットに１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個、またはそれより多くのバイオリアクターを含むことができ、および／または設備は、設備内に１つまたは複数のリアクターを有する複数のユニットを含み得る。様々な態様において、バイオリアクターは、回分、半回分、流加、灌流、および／または連続発酵プロセスにとって適し得る。任意の適したリアクターの直径を用いることができる。態様において、バイオリアクターは、約１００ｍＬ〜約５０，０００Ｌの容積を有し得る。非制限的な例としては、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、２５０リットル、３００リットル、３５０リットル、４００リットル、４５０リットル、５００リットル、５５０リットル、６００リットル、６５０リットル、７００リットル、７５０リットル、８００リットル、８５０リットル、９００リットル、９５０リットル、１０００リットル、１５００リットル、２０００リットル、２５００リットル、３０００リットル、３５００リットル、４０００リットル、４５００リットル、５０００リットル、６０００リットル、７０００リットル、８０００リットル、９０００リットル、１０，０００リットル、１５，０００リットル、２０，０００リットル、および／または５０，０００リットルの容積が挙げられ得る。さらに、適したリアクターは、複数回使用、１回使用、使い捨て、または非使い捨てであり得て、ステンレススチール（例えば、３１６Ｌまたは他の任意の適したステンレススチール）およびインコネルなどの金属合金、プラスチック、および／またはガラスを含む任意の適した材料で形成することができる。

[0063]態様において、および本明細書において特に明記していなければ、本明細書に記載の装置、設備、および方法はまた、そのような産物を分離、精製、および単離するための操作および／または機器などの、特に言及していない任意の適したユニット操作および／または機器を含み得る。従来の現場組み立て設備、モジュール、モビール、および一時的な設備、または他の任意の適した構成、設備、および／またはレイアウトなどの、任意の適した設備および環境を用いることができる。例えば、一部の態様において、モジュールのクリーンルームを用いることができる。加えておよび特に明記していなければ、本明細書に記載の装置、システム、および方法は、単一の場所もしくは施設において収容および／または行うことができ、またはあるいは異なるもしくは複数の場所および／または施設で行うことができる。

[0064]非制限的な例としておよび限定されないが、全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２０１３／０２８０７９７号；第２０１２／００７７４２９号；第２０１１／０２８０７９７号；第２００９／０３０５６２６号；および米国特許第８，２９８，０５４号；第７，６２９，１６７号；および第５，６５６，４９１号は、適し得る例としての設備、機器、および／またはシステムを記載している。

[0065]誘導前の固有の増殖速度が異なり、および誘導時のバイオマス濃度が異なる、例示的なフィードプロファイル。 拡大して中央にした多重線形回帰モデル：ｘ＿ＥＦＢ：誘導時のバイオマス［ｇ／Ｌ］およびμＦＢ：誘導前の固有の増殖速度［１／ｈ］を線形項として含めた。固有の最大タイターを応答とした。 [0066]図３Ａおよび３Ｂ：拡大して中央にした多重線形回帰モデル。 図３Ｃ：拡大して中央にした値の主成分解析。 [0067]図４Ａ：固有の最大タイター［ｇ／ｇ］と誘導相の固有の増殖速度の平均値［１／ｈ］との相関。 固有の最大タイター［ｇ／ｇ］と誘導前の相の終了時に計算した固有の基質取り込み速度ｑ_{Ｓｉｎｉｔ}［ｇ／ｇ／ｈ］との相関。 統計的回帰分析：固有の増殖速度［１／ｈ］は、応答としての固有の最大タイターと相関した。 統計的回帰分析：誘導前の相の終了時に計算した固有の基質取り込み速度ｑ_{Ｓｉｎｉｔ}［ｇ／ｇ／ｈ］は、応答としての固有の最大タイターと相関した。 [0068]誘導後の時間［ｈ］に対してプロットした固有のタイター、固有の産生率［ｇ／ｇ／ｈ］、フィード速度［ｇ／ｈ］、固有の増殖速度μ［１／ｈ］、および固有の基質取り込み速度ｑ_Ｓ［ｇ／ｇ／ｈ］の軌跡。 誘導時のバイオマス量に関して標準化した累積供給基質ｄＳｎ［ｇ／ｇ］に対してプロットした固有のタイター、固有の産生率ｑｐ［ｇ／ｇ／ｈ］、フィード速度［ｇ／ｈ］、固有の増殖速度μ［１／ｈ］、および固有の基質取り込み速度ｑ_Ｓ［ｇ／ｇ／ｈ］の軌跡。 統計的回帰分析：固有の最大タイターまでの時間ｈ＿ｍａｘ［ｈ］は、応答としての固有の最大タイターと相関した。 統計的回帰分析：誘導時のバイオマス量に関して標準化した累積供給基質ｄＳｎ［ｇ／ｇ］は、応答として固有の最大タイターと相関した（式４）。 [0069]図６Ａ：最初の基質取り込み速度と固有の最大タイターとの相関を示す。図６Ｂは、基質取り込み速度の平均値と固有の最大タイターとの相関を示す。 図６Ｃ〜Ｅ：実施した実験（ｎ＝１２）において観察された分散と誘導された分散の比較。ｑｓ＿ｉｎｉｔ一定は、一定のｑ_{Ｓｉｎｉｔ}で実施した実験群を表す；ｑｓ＿ｉｎｉｔ変動は、異なる容積一定フィードレジメンの影響を調べるために実施した実験群を表す；図６Ｃは、ｑｓ_ｉｎｉｔ［ｇ／ｇ／ｈ］における誘導された分散を示す；図６Ｄは、ｑ_Ｓ［ｇ／ｇ／ｈ］における計算された分散を示す。図６は、固有の最大タイター［ｇ／ｇ］において得られた分散を示す。 図６Ｆ：固有の最大タイターに及ぼす固有の基質取り込み速度の平均値の効果の統計分析。図６Ｇ：固有の最大タイターに及ぼす最初の固有の基質取り込み（式３）速度の効果の統計分析。

発明の詳細な説明

[0070]細胞を培養することにより対象タンパク質の改善された産生のための方法が提供され、ここで、フィード戦略は固有の基質取り込みに基づいている。本方法は固有の基質の取り込み速度ｑｓを計算し、設定し、および任意に制御することに関連する。

[0071]生理学的なフィード戦略の観点から生理学を考慮し、組み換え産物の製造が改善される。これによってフィード戦略は、少なくとも１回またはタイムリーに分析されたバイオマス評価に基づいて計算される。このアプローチは１つ以上の対象タンパク質の固有の活性の改善を促進し、および／または、１つ以上の対象タンパク質の生産性を増加させる。

[0072]驚くべきことにこの方法は、特に基質の利用可能性が低い場合には、１つ以上の対象タンパク質の固有の活性および／または収率またはタイターの増加をもたらす。

[0073]本明細書を通じて使用される固有の用語は下記の意味を有する。

[0074]細胞を「培養する」という用語は、細胞と細胞培養培地を、その細胞が生存および／または成長および／または増殖に適した条件下で接触させることを言う。

[0075]本明細書中で使用される用語である「培養物」と「細胞培養物」は、細胞集団の生存および／または成長に適した条件下で、細胞培養培地中に懸濁された細胞集団をいう。本明細書中で使用されるこれらの用語は、細胞集団（例えば宿主細胞培養物）とその集団が懸濁された培地を含む組み合わせを言ってもよい。

[0076]本明細書中で使用される用語である「細胞培養培地」は、細胞の維持、成長、繁殖、または増殖のための栄養溶液を意味するものである。細胞培養培地は固有の細胞培養用途のために最適化されていてもよく、例えば、細胞の成長を促進するために処方された細胞培養成長培地、または組み換えタンパク質産生を促進するために処方された細胞培養産生培地を含む。本明細書中では用語、栄養、構成要素、および成分は置き換え可能であるように使用され、細胞培養培地を作り上げる構成成分を言う。

[0077]流加プロセスにおけるフィード培地など、細胞培養培地に関して用語「化学的に規定された」とは、細胞株作製のインビトロ細胞培養のために適した成長培地であって、その中の全ての化学成分とペプチドが既知であるものを意味するものである。典型的には化学的に規定された培地は動物由来成分を一切含まず、かつ、純粋であり一貫した細胞培養環境を表す。

[0078]本明細書中で使用される用語である「フィード」または「フィード培地」は以下を意味するものである。フィードまたはフィード培地は基質または炭素源を含み、それは化学的に規定されたもしくは複合的な培地またはその混合物でもよい。フィードまたはフィード培地は、プロモーターなどの制御配列を調節する感応物質（inductor）または誘導物質（inducer）を含んでもよい。

