CN104164465B - 一种表达重组蛋白的发酵工艺 - Google Patents
一种表达重组蛋白的发酵工艺 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104164465B CN104164465B CN201410332982.4A CN201410332982A CN104164465B CN 104164465 B CN104164465 B CN 104164465B CN 201410332982 A CN201410332982 A CN 201410332982A CN 104164465 B CN104164465 B CN 104164465B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- recombinant protein
- zymotechnique
- fermentation
- thalline
- incubated overnight
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种表达重组蛋白的发酵工艺,具体为在培养基上接种大肠杆菌,低温过夜培养,然后升温补料培养,适时诱导收获菌体。本发明的发酵工艺整个过程都是在同一个发酵罐中进行,没有过度消耗碳源,菌体生活环境保持稳定,这样在后续的发酵过程中菌体可以保持很快的生长速度,效率大大提高,工艺稳定性也得以增强。同时免去了种子扩大的设备需求,降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质医药生物工程与技术领域,具体涉及一种表达重组蛋白的发酵工艺。
技术背景
大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点,广泛用于重组蛋白表达,在各大科研院所和制药企业发酵规模已经超过千吨。
然而,由于在发酵工艺上长期没有大的技术突破,目前发酵仍然停留在逐级放大菌种后再接种的模式上。由于逐级接种相当于使菌种不停地适应新环境,尤其是在某些发酵工艺中菌种扩大培养基和生产培养基成分不一致的时候更是这样。即使是成分一致,在菌种扩大过程中,由于菌体的生长消耗,也会使得培养基成分发生改变,从而与后续的接种培养基成分不一致,甚至连pH也不一致。
很多情况下,由于菌体需要时间来适应新环境,导致菌体必须经过一个延迟期(Lag phase)。在实际操作中,这个时间可能是2小时,也可能是9小时,取决于菌体适应新环境的能力,每个批次可能都不一样,这就给工艺稳定性提出了挑战。
本发明人在研究过程中发现,在发酵过程中改变传统工艺中的37℃逐级放大培养模式,不需要更换培养基和发酵罐,能够在一个发酵罐中完成所有的发酵工艺。通过采用降低温度的方法可以有效地降低菌体的新陈代谢水平,在低温下,菌体的生长很慢,几乎要用3-5倍的时间来达到常规发酵温度下的生长状态。同时,由于葡萄糖的预先加入,菌体受制于分解代谢物阻遏,会优先利用葡萄糖,即使培养基中可能混有乳糖类的杂质,也不会产生诱导效应,在这样的条件下,菌体能够安然度过夜间的12-20小时,一旦开始升温和补加碳源,可以直接进入对数生长期进行快速增长。该方法可以使菌体在生产培养基中进行长时间的适应,但是并不快速增殖,可以避免菌体自身新陈代谢消耗培养基成分,同时避免菌体产生代谢废物,使得菌体的新陈代谢系统做好准备。这样的一个处理就可以使菌体度过延迟期,一旦开始发酵,直接进入对数生长期(Log phase),发酵时间将会比传统工艺短至少6-9小时,大大降低了生产成本、提高了工作效率,节约了生产时间和原辅料,工艺可控,批间一致性增强,稳定性高。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种表达重组蛋白的发酵工艺,进而使发酵的效率大大提高,工艺稳定性也得以增强。同时免去种子扩大的设备需求,降低成本。
为实现本发明的技术目的,本发明采用以下技术方案:
一种表达重组蛋白的发酵工艺,该发酵工艺在同一个发酵罐中完成,含有如下步骤:
(1)培养基和流加培养液的配制和灭菌;
(2)接种并在低温下过夜培养;
(3)升温并开始补料培养;
(4)诱导并收获菌体。
其中,
(1)培养基的配制和灭菌过程为:
