CN112680393A - 一种能提高生产效率的无菌毛大肠杆菌的构建及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能提高生产效率的无菌毛大肠杆菌的构建及应用，属于基因工程和发酵工程领域。本发明敲除大肠杆菌基因组上菌毛基因簇的64个基因得到突变菌WQM026，该菌株在营养缺乏的培养基中生长变快，菌体总量增多。将PHB和L‑苏氨酸合成的相关基因分别转化到菌株WQM026中，得到的重组菌WQM026/pBHR68和WQM026/pFW01‑thrA*BC‑rhtC可以分别高效合成PHB和L‑苏氨酸。合成的PHB占细胞干重的87.87％，是野生型对照菌的3.44倍。L‑苏氨酸产量为2.49g/L，是野生型对照菌的3.66倍。

Description

一种能提高生产效率的无菌毛大肠杆菌的构建及应用
技术领域
本发明涉及一种能提高生产效率的无菌毛大肠杆菌的构建及应用，属于基因工程和发酵工程领域。
背景技术
细菌菌毛是出现在细胞上的大而长、薄的超分子蛋白质附属物，负责生物膜的形成、趋化、粘附和DNA跨膜转移。菌毛也是细菌生物膜的重要组成部分，对工业活动有多种不利影响，如增加产品变质或污染的风险、引起严重感染、形成休眠细胞以增加抗生素耐药性、消耗细菌的能量和底物，阻断营养物质扩散，形成生物污垢，减少传热，增加腐蚀，缩短发酵设备的使用寿命。
聚羟基烷酸盐(PHAs)是由多种羟基酰基辅酶a作为底物合成的，并作为不溶性球形包裹体或PHA颗粒保留在细胞内。一般认为，PHAs在降低碳当量和储存多余碳方面起着重要作用，这可以提高细胞在饥饿时的抗应力能力。PHAs具有生物降解性、生物相容性、气体阻隔性、压电性、非线性光学活性等由官能团引起的特殊性质。PHAs的性质决定了它可以用作生物降解塑料、组织工程支架和许多其他潜在的应用。聚3-羟基丁酸酯(PHB)是PHA中的一种，大肠杆菌常用于PHB的工业生产。L-苏氨酸是人体必需的营养氨基酸，是蛋白质合成的重要组成部分。广泛应用于人类食品、化妆品、医药、动物饲料和保健品。
大肠杆菌合成PHB和L-苏氨酸的关键在于平衡产物和细胞生长，既要使得细胞生长好，又要增强其合成途径的代谢流，并通过控制产物形成途径的表达水平来提高产量。现有报道中主要通过优化发酵条件、优化代谢途径、提高胞内辅酶浓度和优化表达质粒等手段来改善PHB的合成；L-苏氨酸的高效合成主要集中在代谢途径的修饰上，如脂肪酸阻断、磷酸转移酶系统、底物再分配等方面。而合成PHB和L-苏氨酸的底物乙酰辅酶A和草酰乙酸分别来自糖酵解途径和柠檬酸循环途径，若要高产PHB和L-苏氨酸会消耗大量的碳源，并严重影响菌体生长。这使得PHB产量的提高无法满足工业上生产的需求，L-苏氨酸发酵生长缓慢。因此，提供一种新的促进菌株生长并提高PHB和L-苏氨酸合成的方法，对于进一步提高PHB和L-苏氨酸的合成具有十分重大的意义。
发明内容
为了解决上述存在的技术问题，本发明在大肠杆菌中敲除大肠杆菌基因组上菌毛基因簇的64个基因得到突变菌WQM026，WQM026菌株在营养缺乏(M9)培养基中生长变快，菌体总量增多。随后将PHB和L-苏氨酸合成的相关基因分别转化到精简菌株WQM026中，得到的重组菌WQM026/pBHR68和WQM026/pFW01-thrA*BC-rhtC可以高效合成PHB和苏氨酸。
本发明的第一个目的提供一种促进大肠杆菌生长并提高发酵产品产量的方法，所述方法是敲除大肠杆菌基因组上菌毛基因簇；所述菌毛基因簇为：yagV-Z，gltF-yhcF，fimA-H，sfmA-F，ycbQ-F，ydeQ-T，yraH-K，yadC-N，yehA-D，ybgO-D，yfcO-V和/或ygiL-I。
在一种实施方式中，所述菌毛基因簇含有64个基因，依次为yagV，yagW，yagX，yagY，yagZ，gltF，yhcA，yhcD，yhcE，yhcF，fimA，fimI，fimC，fimD，fimF，fimG，fimH，sfmA，sfmC，sfmD，sfmH，sfmF，ycbQ，ycbR，ycbS，ycbT，ycbU，ycbV，ycbF，ydeQ，ydeR，ydeS，ydeT，yraH，yraI，yraJ，yraK，yadC，yadK，yadL，yadM，htrE，yadV，yadN，yehA，yehB，yehC，yehD，ybgO，ybgP，ybgQ，ybgD，yfcO，yfcP，yfcQ，yfcR，yfcS，yfcT，yfcU，yfcV，ygiL，yqiG，yqiH，yqiI；其序列的NCBI登录号依次为946631，947349，947606，948806，948759，947746，947741，947738，4056032，947735，948838，948841，948843，948844，948845，948846，948847，945522，945367，945160，945407，944977，948306，946773，946934，947185，945561，945562，945559，946050，946049，946047，946042，947658，947657，947656，947654，944837，944835，944829，944828，944819，944859，944841，946642，946617，946621，946619，947550，945110，946537，945325，946620，946788，946779，946818，946418，1450268，1450268，949109，947522，947529，947531，947535。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌MG1655。
本发明的第二个目的是提供应用上述任一方法构建获得的重组大肠杆菌。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还含有质粒pBHR68或质粒pFW01-thrA*BC-rhtC。
本发明的第三个目的是所述重组大肠杆菌在不利环境中的应用。
在一种实施方式中，所述不利环境是缺乏氨基酸的M9培养基，培养基组成包括：葡萄糖4g/L，Na2HPO4·12H2O 17.1g/L，KH2PO44 g/L，NH4Cl 3g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO40.24 g/L和CaCl20.011 g/L。
本发明的第四个目的是提供所述重组大肠杆菌在缺乏氨基酸的条件下合成代谢产物的应用。
在一种实施方式中，所述含有质粒pBHR68的重组大肠杆菌在缺乏氨基酸的条件下生产PHB。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌生产PHB的方法是：菌株在LB平板上活化培养10-15h，接种到培养基中，置于35-38℃，150-250rpm条件下培养5-10h得到种子液，5％(v/v)接种量接种于发酵培养基，置于35-38℃，150-250rpm条件下培养40-50h。
在一种实施方式中，所述生产PHB的发酵培养基，其组成包括：葡萄糖15-20g/L，Na2HPO4·12H2O 15-20g/L，KH2PO41-8 g/L，NH4Cl 1-8g/L，NaCl 0.2-0.8g/L，MgSO40.1-0.5g/L和CaCl20.01-0.05g/L。
在一种实施方式中，所述含有质粒pFW01-thrA*BC-rhtC的重组大肠杆菌在缺乏氨基酸的条件下生产L-苏氨酸。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌生产L-苏氨酸的方法是：菌株在LB平板上活化培养10-15h，接种到培养基中，置于35-38℃，150-250rpm条件下培养5-10h得到种子液，10％(v/v)接种量接种于发酵培养基，置于35-38℃，150-250rpm条件下培养30-40h。
在一种实施方式中，所述生产L-苏氨酸的发酵培养基，其组成包括：酵母粉1-5g/L，柠檬酸1-5g/L，(NH4)2SO420-30 g/L，KH2PO45-10 g/L，葡萄糖25-35g/L，MgSO4·7H2O 1-5g/L，FeSO4·7H2O 2-8mg/L，MnSO4·4H2O 2-8mg/L和CaCO315-25 g/L。
本发明还提供所述促进大肠杆菌生长及有效提高发酵产品产量的方法或所述重组大肠杆菌在药物制备、材料或环保领域的应用。
有益效果
本发明在大肠杆菌中敲除大肠杆菌基因组上菌毛基因簇的64个基因得到突变菌WQM026，WQM026菌株在营养缺乏(M9)培养基中生长变快，菌体总量增多。随后将PHB和L-苏氨酸合成的相关基因分别转化到精简菌株WQM026中，得到的重组菌WQM026/pBHR68和WQM026/pFW01-thrA*BC-rhtC可以分别高效合成PHB和L-苏氨酸。合成的PHB占细胞干重的87.87％，是野生型对照菌MG1655/pBHR68的3.44倍。L-苏氨酸产量为2.49g/L，是MG1655/pFW01-thrA*BC-rhtC的3.66倍。
