CN106574230B - 细菌菌蜕的补料分批生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于断开裂解基因表达和细菌细胞的实际裂解的联系的细菌菌蜕的补料分批生产方法。

Description

细菌菌蜕的补料分批生产方法
发明描述
本发明涉及基于断开裂解基因表达和细菌细胞实际裂解联系的细菌菌蜕补料分批生产方法.
细菌菌蜕平台系统是用于医疗应用的具有前景的新技术.从革兰氏阴性细菌得来，细菌菌蜕是具有持久的细胞形态的空的细菌细胞被膜。细菌菌蜕通过受控的裂解基因异源表达从活菌产生，例如，噬菌体φX174裂解基因E.编码出的蛋白E是靶向细胞分裂位点，在该处寡聚并诱导内外膜的融合的短(91个氨基酸)非酶促膜相关蛋白(Witte et al.，1990.J.Bacteriol.，172(7)：4109-4114).这最终导致了密封周质空间的不同的跨膜隧道结构的形成.由细胞质和周围介质之间的渗透压差驱动，具有其所有成分的细胞质被排出到介质中，留下空细菌菌蜕.
使用细菌菌蜕作为灭活疫苗或佐剂的用途，以及在其细胞被膜结构中携带异源蛋白的重组细菌菌蜕制品在WO91/13555和WO 93/01791中公开，其通过引用并入本文。如WO00/53163中所述的，细菌菌蜕进一步适合作为活性化合物的载体或靶向载体.
细菌菌蜕应用的广谱性迫切需求经济、有力和可扩展的其制备方法.
常规细菌菌蜕生产方法是以分批模式进行的。复合培养基中的低密度分批方法已经被描述在Langemann et al.，2010 Bioengineered bugs，1(5)：326-336中.目前大肠杆菌菌蜕的生产以修改自DeLisa et al.，1999 Biotechnol.Bioeng.，65(1)：54-64.的在确定成分培养基中的中密度分批方法来实现.在该方法中(裂解诱导前约5g/l的生物量干细胞重量(DCW))，可以达到1010个细胞/ml培养肉汤的最终浓度。E-裂解效率超过99.8％.
希望提供使用高密度分批处理方法的更有效的生产细菌菌蜕方法.但先前的这种类型的方法已被证明有问题.在高细胞密度，大量的细胞质成分被排出到培养基中急剧改变培养肉汤的特性.这将导致严重的问题如增加的粘度、起泡、降低的氧传递和坏物质传递。
本发明的目的是提供一种生产细菌菌蜕制品的方法，其中以前的方法的缺点已被克服.该目的是通过使用基于导致高总裂解效率的断开裂解基因表达和实际细胞裂解过程的联系的高细胞密度培养方法来实现的.
因此，本发明的第一个方面涉及生产细菌菌蜕制品的方法，包括下列步骤：
(a)提供包含编码能够在细菌细胞被膜中形成隧道结构的蛋白的裂解基因的细菌细胞，
(b)在其中所述裂解基因不被表达的条件下培养细菌细胞，
(c)在步骤(b)后，使所述细菌细胞经受裂解基因被表达但是细菌细胞裂解被抑制的条件，
(d)在步骤(c)后，使所述细菌细胞经受其中发生所述细菌细胞的裂解的条件，和
(e)获得所得的细菌菌蜕.
在步骤(a)中提供的细菌细胞可以是来自适合细菌菌蜕生产的任何类型的细菌，例如，革兰氏阴性细菌细胞，尤其是大肠杆菌(例如，在EP-A-0 291 021和EP-A-0 516 655中公开的，其通过引用并入本文)，鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、肺炎杆菌、支气管炎博德特菌、幽门螺杆菌、霍乱弧菌、胸膜肺炎放线杆菌、流感嗜血杆菌、溶血曼海姆菌、多杀性巴氏杆菌、绿脓杆菌、恶臭假单胞菌、真氧产碱杆菌或果胶杆菌.
细菌细胞包括编码能够在细菌被膜中形成隧道结构的蛋白质(裂解蛋白)的裂解基因.该裂解基因可以是任何适当类型的裂解基因，例如基因E，优选噬菌体ΦX174裂解基因E(Henrich et al.，1982Mol.Gen.Genet.，185(3)493-497)，包括其天然产生的或重组变体.裂解基因是染色体外的或被整合到细菌细胞的基因组中.
在步骤(b)中，细菌细胞在裂解基因不被表达的条件下培养.为了这个目的，裂解基因优选地被置于可调控启动子的可操作控制下，例如，化学或温度可调控启动子。
可以使用不同的化学可调控启动子/操纵子系统，以通过加入能诱导启动子可操作控制下的基因表达的化合物来控制裂解基因的表达，包括乳糖启动子，色氨酸启动子，tet启动子，tac启动子，trc启动子或者其衍生物.诱导化合物的实例是IPTG，异丙基-D-硫代半乳糖苷，乳糖或阿拉伯糖.
当裂解基因的表达在热可调控启动子的可操作控制下时，温度诱导的λPR或PL启动子或其衍生物可以被使用，任选地与修饰的操纵子序列和温度敏感性c1857阻遏子组合(例如如WO 98/07874中所述，在此通过引用并入)，例如λpL/λpR-c1857系统.热可调控启动子可通过调节温度到容许表达温度来进行诱导.容许表达温度是由达到诱导裂解基因表达的必要温度所确定的.本发明中，优选使用的热可调控启动子在约30℃-37℃下被抑制，并且通过温度升高到约40-50℃，优选约42-45℃一段时间，例如大约至少10分钟能被诱导.