用纯化水分别配制浓度为5-15g/L的甘油、0.1-1g/L的葡萄糖、5-30g/L的大豆蛋白胨、0.01-0.1g/L消泡剂、5-15g/L的十二水磷酸氢二钠、2-10g/L的磷酸二氢钾、1-5g/L的氯化铵、0.2-1g/L的硫酸钠,配制后均匀混合制得混合溶液;用5-10mol/L氢氧化钠溶液调节该混合溶液的pH值至7.2±0.2,并于110-115℃高压蒸汽灭菌15-30分钟;灭菌完成并冷却至20-50℃后,添加已经过0.22μm的微孔滤膜过滤除菌的微量元素浓缩液至终浓度如下:七水硫酸镁200-600mg/L、二水氯化钙10-30mg/L、七水硫酸亚铁10-50mg/L、四水钼酸铵0.01-0.1mg/L、硼酸0.1-0.5mg/L、六水氯化钴0.01-0.1mg/L、五水硫酸铜0.01-0.1mg/L、一水硫酸锰0.05-0.5mg/L、七水硫酸锌0.01-0.1mg/L;
(2)流加培养液的配制和灭菌过程为:
用纯化水配制浓度为500-1000g/L的甘油,在115-121℃高压灭菌20-30分钟,冷却至室温;IPTG 1-10 mol/L,纯化水配制后经过0.22μm的微孔滤膜过滤除菌;用纯化水配制浓度为5-10mol/L的氢氧化钠;
(3)接种并在低温下过夜培养的过程为:
维持培养基温度为20-35℃、通气量为0.5-1vvm、搅拌转速为100-500rpm、罐压为0.05-0.1bar,向发酵罐中按1:50,000-1:5,000的比例接种吸光度OD600为0.2-1的冻存大肠杆菌甘油菌种,保持此发酵条件进行过夜培养。
(4)升温并开始补料培养的过程为:
低温过夜培养12-20小时后,升高发酵温度至35-38℃,提高搅拌转速和通气量,维持溶氧比率于10-30%,补加甘油流加培养液,维持发酵罐中甘油浓度为5-15g/L,氢氧化钠流加培养液由发酵罐控制,将pH维持在7.2±0.2;
(5)诱导并收获菌体的过程为:
将发酵液吸光度OD600升高至10-60时进行诱导,诱导之后4-6小时下罐,收集发酵液,离心收集菌体。
其中,培养基的组成为5-15g/L的甘油、0.1-1g/L的葡萄糖、5-30g/L的大豆蛋白胨、0.01-0.1g/L的消泡剂、5-15g/L的十二水磷酸氢二钠、2-10g/L的磷酸二氢钾、1-5g/L的氯化铵、0.2-1g/L的硫酸钠、200-600mg/L的七水硫酸镁、10-30mg/L的二水氯化钙、10-50mg/L的七水硫酸亚铁、0.01-0.1mg/L的四水钼酸铵、0.1-0.5mg/L的硼酸、0.01-0.1mg/L的六水氯化钴、0.01-0.1mg/L的五水硫酸铜、0.05-0.5mg/L的一水硫酸锰、0.01-0.1mg/L的七水硫酸锌。
其中,流加培养液的组成为的500-1000g/L甘油、1-10mol/L的IPTG。
其中,培养基中含有引起大肠杆菌分解代谢物阻遏的葡萄糖,浓度为0.3-0.7g/L。
其中,培养基中含有作为氮源使用的大豆蛋白胨,浓度为15-25g/L。
其中,消泡剂选自Antifoam204(Sigma制)或Antifoam SI(Wako制)或THIx-298(烟台恒鑫制)或消泡剂0061(佛山盈智制)中的任意一种。
其中,低温下过夜培养温度为20-35℃,进一步优选为25-31℃
其中,重组蛋白选自重组人超氧化物歧化酶或重组人碱性成纤维细胞生长因子或重组人促血小板生成素模拟肽或可溶性表达或者包涵体表达的重组蛋白中的任意一种。
其中,所述的大肠杆菌是指肠杆菌科埃希氏菌属的埃希氏菌及其亚种。
本发明的有益效果在于:
(1)节省了逐级放大菌种的时间,充分利用夜间人员休息时间进行生产;
(2)节省了菌种放大的设备和材料投入,降低了成本;
(3)通过夜间低温条件的驯化,使菌种非常良好地适应了发酵条件,缩短发酵延迟期,大大提高了发酵时菌体生长速度,提高了发酵效率;
(4)菌种均一化程度高,不容易出现发酵延迟的情况,工艺稳定性得到了增强;
(5)葡萄糖的存在利用了大肠杆菌分解代谢物阻遏的生理过程,避免了本底表达;
(6)培养基不含动物源成分和抗生素,符合现代制药工业对于培养基的要求;
(7)方法简单,可操作性强,充分利用发酵工业现有设备,易于推广和工业化大生产的需求。
附图说明
图1为在本发明涉及的发酵工艺下,发酵过程中连续三罐大肠杆菌的生长曲线。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式对本发明的内容作进一步的详细说明。但不应将其理解为本发明的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明的内容所实现的技术方案均属于本发明的范围。显然,根据本发明的内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明的基本技术思想的前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换和变更。