[0079]本明細書中で使用される用語である「感応物質」または「誘導物質」は、ＰＯＩの発現を誘導することが可能な物質を意味するものである。感応物質または誘導物質をフィードの一部として又は別途に細胞培養物中に添加してもよい。枯渇誘導性発現システムの場合には、そのような感応物質または「誘導物質」の欠如がＰＯＩの発現をもたらす。

[0080]本明細書中で使用される用語である「誘導」は各々のバイオプロセスの間に、誘導物質の補足によるか又は何かしらの種類の化学的化合物の枯渇により、ＰＯＩの発現に有利なように代謝が改変される点を意味するものである。

[0081]本明細書中で使用される用語である「誘導相」は、細胞培養の、誘導前（pre-induction）の後と誘導の期間を意味するものであり、その間に細胞が組み換えタンパク質またはＰＯＩを産生する。

[0082]本明細書中で使用される用語である細胞培養物の「産生相」は、細胞の成長が頭打ちとなるか又はほぼ一定のレベルでまたは維持される間の期間を言う。産生相の間に対数的な細胞成長は終わりＰＯＩの産生が主要となる。この期間の間に通常、継続的なタンパク質産生を支持し、望まれるＰＯＩを達成するために、培地が補足される。

[0083]本明細書中で使用される用語である「宿主」または「細胞」または「細胞株」は、長期の期間に亘って増殖する能力を獲得した、特定の細胞型の確立したクローンを言う。用語「宿主細胞株」は、内在的なもしくは組み換えた遺伝子または代謝経路の産物を発現させて、ポリペプチドまたはそのようなポリペプチドにより仲介された細胞代謝産物を産生するために使用される細胞株を言う。「産生宿主細胞株」または「産生細胞株」は、ＰＯＩのような産生工程の産物を取得するためにバイオリアクター中で、培養のためにすぐに使用できる（ready-to use）細胞株であると一般的に理解される。用語「真核宿主」または「真核細胞」または「真核細胞株」は任意の真核細胞または生物を意味するものであり、用語「前核宿主」または「前核細胞」または「前核細胞株」は任意の前核細胞または生物を意味するものであり、その各々を、対象タンパク質（ＰＯＩ）または宿主細胞代謝産物を産生するために培養してもよい。その用語がヒトを含まないことは、良く理解されるところである。

[0084]用語「発現」または「発現システム」または「発現カセット」は、ＰＯＩをコードする望みのコーディング配列と制御配列を、作動可能な結合で含んでいるか又は含有している核酸分子を言い、それにより、これらの配列によって形質転換またはトランスフェクトされた宿主は、ＰＯＩまたは宿主細胞代謝産物などのコードされたタンパク質を産生することができる。好ましくは、細胞は組み換えた対象のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする核酸を含む。好ましくは、制御配列はプロモーターである。好ましくは、プロモーターは誘導性プロモーターなどの調節可能なプロモーターである。好ましくは調節可能または誘導性プロモーターは、糖誘導性プロモーターまたは枯渇誘導性プロモーターからなる群から選択される。糖誘導性プロモーターは、ラムノースプロモーター（ｒｈａＢＡＤ、国際公開第２００６０６１１７４号Ａ２）、メリビオースプロモーター（国際公開第２００６０６１１７３号Ａ２）、アラビノースプロモーター、ｌａｃプロモーター、またはマンノースプロモーター（国際公開第２０１１０１８３７６号Ａ１）であってもよい。枯渇誘導性プロモーターは、例えばｐｈｏＡ（ＥＰ０１７７３４３）などのリン酸枯渇誘導性プロモーター、または、ｐＧ１、ｐＧ３、ｐＧ４、ｐＧ６、ｐＧ７またはｐＧ８（国際公開第２０１３０５０５５１号Ａ１）などの炭素源枯渇誘導性プロモーターでもよい。あるいはプロモーターは、ｐＳＣ１（国際公開第２０１４１３９６０８号Ａ１）などの構成的プロモーター、ＡＯＨプロモ−ター、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、またはＩＰＴＧ誘導性プロモーターであってもよい。発現システムまたは発現カセットは、ＰＯＩの遊離または分泌を許容するシグナルペプチドをコードするシグナル配列または分泌配列をさらに含んでもよい。大腸菌の場合好適なシグナル配列は、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｌａｍＢ、ｍａｌＥ、ｐｈｏＡ、ｂｌａ、ＯｐｐＡ、ＴｒｅＡ、ＭｐｐＡまたはＢｇｌＸであり、ピキアまたはコマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）の場合にはアルファ接合因子またはＥＰＸ−Ｌ（国際公開第２０１４０６７９２６号）である。形質転換を達成するには、発現システムはベクターの中に含まれてもよく；しかしながら、関連するＤＮＡも宿主染色体の中に統合されていてもよい。発現とは、ポリペプチドまたは代謝産物を含む、分泌性又は非分泌性の発現産物を言ってもよい。

[0085]更なる具体的な態様によると、プロモーターおよび／またはシグナル配列は、組み換えタンパク質またはＰＯＩをコードする遺伝子と天然では関係しておらず、ここで組み換えタンパク質又はＰＯＩは異種タンパク質であり、好ましくは、抗体もしくはそのフラグメントなどの免疫グロブリンを含む治療タンパク質、酵素およびペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、制御タンパク質、ワクチンおよびワクチン様タンパク質もしくは粒子、プロセシング酵素、増殖因子、ホルモン、ならびにサイトカインからなる群から選択されるか、またはＰＯＩの代謝産物である。

[0086]具体的には、組み換えタンパク質またはＰＯＩは真核細胞タンパク質、好ましくは哺乳類タンパク質である。本発明によって産生される組み換えタンパク質またはＰＯＩは、多量体タンパク質、好ましくは二量体または四量体であってもよい。本発明の１態様によると、組み換えタンパク質またはＰＯＩは異種タンパク質であり、好ましくは、抗体もしくはそのフラグメントなどの免疫グロブリンを含む治療タンパク質、酵素およびペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、制御タンパク質、ワクチンおよびワクチン様タンパク質もしくは粒子、プロセシング酵素、増殖因子、ホルモン、ならびにサイトカインからなる群から選択されるか、または組み換えタンパク質の代謝産物である。具体的な組み換えタンパク質またはＰＯＩは、抗体などの抗原結合分子、またはそのフラグメントであってもよい。具体的な組み換えタンパク質またはＰＯＩには、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、免疫グロブリン（Ｉｇ）または免疫グロブリンクラスＧ（ＩｇＧ）、重鎖抗体（ＨｃＡｂ）などの抗体、またはそのフラグメント、例えば抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、Ｆｄ、一本鎖可変フラグメント（ｓｖＦｖ）、もしくは加工されたその変種、例えばＦｖ二量体（ダイアボディ）、Ｆｖ三量体（トリアボディ）、Ｆｖ四量体、もしくはミニボディ、およびＶＨまたはＶＨＨまたはＶ−ＮＡＲなどのシングルドメイン抗体がある。

[0087]本明細書中で使用される用語である「誘導前の相（pre-induction phase）」とは、誘導相に先立つ細胞培養の前、すなわち誘導物質または感応物質の添加前の期間を意味するものである。

[0088]本明細書中で使用される用語である「基質」または「炭素源」とは、微生物のための炭素源として適している代謝可能な炭素基質、典型的には炭水化物を意味するものである。基質または炭素源は、細胞培養に使用するのに適している何れの型の有機炭素であってもよい。具体的な態様によれば、炭素源は炭水化物もしくは糖、例えば、グルコース、フルクト−スもしくはマンノースなどのヘキソース、サッカロースなどの二糖、グリセロールもしくはエタノールなどのアルコール、またはその混合物であってもよい。更なる具体的な態様によれば、基質または炭素源は、グルコースまたはグリセロール、またはその混合物である。その基質または炭素源は、他の二次基質または炭素源に対して優先的に代謝されるために、一次炭素源とも呼ばれ、二次基質または炭素源は、細胞に代謝される（すなわちバイオマスの生成または同化のために使用される）のにより好適ではない。好適に代謝される基質または炭素源は、炭素源誘導性プロモーターのための誘導物質として作用し得る炭素源（二次炭素源）とは異なっており、そのような例には、ＡＯＸプロモーターを誘導するメタノール、マンノースプロモーターを誘導するマンノース、ラムノースプロモーターを誘導するラムノース、メリビオースプロモーターを誘導するメリビオース、またはアラビノースプロモーターを誘導するアラビノースなどがある。

[0089]本明細書で使用される用語である「基質フィード速度」は、ｇ／Ｌ／ｈまたはｃ-ｍｏｌ／Ｌ／ｈまたはｍｌ／Ｌ／ｈでフィードされる炭素源（ｃ源）などの基質の速度を意味するものであり、すなわち発酵容量および単位時間あたりの炭素源の量である。言い換えれば基質フィード速度は、細胞の代謝を維持するのに必要とされる炭素源の量である。好ましくは、基質フィード速度は、流加相（fed-batch phase）の一部または全体の間に、継続的に適用される。