在本发明的优选的方面，用于生产细菌菌蜕的细菌细胞的培养按补料分批方法，即，按培养过程中一种或多种营养物被提供给生物反应器，并且其中细胞保留在生物反应器中直至培养结束的培养方法来进行.
在进一步优选的方面，在步骤(b)中，细菌细胞被培养至最终生物量浓度约10-100g DCW/L，优选约20-80g DCW/L，更优选约30-70g DCW/L，最优选约40-60gDCW/L培养基.
在步骤(c)中，细菌细胞经受裂解基因被表达但细菌细胞的裂解被抑制的条件。裂解基因表达可通过诱导如上所述的可调控启动子来触发.为断开裂解基因表达和蛋白裂解过程的联系，已经发现当细菌细胞保持在至少基本上稳定的状态，例如伪稳定或稳定状态时裂解过程可以被抑制.
可替代地，裂解过程也可以通过低于6或高于8的pH值来抑制(Lubitz et al.，1984 J.Gen.Microbiol.，130(5)，1079-1087).
在优选的实施方案中，细菌细胞的裂解是通过特定底物摄取速率qs的调整来控制.
特定底物摄取速率qs(以g/gh计的单位时间消耗底物量)以底物体积摄取速率rs(以g/lh计的单位时间消耗底物量)和物量浓度X(干细胞重g/l)的比率根据公式1来确定.
Figure BPA0000231420280000031
公式1：以g/gh计的特定底物摄取速率的确定.
根据本发明，特定底物速率qs令人惊讶地被确定为控制细菌细胞的裂解的关键参数。特定底物速率qs是影响细胞生理，特别是在裂解基因表达阶段和随后的裂解过程中可量化可控制的工艺参数.因此，裂解蛋白的裂解功能与细菌细胞有裂解能力的生理状态，例如允许细菌细胞进行裂解的生理状态有关.因此，有可能通过将培养转换到细菌细胞的无裂解能力的生理状态来表达裂解基因而不裂解细胞.
因此，在步骤(b)中，生产细菌菌蜕的细菌细胞的培养优选在至少约0.4g/gh，优选至少约0.5g/gh，更优选至少约0.6g/gh，最优选至少约0.7g/gh的特定底物的摄取速率qs下进行.接着，在步骤(c)中，通过转换细胞至低的特定底物摄取速率qs的状态，特别是其中特定底物的摄取速率qs为约0.1-0.3g/gh，更特别为0.2-0.25g/gh可以获得至少基本上稳定的状态。
在步骤(d)中，其中细菌细胞经受其中细菌细胞的裂解发生的条件.裂解过程的开始可以通过将培养复位到细菌细胞有裂解能力的生理状态，例如到其中的特定底物摄取速率qs高的状态来触发.因此，细菌细胞的裂解可以通过提供生长刺激来诱导，特别是通过提供营养物到培养基中，更特别通过提供营养物到培养基来获得至少约0.4g/gh，优选至少约0.5g/gh，更优选至少约0.6g/gh，最优选至少约1.0g/gh的底物摄取速率qs。
在优选的实施方案中，使细菌细胞经受裂解条件后，步骤(d)可以包括额外的启动子诱导步骤，也被称为“修正步骤”，例如可以进行化学或热启动子诱导步骤(见实施例7).此“修正步骤”优选应用于裂解过程末尾阶段，例如不降低补料速率qs.
菌蜕制品中残余的未裂解，可育的细菌细胞的量可通过灭活步骤进一步降低.该灭活步骤可以包括加入能够破坏残余的未裂解的细菌细胞的化学灭活剂，如在WO 2009/090093中描述的β-丙内酯，其通过引用并入本文.
可替代地，残余的未裂解的细菌细胞的失活可以通过共表达能够水解细胞质成分的酶，特别是核酸酶，更特别是如WO 2009/090093中所述的金黄色葡萄球菌核酸酶(S-核酸酶)来实现，其通过引用并入本文。核酸酶由染色体外或已整合到细菌细胞基因组的核酸酶基因编码。核酸酶基因的表达可以与可调控表达控制序列(如WO 2009/090093中所述)可操作连接.
细菌菌蜕制品的理想的目标是实现高裂解效率。裂解效率由裂解步骤之后死细胞的百分比来确定.根据本发明，达到至少约70％，优选至少约80％，更优选至少约90％，达到最优选至少96％的裂解效率.
此外，本发明的方法可以包括控制培养条件，例如通过射频阻抗测量(RFI)和/或可在有规律的和断开联系的补料分批过程中被用于细菌菌蜕生产的基于软传感器的生物量估计.至少在步骤(c)和步骤(d)期间培养基条件可以被监测，特别是通过射频阻抗测量(参见实施例2).
已经发现通过RFI测量的相对介电常数信号反映与活细胞数线性相关的单独活细胞的累积电容(由于存在膜电位)，这样允许裂解过程的实时观察.在RFI信号的基础上，可以实施策略来提供在裂解阶段内特定底物摄取速率qs的控制(见实施例6).使用传感器，例如第一原理软传感器，相对介电常数和存活生物量之间的校准可以在线进行而不需要预先的菌株特异性信息(见实施例3).