实施例一(重组人超氧化物歧化酶发酵)
(1)培养基和流加培养液的配制和灭菌;
培养基的配制和灭菌:
硫酸镁浓缩液:称取七水硫酸镁50g,纯化水定容至100ml并经过0.22μm过滤除菌;
氯化钙浓缩液:称取二水氯化钙1.5g,纯化水定容至100ml并经过0.22μm过滤除菌;
硫酸亚铁浓缩液:称取七水硫酸亚铁2.8g,纯化水定容至100ml并经过0.22μm过滤除菌;
微量元素浓缩液:称取四水钼酸铵0.37g、硼酸2.47g、六水氯化钴0.71g、五水硫酸铜0.25g、一水硫酸锰1.35g、七水硫酸锌0.29g,纯化水定容至100ml并经过0.22μm过滤除菌。
称取甘油225g、葡萄糖15g、大豆蛋白胨600g、Antifoam 2041g、十二水磷酸氢二钠270g、磷酸二氢钾100g、氯化铵80g、硫酸钠21g;纯化水配制后,用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.2,定容至27L并于115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。
灭菌完成并冷却至30℃后,向培养基中添加已经过0.22μm过滤除菌的硫酸镁浓缩液、氯化钙浓缩液、硫酸亚铁浓缩液各30ml,添加微量元素浓缩液3ml。
流加培养液的配制和灭菌:
称取甘油2000g,纯化水定容至2L后在121℃高压灭菌20分钟,冷却至室温;
取IPTG 0.1mol,纯化水定容至100ml后经过0.22μm过滤除菌;
称取氢氧化钠400g,纯化水定容至1L。
(2)接种并在低温下过夜培养;
维持培养基温度31℃、通气量18L/min、搅拌转速300rpm、罐压0.05bar,向发酵罐中按1:30,000的比例接种吸光度OD600为0.3的冻存大肠杆菌甘油菌种。保持此发酵条件进行过夜培养。
(3)升温并开始补料培养;
低温过夜培养17小时后,OD600达到11.46,升高发酵温度至37℃,适度提高搅拌转速和通气量,维持溶氧比率于20%,适时补加甘油流加培养液,维持发酵罐中甘油浓度为5-15g/L,氢氧化钠流加培养液由发酵罐控制,将pH维持在7.2。
(4)适时诱导并收获菌体。
发酵液吸光度OD600升高至24.28时补加30ml IPTG进行诱导,诱导之后4小时下罐,收集发酵液,离心收集菌体。获得湿菌体总共1.6kg。
参数记录:
表达量检测:按照《中国药典2010版附录VF电泳法》,采用第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行菌体的表达量检测。
检测方法:
1.仪器装置
恒压/恒流电源、垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂
(1)30%丙烯酰胺溶液:取丙烯酰胺60g与亚甲基双丙烯酰胺1.6g,加水至200ml,滤纸过滤,避光保存。
(2)分离胶缓冲液:取三羟甲基氨基甲烷36.3g,加水70ml,用盐酸调节pH值至8.8,加水至100ml。
(3)浓缩胶缓冲液:取三羟甲基氨基甲烷6.0g,加水70ml,用盐酸调节pH值至6.8,加水至100ml。
(4)电极缓冲液:取三羟甲基氨基甲烷6.0g、甘氨酸28.8g、十二焼基硫酸钠1.0g,加水至1000ml。
3.操作法
(1)制胶用30%丙烯酰胺溶液-分离胶缓冲液-20%十二烷基硫酸钠溶液-10%过硫酸铵溶液(新鲜配制)-四甲基乙二胺-水(5.0:1.5:0.08:0.1:0.01:5.3)制成分离胶液,灌入模具内至一定高度(剩余体积留作制备浓缩胶用),用水封顶,聚合完毕,倾去水层。再用30%丙烯酰胺溶液-浓缩胶缓冲液-20%十二烷基硫酸钠溶液-10%过硫酸铵溶液(新鲜配制)-四甲基乙二胺-水(0.8:1.3:0.025:0.05:0.005:2.4)制成浓缩胶液,灌在分离胶上,插人样品梳,待浓缩胶液聚合后,小心除去样品梳或水。
(2)对照品溶液和供试品溶液的制备照各品种项下的规定。
(3)电泳垂直板电泳:恒压电泳,初始电压为80V,进入分离胶时调至150-200V,当溴酚蓝迁移胶底处,停止电泳。圆盘电泳:调节电流使每管8mA。
4.固定与染色
考马斯亮蓝染色
①固定液:称取三氯醋酸5g,加水200ml溶解后,加甲醇200ml,再加水至500ml。
染色液:称取考马斯亮蓝R2500.5g,加水200ml溶解后,加甲醇200ml与冰醋酸50ml,再加水至500ml。
脱色液:取甲醇400ml、冰醋酸100ml,加水至1000ml,充分混合。保存液取冰醋酸75ml,加水至1000ml,摇匀。
