CN105899229A - 用于持续的免疫治疗的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了组合物和方法，它们用于通过抗原特异性的方式来促进TR1细胞和/或Breg细胞的形成、扩增和招募，以及在有需要的对象中治疗自身免疫性疾病和病症。

Description

用于持续的免疫治疗的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求2013年11月4日提交的美国临时专利申请61/899,826号的优先权，通过引用将其以整体形式合并至本文中。
技术领域
本发明涉及和免疫疗法和药物相关的组合物和方法。
背景技术
在本说明书的全文中都有用标识性引用或用阿拉伯数字来引用的技术和专利公开文献。在权利要求书之前的说明书中，可以找到对应于阿拉伯数字的所有引用文献的目录。通过引用的方式将所有在此引用的文献合并入本申请，以更完整地描述与本发明相关的现有技术的状态。
自身免疫性疾病（autoimmune diseases）是由免疫系统由自身组织的攻击引起的。理想的疗法是能够选择性地钝化（blunt）自身免疫反应（针对在该疾病中靶定的所有抗原表位）而不会损害全身免疫（对外来抗原的免疫反应）的疗法。不幸地，任何一种自身免疫性疾病涉及的淋巴细胞特异性都非常多并且没有被完全地界定，使其成为具有挑战性的目标。
发明内容
为响应现有技术的这一需求，本发明描述的是在治疗自身免疫性疾病中有用的治疗性组合物。本发明的一个方面涉及一种用于在有需要的对象中扩增和/或发展抗致病的自身反应性T细胞和/或B细胞的群体的方法，所述方法包括以下步骤、或实质上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：向所述对象施用抗原-II类MHC-纳米颗粒（“NP”）复合物（“NP-复合物”），其中所述抗原是自身免疫相关的抗原或自身抗原。在一些方面，在特定的NP上的所有抗原都是相同的或者它们可以是不同的。在另一个方面，在NP上的抗原具有不同的氨基酸序列，但是可以分离自相同的抗原蛋白。在另一个方面，在NP上的抗原来自不同的抗原。在另一个方面，所述MHCII是相同的或不同的。
在一个方面，本发明提供了NP-复合物，所述NP-复合物包括以下物质、或实质上由以下物质组成、或由以下物质组成：纳米颗粒、II类MHC蛋白和疾病相关的抗原，它可以是抗原/ MHCII复合物的形式，用于在对象中扩增和/或发展B调节细胞和TR1细胞（例如TR1和CD4+细胞）的一个或多个群体，其中所述纳米颗粒的直径选自：从约1 nm至约100 nm的直径；从约1 nm至约50 nm的直径或从约1nm至约20 nm或从约5nm至约100 nm的直径，并且抗原-MHCII复合物与纳米颗粒的数量的比例是从约10:1至约1000:1。在一个方面，所述复合物的II类MHC密度为从约0.05 pMHCII /100 nm2NP表面积（包括涂层）至约25 pMHCII /100nm2NP表面积（包括涂层）。所述抗原是涉及自身免疫反应的自身抗原或其模拟物，所述反应例如是糖尿病前期、糖尿病、多发性硬化（“MS”）或多发性硬化相关的疾病，并且任选地其中当疾病是糖尿病前期或糖尿病时，所述自身抗原是来自由胰腺β细胞或自身抗原IGRP、胰岛素、GAD或IA-2蛋白表达的抗原的表位（epitope）。在另一个方面，所述II类MHC成分包括HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP的全部或部分。所述抗原-II类MHC复合物被共价地或非共价地连接至所述纳米颗粒。所述纳米颗粒是生物可吸收的和/或生物可降解的。
在另一个方面，所述纳米颗粒是非脂质体的和/或具有固体核心，所述核心优选是金核心或氧化铁核心。当被共价地连接时，所述抗原-II类MHC复合物通过尺寸小于5 kD的接头被共价地连接至所述纳米颗粒。在一个方面，所述接头包括聚乙二醇（PEG）。所述pMHC可以通过任何结构（包括但不限于接头）或通过交联被连接至所述纳米颗粒或纳米颗粒涂层。在一个方面，所述MHC通过C末端被定向地连接至所述纳米颗粒或涂层。
申请人已经发现，抗原-II类MHC复合物在纳米颗粒上的密度对治疗效果有贡献。因此，如本文所描述地，抗原-MHCII纳米颗粒复合物可以具有确定的密度，所述密度的范围是从纳米颗粒的表面积（包括任何涂层而测量的表面积）的每100 nm2约0.05（个）MHC分子，假设至少有2 MHCII、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12（个）MHCII被复合至纳米颗粒。在一个方面，所述复合物的MHCII的密度为从每100 nm2约0.01 MHCII (0.05MHCII/100 nm2)至约30 MHCII/100 nm2、或从约0.1 MHCII/100 nm2至约25 MHCII/100nm2、或从约0.3 MHCII/100 nm2至约25 MHCII/100 nm2、或从约0.4 MHCII/100 nm2至约25MHCII/100 nm2、或从约0.5 MHCII/100 nm2至约20 MHCII/100 nm2、或从0.6 MHCII/100nm2至约20 MHCII/100 nm2、或从约1.0 MHCII/100 nm2至约20 MHCII/100 nm2、或从约5.0MHCII/100 nm2至约20 MHCII/100 nm2、或从约10.0MHCII/100 nm2至约20 MHCII/100 nm2、或从约15 MHCII/100 nm2至约20 MHCII/100 nm2、或至少约0.5、或至少约1.0、或至少约5.0、或至少约10.0、或至少约15.0 MHCII/100 nm2，纳米颗粒的nm2表面积包括任何涂层。在一个方面，当9个或至少9个MHCII被复合至纳米颗粒时，密度是从约0.3 MHCII/100 nm2至约20 MHCII/100 nm2。
本发明还提供了一种组合物，其包括治疗有效量的本文所述NP复合物以及载体（例如药学上可接受的载体）。在一个方面，在所述组合物中的所有NP复合物是相同的。在另一个方面，所述组合物的NP复合物包括多样化的或不同的MHC-抗原复合物。
本发明进一步提供了制造复合物和组合物的方法。所述方法可以包括以下步骤、或实质上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：将抗原-MHCII复合物（例如MHCII复合物）非共价地涂布或共价地复合至纳米颗粒上。
本发明还提供了医疗和诊断方法。在一个方面，本发明提供了一种用于在有需要的对象中以抗原特异性的方式促进B调节细胞和/或Tr1细胞（例如TR1和CD4+细胞）的形成、扩增和招募的方法，所述方法包括以下步骤、或实质上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：向所述对象施用有效量的本文所述的NP复合物或组合物。
在另一个方面，本发明提供了一种用于在有需要的对象中治疗或抑制本文所述的自身免疫性疾病或病症（例如MS、MS相关的疾病、糖尿病或糖尿病前期）的方法，所述方法包括以下步骤、或实质上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：向所述对象施用有效量的本文所述的NP复合物或组合物，其中所述自身抗原对于将要治疗的疾病来说是疾病相关的，例如为了防止或治疗糖尿病，所述抗原是糖尿病相关的抗原。在另一个方面，所述自身免疫性疾病是MS或MS相关的疾病并且所述抗原是MS相关的。
本发明还提供了试剂盒。所述试剂盒包括以下物质、或实质上由以下物质组成、或由以下物质成：本文所述的NP复合物或组合物以及使用说明。
在一个方面，本发明提供了一种制造纳米颗粒的方法，所述方法包括热分解或加热纳米颗粒前体。在一个实施方式中，所述纳米颗粒是金属或金属氧化物纳米颗粒。在一个实施方式中，所述纳米颗粒是氧化铁纳米颗粒。在一个实施方式中，所述纳米颗粒是金纳米颗粒。在一个实施方式中，本发明提供了根据目前的技术制备的纳米颗粒。在一个实施方式中，本发明提供了一种制造氧化铁纳米颗粒的方法，所述方法包括乙酰丙酮铁的热分解反应。在一个实施方式中，得到的所述氧化铁纳米颗粒是可溶于水的。在一个方面，氧化铁纳米颗粒适于蛋白结合。在一个实施方式中，所述方法包括单一步骤的热分解反应。
在一个方面，所述热分解在存在功能化的PEG分子的情况下发生。功能化的PEG接头的一些非限制性例子示出于表1中。
在一个方面，所述热分解包括加热乙酰丙酮铁。在一个实施方式中，所述热分解包括在存在功能化的PEG分子的情况下加热乙酰丙酮铁。在一个实施方式中，所述热分解包括在存在苄基醚和功能化的PEG分子的情况下加热乙酰丙酮铁。
不受理论约束，在一个实施方式中，功能化的PEG分子被用作还原剂和表面活性剂。本发明提供的制造纳米颗粒的方法通过使颗粒可溶于水的PEG分子，简化和改进了常规方法（其使用难以被置换或难以被完全置换的表面活性剂）。常规地，表面活性剂可以是昂贵的（例如磷脂）或有毒的（例如油酸和油胺）。在另一个方面，不受理论约束，制造纳米颗粒的所述方法避免了使用常规的表面活性剂的需要，从而得到了较高程度的分子纯度和水溶性。
在一个实施方式中，所述热分解涉及乙酰丙酮铁和苄基醚以及在不存在常规的表面活性剂（除了这里使用的试剂）的情况下进行。
在一个实施方式中，用于热分解的温度是约80℃至约300℃、或约80℃至约200℃、或约80℃至约150℃、或约100℃至约250℃、或约100℃至约200℃、或约150℃至约250℃、或约150℃至约250℃。在一个实施方式中，所述热分解在约1小时至约2小时的时间发生。
在一个实施方式中，所述制备氧化铁纳米颗粒的方法包括纯化步骤，所述步骤例如通过使用Miltenyi Biotec LS磁性柱进行。
在一个实施方式中，所述纳米颗粒在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中在约4℃下是稳定的，没有任何可检测的降解或聚集。在一个实施方式中，所述纳米颗粒能够稳定至少6个月。
