CN109576198A - 一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌，该大肠杆菌中的fimA基因失活，本发明还公开了该敲除fimA基因的重组大肠杆菌的构建方法，实验结果表明发酵产敲除大肠杆菌中fimA基因，对大肠杆菌发酵产L‑苏氨酸有一定的促进作用，在增加L‑苏氨酸的产量的同时可以缩短发酵周期。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。
背景技术
L-苏氨酸是由W.C.Rose在1935年从纤维蛋白水解产物中分离和鉴定出来的一种氨基酸，它是人体和动物所需的八种氨基酸中仅次于蛋氨酸、赖氨酸和色氨酸的第四种必需氨基酸。由于人体自身不能合成,必须从食物中摄取,L-苏氨酸作为食品添加剂广泛应用于食品、饲料和医疗方面。最近几年，由于L-苏氨酸的作用十分广泛，国际市场对苏氨酸的需求高速增长，而未来苏氨酸的市场仍将快速增加，苏氨酸已成为需求量增长最快的氨基酸品类之一。
目前L-苏氨酸的生产方法主要有微生物发酵法、蛋白质水解法、化学合成法3种，而现在微生物发酵法占有主流生产方法，具有节约资源，成本低，环境污染小等优点，已经广泛应用于工业生产中。随着生物科学技术的不断创新，工业微生物菌种广泛应用与各种生产中，特别是工业微生物载体系统的构建，为优良的L-苏氨酸生产菌株的筛选和产酸水平的提高提供可靠的技术保障，使微生物直接发酵法生产L-苏氨酸成为一种最优最佳的工业化生产方法。大肠杆菌产苏氨酸现在普遍运用到微生物发酵实验中，其优点是菌种繁殖快，发酵周期短，成本低等特点，但相对于氨基酸行业的需求，虽然产量稳定增加，但是速度还是比较慢。因此基因工程菌高产氨基酸的改造成为生产应用中的重中之重。
大肠杆菌Ⅰ型菌毛由fim操纵子编码，包括fimA-fimH。本发明选择fimA基因进行分子研究，fimA基因是Ⅰ型菌毛的结构基因，由fimA基因编码的亚单位FimA是构成Ⅰ型菌毛的主要结构蛋白，约占Ⅰ型菌毛总蛋白的95％以上。也是大肠杆菌生物膜的关键基因和毒力因子。
发明内容
本发明要解决的问题是，提供一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌，以提高大肠杆菌发酵制备L-苏氨酸的产量。
本发明还要解决的问题是，提供上述敲除fimA基因的重组大肠杆菌的构建方法。
本发明最后要解决的问题是，提供上述敲除fimA基因的重组大肠杆菌在发酵制备L-苏氨酸中的应用。
为解决上述问题，本发明提供如下技术方案：
一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌，该大肠杆菌中的fimA基因失活，所述的失活是指在该菌株中fimA基因失去编码得到正常蛋白质的功能，本发明实施中将大肠杆菌中fimA基因被卡那霉素抗性基因替换，但选用其他基因替换fimA基因，或者在fimA基因中插入其他基因片段均可以使fimA基因失活，所述fimA基因序列如SEQ ID NO：4所示。
其中，所述大肠杆菌为CIBTS1688，大肠杆菌CIBTS1688赠自中国科学院上海生命科学研究院，所述大肠杆菌CIBTS1688已于中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2015233，菌株号为CIBTS1688，其具体信息已在申请号为201510199036.1的发明专利中公开，
其中，所述大肠杆菌的fimA基因被卡那霉素抗性基因替换，替换后在大肠杆菌的基因组上原fimA基因被卡那霉素抗性基因替换。
上述敲除fimA基因的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将质粒PKD46(其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)电转入大肠杆菌CIBTS1688中，筛选出带有PKD46质粒的重组菌，培养重组菌，用L-阿拉伯糖诱导，再将L-阿拉伯糖诱导后的重组菌细胞制备成感受态细胞；
(2)以SEQ ID NO：1～2所示的核苷酸序列为引物，以卡那霉素抗性基因为模板，PCR扩增得到得到打靶片段，所述打靶片段的基因序列如SEQ ID NO：3所示，胶回收纯化打靶片段；
(3)将步骤(2)纯化后的打靶片段电转入步骤(1)得到的的感受态细胞中，以卡那霉素为抗性标记，筛选得到敲除fimA基因的重组大肠杆菌。
上述敲除fimA基因的重组大肠杆菌的构建方法构建得到的敲除fimA基因重组大肠杆菌在本发明的保护范围之内。
上述述敲除fimA基因重组大肠杆菌在生产L-苏氨酸中的应用在本发明的保护范围之内。
有益效果：fimA基因是大肠杆菌的毒力因子和I型菌毛蛋白的重要结构单位，通过对大肠杆菌I型菌毛的fimA基因敲除后，发现对发酵产L-苏氨酸有一定的促进作用，能增加L-苏氨酸的产量并且在可以缩短发酵周期，因此，对研究fimA基因以及fim基因家族对于L-苏氨酸的产量影响提供了理论和实践基础。
附图说明
图1PKD46质粒电泳图，其中泳道1和泳道2为PKD46质粒，泳道3为Marker。
图2敲除片段fimA电泳图，其中泳道1为Marker，泳道2～8为fimA基因PCR图。
图3CIBTS1688ΔfimA菌株菌落PCR验证，其中泳道1为Marker，泳道2为CIBTS1688菌fimA基因敲除前菌落PCR验证，泳道2为CIBTS1688ΔfimA菌株基因敲除后菌落PCR验证。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：构建fimA基因敲除菌株。
1.制备大肠杆菌CIBTS1688受态细胞。
(1)挑取大肠杆菌CIBTS1688单菌落，接种于5ml的LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜，至对数生长后期。将该菌悬液以1:50的比例接种于50ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3h至OD600＝0.8-1.0。
(2)在无菌条件下将培养液转入离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却至0℃，然后4℃，4000rpm离心10min；
(3)弃去上清，倒置1min，以便将培养液流尽；