②固定与染色电泳完毕,取出胶片,置固定液中30分钟,取出胶片,置染色液中1-2小时,用脱色液脱色至凝胶背景透明后保存在保存液中。
实施例二(重组人碱性成纤维细胞生长因子发酵)
(1)培养基和流加培养液的配制和灭菌;
同实施例一(消泡剂使用Antifoam SI)
(2)接种并在低温下过夜培养;
维持培养基温度31℃、通气量18L/min、搅拌转速300rpm、罐压0.05bar,向发酵罐中按1:30,000的比例接种吸光度OD600为0.3的冻存大肠杆菌甘油菌种。保持此发酵条件进行过夜培养。
(3)升温并开始补料培养;
低温过夜培养17小时后,OD600达到11.96,升高发酵温度至37℃,适度提高搅拌转速和通气量,维持溶氧比率于20%,适时补加甘油流加培养液,维持发酵罐中甘油浓度为5-15g/L,氢氧化钠流加培养液由发酵罐控制,将pH维持在7.2。
(4)适时诱导并收获菌体。
发酵液吸光度OD600升高至26.45时补加30ml IPTG进行诱导,诱导之后4小时下罐,收集发酵液,离心收集菌体。获得湿菌体总共1.7kg。
参数记录:
表达量检测:同实施例一。
检测方法:同实施例一。
实施例三(重组人促血小板生成素模拟肽发酵)
(1)培养基和流加培养液的配制和灭菌;
同实施例1(消泡剂使用THIx-298)
(2)接种并在低温下过夜培养;
维持培养基温度25℃、通气量18L/min、搅拌转速300rpm、罐压0.05bar,向发酵罐中按1:30,000的比例接种吸光度OD600为0.3的冻存大肠杆菌甘油菌种。保持此发酵条件进行过夜培养。
(3)升温并开始补料培养;
低温过夜培养17小时后,OD600达到11.36,升高发酵温度至37℃,适度提高搅拌转速和通气量,维持溶氧比率于20%,适时补加甘油流加培养液,维持发酵罐中甘油浓度为5-15g/L,氢氧化钠流加培养液由发酵罐控制,将pH维持在7.2。
(4)适时诱导并收获菌体。
发酵液吸光度OD600升高至25.08时补加30ml IPTG进行诱导,诱导之后4小时下罐,收集发酵液,离心收集菌体。获得湿菌体总共1.6kg。
参数记录:
表达量检测:同实施例1。
检测方法:同实施例1
实施例四(重组人超氧化物歧化酶发酵)
(1)培养基和流加培养液的配制和灭菌;
同实施例1(消泡剂使用消泡剂0061)
(2)接种并在低温下过夜培养;
维持培养基温度30℃、通气量15L/min、搅拌转速300rpm、罐压0.05bar,向发酵罐中按1:30,000的比例接种吸光度OD600为0.3的冻存大肠杆菌甘油菌种。保持此发酵条件进行过夜培养。
(3)升温并开始补料培养;
低温过夜培养17小时后,OD600达到12.02,升高发酵温度至37℃,适度提高搅拌转速和通气量,维持溶氧比率于20%,适时补加甘油流加培养液,维持发酵罐中甘油浓度为5-15g/L,氢氧化钠流加培养液由发酵罐控制,将pH维持在7.2。
(4)适时诱导并收获菌体。
发酵液吸光度OD600升高至22.19时补加30ml IPTG进行诱导,诱导之后4小时下罐,收集发酵液,离心收集菌体。获得湿菌体总共1.5kg。
参数记录:
表达量检测:同实施例1。
检测方法:同实施例1。
实施例五(重组人碱性成纤维细胞生长因子发酵)
(1)培养基和流加培养液的配制和灭菌;
同实施例1(消泡剂使用Antifoam SI)
(2)接种并在低温下过夜培养;
维持培养基温度28℃、通气量13L/min、搅拌转速300rpm、罐压0.05bar,向发酵罐中按1:30,000的比例接种吸光度OD600为0.3的冻存大肠杆菌甘油菌种。保持此发酵条件进行过夜培养。
(3)升温并开始补料培养;
低温过夜培养17小时后,OD600达到12.62,升高发酵温度至37℃,适度提高搅拌转速和通气量,维持溶氧比率于26%,适时补加甘油流加培养液,维持发酵罐中甘油浓度为5-15g/L,氢氧化钠流加培养液由发酵罐控制,将pH维持在7.2。
(4)适时诱导并收获菌体。
发酵液吸光度OD600升高至23.18时补加30ml IPTG进行诱导,诱导之后4小时下罐,收集发酵液,离心收集菌体。获得湿菌体总共1.4kg。
参数记录:
表达量检测:同实施例1。
检测方法:同实施例1。
实施例六(重组人促血小板生成素模拟肽发酵)
(1)培养基和流加培养液的配制和灭菌;
同实施例1(消泡剂使用THIx-298)
(2)接种并在低温下过夜培养;
维持培养基温度31℃、通气量13L/min、搅拌转速300rpm、罐压0.05bar,向发酵罐中按1:30,000的比例接种吸光度OD600为0.3的冻存大肠杆菌甘油菌种。保持此发酵条件进行过夜培养。
(3)升温并开始补料培养;