附图说明
图1：菌毛合成和组装基因簇。
图2：敲除每个菌毛基因簇促进在LB和M9培养基中的生长曲线。
图3：单独敲除菌毛基因簇的PHB合成菌株在M9G培养基中合成PHB镜检。
图4：单独敲除菌毛基因簇的PHB合成菌株在LBG培养基中合成PHB镜检。
图5：菌毛缺失大肠杆菌突变株WQM026的特性分析。
图6：WQM026生产PHB和L-苏氨酸的应用。
具体实施方式
(1)基因的敲除方法
采用CRISPR/Cas9敲除系统对大肠杆菌进行“无痕”基因敲除。首先向大肠杆菌(Escherichia coli str.K-12substr.MG1655)中电转入pCas，通过L-阿拉伯糖诱导，使重组酶Gam、Bet和Exo表达。然后将同源臂片段和含有特定N20序列的pTargetF质粒同时电转入MG1655/Cas9感受态细胞。涂布于卡那霉素和壮观霉素双抗性平板，30℃培养18h后，菌落PCR筛选突变菌株。
获得突变菌株后，向培养基中添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导pCas转录形成sgRNA-pMB1，结合Cas9对pTargetF的pMB1复制子进行切割破坏，去除pTargetF。而含有pCas的菌株可直接进行下一轮的敲除，将含有pCas的菌株于42℃下过夜培养，去除温敏质粒pCas。
(2)PHB产量测定方法
将发酵液在4℃，4000rpm/min下离心20min，弃去上清后，冷冻菌体，并冷冻干燥。称取一定量冷冻干燥菌体进行甲酯化，采用已报道的常规甲酯化方法进行甲酯化，最后进行常规气相色谱定量。
(3)细胞显微观察
为了观察细胞形态，大肠杆菌细胞在固体LB板上生长12h，并用透射电子显微镜(TEM)成像。为了观察细胞内PHA颗粒，在PHA发酵生产24h后，用1％结晶紫制备细菌悬浮液，并用油浸透镜(放大倍数＝100×)在明亮视野显微镜下观察。同时，将大肠杆菌细胞以4000rpm/min的速度离心5min，用磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)洗涤两次，用2.5％戊二醛溶液固定至少72h。用G2 spirit透射电子显微镜在100千伏电压下使用Gatan US40004kx4k CCD获得图像。
(4)PHA的提取、定性和定量分析。
离心收集携带pBHR68的大肠杆菌细胞5mL，采用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤两次，离心收集后，将细胞转移到预先准确称重的离心管中，包上保鲜膜，并扎出多个小洞，使得水分可以蒸干，又避免菌液喷出，在真空冷冻干燥机中冻干48h至完全干燥，一般触摸管底为常温状态，表明已经完全干透，或者用手指轻弹管底，菌体可以散开并轻易脱离管壁，则视为菌体完全干燥。称重量，计算出干重。
称取1-10mg完全干燥的干菌体，同时称取PHB标准样品约10mg转移至预先准确称重的酯化管中，以便准确计算称得的样品重量。然后进行酯化操作，加入2mL甲醇(含有3％硫酸)和2mL氯仿，加上酯化管盖子并盖紧，期间通过超声将样品散开使得酯化更彻底，沸水浴6h以上。大约0.5h后，即可观察到PHB标样一般以粉末形式迅速溶解。若未观察到0.5h后标准品的形态变化与溶解，则应更换整套试剂，甲醇和氯仿的变质都会导致酯化无法正常进行，而更换新开封的试剂往往可以解决上述问题，经过6h沸水浴后，在通风橱中冷却充分后，小心打开酯化管并加入1mL去离子水，这时需要分别将盖子旋紧并激烈震荡至体系完全充分混匀，此时将酯化管置于通风处中静置3h以上以分相，分相后，上层为水相，下层为有机相，取适量有机相加入到气相样品瓶中，盖紧盖子保持密封，保存在-80℃中。
气相色谱是定量PHB含量的准确灵敏的手段。采用Scion-SQ-456-GC模块，配备DB-5MS熔融石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，对提取物进行分析，以确定其PHA组成和准确含量。气相色谱用70ev的电离能获得了正电子电离(EI)，并用扫描间隔为0.5s的m/z50到m/z650的离子对质谱进行了编程。PHA产生量(wt％)以干细胞重量百分比(DCW)表示。气相定量采用岛津GC 2010气相色谱，使用安捷伦DB WAX 30m-0.32mm气相色谱柱和火焰离子化检测器，进样温度为250℃。以不同量的商业化PHB作为标样绘制各标准样品的标准曲线。