(4)用冰预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液5ml轻轻悬浮细胞，充分混匀，冰上放置30min后，4℃下4000rpm离心10min；
(5)弃去上清，并倒置1min，以便最后的痕量培养液流尽；
(6)加入2.5ml预冷含30％甘油的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液；感受态细胞200μL分装，贮存于-80℃保存备用。
2.将质粒PKD46电转入大肠杆菌CIBTS1688感受态中，用氨苄抗性筛选出目的菌株。
(1)将10ul的PKD46质粒加入到100ul CIBTS1688感受态细胞中，冰上预冷10min。
(2)加入预冷的电转杯，条件25uF、200Ω、2.0kv电击。
(4)电击完成立即加入900ul LB培养基，30℃，1h培养。
(4)取100ul中的菌液涂LB抗性平板(氨苄霉素)，30℃过夜培养。
(5)挑取单菌落，菌落PCR验证大肠杆菌CIBTS1688是否含有PKD46质粒。
3.制备经过L-阿拉伯糖诱导的带有PKD46质粒的感受态细胞。
(1)将带有质粒PKD46的大肠杆菌CIBTS1688菌株，命名为CIBTS1688PKD46。将此菌株接种于氨苄抗性的LB中，30℃过夜培养。
(2)过夜培养后的菌液转接与100ml的氨苄抗性LB培养液中，30℃培养至OD＝0.6-0.8，并在培养终止前2h加入L-阿拉伯糖，终浓度1mmol/l。
(3)将菌落分装，4℃4000rpm离心5min,收集菌体。
(4)用预冷10％的甘油离心洗涤3次，浓缩100倍成1ml的感受态细胞，分装200ul，-80℃保存备用。
4.设计引物fimA-kan-F和fimA-kan-R，以PKD4质粒为模板，胶回收纯化目的片段，即打靶片段fimA。
(1)提取PKD4质粒。
(2)以PKD4质粒为模板，引物fimA-kan-F和fimA-kan-R，进行PCR扩增。
fimA-kan-F:CGACTGCCCATGTCGATTTAGAAATAGTTTTTTGAAAGGAAAGCAGCATGgtgtaggctggagctgcttc
fimA-kan-R:AATGACGTCCCTGAACCTGGGTAGGTTATTGATACTGAACCTTGAAGGTCgccatggtccatatgaatatcctcc
表1 PCR反应体系
使用0.8％(0.8g/100mL)琼脂糖凝胶对上述PCR产物(fimA基因片段)行电泳，结果见图2。
5.胶回收纯化打靶片段fimA基因片段：
(1)使用TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对打靶片段fimA进行琼脂糖凝胶电泳；在紫外灯下切出含有打靶片段fimA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽表面液体；
(2)切碎胶块，称量胶块重。计算体积时，以1mg＝1μL进行计算；
(3)向胶块中加入溶解液Buffer GM，Buffer GM加量没过胶块即可，均匀混合后室温15～25℃溶解胶块，此时应间断振荡混合，使胶块充分溶解；
(4)将试剂盒中的Spin Colum安置于Collection Tube上；
(5)将步骤2.4得到的溶液转移至Spin Column中，12 00000rpm离心1min，弃滤液；
(6)重复操作步骤2.7；
(7)将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12000rpm离心1min，弃滤液；
(8)将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μL灭菌水，室温静置1min；
(9)室温12000rpm离心1min洗脱fimA片段；
(10)对纯化后的打靶片段fimA进行琼脂糖凝胶电泳验证。
6.将纯化的打靶片段fimA片段电转CIBTS1688PKD 46的感受态细胞中进行培养。
(1)取100ng的纯化打靶片段fimA，加入经过L-阿拉伯糖诱导的带有PKD46质粒的CIBTS1688感受态细胞中，轻微混匀，于冰上放置15min。
(2)加入预冷的电转杯，电转条件25uF、200Ω、2.0kv电击。
(3)电击完成后立即加入900ul的LB培养液(含有L-阿拉伯糖)于37℃，160rpm培养2h。
(4)取培养后的菌液500ul涂布于带有卡那霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养可见单菌落。
(5)经过PCR验证，验证引入序列如下：
fimA-yz-F:gaacgactgcccatgtcgat；fimA-yz-R:cacaagggtgggcatccctg；
fimA基因敲除前，用上述引物PCR，得到扩增片段大小为621bp，fimA基因敲除后，得到扩增片段大小为1568bp；得到目的菌种CIBTS1688PKD46ΔfimA：：kan，即得到敲除fimA基因的目的菌株(命名为CIBTS1688ΔfimA)。
实施例2：利用发酵工艺对比原始菌株CIBTS1688和分子改造后菌株CIBTS1688ΔfimA的苏氨酸产量差异、发酵周期、糖转化率。
(1)取20μL CIBTS1688和改造CIBTS1688ΔfimA甘油菌分别接种于5mL LB液体培养基与带有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜；
(2)按体积比1:10将步骤(1)得到的菌液接种于50mL的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养2h，菌液浓度达到OD600＝0.8-1.0左右；
(3)按体积比5-10％的比例将菌液接种于发酵培养基中，37℃，200～220rpm，发酵，葡萄糖耗尽后反应结束，利用高效液相色谱仪测定发酵液中L-苏氨酸的含量，结果见表3。
其中，发酵培养基配方如下：葡萄糖30g/L，氯化钠0.8g/L，硫酸铵25g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，七水硫酸镁1.0g/L，无水硫酸铜0.05g/L，七水硫酸铁0.05g/L，酵母粉1.0g/L，碳酸钙15g/L，pH7.2-7.4。
其中，HPLC检测方法如下：
色谱条件：Sepax AA专用柱，4.6*150mm、检测波长254nm、柱温：36℃，进样量5μL。
衍生剂配置：三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1.4mL，加乙腈2mL混匀；
异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯25μL加乙腈2mL混匀。
流动相A：称取15.2g的醋酸钠，加水1850mL，溶解后用冰醋酸调PH值至6.5。
流动相B：80％乙腈(v/v)；
流速：0.8mL/min，数据采集时间50min。
表2 HPLC梯度洗脱程序
表3基因工程菌的L-苏氨酸产量
注：菌群数量是在发酵稳定后测定，CIBTS1688发酵36h苏氨酸的产量达到稳定且达到最高值，糖耗结束，CIBTS1688ΔfimA发酵30h苏氨酸产量达到稳定且达到最高值，糖耗结束。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgactgccca tgtcgattta gaaatagttt tttgaaagga aagcagcatg gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 2
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aatgacgtcc ctgaacctgg gtaggttatt gatactgaac cttgaaggtc gccatggtcc 60
atatgaatat cctcc 75
<210> 3
<211> 1572
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgactgccca tgtcgattta gaaatagttt tttgaaagga aagcagcatg gtgtaggctg 60
gagctgcttc gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata ggaacttcaa 120
gatcccctca cgctgccgca agcactcagg gcgcaagggc tgctaaagga agcggaacac 180
gtagaaagcc agtccgcaga aacggtgctg accccggatg aatgtcagct actgggctat 240
ctggacaagg gaaaacgcaa gcgcaaagag aaagcaggta gcttgcagtg ggcttacatg 300
gcgatagcta gactgggcgg ttttatggac agcaagcgaa ccggaattgc cagctggggc 360
gccctctggt aaggttggga agccctgcaa agtaaactgg atggctttct tgccgccaag 420
gatctgatgg cgcaggggat caagatctga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat 480
gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg 540
ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc 600
gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca 660
ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct 720
cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga 780
tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg 840
gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat 900
cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga 960
gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg 1020
cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg 1080
ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat 1140
agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct 1200
cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga 1260
cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg 1320
ccatcacgag atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt 1380
ttccgggacg ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc 1440
caccccagct tcaaaagcgc tctgaagttc ctatactttc tagagaatag gaacttcaat 1500
gacgtccctg aacctgggta ggttattgat actgaacctt gaaggtcgcc atggtccata 1560
tgaatatcct cc 1572
<210> 4
<211> 6326
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catcgattta ttatgacaac ttgacggcta catcattcac tttttcttca caaccggcac 60
ggaactcgct cgggctggcc ccggtgcatt ttttaaatac ccgcgagaaa tagagttgat 120
cgtcaaaacc aacattgcga ccgacggtgg cgataggcat ccgggtggtg ctcaaaagca 180
gcttcgcctg gctgatacgt tggtcctcgc gccagcttaa gacgctaatc cctaactgct 240
ggcggaaaag atgtgacaga cgcgacggcg acaagcaaac atgctgtgcg acgctggcga 300
tatcaaaatt gctgtctgcc aggtgatcgc tgatgtactg acaagcctcg cgtacccgat 360
tatccatcgg tggatggagc gactcgttaa tcgcttccat gcgccgcagt aacaattgct 420
caagcagatt tatcgccagc agctccgaat agcgcccttc cccttgcccg gcgttaatga 480
tttgcccaaa caggtcgctg aaatgcggct ggtgcgcttc atccgggcga aagaaccccg 540
tattggcaaa tattgacggc cagttaagcc attcatgcca gtaggcgcgc ggacgaaagt 600
aaacccactg gtgataccat tcgcgagcct ccggatgacg accgtagtga tgaatctctc 660
ctggcgggaa cagcaaaata tcacccggtc ggcaaacaaa ttctcgtccc tgatttttca 720
ccaccccctg accgcgaatg gtgagattga gaatataacc tttcattccc agcggtcggt 780
cgataaaaaa atcgagataa ccgttggcct caatcggcgt taaacccgcc accagatggg 840
cattaaacga gtatcccggc agcaggggat cattttgcgc ttcagccata cttttcatac 900
tcccgccatt cagagaagaa accaattgtc catattgcat cagacattgc cgtcactgcg 960
tcttttactg gctcttctcg ctaaccaaac cggtaacccc gcttattaaa agcattctgt 1020
aacaaagcgg gaccaaagcc atgacaaaaa cgcgtaacaa aagtgtctat aatcacggca 1080
gaaaagtcca cattgattat ttgcacggcg tcacactttg ctatgccata gcatttttat 1140
ccataagatt agcggatcct acctgacgct ttttatcgca actctctact gtttctccat 1200
acccgttttt ttgggaattc gagctctaag gaggttataa aaaatggata ttaatactga 1260
aactgagatc aagcaaaagc attcactaac cccctttcct gttttcctaa tcagcccggc 1320
atttcgcggg cgatattttc acagctattt caggagttca gccatgaacg cttattacat 1380
tcaggatcgt cttgaggctc agagctgggc gcgtcactac cagcagctcg cccgtgaaga 1440
gaaagaggca gaactggcag acgacatgga aaaaggcctg ccccagcacc tgtttgaatc 1500
gctatgcatc gatcatttgc aacgccacgg ggccagcaaa aaatccatta cccgtgcgtt 1560
tgatgacgat gttgagtttc aggagcgcat ggcagaacac atccggtaca tggttgaaac 1620
cattgctcac caccaggttg atattgattc agaggtataa aacgaatgag tactgcactc 1680
gcaacgctgg ctgggaagct ggctgaacgt gtcggcatgg attctgtcga cccacaggaa 1740
ctgatcacca ctcttcgcca gacggcattt aaaggtgatg ccagcgatgc gcagttcatc 1800
gcattactga tcgttgccaa ccagtacggc cttaatccgt ggacgaaaga aatttacgcc 1860
tttcctgata agcagaatgg catcgttccg gtggtgggcg ttgatggctg gtcccgcatc 1920
atcaatgaaa accagcagtt tgatggcatg gactttgagc aggacaatga atcctgtaca 1980
tgccggattt accgcaagga ccgtaatcat ccgatctgcg ttaccgaatg gatggatgaa 2040
tgccgccgcg aaccattcaa aactcgcgaa ggcagagaaa tcacggggcc gtggcagtcg 2100
catcccaaac ggatgttacg tcataaagcc atgattcagt gtgcccgtct ggccttcgga 2160
tttgctggta tctatgacaa ggatgaagcc gagcgcattg tcgaaaatac tgcatacact 2220
gcagaacgtc agccggaacg cgacatcact ccggttaacg atgaaaccat gcaggagatt 2280
aacactctgc tgatcgccct ggataaaaca tgggatgacg acttattgcc gctctgttcc 2340
cagatatttc gccgcgacat tcgtgcatcg tcagaactga cacaggccga agcagtaaaa 2400
gctcttggat tcctgaaaca gaaagccgca gagcagaagg tggcagcatg acaccggaca 2460
ttatcctgca gcgtaccggg atcgatgtga gagctgtcga acagggggat gatgcgtggc 2520
acaaattacg gctcggcgtc atcaccgctt cagaagttca caacgtgata gcaaaacccc 2580
gctccggaaa gaagtggcct gacatgaaaa tgtcctactt ccacaccctg cttgctgagg 2640
tttgcaccgg tgtggctccg gaagttaacg ctaaagcact ggcctgggga aaacagtacg 2700
agaacgacgc cagaaccctg tttgaattca cttccggcgt gaatgttact gaatccccga 2760
tcatctatcg cgacgaaagt atgcgtaccg cctgctctcc cgatggttta tgcagtgacg 2820
gcaacggcct tgaactgaaa tgcccgttta cctcccggga tttcatgaag ttccggctcg 2880
gtggtttcga ggccataaag tcagcttaca tggcccaggt gcagtacagc atgtgggtga 2940
cgcgaaaaaa tgcctggtac tttgccaact atgacccgcg tatgaagcgt gaaggcctgc 3000
attatgtcgt gattgagcgg gatgaaaagt acatggcgag ttttgacgag atcgtgccgg 3060
agttcatcga aaaaatggac gaggcactgg ctgaaattgg ttttgtattt ggggagcaat 3120
ggcgatgacg catcctcacg ataatatccg ggtaggcgca atcactttcg tctactccgt 3180
tacaaagcga ggctgggtat ttcccggcct ttctgttatc cgaaatccac tgaaagcaca 3240
gcggctggct gaggagataa ataataaacg aggggctgta tgcacaaagc atcttctgtt 3300
gagttaagaa cgagtatcga gatggcacat agccttgctc aaattggaat caggtttgtg 3360
ccaataccag tagaaacaga cgaagaatcc atgggtatgg acagttttcc ctttgatatg 3420
taacggtgaa cagttgttct acttttgttt gttagtcttg atgcttcact gatagataca 3480
agagccataa gaacctcaga tccttccgta tttagccagt atgttctcta gtgtggttcg 3540
ttgtttttgc gtgagccatg agaacgaacc attgagatca tacttacttt gcatgtcact 3600
caaaaatttt gcctcaaaac tggtgagctg aatttttgca gttaaagcat cgtgtagtgt 3660
ttttcttagt ccgttacgta ggtaggaatc tgatgtaatg gttgttggta ttttgtcacc 3720
attcattttt atctggttgt tctcaagttc ggttacgaga tccatttgtc tatctagttc 3780
aacttggaaa atcaacgtat cagtcgggcg gcctcgctta tcaaccacca atttcatatt 3840
gctgtaagtg tttaaatctt tacttattgg tttcaaaacc cattggttaa gccttttaaa 3900
ctcatggtag ttattttcaa gcattaacat gaacttaaat tcatcaaggc taatctctat 3960
atttgccttg tgagttttct tttgtgttag ttcttttaat aaccactcat aaatcctcat 4020
agagtatttg ttttcaaaag acttaacatg ttccagatta tattttatga atttttttaa 4080
ctggaaaaga taaggcaata tctcttcact aaaaactaat tctaattttt cgcttgagaa 4140
cttggcatag tttgtccact ggaaaatctc aaagccttta accaaaggat tcctgatttc 4200
cacagttctc gtcatcagct ctctggttgc tttagctaat acaccataag cattttccct 4260
actgatgttc atcatctgag cgtattggtt ataagtgaac gataccgtcc gttctttcct 4320
tgtagggttt tcaatcgtgg ggttgagtag tgccacacag cataaaatta gcttggtttc 4380
atgctccgtt aagtcatagc gactaatcgc tagttcattt gctttgaaaa caactaattc 4440
agacatacat ctcaattggt ctaggtgatt ttaatcacta taccaattga gatgggctag 4500
tcaatgataa ttactagtcc ttttcctttg agttgtgggt atctgtaaat tctgctagac 4560
ctttgctgga aaacttgtaa attctgctag accctctgta aattccgcta gacctttgtg 4620
tgtttttttt gtttatattc aagtggttat aatttataga ataaagaaag aataaaaaaa 4680
gataaaaaga atagatccca gccctgtgta taactcacta ctttagtcag ttccgcagta 4740
ttacaaaagg atgtcgcaaa cgctgtttgc tcctctacaa aacagacctt aaaaccctaa 4800
aggcttaagt agcaccctcg caagctcggt tgcggccgca atcgggcaaa tcgctgaata 4860
ttccttttgt ctccgaccat caggcacctg agtcgctgtc tttttcgtga cattcagttc 4920
gctgcgctca cggctctggc agtgaatggg ggtaaatggc actacaggcg ccttttatgg 4980
attcatgcaa ggaaactacc cataatacaa gaaaagcccg tcacgggctt ctcagggcgt 5040
tttatggcgg gtctgctatg tggtgctatc tgactttttg ctgttcagca gttcctgccc 5100
tctgattttc cagtctgacc acttcggatt atcccgtgac aggtcattca gactggctaa 5160
tgcacccagt aaggcagcgg tatcatcaac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 5220
acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 5280
ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 5340
ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 5400
tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 5460
tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 5520
gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 5580
tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 5640
tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 5700
ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 5760
tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 5820
ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 5880
gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 5940
ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 6000
cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 6060
ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 6120
ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 6180
gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 6240
ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 6300
cacatttccc cgaaaagtgc cacctg 6326
<210> 5
<211> 549
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaaaatta aaactctggc aatcgttgtt ctgtcggctc tgtccctcag ttctacagcg 60
gctctggccg ctgccacgac ggttaatggt gggaccgttc actttaaagg ggaagttgtt 120
aacgccgctt gcgcagttga tgcaggctct gttgatcaaa ccgttcagtt aggacaggtt 180
cgtaccgcat cgctggcaca ggaaggagca accagttctg ctgtcggttt taacattcag 240
ctgaatgatt gcgataccaa tgttgcatct aaagccgctg ttgccttttt aggtacggcg 300
attgatgcgg gtcataccaa cgttctggct ctgcagagtt cagctgcggg tagcgcaaca 360
aacgttggtg tgcagatcct ggacagaacg ggtgctgcgc tgacgctgga tggtgcgaca 420
tttagttcag aaacaaccct gaataacgga accaatacca ttccgttcca ggcgcgttat 480
tttgcaaccg gggccgcaac cccgggtgct gctaatgcgg atgcgacctt caaggttcag 540
tatcaataa 549
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaacgactgc ccatgtcgat 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cacaagggtg ggcatccctg 20
Claims (6)
1.一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌，其特征在于，该大肠杆菌中的fimA基因失活。
2.根据权利要求1所述的敲除fimA基因的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌为CIBTS1688。
3.根据权利要求1或2所述的敲除fimA基因的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌的fimA基因被卡那霉素抗性基因替换。
4.权利要求1～3任一所述敲除fimA基因的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将质粒PKD46电转入大肠杆菌CIBTS1688中，筛选出带有PKD46质粒的重组菌，培养重组菌，用L-阿拉伯糖诱导，再将L-阿拉伯糖诱导后的重组菌细胞制备成感受态细胞；
(2)以SEQ ID NO：1～2所示的核苷酸序列为引物，以卡那霉素抗性基因为模板，PCR扩增得到得到打靶片段，所述打靶片段的基因序列如SEQ ID NO：3所示，胶回收纯化打靶片段；
(3)将步骤(2)纯化后的打靶片段电转入步骤(1)得到的的感受态细胞中，以卡那霉素为抗性标记，筛选得到敲除fimA基因的重组大肠杆菌。
5.权利要求4所述敲除fimA基因的重组大肠杆菌的构建方法构建得到的敲除fimA基因重组大肠杆菌。
6.权利要求4所述敲除fimA基因重组大肠杆菌CIBTS1688ΔfimA在生产L-苏氨酸中的应用。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110055205A (zh) * | 2019-05-13 | 2019-07-26 | 南京工业大学 | 一种敲除fimH基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 |
| JP7507897B2 (ja) | 2021-01-15 | 2024-06-28 | 江南大学 | 生産効率を向上させる線毛無し大腸菌の構築及び使用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1038035A1 (de) * | 1997-11-19 | 2000-09-27 | Pharma-Zentrale Gmbh | VERFAHREN ZUR IDENTIFIZIERUNG VON $i(ESCHERICHIA COLI) STAMM DSM 6601 |
| WO2006088997A2 (en) * | 2005-02-15 | 2006-08-24 | The Research Foundation Of State University Of Newyork At Buffalo | Adjuvant activities of b pentamers of lt-iia and lt-iib enterotoxin |
| CN108315447A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-07-24 | 扬州大学 | 产肠毒素大肠杆菌I型菌毛基因fimA的应用 |
| CN108531439A (zh) * | 2018-04-16 | 2018-09-14 | 南京工业大学 | 一种大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用 |
| CN110079567A (zh) * | 2019-05-13 | 2019-08-02 | 南京工业大学 | 一种过表达fimH基因的重组大肠杆菌在发酵生产氨基酸中的应用 |
| CN112680393A (zh) * | 2021-01-15 | 2021-04-20 | 江南大学 | 一种能提高生产效率的无菌毛大肠杆菌的构建及应用 |
-
2018
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1038035A1 (de) * | 1997-11-19 | 2000-09-27 | Pharma-Zentrale Gmbh | VERFAHREN ZUR IDENTIFIZIERUNG VON $i(ESCHERICHIA COLI) STAMM DSM 6601 |
| WO2006088997A2 (en) * | 2005-02-15 | 2006-08-24 | The Research Foundation Of State University Of Newyork At Buffalo | Adjuvant activities of b pentamers of lt-iia and lt-iib enterotoxin |
| CN108315447A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-07-24 | 扬州大学 | 产肠毒素大肠杆菌I型菌毛基因fimA的应用 |
| CN108531439A (zh) * | 2018-04-16 | 2018-09-14 | 南京工业大学 | 一种大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用 |
| CN110079567A (zh) * | 2019-05-13 | 2019-08-02 | 南京工业大学 | 一种过表达fimH基因的重组大肠杆菌在发酵生产氨基酸中的应用 |
| CN112680393A (zh) * | 2021-01-15 | 2021-04-20 | 江南大学 | 一种能提高生产效率的无菌毛大肠杆菌的构建及应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| PER KLEMN: ""The fimA gene encoding the type-1 fimbrial subunit of Escherichia coli Nucleotide sequence and primary structure of the protein"", 《EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY》 * |
| 何素芬: ""禽致病性大肠杆菌I型菌毛fimH基因缺失突变株的构建及其相关功能性分析"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）》 * |
| 杨洁等: ""定向敲除牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA的重组质粒构建"", 《中华口腔医学杂志》 * |
| 郭志燕: ""FimA介导F18ab+大肠杆菌病原性的研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110055205A (zh) * | 2019-05-13 | 2019-07-26 | 南京工业大学 | 一种敲除fimH基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 |
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