低温过夜培养17小时后,OD600达到10.53,升高发酵温度至37℃,适度提高搅拌转速和通气量,维持溶氧比率于26%,适时补加甘油流加培养液,维持发酵罐中甘油浓度为5-15g/L,氢氧化钠流加培养液由发酵罐控制,将pH维持在7.2。
(4)适时诱导并收获菌体。
发酵液吸光度OD600升高至21.89时补加30ml IPTG进行诱导,诱导之后4小时下罐,收集发酵液,离心收集菌体。获得湿菌体总共1.4kg。
参数记录:
表达量检测:同实施例1。
检测方法:同实施例1。
比较例一(重组人促血小板生成素模拟肽发酵)采用传统的发酵工艺进行发酵
(1)培养基和流加培养液的配制和灭菌
同实施例1(消泡剂使用THIx-298)
(2)一级摇瓶接种培养;
向摇瓶中加入200ml配制完成的培养基,然后向摇瓶中按1:30,000的比例接种吸光度OD600为0.3的冻存大肠杆菌甘油菌种。维持摇瓶培养温度37℃、转速300rpm,摇瓶培养5h。
(3)二级发酵罐扩大培养;
向1L种子罐中加入1L配制完成的培养基,然后向种子罐中按1:300的比例接种吸光度OD600为1.04的摇瓶发酵液。维持培养基温度37℃、通气量13L/min、搅拌转速300rpm、罐压0.05bar,保持此发酵条件培养3h。
(4)发酵罐生产培养;
维持培养基温度37℃、通气量13L/min、搅拌转速300rpm、罐压0.05bar,向发酵罐中按1:300的比例接种吸光度OD600为1.12的摇瓶发酵液。适度提高搅拌转速和通气量,维持溶氧比率于26%,适时补加甘油流加培养液,维持发酵罐中甘油浓度为5-15g/L,氢氧化钠流加培养液由发酵罐控制,将pH维持在7.2。
(5)适时诱导并收获菌体。
发酵液吸光度OD600升高至24.67时补加30ml IPTG进行诱导,诱导之后4小时下罐,收集发酵液,离心收集菌体。获得湿菌体总共1.3kg。
参数记录:
表达量检测:同实施例1。
检测方法:同实施例1。
从实施例来看,本发明的发酵工艺可以在6小时时间内完成发酵,收获菌体湿重约为1.5kg,表达量在20%左右,单位时间菌体产率约0.25kg/h。发酵的效率得以大大提高,工艺稳定性也得以增强。同时免去种子扩大的设备需求,降低了成本。
Claims (9)
1.一种表达重组蛋白的发酵工艺,其特征在于,该发酵工艺在同一个发酵罐中完成,含有如下步骤 :
(1)培养基和流加培养液的配制和灭菌;
(2)接种并在低温下过夜培养;
(3)升温并开始补料培养;
(4)诱导并收获菌体;
其中具体步骤如下:
(1)培养基的配制和灭菌过程为:
用纯化水分别配制浓度为5-15g/L 的甘油、0.1-1g/L 的葡萄糖、5-30g/L 的大豆蛋白胨、0.01-0.1g/L 消泡剂、5-15g/L 的十二水磷酸氢二钠、2-10g/L 的磷酸二氢钾、1-5g/L的氯化铵、0.2-1g/L 的硫酸钠,配制后均匀混合制得混合溶液;用5-10mol/L 氢氧化钠溶液调节该混合溶液的pH 值至7.2±0.2,并于110-115℃高压蒸汽灭菌15-30 分钟;灭菌完成并冷却至20-50℃后,添加已经过0.22μm 的微孔滤膜过滤除菌的微量元素浓缩液至终浓度如下:七水硫酸镁200-600mg/L、二水氯化钙10-30mg/L、七水硫酸亚铁10-50mg/L、四水钼酸铵0.01-0.1mg/L、硼酸0.1-0.5mg/L、六水氯化钴0.01-0.1mg/L、五水硫酸铜
0.01-0.1mg/L、一水硫酸锰0.05-0.5 mg/L、七水硫酸锌0.01-0.1mg/L ;
(2)流加培养液的配制和灭菌过程为:
用纯化水配制浓度为500-1000g/L 的甘油,在115-121℃高压灭菌20-30 分钟,冷却至室温; IPTG 1-10 mol/L,纯化水配制后经过0.22μm 的微孔滤膜过滤除菌;用纯化水配制浓度为5-10mol/L 的氢氧化钠;
(3)接种并在低温下过夜培养的过程为:
维持培养基温度为20-35℃、通气量为0.5-1vvm、搅拌转速为100-500rpm、罐压为0.05-0.1bar,向发酵罐中按1:50,000-1:5,000 的比例接种吸光度OD600 0.2-1 的冻存大肠杆菌甘油菌种,保持此发酵条件进行过夜培养;
(4)升温并开始补料培养的过程为:
低温过夜培养12-20 小时后,升高发酵温度至35-38℃,提高搅拌转速和通气量,维持溶氧比率于10-30%,补加甘油流加培养液,维持发酵罐中甘油浓度为5-15g/L,氢氧化钠流加培养液由发酵罐控制,将pH 维持在7.2±0.2 ;
(5)诱导并收获菌体的过程为:
将发酵液吸光度OD600 升高至10-60 时进行诱导,诱导之后4-6 小时下罐,收集发酵液,离心收集菌体。
