CN101182536A - 广宿主打孔质粒载体、其构建方法及在制备菌蜕中应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种广宿主打孔质粒载体pBBR－E及其构建方法，本发明还公开了该广宿主打孔质粒载体pBBR－E在制备支气管败血波氏杆菌菌蜕中的用途，属于基因工程领域。本发明广宿主打孔质粒载体pBBR－E由温敏调控基因cI857、噬菌体溶菌基因E和广宿主质粒pBBR4－MCS组成。本发明构建的打孔质粒载体pBBR－E是基于广宿主范围的质粒载体pBBR4－MCS的基础上构建而成，可以在大多数革兰氏阴性菌中复制并高效表达溶菌基因E，在制备气管败血波氏杆菌Ghost菌蜕时裂解效率较高，可高达99.9997％，比现有技术高出了约4个数量级。
Description
技术领域
本发明涉及一种质粒载体，尤其涉及一种广宿主打孔质粒载体及其构建方法，本发明还涉及广宿主打孔质粒载体在制备支气管败血波氏杆菌菌蜕中的用途，属于基因工程领域。
背景技术
“Bacterial Ghost”(细菌菌蜕)是一种没有细胞浆和核酸的空细菌体。将PhiX174噬菌体E裂解基因在细菌中表达，该基因编码蛋白在细菌细胞膜和胞壁上可形成穿膜隧道，在渗透压的作用下使菌体破裂，细菌胞内细胞浆和核酸成分通过此隧道被排出，形成一种空的细菌外壳，即为“Bacterial Ghost”。bacterial ghost是由内膜(cytoplasmic membrane)，胞浆间隙(periplasmic space)和外膜(outer membrane)组成，因此细胞壁在很大程度上被完整保存下来。在有些菌株的外膜上还有一层S-layer，也成为bacterial ghost的成分之一。Bacterial Ghost本身可作为一种很好的疫苗，因为这种形式保留了和活菌一样的细菌胞膜结构和相关抗原蛋白，而外膜含有天然的免疫细胞通过模式识别受体识别的高度保守结构PAMP(pathogen-associatedmolecular patterns)，例如脂多糖，肽聚糖，CPG，OmpA，菌毛等，能有效地被DC和巨噬细胞所吞噬。目前，ghost通过静脉、皮下、气体等途径免疫已经在小鼠、兔子、猪等动物模型中取得了良好的免疫保护效果。用A.pleuropneumoniae ghosts气体免疫接种猪，诱导了针对A.pleuropneumoniae引起的胸膜肺炎的完全保护。霍乱菌ghost(VCG)经皮下注射小鼠诱导血清产生高水平的抗霍乱特异性IgG抗体。同时显示，针对VCG的抗体足以保护新生小鼠免遭霍乱弧菌的感染。另外，Bacterial Ghost还可以用作一种极好的递送系统，通过在细菌裂解之前对细菌进行外膜的人工改造，将外来抗原，核酸或药物等其它成分锚定于胞膜的内、外侧，或充于胞浆周质。这样制备的重组ghost拥有完好的，天然的细菌外膜结构，能同时激发体液和细胞免疫应答。其菌毛等表面黏附结构，又使之能靶向黏附在特异性的组织，如胃肠道和呼吸道的黏膜表面，进而较易被机体吞噬细胞，如PP结(Peyer’s Patches)的M细胞所识别捕获，故而可有效递送疫苗抗原至黏膜表面和诱发相关黏膜免疫应答。Eko等人将沙眼衣原体(C.trachomatis)抗原在霍乱菌的内膜表达，然后裂解制备的重组ghost(VCG)有效地激发了生殖道黏膜的Th1型免疫应答，现在正在着手进入临床实验。与传统的原核系统表达蛋白相比，重组bacterial ghost有几大优势：(1)重组蛋白被整合在一个具有高度免疫原性的环境中；(2)对蛋白的大小要求范围宽泛，但蛋白的分子量最好在2000到200,000Da之间；(3)重组蛋白被直接表达后整合到细菌的膜上，裂解后就能直接用于免疫动物，而不必要象以前制备免疫原时要先分离纯化重组蛋白；(4)整合在细胞壁的重组蛋白是以天然的构象，所以保持了它原有的活性形式。而一般基因重组的蛋白通过原核系统大都以包涵体的形式表达，只能通过变性、复性的方法在一定程度上恢复蛋白活性。(5)ghost的制备相对简单，可用发酵技术获得，而不需进行复杂的纯化工作；可以冻干的形式贮存于室温。
溶解基因E的表达可在λpL/pR-cI857或在lacPO-lacIq启动阻遏系统的转录控制下完成。一些含有不同抗性标记、复制起始区和基因E表达控制的特异性溶解质粒已经被构建出来。λpR启动子和温敏阻遏物cI857在30℃以下能抑制基因E的表达，高于30℃会导致阻遏物cI857热灭活而诱导E基因表达。为了制备ghost，细菌须在28℃条件下生长到对数生长期，然后升温到42℃诱导其溶解。