(5)ATP和乙酰辅酶A的提取与测定
大肠杆菌细胞在M9培养基中培养至对数生长早期或中期(OD600＝0.8-1.0)，用ATP和乙酰辅酶A测定试剂盒收集细胞内ATP和乙酰辅酶A水平。根据ATP检测试剂盒说明书进行细胞内ATP的提取和定量，用agilent1260系列HPLC系统进行ATP分析，分析柱为250mm×4.0mm ODS-2HYPERSIL C18色谱柱。
(6)MG1655和WQM026的转录组分析
将大肠杆菌MG1655和WQM026在M9培养基中培养至指数中期，在12000rpm下收获3min，用PBS缓冲液洗涤两次，在液氮中快速冷冻。RNA文库的提取、构建和测序由GENEWIZ生物技术公司执行。以MG1655基因组为参考序列，进行序列读取、比对和分析。通过FIESTAViewer v.1.0软件，根据它们的表达水平和P值≤0.05计算差异基因表达。
(7)L-苏氨酸浓度分析：
Agilent 1200或1260系列高效液相色谱系统，配备Thermo 250mm×4.0mm ODS-2HYPERSIL C18色谱柱，用于检测L-苏氨酸浓度。L-苏氨酸浓度采用邻苯二甲醛柱前衍生法(Koros,A.,Varga,Z.,Molnar-Perl,I.2008.Simultaneous analysis ofamino acids andamines as their o-phthalaldehyde-ethanethiol-9-fluorenylmethyl chloroformatederivatives in cheese by high-performance liquid chromatography.JChromatogrA,1203(2),146-52.)进行定量检测。
(8)培养基：
LB培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10和NaCl 10。
M9培养基(g/L)：葡萄糖4，Na2HPO4·12H2O 17.1，KH2PO44，NH4Cl 3，NaCl 0.5，MgSO40.24和CaCl20.011。
LBG培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨10和NaCl 10。
M9G培养基(g/L)：葡萄糖20，Na2HPO4·12H2O 17.1，KH2PO44，NH4Cl 3，NaCl0.5，MgSO40.24和CaCl20.011。
PHB发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，Na2HPO4·12H2O 17.1，KH2PO44，NH4Cl 3，NaCl0.5，MgSO40.24和CaCl20.011。
L-苏氨酸发酵培养基(g/L)：酵母粉2，柠檬酸2，(NH4)2SO425，KH2PO47.46，葡萄糖30，MgSO4·7H2O 2，FeSO4·7H2O 0.005，MnSO4·4H2O 0.005和CaCO320。
实施例1菌毛缺失工程菌构建
菌毛缺失工程菌具体构建过程如下：
(1)MG1655/pCas感受态细胞细胞制备：
接种带有Red重组辅助质粒pCas9(Jiang,Y.,Chen,B.,Duan,C.,Sun,B.,Yang,J.,Yang,S.2015.Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9 system.Appl EnvironMicrobiol,81(7),2506-14.)的大肠杆菌MG1655，于含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，30℃，200rpm过夜培养。按2％接种量转接100mL LB液体培养基，30℃，200rpm培养至OD600＝0.2时加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导重组酶的表达，继续培养至OD600＝0.5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50mL离心管中，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的10％甘油洗涤3次，最后用1mL 10％甘油悬浮，每管80μL分装至预冷的无菌EP管中备用。
(2)pTargetF质粒构建：
pTargetF系列质粒的构建引物列于表2。质粒pTargetF01由pTargetF作为模板，利用引物F-sgRNA-yagV-Z和R-sgRNA，使用测序引物T-yagV-Z-F和T-sgRNA-R证实质粒的正确性。其他质粒pTargetF02、pTargetF03、pTargetF04、pTargetF05、pTargetF06、pTargetF07、pTargetF08、pTargetF09、pTargetF10、pTargetF11、pTargetF12、pTargetF27、pTargetF28、pTargetF29和pTargetF30采用相同的方法构建(Jiang,Y.,Chen,B.,Duan,C.,Sun,B.,Yang,J.,Yang,S.2015.Multigene editing in the Escherichia coli genome via theCRISPR-Cas9 system.Appl EnvironMicrobiol,81(7),2506-14.)，并使用相应的引物。
(3)CRISPR-Cas9构建突变株：大肠杆菌MG1655基因组中共有12个菌毛合成和组装基因簇yagVWXYZ，gltFyhcADEF，fimAICDFGH，sfmACDHF，ycbQRSTUVF，ydeQRST，yraHIJK，yadCKLMhtrEecpDyadN，yehABCD，ybgOPQD和yfcOPQRSTUV，这12个菌毛合成和组装基因簇又分为64个基因，分别为yagV，yagW，yagX，yagY，yagZ，gltF，yhcA，yhcD，yhcE，yhcF，fimA，fimI，fimC，fimD，fimF，fimG，fimH，sfmA，sfmC，sfmD，sfmH，sfmF，ycbQ，ycbR，ycbS，ycbT，ycbU，ycbV，ycbF，ydeQ，ydeR，ydeS，ydeT，yraH，yraI，yraJ，yraK，yadC，yadK，yadL，yadM，htrE，yadV，yadN，yehA，yehB，yehC，yehD，ybgO，ybgP，ybgQ，ybgD，yfcO，yfcP，yfcQ，yfcR，yfcS，yfcT，yfcU，yfcV，ygiL，yqiG，yqiH，yqiI，其序列的NCBI登录号依次为946631，947349，947606，948806，948759，947746，947741，947738，4056032，947735，948838，948841，948843，948844，948845，948846，948847，945522，945367，945160，945407，944977，948306，946773，946934，947185，945561，945562，945559，946050，946049，946047，946042，947658，947657，947656，947654，944837，944835，944829，944828，944819，944859，944841，946642，946617，946621，946619，947550，945110，946537，945325，946620，946788，946779，946818，946418，1450268，1450268，949109，947522，947529，947531，947535。
用CRISPR-Cas9方法，分别从大肠杆菌MG1655基因组中敲除12个菌毛合成和组装基因簇yagVWXYZ，gltFyhcADEF，fimAICDFGH，sfmACDHF，ycbQRSTUVF，ydeQRST，yraHIJK，yadCKLMhtrEecpDyadN，yehABCD，ybgOPQD和yfcOPQRSTUV，构建了相应突变株WQM001，WQM002，WQM003，WQM004，WQM005，WQM006，WQM007，WQM008，WQM009，WQM010，WQM011和WQM012。例如，WQM001是从基因组中敲除yagVWXYZ基因簇。上游和下游同源臂用引物对F1-yagV-Z/R1-yagV-Z和F2-yagV-Z/R2-yagV-Z扩增，这两个PCR产物用胶回收试剂盒回收，并用引物对F1-yagV-Z/R2-yagV-Z进行重叠PCR，得到重叠同源臂。纯化后的重叠同源臂(400ng)和pTargetF01(100ng)混合后，电转入80μLMG1655/pCas感受态细胞中。电转后细胞在30℃下复苏45min，接着涂布于含有50μg/mL壮观霉素和卡那霉素的双抗性平板。在30℃下培养36h后，用引物F1-yagV-Z/R2-yagV-Z进行菌落PCR并挑选出目的菌株。接着将突变株接入含有IPTG(终浓度为0.5mmol/L)的LB培养基中过夜培养，去除pTargetF01质粒。pCas质粒含有温敏复制子，在42℃下培养24h去除pCas质粒。不含pTargetF01和pCas质粒的菌株用于后续研究。其他11个突变株WQM002，WQM003，WQM004，WQM005，WQM006，WQM007，WQM008，WQM009，WQM010，WQM011，WQM012采用相同方法构建。WQM026是采用此方法逐个敲除所有12个菌毛操纵子构建的。本部分涉及的菌株、质粒和引物如表1和2所示。
表1菌株和质粒表
Figure BDA0002899854410000071
Figure BDA0002899854410000081
Figure BDA0002899854410000091
表2引物序列表
Figure BDA0002899854410000101
Figure BDA0002899854410000111
Figure BDA0002899854410000121
实施例2敲除单个菌毛基因簇促进生长和PHB合成
大肠杆菌含有12个合成和组装菌毛的基因簇(图1)。菌毛不仅能增加细菌的致病性，而且在其合成和组装过程中消耗了大量的能量和碳源。因此，从理论上讲，去除这些菌毛可以提高大肠杆菌的生物安全性和生产效率。
从大肠杆菌MG1655的染色体上分别去除了12个菌毛合成和组装基因簇，得到的菌株WQM001、WQM002、WQM003、WQM004、WQM005、WQM006、WQM007、WQM008、WQM009、WQM010、WQM011和WQM012。这些菌株分别在LB和M9培养基中培养。每隔2h检测菌液OD值并绘制得到菌株的生长曲线，如图2所示：在LB培养基中，所有12株突变株的生长曲线与对照株MG1655相似，表明去除大肠杆菌中12个菌毛合成和组装基因簇中的任何一个都不会影响或会略微改善细胞生长；在M9培养基中，12株突变株的生长状况均好于对照株MG1655。菌毛的生物合成和组装需要消耗大量的氨基酸，在M9培养基中不含有任何氨基酸，在M9培养基中生长的大肠杆菌细胞必须自身合成所有20种氨基酸才能合成蛋白质。因此，减少菌毛合成和组装使突变体中保存的氨基酸可用于促进细胞生长。这表明，去除大肠杆菌中的菌毛有利于细胞生长，特别是在营养缺乏的条件下。
为了检测菌毛突变体的生产效率，将空载体pBSK和含有PHA合成基因的pBHR68电转导入MG1655和12个突变菌株中，得到MG1655/pBSK、WQM001/pBSK、WQM002/pBSK、WQM003/pBSK、WQM004/pBSK、WQM005/pBSK、WQM006/pBSK、WQM007/pBSK、WQM008/pBSK、WQM009/pBSK、WQM010/pBSK、WQM011/pBSK、WQM010/pBSK、WQM011/pBSK和WQM012/pBSK；MG1655/pBHR68、WQM001/pBHR68、WQM002/pBHR68、WQM003/pBHR68、WQM004/pBHR68、WQM005/pBHR68、WQM006/pBHR68、WQM007/pBHR68、WQM008/pBHR68、WQM009/pBHR68、WQM010/pBHR68、WQM011/pBHR68、WQM010/pBHR68、WQM011/pBHR68和WQM012/pBHR68。这些重组菌株在M9G和LBG培养基中生长，在显微镜下观察细胞及其载体对照(图3和4)。
当在M9G培养基中生长时(图3)，所有13个空载菌株都显示出相似的大小，并且没有产生任何PHA。其中MG1655/pBHR68细胞体积略有增大，仅有少数细胞产生PHA。然而，含有PHA合成基因的pBHR68的12个突变菌株的细胞大小明显增大，几乎所有细胞都产生PHA(细胞内的白色颗粒)。
在LBG培养基中生长时(图4)，所有13个空载菌株大小相似，均未产生PHA。MG1655/pBHR68的大小与其对照相似，且不产生PHA。12个含有pBHR68的突变体细胞大小增大，产生PHA的程度小于M9G培养基中的相应菌株。这表明去除菌毛有利于大肠杆菌产生PHA。
实施例3 WQM026的形态与代谢物分析
实施例2结果可以看出，每一个菌毛合成和组装基因簇的去除都能促进大肠杆菌细胞的生长和PHA的生物合成，因此大肠杆菌MG1655染色体上的12个菌毛合成和组装基因簇全部被删除，从而构建菌毛缺陷菌株WQM026(构建方式见实施例1)。每隔2h检测菌液OD值并绘制得到菌株的生长曲线，如图5A所示：WQM026在LB培养基中的生长略好于MG1655，在M9培养基中的生长远好于MG1655，在培养至18h时WQM026的OD值约是MG1655的3倍。这表明去除大肠杆菌中的所有12个菌毛基因簇有利于细胞生长，特别是在缺乏营养的环境中。电镜观察MG1655和WQM026细胞，MG1655细胞表面布满大量菌毛(图5B)，但WQM026表面光滑，无菌毛迹象(图5C)。
为了探讨菌毛缺失时大肠杆菌产生更多PHA的原因，测定了WQM026中乙酸和乙酰辅酶A的浓度。乙酰辅酶A是PHA合成的直接前体，而乙酸是由乙酰辅酶A产生的。WQM026的乙酸和乙酰辅酶A水平显著高于MG1655，分别提高了23.57％和79.18％(图5D)。菌毛的缺失提高了大肠杆菌WQM026体内乙酸和乙酰辅酶A水平，有利于大肠杆菌产生PHA。此外，WQM026中的柠檬酸盐浓度比MG1655低28.78％(图5D)。柠檬酸盐是TCA循环中的关键代谢物，其在WQM026中的较低浓度表明节省的碳并未流入TCA循环，进一步说明菌毛的缺失减少了能量消耗。由于各种菌毛的生物合成和组装需要能量，因此还测定了含MG1655的WQM026中的细胞内ATP浓度(图5D)。WQM026和MG1655中的ATP浓度分别为0.741和0.402μmol/g，WQM026较MG1655中的ATP浓度提高了1.8倍。这表明去除菌毛可以节省能源。
实施例4 WQM026在合成PHB的应用
与对照MG1655相比，WQM026具有生长良好、ATP和乙酰辅酶A积累量高的优点。因此，在发酵工业中的应用值得探索。
将产生PHA的质粒pBHR68电转导入WQM026，得到WQM026/pBHR68。超薄切片电镜分析显示，巨大的PHA颗粒填充WQM026/pBHR68细胞(图6B)，但在MG1655/pBHR68细胞中只观察到极少量的PHA(图6A)。这表明WQM026可以有效地合成PHA。
PHA可由多种底物合成并形成细胞内不溶性球形包涵体或PHA颗粒。有超过90种不同的PHA单体。在大肠杆菌中引入pBHR68通常会产生聚3-羟基丁酸酯(PHB)，但当pBHR68被引入时，也会产生其他类型的PHA。因此，采用GC/MS法测定PHA的种类和产量。
菌株在LB平板上活化培养12h，挑取1大环菌苔接种到含有50mL LB的250mL锥形瓶中，置于37℃，200rpm条件下培养6h得到种子液，5％(v/v)接种量接种于50mL发酵培养基，置于37℃，200rpm条件下培养48h。
对上述菌株WQM026/pBHR68的发酵液进行PHA提取、甲基酯化和GC/MS分析，在GC光谱中只观察到一个峰，其保留时间为5.508min，与标准PHB的保留时间完全相同(图6C)。WQM026/pBHR68产生的PHA的质谱分析也显示了与标准PHB相同的模式(图6D)。这证实了WQM026/pBHR68产生的PHA是PHB。如图6E所示，与对照MG1655/pBHR026相比，WQM026/pBHR68的PHB和干细胞重量百分比(DCW)产量均显著增加，分别达到3.31g/L和87.87％，较对照MG1655/pBHR026分别提高了倍2和3.44倍。
实施例5 WQM026在合成L-苏氨酸的应用
由于大肠杆菌已被开发用于生产L-苏氨酸，WQM026中高效生产L-苏氨酸的潜力也被进一步研究。将含有L-苏氨酸生物合成和转运关键基因的质粒pFW01-thrA*BC-rhtC分别转入MG1655和WQM026，得到MG1655/pFW01 thrA*BC-rhtC和WQM026/pFW01thrA*BC-rhtC。
菌株在LB平板上活化培养12h，挑取1大环菌苔接种到含有50mL LB的200mL锥形瓶中，置于37℃，200rpm条件下培养4h得到种子液，10％(v/v)接种量接种于80mL发酵培养基，置于37℃，200rpm条件下培养36h。测定发酵液中L-苏氨酸的含量，与对照菌株MG1655/pFW01 thrA*BC rhtC相比，WQM026/pFW01 thrA*BC rhtC合成L-苏氨酸的产量达到2.49g/L，相比对照菌株MG1655/pFW01 thrA*BC rhtC提高了266.18％(3.66倍)(图6F)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种促进大肠杆菌生长并提高发酵产品产量的方法，其特征在于，敲除大肠杆菌基因组上菌毛基因簇；所述菌毛基因簇为：yagV-Z，gltF-yhcF，fimA-H，sfmA-F，ycbQ-F，ydeQ-T，yraH-K，yadC-N，yehA-D，ybgO-D，yfcO-V和/或ygiL-I。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌毛基因簇含有64个基因，依次为yagV，yagW，yagX，yagY，yagZ，gltF，yhcA，yhcD，yhcE，yhcF，fimA，fimI，fimC，fimD，fimF，fimG，fimH，sfmA，sfmC，sfmD，sfmH，sfmF，ycbQ，ycbR，ycbS，ycbT，ycbU，ycbV，ycbF，ydeQ，ydeR，ydeS，ydeT，yraH，yraI，yraJ，yraK，yadC，yadK，yadL，yadM，htrE，yadV，yadN，yehA，yehB，yehC，yehD，ybgO，ybgP，ybgQ，ybgD，yfcO，yfcP，yfcQ，yfcR，yfcS，yfcT，yfcU，yfcV，ygiL，yqiG，yqiH，yqiI；其序列的NCBI登录号依次为946631，947349，947606，948806，948759，947746，947741，947738，4056032，947735，948838，948841，948843，948844，948845，948846，948847，945522，945367，945160，945407，944977，948306，946773，946934，947185，945561，945562，945559，946050，946049，946047，946042，947658，947657，947656，947654，944837，944835，944829，944828，944819，944859，944841，946642，946617，946621，946619，947550，945110，946537，945325，946620，946788，946779，946818，946418，1450268，1450268，949109，947522，947529，947531，947535。
3.根据权利要求1～2任一所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌MG1655。
4.应用权利要求1～3任一所述方法构建获得的重组大肠杆菌。
5.根据权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，还含有质粒pBHR68或质粒pFW01-thrA*BC-rhtC。
6.权利要求4或5所述重组大肠杆菌在缺乏氨基酸的环境下合成代谢产物的应用。
7.一种发酵生产PHB的方法，其特征在于，所述方法是使用权利要求5所述重组大肠杆菌在缺乏氨基酸的环境下进行发酵。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述缺乏氨基酸的环境是菌株生产PHB的发酵培养基，其组成包括：葡萄糖15-20g/L，Na2HPO4·12H2O 15-20g/L，KH2PO4 1-8g/L，NH4Cl1-8g/L，NaCl 0.2-0.8g/L，MgSO4 0.1-0.5g/L和CaCl2 0.01-0.05g/L。
9.一种发酵生产L-苏氨酸的方法，其特征在于，所述方法是使用权利要求5所述重组大肠杆菌在缺乏氨基酸的环境下进行发酵。
10.权利要求1～3任一所述方法，或权利要求4～5任一所述重组大肠杆菌在发酵、药物制备、材料或环保领域的应用。
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