2.根据权利要求1 所述的一种表达重组蛋白的发酵工艺,其特征在于,所述的培养基中含有引起大肠杆菌分解代谢物阻遏的葡萄糖,浓度为0.3-0.7g/L。
3.根据权利要求1 所述的一种表达重组蛋白的发酵工艺,其特征在于,所述的培养基中含有作为氮源使用的大豆蛋白胨,浓度为15-25g/L。
4.根据权利要求1 所述的一种表达重组蛋白的发酵工艺,其特征在于,所述的消泡剂选自Antifoam 204或Antifoam SI或THIx-298或消泡剂0061中的任意一种。
5.根据权利要求1 所述的一种表达重组蛋白的发酵工艺,其特征在于,所述的低温下过夜培养温度为20-35℃。
6.根据权利要求5 所述的一种表达重组蛋白的发酵工艺,其特征在于,所述的低温下过夜培养温度为25-31℃。
7.根据权利要求1 所述的一种表达重组蛋白的发酵工艺,其特征在于所述的重组蛋白选自可溶性表达或者包涵体表达的重组蛋白。
8.根据权利要求7所述的一种表达重组蛋白的发酵工艺,其特征在于所述的重组蛋白选自重组人超氧化物歧化酶或重组人碱性成纤维细胞生长因子或重组人促血小板生成素模拟肽中的任意一种。
9.根据权利要求1 所述的一种表达重组蛋白的发酵工艺,其特征在于,表达重组蛋白的菌种为大肠杆菌,进一步为肠杆菌科埃希氏菌属的埃希氏菌及其亚种。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410332982.4A CN104164465B (zh) | 2014-07-14 | 2014-07-14 | 一种表达重组蛋白的发酵工艺 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410332982.4A CN104164465B (zh) | 2014-07-14 | 2014-07-14 | 一种表达重组蛋白的发酵工艺 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104164465A CN104164465A (zh) | 2014-11-26 |
CN104164465B true CN104164465B (zh) | 2017-07-04 |
Family
ID=51908446
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410332982.4A Active CN104164465B (zh) | 2014-07-14 | 2014-07-14 | 一种表达重组蛋白的发酵工艺 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104164465B (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107488623B (zh) * | 2017-09-22 | 2021-10-08 | 海南省产品质量监督检验所 | 一种重组大肠杆菌摇瓶培养基及其提高目的蛋白表达量的方法 |
CN110862945B (zh) * | 2019-11-29 | 2023-02-03 | 宁波酶赛生物工程有限公司 | 一种大肠杆菌诱导蛋白表达的发酵方法 |
CN112625988A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-04-09 | 江苏诚信药业有限公司 | 一种大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法和应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE426674T1 (de) * | 2000-11-03 | 2009-04-15 | Genentech Inc | Stoffwechselanderungen in garungen zur produktion rekombinanter proteine |
WO2007099462A2 (en) * | 2006-03-02 | 2007-09-07 | Institut Pasteur | Recombinant pichia pastoris strains and process for the production of recombinant human interferon alpha |
CN102965419A (zh) * | 2011-08-28 | 2013-03-13 | 杭州路富生物科技有限公司 | 一种重组人生长激素工程菌的发酵优化工艺 |