在一个方面，本发明提供了一种制造纳米颗粒复合物的方法，所述方法包括将pMHC与本发明提供的氧化铁纳米颗粒接触。不受理论约束，pMHC编码在其羧基末端的半胱氨酸，它能够在约pH 6.2至约pH 6.5下与功能化的PEG中的马来酰亚胺基反应约12至约14小时。
在一个方面，所述制造纳米颗粒复合物的方法包括纯化步骤，所述步骤例如通过使用Miltenyi Biotec LS磁性柱（magnetic column）进行。
附图说明
附图构成说明书的一部分并且用来进一步说明本发明的某些方面。本发明可通过参考这些附图中的一个或多个并结合所呈现的具体实施方式的详细描述而被更好地理解。
图1A-1C示出了NP-复合物的示意图。图1A示出了单链I类pMHC表达构建体（上）和对应的pMHC四聚体（标记有荧光物）结合至同源CD8+ T-细胞的代表性流式细胞仪简图。图1B示出了接头/连接物和NP复合物的二维结构。如可以看到的，一个NP能够包含通过各种化学接头复合至纳米颗粒核心的相同的抗原。图1C示出了结合至NP的马来酰亚胺功能化的NP。
图2示出了典型的II类pMHC单体的结构（上）以及使用对应的pMHC四聚体染色或未染色的同源CD4+ T-细胞的代表性FACS简图。
图3A-3B示出了在刚患糖尿病的NOD小鼠中不同的T1D-相关的II类pMHC-NP逆转血糖升高。图3A示出了单个小鼠血糖曲线。在正常血糖稳定4周时，认为小鼠“被治愈”，此后停止治疗。将外来抗原HEL14-22作为对照。图3B示出了疾病逆转的发生。
图4示出了腹腔糖耐量试验（IPTGTT）和在长期被治愈的小鼠中的胰岛素生产能力。IDDM，糖尿病的未治疗的小鼠；被治愈的，在50周龄（治疗停止之后>30周）具有正常血糖的小鼠；对照，年龄匹配的非糖尿病的未治疗的小鼠（50周龄）。
图5示出了T1D相关的II类pMHC-NP扩增同源的自身调节性CD4+ T细胞。数据与使用2.5mi/I-Ag7-NP处理的小鼠一致。右下角，扩增对于NP上的pMHC是特异的，因为使用2.5mi/I-Ag7-NP处理的小鼠没有显示出两种其他自身反应性CD4+ T-特异性的增加百分比。PLN，胰腺淋巴结；MN，肠系膜淋巴结；BM，骨髓（记忆T细胞的储存库）。
图6示出了T1D相关的II类pMHC-NP扩增同源的自身调节性CD4+ T细胞。示出的扩增是对于脾的，但是在胰腺淋巴结、血液和骨髓中看到了相似的模式。“发病”对应于治疗之前的值；“被治愈的”是使用pMHC-NP而血糖正常的小鼠（在治疗停止的>30周分析）；“IDDM”是在治疗停止之后复发的小鼠（~25%）；“59周龄”对应于年龄匹配的未处理的非糖尿病的对照。
图7示出了T1D相关的II类pMHC-NP扩增同源记忆样T-调节-1（“Tr1或TR1”）细胞。
图8示出了由II类pMHC-NP扩增的自身反应性CD4+ T-细胞制造IL-10。使用同源的和非同源的肽对来自使用IGRP126-145/I-Ag7-NP或对照NP处理的小鼠的IGRP126-145/I-Ag7四聚体+细胞进行分选、处理，并通过luminex技术测试上清液的细胞因子含量。
图9示出了II类pMHC-NP以依赖于IL-10和TGFb的方式逆转高血糖。图9示出了IGRP4-22/IAg7-NP能够使使用细胞因子阻断抗体（“Ab”）处理的小鼠恢复正常血糖（上）、扩增同源Tr1细胞（左下）并抑制PLN中的自身抗原提呈（至IGRP206-214-反应性CD8+ T-细胞；右下）。抗-IL10和抗-TGFβ Ab部分地恢复自身抗原提呈并抑制pMHC-NP的治疗效果，而不损害Tr1细胞扩增。
图10A-10B显示，II类pMHC-NP治疗不损害全身免疫。图10A显示，经pMHC-NP处理的NOD小鼠能够容易地清除急性病毒（牛痘病毒）感染（下，比较感染后4日与14日），而不管自身调节Tr1 CD4+ T-细胞的全身扩增（上）。图10B显示，与未处理和未接种疫苗的小鼠相比，经pMHC-NP处理的小鼠（10个剂量）能够在CFA中的免疫接种时对KLH-DNP产生抗体反应。
图11示出了II类pMHC-NP治疗降低了在C57BL/6小鼠中已经建立的EAE的严重程度。使用在CFA中的pMOG35-55免疫接种B6小鼠，并静脉内使用百日咳毒素进行处理。使用15分制的已经建立的标准，针对EAE的症状对小鼠进行打分。从免疫接种之后21日开始，使用两周剂量的7.5-22.5 ug的涂布有pMOG38-49/IAb的NP处理被感染的小鼠。
图12A-12C示出了II类pMHC-NP的结构和性质。图12A描述了能够被用来将pMHC共价地涂布至功能化的、生物相容的氧化铁NP的不同的化学方法。图12B是涂布了pMHC的NP的透射电子显微照片。图12B示出了涂布了pMHC的NP和未涂布的NP的动态光散射图。
图13A-13C示出了在经II类pMHC-NP处理的小鼠中，同源B细胞进入Breg细胞的扩增和分化。在图13A中，将经PKH26标记/经2.5mi肽脉冲的B细胞（下）（或者树突状细胞，上）以及经CFSE标记/经GPI肽脉冲的B细胞（下）（或者树突状细胞，上）的1:1混合物注射进经2.5mi/IAg7-NP处理的NOD小鼠中。七天之后，分析宿主的B细胞（下）或树突状细胞（上）的亚型的出现。左侧图板显示了代表性的结果，右侧直方图显示了从几个实验获得的结果的概述。该数据显示，经2.5mi-肽脉冲的B细胞（而非DC）在经2.5mi/IAg7-NP处理的NOD小鼠中扩增。在B（左侧面板），申请人比较了在经处理2.5mi/IAg7-NP以及经涂布有对照（糖尿病不相关的）pMHC-NP的NP处理的NOD小鼠的胰腺癌（PLN）和肠系膜（MLN）淋巴结中的B细胞含量。数据显示，B细胞在前者中的招募增加。在B（右侧面板），申请人比较了B细胞至PLN的招募随着Tr1细胞招募的变化。使用数种不同的pMHC-NP制剂得到数据。数据显示，在扩增有pMHC-NP的TR1细胞的招募和B细胞至PLN的招募之间存在统计学上显著的相关性。在图13B中，申请人将经2.5mi肽或对照肽脉冲的B细胞（来自IL10-eGFP敲入的NOD小鼠）转移入数种不同的供体小鼠类型（上部标签）。7天之后，分析脾的被灌注的B细胞向表达高水平的CD1d和CD5、产生IL10的（eGFP+）B细胞（B调节细胞）的转变。数据显示，只有在经2.5mi/IAg7-NP处理的宿主中，存在稳健的扩增和同源（装载有2.5mi）B细胞向B-reg细胞的转变。
图14示出了通过乙酰丙酮铁的热分解及生物结合而合成表面功能化的氧化铁纳米颗粒。
详细描述
要理解的是，本发明并不限于所描述的特定实施方式，因为这些实施方式肯定可以变化。还要理解的是，本文所使用的术语仅为描述特定实施方式的目的而使用，并非意在限制，因为本发明的范围仅由所附权利要求来限定。
必须注意的是，本文和权利要求中所使用的单数形式“一个”和“该”，除非文中有明确说明，否则都包括复数个指代。因此，例如，当提到“赋形剂”时，其包括多种赋形剂。
定义
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。如本文所使用的，以下术语具有下述含义。
如本文所使用的，术语“包括”是指该组合物和方法包括所引述的内容，但不排除其他内容。当用来定义组合物和方法时，“实质上由…组成”意味着排除对于该组合物或方法具有任何实质性意义的其他内容。因此，如本文所定义的，实质上由该元素组成的组合物不会排除不会实质性影响所要求保护的发明的基本的和新颖的特性的材料或步骤，例如是用于治疗或防止多发性硬化症的组合物。“由…组成”意味着排除高于痕量的其他组分和实质性的方法步骤。由每个这些过渡术语定义的实施方式都在本发明的范围内。
“自身反应性T细胞”是识别“自身抗原”的T细胞，该抗原是由包含该T细胞的相同的个体产生和包含的分子。
“致病性T细胞”是对含有该T细胞的对象有害的T细胞。反之，非致病性T细胞是对对象实质上无害的T细胞，并且抗致病性T细胞减少、改善、抑制或无效化致病性T细胞的损害。
如本文所使用的，术语调节B细胞或B-调节细胞（“B-reg”）是指对抗炎症作用负责的那些细胞，该作用是由CD1d、CD5的表达和IL-10的分泌表征的。B-reg还通过Tim-1的表达来识别，并且可以通过Tim-1连接来诱导从而提高耐受性。资料显示，作为B-reg的能力是由许多刺激因子驱动的，这些因子例如是toll样受体、CD40配体和其它因子。但是，B-reg的全面表征正在进行中。B-reg还表达高水平的CD25、CD86和TGF-β。B细胞的这一亚型能够抑制Th1增殖，因此对自身耐受的维持有贡献。B-reg作用的增强应该成为许多免疫调节药物的目标，有助于更好地控制自身免疫疾病。参看例如： ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23707422，最后一次登录是在2013年10月31日。
T调节1细胞（Tr1）是CD4+ T的亚型，它具有调节特性并且能够抑制体外和体内的抗原特异性免疫反应。这些T调节1（Tr1）细胞是由它们独特的细胞因子生成来界定的，并且制造高水平的IL-10和TGF-β而不制造IL-4或IL-2。由这些细胞生成的IL-10和TGF-β介导体外的主要的初始（naive）T细胞的抑制。还存在Tr1细胞在体内存在的证据，并且有文献报导了在已经接受了异基因干细胞移植的具有严重的联合免疫缺陷的患者中存在生成高水平IL-10的CD4(+) T细胞。Tr1细胞参与外周耐受的调控，并且它们有可能被用作细胞疗法以调节体内的免疫反应。参看例如：ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10887343，最后一次登录是在2013年10月31日。
1型T调节（Tr1）细胞是由它们制造高水平的IL-10和TGF-β的能力来界定的。对多种抗原特异的Tr1细胞出现在体内，但是也可以存在IL-10的情况下分化自体外的初始CD4+T细胞。Tr1细胞具有较低增殖能力，这可以通过IL-15来克服。Tr1细胞通过产生IL-10和TGF-β来抑制初始和记忆T辅助1或2型响应。分子水平的Tr1细胞的进一步表征将界定它们的作用机制并弄清它们与Tr细胞的其他亚型的关系。可以预见Tr1细胞被用来识别新型靶标以用于开发新的治疗剂以及被用作细胞疗法以调节外周耐受。参看例如：ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11722624，最后一次登录是在2013年10月31日。