[0090]本明細書で使用される用語である「フィード戦略」は、誘導相の間に、バイオリアクター中の微生物に、基質の規定された供給を行う方法を意味するものである。

[0091]本明細書中で使用される用語である「計算する」は、異なる時点で基質取り込み速度を評価することを意味するものであり、それは典型的にはオフラインバイオマス測定を適用することにより行われる。

[0092]本明細書中で使用される用語である「設定する」は、少なくとも１時点のバイオマス評価に従ったｑｓに基づいて、基質フィード速度設定点またはプロファイルを調整することを意味するものである。

[0093]本明細書中で使用される用語である「少なくとも」は、特定の値が前記の特定の値と同じであるか、またはそれ以上である状況を言う。例えば「少なくとも１」は、「１またはそれ以上」と同じであり、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５・・・等であると理解される。

[0094]本明細書中で使用される用語である「制御する」は、定期的な、基質取り込み速度の繰り返し計算と、それに続くフィード速度の調整を意味するものとする。これは典型的には、バイオマスのリアルタイム評価／測定によって行われ、それは、固有の基質取り込み速度の計算と、続いての自動化されたフィード速度調整を促進する。

[0095]本明細書中で使用される用語である「バイオマス評価」は、バイオリアクター中のオンラインまたはオフライン測定または評価に基づいたバイオマスの定量を言うものとする。

[0096]本明細書中で使用される用語である細胞の「維持速度」または「細胞維持速度」は、生理的な機能のハウスキーピング（housekeeping）／維持（upkeep）のための、細胞のエネルギー要求を意味するものであり、その機能には例えば、細胞膜を渡っての濃度グラジエントの維持、ＤＮＡ修復またはＲＮＡ合成が含まれる。維持速度においては、得られる正味のバイオマス合成は無いか、または殆ど無いか、または僅かな減少さえあり、固有の増殖速度μは約ゼロ（０）であるか、または０に満たない。本明細書中で使用される用語である「維持速度に近似する」は上記で規定された維持速度と、維持速度よりも約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、または約１０％、または約５％、または約３％、または約２％上回る値も含むものである。そのように維持速度よりも僅かに高い条件下でさえも、細胞のバイオマス合成は起こり得るものであり、固有の増殖速度μは０に近似するか、またはそれを上回るか僅かに上回る。好適な態様において、そのように維持速度よりも僅かに高い値でのμは、０．０００１から０．０００４/ｈ、０．０００５から０．０００９/ｈ、０．００１から０．００４/ｈ、０．００５から０．００９/ｈ、０．０１から０．０４/ｈ、０．０５から０．０９/ｈ、または０．１から０．２/ｈの範囲内であり、好ましくは０．００５から０．０１５/ｈの範囲内であり、最も好ましくは０．００８から０．００１２/ｈの範囲内である。

[0097]本明細書中で使用される用語である「ソフトセンサー」は、容易に入手できるプロセスデータの数学的プロセシングによる、重要な非測定プロセス変数へのアクセスを許容するプロセス分析装置である。それらは典型的にはハードタイプのセンサーと比較して価格が低く、システムの無菌バリアを侵すことはない。

[0098]本明細書中で使用される用語である「ハードセンサー」は、濁度、培養液（broth）蛍光、または誘電率などの重要なプロセス変数を測定するためのプロセス装置を言う。

[0099]本明細書中で使用される用語である「約」は、特段の記述があるか、または本技術分野における通常の許容範囲内として理解される事情から自明である場合以外には、例えば、平均の２標準偏差内である。約は述べられた値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内であると理解される。

[0100]バイオマスの固有の基質取り込み速度ｑｓは、細胞培養物の生理学的な状態と直接的に結びついており、よって、バイオマスの固有の産生率ｑ_Ｐに高い影響力を有している。パラメータｑｓを制御するために、及びそれによって固有の産生率ｑ_Ｐを操作するために、所定の時点における発酵槽中でのバイオマス濃度を知らなければならない。

[0101]本明細書中で使用される用語である「リアルタイムバイオマス評価」は、バイオマスに関する評価に基づいて実行中のプロセスの中で行われる、リアルタイムのバイオマス評価を意味するものである。タンパク質の過剰発現により引き起こされるエネルギー代謝の中の誘導変化により、収率係数の変化がもたらされる（Ｊｅｎｚｃｈ，Ｓｉｍｕｔｉｓ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｓｃｈａｅｐｅ，Ｋｕｐｒｉｊａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１４）。よってリアルタイムバイオマス評価のための種々のアプロ−チが報告されている（Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．１９９１，ｄｅ Ａｓｓｉｓ ａｎｄ Ｆｉｌｈｏ ２０００，Ｊｏｂｅ，Ｈｅｒｗｉｇ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｊｅｎｚｓｃｈ，Ｇｎｏｔｈ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｊｅｎｚｓｃｈ，Ｓｉｍｕｔｉｓ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｐａｓｓｒｉｎｈａ，Ｂｏｎｉｆａｃｉｏ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｄａｂｒｏｓ，Ｓｃｈｕｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１０）。これらのリアルタイムアプローチは、バイオマス評価の基となる原理により、ハードタイプセンサー（Ｄａｂｒｏｓ，Ｄｅｎｎｅｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．２００９）と、モデルベースのもの（Ｊｅｎｚｃｈ，Ｓｉｍｕｔｉｓ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｊｅｎｚｓｃｈ，Ｇｎｏｔｈ ｅｔ ａｌ．２００６）；に分類することができる。モデルベースのアプローチの例はソフトセンサーの使用であろう（Ｗｅｃｈｓｅｌｂｅｒｇｅｒ ２０１３）。ソフトセンサーの背後にある中心となるアイデアは、重要なプロセス変数の評価のために、比較的に容易にアクセスできるオンラインデータを使用することである。

[0102]用語「ｑ_{Ｓｉｎｉｔ}」は、フィード速度を設定することにより誘導の時点で到達した、固有の基質取り込み速度を言う。本明細書中で使用される用語である「ｑｓ」は、プロセス相についてタイムリーに変動する固有の基質取り込み速度の平均を言う。

[0103]最先端の知識と対比して本発明は初めて、普通ではなく低い（非制御、および制御の両者）ｑｓ値は、組み換えて発現したタンパク質の生産性増加をもたらす、という驚くべき発見を描くものである。第２の驚くべき発見は、生理学的なパラメータである固有の基質取り込み速度ｑｓを、生成相の間に定常的に低いレベルに能動的に制御することにより、組み換えタンパク質のタイターを最大５０％増加させることができるということである。

[0104]更にハードウェアプローブが利用可能であり、プロセスと生物固有の較正が確立された後に、それによってリアルタイムでオンラインのバイオマス計測をすることが可能となる。これらの市販されているバイオマス計測は、例えば静電容量計測（例えばＡｂｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ）または光学密度（例えばＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ）に基づく。

[0105]上記で述べたようにバイオマス計測は、生理学的パラメータであるバイオマス増殖速度μと基質消費速度ｑｓの計算を行う基礎である。生産性を転用可能な様に表現するためにバイオマス値が必要である：
（１）μ＝１／Ｘ^＊ｄＸ／ｄｔ
（２）ｑｓ＝１／Ｘ^＊ｄＳ／ｄｔ
（３）ｑ_Ｐ＝１／Ｘ^＊ｄＰ／ｄｔ
μ バイオマス増殖速度［１／ｈ］
Ｘ バイオマス濃度［ｇ／Ｌ］
ｑｓ バイオマス固有の基質取り込み速度［ｇ／ｇ／ｈ］
Ｓ 基質濃度［ｇ／Ｌ］
ｑ_Ｐ バイオマス固有の産生速度［ｇ／ｇ／ｈ］
Ｐ 生成物濃度［ｇ／Ｌ］
ｔ 培養時間［時間］
[0106]流加発酵においては、フィードされた基質は細胞によって速やかに消費される。よって基質取り込み速度はバイオマス固有の基質フィード速度と等しく、よって、フィードポンプのポンプ速度と現在のバイオマス濃度から推測することができる。成長速度と基質取り込み速度の両者の値は、バイオマス−基質収量係数Ｙ_Ｘ／Ｓ：
（４）Ｙ_Ｘ／Ｓ＝μ／ｑｓ
によって結びついている。
Ｙ_Ｘ／Ｓ バイオマス−基質収量係数（ｇ／ｇ）
[0107]もし収量係数Ｙ_Ｘ／Ｓが既知であるならば、式４に従ってμは直接的にｑｓに変換することができ、その逆も同様である。もしＹ_Ｘ／Ｓが一定でないならば、この変換は複雑となる。もし組み換えにより発現したタンパク質が細胞の代謝状態に大きな影響を有するならば、産生相の間にＹ_Ｘ／Ｓ値の変化が観察される。これは広範囲のタンパク質について真実であり、なぜならばそれらの発現は、細胞のタンパク質合成とエネルギー代謝に代謝上の負荷をかけるからである。

[0108]μとｑｓの間の生理学的な差は、微生物増殖μを単に細胞の基質取り込みｑｓの結果として述べることにより一般化することができる。細胞の生理を制御する主要パラメータ（環境パラメータに加えて）は、栄養の入手可能性である。栄養が入手できる場合に限り、細胞はそれらを、細胞分裂、（組み換え）タンパク質産生または維持のいずれかのために変換することができる。この相関関係は式５：
（５）ｑｓ＝１／Ｙ_Ｘ／Ｓ ^＊μ＋１／Ｙ_Ｐ／Ｓ ^＊ｑ_Ｐ＋ｍ^＊Ｘ
に示されるように述べることができる。
Ｙ_Ｐ／Ｓ 産物−基質収量係数［ｇ／ｇ］
ｍ 維持係数［１／ｈ］
[0109]この観点から、「症状（symptom）」μの制御の代わりに、上流パラメータｑｓの制御はより有意義である。

[0110]式４と５において述べたように、μとｑｓの間の相関は、μ＝Ｙ_Ｘ／Ｓ ^＊ｑｓにより与えられる。収量係数Ｙ_Ｘ／Ｓは、非誘導大腸菌細胞については、典型的には０．４〜０．５ｇ／ｇであるが、ＰＯＩの発現が誘導されているときには大きく減少する。多くの組み換えタンパク質において、タンパク質発現は細胞にとって高度の代謝負荷をもたらし、すなわち、タンパク質合成のネットワークと、フォールディングまたはタンパク質分解などの二次的プロセスによって、多くのエネルギーが消費される。さらに組み換え産物は細胞にとって有毒ですらあって、細胞の成長を完全に阻害するかもしれない（Ｙ_Ｘ／Ｓ〜０）。

[0111]μを制御する追加の難点は、技術的な難点である。式１と２を比較すると、μの計算は間違いを起こしやすいバイオマスＸの計測を２回考慮している（ｑｓの計算においてＸ値は１つであることに比較して）ことが判る。この不利益に関わらず、例えばＧｎｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００８ａに述べられているように、発酵プロセスにおいてμの制御はしばしば使用されている。

[0112]我々が知る限り、非常に低い栄養供給において生産性が増加することを示すことは、文献のどの報告においても見出されなかった。細胞の生存を、維持速度、または本明細書中で規定されたその維持速度の近似においてのみ保証する、そのように低い栄養供給においてさえである。よって、もしフィード戦略が単に技術的（例えばポンプ速度）なものであっても、生理学的な変数であるｑｓまたはμにすら基づくフィード戦略による生理学的なアプローチであっても、それは問題とならない。

[0113]本発明は、組み換えタンパク質の高い産生のために最適なレベルにｑｓを制御する目的で、リアルタイムバイオマス評価を初めて適用するものでもある。本技術分野の最先端の知識とは対照的に実施された実験は、誘導相を通じて生理学的な変数である固有の基質取り込み速度ｑｓを能動的に制御したときに、免疫グロブリン（例えばＦＡｂ）などの組み換えタンパク質のタイターを最大５０％増加することができるという驚くべき発見を最初にもたらした。

[0114]我々が知る限りこれまでのところ、このように低いレベルのｑｓにおいて、生理学的なプロセスの制御のみによって引き起こされるこのように顕著な細胞生産性の増加があることを誰も示してはいなかった。有利なｑｓ制御の最初の発見は一般的に、実際のｑｓレベルとは無関係である。具体的には、好ましくは誘導相の開始において、ｑｓ値が適切なレベルに能動的に設定され、任意に制御される場合。誘導相において、固有の取り込み速度は能動的に設定され、任意に細胞維持速度の範囲内に、または上記で規定された細胞維持速度の僅かに高く制御される。

[0115]第二の驚くべき発見は、普通でなく低いｑｓ値（非制御および制御の両者において）は、原核細胞（例えば大腸菌細胞）などの細胞内で、抗体フラグメント（Ｆａｂ）などの組み換えにより発現したタンパク質の全般的な生産性の増加をもたらす、というものである。

[0116]我々が知る限り、非常に低い基質取り込み速度ｑｓが高いｑ_Ｐに最適であることが見出されたという、フィードとｑ_Ｐの間の相関は報告されていなかった。よって最適な基質フィードを、細胞維持の範囲内の非常に低いレベル（ここでμ〜０であり、ｑｓ〜０．０３から０．１５ｇ／ｇ／ｈ）として特許請求をしている我々の発明は、驚くべきものであり新規である。

[0117]よって驚くべきことに、固有の基質取り込み速度ｑｓを細胞維持速度の範囲内、または細胞維持速度よりも約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％高く設定し、および任意に制御も行うことは、固有の増殖速度μなどの従来のパラメータによって制御された細胞培養物と比較したときに、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または少なくとも約５０％の生産性の増加をもたらす。

[0118]下記の項目は更に、本明細書に提供された開示の具体的な観点、および教示を実施するための具体的な態様を提供する。

[0119]１．組み換えた対象のタンパク質（ＰＯＩ）を作製する方法であって、
（ａ）細胞培養培地中で細胞を培養し、少なくとも１つの基質を含むフィードを細胞培養物中に添加することにより前記ＰＯＩを発現させること、
（ｂ）前記ＰＯＩの誘導相および／または産生相の間に、前記細胞の固有の基質取り込み速度ｑｓを、計算し、設定し、および、任意に制御するフィード戦略を適用することであって、ここでｑｓは前記細胞培養物の維持速度に近似して設定されること；および
（ｃ）前記ＰＯＩを前記細胞培養物から単離すること、
を含む方法。

[0120]２．ｑｓは０．０３から０．１５ｇ／ｇ／ｈ、好ましくは０．０５から０．１２ｇ／ｇ／ｈ、より好ましくは０．０８から０．１２ｇ／ｇ／ｈの範囲内であり、最も好ましくは、ｑｓは約０．１２／ｇ／ｈである、項目１に記載の方法。

[0121]３．ｑｓは制御されるか、または制御されない、項目１または２に記載の方法。

[0122]４．前記ＰＯＩの産生相の少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９５％の間にわたり、ｑｓは一定であるように、減少するように、または増加するように制御されている、項目３に記載の方法。

[0123]５．前記ＰＯＩの産生相の少なくとも５０％の時間にわたり、ｑｓは一定の値（＋/−１５％）に制御される、項目３または４に記載の方法。

[0124]６．ｑｓが約０．０３ｇ／ｇ／ｈ、０．０４ｇ／ｇ／ｈ、０．０５ｇ／ｇ／ｈ、０．０６ｇ／ｇ／ｈ、０．０７ｇ／ｇ／ｈ、０．０８ｇ／ｇ／ｈ、０．０９ｇ／ｇ／ｈ、０．１ｇ／ｇ／ｈ、０．１１ｇ／ｇ／ｈ、０．１２ｇ／ｇ／ｈ、０．１３ｇ／ｇ／ｈ、０．１４ｇ／ｇ／ｈ、または０．１５ｇ／ｇ／ｈであり、最も好ましくはｑｓが約０．１２ｇ／ｇ／ｈである、項目５に記載の方法。

[0125]７．前記ＰＯＩの産生相の少なくとも５０％の時間にわたり、ｑｓは制御され、かつ減少させられる項目３に記載の方法。

[0126]８．ｑｓが０．１５から０．０５ｇ／ｇ／ｈに減少し、好ましくは０．１５から０．１２ｇ／ｇ／ｈ以下に、０．１５から０．１０ｇ／ｇ／ｈに、０．１５から０．０７ｇ／ｇ／ｈに、０．１５から０．０５ｇ／ｇ／ｈに、０．１２から０．１ｇ／ｇ／ｈに、０．１２から０．０７ｇ／ｇ／ｈに、０．１２から０．０５ｇ／ｇ／ｈに、０．１０から０．０７ｇ／ｇ／ｈに、０．１から０．０５ｇ／ｇ／ｈに、または０．１から０．０３ｇ／ｇ／ｈに減少する、項目６に記載の方法。

[0127]９．フィード速度を調整することによりｑｓが制御される、先行するいずれか１項目に記載の方法。

[0128]１０．ｑｓがフィードバック制御される固有の基質取り込み速度により制御される、先行するいずれか１項目に記載の方法。

[0129]１１．バイオマスを定量することにより、前記フィード戦略が生理学的に制御される、先行するいずれか１項目に記載の方法。

[0130]１２．バイオマス評価／計測によってバイオマスが測定される、項目１１の方法。

[0131]１３．リアルタイムバイオマス評価／計測によってバイオマスが測定される、項目１２の方法。

[0132]１４．リアルタイムバイオマス計測が、ソフトセンサーまたはハードセンサーを用いて行われる、項目１３に記載の方法。

[0133]１５．前記基質がグルコースまたはグリセロールである、先行するいずれか１項目に記載の方法。

[0134]１６．前記細胞が真核細胞または原核細胞からなる群から選択される、先行するいずれか１項目に記載の方法。

[0135]１７．前記真核細胞が、哺乳類、昆虫、酵母、糸状菌および植物細胞からなる群から選択され、好ましくは、酵母細胞であり、最も好ましくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｒｉｓ）、コメガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｒｉｓ）、Ｋ・ファフィー（Ｋ ｐｈａｆｆｉｉ）、またはＫ・シュードパストリス（Ｋ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）である、項目１６に記載の方法。

[0136]１８．前記原核細胞が、大腸菌、枯草菌、およびシュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）からなる群から選択される、項目１６に記載の方法。

[0137]１９．前記原核細胞が大腸菌である、項目１８に記載の方法。

[0138]２０．前記ＰＯＩの大部分が、細胞質内に、ペリプラズム内に、または細胞外に位置する、項目１６に記載の方法。

[0139]２１．前記ＰＯＩをコードする核酸に作動可能に連結した制御可能なプロモーターを含む発現システムまたは発現カセットを用いて前記ＰＯＩを発現させる、先行するいずれか１項目に記載の方法。

[0140]２２．前記制御可能なプロモーターが誘導性プロモーターであるか、または、枯渇誘導性プロモーターである、項目２１に記載の方法。

[0141]２３．前記誘導性プロモーターがラムノースプロモーター、メリビオースプロモーター、マンノースプロモーター、アラビノースプロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、または、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターである、項目２１または２２に記載の方法。

[0142]２４．前記ラムノースプロモーターがｒｈａＢＡＤである、項目２３に記載の方法。

[0143]２５．前記ＰＯＩが異種タンパク質であり、好ましくは、治療タンパク質、酵素およびペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、制御タンパク質、ワクチンおよびワクチン様タンパク質もしくは粒子、プロセシング酵素、増殖因子、ホルモン、ならびにサイトカインからなる群から選択されるか、またはＰＯＩの代謝産物である、先行するいずれか１項目に記載の方法。

[0144]２６．前記治療タンパク質が抗原結合分子であり、好ましくは免疫グロブリンであり、より好ましくは抗体または抗体フラグメントであり、最も好ましくはＦａｂまたはｓｃＦｖ抗体である、項目２５に記載の方法。

[0145]２７．前記原核細胞が大腸菌であり、前記プロモーターがｒｈａＢＡＤである、先行するいずれか１項目に記載の方法。

[0146]２８．組み換えた対象のタンパク質（ＰＯＩ）を作製する方法であって、
（ａ）細胞培養培地中で細胞を培養し、少なくとも１つの基質を含むフィードを前記細胞培養物中に添加することにより前記ＰＯＩを発現させること、
（ｂ）ｑｓを細胞培養物の維持速度よりも僅かに高く設定すること；および
（ｃ）前記ＰＯＩを細胞培養物から単離すること、
を含む方法。

[0147]２９．ｑｓは０．０３から０．１５ｇ／ｇ／ｈ、好ましくは０．０５から０．１２ｇ／ｇ／ｈ、より好ましくは０．０８から０．１２ｇ／ｇ／ｈの範囲内であり、最も好ましくはｑｓは約０，１２／ｇ／ｈである、項目２８に記載の方法。

下記の実施例は本発明の理解を助けるために示されたものであるが、如何なる意味においても発明の範囲を制限することを意図したものではなく、そのように理解されるべきではない。実施例は従来の方法、例えばクローニング、トランスフェクション、および微生物宿主細胞中でのタンパク質発現の方法の基礎的な観点などの詳細な記載を含まない。そのような方法は本技術分野の当業者に良く知られているものである。

[00148]誘導前の固有の増殖速度および誘導時のバイオマス濃度の影響を調べるために、二要因スクリーニング設計（ＤｏＥ）を選択した。異なるバイオマス濃度の差を補償するために、誘導時の容積一定フィード速度は、同じ固有の基質取り込み（ｑｓ_ｉｎｉｔ、式３および図２を参照されたい）に基づいた。

[00149]転用可能性を増加させるために、研究の目標は、プロセスパラメータと固有の最大タイターとの相関が観察されたことの生理的原因を説明することである。それぞれのＤｏＥのデータに基づいて、最も有望な生理的記述子は、主成分分析の助けを借りて同定される。情報マイニングアプローチを用いて、生理学を、その後の研究のための要因を選択するために最大の固有タイターに関連させる。

[00150]本明細書において、生理学は、定義されたプロセス相における時間依存的生理的変数の平均値に対応する単一の数値、すなわち生理的記述子によって記載される。

材料および方法
[00151]改変Ｋ１２大腸菌株をモデル発現系として用いた。株は、ラムノース誘導発現系（ｒｈａＢＡＤプロモーター；国際公開第２００６０６１１７４号Ａ２）を特徴とする。組み換えたタンパク質産物は、Ｆａｂ抗体であった。株は、ラムノースを炭素源として利用することができないことから、誘導物質の一度の添加で十分であった。

[00152]発酵に関して、既定の培地を用いた（Ｗｉｌｍｓ，Ｈａｕｃｋ ｅｔ ａｌ．２００１）。

[00153]４つのガラスバイオリアクターからなるＤＡＳＧＩＰマルチバイオリアクターシステムにおいて作業容積各２Ｌ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ；Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で流加培養実験を行った。リアクターは、バッフルおよび３つのディスクインペラ攪拌子を備えている。ＤＡＳＧＩＰ制御ソフトウェアｖ４．５改訂版２３０を用いて、プロセスパラメータ：ｐＨ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ，ＵＳＡ）およびｐＯ_２（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ；Ｇｒｅｉｆｅｎｓｅｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；モジュールＤＡＳＧＩＰ ＰＨ_４ＰＯ_４）、温度および攪拌子の速度（モジュールＤＡＳＧＩＰ ＴＣ４ＳＣ４）および曝気（モジュールＤＡＳＧＩＰ ＭＸ４／４）を制御した。ｐＨ制御は、ポンプモジュールＤＡＳＧＩＰ ＭＰ８による１２．５％ＮＨ_４ＯＨ塩基の添加によって促進した。同じポンプモジュールを用いて、フィードを添加した。リアクターを１２１℃で２０分間滅菌した。オフガス中のＣＯ_２、Ｏ_２濃度をそれぞれ、非分散赤外線および二酸化ジルコン検出原理を用いてガス分析器（モジュールＤＡＳＧＩＰ ＧＡ４）によって定量した。ガス流は、ガス混合モジュールＤＡＳＧＩＰ ＧＡ４によって制御した。

[00154]凍結保存液からの前培養物を、振とうフラスコに接種した（１Ｌフラスコに１００ｍＬ）。３０℃および２００ｒｐｍでおよそ１７時間後、回分容積の２．５％の前培養物の容積同等物を用いて、回分培地を接種した。回分培地（２０ｇ／Ｌ Ｃ−源）の接種後、回分培養中のＣ−源は、１２時間以内に消費された。誘導前フィード戦略は、式１および式２に従って指数的フィードフォワードプロファイルに基づいた。流加培養後、培養物をラムノースによって誘導した。誘導フィード速度を、誘導前相の終了時に式３に従って計算し（Ｗｅｃｈｓｅｌｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、容積フィード速度は誘導相を通して一定のままであった。溶存酸素レベル（ＤＯ_２）は、純粋な酸素を空気に補充することによって２５％超（接種前に３５℃、１気圧で１００％を設定した）に制御した。ｐＨは、窒素源としての役割も果たす１２．５％ＮＨ_４ＯＨを添加することによって７で一定に維持した。温度は、プロセス全体に関して３５℃に設定した。

式６
Ｆ_（ｔ）＝Ｆ_０ ^＊ｅ^{（μ＊ｔ）}
式７
Ｆ_０＝（ｘ_０ ^＊Ｖ_０ ^＊μ）／（ｃ_ｆｅｅｄ ^＊Ｙ_ｘｓ）
式８
Ｆ_ｉｎｄ＝（ｘ_ＥＦＢ ^＊Ｖ_ＥＦＢ ^＊ｑｓ_ｉｎｉｔ）／（ｃ_ｆｅｅｄ）
[00155]バイオマス乾燥細胞重量濃度を、１０５℃で７２時間乾燥後に重量測定法で定量した。Ｆ_０（式７）の計算にとって必要な初回バイオマス濃度は、光度測定原理（ＯＤ６００ｎｍ）によって計測した。試料をＯＤ測定の線形範囲の０．８未満となるように希釈し、その後確立された線形回帰の使用によってバイオマス濃度に変換した。

[00156]オフライン試料を遠心分離（４３００ｒｃｆ、１０分間）して、沈降物を蒸留水で洗浄した後、−２０℃で保存した。凍結した沈降物を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ Ｎａ−ＥＤＴＡ ｐＨ７．４で最終容積２０ｍＬに再懸濁し、１４００±１００ｂａｒで６回ホモジナイズした（Ａｖｅｓｔｉｎ ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ，Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）。

[00157]産物の量は、ｐＨ勾配を用いる工業用プロテインＧアフィニティクロマトグラフィー方法によって計測した。正確に折り畳まれた産物のみが結合することから、産物量の計測はまた、産物の品質の計測でもあると考えられる。

[00158]代謝速度および収量係数の計算を、Ｍａｔｌａｂ ２０１２ ｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）によって行った。Ｗｅｃｈｓｅｌｂｅｒｇｅｒら（２０１２；式８および９）に記載されるように、ソフトウェアを、固有の速度および収量係数の計算のために用いた。

[00159]一般的なＤｏＥ評価は、それぞれの要因の設定点に基づくことから、通常のプロセスの偏差を考慮せず、潜在的な設定点の偏差によって誘発される効果が潜在的にマスクされてしまう。因子相関に対する最も現実的な応答を確保するために、本発明者らは、その単なる設定点の代わりに入力として実際に得られたプロセス変数を用いた。

[00160]変数を、Ｄａｔａｌａｂバージョン３．５（Ｅｐｉｎａ ｈｔｔｐ：／／ｄａｔａｌａｂ．ｅｐｉｎａ．ａｔ／によって供給される）によって相関性に関して試験し、統計ソフトウェアＭＯＤＤＥ（Ｕｍｅｔｒｉｃｓ，Ｕｍｅａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を介して多重線形回帰モデルを適合させて分析した。

結果
[00161]誘導前の固有の増殖速度およびバイオマス濃度が誘導相における産生率に及ぼす影響を解明するために、実験の設計に従って７つの発酵実験を行った（図２Ａ）。誘導前の固有の増殖速度の０．０８〜０．１６［１／ｈ］の範囲および誘導時のバイオマスの２０．７〜４４．６［ｇ／Ｌ］の範囲が調べられるようにスクリーニング設計を選択した。誘導相の影響を回避するために、容積一定フィードプロファイルは、全ての実験において式８に基づいて計算した同じｑｓ_ｉｎｉｔ（０．２２±０．０２７［ｇ／ｇ／ｈ］）について計算し、基づいた。

[00162]Ｈ０仮説：「誘導前の相は誘導相とは無関係である」を評価するために、統計検定を行った。

[00163]統計分析に従うと（図２Ｂ）、誘導前の相（μＦＢ）における固定の増殖速度（μ）も誘導時（ｘ＿ＥＦＢ？）のバイオマス（ＢＭ）のいずれも、誘導相の際のＦａｂ抗体の固有の最大タイター（ＳＣＦ）に有意に影響を及ぼさないことが見出された（ｐ＝０．６８５；α＝０．１）。その結果、誘導前および誘導後の相に相関関係がないというＨ０を採択する。

[00164]Ｗｅｃｈｓｅｌｂｅｒｇｅｒら（２０１２）の研究と整合して、誘導前および誘導相の間の相関関係は、この発現系に関して検出されなかった。

[00165]誘導相の生理学に及ぼす誘導前の相の可能性がある影響を調べるために、全てのオンラインおよびオフラインデータを、上記で概要したように処理して固有の速度および収量係数を得た。

[00166]誘導相における固有の増殖速度の平均値の生理的記述子を、２つの要因：誘導前の固有の増殖速度（μＦＢ）および誘導前の相の終了時のバイオマス濃度（ｘ＿ＥＦＢ）、の応答として用いる（図３Ａ）。２つの主な要因の生理的記述子、すなわちバイオマス収量係数（Ｙｘ／ｓ）（図３Ａ）と誘導相における固有の増殖速度（μｉｎｄ）（図３Ｂ）が、誘導前の相での固有の増殖速度（μＦＢ）および誘導前の相の終了時でのバイオマス濃度（ｘ＿ＥＦＢ）と相関しないという知見は、誘導前および誘導相の仮説としての相関関係をさらに否定している。誘導相の生産性の他に、誘導相の生理的記述子も、誘導前の固有の増殖速度およびバイオマス濃度によって有意に影響を受けなかった。しかし、実験の当初の設計（ＤｏＥ）の要因は有意ではなかったが（図２）、固有の最大産物タイター分散において分散が観察された（図６Ａ）。このことは、生理的説明に疑問を呈する。

[00167]Ｆａｂ抗体の固有のタイターにおいて観察された分散（０．０１３７±０．０２５５［ｇ／ｇ］）（図６Ａを参照されたい）により、生理的原因を特定するためには、包括的なバイオプロセス分析が最も重要である。したがって、選択されたプロセスパラメータおよび生理的記述子の組に含まれる全ての分散を、主成分分析を用いて分析した（図３Ｃ）。

[00168]図３Ｃは、拡大して中央にした値による主成分分析を示す：μ、固有の増殖速度［１／ｈ］；μ_ＦＢ、誘導前の相での固有の増殖速度［１／ｈ］；ＢＭ_ＥＦＢ、誘導前の相の終了時のバイオマス濃度［ｇ／Ｌ］；ｑ_Ｓ、固有の基質取り込み速度［ｇ／ｇ／ｈ］；ＰＳＰｅｌ、固有の最大タイター［ｇ／ｇ］；時間_ｍａｘ、固有の最大タイターまでの時間［ｈ］；ｄＳｎ_ｍａｘ、固有の最大タイターまでの標準化した基質代謝量［ｇ／ｇ］：ｑ_ＣＯ２、固有の二酸化炭素排泄速度［ｇ／ｇ／ｈ］；ｑｐｐ、固有の産生率［ｇ／ｇ／ｈ］；Ｙ_ＣＯ２、基質あたりの二酸化炭素収量［ｇ／ｇ］；Ｙｐｐｓ、基質あたりの産物収量［ｇ／ｇ］；Ｙ_Ｘ／Ｓ、バイオマス収量［ｇ／ｇ］。

[00169]ＰＣＡは、固有の増殖速度μと固有の最大産物タイターとの間に負の相関があることを示唆している（図３Ｃ）。一方、固有の最大タイターに及ぼす２つの誘導前記述子、すなわち誘導前の相の終了時のバイオマスＢＭ_ＥＦＢと誘導前の固有の増殖速度μ_ＦＢの影響はわずかであるように思われる。生理的パラメータの分析は、固有の増殖速度が固有の最大タイターの変化ＰＳＰｅｌの原因であることを強く指摘する。

[00170]さらなるバイオプロセス開発を目的として、情報マイニングアプローチは、理論的リスク評価よりむしろ経験的データに基づく要因の選択を容易にする。その結果、その後のＤｏＥでは調整μを示す。しかし、高度に転用可能で単純なバイオプロセスを目標とすることは、フィード戦略を一定の容積流速度に制限する。適切なフィード流速を計算するためには、誘導時点でのそれぞれのバイオマス濃度を知る必要がある。μを計算の基礎として用いることは、バイオマス評価の誤差伝搬を増大させるリスクがより大きくなり、そのため、ｑｓ_ｉｎｉｔに基づいて計算を行う。線形のＤｏＥ（ｎ＝５）は、２つのレベルのｑｓ_ｉｎｉｔ（０．０８８〜０．３２３［ｇ／ｇ／ｈ］）を含み、２つの中心点を特徴とした。

[00171]図４Ｂに例証するように、固有の最大タイターｑｓ_ｉｎｉｔレベルの負の相関が観察された。ｑｓ_ｉｎｉｔは、固有の最大タイターの重要な要因であり、信頼水準は０．９５Ｒ２ ０．８６３／Ｑ２ ０．６５２であった。固有の最大タイターは、達成された最低のｑｓ_ｉｎｉｔで見出された。

[00172]固有の増殖速度に影響を及ぼすために、ｑｓ_ｉｎｉｔを、式８に従ってフィード速度を調節することによって調整した。フィード速度に基づく研究戦略は、基質または時間が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に関して寿命の関連次元であるか否かという問題を提起する。フィード速度の強い影響により、タイターの差は、産物のより高い産生速度またはより効率的な産生によって引き起こされ得る。この理由から、本発明者らは、ｘ軸の時間を供給した基質の累積量に置き換えた（図５Ｂ）。誘導前の相の終了時でのバイオマスの量が異なることは、ｑｓ_ｉｎｉｔに基づいて計算した場合にフィード速度が異なることを暗示していることから、標準化が必要である（式８）。その結果、転用可能性のために、供給した基質量を誘導前の相の終了時のバイオマスの量に関して標準化して、式９の変数ｄＳｎ［ｇ／ｇ］を得た。

式９
ΔＳｎ（ｔ）＝（Ｓ_ｔ−Ｓ_ＥＦＢ）／ＢＭ_ＥＦＢ
[00173]時間に対して固有のタイターをプロットして（図５Ａ）、固有の最大タイターに到達する時点での差を可視化する。固有の最大タイターは、ｑｓ_ｉｎｉｔが低い実験ではｑｓ_ｉｎｉｔが高い実験よりずっと遅れて到達する。興味深いことに、固有の最大タイターをｄＳｎに対してプロットすると（図５Ｂ）、産物形成の軌跡が整列し、固有の最大タイターが類似のｄＳｎ（３．１±０．３３６ｇ／ｇ）で見出され得る。

[00174]ｑ_ｓとしての生理的記述子の計算を、定義されたプロセス相において実施する。この関与において、計算の範囲は、累積基質取り込みｄＳｎに基づいた。対象のプロセス相は、あらゆる生理的記述子の計算に関して３．６ｇ／ｇのｄＳｎに対応する。その結果、「ｑ_Ｓ」は、誘導相において、３．６ｇ／ｇのｄＳｎに対して計算される平均値ｑ_Ｓと呼ばれている。

[00175]統計分析に関して、時間に関してＦａｂ抗体の固有の最大タイター（ＳＣＦ）に到達する点（図５Ｃ）と標準化したフィード基質（ｄＳｎ）（図５Ｄ）とを比較した。線形回帰の形での解析により、実験によって、固有の最大タイターに到達する時点が有意に異なる（Ｒ２＝０．６３９；Ｑ２＝０．５０５）（図５Ｃ）ことが実証される。これに対し、固有の最大タイターまでの標準化した供給フィードの量（ｄＳｎ）は、有意に異ならないことが見出された（Ｒ２＝０．０４２；Ｑ２＝０．１９６）（図５Ｄ）。固有の最大タイターは、供給した基質ｄＳｎの、有意に異ならない量で達成される。固有の最大タイターのレベルはｑｓ_ｉｎｉｔに依存しているが（図４Ｂ）、有意に異なる固有の最大タイターに到達するまで同じ量のフィード（ｄＳｎ）が消費される。この知見は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が、産物形成に関して異なる効率で同じ量の供給基質を用いていることを暗示している。その結果、有意に異ならない基質の量は、異なる産物の量をもたらし、基質あたりの産物収量［ｇ／ｇ］の有意な差を特徴とする（Ｆ＝１６／Ｒ２＝０．６２）。これらの知見は、ｄＳｎが固有の最大タイターの強力な予測因子であり、バイオプロセス内でのサンプリングを予定する（時間を決める）ために用いることができることを示している。

[00176]情報マイニングの観点から、実施した全ての実験を用いて全てのデータに基づいてこれまでの知見を再評価する（図６Ａ／Ｂ）。図６Ｃ〜Ｅは、平均値および最初の基質の取り込み速度の評価の差に読者の注意を向ける。

[00177]最も影響の大きい変数を調整することによってバイオプロセスを最適化するという意図を考慮すると、分散の増加（図６Ｃ、ｑｓ＿ｉｎｔ変動対ｑｓ＿ｉｎｔ一定）は、固有の最大タイターにおいてあまり顕著でないことが観察された（図６Ｅ、ｑｓ＿ｉｎｔ変動対ｑｓ＿ｉｎｔ一定）。バイオマスの増加により、細胞および時間あたりに利用可能な基質量（ｑ_Ｓ）は、容積一定フィードプロファイルの性質により減少する（図５Ａ）。当初、ｑｓ_ｉｎｉｔの変動によって、細胞あたりに利用可能な基質量の差はさらに大きくなる。しかしｑｓのこの差は、リアルタイムｑｓの軌跡が急速に収束することから急速に小さくなる。ｑｓ_ｉｎｉｔにおける最初の差は大きいが、実験全体に対する生理的記述子ｑｓの差は、ごく軽微である（図６Ｃ／Ｄ）。ｑｓ_ｉｎｉｔに基づくプロセス開発アプローチは、基質の蓄積を回避しなければならないことから、最大基質取り込み速度によって厳密に制限される。基礎となる生理的記述子を直接制御するために、ｑ_Ｓは、本明細書においてより一層有望であるように思われるが、リアルタイムでバイオマスを評価するための進んだバイオプロセス制御方法が必要である。しかし、このアプローチは、固有の最大タイターにおいて誘導された分散のおそらくより高い範囲に関連して、固有の最大タイターのより一層直接的な調節を提供する。

考察
[00178]誘導前の相と誘導相との有意な相関関係がないことを示すことができた。２つの異なる発現系の相関関係を繰り返し試験することによって、本知見の範囲を、プラットフォームの知識へと拡大した。本知見のより大きい範囲は以下の結果を有する：これはプラットフォーム内の将来の実験設計における要因の数を低減させ、その結果、バイオプロセス開発（販売までの時間）を加速する。

[00179]誘導前の相は誘導相に対して有意な効果を有しないというプラットフォーム特異的な事前の知識に基づくと、誘導前の相の影響を調べる実験は省略することができ、プラットフォーム技術の制限によってのみ制約される。見出された相関関係のその後の実験の設計への結果としてのフィードバックは、その中でさらなる研究のために最も影響が大きい要因を選択する可能性を増加させる。

[00180]工業での状況では、固有の最大タイターに達した後に、発酵を停止させて回収する。ＰＡＴイニシアチブに従うバイオプロセス開発では、サンプリングは、全体的なバイオプロセスの理解を促進するはずであり、バイオプロセス最適化では、サンプリングは、固有の最大タイターが予想されるプロセス領域により集中すべきである。したがって、誘導相において固有の最大タイターが起こる時期を分析および予測することは重要である。容易にアクセス可能であるが強力な予測因子であるｄＳｎは、実際に関連する領域におけるサンプリングに関して努力を集中して行うために役立つ。固有の最大タイターの領域における時間分解能を増加させることも、高い効率でのプロセス最適化を促進する。バイオプロセス開発の将来は、小規模バイオリアクターにあることから、本明細書に提示した単純な最大タイターの予測方法は、さらに重要となる。連続的な時間分解サンプリングが、例えばヒトリソース、ならびに／またはほとんどおよび／もしくは全ての小規模パラレルバイオリアクターの限定された量によって限定される場合、サンプリングポイントの選択は、非常に重要であり、ｄＳｎに従うサンプリングによって非常に容易となる。

ｑｓ_ｉｎｉｔに基づくバイオプロセス開発戦略を用いると、恩恵があることが示された。それにもかかわらず、一定の容積フィード速度ｑｓ_ｉｎｉｔに基づくフィード戦略は、代謝物の蓄積を防止しなければならないという生理学的制約によって強く制限される。この点において、定数ｑ_Ｓに関して動的に適合させたフィードは、より多くのプロセスに対して技術的自由度を与える。

参考文献
Dabros, M., D. Dennewald, D. Currie, M. Lee, R. Todd, I. Marison and U. von Stockar (2009). "Cole-Cole, linear and multivariate modeling of capacitance data for on-line monitoring of biomass." Bioprocess and Biosystems Engineering 32(2): 161-173.
Dabros, M., M. Schuler and I. Marison (2010). "Simple control of specific growth rate in biotechnological fed-batch processes based on enhanced online measurements of biomass." Bioprocess and Biosystems Engineering 33(9): 1109-1118.
de Assis, A. J. and R. M. Filho (2000). "Soft sensors development for on-line bioreactor state estimation." Computers & Chemical Engineering 24(2-7): 1099-1103.
Dietzsch, C., O. Spadiut and C. Herwig (2011). "A dynamic method based on the specific substrate uptake rate to set up a feeding strategy for Pichia pastoris." Microb Cell Fact 10: 14.
Gnoth, S., M. Jenzsch, R. Simutis and A. Lubbert (2008). "Product formation kinetics in genetically modified E. coli bacteria: inclusion body formation." Bioprocess and Biosystems Engineering 31(1): 41-46.
Jenzsch, M., S. Gnoth, M. Beck, M. Kleinschmidt, R. Simutis and A. Lubbert (2006). "Open-loop control of the biomass concentration within the growth phase of recombinant protein production processes." J Biotechnol 127(1): 84-94.
Jenzsch, M., R. Simutis, G. Eisbrenner, I. Stuckrath and A. Lubbert (2006). "Estimation of biomass concentrations in fermentation processes for recombinant protein production." Bioprocess Biosyst Eng 29(1): 19-27.
Jenzsch, M., R. Simutis and A. Luebbert (2006). "Generic model control of the specific growth rate in recombinant Escherichia coli cultivations." J Biotechnol 122(4): 483-493.
Jobe, A. M., C. Herwig, M. Surzyn, B. Walker, I. Marison and U. von Stockar (2003). "Generally applicable fed-batch culture concept based on the detection of metabolic state by on-line balancing." Biotechnol Bioeng 82(6): 627-639.
Passrinha, L. A., M. J. Bonifacio and J. A. Queiroz (2009). "Application of a fed-batch bioprocess for the heterologous production of hSCOMT in Escherichia coli." J Microbiol Biotechnol 19(9): 972-981.
Riesenberg, D., V. Schulz, W. A. Knorre, H. D. Pohl, D. Korz, E. A. Sanders, A. Rob and W. D. Deckwer (1991). "High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate." Journal of Biotechnology 20(1): 17-27.
Sagmeister, P., P. Wechselberger, M. Jazini, A. Meitz, T. Langemann and C. Herwig (2013). "Soft sensor assisted dynamic bioprocess control: Efficient tools for bioprocess development." Chemical Engineering Science 96(0): 190-198.
Schaepe, S., A. Kuprijanov, R. Simutis and A. Lubbert (2014). "Avoiding overfeeding in high cell density fed-batch cultures of E. coli during the production of heterologous proteins." Journal of Biotechnology 192, Part A: 146-153.
Wechselberger, P., P. Sagmeister, H. Engelking, T. Schmidt, J. Wenger and C. Herwig (2012). "Efficient feeding profile optimization for recombinant protein production using physiological information." Bioprocess Biosyst Eng 35(9): 1637-1649.
Wechselberger, P., P. Sagmeister and C. Herwig (2013). "Real-time estimation of biomass and specific growth rate in physiologically variable recombinant fed-batch processes." Bioprocess Biosyst Eng 36(9): 1205-1218.
Wilms, B., A. Hauck, M. Reuss, C. Syldatk, R. Mattes, M. Siemann and J. Altenbuchner (2001). "High-cell-density fermentation for production of L-N-carbamoylase using an expression system based on the Escherichia coli rhaBAD promoter." Biotechnology and Bioengineering 73(2): 95-103.

Claims (29)

1. 組み換えた対象のタンパク質（ＰＯＩ）を作製する方法であって、
   （ａ）少なくとも１つの基質を含むフィードを細胞培養培地に添加すること、
   （ｂ）前記細胞培養培地において、前記ＰＯＩの誘導相および／または産生相の間に、細胞の固有の基質取り込み速度ｑｓで細胞を培養して前記ＰＯＩを発現させることであって、ここでｑｓは細胞培養物の維持速度に近似して設定されること；および
   （ｃ）前記ＰＯＩを前記細胞培養培地から単離すること、
   を含む方法。
2. ｑｓは０．０３から０．１５ｇ／ｇ／ｈ、好ましくは０．０５から０．１２ｇ／ｇ／ｈ、より好ましくは０．０８から０．１２ｇ／ｇ／ｈの範囲内であり、最も好ましくは、ｑｓは約０．１２／ｇ／ｈである、請求項１に記載の方法。
3. ｑｓは制御されるか、または制御されない、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記ＰＯＩの産生相の少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９５％の間にわたり、ｑｓは一定であるように、減少するように、または増加するように制御されている、請求項３に記載の方法。
5. 前記ＰＯＩの産生相の少なくとも５０％の時間にわたり、ｑｓは一定の値（±１５％）に制御される、請求項３または４に記載の方法。
6. ｑｓが約０．０３ｇ／ｇ／ｈ、０．０４ｇ／ｇ／ｈ、０．０５ｇ／ｇ／ｈ、０．０６ｇ／ｇ／ｈ、０．０７ｇ／ｇ／ｈ、０．０８ｇ／ｇ／ｈ、０．０９ｇ／ｇ／ｈ、０．１ｇ／ｇ／ｈ、０．１１ｇ／ｇ／ｈ、０．１２ｇ／ｇ／ｈ、０．１３ｇ／ｇ／ｈ、０．１４ｇ／ｇ／ｈ、または０．１５ｇ／ｇ／ｈであり、最も好ましくはｑｓが約０．１２ｇ／ｇ／ｈである、請求項５に記載の方法。
7. 前記ＰＯＩの産生相の少なくとも５０％の時間にわたり、ｑｓは制御され、かつ減少させられる請求項３に記載の方法。
8. ｑｓが０．１５から０．０５ｇ／ｇ／ｈに減少し、好ましくは０．１５から０．１２ｇ／ｇ／ｈ以下に、０．１５から０．１０ｇ／ｇ／ｈに、０．１５から０．０７ｇ／ｇ／ｈに、０．１５から０．０５ｇ／ｇ／ｈに、０．１２から０．１ｇ／ｇ／ｈに、０．１２から０．０７ｇ／ｇ／ｈに、０．１２から０．０５ｇ／ｇ／ｈに、０．１０から０．０７ｇ／ｇ／ｈに、０．１から０．０５ｇ／ｇ／ｈに、または０．１から０．０３ｇ／ｇ／ｈに減少する、請求項６に記載の方法。
9. フィード速度を調整することによりｑｓが制御される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. ｑｓがフィードバック制御される固有の基質取り込み速度により制御される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. バイオマスを定量することにより、ｑｓが生理学的に制御される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. バイオマス評価／計測によってバイオマスが測定される、請求項１１に記載の方法。
13. リアルタイムバイオマス評価／計測によってバイオマスが測定される、請求項１２に記載の方法。
14. リアルタイムバイオマス計測が、ソフトセンサーまたはハードセンサーを用いて行われる、請求項１３に記載の方法。
15. 前記基質がグルコースまたはグリセロールである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記細胞が真核細胞または原核細胞からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記真核細胞が、哺乳類、昆虫、酵母、糸状菌および植物細胞からなる群から選択され、好ましくは、酵母細胞であり、最も好ましくはピキア・パストリス（Pichia pastris）、コメガタエラ・パストリス（Komagataella pastris）、Ｋ．ファフィー（K. phaffii）、またはＫ．シュードパストリス（K. pseudopastoris）である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記原核細胞が、大腸菌、枯草菌、およびシュードモナス菌（Pseudomonas）からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
19. 前記原核細胞が大腸菌である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記ＰＯＩの大部分が、細胞質内に、ペリプラズム内に、または細胞外に位置する、請求項１６に記載の方法。
21. 前記ＰＯＩをコードする核酸に作動可能に連結した制御可能なプロモーターを含む発現システムまたは発現カセットを用いて前記ＰＯＩを発現させる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記制御可能なプロモーターが誘導性プロモーターであるか、または、枯渇誘導性プロモーターである、請求項２１に記載の方法。
23. 前記誘導性プロモーターがラムノースプロモーター、メリビオースプロモーター、マンノースプロモーター、アラビノースプロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、または、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターである、請求項２２に記載の方法。
24. 前記ラムノースプロモーターがｒｈａＢＡＤである、請求項２３に記載の方法。
25. 前記ＰＯＩが異種タンパク質であり、好ましくは、治療タンパク質、酵素およびペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、制御タンパク質、ワクチンおよびワクチン様タンパク質もしくは粒子、プロセシング酵素、増殖因子、ホルモン、ならびにサイトカインからなる群から選択されるか、またはＰＯＩの代謝産物である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記治療タンパク質が抗原結合分子であり、好ましくは免疫グロブリンであり、より好ましくは抗体または抗体フラグメントであり、最も好ましくはＦａｂまたはｓｃＦｖ抗体である、請求項２５に記載の方法。
27. 前記細胞が大腸菌であり、前記ＰＯＩをコードする核酸に作動可能に連結したｒｈａＢＡＤプロモーターを含む発現システムまたは発現カセットを用いて前記ＰＯＩを発現させる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
28. 組み換えた対象のタンパク質（ＰＯＩ）を作製する方法であって、
    （ａ）少なくとも１つの基質を含むフィードを細胞培養培地中の細胞に添加すること、（ｂ）前記細胞培養培地において、細胞培養物の維持速度よりも僅かに高いｑｓで前記細胞を培養して前記ＰＯＩを発現させること；および
    （ｃ）前記ＰＯＩを前記細胞培養物から単離すること、
    を含む方法。
29. ｑｓは０．０３から０．１５ｇ／ｇ／ｈ、好ましくは０．０５から０．１２ｇ／ｇ／ｈ、より好ましくは０．０８から０．１２ｇ／ｇ／ｈの範囲内であり、最も好ましくはｑｓは約０．１２／ｇ／ｈである、請求項２８に記載の方法。

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