CN110387347A - 一株大肠杆菌膜壁精简底盘菌株及其高产phb的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株大肠杆菌膜壁精简底盘菌株及其高产PHB的应用，属于基因工程和发酵工程领域。本发明敲除野生型大肠杆菌W3110基因组上脂多糖的核心糖基因簇gmhD‑waaQ和O‑抗原基因簇wbbL‑rmlB，胞外多糖基因簇galF‑wza，4型荚膜多糖合成基因簇yccC‑ymcD，三个鞭毛基因簇flhE‑motA、fliY‑fliR、flgN‑flgL，和一个菌毛基因簇fimB‑fimH得到菌株WJW08，然后将PHB合成相关的基因转化到菌株中得到重组菌WJW08/pBHR68，在正常的发酵条件下该重组菌可以合成细胞干重81.9％的PHB，是野生对照菌W3110/pBHR68(1.5％)的54.6倍。

Description

一株大肠杆菌膜壁精简底盘菌株及其高产PHB的应用

技术领域

本发明涉及一株大肠杆菌膜壁精简底盘菌株及其高产PHB的应用，属于基因工程和发酵工程领域。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是一类由微生物合成的可再生可降解且具有多元材料学性能的高分子聚合物，在医学、材料和环保领域有着广泛的应用前景。聚羟基脂肪酸酯广泛存在于微生物细胞内，主要作为碳源及能量的贮存载体。生长环境C:N比例越高，越有利于PHA的合成。PHA在胞内以疏水性颗粒的形式存在，在特定条件下其含量可以超过细胞干重的90％。PHA根据单体种类、聚合方式的不同，具有从坚硬质脆的硬塑料到柔软的弹性体等一系列多样性的材料学特性。由于PHA可由可再生资源为原料合成，进入自然界后可以被细菌等生物完全降解，替代常规石油基塑料可以缓解严重的“白色污染”问题，从而引起世界各国科学界和工业界的广泛重视。

聚3-羟基丁酸酯(PHB)是PHA中的一种，大肠杆菌常用于PHB的工业生产。PHB是一种胞内产物，PHB颗粒是胞内的碳源储存物质，以不溶性微球状颗粒状形式存在于细胞质中。PHB合成受到很多调控，如C:N比例，当碳过剩、氮缺乏时，PHB更易合成，当胞内其他C源代谢旺盛时，或者氨基酸转运酶活低时，PHB合成会受到影响。大肠杆菌合成PHB的关键在于平衡产物和细胞生长，既要使得细胞生长好，又要增强其合成途径的代谢流，并通过控制产物形成途径的表达水平来提高产量。而原始大肠杆菌菌株合成PHB的产量一般为细胞干重的0～50％，现有报道中主要通过优化发酵条件、优化代谢途径、提高胞内辅酶浓度和优化表达质粒等手段来改善PHB的合成。但是这些方法使得PHB产量的提高仍然无法满足工业上生产的需求。因此，提供一种新的提高PHB合成的方法，对于进一步提高PHB的合成具有十分重大的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种生产聚3-羟基丁酸酯(PHB)的重组菌，敲除大肠杆菌基因组上脂多糖的核心糖基因簇gmhD-waaQ和O-抗原基因簇wbbL-rmlB，胞外多糖基因簇galF-wza，4型荚膜多糖合成基因簇yccC-ymcD，三个鞭毛基因簇flhE-motA、fliY-fliR、flgN-flgL，和一个菌毛基因簇fimB-fimH；并将β-酮基硫解酶，乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶的编码基因转化到菌株中。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌W3110。

在一种实施方式中，所述核心糖基因簇gmhD-waaQ含有14个基因，分别为waaQ，waaG，waaP，waaS，waaB，waaO，waaR，waaY，waaZ，waaU，waaL，waaC，waaF，gmdD(rfaD)，其序列的NCBI登录号依次为“BAE77660.1”，“BAE77661.1”，“BAE77662.1”，“BAE77663.1”，“BAE77664.1”，“BAE77665.1”，“BAE77666.1”，“BAE77667.1”，“BAE77668.1”，“BAE77669.1”，“BAE77670.1”，“BAE77671.1”，“BAE77672.1”,“BAE77673.1”。

在一种实施方式中，所述O-抗原基因簇wbbL-rmlB含有11个基因，分别为wbbL::IS5，wbbK，wbbJ，wbbI，wzy，glf，wzx，rmlC，rmlA，rmlD，rmlB，其序列登录号依次为“BAA15873.1”，“BAA15874.1”，“BAA15875.1”，“BAA15876.1”，“BAA15877.1”，“BAA15878.1”，“BAA15879.1”，“BAA15880.1”，“BAA15881.1”，“BAA15882.1”，“BAA15883.1”，“BAA15884.1”。

在一种实施方式中，所述胞外多糖基因簇galF-wza含有21个基因，分别为wza，wzb，wzc，wcaA，wcaB，wcaC，wcaD，wcaE，wcaF，gmd，wcaG，wcaH，wcaI，manC，manB，wcaJ，wzx，wcaK，wcaL，wcaM，galF，其基因序列的NCBI登录号依次为“BAE76576.1”、“BAE76575.1”、“BAA15913.1”、“BAA15912.1”、“BAA15911.1”、“BAE76574.1”、“BAE76573.1”、“BAE76572.1”、“BAA15910.1”、“BAA15909.1”、“BAA15908.1”、“BAA15907.1”、“BAA15906.1”、“BAA15905.1”、“BAA15901.1”“BAA15900.1”、“BAA15899.1”、“BAE76571.1”、“BAA15898.1”、“BAA15897.1”、“BAA15896.1”。

在一种实施方式中，所述4型荚膜多糖合成基因簇yccC-ymcD含有7个基因，分别为yccC，etp，yccZ，ymcA，ymcB，ymcC，ymcD，其基因序列的NCBI登录号依次为："BAA35746.1"，"BAA35747.2"，"BAA35748.1"，"BAA35749.1"，"BAA35750.2"，"BAA35751.1"，"BAA35752.2"。

在一种实施方式中，所述鞭毛基因簇flhE-motA包含flhE、flhA、flhB、cheZ、cheY、cheB、cheR、tap、tar、cheW、cheA，motB，motA共13个基因；所述鞭毛基因簇fliY-fliR包含fliY，fliZ，fliA、fliC、fliD、fliS、fliT、amyA、yedD、yedE、yedF、yedL，yedN，yedM，intG、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliJ、fliK、fliL、fliM、fliN、fliO、fliP、fliQ、fliR共30个基因；所述鞭毛基因簇flgN-flgL包含flgN、flgM、flgA、flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgH、flgI、flgJ、flgK、flgL共14个基因；所述菌毛基因簇fimB-fimH包含fimB、fimE、fimA、fimI、fimC、fimD、fimF、fimG、fimH共9个基因。

在一种实施方式中，所述鞭毛基因簇flhE-motA包含的flhE、flhA、flhB、cheZ、cheY、cheB、cheR、tap、tar、cheW、cheA，motB，motA基因，序列NCBI上登录号分别为"BAA15687.1"、"BAA15688.2"、"BAA15696.1"、"BAA15697.1"、"BAA15698.1"、"BAA15699.1"、"BAA15700.1"、"BAA15701.1"、"BAA15702.1"、"BAA15703.1"、"BAA15709.1"、"BAA15710.1"、"BAA15711.1"。

在一种实施方式中，所述鞭毛基因簇fliY-fliR包含的fliY，fliZ，fliA、fliC、fliD、fliS、fliT、amyA、yedD、yedE、yedF、yedL，yedN，yedM，intG、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliJ、fliK、fliL、fliM、fliN、fliO、fliP、fliQ、fliR基因，序列NCBI上登录号分别为"BAA15740.1"、"BAA15741.1"、"BAA15742.1"、"BAA15751.1"、"BAA15752.2"、"BAA15753.1"、"BAA15754.1"、"BAA15755.1"、"BAA15756.1"、"BAA15757.1"、"BAA15758.1"、"BAE76552.1"、"BAE76553.1"、"BAE76553.1"、"BAE76553.1"、"BAA15760.1"、"BAA15763.1"、"BAA15764.1"、"BAA15765.1"、"BAA15766.1"、"BAA15767.1"、"BAA15768.1"、"BAA15769.1"、"BAA15770.1"、"BAA15771.1"、"BAA15772.2"、"BAA15773.1"、"BAA15774.1"、"BAA15775.1"。