E蛋白介导的溶解已经成功地应用于各种大肠杆菌菌株、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏杆菌、支气管败血博德特氏杆菌、幽门螺旋杆菌、霍乱弧菌、胸膜肺炎放线杆菌、流感嗜血杆菌、溶血巴氏杆菌、多杀巴氏杆菌、绿脓杆菌、恶臭假单胞菌等。范围如此之大说明了只要E溶解盒被引入到适当的载体中，E蛋白介导的溶解可能会在每个革兰氏阴性菌中发生。
目前，国外在制备革兰氏阴性菌的ghost菌蜕时使用的打孔质粒载体大多来源于目的菌株与大肠杆菌的穿梭质粒载体，在此基础上构建的打孔质粒载体一般只能用于制备目的菌株或亲缘关系较近菌种的ghost菌蜕，应用范围相对比较狭窄。
发明内容
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种应用范围相对比较宽的广宿主打孔质粒载体。
本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种广宿主打孔质粒载体pBBR-E，温敏调控基因cI857(SEQ ID NO.6)、噬菌体溶菌基因E(SEQ ID NO.5)和广宿主质粒pBBR4 MCS组成。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种构建上述广宿主打孔质粒载体pBBR-E的方法。
本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种构建广宿主打孔质粒载体pBBR-E的方法，包括：
以噬菌体PhiX174双链DNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物进行PCR扩增，得到溶菌基因E；将溶菌基因E纯化后用T4 DNA连接酶与经EcoRI和VamHI双酶切消化的pBV220载体相连接，得到打孔质粒载体pBV-E；以打孔质粒载体pBV-E为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物纯化后用BamH I和SacI双酶切，然后与同样双酶切的广宿主质粒pBBR4-MCS相连接，即得。
本发明所要解决的再一个技术问题是利用所构建的广宿主打孔质粒载体pBBR-E应用于制备支气管败血波氏杆菌菌蜕。
本发明所要解决的再一个技术问题是通过以下技术方案来实现的：
广宿主打孔质粒载体pBBR-E在制备支气管败血波氏杆菌菌蜕中的应用，包括：将广宿主打孔质粒载体pBBR E电击转化到支气管败血波氏杆菌I相菌“A50-4”菌株感受态细胞中；转化后涂布Amp+的改良鲍姜氏琼脂平板(10％脱纤绵羊血)，转化子通过菌落PCR进行鉴定；将含有广宿主打孔质粒载体pBBR-E的支气管败血波氏杆菌接种到改良鲍姜氏(50μg/mL氨苄青霉素)液体培养基中，28℃过夜震荡培养(220r/min)，然后转接于含50μg/mL氨苄青霉素的改良鲍姜氏液体培养基中，28℃震荡培养至OD600nm达0.5左右；取出100μl培养物备用，将剩余培养物迅速调高到42℃培养以诱导E基因表达，继续培养5-7小时；取诱导前后的培养物各100μl适当稀释后涂鲍姜氏琼脂平板进行活菌CFU检测；溶菌结束后形成的ghost菌蜕用PBS洗涤3次，冻干保存；
本发明打孔质粒载体pBBR-E是基于广宿主范围的质粒载体pBBR4-MCS的基础上构建而成，该打孔质粒载体可以在大多数革兰氏阴性菌中复制并表达溶菌基因E，从而制备相应菌株的ghost菌蜕。
本发明打孔质粒载体pBBR-E可应用于制备支气管败血波氏杆菌Ghost菌蜕，由于本发明打孔质粒载体pBBR E是基于广宿主范围的质粒载体pBBR4-MCS构建而成的，由于后者是来源于支气管败血波氏杆菌，所以在制备气管败血波氏杆菌Ghost菌蜕时裂解效率较高，可高达99.9997％，比国外高出了约4个数量级。
附图说明
图1本发明广宿主打孔质粒载体pBBR-E的构建示意图；
图2支气管败血波氏杆菌Ghost(菌蜕)的透射电镜观察结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验材料
支气管败血波氏杆菌I相菌“A50-4”菌株为本研究室自藏(该菌株也可从普通生物试剂公司购买得到)，噬菌体PhiX174购于Promega(北京)生物技术有限公司。质粒pBV220的构建过程可按照以下文献构建：张智清，姚立红，侯云德，含PrPl启动子的原核高效表达载体的组建及其应用，病毒学报，1990，6(2)，111-116。