在另一方面，本发明涉及使用上述裂解策略生产目标蛋白.通过其方法，大量目标蛋白可迅速释放到培养基中，并从中收集.
因此，重组生产目标蛋白的方法包括下列步骤：
(a)提供包含(i)编码能够在细菌细胞被膜中形成隧道结构的蛋白的裂解基因和(ii)编码目标蛋白的基因的细菌细胞，
(b)在裂解基因不被表达的条件下培养细菌细胞，
(c)在步骤(b)后，使细菌细胞经受裂解基因被表达，但裂解被抑制的条件，
(d)在步骤(c)后，使细菌细胞经受其中发生细菌细胞的裂解的条件，和
(e)回收和任选地纯化步骤(b)和/或步骤(c)中已被表达的目标蛋白.
目标蛋白可以是任何蛋白，例如适合于药物用途的真核蛋白.其是由异源基因(目标基因)编码的，该基因可以以染色体外的形式存在，例如在染色体外质粒上编码或整合到细菌染色体中.优选地，目的基因处于上文所述的可调节启动子的操作控制之下.控制目的基因表达的启动子可以与控制裂解基因表达的启动子相同或不同.优选地，目的基因的表达被独立地或从裂解基因的表达诱导.对于生产目标蛋白的方法的进一步优选特征，参考上文公开的生产细菌菌蜕的讨论.
在另一方面，本发明涉及重组生产噬菌体ΦX174蛋白E或其衍生物的方法，包括下列步骤：
(a)提供包含编码蛋白质E或其衍生物的裂解基因的细菌细胞，
(b)在裂解基因不被表达的条件下培养细菌细胞，
(c)在步骤(b)后，使细菌细胞经受裂解基因被表达，但细菌细胞的裂解被抑制的条件，
(d)在步骤(c)后，使细菌细胞经受其中发生细菌细胞的裂解的条件，和
(e)回收和任选地纯化蛋白E或其衍生物.
对于用于生产噬菌体ΦX174蛋白E或其衍生物的方法的优选特征，参考上文公开内容。
此外，本发明将通过下列附图和实施例更详细地说明.
附图说明
图1：用断开联系的E-裂解生产细菌菌蜕过程的概念.T和qs指示的过程阶段示意图显示断开E-表达和E-裂解联系可以通过控制qs来实现.该过程被分成(1+2)分批/为了积累生物量的补料分批阶段，(3)E-表达阶段，其中蛋白E形成由低qs值的温度升高诱导，随后是在较低温度下具有增加的qs值的(4)E-裂解阶段。
图2：通过简单的温度(红线)改变断开联系的E-裂解.温度变化的期间，相对介电常数(绿线)和细胞存活率(实心球线)保持基本上不受影响.延迟后，细胞存活率下降而在同时细菌菌蜕形成(空心球线)。
图3：(A)在2l规模断开联系的E-裂解过程的示例.过程阶段标明：补料分批(qs＝0.6g/gh，T＝35℃)，E-表达(qs＝0.1g/gh，T＝42℃)和E-裂解(qs＝0.6g/gh，T＝27.5℃).细胞存活率和由流式细胞术测量(FCM)检测的E-裂解效率通过实心和空心球分别表示.(B)寻找在T＝27.5℃触发E-裂解最小的qs值.
图4：在高度动态的E-裂解阶段期间控制qs的策略方案.计算/软测量步骤以灰色加阴影.(中间)输出用蓝色虚线方框线给出.
图5：培养过程中相对介电常数(绿线)，温度(红线)和补料速度(蓝线)曲线.实际进补料速率精确跟随电容信号而没有大的延迟。
图6：用“修正步骤”断开联系的E-裂解.E-表达和E-裂解阶段(如指示)之后，通过施加短的温度变化至42℃引入一个“修正步骤”。
实施例
实施例1：材料和方法
细菌菌株
Ardeypharm(Herdecke，德国)提供的大肠杆菌Nissle 1917(EcN；06：K5：H1，ΔpMut1，ΔpMut2).在质粒pGLysivb上携带温度诱导基因E盒和带有庆大霉素抗性盒以及纯化质粒pGLysivb(Haidinger et al.2001，Cytometry，44(2)：106-12)的EcN由BIRD-CGmbH&CoKG(Kritzendorf，奥地利)提供.大肠杆菌C41(EcC41；OverExpressTMC41(DE3)：F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3))从Lucigene(Middleton，W1，美国)购买.
通过研究EcN(pGLysivb)和EcC41(pGLysivb)发现两种菌株都有μmax(35℃，DeLisa培养基)＝0.75h-1和生物量产量系数Yx/s(35℃，补料分批)＝0.5g/g的非常相似的生长特性.
CaCl2/RbCl2感受态细胞的制备(EcC41)
向30毫升Luria Bertani(LB)培养基中接种EcC41储备物.将培养物在+36℃温水浴下培养至OD600约0.5.离心收集细胞(10min，+4℃，1700g)，重悬于20ml预冷的MOPS I溶液，并保持在冰上10分钟。重复离心，将细胞重新悬浮于6ml MOPS II溶液并在冰上保持30分钟.最后离心后，将细胞再悬浮于480μl MOPS II和180μl甘油(50％v/v)中.将100μl等份储存在-80℃.