CN102653733A (zh) * | 2012-04-12 | 2012-09-05 | 大连大学 | 微生物发酵生产低温超氧化物歧化酶的方法 |
-
2014
- 2014-07-14 CN CN201410332982.4A patent/CN104164465B/zh active Active
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
利用大肠杆菌获取重组蛋白的研究进展;唐以杰等;《广东教育学院学报》;20010625;第21卷(第2期);第60-63页 * |
重组人过氧化氢酶在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测;孙华等;《暨南大学学报(自然科学与医学版)》;20140513;第35卷(第2期);第186-195页 * |
重组大肠杆菌高细胞密度发酵研究进展;张建新等;《中国酿造》;20110215(第2期);第5-7页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104164465A (zh) | 2014-11-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104164465B (zh) | 一种表达重组蛋白的发酵工艺 | |
WO2018014453A1 (zh) | 一种提高重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺 | |
CN104694612B (zh) | 一种工业化发酵高产l‑色氨酸的方法 | |
CN102296102B (zh) | 微生物法生产葡萄糖酸盐的控制方法 | |
JP2019526282A (ja) | 藻類を増殖させるための改善された方法 | |
CN103898171A (zh) | 葡萄糖酸钠高效发酵生产工艺 | |
CN108285913B (zh) | 一种制备提取l-谷氨酰胺的工艺 | |
CN106978465A (zh) | 一种提高桦褐孔菌总三萜发酵产量的发酵方法 | |
CN111733200A (zh) | 调节ptm1添加方式提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺 | |
CN105543144A (zh) | 一种适用于表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌的培养基及发酵方法和应用 | |
CN109234215B (zh) | 一种鼠李糖乳杆菌低盐培养基及培养方法 | |
CN113773963A (zh) | 一种高密度高产率的紫球藻培养方法 | |
CN109517858A (zh) | 一种生产和提取l-色氨酸的方法 | |
CN111662944A (zh) | 一种人血清白蛋白的制备方法及其纯化方法 | |
CN106190909B (zh) | 副鸡嗜血杆菌b型株发酵培养基、其制备方法及其应用 | |
CN108220369A (zh) | 一种生产重组水蛭素的方法 | |
CN109680025B (zh) | 提高重组人源胶原蛋白生产水平且降低蛋白降解速度的发酵工艺 | |
US7229792B2 (en) | Method of producing recombinant proteins | |
CN115558613B (zh) | 一种提高诱导眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30表达效率的培养基及其配制方法 | |
CN106701638B (zh) | 一种蛭弧菌微生态制剂的发酵制备方法 | |
CN103993057B (zh) | 重组人血管内皮抑素的诱导表达方法 | |
CN107988294A (zh) | 调节温度提高重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺 | |
SU482051A3 (ru) | Способ получени протеинсодержащих веществ | |
CN109082388A (zh) | 鸭大肠杆菌高密度发酵培养基及其制备方法 | |
CN105154500B (zh) | 一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |