CN1182242C - 一种生态安全型根瘤菌制剂生产工艺与方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物根瘤菌分子生物学技术领域。其特征在于提出一种生态安全型根瘤菌制剂的生产工艺和方法，该根瘤菌只能在人工控制条件下生长繁殖并发挥其作用，在土壤、河流、湖泊和海洋等自然环境中将因得不到必需的营养物而死亡。本发明的要点是通过根瘤菌必需基因突变株的筛选，必需基因purL结构基因的克隆，诱导表达purL基因的克隆，从而构建、筛选得到生态安全型重组根瘤菌，以该菌为原料制成一种生态安全型根瘤菌制剂。

Description

一种生态安全型根瘤菌制剂生产工艺与方法

技术领域

本发明属于农业微生物应用技术领域，涉及根瘤菌分子生物学技术领域及其制剂的创制。

背景技术

根瘤菌是能与豆科植物共生固氮的土壤微生物。在伯杰氏细菌鉴定手册(第8版，1977)中，属于根瘤菌科(Rhizobiaceae)的根瘤菌属(Rhizobium)。近年来，随着研究工作的深入，已进一步细分出根瘤菌属、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、中生根瘤菌属(Mesorhizobium)和固氮茎瘤菌属(Azorhizobium)等5个属，共17个种。

根瘤菌在培养条件下为革兰氏染色负反应(G-)的杆菌，大小0.5-0.9×1.2-3.0μm，有单生、侧生或周生鞭毛，能运动。由于含有折光性的多聚β-羟基丁酸颗粒性贮藏物质使细胞染色不均匀而呈环节状，细胞外多含有粘液性物质而使菌落呈无色粘液状。

根瘤菌在与植物共生的根瘤中多发育分化为膨大的棒状、T形、Y形或X形等类菌体，利用豆科植物提供的碳源和能源发挥固氮作用，并以氨态、酰脲或酰胺态形式为植物提供氮素养料。

根瘤菌系化能异养微生物。一般能利用多种糖类、多元醇和有机酸，合适的碳源有葡萄糖、甘露醇、蔗糖和甘油等。能利用无机氮化物(NH₄ ⁺和NO₃ ^-)，但加有机氮化物(如豆芽汁或酵母汁)时能更好生长。多数根瘤菌需要维生素类生长因子(如硫胺素、泛酸钙、尼克酰胺和生物素等)。常用的根瘤菌培养基有甘露醇酵母汁培养基(YMA，Bergersen，F.J.1961.The growth of Rhizobium insynthetic media.Austr.J.Biol.14：349-360)、豆芽汁培养基(SSB)和基本培养基(SM，张忠明，陈华癸，李阜棣，紫云英根瘤菌基因文库的构建及含完整结瘤基因的重组质粒pRaZ15的分离。生物工程学报，1991，7(3)：213-219)等。

根瘤菌属于中温性有机营养型微生物，其最适生长温度为25-30℃，在35℃以上的高温条件下多停止生长。

根瘤菌与豆科植物的共生关系具有专一性并表现为互接种族关系，即特定类群的根瘤菌只能感染一定种类的豆科植物，只有属于同一互接种族的植物才能互相利用其根瘤菌结瘤固氮。

本发明所用的大豆根瘤菌为费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)，抗萘啶酮酸和青霉素，世代时间为2.7小时。

必需基因或看家基因(housekeeping gene)系指生物生存必需的基因，它们一般参与控制生物的主要代谢过程，必需基因的突变或缺失将导致生物对该基因参与控制代谢产物的依赖，一旦环境或培养基中缺少该代谢产物，将导致突变生物的死亡。

Bertino和Stacey(1966)报道可以用氨基喋呤(aminopterin)或三甲氧苄二氨嘧啶(trimethoprim)与野生型大肠杆菌共培养来富集并筛选出嘧啶缺失突变株(J B Bertino and K A Stacey，1966，.Asuggested mechanism for the selective procedure for isolating thymine-requiring mutants of Escherichiacoli.Biochen J，101：32-33。

Quandt和Hynes(1993)构建成适用于G^-细菌基因定位置换的自杀性重组质粒pJQ200、pJQ210和pJQ254，特别适用于进行G^-细菌必需基因的定位诱变以简化突变株的筛选方法(Quandt，J andHynes M F.，1993，Versitile suicide vectors which allow selection for gene replacement in Gram-negativebacteria，Gene，127：15-21)。

上述经自发或诱发突变获得的生活力下降的病原微生物已被长期用于动物或人的免疫预防接种。Straley等(1984)比较研究了具有代谢缺陷的鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)弱毒株的生存能力(S C Straley et al.，1984，Growth in mouse peritoneal macrophages of Yersinia pestis lackingestablished virulence determinants，Infection and Immunity，45(3)：649-654)。

Noriega等(1994)用编码芳香族氨基酸合成酶基因aroA缺失的志贺氏菌(Shigella sp.)突变株作免疫原接种，证实它们能与野生型菌株一样诱发抗体的产生^[4]。伯纳得斯等(1993)向中国专利局提出了名为“一种含有伪狂犬病病毒突变株的疫苗”的专利申请(专利申请号为93108805)，该专利以病毒糖蛋白gp50突变株生产疫苗，可有效预防动物的伪狂犬病。Gicguel等于1998年向美国专利局提交了名为“用作疫苗免疫原的弱化重组分枝杆菌”的专利申请(专利申请号6261568)。该专利采用基因定位置换法筛选获得了结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)嘌呤合成酶必需基因purC突变的弱毒株。突变株用于免疫注射时虽然降低了增殖能力，在哺乳动物体内的存活时间仍然能引起与野生型菌株相同的免疫反应(Gicquel B et al，1998，Attenuatedrecombinant mycobacteria useful as immunogens or as vaccine components，United States Patent6261568.)。

随着近代分子生物学与基因工程技术的发展，一大批转基因的重组微生物制剂已获得有关基因工程安全管理机构的批准进入小区试验、环境释放或商品化生产。虽然重组微生物制剂在批准前已逐级进行了严格的安全性试验，证明它们的释放没有对环境中的其它生物产生可以检测到的影响，但是仍难于排除由此而产生的生存竞争及其对其它环境生物的潜在威胁，尤其是当重组微生物带有抗性基因标记时，重组微生物在环境中的存在将始终存在抗性基因向土著性微生物或其它环境生物转移的可能性。

发明内容

本发明的目的在于提出一种生态安全型根瘤菌制剂的生产工艺和方法，该根瘤菌只能在人工控制条件下生长繁殖并发挥其作用，在土壤、河流、湖泊和海洋等自然环境中将因得不到必需的营养物而死亡。

本发明通过以下技术方案实现：

采用分子生物学方法与技术，构建和筛选费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)嘌呤合成酶基因purL的突变株，该突变株只能在供给该必需基因产物嘌呤的人工培养条件下生长繁殖，一旦释放到不含嘌呤的环境中时将因得不到该代谢产物而死亡。为了克服费氏中华根瘤菌突变株只结瘤不固氮的缺陷，本申请采用基因工程技术，从费氏中华根瘤菌中用PCR扩增法钓出该嘌呤purL的结构基因，按以下技术路线构建生态安全的费氏中华根瘤菌：将已报道的根瘤菌诱导型固氮酶调节基因fixK启动子和purL结构基因一道克隆到可在大肠杆菌和费氏中华根瘤菌细胞内复制的穿梭质粒载体上，将获得的重组质粒导入上述PurL突变株即可筛选获得生态安全的重组费氏中华根瘤菌。该重组根瘤菌在人工培养或工业化生产时，可以用含有嘌呤的完全培养基生产接种剂。接种后与豆科植物形成根瘤的共生条件可以诱导fixK启动子启动purL基因的表达而恢复其共生固氮作用。一旦重组根瘤菌释放到环境中之后，将由于缺少嘌呤营养物而不能生长，并且很快从环境中消亡。

以下对本发明作进一步描述：

一种构建并筛选生态安全型重组根瘤菌的的方法，其特征包括如下步骤：

(1)根瘤菌必需基因突变株的筛选：

以费氏中华根瘤菌生产菌株为出发菌，采用定位诱变将发光酶标记基因luxAB插入purL基因并克隆到不能在根瘤菌细胞内复制的自杀质粒上，经转化导入供试根瘤菌后，可以从野生型出发菌中筛选获得稳定的嘌呤合成酶基因缺陷的PurL-突变株；

(2)必需基因purL结构基因的克隆：

根据已报道的purL基因的编码区5’和3’端序列再加上与拟用克隆载体的克隆位点相适合的限制性内切酶位点设计并合成出一对引物，从供试菌基因组中扩增出purL基因的结构基因，经与同样双酶切并能在根瘤菌和大肠杆菌细胞内均能复制的穿梭载体连接后转化大肠杆菌，筛选获得含有purL结构基因重组质粒的转化子，从中分离出以purL基因为报告基因的启动子探针载体；

(3)诱导表达purL基因的克隆：

在基因信息库上查出费氏中华根瘤菌共生条件下诱导表达的fixK基因启动子区的DNA序列，根据purL结构基因和穿梭载体的要求设计并人工合成出含有相应双酶切位点的诱导型启动子序列，用于与经同样双酶切的(2)步骤中所构建的启动子探针载体连接，构建成含有诱导表达purL基因的重组质粒。

(4)生态安全型重组根瘤菌的构建与筛选：

用步骤(3)中获得的含诱导型表达purL基因的重组质粒转化在步骤(1)中得到的PurL-突变株，在编号为SM的基本培养基和YMA平板上筛选转化子，只有在YMA上生长、在SM上不生长者才是需要的生态安全型重组费氏中华根瘤菌。

(5)盆栽实验：

用步骤(4)中获得的生态安全型重组费氏中华根瘤菌与植物进行盆栽实验，应使植物生长状况和干重与野生型菌株相似，并且随时间延长在土样中检测菌数明显小于野生型菌株。

附图说明

图1，是本发明的基因置换载体pHN701的物理图谱。

本发明的效果：

与常用的根瘤菌制剂相比，本发明的生态安全型根瘤菌菌剂的优点如表1所示：

表1本发明的根瘤菌菌剂与常用根瘤菌菌剂性能比较

序号        比较项目              生态安全型根瘤菌剂      常规根瘤菌剂

1           生存性                可诱导调节              不可调节

2           对环境安全性          高                      低

3           标记基因              有                      无

4           在环境中的追踪检测    容易                    困难

5           抗性基因转移性        无                      难于彻底排除

具体实施方式

实施例：

一.材料与方法

1.菌株与培养条件：

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α和S17-1(转移供体宿主菌)用LB液体或固体培养基在37℃培养。费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HH103在完全培养基TY(Beringer，J.E.J Gen.Microbiol.1974(84)：188-198)或基本培养基SM中于28℃培养。费氏中华根瘤菌腺嘌呤缺陷型在完全培养基TY或添加腺嘌呤(50μg/ml)与维生素B1(0.1μg/ml)的SMAV培养基中培养。

抗生素用量对于大肠杆菌为：庆大霉素20μg/ml，氨苄青霉素100μg/ml；对于根瘤菌为：链霉素200μg/ml，庆大霉素20μg/ml。

筛选同源双交换时培养基中添加蔗糖用量为10％。

2.大肠杆菌与根瘤菌间的接合转移：

含有目的质粒的大肠杆菌S17-1经活化后在LB液体中培养至对数中期，与活化后在TY液体培养至对数中期的根瘤菌HH103等体积混合，菌体用TY液体洗涤三次后用小量TY液体悬浮，滴加在铺于TY平板上的微孔滤膜上，28℃下静置1-2天，用无菌水稀释涂在含所需抗生素的SM平板上，挑取长出的菌落作相应的分析。

3.质粒DNA的抽提与克隆操作：

参照《分子克隆实验指南》介绍的方法。

4.植物土培盆栽结瘤试验：

供试大豆品种为黑农33和鄂豆4号，土壤为经121℃30分钟灭菌的黄棕壤，用市售灭菌盆栽花瓷钵作盆栽试验，大豆经表面灭菌催芽后播种，并接种100倍稀释菌剂1ml。在光照室培养，需要灌水时用无菌水补至原盆钵重。

二.操作步骤：

1.基因置换载体pHN701的构建：

费氏中华根瘤菌L178(pMUS509)中含有携带有purL全基因(GenBank Accession number：AF275718)的pMUS509质粒。设计PCR引物，左端从purL结构基因开始，带有XbaI位点，序列为：ACATCTAGAACGATGACGATTTCCAACACC，右端在purL转录终止子以后带有EcoRV位点，序列为：CATGTCTTCGCTATCGCCTG。用该引物对以pMUS509为模板，采用高保真pfu酶，扩增出含purL结构基因的DNA片段，全长约2.4kb。PCR条件为：96℃预热3分钟，再以96℃1分钟，57℃2分钟，72℃4分钟循环25次，最后72℃10分钟。扩增产物经纯化后用XbaI和EcoRV双酶切并与同样双酶切的pUCM-T载体进行连接，得到重组质粒pHNPURL1。pHN101(李友国，李杰，刘墨青，周俊初，导入dctABD和parCBA/DE基因提高大豆慢生根瘤菌固氮效率和稳定性的研究。遗传学报.2000，27(8)：742-750)质粒上携带有约3.3kb的luxAB片段，可用BglII切下，经纯化后与BglII酶切的pUCM-T载体相连，得到重组质粒pHNLUX1，再用NotI和XhoI双酶切下luxAB片段，与经同样双酶切的pHNPURL1载体连接，可得到pHNPURL2载体，purL结构基因中的NotI-XhoI片段已被luxAB取代，造成基因的缺失破坏。再用XbaI和KpnI酶切下4.7kb已插入luxAB的purL片段，与同样酶切的pJQ200KS(Quandt，J.，and M.F.Hynes.Versatile suicide vectors allow direct selection for genereplacement in Gram-negative bacteria.Gene，1993，127：15～21)载体相连，得到基因置换载体pHN701(由图1所示)。

2.腺嘌呤缺陷型突变株的筛选：

用pHN701转化大肠杆菌S17-1((Quandt，J.，and M.F.Hynes.Versatile suicide vectors allow directselection for gene replacement in Gram-negative bacteria.Gene，1993，127：15～21)，活化后在LB液体中培养至对数中期，与培养至对数中期的S.fiedii HH103(Gil-Serrano，A.M.；Rodriguez-Carvajal，M.A.；Tejero-Mateo，P.；Espartero，J.L.；Menendez，M.；Corzo，J.；Ruiz-Sainz.Structural determination of a5-acetamido-3，5，7，9-tetradeoxy-7-(3-hydroxybutyramido)-L-manno-nonulosonic acid-containinghomopolysaccharide isolated from Sinorhizobium fredii HH103.Biochem.J.，1999，342：527-535)等体积混合后加2ml无菌水，将菌液均匀涂在SMAV固体培养基上，28℃培养一周，长出的菌落经在TY平板活化，共得到9个可能发生了单交换的菌株。选取5个在SMVA中培养24小时，菌液稀释至10-3，均匀涂在添加了10％蔗糖的SMAV平板上，同时设置不加蔗糖的平板作为对照。培养7天后可以发现在5个含蔗糖平板上各长出23、40、9、6和38个菌落，而不加蔗糖平板上的菌落数均达104左右，这些在蔗糖平板长出的菌落即可能是发生了双交换而丢失了sacB基因。为了验证是否发生了基因交换并且破坏了其原有正常的purL基因，选取部分菌落分别点种在SM和SMAV平板上，28℃培养3天后，发现有一些菌落在SMAV平板上长势与野生型相同，而在SM培养基上不生长或生长极其缓慢。将这些生长需要腺嘌呤的菌落接种在液体培养基上检验，证实均系purL基因破坏的腺嘌呤缺陷型突变株。将它们命名为P825。

6.含共生特异性启动子P_fixK的purL诱导表达系统的建立：

为了使purL基因能在共生固氮过程中特异性表达，需要对基因的启动子进行改造，换成共生固氮过程的特异性启动子。为此本发明选择了苜宿中华根瘤菌(Sinorhizobium.meliloti)的fixK启动子进行purL原有启动子的改造。P_fixK受厌氧感应组分FixJ的调控(David，M.Cell，1988，54：671-683)，在共生固氮阶段特异性启动。

S.meliloti的fixK全基因序列，设计引物扩增它的启动子并包含核糖体结合位点的SD序列。P_fixK的引物为：5’-CTCAAGCTTCTTCTGATCTGCCGAGTTGA和3’-ACATCTAGATTCCCCGTTCGATGTGGGGAC，左右引物分别含HindIII与XbaI位点。以S.meliloti总DNA为模板扩增P_fixK。 PCR条件为：94℃预热3分钟，以94℃1.5分钟，56℃2分钟，72℃1.5分钟循环25次，最后72℃10分钟。得到P_fixK片段约500kb。扩增片段经纯化，用HindIII与XbaI双酶切，与经同样酶切的pUCM-T(购自BiocolorBiological Science & Technology公司)载体连接，得到重组质粒pHNFIXK。质粒pHNPURL1用XbaI和KpnI酶切，回收2.4kb的含purL结构基因的片段，与同样酶切的pHNFIXK载体连接，得到重组质粒pHNFKP，purL的启动子则更换成P_fixK。质粒pBBR1MCS5(Kovach，M.E.，P.H.Elzer，D.S.Hill，G.T.Robertson，M.A.Farris，R.M.Roop II，and K.M.Peterson.Four new derivatives of the broad-host-rangecloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic resistance cassettes.Gene，1995，166：175-176)是能在根瘤菌和大肠杆菌中稳定遗传的穿梭载体，用HindIII和KpnI双酶切该质粒，与来自pHNFKP的含诱导型启动子的purL片段相连，得到重组质粒pHN801K。其上携带有P_fixA+purL的共生特异性表达基因。另外，还将的purL结构基因克隆到pBBR1MCS5上，命名为pHN801C，作为无启动子对照。

7.生态安全型重组大豆根瘤菌的获得：

将pHN801C和pHN801K分别转化到大肠杆菌S17-1中，与前面已得到的腺嘌呤缺陷型菌株作接合转移，在SM+链霉素(200μg/ml)+庆大霉素(20μg/ml)和YMA+链霉素(200μg/ml)+庆大霉素(20μg/ml)平板上上筛选到转移子，只有在YMA上生长、在SM上不生长者才是需要的生态安全型重组费氏中华根瘤菌P825(pHN801K)。

8.盆栽实验：

将供试大豆种子表面灭菌并催芽后，播种在无菌土钵中，分别用S.fredii HH103，P825，P825(pHN801C)和P825(pHN801K)活化后接种，光照培养40天后测定各处理植株生长状况与干重，并分别在收后7天，15天，1月，2月，3月，4月，5月和6月内取土样检测发光根瘤菌数量。P825(pHN801K)由于含有共生条件下诱导表达的fixK启动子(Soupene E，Foussard M，Boistard P，Truchet G，Batut J.1995.Oxygen as a key developmental regulator of Rhizobium meliloti N2-fixationgene expression within the alfalfa nodule.Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 92，3759-3763.)，因此可以共生诱导表达purL基因，使植物生长状况和干重与接种野生型菌株的植株相似，并且随时间延长在土样中检测发光根瘤菌数量明显小于野生型菌株。

Claims (1)

1、一种构建并筛选生态安全型重组根瘤菌的方法，其特征包括如下步骤：

(1)根瘤菌必需基因突变株的筛选：

以费氏中华根瘤菌生产菌株为出发菌，采用定位诱变将发光酶标记基因luxAB插入purL基因并克隆到不能在根瘤菌细胞内复制的自杀质粒pJQ200KS上，经转化导入根瘤菌株后从野生型出发菌中筛选获得稳定的嘌呤合成酶基因缺陷的PurL-突变株；

(2)必需基因purL结构基因的克隆：

根据已报道的purL基因的编码区5’和3’端序列再加上与拟用克隆载体的克隆位点相适合的限制性内切酶位点设计并合成出一对引物，从供试菌基因组中扩增出purL基因的结构基因，经与同样双酶切并能在根瘤菌和大肠杆菌细胞内均能复制的穿梭载体pBBR1MCS5连接后转化大肠杆菌，筛选获得含有purL结构基因重组质粒的转化子，从中分离出以purL基因为报告基因的启动子探针载体；

(3)诱导表达purL基因的克隆：

根据费氏中华根瘤菌共生条件下诱导表达的fixK基因启动子区的DNA序列、purL结构基因和穿梭载体的要求设计并人工合成出含有相应双酶切位点的诱导型启动子序列，用于与经同样双酶切的(2)步骤中所构建的启动子探针载体连接，构建成含有诱导表达purL基因的重组质粒；

(4)生态安全型重组根瘤菌的构建与筛选：

用步骤(3)中获得的含诱导型表达purL基因的重组质粒转化在步骤(1)中得到的PurL-突变株，在编号为SM的基本培养基+链霉素+庆大霉素和YMA培养基+链霉素+庆大霉素平板上筛选转化子，选择在YMA上生长、在SM上不生长的为生态安全型重组费氏中华根瘤菌。

(5)盆栽实验：

用步骤(4)中获得的生态安全型重组费氏中华根瘤菌与植物进行盆栽实验，应使植物生长状况和干重与野生型菌株相似，并且随时间延长在土样中检测菌数明显小于野生型菌株。

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