在一种实施方式中，所述鞭毛基因簇flgN-flgL包含的flgN、flgM、flgA、flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgH、flgI、flgJ、flgK、flgL基因，序列NCBI上登录号分别为"BAA35878.1"、"BAA35879.1"、"BAA35880.1"、"BAA35881.1"、"BAA35882.1"、"BAA35883.1"、"BAA35885.2"、"BAA35886.1"、"BAA35887.1"、"BAA35888.2"、"BAA35889.1"、"BAA35890.1"、"BAA35891.1"、"BAA35892.1"。

在一种实施方式中，所述菌毛基因簇fimB-fimH包含的fimB、fimE、fimA、fimI、fimC、fimD、fimF、fimG、fimH基因，序列的NCBI上登录号分别为"BAE78305.1"、"BAE78306.1"、"BAE78307.1"、"BAE78308.1"、"BAE78309.1"、"BAE78310.1"、"BAE78311.1"、"BAE78312.1"、"BAE78313.1"。

在一种实施方式中，所述β-酮基硫解酶的protein ID为QBK40993.1；所述乙酰辅酶A还原酶的protein ID为QBK40994.1；所述PHB合成酶的protein ID为QBK40992.1。

在一种实施方式中，所述转化是将含有β-酮基硫解酶、乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶的编码基因的PHB合成基因簇phaCAB连接到表达质粒上后，转化到宿主大肠杆菌中。

在一种实施方式中，所述基因簇phaCAB的序列的NCBI登录号为“QBK40992.1”。

本发明的第二个目的是提供一种生产PHB的方法，所述方法是应用所述的重组菌进行发酵生产。

在一种实施方式中，所述发酵生产是将所述的重组菌接种到发酵培养基中，以葡萄糖为底物，进行发酵生产。

在一种实施方式中，所述发酵培养基的组成包括：20g/L葡萄糖，17.1g/LNa₂HPO₄·12H₂O，3g/L KH₂PO₄，0.5g/L NaCl，添加1mM MgSO₄，0.1mM CaCl₂，10mg/mL维生素B1。

本发明还提供所述重组菌或所述方法在药物制备、材料或环保领域的应用。

本发明的有益效果：

本发明敲除野生型大肠杆菌W3110基因组上脂多糖的核心糖基因簇ΔgmhD-waaQ和O-抗原基因簇ΔwbbL-rmlB，胞外多糖基因簇galF-wza，4型荚膜多糖合成基因簇yccC-ymcD，三个鞭毛基因簇flhE-motA、fliY-fliR、flgN-flgL，和一个菌毛基因簇fimB-fimH最终得到菌株WJW08，然后将β-酮基硫解酶，乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶的编码基因转化到菌株中得到重组菌WJW08/pBHR68。在正常的发酵条件下重组菌WJW08/pBHR68可以合成细胞干重81.9％的PHB，PHB体积产量是野生对照菌W3110/pBHR68(1.5％)的54.6倍。

生物材料

野生型大肠杆菌W3110购买自ATCC，保藏编号为ATCC39936。

大肠杆菌WJW00(基因型为E.coli W3110ΔgmhD)已经于专利《一种产Kdo2-lipidA的基因工程菌及其构建方法和应用》(公布号：CN103820377A，公开日：2014.05.28)中公开，其是在野生型大肠杆菌W3110中，敲除核心糖中L-D-庚糖合成关键基因gmhD(又名rfaD)获得。

表1菌株

表2序列表

附图说明

图1：大肠杆菌基因簇。

图2：质粒pDTW202-cat的构建。

图3：LPS精简菌株WJW02的构建。

图4：PCR验证WJW02的构建；泳道1：在W3110中敲除基因簇waaQ-gmhD；泳道2：在W3110中敲除基因簇wbbL-rmlB；泳道3和4：野生菌W3110对照。

图5：PCR验证基因簇yccC-ymcD的敲除。

图6：细胞形态的观察。

图7：细胞的生长曲线。

图8：重组菌株WJW08/pBHR68和对照菌W3110/pBHR68合成PHB的摇瓶发酵。

具体实施方式

(1)基因的敲除方法

采取组合式位点特异性重组方法和CRISPR/Cas9敲除系统两种方法进行大片段基因簇敲除。其中，组合式位点特异性重组方法如图1所示，在靶基因簇的一端通过Red重组引入lox L-kan片段，接着在另一端通过Red重组引入cat-lox R片段，然后通过Cre酶表达，识别位点lox L和lox R，进行位点重组，并采用AMP抗性筛选，通过抗性验证获得无Kan、Cm抗性的转化子，进一步采用PCR验证基因型，确定转化子正确无误。采用FRT位点的精简方法类似，在靶基因簇的两端引入FRT位点(可以为两个)，然后通过Flp酶表达，识别FRT位点，通过抗性筛选即可获得正确敲除突变株。Flp酶可以不断识别FRT位点，直到将不含必需基因的最远端FRT位点重组。

CRISPR/Cas9敲除系统的工具质粒pCas和pTargetF购买于淼灵质粒公司。敲除流程参考Jiang等的方法(Jiang,Y.,Chen,B.,Duan,C.,et.al.Multigene editing in theEscherichia coli genome via the CRISPR-Cas9system[J].Appl Environ Microbiol,2015,81(7):2506-14 10.1128/AEM.04023-14)。具体敲除流程为：首先向大肠杆菌出发菌W3110中转入pCas质粒，然后进行L-阿拉伯糖诱导后制备电转感受态，以备敲除；其次需要通过重叠PCR连接上下游同源臂构建敲除片段；再通过pTargetF质粒重构建引入20nt与目的基因靶序列相同的N₂₀序列，构建敲除质粒pTargetF-gene；将敲除片段和敲除质粒同时电转入含有pCas的相应菌株中，进行筛选获得敲除转化子，最后去除敲除质粒和pCas，获得正确无抗无痕敲除突变株。

(2)PHB产量测定方法

将发酵液倒入离心管中静止放置2h，弃去上清后，冷冻菌体，并冷冻干燥。称取一定量冷冻干燥菌体进行甲酯化，采用已报道的常规甲酯化方法甲酯化，最后进行常规气象色谱定量。

(3)发酵参数测定方法

①OD和pH测定

用去离子水调零，调整稀释倍数至在比色皿中测的OD₆₀₀在0.2至0.8之间。待示数稳定后记录读数，乘以稀释倍数，即得OD。

对刚取的发酵样品直接进行pH测定，采用pH计测定直接读数。

②残糖测定

SBA-40C生物传感器是通过葡萄糖分子和反应膜上的受体结合所反映出电信号变化来定量葡萄糖浓度的；测定方法是将样品10000rpm离心2min，将20μl上清液加入到总体系为1000μl的待测体系中，并剧烈震荡均匀；准确吸取25μl标样(含有1g/L葡萄糖)快速打入进样孔内，等待仪器平衡后，待指示灯不闪烁后，重复3针以上，均基本一致，视为定标完成；准确吸取25μl样品快速打入进样孔内，记录仪器显示屏指数，除以2即得残糖数值。

③PHB的提取和测定

取不同发酵时间的PHB合成细胞，离心收集5mL细胞，采用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤两次，离心收集后，将细胞转移到预先准确称重的离心管中，包上保鲜膜，并扎出多个小洞，使得水分可以蒸干，又避免菌液喷出，在真空冷冻干燥机中冻干48h至完全干燥，一般触摸管底为常温状态，表明已经完全干透，或者用手指轻弹管底，菌体可以散开并轻易脱离管壁，则视为菌体完全干燥。称重量，计算出干重。

称取1-10mg完全干燥的干菌体，同时称取PHB标准样品约10mg转移至预先准确称重的酯化管中，以便准确计算称得的样品重量。然后进行酯化操作，加入2mL甲醇(含有3％硫酸)和2mL氯仿，加上酯化管盖子并盖紧，期间可以超声，帮助样品散开，使得酯化更彻底，沸水浴6h以上。大约半小时后，即可观察到PHB标样一般以粉末形式迅速熔化。若未观察到半小时后标准品的形态变化与溶解，则应更换整套试剂，甲醇和氯仿的变质都会导致酯化无法正常进行，而更换新开封的试剂往往可以解决上述问题，经过六小时沸水浴后，在通风橱中冷却充分后，小心打开酯化管并加入1mL去离子水，这时需要分别将盖子旋紧并激烈震荡至体系完全充分混匀，此时将酯化管置于通风处中静置3h以上以分相，分相后，上层为水相，下层为有机相，取适量有机相加入到气相样品瓶中，盖紧盖子保持密封，保存在-80℃中。气相色谱是定量PHB含量的准确灵敏的手段。气相定量采用岛津GC 2010气相色谱，使用安捷伦DB WAX 30m-0.32mm气相色谱柱和火焰离子化检测器，进样温度为250℃。以不同量的商业化PHB作为标样绘制各标准样品的标准曲线。

实施例1 工程菌WJW00的构建

工程菌WJW00已经在SCI论文《Construction and Characterization of anEscherichia coli Mutant Producing Kdo₂-Lipid A》中公开(公开日：2014年3月13日)。具体构建过程如下：

(1)gmhD基因敲除片段的获得

采用化学全合成或PCR分步扩增的方法获得gmhD基因敲除片段，其两端为gmhD基因上下游同源臂、中间为带有FRT位点的kan片段。gmhD基因敲除片段的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。将gmhD基因敲除片段克隆到质粒pBlueScriptIISK(+)，获得重组质粒pBlueScript IISK(+)-gmhDU-Fkan-gmhDD。以该质粒为模板，可以扩增获得敲除片段gmhDU-Fkan-gmhDD。

(2)敲除感受态的制备及电转化

接种带有Red重组辅助质粒pKD46(DatsenkoKA,Wanner BL.One-Stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(12):6640-6645)的大肠杆菌W3110(ATCC39936)于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃，200rpm过夜培养。按2％接种量转接100mL LB液体培养基，30℃，200rpm培养至OD₆₀₀＝0.2时加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导重组酶的表达，继续培养至OD₆₀₀＝0.5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50mL离心管中，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的10％甘油洗涤3次，最后用1mL10％甘油悬浮，每管80μL分装至预冷的无菌EP管中。

将500-1000ng的gmhD敲除片段加入感受态细胞中，混匀，冰浴15min，1.5kv电击5ms，30℃孵育2h，涂布30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，30℃培养，挑取转化子于含30μg/mL卡那霉素及100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，PCR验证，将得到的菌株命名为WJW00-Fkan。

(3)突变株抗性标记的去除

将PCR验证阳性的菌株接种含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，42℃过夜培养，将培养液划线30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，37℃培养，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素的敏感性，将含有卡那霉素抗性并对氨苄青霉素敏感的菌株命名为W3110△gmhD::kan并保藏。以此为出发菌株做感受态，转入pCP20质粒(CherepanovPP,WackernagelW.Genedisruption in Escherichia coli:Tc R and Km Rcassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.Gene,1995,158(1):9-14)，42℃热激表达FLP酶，将阳性菌株于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导Flp重组酶的表达，介导FRT位点特异性重组，PCR验证挑选转化子。结果见图1，在大肠杆菌WJW00，WJW00-Fkan和W3110染色体中gmhD区域周围扩增的DNA片段大小分别为552，1854和889bp。

将PCR验证正确的菌株42℃热激后划线LB平板，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素及卡那霉素的敏感性，对两种抗生素均敏感的菌株即为E.coli W3110△gmhD，将其命名为WJW00并保藏。

实施例2 LPS精简菌株WJW01的构建

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)包括类脂A、核心糖和O-抗原三部分，其中类脂A为高度保守区，而核心糖和O-抗原由不同的糖分子组成。其中核心糖合成基因簇包含14个基因，分别是waaQ，waaG，waaP，waaS，waaB，waaO，waaR，waaY，waaZ，waaU，waaL，waaC，waaF，gmdD。在实施例1得到的菌株WJW00基础上继续敲除核心糖基因簇gmdD(gmhD)-waaFC-waaQGPSBORYZUL中除gmhD基因外剩余的13个基因。

(1)参照实施例1中gmhD基因的敲除过程敲除waaQ基因

1)waaQ基因敲除片段的获得

采用化学全合成或PCR分步扩增的方法获得waaQ基因敲除片段，其两端为waaQ基因上下游同源臂、中间为带有FRT位点的kan片段。waaQ基因敲除片段的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。将waaQ基因敲除片段克隆到pBlueScript II SK(+)，获得重组质粒pBlueScript II SK(+)-waaQU-Fkan-waaQD。以该质粒为模板，可以扩增获得敲除片段waaQU-Fkan-waaQD。

2)敲除感受态的制备及电转化

接种带有Red重组辅助质粒pKD46(Datsenko K A,Wanner B L.One-Stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97(12):6640-6645)的大肠杆菌W3110(ATCC39936)于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃，200rpm过夜培养。按2％接种量转接100mL LB液体培养基，30℃，200rpm培养至OD₆₀₀＝0.2时加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导重组酶的表达，继续培养至OD₆₀₀＝0.5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50mL离心管中，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的10％甘油洗涤3次，最后用1mL 10％甘油悬浮，每管80μL分装至预冷的无菌EP管中。

将500-1000ng waaQ敲除片段加入感受态细胞中，混匀，冰浴15min，1.5kv电击5ms，30℃孵育2h，涂布30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，30℃培养，挑取转化子于含30μg/mL卡那霉素及100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，PCR验证结果。

3)突变株抗性筛选

将PCR验证阳性的菌株接种含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，42℃过夜培养，将培养液划线30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，37℃培养，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素的敏感性，将含有卡那霉素抗性并对氨苄青霉素敏感的菌株命名为WJW00△waa Q::kan并保藏。

(2)核心糖基因簇的敲除

步骤(1)得到的菌株WJW00△waaQ::kan基因组上存在三个FRT位点，分别为gmhD敲除遗留的1个FRT位点和waaQ敲除引入的抗性标记两端的2个FRT位点。

以菌株WJW00△waaQ::kan为出发菌株做感受态，转入pCP20质粒(Cherepanov PP,Wackernagel W.Gene disruption in Escherichia coli:Tc^R and Km^R cassettes withthe optio n of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistancedeterminant.Gene,1995,158(1):9-1 4)，42℃热激表达FLP酶，将阳性菌株于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导Flp重组酶的表达，介导所有的FRT位点特异性重组，因此将三个FRT位点重组后，不仅删除了卡那霉素抗性标记，也删除了gmhD和waaQ之间的所有基因。

采用引物waaQ-U-F和gmhD-D-R PCR验证挑选转化子，将PCR验证正确的菌株42℃热激后划线LB平板，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素及卡那霉素的敏感性，选取对两种抗生素均敏感的菌株命名为WJW01并保藏。

表3引物序列表

实施例3 LPS精简菌株WJW02的构建

O-抗原合成基因簇rmlBrmlBDACX-glf-wbbHIJKL包含11个基因，分别是wbbL::IS5，wb bK，wbbJ，wbbI，wzy，glf，wzx，rmlC，rmlA，rmlD，rmlB。在WJW01基础上进一步敲除O-抗原合成基因簇后获得WJW02。具体操作如下：

(1)工具质粒pDTW202-cat的构建

O-抗原基因簇wbbL-rmlB的敲除采取lox LR位点特异性重组方法。因此在构建大肠杆菌基因组精简系统时，需要构建1个工具质粒pDTW202-cat。该质粒的构建过程具体为：

1)以质粒pDTW109(参见谭延振的硕士学位论文《谷氨酸棒状杆菌基因敲除系统的构建》3.2.1节，公开日：2012.03.27)为模板，利用引物Tac-M-cat-F和Tac-M-cat-R，扩增带有Tac-M-cat基因盒，并以酶切位点SmaI进行单酶双切，得到抗性片段以备连接。

2)以工具质粒pDTW202质粒(参见谭延振的硕士学位论文《谷氨酸棒状杆菌基因敲除系统的构建》2.4.2节，公开日：2012.03.27)为模板，利用引物pDTW202-lox RE-F和pDTW202-lox LE-R，扩增不含有kan抗性基因片段的剩余质粒片段，也采用SmaI进行单酶双切，所扩增的质粒片段带有lox L和lox R特异性位点。

3)将步骤1)与步骤2)中得到的片段利用T4连接酶进行连接，构建得到带有lox L-cat-lox R基因盒的质粒pDTW202-cat(见图2)，其含带有较强启动性的氯霉素抗性基因cat，可以用于基因簇敲除筛选标记。酶切和PCR验证均正确。

(2)wbbL和rmlB基因的敲除

1)wbbL和rmlB基因敲除片段的获得

wbbL基因敲除片段的构建：采用化学全合成或PCR分步扩增的方法获得wbbL基因敲除片段。其上下游同源臂分别设计在引物中，以工具质粒pDTW202为模板，采用引物wbbL-U-loxLE-kan和wbbL-D-kan直接扩增获得wbbL敲除片段，该敲除片段只含有lox L位点，而不含有lox R位点。wbbL基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

rmlB基因敲除片段的构建：采用化学全合成或PCR分步扩增的方法获得rmlB基因敲除片段。其上下游同源臂分别设计在引物中，以工具质粒pDTW202-cat为模板，采用引物rmlB-U-cat和rmlB-D-loxRE-cat直接扩增获得rmlB敲除片段，该敲除片段只含有lox R位点，而不含有lox L位点。rmlB基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2)敲除感受态的制备及电转化

接种带有Red重组辅助质粒pKD46(Datsenko K A,Wanner B L.One-Stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97(12):6640-6645)的大肠杆菌W3110(ATCC39936)于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃，200rpm过夜培养。按2％接种量转接100mL LB液体培养基，30℃，200rpm培养至OD₆₀₀＝0.2时加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导重组酶的表达，继续培养至OD₆₀₀＝0.5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50mL离心管中，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的10％甘油洗涤3次，最后用1mL 10％甘油悬浮，每管80μL分装至预冷的无菌EP管中。

将500-1000ng wbbL敲除片段加入感受态细胞中，混匀，冰浴15min，1.5kv电击5ms，30℃孵育2h，涂布30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，30℃培养，挑取转化子于含30μg/mL卡那霉素及100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，采用引物wbbL-F和wbbL-R PCR验证结果。正确菌株命名为WJW01ΔwbbL::loxL-kan。

在WJW01ΔwbbL::loxL-kan菌株中进一步敲除rmlB基因，将500-1000ng rmlB敲除片段加入感受态细胞中，涂布30μg/mL氯霉素的LB固体平板，30℃培养，挑取转化子于含30μg/mL卡那霉素及30μg/mL氯霉素的LB液体培养基中培养，采用引物rml-F和rml-R PCR验证结果。

将PCR验证阳性的菌株接种含30μg/mL卡那霉素及30μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，42℃过夜培养，将培养液划线30μg/mL卡那霉素及30μg/mL氯霉素的LB固体平板，37℃培养，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素的敏感性，将含有卡那霉素抗性和氯霉素抗性并对氨苄青霉素敏感的菌株命名为W3110△wbbL::kan△rmlB::cat并保藏。

(3)O-抗原合成基因簇的敲除

步骤(2)得到的菌株W3110△wbbL::kan△rmlB::cat基因组上存在1个lox L位点和1个lox R位点。以此为出发菌株做感受态，转入pKD-Cre质粒(韩雅宁硕士毕业论文《合成不同结构类脂A分子的大肠杆菌的构建》，公开日：2013-12-31)，表达Cre酶，将阳性菌株于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mm ol/L)诱导Cre重组酶的表达，介导lox L和lox R位点特异性重组，不仅删除了卡那霉素抗性标记和氯霉素抗性标记，也删除了wbbL和rmlB之间的所有基因。采用引物wbbL-F和rm lB-R进行PCR验证，将PCR验证正确的菌株42℃热激后划线LB平板，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素的敏感性，选取对三种抗生素均敏感的菌株命名为WJW02并保藏。

精简菌株WJW02的基因型经过PCR验证正确，而对照野生型的片段太长，扩增不出条带，说明精简菌株WJW02的LPS基因簇已经被成功删除。

表4引物序列表

实施例4 精简菌株WJW03的构建

采用上述实施例3中WJW02构建方法，在WJW02基础上进一步敲除胞外多糖合成及转运基因簇(包含wza，wzb，wzc，wcaA，wcaB，wcaC，wcaD，wcaE，wcaF，gmd，wcaG，wcaH，wcaI，manC，manB，wcaJ，wzx，wcaK，wcaL，wcaM，galF共21个基因)，获得WJW03。由于在W3110基因组上，胞外多糖合成及转运基因簇和O-抗原合成转运基因簇紧邻，即galF的紧邻基因为O-抗原合成基因rmlB，因此在单敲除wbbL并已经引入lox LE位点的菌株中继续敲除wza，并引入lox RE，再进行位点特异性重组删除wbbL和wza之间所有的基因和抗性标记基因，最终去除pKD-Cre质粒获得无抗突变株WJW03。具体步骤如下：

(1)wza敲除片段的构建

wza基因敲除片段的构建：采用化学全合成或PCR分步扩增的方法获得wza基因敲除片段。其上下游同源臂分别设计在引物中，以工具质粒pDTW202-cat为模板，采用引物wza-D-cat和wza-D-loxRE-cat直接扩增获得wza敲除片段，该敲除片段只含有lox R位点，而不含有lox L位点。wza基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

表5引物序列

(2)接下来的敲除步骤同实施例3，最终得到菌株W3110ΔgmhD-waaQΔwbbL-rmlBΔgal F-wza，将其命名为WJW03。

实施例5 精简菌株WJW04的构建

采用CRISPR/Cas9敲除的方法，在WJW03菌株中敲除4型荚膜多糖合成基因簇yccC-y mcD(包含yccC，etp，yccZ，ymcA，ymcB，ymcC，ymcD共7个基因)，其中yccC-ymcD基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，验证正确后得到菌株W3110ΔgmhD-waa QΔwbbL-rmlBΔgalF-wzaΔyccC-ymcD，将其命名为WJW04。

敲除过程需要构建1个敲除质粒pTargetF-yccC-ymcD和一个含有上下游同源臂的敲除片段，构建过程具体为：

①通过网站http://crispr.mit.edu/的分析，选取20nt与目的基因靶序列互补的N₂₀序列(参见表6引物pTargetF-yccC-ymcD-F的下划线序列)。

②以质粒pTargetF为模板，使用正向引物pTargetF-yccC-ymcD-F(5’端为步骤(1)中的N₂₀序列)和反向引物pTargetF-R，扩增后去磷酸化并连接得到引入了N₂₀序列的敲除质粒pTargetF-galF-wza。

表6引物序列

③同源臂敲除片段的构建

以W3110基因组为模板，用同源臂引物yccC-ymcD-U-F/yccC-ymcD-U-R，yccC-ymcD-D-F/yccC-ymcD-D-R分别扩增得到上游同源臂和下游同源臂，并用重叠PCR的方法连接，得到基因簇yccC-ymcD的敲除片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)。

表7引物序列

④基因的电转敲除

向大肠杆菌WJW03/pCas感受态细胞中加入100ng敲除质粒pTargetF-yccC-ymcD和500ng敲除片段电转复苏培养。用引物yccC-ymcD-U-F/yccC-ymcD-D-R进行菌落PCR验证(图2)。

⑤敲除质粒pTargetF-yccC-ymcD和温敏质粒pCas的去除

通过IPTG诱导去除敲除质粒pTargetF-yccC-ymcD的酶表达，筛选出对壮观霉素敏感的单菌落，即得到去除pTargetF-yccC-ymcD敲除质粒的突变菌株。将去除敲除质粒的突变菌株接至LB试管，42℃振荡培养，在LB平板上划线分离单菌落。筛选出对卡那霉素敏感的单菌落，即得到去除pCas的无抗突变菌株，将其命名为WJW04。

实施例6 精简菌株WJW05、WJW06、WJW07和WJW08的构建

采用实施例5类似的方法，敲除大肠杆菌WJW04的鞭毛合成及转运基因簇flhE-motA，获得WJW05；采用CRISPR/Cas9敲除系统敲除大肠杆菌WJW05的鞭毛合成及转运基因簇fliY-fliR，获得WJW06；采用CRISPR/Cas9敲除系统敲除大肠杆菌WJW06的鞭毛合成及转运基因簇flgN-flgL，获得WJW07。采用CRISPR/Cas9敲除系统敲除大肠杆菌WJW07的菌毛合成及转运基因簇fimB-fimH，获得WJW08。其中基因簇flhD-motA、fliY-fliR、flgN-flgL和fimB-fimH敲除片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQID NO.11所示。

验证正确后得到菌株W3110ΔgmhD-waaQΔwbbL-rmlBΔgalF-wzaΔyccC-ymcDΔflhE-motAΔfliY-fliRΔflgN-flgLΔfimB-fimH，将其命名为WJW08。

实施例7 菌株WJW08和W3110的细胞形态和生长曲线

LB培养基组成：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L和NaCl 10g/L。

M9G培养基的组成：20g/L葡萄糖(Glucose)，17.1g/L十二水合磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)，3g/L磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，0.5g/L氯化钠(NaCl)，添加1mM硫酸镁(MgSO₄)，0.1mM氯化钙(CaCl₂)，10mg/mL维生素B1(VB₁)。

(1)在LB固体平板培养14h后，进行磷钨酸负染进行透射电镜观察。发现精简菌株的细胞形态较野生型W3110有很大变化。首先野生型W3110的细胞呈杆状，周围有鞭毛结构，菌毛结构和胞外多糖分泌物；而精简菌株WJW08的细胞大小明显增大，约增大1倍，且细胞表面无鞭毛结构、菌毛结构和胞外多糖分泌物，细胞表面和周围较干净。

(2)采用基本培养基M9G培养菌体，并测定其生长曲线。

结果表明：精简菌株WJW08较野生对照W3110生长加快，尤其是对数期，OD600一直高于W3110，甚至高出1倍，进入稳定期时间为10h，与W3110一致，15h时达到最高OD₆₀₀，为3.33，此时较W3110提高15.2％。结果表明一系列膜壁结构相关合成和转运基因簇的删除，使得精简菌株WJW08的生长明显变好，有利于生物量增加，有利于工业生产应用。

实施例8 重组菌W3110/pBHR68、WJW08/pBHR68的构建

(1)质粒pBHR68的构建

质粒pBHR68公开于SCI论文(Spiekermann,P.,Rehm,B.H.,Kalscheuer,R.,Baumeister,D.,Steinbuchel,A.,1999.A sensitive,viable-colony staining methodusing Nile red for direct screening of bacteria that accumulatepolyhydroxyalkanoic acids and other lipid storagecompounds.Arch.Microbiol.171(2),73-80，公开日：1999.01.17)，其含有phaCAB基因簇并含有氨苄青霉素抗性标记，其中phaCAB基因簇含有β-酮基硫解酶、乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶的编码基因。

(2)感受态的制备

分别接种大肠杆菌W3110(ATCC39936)、WJW00～WJW06于LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养。按2％接种量转接到50mL LB液体培养基，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀＝0.5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50mL离心管中，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的0.01M的CaCl₂洗涤3次，最后用1mL 0.01M的CaCl₂悬浮，加入1m 30％甘油混匀，每管200μL分装至预冷的无菌EP管中。

(3)转化

将100-200ng的质粒pBHR68加入感受态细胞中，涂布100μg/mL氨苄霉素的LB固体平板，37℃培养，挑取转化子验证正确后分别命名为W3110/pBHR68、WJW08/pBHR68。

实施例9 重组菌发酵生产PHB

LB培养基组成：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L和NaCl 10g/L。

M9G培养基的组成：20g/L葡萄糖(Glucose)，17.1g/L十二水合磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)，3g/L磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，0.5g/L氯化钠(NaCl)，添加1mM硫酸镁(MgSO₄)，0.1mM氯化钙(CaCl₂)，10mg/mL维生素B1(VB₁)。

(1)种子液培养

分别挑取1环实施例4中得到的重组菌W3110/pBHR68、WJW08/pBHR68菌苔至25mLLB培养基中，并添加100μg/mL氨苄青霉素，37℃、200rpm培养5h至对数中期。

(2)发酵合成PHB

培养方法：将种子液(OD₆₀₀＝1.8左右)按照初始OD₆₀₀＝0.25转接至常规PHB发酵培养基M9G，并加入氨苄青霉素使其终浓度为100μg/mL，37℃、200rpm，发酵48h。

结果表明：精简菌株重组菌WJW08/pBHR68合成PHB占细胞干重比达到81.9％，较野生对照菌提高54倍；细胞干重达到5.03g/L，较野生对照菌提高2.8倍；葡萄糖转化率达到0.356g/g，较野生对照提高147倍。该结果说明精简菌株WJW08可以显著促进PHB的合成，在工业生产应用有良好的应用前景。

表8菌株的摇瓶发酵

虽然本发明以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一株大肠杆菌膜壁精简底盘菌株及其高产PHB的应用

<160> 35

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 310

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Ile Ile Val Thr Gly Gly Ala Gly Phe Ile Gly Ser Asn Ile Val

1 5 10 15

Lys Ala Leu Asn Asp Lys Gly Ile Thr Asp Ile Leu Val Val Asp Asn

20 25 30

Leu Lys Asp Gly Thr Lys Phe Val Asn Leu Val Asp Leu Asn Ile Ala

35 40 45

Asp Tyr Met Asp Lys Glu Asp Phe Leu Ile Gln Ile Met Ala Gly Glu

50 55 60

Glu Phe Gly Asp Val Glu Ala Ile Phe His Glu Gly Ala Cys Ser Ser

65 70 75 80

Thr Thr Glu Trp Asp Gly Lys Tyr Met Met Asp Asn Asn Tyr Gln Tyr

85 90 95

Ser Lys Glu Leu Leu His Tyr Cys Leu Glu Arg Glu Ile Pro Phe Leu

100 105 110

Tyr Ala Ser Ser Ala Ala Thr Tyr Gly Gly Arg Thr Ser Asp Phe Ile

115 120 125

Glu Ser Arg Glu Tyr Glu Lys Pro Leu Asn Val Tyr Gly Tyr Ser Lys

130 135 140

Phe Leu Phe Asp Glu Tyr Val Arg Gln Ile Leu Pro Glu Ala Asn Ser

145 150 155 160

Gln Ile Val Gly Phe Arg Tyr Phe Asn Val Tyr Gly Pro Arg Glu Gly

165 170 175

His Lys Gly Ser Met Ala Ser Val Ala Phe His Leu Asn Thr Gln Leu

180 185 190

Asn Asn Gly Glu Ser Pro Lys Leu Phe Glu Gly Ser Glu Asn Phe Lys

195 200 205

Arg Asp Phe Val Tyr Val Gly Asp Val Ala Asp Val Asn Leu Trp Phe

210 215 220

Leu Glu Asn Gly Val Ser Gly Ile Phe Asn Leu Gly Thr Gly Arg Ala

225 230 235 240

Glu Ser Phe Gln Ala Val Ala Asp Ala Thr Leu Ala Tyr His Lys Lys

245 250 255

Gly Gln Ile Glu Tyr Ile Pro Phe Pro Asp Lys Leu Lys Gly Arg Tyr

260 265 270

Gln Ala Phe Thr Gln Ala Asp Leu Thr Asn Leu Arg Ala Ala Gly Tyr

275 280 285

Asp Lys Pro Phe Lys Thr Val Ala Glu Gly Val Thr Glu Tyr Met Ala

290 295 300

Trp Leu Asn Arg Asp Ala

305 310

<210> 2

<211> 1854

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tccgttacac cttcagcaac ggttttgaac ggtttgtcgt aacccgccgc gcgcagattt 60

gtcagatctg cctgagtgaa cgcctgatag cggcctttca gtttatccgg gaacggaatg 120

tattcgatct ggcctttctt gtgataagcc agcgtagcat cagctaccgc ctggaaggat 180

tccgcacgac cagtaccgag attgaagatg ccggaaacgc cattttccag gaaccacaga 240

ttcacatcag ccacgaattc gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag 300

agaataggaa cttcggaata ggaacttcaa gatcccctta ttagaagaac tcgtcaagaa 360

ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc 420

ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct 480

gatagcggtc cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt 540

ccaccatgat attcggcaag caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg 600

gcatgcgcgc cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt 660

ccagatcatc ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat 720

gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg 780

catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc 840

ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag 900

ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt 960

cattcagggc accggacagg tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca 1020

gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata 1080

gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa 1140

acgatcctca tcctgtctct tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg 1200

gcaagaaagc catccagttt actttgcagg gcttcccaac cttaccagag ggcgccccag 1260

ctggcaattc cggttcgctt gctgtccata aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa 1320

gcccactgca agctacctgc tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc 1380

agtagctgac attcatccgg ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc tacgtgttcc 1440

gcttccttta gcagcccttg cgccctgagt gcttgcggca gcgtgagctt caaaagcgct 1500

ctgaagttcc tatactttct agagaatagg aacttcgaac tgcaggtcga cggatccccg 1560

gaattaattc tcatgtttga cagcttatca ctgatcagtg aattaatggc aagctttact 1620

tgccgtccca ctcggtggtg gaagagcacg cgccttcgtg gaaaatcgct tcgacatcgc 1680

cgaactcttc gccagccata atctggatca ggaagtcttc cttatccata tagtctgcga 1740

tattcagatc caccaggttc acaaacttgg tgccgtcttt caggttgtcc accaccagaa 1800

tatcggtgat gcctttatca ttcagggctt taacgatgtt gctgccgata aagc 1854

<210> 3

<211> 1697

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

agcacgtcaa agtaagtgcg ttatcagtat tcaggtagct gttgagcctg gggcggtagc 60

gtgctttttt ctgcttaact taaccagaca atcacacaaa agagtcgcta gtggaaaagc 120

catttcgaaa aatcctggtc ataaaggaat tcgtgtaggc tggagctgct tcgaagttcc 180

tatactttct agagaatagg aacttcggaa taggaacttc aagatcccct tattagaaga 240

actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa 300

gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 360

acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 420

agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat 480

cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct 540

gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc 600

gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca 660

gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca 720

ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa 780

cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct 840

cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc 900

cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt 960

catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt 1020

caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc 1080

agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag 1140

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atcgccatgt aagcccactg caagctacct gctttctctt tgcgcttgcg ttttcccttg 1260