术语“抑制”、“减少”或“防止”或这些术语的任何变形，当被用在权利要求和/或说明书中时，包括任何可检测的下降或完全抑制以达到期望的结果。
在本发明全文中，术语“约”被用来表示该值包含用来检测该值的装置或方法的误差的标准偏差。当用在数字表示（例如温度、时间、量和浓度）之前时（包括范围值），术语“约”表示近似值，其可上（+）下（–）改变10 %、5 % 或1 %。
“生物相容性的”是指递送系统的成分不会导致组织损伤或对人类生物系统造成损伤。为赋予生物相容性，会优先使用已在人体中有安全使用记录或具有GRAS （GenerallyAccepted As Safe）状态的聚合物和赋形剂。生物相容性是指用在组合物中的组分和赋形剂最终会被“生物吸收”或被身体清除而不会对身体产生不利作用。一种组合物要成为生物相容的，并且被认为是无毒的，其必须不能对细胞造成毒性。类似地，术语“生物可吸收的”是指由在一段时间内在体内经历生物吸收的材料制成的纳米颗粒，因而可避免在患者体内形成该材料的长期累积。在优选的实施方式中，该生物相容性纳米颗粒在少于2年的时间段内被生物吸收，优选少于1年，更优选少于6个月。生物吸收率与颗粒的尺寸、所使用的材料、以及本领域技术人员普遍意识到的其他因素相关。生物可吸收的生物相容性材料的混合物可被用来形成本发明中使用的纳米颗粒。在一个实施方式中，可将氧化铁和生物相容性的生物可吸收的聚合物混合。例如，可将氧化铁与PGLA混合以形成纳米颗粒。
抗原-MHC-纳米颗粒复合物（NP-复合物）是指在表面上（例如生物相容性生物可降解纳米球上）的抗原分子或蛋白质的肽、碳水化合物、脂质或其他抗原节段、片段或表位的表现形式（即，自身肽或自身抗原）。如本文所使用的，“抗原”是指可在对象中诱导免疫响应或抗病原性细胞的扩增的分子的全部、部分、片段或节段。
“模拟物”是特定配体或肽的类似物，其中该类似物与该配体实质上相似。“实质上相似”是指该类似物的结合属性与该配体类似，但该模拟物具有一个或多个功能基团或修饰位点，它们共同占据该配体的分子量的少于约50%、少于约40%、少于约30%、少于约20%、少于约10%、或少于约5%。
术语“抗病原性自身反应性T细胞”是指具有抗病原性特性的T细胞（即抵消自身免疫疾病（例如MS、MS相关的疾病或病症、或糖尿病前期）的T细胞）。这些T细胞可以包括抗炎T细胞、效应T细胞、记忆T细胞、低亲和力T细胞、T辅助细胞、自动调节T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、TR1细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞等。
术语“抗炎T细胞”是指促进抗炎响应的T细胞。T细胞的抗炎功能可通过抗炎蛋白质、细胞因子、趋化因子等的生成和/或分泌而实现。抗炎蛋白质也旨在包括抑制免疫响应的抗增殖性信号蛋白。抗炎蛋白质包括IL-4、IL-10、IL-13、IL-21、IL-23、IL-27、IFN-α、TGF-β、IL-1ra、G-CSF以及TNF和 IL-6的可溶性受体。还包括具有炎症表型但杀死抗原提呈细胞或安排特定自身免疫响应的抗炎细胞。相应地，本发明的一些方面涉及用于在患者中治疗自身免疫疾病（例如MS、MS相关的疾病、糖尿病或糖尿病前期）的方法，该方法包括以下步骤、实质上由以下步骤组成或进一步由以下步骤组成：向该患者施用抗原MHCII -纳米颗粒复合物，其中所述抗原是疾病相关的抗原。
术语“IL-10”或“白介素-10”是指由IL-10基因编码的细胞因子。IL-10序列可通过GenBank登录号NM_000572.2（mRNA）和NP_000563.1（蛋白质）获得。
术语“TGF-β”或“转化生长因子β”是指可具有抗炎作用的蛋白质。TGF-β是以至少三种同种型存在的分泌蛋白，分别被称为TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。它也是TGF-β1的原名，其是该家族的创始成员。TGF-β家族是转化生长因子β超家族的一部分，其包括抑制素类、激活素、抗中肾旁管激素、骨形态生成蛋白、decapentaplegic蛋白和Vg-1。
“有效量”是足以实现预期目的的量，预期目的的非限制性的例子包括：启动免疫响应、调节免疫响应、抑制炎症响应和调节T细胞活性或T细胞群。在一个方面，有效量是指实现所提及的治疗目的的量，例如治疗有效量。如本文所详细描述的，有效量或剂量取决于目的和组合物、成分，并且可根据本发明公开的内容来确定。
词语“一个”或“一种”与术语“包括”在权利要求和/或说明书中结合使用时，其可能意味着“一个”，但也与“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”的意思一致。
“纳米球”、“NP”或“纳米颗粒”在本文是指以单个或多个形式适当施用给对象、细胞或组织的小的离散颗粒。在某些实施方式中，纳米颗粒的形状是实质上球形的。在一些实施方式中，纳米颗粒并非是脂质体或病毒颗粒。在进一步的实施方式中，纳米颗粒是固体或者具有固体核心。如本文所使用的，术语“实质上球形的”是指颗粒的形状不偏离球状超过约10%。本发明的各种已知抗原或肽复合物可被施用至这种颗粒。本发明的纳米颗粒的尺寸为约1 nm至约1 µm，并且优选地为约1 nm至约100 nm，或者约1 nm至约50 nm，或者约5至50nm或者约5 nm至100 nm，并且在某些方面，当指代多个纳米颗粒时，是指多个纳米颗粒的平均直径或中间值。较小的纳米尺寸的颗粒可通过例如分离工艺获得，从而允许较大的颗粒沉淀在水性溶液中。该溶液的上部随后通过本领域已知的方法回收。该上部富集了较小尺寸的颗粒。该工艺可被重复直到生成期望的平均尺寸。
权利要求中使用的术语“或”，除非另有明确说明仅指择一方案或这些替代方案相互排斥之外，是指“和/或”，即使公开的内容支持指代择一方案和“和/或”的定义。
如本文所使用的，短语“免疫响应”或其等同体“免疫学响应”是细胞介导的响应（由抗原特异性T细胞或它们的分泌产物介导）的进展。细胞免疫响应是通过将多肽表位与I类或II类MHC分子相关联而提呈来诱导，从而治疗或防止病毒感染、扩增抗原特异性Breg细胞、TC1、CD4+ T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T 细胞和/或疾病生成的、自动调节的T细胞和B“记忆”细胞。这些响应有可能涉及其他成分的激活。
本文使用的术语“炎症反应”和“发炎”表示个体的血管组织对有害刺激（例如病原体、受损细胞或刺激物）的复杂的生物学响应，包括分泌细胞因子，更具体地是促炎性细胞因子，即，主要是由活化的免疫细胞产生并且涉及炎症反应的扩大的细胞因子。促炎性细胞因子的例子包括但不限于，IL-1、IL-6、IL-10、TNF-a、IL-17、IL21、IL23、IL27和TGF-β。示例性的发炎包括急性发炎和慢性发炎。急性发炎表示短期过程，其特点在于由于血浆和白细胞对组织的浸润导致的典型的发炎症状（肿胀、发红、疼痛、发热和功能丧失）。急性发炎通常只要存在损伤刺激即出现，并且一旦刺激被除去、分解或通过形成瘢痕而隔离（纤维化）即停止。慢性发炎表示一种状态，其特点是并发活性炎症、组织破坏并且尝试修复。慢性发炎没有以上列出的急性发炎的那些典型症状。相反，慢性发炎组织的特点是单核免疫细胞（单细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞）的浸润、组织破坏，并尝试愈合（包括血管生成和纤维化）。在本发明的意义上，发炎可通过影响，特别是抑制形成个体内炎症相关的复杂生物学响应的任何一个事件来抑制。
自身免疫性疾病可以包括但不限于：糖尿病、糖尿病前期、移植排斥、多发性硬化、多发性硬化相关的疾病、卵巢早衰、硬皮病、斯耶格伦氏病、狼疮、vilelego病、脱发（秃顶）、腺体衰竭、格雷夫斯病、甲状腺功能减退症、多发性肌炎、天疱疮、克罗恩病、结肠炎、自身免疫性肝炎、垂体功能减退症、心肌炎、阿狄森氏病、自身免疫性皮肤病、葡萄膜炎、恶性贫血、甲状旁腺功能减退、和/或类风湿性关节炎。在一些方面，抗原/ MHCII/颗粒复合物的肽成分衍生自或设计自在将被该治疗探测、调制、或减弱的自身免疫响应中涉及的自身抗原或自身抗原表位、或其模拟物。在特定的方面，自身抗原是肽、碳水化合物、或脂质。在一些方面，自身抗原是由对象的某些细胞（例如胰腺β细胞）表达的片段、表位、或蛋白的肽、碳水化合物、或脂质，并且包括但不限于IGRP的片段、胰岛素、GAD或IA-2蛋白。已经对多种自身免疫性疾病鉴定了多种这样的蛋白或表位。所述自身抗原可以是衍生自第二内分泌或神经分泌成分（例如胰岛周围雪旺氏细胞等）的肽、碳水化合物、或脂质。
如本文所使用的，术语“疾病相关的”抗原是指其被选择来治疗被选择的疾病的抗原或片段。例如，糖尿病相关的抗原是其将会治疗糖尿病的抗原或片段。MS相关的抗原被选择来治疗MS。糖尿病相关的抗原不会被选择来治疗MS。相似地，自身免疫相关的抗原是与自身免疫疾病相关的并且不会被选择来治疗自身免疫之外的疾病或病症（例如癌症）的抗原。