通过研究EcN(pGLysivb)和EcC41(pGLysivb)发现两种菌株都有μmax(35℃，DeLisa培养基)＝0.75h-1和生物量产量系数Yx/s(35℃，补料分批)＝0.5g/g的非常相以的生长特性.
CaCl2/RbCl2感受态细胞的转化(EcC41)
感受态细胞在冰上解冻(10分钟).将2μl质粒-DNA(pGLysivb)加入到100μl感受态细胞(EcC41)中，并保持在冰上30分钟。将细胞于+36℃暴露于热激2分钟，转入700μl LB培养基并在+36℃下摇动1小时.将细胞涂布于含有选择性抗生素的琼脂平板上，挑取阳性克隆并培养.用25％v/v甘油制备工作细胞库(WCB，1.8毫升冷冻储备液)并储存在-80℃.
培养基
使用根据DeLisa等人的，补充有庆大霉素(20mg/l)，以葡萄糖为碳源(分批培养基葡萄糖浓度：20g/l；补料分批培养基葡萄糖浓度为400g/l)的确定培养基.
生物反应器
补料分批实验在两个工作体积为10l和20l的不锈钢生物反应器Techfors-S(Infors，瑞士)中进行.温度，pH，通气，反应器压力和搅拌器速度经由Techfors-S集成面板控制.pH用作为碱的6M NH4OH和作为酸的1M H3PO4控制在pH7.2.进气空气和氧气通过膜型过滤器Novasip C3PFRP1A(Pall，Port Washington，NY；USA)过滤.培养容器在接种前在121℃下原位灭菌20分钟.
此外，使用有类似仪器的平行四元生物反应器系统Microbiology BD(DASGIP，Jülich，Germany)来做筛选规模实验.筛选规模系统的工作体积为1-2l。
排气分析
CO2和O2的排气浓度分别用红外线和顺磁原理通过气体分析仪定量(Servomex，Crowborough，United Kingdom；Dr.Marino Müller AG，Egg，Switzerland).流动中的空气和氧气通过质量流量控制器(
Figure BPA0000231420280000082
Aesch，瑞士)定量.
DASGIP四元系统排气分析是由特征为O2和CO2BlueSens传感器的GA4(DASGIP，Jülich，Germany)模块(BlueSens，Herten，Germany)完成.
在线射频阻抗测量(RFI)
环型探针(Aber Instruments，Aberystwyth，Wales，UK)被用于相对介电常数Δε的在线测量.Δε通过使用两个频率，非细胞背景(10兆赫)导致的高频和归于活细菌细胞的低频(1MHz)来估算.所得值之间的差给出相对介电常数Δε，其可以关联存活生物量浓度。测量原理的更多信息被Markx et al.，1999 Enzyme and Microbial Technology，25(3-5)，161-171给出.
积累生物量的培养模式(分批/补料分批)
用预培养物(90/120ml，OD6001-2)分别接种含4和7升的分批培养基的生物反应器(10/20l工作体积).在如由CO2排气浓度的下降检测到的分批阶段末尾，开始生长率为μ＝0.3h-1的指数补料分批培养.指数补料速率F(t)根据公式2计算.
Figure BPA0000231420280000081
公式2：以g/h计的指数补料分批培养中补料速率F的计算
初始补料速率F0通过下面的公式3计算
Figure BPA0000231420280000091
公式3：以g/h计的指数补料分批培养初中始补料速率F0的计算
分批阶段X0末尾的生物量浓度从测量的OD600计算.补料浓度S0从培养基成分给出，补料浓度ρf依靠重量分析决定.培养参数总结在表1中.
Figure BPA0000231420280000092
表1：分批/补料分批阶段培养参数
Figure BPA0000231420280000093
表2：应用的基于代时的缩小比例模型概要
Figure BPA0000231420280000094
器装置执行E-裂解阶段期间的qs控制策略。
用于生物量估算的累积软传感器
如Wechselberger等人(见上)所述的累积软传感器被用于估算生物量浓度.简言之，所应用的软传感器基于涉及还原程度及矩阵公式中碳平衡的的冗余方程系统(冗余1).底物摄取速率(rs)通过所测量的补料流F(t)和已知的补料浓度S0和密度ρf计算.二氧化碳演进(rco2)和氧气摄取速率(rO2)从测得的空气和氧气的流速，以及排气中测得的氧气和二氧化碳的浓度来计算.
该超定方程系统允许假定细胞群体的固定的C-摩尔化学计量(CH1.8N0.23O0.56，灰分5.5％)估算生物量形成率rx.生物量形成率rx被积分并累计来得知形成的总生物量.除以目前肉汤体积V(t)给出生物量浓度.软传感器与补料分批的指数补料倾斜同时开始.分批阶段末尾估算的生物量浓度被用作软传感器的起始值.
在线和离线分析
生物量
在105℃干燥最少72小时后重量分析法定量生物量浓度.样品离心(5,000rpm，10min)，并用蒸馏水洗涤沉淀.用于补料分批起始(公式2)以及软传感器的起始值(见上文)的生物量浓度通过光度原理估算(DCW＝0.33*OD600)
底物和小代谢物
裂解阶段上清液中的葡萄糖以及醋酸盐浓度以HPLC定量(使用HPLC柱SupelcogelC-610，Sigma Aldrich，流速：0.5ml/min，洗脱液：0.1％H3PO4/NaN3，30℃，RefractiveIndex(RI)detector)。在分析前，将样品稀释(1∶5)以允许通过0.2μm过滤器过滤.
流式细胞术(FCM)测量
对于FCM，使用有488nm的蓝色固态激光器的Cube 6系统(Partec，Mü nster，Germany).样品被适当稀释，并用两种荧光染料染色：用于染色细胞膜的RH 414(abs./em.：532/718nm，终浓度：3nM)和用于测定细胞存活率的DiBAC4(3)(abs./em.：493/516nm，终浓度：0.75nM)(两种染料：AnaSpec，Fremont CA，USA)。RH 414的信号在通道FL2(橙色)被拾取，确定用于排除非细胞背景的栅.FSC(前向散射)和FL1(绿色)信号的组合被用来确定存活细胞(R1)，死但完整细胞(R2)以及细菌菌蜕(R3)的区域栅.裂解效率(LE)可以从各区域的颗粒计数直接计算：
Figure BPA0000231420280000111
公式4：从区域R1-3中的细胞计数计算裂解效率LE.
蛋白E的蛋白印迹检测
通过使用XCell IITMBlot Module(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)湿印迹法完成蛋白至预制胶的转移.蛋白转移通过用PonceauS染色验证.使用
Figure BPA0000231420280000112
(Roth，Karlsruhe，Germany)工作液在室温下进行封闭1小时.
抗体和开发：膜用TBST缓冲液洗涤5分钟，然后以初级抗体在室温下孵育2小时.孵育后膜在TBST中洗涤4×5分钟.然后施以第二抗体(HRP偶联)1小时，并将膜在TBST中洗涤4×5分钟.膜与5毫升的SuperSignal West Pico Chemiluminescent Subs trate(ThermoFisher Scientific，Rockford，MA，USA)孵育3分钟.所有步骤在搅拌下进行.使用软件QuantityOne(Bio-Rad，Hempstead，UK)以ChemiDocTMXRS(Bio-Rad，Hempstead，UK)进行检测。
实施例2：过程监测和控制的射频阻抗测量
射频阻抗测量(RFI)已经成为用于监测和控制哺乳动物、酵母和微生物过程的有价值过程分析工具(Carvell et al.，2006Cytotechnology，50(1-3)，35-48，Soley etal.，2005 J.Biotechnol.，118(4)，398-405，Yardiey et al.，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.17，3-35)。RFI的(生物)物理背景在Asami et al.，2002Journal of Non-Crystalline Solids，305(1-3)，268-277，Davey et al.，1993Analytica Chimica Acta，279，155-161中回顾.
基于RFI的对细胞培养过程的控制策略包括活细胞特定灌注速度的反馈控制，代谢活性的估算和哺乳动物细胞培养中谷氨酰胺补料速率的控制.此外，使用RFI以计算细胞培养过程中特定热流量速率，其可以被用作可能的控制变量.对于微生物系统，RFI的应用通常专注于在线监测存活生物量。RFI作为大肠杆菌中生产异源蛋白控制策略中存活细胞浓度代表性测量的成功整合在Kaiser et al.，2008 Eng.Life Sci.，8(2)，132-138中报道.此外，基于RFI所获生理信息的过程控制应用在Matanguihan et al.，1994Bioprocess.Eng.，11(6)，213-222提出.
实施例3：生物量的第一原理软传感
术语“软传感器”或“软件传感器”指的是使用合适的过程模型从容易访问的过程数据计算不能或难以访问的过程变量的数学软件.关于软传感器对生物过程应用的性能的综述由Assis et al.，2000 Chemical Engineering，24(2-7)，1099-1103给出.生物量干细胞重量浓度(作为催化剂或产品)可以被认为是生物过程控制和监测方法的基础关键变量.因此，该过程变量的实时访问有极大的重要性.可以应用不同测量原理软传感器后的临近不同硬型传感器来使该变量可以实时访问.用于生物量估算的软传感器大致可以分为需要训练数据集的软传感器，例如基于人工神经网络的，和第一原理软传感器，例如基于元素平衡的.如Sagmeister et al.，2013 Chemical Engineering Science，96，190-198和Wechselberger et al，2012 Engineer ing，36(9)，1205-1218描述的，按照累积元素平衡法用于生物量估算第一原理软传感器已经被包含在新开发的动态生物过程控制PAT策略中，累积元素平衡法涉及包括碳(C-)和还原度(DoR-)平衡的冗余方程系统.
实施例4：通过温度刺激诱导基因E的表达
现有知识中对单一细胞有效诱导E基因后一分钟内E-裂解是必然的，并且每个细胞成功E-裂解需要少于1000个分子的E蛋白，基于此提出通过42℃10分钟的短温度刺激来完成断开。使用EcN(pGLysivb)，通过有特定底物摄取速率qs＝0.6g/gh(即μ＝0.3h-1)的指数补料分批的生物质X＝40g/l DCW积累之后，温度刺激(42℃10分钟)用于诱导基因E表达.如所预期的，按RFI测量反应的(绿线，图2)，在此10分钟的时间段内没有观察到E-裂解开始的即时迹象.接着，将温度降低到27.5℃.随后2小时过程中观察到的相对介电常数与细胞存活率的同时降低(FCM数据，实心球，图2)。由于存活率降低伴随着相称的BGs出现(FCM数据，空心球，图2)，可以证明介电常数信号确实反映了E裂解的实际进展.在E-裂解阶段没有观察到起泡.