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ttcaaaagcg ctctgaagtt cctatacttt ctagagaata ggaacttcga actgcaggtc 1440

gacggatccc cggaattaat tctcatgttt gacagcttat cactgatcag tgaattaatg 1500

gcaagcttaa ttatgatcgt ggcgttttgt ttatataaat attttccatt tggtgggctt 1560

caacgtgact ttatgcgcat tgcatcaaca gttgccgcac ggggccacca tgttcgggta 1620

tatacacagt cgtgggaagg cgattgcccg aaagcatttg agcttattca ggtgccagtt 1680

aagtcccata ccaacca 1697

<210> 4

<211> 1342

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

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tcactatagg gcgaattggg taccgggccc taccgttcgt ataatgtatg ctatacgaag 120

ttatttcacg ctgccgcaag cactcagggc gcaagggctg ctaaaggaag cggaacacgt 180

agaaagccag tccgcagaaa cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct 240

ggacaaggga aaacgcaagc gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc 300

gatagctaga ctgggcggtt ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc 360

cctctggtaa ggttgggaag ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga 420

tctgatggcg caggggatca agatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga 480

ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct 540

atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc 600

aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactccaag 660

acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg 720

acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc 780

tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc 840

ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg 900

agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc 960

atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcggatg cccgacggcg 1020

aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc 1080

gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag 1140

cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg 1200

tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg 1260

agttcttctg agcgggactc tggggttcga tagatcctgc gcaccaatca acaaccgtat 1320

cagaatagat actttcttta gg 1342

<210> 5

<211> 1305

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

caacatggct ttcagcagcc agtatttcac gctgccgcaa gtaagttggc agcatcaccc 60

gacgcacttt gcgccgaata aatacctgtg acggaagatc acttcgcaga ataaataaat 120

cctggtgtcc ctgttgatac cgggaagccc tgggccaact tttggcgaaa atgagacgtt 180

gatcggcacg taagaggttc caactttcac cataatgaaa taagatcact accgggcgta 240

ttttttgagt tatcgagatt ttcaggagct aaggaagcta aaatggagaa aaaaatcact 300

ggatatacca ccgttgatat atcccaatgg catcgtaaag aacattttga ggcatttcag 360

tcagttgctc aatgtaccta taaccagacc gttcagctgg atattacggc ctttttaaag 420

accgtaaaga aaaataagca caagttttat ccggccttta ttcacattct tgcccgcctg 480

atgaatgctc atccggaatt ccgtatggca atgaaagacg gtgagctggt gatatgggat 540

agtgttcacc cttgttacac cgttttccat gagcaaactg aaacgttttc atcgctctgg 600

agtgaatacc acgacgattt ccggcagttt ctacacatat attcgcaaga tgtggcgtgt 660

tacggtgaaa acctggccta tttccctaaa gggtttattg agaatatgtt tttcgtctca 720

gccaatccct gggtgagttt caccagtttt gatttaaacg tggccaatat ggacaacttc 780

ttcgcccccg ttttcaccat gggcaaatat tatacgcaag gcgacaaggt gctgatgccg 840

ctggcgattc aggttcatca tgccgtctgt gatggcttcc atgtcggcag aatgcttaat 900

gaattacaac agtactgcga tgagtggcag ggcggggcgt aattttttta aggcagttat 960

tggtgccctt aaacgcctgg tgctacgcct gaataagtga taataagcgg atgaatggca 1020

gaaattcgaa agcaaattcg acccggtcgt cggttcaggg cagggtcgtt aaatagccgc 1080

ttatgtctat tgctggttta ccggtttatt gactaccgga agcagtgtga ccgtgtgctt 1140

ctcaaatgcc tgaggccagt ttggggttcg ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaac 1200

ggtaccgcgg tggagctcca gcttttgttc cctttagtga gggttaattg cgcttaattt 1260

attccatatt acttcagagc atgctgtgaa ataagcggct ctcag 1305

<210> 6

<211> 1295

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cagggcctgt aattgaacgg tcaacatggc tttcagcagc caggtgcatc actgcatccg 60

gctgatgctg agcaaaaatc cgtgccattg caggtgcatc gcaaatatcc gcatgttcaa 120

aaacatagcg ttcagaatca gaaacatcag caagtgattc ccggtttccg gcgtacgtta 180

atttatcgac attaacaaca ctatcctgcg tattatttat aatgtgacga actacagctg 240

aaccaataaa tcctgcgcca ccagtaacaa gtattttcac ttaatttatt ccatattact 300

tcagagcatg ctgtgaaata agcggctctc agtttgatta atagaggtat taatgcacgc 360

taccgcccct ggctttacag ctaccagagc actgcatgca tgcctatgat gtgacgagcg 420

ttacccactc gcgctaaacc cgaaaaattc aaacgctaat tgtcttacca atccgctctg 480

gaaacaagga aaatcctgga aaactttgaa taaaacccta ctgctaactc gttgttattc 540

tgatggttta tataaaacaa cggcaggaag attcgcaaca aattactttt gctgcgaatt 600

ttcactgccg ttataatttt cttatcaacc gttacatccg gtcagatttt caggcatcaa 660

tttcattttg gatttcatca ttgtttattt atcactttgg cagagtaatt atcctgtgca 720

ctattaatag caatgtcgcc atgcacattt accttgcagt taattgaata aaaatttaac 780

tggcatcagt cctaaaaaaa ttgatttcat ccgcaggcta ttgacagaat aattcagact 840

ggtctttcag gcatccagac acgctaccgc ccctggcttt ttagctacca atacactgat 900

ttagtttaat ttttcacacc ctctcagcat gcagtcgttg atgagaaagg gttattacgg 960

aaattaactt ccgaatataa ggtgacatta tggtaattga atattggctt tccaataatg 1020

caggaggaag tgttacagct aacggaatag caggcaagat aacaattcgg taattggcta 1080

tttttaagaa ttatattaag tgtcattcaa tatggttttt aggagtttct ttaggttgac 1140

aatatttaat atagtgtctc cacatgcgat atttcttaaa taatgtttta ttattaccac 1200

ttttaattca gggataatgt gaggttatta ccctcaaata atatgagata aatagtgctg 1260

caacattgca tttttgcccc gatttatcca tgatc 1295

<210> 7

<211> 1164

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

cgccaccccg ttattagatt tgatcaagac agcgttgacg ccccatccac cgcaaaaaca 60

ggcgtatggt gtgacattac ccacttcagt gctgtttatc gccggacacg atactaatct 120

ggcaaatctc ggcggcgcac tggagctcaa ctggacgctt cccggtcagc cggataacac 180

gccgccaggt ggtgaactgg tgtttgaacg ctggcgtcgg ctaagcgata acagccagtg 240

gattcaggtt tcgctggtct tccagacttt acagcagatg cgtgataaaa cgccgctgtc 300

attaaatacg ccgcccggag aggtgaaact gaccctggca ggatgtgaag agcgaaatgc 360

gcagggcatg tgttcgttgg caggttttac gcaaatcgtg aatgaagcac gcataccggc 420

gtgcagtttg taatgcataa aaaagagcat tcagttacct gaatgctctg aggctgatga 480

caaacgaaga actgtctaat gcgtagaccg gaaaaggcgt tcacgccgca tccggccact 540

ttcagtttta ctctttctcg gagaggattg cagaaagctt gtgtttcata acttttcctt 600

tattcatcgc atggacaata cgggtgatgc tgccaactta ctgatttagt gtatgatggt 660

gtttttgagg ttctccagtg gcttctgttt ctatcagctg tccctcctgt tcagctactg 720

acggggtggt gcgtaacggc aaaagcactg ccggacatca gcgctatctc tgctctcact 780

gccgtaaaac atggcaactg cagttcactt acaccgcttc tcaacccggt acgcaccaga 840

aaatcattga tatggccatg aatggcgttg gatgccgggc aacagcccgc attatgggcg 900

ttggcctcaa cacgattttc cgccatttaa aaaactcagg ccgcagtcgg taacctcgcg 960

catacagccg ggcagtgacg tcatcgtctg cgcggaaatg gacgaacagt ggggatacgt 1020

cggggctaaa tcgcgccagc gctggctgtt ttacgcgtat gacaggctcc ggaagacggt 1080

tgttgcgcac gtattcggtg aacgcactat ggcgacgctg gggcgtctta tgagcctgct 1140

gtcacccttt gacgtggtga tatg 1164

<210> 8

<211> 1629

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

cgtgagagtg aagcctgatc agggttagcc gatcaggctt ttttattgcc atctaaatgt 60

attctgaaaa tggacatgcc attgttttct cactgttgga taagaggcca gaagcgtaat 120

atccggcccc agggaaacga taacggttga atttaaggaa taccgcagtg tttaaatttc 180

ttgtattaac attaggcatt atctcttgcc aggcttacgc agaagatacg gttatagtaa 240

acgaccatga catttcagcc atcaaagatt gttggcaaaa aaattcagat gatgatactg 300

acgttaacgt gatcaaatca tgcctgcgac aagaatacaa tctcgtcgat gcgcaattaa 360

ataaagccta tggtgaagct tatcgttata tagaacaagt gccacgcaca ggtgtaaaaa 420

aacctgatac cgaacaactt aacttgctta aaaaatcaca gcgagcctgg ctggatttta 480

gggacaaaga atgtgaatta atcctttcaa atgaggacgt tcaggattta agtgaccctt 540

attctgaatc agaatggctc tcatgtatga tcatacagac caatacgcga actcgccagt 600

tgcagctata ccgtaactct gaagattttt atccaagccc tttgacaaga ggataattca 660

catctttttg gcatgttttg ttgcaagcta ttcctgataa ataattgcaa caagacatcg 720

agcctttttc actgagttat taaacatact cgcgagcgcg taattttttt gtccttccga 780

catcatcctt ccactgttga ccatgacagg atgttcagtc gtcaggcgtt aacgcgcgat 840

tggggcaaaa aaaagcagcg gtacgtcgtt accgctgctg gaatgttgcg cctcaccgta 900

tcagttaaac agcctgtact ctctgttcat ccagcagttg tgggataata tcggcaggat 960

tctgggaaag tttacgtctt tttactgccc gggatggcgg ttgacataag ctgcaggcaa 1020

agctgccaac aggctggtga gcgtgggtaa taaaattgcc gccgcagcag ttgcagctgg 1080

aaagttgcag taatccactt tcaacaaacc gcaccaatgt ccaggcacgg gttaatgcca 1140

gcagtggtcc ttcttctgct tgtgggcact gttcaaggta taaacggtag gctttgatca 1200

ccgcatcgac gccattacac aaaccggttt tcagtaaaaa ctgccatgca ttacagaaca 1260

tcgaagcatg aacgttttgt tcccaggtca taaaccagtc ggttgagaat ggcagcatgc 1320

ctttcggcgg tgggcttccg cgcagttctt tataaagttt tatcaggcgt ccgcgactta 1380

actgtgtttc gctttccagc atctgcaaac gagcgcccag ggtgatcaat tccattgcca 1440

gctgaatatc ccgcgcttcc tgaacaatgc ttttttcact catgatcagg cccttttctt 1500

gcgcagcgct tcttcaggct gattaacatc attcagcaag cgtgttgaga gcatgatgcc 1560

ggtatgaatt tgctggagat cgtcaacgcg ggaatcttgc gtcaactgag taatcgtctg 1620

gtggctgtc 1629

<210> 9

<211> 1099

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

caagagcatt agaaccgcca accggaatga catacgggcg aaagccttgt gcttcgactc 60

gcgtcgccag ctcttccagt tgggcattgg gatcggtcag tgcgtcgcac atttcaatct 120

gggtattgaa cagatccagc aacaagcgat tgccgttggt taaatagttt tctgcggttg 180

tgccaatagg attttccagc agcgccacgc agtgcagacc gagtttggca gcgactgcgg 240

cagtctgccg cacatggtta gactggatcg ccccggcagt aatcagcgta tcggcacctt 300

cacgcagagc atctgccgcg agaaattcca gcttacgtaa tttattgccg cccattgcca 360

tgggggtgac gtcatcccgt ttgatgaaaa tttcccgtcc tagataatca gaaaagcgcg 420

gcagatattc gagcggcgtt ggcgcgccga taaactccag ccgtggaaaa cgggttaaat 480

tatgcagtgg cataacagcc tccgatgtgt gttgttgtga ttttcttatt atgcacgctg 540

aaaacgcgta aataaaaaag gcgctagtga aagcgccctt ttttgtcatt atgctgattc 600

cgtaacgttt atcatgttat cctaaggatt atccgaaaaa taatacctac gaacatcttc 660

caggatactc ctgcagcgaa atatttgttt taagctcact cacatatcgc aacatttact 720

ttactttaag acaattccag gcaaattata caacacttta cgggatagta agtccgcctg 780

aaaaatcgcg agagtggcgc attaggtgac ccatgttgtt ccgtttagtc atgatgaaat 840

attcaggtaa ggggaattat cgttacgcat tgagtgaggg tatgccatgt caacgattat 900

tatggattta tgtagttaca cccgactagg tttaaccggg tatctgttga gtagaggggt 960

taaaaaaaga gaaatcaacg acattgaaac cgttgatgac cttgccatag cttgtgattc 1020

acagcgccct tcagtggtgt ttattaatga ggactgtttc atccacgatg cttctaacag 1080

tcagcgtatc aagctcatc 1099

<210> 10

<211> 1273

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gggttgcgtc tttgtttcct gttggcgctg ccgagtgcgg ttgcgttggg cattctttcc 60

ggtccgttga ccgtttcgct gttccagtac ggtaaattta ccgcgtttga tgcgctgatg 120

acccagcggg cgttaattgc ctactcggtg ggtttgattg gcctgattgt agtgaaagtg 180

ttggctcctg gcttttattc ccgccaggac attaaaacgc cagtgaaaat tgccatcgtt 240

acgctgattt taacgcaatt gatgaacctg gcgtttattg gtccgttgaa acatgccggg 300

ctgtcacttt ctattggtct ggcggcgtgt ctgaatgctt cgctgcttta ctggcagttg 360

cgtaagcaga aaatctttac cccgcaaccc ggctggatgg cgtttctgtt gcgtctggtg 420

gtggcggtac tggtgatgtc tggcgtgctt ttaggtatgt tacatatcat gccggagtgg 480

tcattgggta ccatgccctg gcgtttactg cgtttaatgg cggtcgtgct ggcggggatt 540

gccgcgtact tcgctgcact ggcggtactg ggcttcaaag ttaaagaatt tgcccgccgg 600

acggtgtaac aatgcattcc ggcctgcagt gcaggccgga gataatcttc agatcgctct 660

tccagctcag caaataattt cgctttaaaa catatcatga aactgggtat gttttgtctg 720

cctgctctgg gatcgctggg gcgggcattt ttttgcctat tttgcattgt tggttagcaa 780

ggatgccatt cgatgaattt taatatgttg attcaaagat gaaataaaaa agccctggca 840

gttaccaggg cttgattact ttgagctaat tattactcaa caggttgcgg acgcgcagga 900

gcggcagagg catgatgtgt tgccgtatga ccacctgcgg cacctttacc ttcgaaggca 960

aaagtagggc gctgccagtc actgtgacgc ggtgcctccg gaacatattc cggtgctgga 1020

gcgcgcgtca ttggcgcggt agcgtggtta tgctcaacgg tgacctcagg ttcgaccgca 1080

gctaccgttt caacttctgc tgcgacttca gcgactactg gcgcggcagg ttgagcaaca 1140

acttcaggtt cagcaactac aacctcagca gtttcgacaa cttcttcaat atctgccgtc 1200

tcttcctgcg gttcaaccac cggttctgct tgttctgcaa cttcctgggc tacggcaaca 1260

tcagactcgg taa 1273

<210> 11

<211> 1894

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

aacacttgcg gtggtcttca aaaactaaag atcttagttt aactatttgt tttataaata 60

atttattaag agtctaaaca aggggagctt tgcaagctaa ctcagtgagc ttggtgaaaa 120

tcagtgttta cccgccatca ggctgagcat aattctcatc atgaaatatg tttcctggtt 180

tgtggcttgt aactggtcac ttctgaagtc gatctggaga ggcttgttga tgttggtgtt 240

ttcaggatga tgtttcactt agtttgtttg ccgtatcgcc cggcgaatgg ctgtgattga 300

ggaaggttta agtcgtagtg accaaagcta tatttaccaa cgaatgtaga tgaaaaaatc 360

atctcctgcg ttcccccata tctctaggat aaaaaggaat gtaacaatct catggcgtaa 420

gctgacgaat cagcaggaat aatcgctagg gacctaagaa ttagcatgat aatagccact 480

aagaaattac tgcgctccat gaaatagcca ttttgtggca aatggagttg actaataatg 540

tcatatgtga gacggctagt tgaacgaata ttaaattttg ctgaattttt tatgttgatt 600

ttacttgtta cagaacatat cacatgatat atagataaga ttagttgcat taatgatgag 660

ggttattatt agattcgtat ccgattgata aatatataaa ggtacatagc atgcaagagc 720

atggcgtttg tatggcaacg ttattataat taacagttgc tactccattt aagttcactc 780

agaagaactg gtccacttac gttagttatt aagcaaacgt tcgcttttat aaacataatc 840

aggataaaaa tgttggatta ttgctaaccc agcacagcta gtgcgcgtct gtaattataa 900

gggaaaaacg atgaagaata aggctgataa caaaaaaagg aacttcctga cccatagtga 960

aatcggcggt gagtctggga ttaacggcaa attatgcacg taccggaggg caggtgactg 1020

cagggaatgt gcaatcgatt attggcgtga cttttgttta tcaataaaga aatcacagga 1080

cattgctaat gctggtacgc aatattacct gaagctaaaa acctgcacgt tagccctttg 1140

taggccagat aagacgcgtc agcgtcgcat ctggcataaa caaagcgcac tttgctggtc 1200

tgttcccctc accctaaccc tctccccgga ggggcgaggg gactgtccgg gcacattttt 1260

agactttgtc atcagtctga gcctgccatt ggcaggctct ggtgtccttt tacgctacca 1320

tgctaataat cagcacaata atcagcccaa ccacggagtt gaccagctcc agcagacccc 1380

aggttttcaa cgtgtctttt actgacaggt caaagtaacc tttgaacaac cagaaagatg 1440

catcgttaat gtgggtgagg gtgttggaac ccgcagccgt cgccagtacc agcagcgccg 1500

gattcacgcc aaccagctga ccagttgctg gatctaggat tgcagcactg ataatcccgg 1560

cggcggtcat cgccgaaacg acaccctgac ccgtcgccag acgaattagc acagtgatca 1620

gccatgccat gatgtagggc gagatattgc cgtgggacat caacatgccg atggtgtcgc 1680

caatgccggt gtcgatgatg gtctgcttca gcacgccacc cgcaccgatg atcagaatca 1740

ccattgcaat actcttcacc gcgctttcaa aagcgttcat cacccactgc atgtcatgac 1800

cacgtgcggt gccaaagagt acgaatgcaa ccaccatcgc aataaacatt gcaatcggcg 1860

aggaaccgat aaagttaacc acttcccagg cagg 1894

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ccgctcgaga gcacgtcaaa gtaagt 26

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

aaaactgcag gctttatcgg cagcaaca 28

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

tcccccgggg taagttggca gcatcacccg acgca 35

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

tcccccggga actggcctca ggcatttgag aag 33

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

tcccccgggt ggggttcgat aacttcgtat 30

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

tcccccgggt tgcggcagcg tgaaataac 29

<210> 18

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

acttattaaa gtataaatag cttatccatg cttatatgct tacggcttta taaatacgac 60

tcactatagg gcg 73

<210> 19

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

cctaaagaaa gtatctattc tgatacggtt gttgattggt gcgcaggatc tatcgaaccc 60

cagagtcccg 70

<210> 20

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

taaatgccgc agggcctgta attgaacggt caacatggct ttcagcagcc agtatttcac 60

gctgccgcaa cc 72

<210> 21

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

ctgagagccg cttatttcac agcatgctct gaagtaatat ggaataaatt aagcgcaatt 60

aaccctcact aaag 74

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

tcccatcact gccataccga 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

tcgggcggac caaatgatac 20

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

cgcgtaagct gtcgtctcag ta 22

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

tcataggcat gcatgcagtg c 21

<210> 26

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

taagaacgtc ccccggcccg acgcgatact ggtaattcgc gatctcactt tatttcacgc 60

tgccgcaacc 70

<210> 27

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

gctattaata gtgcacagga taattactct gccaaagtga taaataaaca gcgcaattaa 60

ccctcactaa ag 72

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

actacgtgga ccttgccgat 20

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

gatgcctgaa agaccagtct g 21

<210> 30

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

actggttcgt agcgcacgta gttttagagc tagaaatagc 40

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 31

actagtatta tacctaggac tgagc 25

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 32

cgccaccccg ttattagatt tg 22

<210> 33

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 33

gaaacacaag ctttctgcaa tcctctccga gaaagagtaa aactgaaag 49

<210> 34

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 34

ctttcagttt tactctttct cggagaggat tgcagaaagc ttgtgtttc 49

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 35

catatcacca cgtcaaaggg 20

Claims (10)

1.一种生产聚3-羟基丁酸酯(PHB)的重组菌，其特征在于，敲除大肠杆菌基因组上脂多糖的核心糖基因簇gmhD-waaQ和O-抗原基因簇wbbL-rmlB，胞外多糖基因簇galF-wza，4型荚膜多糖合成基因簇yccC-ymcD，三个鞭毛基因簇flhE-motA、fliY-fliR、flgN-flgL，和一个菌毛基因簇fimB-fimH；并将β-酮基硫解酶，乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶的编码基因转化到菌株中。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌W3110。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鞭毛基因簇flhE-motA包含flhE、flhA、flhB、cheZ、cheY、cheB、cheR、tap、tar、cheW、cheA，motB，motA，共13个基因；所述鞭毛基因簇fliY-fliR包含fliY，fliZ，fliA、fliC、fliD、fliS、fliT、amyA、yedD、yedE、yedF、yedL，yedN，yedM，intG、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliJ、fliK、fliL、fliM、fliN、fliO、fliP、fliQ、fliR共30个基因；所述鞭毛基因簇flgN-flgL包含flgN、flgM、flgA、flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgH、flgI、flgJ、flgK、flgL共14个基因；所述菌毛基因簇fimB-fimH包含fimB、fimE、fimA、fimI、fimC、fimD、fimF、fimG、fimH共9个基因。

4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述β-酮基硫解酶的protein ID为QBK40993.1；所述乙酰辅酶A还原酶的protein ID为QBK40994.1；所述PHB合成酶的proteinID为QBK40992.1。

5.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述转化是将含有β-酮基硫解酶、乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶的编码基因的PHB合成基因簇phaCAB连接到表达质粒上后，转化到宿主大肠杆菌中。

6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述基因簇phaCAB的序列的NCBI登录号为“QBK40992.1”。

7.一种生产PHB的方法，其特征在于，所述方法是应用权利要求1～6任一所述的重组菌进行发酵生产。

8.根据权利要求7所述的方法，所述发酵生产是将所述的重组菌接种到发酵培养基中，以葡萄糖为底物，进行发酵生产。

9.根据权利要求8所述的方法，所述发酵培养基的组成包括：20g/L葡萄糖，17.1g/LNa₂HPO₄·12H₂O，3g/L KH₂PO₄，0.5g/L NaCl，添加1mM MgSO₄，0.1mM CaCl₂，10mg/mL维生素B1。

10.权利要求1～6任一所述重组菌或权利要求7～9任一所述方法在药物制备、材料或环保领域的应用。