广宿主质粒pBBR4-MCS可按照以下文献构建得到：Kovach ME et al.″pBBR1MCS：A broad-host-range cloning vector″，Biotechniques 16：800-802(1994)。
实施例1 广宿主打孔质粒载体pBBR-E的构建
1.1噬菌体PhiX174溶菌基因E的克隆
根据GenBank中噬菌体PhiX174溶菌基因E的编码序列设计引物：
Lysis E-U：5’-AGGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3’(SEQID NO.1)
Lysis E-L：5’-AGGGGATCCGAGCTCTCACTCCTTCCG-3’(SEQID NO.1)
上、下游引物5’端分别引入了限制性酶切位点EcoR I和BamHI，由上海生工合成。以噬菌体PhiX174双链DNA为模板扩增溶菌基因E：PCR扩增反应体系为50μL，其中MgSO42mM，上、下游引物各1μM，dNTP 200μM，10x Taq buffer，TaqTMDNA聚合酶2 U(TaKaRa)，模板DNA10ng。PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃30s，59℃30s，72℃30s，30个循环，72℃5min。PCR产物经凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收，然后用EcoR I和BamHI进行酶切，用胶回收试剂盒回收。
1.2打孔质粒载体pBV-E的构建
将纯化的溶菌基因E用T4 DNA连接酶(TaKaRa)与经EcoRI和BamHI双酶切消化的pBV220载体相连接，16℃过夜连接并热激转化入大肠杆菌TG1感受态细胞，经菌落PCR鉴定为阳性的克隆进行增菌并利用碱裂解法小量提取质粒，命名为pBV-E，对克隆的溶菌基因E进行测序鉴定。
1.3打孔质粒载体pBBR-E的构建
根据pBV220质粒载体上温敏调控基因cI857的序列设计引物cI-U，根据溶菌基因E的序列设计引物E-L，序列如下：
cI-U：5’-GGGGGGATCCTCAGCCAAACGTCTC-3’ (SEQ ID NO.3)
E-L：5’-ACTGTTGAGCTCTCACTCCTTCCGCA-3’ (SEQ ID NO.4)
上、下游引物5’端分别引入了限制性酶切位点BamHI和Sac I，由上海生工合成。以打孔质粒载体pBV-E为模板，cI-U和E-L为引物进行PCR扩增，所得PCR产物包括温敏调控基因cI857以及溶菌基因E，命名为cI+E。PCR扩增反应体系为50μL，其中MgSO4 2mM，上、下游引物各1μM，dNTP 200μM，10x Taq buffer，LA TaqTM DNA聚合酶2U(TaKaRa)，模板DNA10ng。PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃ 30s，59℃1min，72℃1.5min，30个循环，72℃10min。PCR产物cI+E纯化后用BamHI和Sac I双酶切，然后与同样双酶切的广宿主质粒pBBR4-MCS相连接，热激转化入大肠杆菌TG1感受态细胞，经菌落PCR鉴定为阳性的克隆进行增菌并利用碱裂解法小量提取质粒，命名为pBBR-E，对克隆的温敏调控基因cI857以及溶菌基因E进行测序鉴定。
实施例2 支气管败血波氏杆菌ghost的制备
将广宿主打孔质粒载体pBBR-E电击转化到支气管败血波氏杆菌I相菌“A50-4”菌株感受态细胞中，电击感受态的制备参照Sambrook等的方法(分子克隆实验指南)，电穿孔仪(Micro-pulser，Bio-Rad，USA)的电击参数为：12.5 kV/cm、200Q、25μf、5.0ms，转化后涂布Amp+的改良鲍姜氏琼脂平板(10％脱纤绵羊血)，转化子通过菌落PCR进行鉴定。将含有广宿主打孔质粒载体pBBR E的支气管败血波氏杆菌接种到改良鲍姜氏(50μg/mL氨苄青霉素)液体培养基中，28℃过夜震荡培养(220r/min)，然后转接1-2mL于50mL含50μg/mL氨苄青霉素的改良鲍姜氏液体培养基中，28℃震荡培养至OD600nm达0.5左右。取出100μl培养物备用，将剩余培养物迅速调高到42℃培养以诱导E基因表达，继续培养5-7小时。取诱导前后的培养物各100μl适当稀释后涂鲍姜氏琼脂平板进行活菌CFU检测。溶菌结束后形成的ghost菌蜕用PBS洗涤3次，冻干保存，并对冻干后的菌蜕进行活菌CFU检测。
检测结果：溶菌前后的培养物从2.6×109下降到6.8×103(CFU/ml)，溶菌灭活效率达99.9997％。
试验例1 支气管败血波氏杆菌Ghost(菌蜕)的透射电镜观察
将实施例2中42℃中诱导培养5-7小时的菌液4000g离心10min，以2.5％戌二醛固定细菌，置4℃下2h，0.01mol/L PBS洗涤3次，离心后经四氧化锇再固定、乙醇逐级脱水、包埋剂包埋等步骤处理后进行电镜观察。结果见图2。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>中国农业科学研究院哈尔滨兽医研究所
<120>广宿主打孔质粒载体、其构建方法及在制备菌蜕中应用
<130>P658
<160>6
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>phage E
<400>1
agggaattca tggtacgctg gactttgtgg 30
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>phage E
<400>2
aggggatccg agctctcact ccttccg 27
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>phage E
<400>3
ggggggatcc tcagccaaac gtctc 25
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>phage E
<400>4
actgttgagc tctcactcct tccgca 26
<210>5
<211>276
<212>DNA
<213>phage E
<400>5
atggtacgct ggactttgtg ggataccctc gctttcctgc tcctgttgag tttattgctg 60
ccgtcattgc ttattatgtt catcccgtca acattcaaac ggcctgtctc atcatggaag 120
gcgctgaatt tacggaaaac attattaatg gcgtcgagcg tccggttaaa gccgctgaat 180
tgttcgcgtt taccttgcgt gtacgcgcag gaaacactga cgttcttact gacgcagaag 240
aaaacgtgcg tcaaaaatta cgtgcggaag gagtga 276
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<212>DNA
<213>
<400>6
tcagccaaac gtctcttcag gccactgact agcgataact ttccccacaa cggaacaact 60
ctcattgcat gggatcattg ggtactgtgg gtttagtggt tgtaaaaaca cctgaccgct 120
atccctgatc agtttcttga aggtaaactc atcaccccca agtctggcta tgcagaaatc 180
acctggctca acagcctgct cagggtcaac gagaattaac attccgtcag gaaagcttgg 240
cttggagcct gttggtgcgg tcatggaatt accttcaacc tcaagccaga atgcagaatc 300
actggctttt ttggttgtgc ttacccatct ctccgcatca cctttggtaa aggttctaag 360
cttaggtgag aacatccctg cctgaacatg agaaaaaaca gggtactcat actcacttct 420
aagtgacggc tgcatactaa ccgcttcata catctcgtag atttctctgg cgattgaagg 480
gctaaattct tcaacgctaa ctttgagaat ttttgtaagc aatgcggcgt tataagcatt 540
taatgcattg atgccattaa ataaagcacc aacgcctgac tgccccatcc ccatcttgtc 600
tgcgacagat tcctgggata agccaagttc atttttcttt ttttcataaa ttgctttaag 660
gcgacgtgcg tcctcaagct gctcttgtgt taatggtttc ttttttgtgc tcatacgtta 720
aatctatcac cgcaagggat aaatatctaa caccgtgcgt gttgactatt ttacctctgg 780
cggtgataat ggttgcatgt actaaggagg ttgtatggaa caacgcataa ccctgaaaga 840
ttatgcaatg cgctttgggc aaaccaagac agctaaagat ctctcaccta ccaaacaatg 900
cccccctgca aaaaataaat tcatataaaa aacatacaga taaccatctg cggtgataaa 960
ttatctctgg cggtgttgac ataaatacca ctggcggtga tactgagcac atcagcagga 1020
cacactgacc accatgaagg tgacgctctt aaaaattaag ccctgaagaa gggcagcatt 1080
caaagcagaa ggctttgggg tgtgtgatac gaaacgaagc attggttaaa aattaaggag 1140
gaattc 1146
Claims (3)
1.一种广宿主打孔质粒载体pBBR-E，其特征在于：由温敏调控基因cI857、噬菌体溶菌基因E和广宿主质粒pBBR4-MCS组成。
2.一种构建权利要求1的广宿主打孔质粒载体pBBR-E的方法，包括：以噬菌体PhiX174双链DNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQID NO.2为引物进行PCR扩增，得到溶菌基因E；将溶菌基因E纯化后用T4 DNA连接酶与经EcoRI和BamH I双酶切消化的pBV220载体相连接，得到打孔质粒载体pBV-E；以打孔质粒载体pBV-E为模板，以SEQ ID NO.3和SEQID NO.4为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物纯化后用BamH I和SacI双酶切，然后与同样双酶切的广宿主质粒pBBR4-MCS相连接，即得。
3.权利要求1的广宿主打孔质粒载体pBBR-E在制备支气管败血波氏杆菌菌蜕中的应用，包括：将广宿主打孔质粒载体pBBR-E电击转化到支气管败血波氏杆菌I相菌“A50-4”菌株感受态细胞中；转化后涂布Amp+的改良鲍姜氏琼脂平板，转化子通过菌落PCR进行鉴定；将含有广宿主打孔质粒载体pBBR-E的支气管败血波氏杆菌接种到改良鲍姜氏液体培养基中，28℃过夜震荡培养，然后转接于含50μg/mL氨苄青霉素的改良鲍姜氏液体培养基中，28℃震荡培养至OD600nm达0.5左右；取出100μl培养物备用，将剩余培养物迅速调高到42℃培养以诱导E基因表达，继续培养5-7小时；取诱导前后的培养物各100μl适当稀释后涂鲍姜氏琼脂平板进行活菌CFU检测；溶菌结束后形成的ghost菌蜕用PBS洗涤3次，冻干保存。
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|---|---|---|---|---|
| CN101503686B (zh) * | 2009-03-02 | 2011-03-30 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 增强噬菌体溶菌基因打孔效率的dna序列及其应用 |
| CN106574230A (zh) * | 2014-02-21 | 2017-04-19 | 比得-C有限责任两合公司 | 细菌菌蜕的补料分批生产方法 |
-
2007
- 2007-11-26 CN CN 200710193752 patent/CN101182536A/zh active Pending
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20080521 |