仅使用短温度刺激的过程获得了85％的最终裂解效率.
实施例5：断开E-裂解过程联系示例
断开E-裂解过程联系在2l规模用EcC41(pGLysivb)展示，如图3(A)所示.生物质在有特定底物摄取速率qs＝0.6g/gh(μ＝0.3h-1)的指数补料分批中积累.接着，通过减少补料速率将特定底物摄取速率降低到0.1g/gh.随qs降低，温度升高至42℃来表达E基因。由于E表达期期间存活率只轻微降低(实心球，图3(A))，FCM测量证实种群没有立刻受到E裂解的影响.E基因表达1小时后将温度降至温度诱导启动子紧密关闭且E基因不再表达的27.5℃.同时，特定底物摄取速率移回qs＝0.6g/gh.随qs上调，按FCM检测的E裂解效率提高到76％(空心球，图3(A)).
用菌株EcC41(如图所示)以及EcN(数据未显示)成功地进行了所描述的方法.整体而言可以得出结论，特定底物摄取速率qs(细胞特定代谢活性的度量)对细胞裂解能力有力地有强影响.可以通过降低特定底物摄取速率的方式将过程保持在非裂解能力生理状态，尽管蛋白E存在(通过Western印迹分析在菌团中发现蛋白E，数据未显示).接着，可以通过改变qs触发E裂解，这意味着通过qs对生理状态的影响是可逆的.这些发现为提出的断开过程联系模式夯实基础.
确定触发E-裂解需要的最小qs值
EcC41(pGLysivb)在20l规模指数补料分批(qs＝0.6g/gh，T＝35℃)中生长至X＝30g/l的生物量浓度.基因E的表达通过温度转变为42℃来诱导，同时为了防止有效的E裂解，qs减至0.1g/gh。RFI信号在E-表达阶段保持不变，表明E-裂解成功(绿线，图3(B)).E-表达1小时后，将温度降低至27.5℃，并开启软传感器辅助的qs-控制器.特定底物摄取速率在2小时的时间段内逐渐增加.进入E裂解阶段大约1小时时，指示E-裂解开始的RFI信号骤降(垂直箭头，图3(B)).因此，我们已发现，qs是E裂解的唯一触发器(其中qs，min是温度的函数，数据未显示)，并且在27.5℃裂解开始的阈值是qs，min＝0.4g/gh；如图3(B)中水平箭头所示.这些数据显示了通过qs方式断开E表达和E裂解联系的可行性.
实施例6：在裂解阶段特异性底物摄取速率的控制
由于特定底物摄取速率qs可以被认为是所述有断开E表达和E裂解联系的BG生产的主要关键工艺参数(CPP)，为了优化目的开发了基于qs的控制策略。
如从FCM获得的，发现相对介电常数信号与E裂解阶段活细胞数量的减少相关(参见实施例4).在E裂解期间细菌丢失了其膜电位，可以假定RFI信号精确地反映了群体中剩余的存活细胞部分，如Yardley et al.，2000 Biotechnol.Genet.Eng.Rev.17，3-35中回顾的。由于该信号是高及时解析实时可得的，选择其以发展有在高度动态的E-裂解过程期间保持恒定底物摄取速率目的的基于qs的控制策略.
类比公式4，在任何给定的时间特定底物摄取速率qs.sp的进料速率设置点可以如公式5给出的计算.
Figure BPA0000231420280000141
公式5：计算作为不同时间所需特定底物摄取速率qs.sp函数的补料速率设置点
存活生物量X(t)和肉汤体积V(t)的当前值因此是未知的.肉汤体积可以使用初始反应器体积，和已知的补料，碱和气体的通量以及排出的O2和CO2气体浓度实时计算.E-裂解阶段的存活生物量浓度可以从RFI信号来计算.补料分批期间存活生物量的浓度通过第一原理软传感器估算，而补料分批末期存活生物量X和相对介电常数Δε间的线性关系根据公式6在线建立.
Figure BPA0000231420280000142
公式6：计算作为介电常数Δε函数的存活生物量浓度X(t).mε和bε为线性方程式相关常数.
由于E-裂解期间存活生物量浓度的变化是高度动态的，补料速度通过补料泵设定点直接控制.如为计算生物量描述的，补料速率F(t)和补料泵设定点Psp(t)之间的线性关联根据公式7在线完成。
PSP(t)＝mp×F(t)+bp
公式7：计算作为流量F(t)函数的进料泵设置点Psp(t).mp和bp是线性方程的相关常数.
追踪过程输入和所有所述计算(软传感，体积计算，补料速度设定点的计算，介电常数转化为生物量和补料速度设定点转化为泵设定点)通过PIMS完成.在E-裂解阶段开始之前，线性方程的相关常数短暂实施.图4显示E-裂解阶段期间用于控制qs的所述PAT-策略的示意图.该策略的成功实施和基于RFI的qs控制有关(见图5)。
实施例7：使用“修正步骤”增加E-裂解效率
为了推动E-裂解效率朝向所需的范围内，我们进行了“修正步骤”.基于该假设，低的总E-裂解效率可以被解释为在部分细菌群体基因E表达诱导不足，温度刺激是在E-裂解阶段末期施加.该温度刺激的施加不降低补料速率(如实施例4中所述)。
用EcC41(pGLysivb)的补料分批(35℃，qs＝0.3g/gh)可行性实验以201规模生物量积累36g/l进行.E表达阶段在42℃下，以qs(E-表达)＝0.1g/gh进行1小时。用T(E-裂解)＝35℃下，qs(E-裂解)＝1.0g/gh的上述策略(实施例6)控制E裂解阶段期间的补料.E裂解阶段2个小时后温度转变为42℃作为“修正步骤”实施.细胞存活率和E-裂解效率用FCM数据(图6)进行评估.
在E-裂解阶段的E裂解效率仅为60％，但是，一旦温度改变被实施，E-裂解效率就迅速上升至96％的最大值.与此实验中，我们能够证明使用断开E-表达和E-裂解阶段联系的原理，所需量级的E-裂解效率是可能的.由于起泡与qs-控制的断开E裂解联系概念和使用温度刺激的方法都无关，两者的结合，即断开E裂解联系与“修正步骤”，适合高密度细菌菌蜕生产方法。
结论
在升高的生物量密度(50g DCW/I)和升高的温度下，E蛋白介导的裂解伴随着过多的泡沫.因此，传统的涉及热诱导的λpR-c1857启动子系统的补料分批生产过程并不非常适合.
使用过程技术参数断开裂解基因表达和实际蛋白介导裂解联系是可行的.特定底物摄取速率(qs)被确定为控制细菌细胞裂解过程中的关键参数。
开发了通过特定底物速率(qs)断开裂解基因表达和细菌细胞的实际裂解联系的补料分批过程方法，以克服先前观察到的起泡问题.
相对介电常数信号(RFI)与活细胞数线性相关，这允许裂解过程的实时观察.
在RFI信号的基础上，实施策略来提供裂解阶段内特定底物摄取速率qs的控制。使用第一基本软传感器，相对介电常数和存活生物量之间的所需校准可以在线完成而不需更现有菌株特异性信息.
温度刺激(42℃)10分钟足以引发蛋白E介导的裂解，即使其后温度降低至20℃以避免起泡也具有约85％的E-裂解效率.
进行多变量研究尝试找出断开裂解基因表达/裂解过程联系的关键工艺参数，在裂解基因表达阶段发现了qs.允许将裂解基因表达与裂解过程联系断开的qs的最佳值被发现为0.1g/gh。
将qs控制的断开裂解联系和作为“修正步骤”的第二温度刺激(42℃)结合，在可行性实验中获得了96％的裂解效率，表明可以达到理想的产品规格参数，例如，高裂解效率。

Claims (29)

1.生产细菌菌蜕制品的方法，包括以下步骤：
(a)提供包含编码能够在细菌细胞被膜中形成隧道结构的蛋白的裂解基因的细菌细胞，其中所述裂解基因的表达在可调控的启动子的可操作控制之下，
(b)在其中所述裂解基因不被表达的条件下培养细菌细胞，至最终生物量浓度为10-80g干细胞重/L，其中干细胞重＝0.33×OD600，该步骤(b)包括在至少0.4g/gh的特定底物摄取速率qs下培养细菌细胞，其中qs以底物体积摄取速率rs和生物量浓度X的比率根据下列公式来确定：
Figure FDA0002554308270000011
其中特定底物摄取速率qs是以g/gh计的单位时间消耗底物量来表示，底物体积摄取速率rs是以g/lh计的单位时间消耗底物量来表示，生物量浓度X是以干细胞重g/l来表示；
(c)在步骤(b)后，使所述细菌细胞经受其中所述裂解基因通过诱导所述可调控的启动子被表达、但是所述细菌细胞的裂解被抑制的条件，且其中使所述细菌细胞处于至少基本上稳定的状态，在该步骤(c)中，特定底物摄取速率qs为0.1-0.3g/gh；
(d)在步骤(c)后，使所述细菌细胞经受其中发生所述细菌细胞的裂解的条件，并在之后进行进一步的启动子诱导步骤，和
(e)获得所得的细菌菌蜕。
2.根据权利要求1的方法，其中细菌细胞是革兰氏阴性细菌细胞。
3.根据权利要求2的方法，其中细菌细胞是大肠杆菌细胞。
4.根据权利要求1的方法，其中编码裂解蛋白的裂解基因是噬菌体ΦX174裂解基因E。
5.根据权利要求1的方法，其中在步骤(d)中所述启动子诱导步骤为化学或热启动子诱导步骤。
6.根据权利要求1的方法，其中可调控的启动子为化学可调控的启动子或热可调控的启动子，所述化学可调控的启动子是乳糖启动子或色氨酸启动子，所述热可调控的启动子是λc I857启动子。
7.根据权利要求1-6任一项的方法，其中细菌细胞的培养以补料分批培养方式进行。
8.根据权利要求1-6任一项的方法，其中细菌细胞的培养进行到最终生物量浓度为20-70g DCW/L培养基。
9.根据权利要求8的方法，其中细菌细胞的培养进行到最终生物量浓度为30-60g DCW/L培养基。
10.根据权利要求9的方法，其中细菌细胞的培养进行到最终生物量浓度为40-50gDCW/L培养基。
11.根据权利要求1-6任一项的方法，其中步骤(c)包括通过加入诱导化学化合物和/或通过调节温度到容许表达温度来诱导可调控的启动子。
12.根据权利要求1-6任一项的方法，其中在步骤(d)中，通过提供生长刺激来诱导细菌细胞的裂解。
13.根据权利要求12的方法，其中在步骤(d)中，通过提供营养物到培养基来诱导细菌细胞的裂解。
14.根据权利要求13的方法，其中在步骤(d)中，通过提供营养物到培养基中以得到至少0.4g/gh的底物摄取速率qs来诱导细菌细胞的裂解。
15.根据权利要求1-6任一项的方法，其中对残留的未裂解的细菌细胞进行灭活。
16.根据权利要求15的方法，其中所述残留的未裂解细菌细胞的灭活包括用能破坏残留的未裂解细菌细胞的化学失活剂来灭活，或者其中所述残留的未裂解细菌细胞的灭活包括共表达核酸酶。
17.根据权利要求16的方法，其中所述化学失活剂是β-丙内酯，所述核酸酶是S-核酸酶。
18.根据权利要求1-6任一项的方法，其中达到至少70％的E-裂解效率。
19.根据权利要求18的方法，其中达到至少80％的E-裂解效率。
20.根据权利要求19的方法，其中达到至少90％的E-裂解效率。
21.根据权利要求20的方法，其中达到至少96％的E-裂解效率。
22.根据权利要求1-6任一项的方法，其中至少在步骤(c)和步骤(d)期间监测所述培养基条件。
23.根据权利要求22的方法，其中通过射频阻抗测量来监测所述培养基条件。
24.重组生产目标蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)提供细菌细胞，所述细菌细胞包含(i)编码能够在细菌细胞被膜中形成隧道结构的蛋白的裂解基因，其中裂解基因的表达是受可调控的启动子的可操作控制，和(ii)编码目标蛋白的基因，
(b)在其中裂解基因不被表达的条件下培养所述细菌细胞，至最终生物量浓度为10-80g干细胞重/L，其中干细胞重＝0.33×OD600，该步骤(b)包括在至少0.4g/gh的特定底物摄取速率qs下培养细菌细胞，其中qs以底物体积摄取速率rs和生物量浓度X的比率根据下列公式来确定：
Figure FDA0002554308270000041
其中特定底物摄取速率qs是以g/gh计的单位时间消耗底物量来表示，底物体积摄取速率rs是以g/lh计的单位时间消耗底物量来表示，生物量浓度X是以干细胞重g/l来表示；
(c)在步骤(b)后，使所述细菌细胞经受其中所述裂解基因通过诱导所述可调控的启动子被表达、但所述细菌细胞的裂解被抑制的条件，且其中使所述细菌细胞处于至少基本上稳定的状态，在该步骤(c)中，特定底物摄取速率qs为0.1-0.3g/gh；
(d)在步骤(c)后，使所述细菌细胞经受其中发生所述细菌细胞的裂解的条件，并在之后进行进一步的启动子诱导步骤，和
(e)回收步骤(b)和/或步骤(c)中已被表达的目标蛋白。
25.根据权利要求24的方法，其中在步骤(d)中所述启动子诱导步骤为化学或热启动子诱导步骤。
26.根据权利要求24的方法，进一步包括纯化步骤(b)和/或步骤(c)中已被表达的目标蛋白。
27.重组生产噬菌体ΦX174蛋白E或其衍生物的方法，包括以下步骤：
(a)提供包含编码裂解蛋白E或其衍生物的裂解基因的细菌细胞，其中裂解基因的表达在可调控的启动子的可操作控制之下，
(b)在其中所述裂解基因不被表达的条件下培养所述细菌细胞，至最终生物量浓度为10-80g干细胞重/L，其中干细胞重＝0.33×OD600，该步骤(b)包括在至少0.4g/gh的特定底物摄取速率qs下培养细菌细胞，其中qs以底物体积摄取速率rs和生物量浓度X的比率根据下列公式来确定：
Figure FDA0002554308270000051
其中特定底物摄取速率qs是以g/gh计的单位时间消耗底物量来表示，底物体积摄取速率rs是以g/lh计的单位时间消耗底物量来表示，生物量浓度X是以干细胞重g/l来表示；
(c)在步骤(b)后，使所述细菌细胞经受其中所述裂解基因通过诱导所述可调控的启动子被表达、但所述细菌细胞的裂解被抑制的稳定状态的条件，在该步骤(c)中，特定底物摄取速率qs为0.1-0.3g/gh；
(d)在步骤(c)后，使所述细菌细胞经受其中发生所述细菌细胞的裂解的条件，并在之后进行进一步的启动子诱导步骤，和
(e)回收所述蛋白E或其衍生物。
28.根据权利要求27的方法，其中在步骤(d)中所述启动子诱导步骤为化学或热启动子诱导步骤。
29.根据权利要求27的方法，进一步包括纯化步骤(b)和/或步骤(c)中已被表达的目标蛋白。
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