如本文所使用的，术语“糖尿病”是指由遗传和环境因素引起的碳水化合物代谢的可变疾病，其特征通常是胰岛素的分泌或利用不足、生成的尿量过多、在血液和尿中的糖含量过多、以及口渴、饥饿和体重减轻。糖尿病的特征在于1型糖尿病和2型糖尿病。非肥胖糖尿病（“NOD”）小鼠是被接受的用于研究和治疗糖尿病的动物模型。小鼠中的1型糖尿病（T1D）与自身反应性CD8+ T-细胞相关。非肥胖糖尿病（NOD）小鼠发展出与人类T1D非常相似的一种形式的T1D，它起因于识别不断增加的自身抗原的T细胞对胰腺β细胞的选择性破坏。虽然T1D的引发明显需要CD4+细胞的参与，但是有令人信服的证据表明T1D是CD8+ T细胞依赖性的。已经发现，NOD小鼠中的胰岛相关的CD8+细胞的很大一部分使用CDR3-不变的Vα17-Jα42+ TCR（被称为“8.3-TCR样”）。这些细胞在MHC分子Kd的情况下识别模拟表位NRP-A7（使用组合肽库来定义的），它们已经是最早的NOD胰岛CD8+浸润物的显著成分、是致糖尿病的，并且靶定来自胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化的亚基相关的蛋白（IGRP，一种未知功能的蛋白）的肽。识别该肽（IGRP206-214，与NRP-A7相似）的CD8+细胞在循环中异常频繁（>1/200CD8+细胞）。值得注意的是，NOD小鼠中的胰岛炎到糖尿病的进展总是伴随着循环的IGRP206-214-反应性CD8+池的循环扩展，以及其胰岛相关的配对物的快速成熟。最近，已经显示，NOD小鼠中的胰岛相关的CD8 +细胞识别多个IGRP表位，表明IGRP是对CD8+细胞的主要的自身抗原，至少在鼠类T1D中是。NOD胰岛相关的CD8 +细胞，特别是那些早在疾病过程中发现的细胞，也识别胰岛素表位（Ins B15-23）。
相关研究已经表明，某些HLA I类等位基因（即HLA-A*0201）使得易患人类T1D。病理学研究已经显示，初诊患者的胰岛病变主要由（HLA I类限制的）CD8+ T-细胞组成，这些细胞也是通过移植胰腺同基因移植物（来自同卵双胞胎）或同种异体移植（来自相关的捐献者）治疗的患者中主要的细胞群体。
胰岛素是人类和鼠类T1D中抗体和CD4+响应的关键靶标。在胰岛移植接受者和在自发性疾病的过程中，人类胰岛素B链表位hInsB10-18由HLA-A*0201提呈至自身反应性CD8+细胞。此外，已经从小鼠前胰岛素原1或2识别了四个额外的肽，它们在HLA-A*0201的情况下从HLA-A*0201-转基因小鼠中被胰岛相关的CD8+ T-细胞识别。
如本文所使用的，术语“糖尿病前期”是指在糖尿病症状之前的无症状期，其特征是亚临床β细胞损伤，其中患者表现出正常的血浆葡萄糖水平。它的特征还在于存在胰岛细胞自身抗体（ICAs），当接近的临床症状的发作时，还伴随着对葡萄糖的不耐受。
如本文所使用的，术语“多发性硬化症”或“MS”是指自身免疫性疾病，其中身体的免疫系统在覆盖神经的保护套进行侵蚀。这干扰了大脑和身体其余部分的通信。最终，这会导致神经自身的恶化，该过程是不可逆的。
如本文所使用的，术语“多发性硬化症相关的疾病”是指与MS的易感性或与MS共同呈现的疾病。这些疾病的非限制性例子包括：视神经脊髓炎（NMO）、葡萄膜炎、神经性疼痛硬化、动脉粥样硬化、动脉硬化、硬化播散性全身性硬化症、脊髓-光学MS、原发性进行MS（PPMS）、以及复发缓解型MS（PPMS）、进行性全身性硬化症、以及共济失调硬化症。
术语“表位”和“抗原决定簇”可互换使用，并且是指抗原上B细胞和/或T细胞所响应或识别的位点。B细胞表位可由连续氨基酸形成或通过蛋白质的三次折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时仍保留，但由三次折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时会丢失。表位通常包括至少3个、更常见为至少5个或8-10个以独特空间构象存在的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体分析法和2维核磁共振法。参见例如Glenn E. Morris, Epitope Mapping Protocols(1996)。T细胞识别CD8细胞的约9个氨基酸的连续表位，或CD4细胞的约13-15个氨基酸的表位。识别该表位的T细胞可通过测定抗原依赖性增殖的体外实验来识别，该测定可通过3H-胸腺嘧啶加入、通过已接触抗原的T细胞对表位的响应（Burke et al., J. Inf. Dis.,170:1110-1119, 1994）、通过抗原依赖性杀伤（细胞毒性T淋巴细胞实验，Tigges et al.,J. Immunol., 156(10):3901-3910, 1996）、或通过细胞因子分泌来确定。细胞介导的免疫响应的存在可通过增殖实验（CD4+ T细胞）或CTL实验（细胞毒性T淋巴细胞）来确定。
任选地，抗原或优选地抗原的表位可化学地结合至，或表达为，与其他蛋白融合的融合蛋白，所述其他蛋白例如是MHC和MHC相关蛋白。
如本文所使用的，术语“患者”和“对象”可意思相近，并且是指哺乳动物。在一些实施方式中，患者是人。在其他实施方式中，患者是通常用在实验室中的哺乳动物，例如是小鼠、大鼠、猴、狗、猫、牛、马或羊。
如本申请中所使用的，术语“多核苷酸”是指一种核酸分子，其可为重组的，或是分离的且不含全基因组核酸。术语“多核苷酸”包括寡核苷酸（长度为100个残基或更少的核酸）、重组载体（包括例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等）。在某些方面，多核苷酸包括调节序列，它们被分离得实质上远离它们的天然基因或蛋白质编码序列。多核苷酸可为RNA、DNA、其类似物、或它们的组合。编码多肽的全部或部分的核酸可含有编码该多肽的全部或一部分的连续核酸序列，并具有以下长度：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000、或更多个核苷酸、核苷或碱基对。还预期的是，来自特定物种的特定多肽可由含有天然变体的核酸编码，所述天然变体具有稍微不同的核酸序列但编码相同或实质性相似的蛋白质、多肽或肽。
多核苷酸是由特定序列的四种核苷酸碱基构成的：腺嘌呤（A）；胞嘧啶（C）；鸟嘌呤（G）；胸腺嘧啶（T）；以及如果多核苷酸是RNA时替代胸腺嘧啶的尿嘧啶（U）。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表现形式。该字母表现形式可被输入到具有中央处理单元的计算机的数据库中，并且可用于生物信息学应用，例如功能基因组学和同源性检索。
如本文关于核酸（例如DNA或RNA）所使用的，术语“分离的”或“重组的”是指分离自其它DNA或RNA的分子，分别为存在于大分子以及多肽的天然来源中的分子。术语“分离的或重组的核酸”包括不是天然地作为片段存在并且在自然状态下找不到的核酸片段。术语“分离的”在本文中也用来指分离自其他细胞蛋白质的多核苷酸、多肽和蛋白质，并且意在包括纯化的和重组的多肽。在其他实施方式中，术语“分离的或重组的”是指分离自成分、细胞，其中细胞、组织、多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段在天然状态下通常是联合在一起的。例如，一个分离的细胞是指分离自不相似表型或基因型的组织或细胞的一个细胞。分离的多核苷酸是分离自3’ 和5’连续核苷酸，该分离的多核苷酸在其天然或自然环境中（例如在染色体上）通常是与3’ 和5’连续核苷酸相连的。对于本领域技术人员明显的是，非天然的核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要进行“分离”从而预期天然副本相区别。
多核苷酸或多核苷酸区域（或多肽或多肽区域）与另一序列具有特定百分数（例如，80%、85%、90%或95%）的“序列一致性”是指，在比较着两个序列时，当比对时，该百分数的碱基（或氨基酸）是相同的。该比对以及同源性或序列一致性百分比可利用本领域已知的软件来确定，例如在Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds.1987) Supplement 30, 7.7.18部分，表格7.7.1中描述的那些软件。优选地，比对时使用默认参数。优选的比对程序是BLAST，使用默认参数。特别地，优选的程序为BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码 = 标准；过滤器 = 无；链= 两种；切断 = 60；预期 = 10；Matrix = BLOSUM62；描述 = 50 个序列；分类 = HIGH SCORE；数据库 = 非冗余,GenBank+ EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS翻译 + SwissProtein + SPupdate + PIR。这些程序的详细信息可在以下网址找到ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。
不用明确说明即可推测得出，除非另有说明，否则当本发明涉及到多肽、蛋白质、多核苷酸或抗体时，其等价物或生物学等价物也在本发明的保护范围之内。如本文所使用的，当提到参考抗原、蛋白、抗体、片段、多肽或核酸时，术语“其生物学等价物”与“其等价物”同义，并且是指具有最小同源性但仍保持期望的结构或功能性的抗原、蛋白、抗体、片段、多肽或核酸。除非本文另有特别说明，否则预期的是，任何本文提及的多核苷酸 、多肽或蛋白质也包括其等价物。在一个方面，等价多核苷酸是在严格条件下与本文所述用于所描述的方法的多核苷酸或其互补序列杂交的多核苷酸。在另一个方面，等价抗体或抗原结合多肽是指以至少70%、或至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%的亲和性或更高的亲和性结合至参考抗体或抗原结合片段的抗体或多肽。在另一个方面，其等价物在竞争性ELISA实验中与该抗体或抗原结合片段竞争结合至其抗原。在另一个方面，等价物具有至少约80%同源性或一致性，或者至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约98%的同源性或一致性，并且表现出与参考蛋白、多肽或核酸实质上等同的生物学活性。
“杂交”是指一个或多个多核苷酸发生反应以形成复合物的反应过程，该复合物通过核苷酸残基的碱基之间的氢键结合而稳定化。氢键结合可为Watson-Crick碱基配对、Hoogstein结合或任何其他序列特异性方式结合。该复合物可包括形成双链结构的两个链、形成多链复合物的三个或更多个链、单个自身杂交的链、或这些的任何组合。杂交反应可以为更广泛过程中的一个步骤，例如是PC反应的起始步骤，或多核苷酸核酶催化中的酶促裂解步骤。
严格杂交条件的例子包括：温育温度为约25℃至约37℃；杂交缓冲液浓度为约6xSSC至约10x SSC；甲酰胺浓度为约0%至约25%；并且洗涤溶液为约4x SSC至约8x SSC。中等杂交条件的例子包括：温育温度为约40℃至约50℃；缓冲液浓度为约9x SSC至约2x SSC；甲酰胺浓度为约30%至约50%；并且洗涤溶液为约5x SSC至约2x SSC。高严格杂交条件的例子包括：温育温度为约55℃至约68℃；缓冲液浓度为约1x SSC至约0.1x SSC；甲酰胺浓度为约55%至约75%；并且洗涤溶液为约1x SSC、0.1x SSC、或去离子水。一般而言，杂交温育时间为5分钟至24小时，具有1、2或更多个洗涤步骤，并且洗涤温育时间为约1、2、或15分钟。SSC是0.15 M NaCl和15 mM柠檬酸盐缓冲液。要理解的是，可使用利用其它缓冲系统的SSC等价物。
“同源性”或“一致性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可通过比较每个序列中的一个位置来确定，这些序列可被对齐从而进行比较。当被比序列中的一个位置被相同碱基或氨基酸占据时，那么这些分子在该位置是同源的。序列之间的同源性程度与序列共享的匹配或同源位置的数量有关。“不相关的”或“非同源的”序列与本发明的序列中的一个共享少于40%的一致性，或少于25%的一致性。
“同源性”或“一致性”或“相似性”也可以指在严格条件下杂交的两个核酸分子。
如本文所使用的，术语“治疗”是指获得期望的药理学和/或生理学效果。该效果可为治疗性的，表现为部分地或完全地治愈疾病和/或由该疾病造成的负面作用。在一个方面，治疗表示使用已建立的规模的疾病症状的减少。
IGRP是由基因IDDM7（2q31）（位于染色体2q28-32，与T1D易感基因重叠）编码的，近期它也被识别为人类T1D中潜在相关的β-细胞自身抗原。通过表达HLA-A*0201转基因的、来自鼠类I类MHC缺失的NOD小鼠的胰岛相关的CD8+细胞识别了人类IGRP的两个HLA-A*0201-结合表位（hIGRP228-236和hIGRP265-273）。结合至鼠类II类MHC分子（IAg7）的IGRP抗原的非限制性例子包括例如IGRP206-214（其包含抗原肽VYLKTNVFL）、IGRP4-22（其包含抗原肽LHRSGVLIIHHLQEDYRTY或其等价物）和IGRP128-145（其包含抗原肽TAALSYTISRMEESSVTL或其等价物）。
“防止”是指在体外或体内防止在倾向于患有疾病或具有作用的系统或对象中出现的该疾病或作用。
“组合物”是指活性试剂和惰性（例如可检测试剂或标记物）或活性的另一种化合物或组合物（例如佐剂）的组合。在一些实施例中，该组合物不包含助剂。
“药物组合物”包括活性试剂与惰性或活性的载体的组合，所述载体使得该组合物适于体外、体内或间接体内的诊断或治疗用途。
术语“功能上等同的密码子”是指编码相同氨基酸的密码子，例如精氨酸或丝氨酸的6个密码子，并且也指编码生物学等价氨基酸的密码子（见下表）。
密码子表
。
如本文所使用的，“蛋白质”或“多肽”或“肽”是指包含至少五个氨基酸残基的分子。
本发明的其他目的、特点和优点将从以下详细描述中明显看出。但是，要理解的是，详细的描述和具体的例子虽然表示了本发明的具体实施方式，但仅为了解释的目的而给出，因为对于本领域技术人员明显的是，可根据该详细的描述，在本发明的范围内做出各种改变和修饰。
描述性实施方式
目前没有治疗平台使得能够完全抑制多克隆自身免疫反应而不影响全身免疫。本文描述的本申请人的发现使得能够设计自身免疫性疾病特异性药物，该药物使自身反应性疾病特异的CD4+ T细胞和B细胞转变为同源的、单特异性的调节CD4+ T细胞和B细胞，它们协同地抑制宿主的所有其他自身反应性T和B细胞反应，不论其精细的抗原特异性，但是具有灵敏的疾病特异性，而不会损害全身免疫。
型糖尿病（T1D）的自身抗原复杂性
T1D是由逐渐侵蚀胰岛β细胞的慢性自身免疫反应引起的。在人类和NOD小鼠中的B细胞破坏都受到识别许多自身抗原的T细胞影响(Tsai, S. et al. (2008) Adv. Immunol.100:79-124; Lieberman, S. et al. (2003) Tissue Antigens 62:359-377)。虽然这些事件的精确序列仍然不明确，但是目前的证据表明：T1D需要CD4+和CD8+细胞；自身反应性T细胞通过结合在局部APC上的B细胞抗原而分化为杀伤子；这些T细胞靶定相当多的自身抗原(Tsai, S. et al. (2008) Adv. Immunol. 100:79-124; Santamaria, P. (2010)Immunity 32:437-445)。
已经表明，可溶性肽能够引起体内的肽特异性T细胞耐受，但是不能够钝化多特异性自身免疫反应(Han et al. (2005) Nature Medicine 11(6):645-652)。令人意外地，已经发现，与使用可溶性肽的治疗不同，使用涂布有单T1D相关的I型pMHC的NP的治疗（最初被用作阴性对照）钝化了糖尿病前期NOD小鼠的恶化并且恢复了糖尿病动物中的正常血糖(Tsai, S. et al. (2010) Immunity 32:568-580)。后续的工作意外地发现，pMHC-NP治疗通过以表位特异性的方式使经历了自身抗原的自身反应性CD8+细胞扩增而发生作用，这些CD8+细胞通过抑制和杀死装载了自身抗原的APC，从而抑制其他自身抗原性T细胞特异性的招募。更近地，申请人发现，该治疗平台可以被用于自身反应性T调节CD4+细胞的体外扩增。特别地，申请人发现，涂布有单个T1D相关的II类pMHC的NP使疾病特异性TR1 CD4+ T细胞扩增，表达TR1标记物CD49b 和LAG3 (Gagliani, N. et al. (2013) Nature Medicine 19:739-746)并产生细胞因子IL10和TGF-β（见以下）。
这些发现共同地支持了自身免疫的进展中的新范例，其中通过内源性表位进行的初始自身反应性CD8+或CD4+ T细胞的慢性刺激触发了它们分化为记忆样自身反应性调节T细胞；这些记忆自身反应性调节细胞通过抑制和/或杀死装载了自身抗原的APC，抑制同源和非同源的高亲和力的自身反应性T细胞特异性的激活(Tsai, S. et al. (2010)Immunity 32:568-580)。重要地，并且不受理论约束，当被作为配体涂布至NP上时，在自身免疫性疾病（在众多之中的）中涉及的任何单个表位（pMHC）特异性都可以被用来钝化复杂的自身免疫反应。申请人相信，这些NP制剂不能激活初始T细胞，从而诱导效应T细胞反应，因为它们缺少关键的共刺激分子（例如CD80和CD86）。实际上，同源的初始和效应自身反应性细胞通过该方法被删除。所以，实行其发现的治疗方法为自身免疫中的一类新的治疗提供了平台，它潜在地能够以疾病和器官特异性的方式解决多克隆自身免疫反应，而不会影响全身免疫。
方法
本发明还提供了医疗和诊断方法。在一个方面，提供了一种用于在有需要的对象中以抗原特异性方式促进B调节细胞和/或TR1细胞（例如TR1和CD4+细胞）的形成、扩增和招募的方法，所述方法包括以下步骤、或实质上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：向所述对象施用有效量的本文所述的NP-复合物或组合物。
在另一个方面，提供了一种在有需要的对象中治疗或防止自身免疫性疾病或病症（例如MS、MS相关的疾病、糖尿病或糖尿病前期）的方法，所述方法包括以下步骤、或实质上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：向所述对象施用有效量的本文所述的NP-复合物或组合物，其中抗原对于将要治疗的疾病是疾病相关的，例如，对于糖尿病的防止或治疗，抗原是糖尿病相关的抗原。在进一步的方面，自身免疫性疾病是多发性硬化或多发性硬化相关的疾病并且抗原是MS相关的。
用于治疗或防止糖尿病前期或糖尿病的肽抗原包括但不限于：hInsB10-18(HLVEALYLV)、hIGRP228-236 (LNIDLLWSV)、hIGRP265-273 (VLFGLGFAI)、IGRP206-214(VYLKTNVFL)、NRP-A7 (KYNKANAFL)、NRP-I4 (KYNIANVFL)、NRP-V7 (KYNKANVFL)、YAI/Db(FQDENYLYL)和/或INS B15–23 (LYLVCGERG)、GAD65114-123、VMNILLQYVV；GAD65536-545、RMMEYGTTMV；GFAP143-151、NLAQTDLATV；GFAP214-222、QLARQQVHV；IA-2172-180、SLSPLQAEL；IA-2482-490、SLAAGVKLL；IA-2805-813、VIVMLTPLV；ppIAPP5-13、KLQVFLIVL；ppIAPP9-17、FLIVLSVAL；IGRP152-160、FLWSVFMLI；IGRP211-219、NLFLFLFAV；IGRP215-223、FLFAVGFYL；IGRP222-230、YLLLRVLNI；IGRP228-236、LNIDLLWSV；IGRP265-273、VLFGLGFAI；IGRP293-301、RLLCALTSL；Pro-insulinL2-10、ALWMRLLPL；Pro-insulinL3-11、LWMRLLPLL；Pro-insulinL6-14、RLLPLLALL；Pro-insulinB5-14、HLCGSHLVEA；Pro-insulinB10-18、HLVEALYLV；Pro-insulinB14-22、ALYLVCGER；Pro-insulinB15-24、LYLVCGERGF；Pro-insulinB17-25、LVCGERGFF；Pro-insulinB18-27、VCGERGFFYT；Pro-insulinB20-27、GERGFFYT；Pro-insulinB21-29、ERGFFYTPK；Pro-insulinB25-C1、FYTPKTRRE；Pro-insulinB27-C5、TPKTRREAEDL；Pro-insulinC20-28、SLQPLALEG；Pro-insulinC25-33、ALEGSLQKR；Pro-insulinC29-A5、SLQKRGIVEQ；Pro-insulinA1-10、GIVEQCCTSI；Pro-insulinA2-10、IVEQCCTSI；Pro-insulinA12-20、SLYQLENYC 或其等价物和/或组合。额外的例子包括：ProIns 76-90、SLQPLALEGSLQKRG、ProIns 79-89、PLALEGSLQKR、ProIns 90-109、GIVEQCCTSICSLYQLENYC、ProIns 94-105、QCCTSICSLYQL、GAD 247-266、NMYAMMIARFKMFPEVKEKG、GAD 255-265、RFKMFPEVKEK、GAD 555-567、NFFRMVISNPAAT、IGRP13-25、QHLQKDYRAYYTF、IGRP 8-27、GVLIIQHLQKDYRAYYTFLN、ProIns B24-C36、FFYTPMSRREVED及其每个的等价物。
当所述方法涉及MS或MS相关的疾病的治疗时，所述复合物包括涉及多发性硬化的抗原。这些抗原包括例如在美国专利公开2012/0077686号中公开的抗原，以及来源于髓鞘碱性蛋白、髓鞘相关糖蛋白、髓鞘少突胶质细胞蛋白、蛋白脂质蛋白、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白、髓鞘相关的少突胶质细胞碱性蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白NOGO A、糖蛋白Po、外周髓鞘蛋白22、以及2'3'环状核苷酸3'-磷酸二酯酶的抗原。在一些实施例中，所述抗原来源于髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）。非限制性的例子包括例如MAG287-295、SLLLELEEV；MAG509-517、LMWAKIGPV；MAG556-564、VLFSSDFRI；MBP110-118、SLSRFSWGA；MOG114-122、KVEDPFYWV；MOG166-175、RTFDPHFLRV；MOG172-180、FLRVPCWKI；MOG179-188、KITLFVIVPV；MOG188-196、VLGPLVALI；MOG181-189、TLFVIVPVL；MOG205-214、RLAGQFLEEL； PLP80-88、FLYGALLLA或其等价物或组合。
能够被用在本发明中的抗原的其他非限制性例子包括多肽，这些多肽包括以下多肽、或实质上由以下多肽组成、或由以下多肽组成：MOG35-55、MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK；MOG36-55、EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK；MAG287-295、SLLLELEEV；MAG509-517、LMWAKIGPV；MAG556-564、VLFSSDFRI；MBPI110-118、SLSRFSWGA；MOG114-122、KVEDPFYWV；MOG166-175、RTFDPHFLRV；MOG172-180、FLRVPCWKI；MOG179-188、KITLFVIVPV；MOG188-196、VLGPLVALI；MOG181-189、TLFVIVPVL；MOG205-214、RLAGQFLEEL；PLP80-88、FLYGALLLA或其每一个的等价物、或其组合。
确定和监控疗法的方法在本领域是已知的，并在本文简要描述。当在体外递送时，施用通过将组合物与组织或细胞以任何适当方法接触而进行，例如，通过施用至细胞或组织培养基，并且用作筛选器以确定该疗法是否适合某个个体或者用以筛选出替代性疗法，从而作为所公开的组合物的替代或与其结合。当在体内递送时，施用通过全身或局部施用进行。在体内，所述方法可在人体施用之前在非人动物上实施，以筛选出替代性疗法，从而作为所公开的组合物的替代或与其结合。在人或非人哺乳动物中，它们对于治疗疾病或病症也是有用的。
上述方法要求有效量的NP-复合物的施用。
抗原-MHC-纳米颗粒复合物的MHC可为MHC I、MHC II或非经典MHC，但优选MHCII。MHC蛋白在本文中有描述。在一个实施方式中，抗原-MHC-纳米颗粒复合物的MHC是I类MHC。在另一个实施方式中，该MHC是II类MHC。在其他实施方式中，抗原-MHC-纳米颗粒复合物的MHC成分是II类MHC或如本文所述的非经典MHC分子。在一个方面，所述抗原包括以下多肽GWYRSPFSRVVH或GWYRSPFSRVVH的等价物、或实质上由其组成、或由其组成。
纳米颗粒的尺寸可在约1 nm至约1 μm之间变化。在某些实施方式中，纳米颗粒的直径小于约1 μm。在其他实施方式中，纳米颗粒的直径小于约500 nm、小于约400 nm、小于约300 nm、小于约200 nm、小于约100 nm、或小于约50 nm。在另外的实施方式中，纳米颗粒的直径为约1 nm至约10 nm、15 nm、20 nm、25 nm、30 nm、40 nm、50 nm、75 nm或100 nm。在具体的实施方式中，纳米颗粒为约1 nm至约100 nm、约1 nm至约50 nm、约1 nm至约20 nm、或约5 nm至约20 nm。
复合物的尺寸可在约5 nm至约1 μm之间变化。在某些实施方式中，复合物的直径小于约1 μm或小于100 nm。在其他实施方式中，复合物的直径小于约500 nm、小于约400nm、小于约300 nm、小于约200 nm、小于约100 nm、或小于约50 nm。在进一步的实施方式中，复合物为约5 nm或10 nm至约50 nm、或约5 nm至约75 nm、或约5 nm至约50 nm、或约5 nm至约 60 nm、或约10 nm至约60 nm，或者在一个方面为约55 nm。
申请人已经发现，纳米颗粒上的抗原-MHC复合物的密度对治疗效果有贡献。因此，如本文公开的，抗原-MHC纳米颗粒复合物可以具有所定义的密度，该密度为包括该复合物的纳米颗粒的每100 nm2表面积上约0.05个MHC分子，假设至少2 MHC、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12（个）MHC被复合至纳米颗粒。在一个方面，复合物的MHC密度为每100 nm2约0.01 MHC (0.05 MHC/100 nm2)至约30 MHC/100 nm2、或约0.1 MHC/100 nm2至约25 MHC/100 nm2、或约0.3 MHC/100 nm2至约25 MHC/100 nm2、或约0.4 MHC/100 nm2至约25 MHC/100 nm2、或约0.5 MHC/100 nm2至约20 MHC/100 nm2、或约0.6 MHC/100 nm2至约20MHC/100 nm2、或约1.0 MHC/100 nm2至约20 MHC/100 nm2、或约5.0 MHC/100 nm2至约20MHC/100 nm2、或约10.0MHC/100 nm2至约20 MHC/100 nm2、或约15 MHC/100 nm2至约20MHC/100 nm2、或至少约0.5、或至少约1.0、或至少约5.0、或至少约10.0、或至少约15.0MHC/100 nm2。在一个方面，当9或至少9（个）MHC被复合至纳米颗粒时，密度范围是约0.3MHC/100nm2至约20 MHC/100nm2。
在其方法的一个方面，提供了一种用于在有需要的患者中积累B调节细胞和/或抗炎T细胞的方法。在进一步的实施方式中，T细胞是CD4+或CD8+ T细胞。在相关的实施方式中，T细胞分泌IL-10或TGFβ。所述方法包括以下步骤、或实质上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：向所述患者施用有效量的本文所述的抗原-MHC纳米颗粒复合物。
在一个实施方式中，本文所述的组合物和方法是用于治疗自身免疫性疾病，例如MS、MS相关的疾病、糖尿病或糖尿病前期。所述方法包括以下步骤、或实质上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：向由此需要的患者施用有效量的本文所述的抗原- MHCII纳米颗粒复合物。
在本文中描述了关于体外和体内施用的模型的细节。
本发明还提供了NP-复合物用于制备用于治疗和/或防止本文所述的疾病或病症的药物的用途。
抗原-MHC-纳米颗粒复合物
A. 多肽和多核苷酸
另一些方面涉及分离和或纯化的多肽抗原，其包含以下组分、或实质上由以下组分构成、或由以下组分构成：本文所述的氨基酸序列，或与抗原的氨基酸序列具有至少约80%的序列一致性、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少98%的序列一致性的多肽，或由与编码抗原的氨基酸序列的多核苷酸具有至少约80%的序列一致性、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少98%的序列一致性的多核苷酸或其互补序列编码的多肽，或由在中等至高严格条件下与编码抗原的氨基酸序列的多核苷酸或其互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽。本发明还提供了分离的和纯化的编码本文所述的抗原多肽的多核苷酸，或与本文公开的序列具有至少约80%的序列一致性、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少98%的序列一致性的氨基酸或等价物，或者是在严格条件下与所述多核苷酸、其等价物或其互补序列杂交的多核苷酸，并且提供了由这些多核苷酸编码的分离且纯化的多肽。这些多肽和多核苷酸能够与它们在天然状态下不联合在一起的非天然的物质联合在一起，这些物质例如是载体、药学上可接受的载体、运载体和MHC分子、本领域已知的和本文所述的纳米颗粒。
来自抗原物种（antigenic species）的抗原（包括区段、片段和其他分子），包括但不限于，由本发明的经典和非经典MHC分子提呈的肽、碳水化合物、脂质或其他分子，通常被复合或可操作地连接至MHC分子或其衍生物。T淋巴细胞的抗原识别受限于主要组织相容性复合物（MHC）。特定的T淋巴细胞仅在其被结合至特定的MHC分子时才识别抗原。一般而言，T淋巴细胞仅在存在自身MHC分子的情况下被刺激，并且当抗原的片段结合至自身MHC分子时抗原被识别。MHC限制作用确定出了T淋巴细胞特异性，表现在所识别的抗原以及结合其抗原片段的MHC分子方面。在特定的方面，某些抗原可与某些MHC分子或由其衍生的多肽配对。
本文使用的术语“可操作地连接”或“涂布”是指单个多肽（例如MHC）和抗原（例如肽）成分被结合从而在结合于靶定位点（例如免疫细胞）之前形成活性复合物的情况。这包括单个多肽复合物成分被合成或重组表达并随后被分离和组合以在施用至对象之前在体外形成复合物的情况；嵌合或融合多肽（即复合物的每个离散的蛋白质成分被包含在单个多肽链中）被合成或重组表达为完整复合物的情况。通常，多肽复合物被添加至纳米颗粒以产生具有被吸附的或链接的多肽复合物的纳米颗粒，其中分子的数量:纳米颗粒的数量的比率为从约、至少约、或至多约0.1、0.5、1、3、5、7、10、15、20、25、30、35、40、50、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500或更多:1，更常见地为0.1:1、1:1至50:1或300:1。纳米颗粒的多肽含量可利用标准技术来确定。
分子
细胞内抗原和细胞外抗原对免疫系统的作用在识别和适当响应方面有很大区别。抗原向T细胞的提呈通过两种不同种类的分子来介导，即I类MHC（MHC-I）和II类MHC（MHC-II）（在本文中还被称为“pMHC”），它们使用不同的抗原加工途径。来源于细胞内抗原的肽由I类MHC分子提呈至CD8+ T细胞，I类MHC分子几乎在所有细胞上都表达，而细胞外抗原来源的肽由MHC-II分子提呈至CD4+ T细胞。但是，这种二分法也有例外。多项研究显示，由胞饮颗粒生成的多肽或可溶性蛋白质在巨噬细胞以及树突细胞中被提呈在MHC-I分子上。在本发明的某些实施方式中，特定的抗原在合适MHC I类或II类多肽的情况下被识别并被提呈在抗原-MHC-纳米颗粒复合物中。在某些方面，对象的基因组成可被评估从而确定哪种MHC多肽要被用于特定的患者以及特定一组的肽。在一些实施方式中，I类MHC成分包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G或CD-1的全部或部分。在MHC成分是II类MHC成分的实施方式中，所述II类MHC成分可以包括HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP的全部或部分。
预期非经典MHC分子也可用在本发明的MHC复合物中。非经典MHC分子是非多态性的，在物种之间是保守的，并且具有狭窄、深的、疏水的配体结合袋。这些结合袋能够将糖脂和磷脂提呈至自然杀伤T（NKT）细胞或特定亚型的CD8+ T细胞（例如Qa1或HLA-E-限制的CD8+ T细胞）。NKT细胞是独特的淋巴细胞群，其共表达NK细胞标记物和半不变（semi-invariant）T细胞受体（TCR）。它们参与了与许多疾病相关的免疫响应的调节。
抗原成分
本发明的某些方法包括关于抗原成分的方法和组合物，所述抗原成分包括多肽的区段、片段或表位、肽、核酸、碳水化合物、脂质和其他引起或诱导抗原响应的分子（统称为抗原）。具体而言，抗原决定簇的抗原区段或片段，经自身免疫响应导致细胞破坏，其可以被识别并用于制造本文所述的抗原-MHC-纳米颗粒复合物。本发明的实施方式包括用于调节身体的细胞或组织中的免疫响应的组合物和方法。
本发明的抗原多肽和肽可通过各种氨基酸缺失、插入和/或取代而被修饰。在特定实施方式中，经修饰的多肽和/或肽能够调节对象中的免疫响应。在一些实施方式中，使用了野生型的蛋白质或肽，但在本发明的许多实施方式中，使用了经修饰的蛋白质或多肽以生成抗原-MHC-纳米颗粒复合物。抗原-MHC-纳米颗粒复合物可被用来产生抗炎免疫响应，从而改变免疫系统的T细胞群（即，改造免疫系统），和/或为特定组织招募和累积抗炎T细胞。以上所述术语可在本文中被互换使用。“经修饰的蛋白质”或“经修饰的多肽”或“经修饰的肽”是指相对于野生型蛋白质或多肽化学结构（特别是其氨基酸序列）被改变了的蛋白质或多肽。在一些实施方式中，经修饰的蛋白质或多肽或肽具有至少一种经改变的活性或功能（要意识到蛋白质或多肽或肽可具有多种活性或功能）。特别预期的是，经修饰的蛋白质或多肽或肽的一种活性或功能可被改变，但另一方面可保留一种野生型活性或功能，例如免疫原性或在MHC-纳米颗粒复合物的情况下的与免疫系统的其他细胞相互作用的能力。
肽抗原的非限制性例子包括但不限于：hInsB10-18 (HLVEALYLV)、hIGRP228-236(LNIDLLWSV)、hIGRP265-273 (VLFGLGFAI)、IGRP206-214 (VYLKTNVFL)、NRP-A7 (KYNKANAFL)、NRP-I4 (KYNIANVFL)、NRP-V7 (KYNKANVFL)、YAI/Db (FQDENYLYL)和/或INS B15–23(LYLVCGERG)，以及在美国专利申请公开2005/0202032号中公开的肽和蛋白以及其等价物和/或组合。
在一些方面，用于T1D的治疗的肽抗原是GAD65114-123、VMNILLQYVV；GAD65536-545、RMMEYGTTMV；GFAP143-151、NLAQTDLATV；GFAP214-222、QLARQQVHV；IA-2172-180、SLSPLQAEL；IA-2482-490、SLAAGVKLL；IA-2805-813、VIVMLTPLV；ppIAPP5-13、KLQVFLIVL；ppIAPP9-17、FLIVLSVAL；IGRP152-160、FLWSVFMLI；IGRP211-219、NLFLFLFAV；IGRP215-223、FLFAVGFYL；IGRP222-230、YLLLRVLNI；IGRP228-236、LNIDLLWSV；IGRP265-273、VLFGLGFAI；IGRP293-301、RLLCALTSL；Pro-insulinL2-10、ALWMRLLPL；Pro-insulinL3-11、LWMRLLPLL；Pro-insulinL6-14、RLLPLLALL；Pro-insulinB5-14、HLCGSHLVEA；Pro-insulinB10-18、HLVEALYLV；Pro-insulinB14-22、ALYLVCGER；Pro-insulinB15-24、LYLVCGERGF；Pro-insulinB17-25、LVCGERGFF；Pro-insulinB18-27、VCGERGFFYT；Pro-insulinB20-27、GERGFFYT；Pro-insulinB21-29、ERGFFYTPK；Pro-insulinB25-C1、FYTPKTRRE；Pro-insulinB27-C5、TPKTRREAEDL；Pro-insulinC20-28、SLQPLALEG；Pro-insulinC25-33、ALEGSLQKR；Pro-insulinC29-A5、SLQKRGIVEQ；Pro-insulinA1-10、GIVEQCCTSI；Pro-insulinA2-10、IVEQCCTSI；Pro-insulinA12-20、SLYQLENYC或其等价物和/或组合。
抗原的其他非限制性例子包括能够被用在本发明中的MS和MS相关的抗原，它们包括以下多肽、或实质上由以下多肽组成、或由以下多肽组成：MOG35-55、MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK；MOG36-55、EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK；MAG287-295、SLLLELEEV；MAG509-517、LMWAKIGPV；MAG556-564、VLFSSDFRI；MBPI110-118、SLSRFSWGA；MOG114-122、KVEDPFYWV；MOG166-175、RTFDPHFLRV；MOG172-180、FLRVPCWKI；MOG179-188、KITLFVIVPV；MOG188-196、VLGPLVALI；MOG181-189、TLFVIVPVL；MOG205-214、RLAGQFLEEL；PLP80-88、FLYGALLLA、或其每一个的等价物、或其组合。
在进一步的方面，用于治疗MS和MS相关的疾病的肽抗原包括但不限于：MOG35-55、MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK；MOG36-55、EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK；MAG287-295、SLLLELEEV；MAG509-517、LMWAKIGPV；MAG556-564、VLFSSDFRI；MBP110-118、SLSRFSWGA；MOG114-122、KVEDPFYWV；MOG166-175、RTFDPHFLRV；MOG172-180、FLRVPCWKI；MOG179-188、KITLFVIVPV；MOG188-196、VLGPLVALI；MOG181-189、TLFVIVPVL；MOG205-214、RLAGQFLEEL；PLP80-88、FLYGALLLA MAG287-295、SLLLELEEV；MAG509-517、LMWAKIGPV；MAG556-564、VLFSSDFRI、及其等价物和/或组合。
用于治疗MS和MS相关的疾病的抗原包括在美国专利申请公开2012/0077686号中公开的抗原、以及来源于髓鞘碱性蛋白、髓鞘相关糖蛋白、髓鞘少突胶质细胞蛋白、蛋白脂质蛋白、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白、髓鞘相关的少突胶质细胞碱性蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白NOGO A、糖蛋白Po、外周髓鞘蛋白22、以及2'3'环状核苷酸3'-磷酸二酯酶的抗原。在一些实施例中，所述抗原来源于髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）。
在一些实施方式中，蛋白质或多肽（野生型或经修饰）（包括感兴趣的蛋白质或肽的任何复合物，特别是MHC-肽融合体）的尺寸可包含，但不限于，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500个氨基分子或更多，包括延伸出的任何范围或值，以及它们的衍生物。在某些方面，5、6、7、8、9、10或更多个连续的氨基酸（包括其衍生物）和抗原的片段（例如本文所公开和引用的那些氨基酸序列）可被用作抗原。预期的是，多肽可通过截断而突变，使得它们短于它们相应的野生型形式，但它们也可能通过融合或结合具有特定功能（例如为实现以蛋白质复合物形式呈现，或为实现增强的免疫原性等等）的异源蛋白质序列而被改变。
蛋白质组合物可通过本领域技术人员已知的任何技术来制备，包括（i）通过标准化分子生物学技术表达蛋白质、多肽或肽，（ii）从自然来源中分离蛋白质化合物，或（iii）化学合成蛋白质物质。各种基因的核苷酸以及蛋白质、多肽和肽序列之前已公开，并且可在公认的计算机数据库中找到。一种这样的数据库是美国国家生物技术信息中心的GenBank和GenPept数据库（网址ncbi.nlm.nih.gov/）。这些基因的全部或部分编码区可利用本文公开的技术或本领域技术人员已知的技术来扩增和/或表达。
这些组合物的自身抗原表位和其他多肽的氨基酸序列变化可以是取代变化、插入变化或缺失变化。本发明的多肽的修饰，与野生型相比，可能影响肽或多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500个或更多个非连续或连续的氨基酸。
缺失改变通常缺乏了天然或野生型氨基酸序列的一个或多个残基。可能缺失单个残基，或者缺失多个连续的氨基酸。终止密码子可被引入（通过取代或插入）到编码核酸序列中，以产生截短蛋白。插入突变通常涉及在多肽的非末端位点添加物质。这可包括插入一个或多个残基。也可以进行末端添加，产生所谓的融合蛋白。
取代变化通常包含在蛋白质内的一个或多个位点处的一个氨基酸与另一个氨基酸的替换，并且可被设计用来调节多肽的一种或多种性质，并伴随其他功能或性质的保留或丧失。取代可以是保守性的，即，一个氨基酸被具有相似形状和电荷的氨基酸替代。保守性取代在本领域是熟知的，包括例如以下改变：丙氨酸到丝氨酸；精氨酸到赖氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸到谷氨酸；半胱氨酸到丝氨酸；谷氨酰胺到天冬酰胺；谷氨酸到天冬氨酸；甘氨酸到脯氨酸；组氨酸到天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸到亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸到缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸到精氨酸；蛋氨酸到亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；丝氨酸到苏氨酸；苏氨酸到丝氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸到异亮氨酸或亮氨酸。可替换地，取代可以是非保守的，因而多肽或肽的功能或活性受到影响，例如对细胞受体的亲合力或亲和性受到影响。非保守性变化通常涉及以化学上不相似的残基来取代一个残基，例如极性或带电荷的氨基酸对非极性或不带电荷的氨基酸的取代，以及相反的情况。
本发明的蛋白质可以是重组的，或在体外合成的。可替代地，重组蛋白可从细菌或其它宿主细胞中分离出来。
还要理解的是，氨基酸和核酸序列可包括额外的残基，例如分别是额外的N-或C-末端氨基酸，或5'或3'的核酸序列，但仍然基本上是如本文所公开的其中一个序列的序列，只要该序列符合如上所述的条件，包括生物学蛋白活性（例如免疫原性）的维持。添加末端序列特别适用于核酸序列，其可例如包括在5'或3'编码区的侧翼的各种非编码序列。
预期的是，在本发明的组合物中，每ml含有约0.001 mg至约10 mg的总蛋白质。因此，组合物中的蛋白质的浓度可为约、至少约或至多约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、50、100 µg/ml或mg/ml或更高（或由此衍生的任何范围值）。其中，约、至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%可以是抗原-MHC-纳米颗粒复合物。
另外，美国专利4,554,101号 (Hopp)教导了表位的识别以及基于亲水性由主要氨基酸序列制备表位，该专利通过引用合并至本文中。通过Hopp公开的方法，本领域技术人员能够从氨基酸序列中识别出潜在的表位，并确认它们的免疫原性。许多科技文献也涉及到二级结构的预测以及根据氨基酸序列的分析来识别表位(Chou & Fasman, Adv.Enzymol., 47:45-148, 1978; Chous and Fasman, Annu, Rev. Biochem., 47:251-276,1978, Chou and Fasman, Biochemistry, 13(2):211-222, 1974; Chau and Fasman,Biochemistry, 13(2):222-245, 1974, Chou and Fasman, Biophys. J., 26(3):385-399, 1979)。如果期望的话，任何这些文献都可被用来补充Hopp在美国专利4,554,101号中的教导。
对于任何特定的自身免疫性疾病，可以使用本领域已知的方法识别和预选择抗原MHC复合物。算法存在-来源于已知会结合至特定的MHC分子的一组对齐的肽，其可以被用作肽-MHC结合和T细胞表位的预测器。
非肽分子可作为抗原或抗原片段而与MHC分子复合，这样的分子包括，但不限于，碳水化合物、脂质、小分子等。碳水化合物是多种细胞的外表面的主要成分。某些碳水化合物是不同分化阶段的特征，并且很多时候这些碳水化合物被特异性抗体识别。独特的碳水化合物的表达可被限制至特定的细胞类型。
底物/纳米颗粒
在某些方面，抗原/ MHC复合物被可操作地连接至基底（底物），它可被共价或非共价地结合至基底。基底可以是纳米颗粒的形式，其任选地包括生物相容性的和/或生物可吸收材料。因此，在一个实施方式中，所述纳米颗粒是生物相容性的和/或生物可吸收的。在另一个方面，所述纳米颗粒具有固体核心和/或并非是脂质体。基底也可以是例如那些在美国专利公开2009/0155292号中所述的纳米颗粒的形式。纳米颗粒的结构的尺寸可变，已知的有纳米球、纳米颗粒或生物相容性的生物可降解的纳米球或生物相容性的生物可降解的纳米颗粒。含有抗原/ MHC复合物的这种粒状制剂可通过该复合物与纳米颗粒的共价或非共价结合而形成。
纳米颗粒通常由实质上球形的核构成，并且任选地包含一个或多个层。该核的尺寸和成分可变化。除了核之外，纳米颗粒可具有一个或多个层以提供适合应用目的的功能性。如果存在层的话，层的厚度可根据具体的应用需要而变化。例如，层可赋予有用的光学性质。
层也可赋予化学或生物学功能性，在本文这称为化学活性层或生物学活性层，并且对于这些功能性而言，该层或这些层通常的厚度为约0.001微米（1纳米）至约10微米或更大（取决于期望的纳米颗粒直径），这些层通常被施用在纳米颗粒的外表面。
核和层的成分可不同。颗粒或核的合适材料包括，但不限于，聚合物、陶瓷材料、玻璃、矿物质等。例子包括，但不限于，标准和特种玻璃、二氧化硅、聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸酯、丙烯酸聚合物、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈、聚酰胺、含氟聚合物、有机硅、纤维素、硅、金属（例如，铁、金、银）、矿物质（例如红宝石）、纳米颗粒（例如，金纳米颗粒、胶体粒子、金属氧化物、金属硫化物、金属硒化物和磁性材料（如铁的氧化物）），以及它们的复合材料。核可以为同质成分，或根据期望的性质可为两种或更多种材料的复合材料。在某些方面，会使用金属纳米颗粒。这些金属颗粒或纳米颗粒可由Au、Pt、Pd、Cu、Ag、Co、Fe、Ni、Mn、Sm、Nd、Pr、Gd、Ti、Zr、Si、和In、前体、它们的二元合金、它们的三元合金以及它们的金属间化合物形成。参见美国专利6,712,997号。在某些实施方式中，如果纳米颗粒是生物相容性的和生物可吸收的，核和层的成分可不同。核可为同质成分，或根据期望的性质可为两种或更多种材料的复合材料。在某些方面，会使用金属纳米球。这些金属纳米颗粒可由Fe、Ca、Ga等形成。在某些实施方式中，所述纳米颗粒包括的核包括金属或金属氧化物，例如金或氧化铁。
如前所述，纳米颗粒除包括核之外还可包括一个或多个层。纳米颗粒可包括由生物可降解糖或其他聚合物构成的层。生物可降解层的例子包括但不限于葡聚糖；聚（乙二醇）；聚（环氧乙烷）；甘露醇；基于聚丙交酯（PLA）、聚乙交酯（PGA）、聚己内酯（PCL）的聚酯；PHB-PHV类的聚羟基链烷酸酯 ；和其它改性的聚糖，例如淀粉、纤维素和壳聚糖。此外，纳米颗粒可包括具有用于附接化学功能性以实现化学键合或结合位点的合适表面的层。
层可通过本领域技术人员已知的多种方式产生于纳米颗粒上。例子包括溶胶-凝胶化学技术，例如Iler, Chemistry of Silica, John Wiley & Sons, 1979; Brinkerand Scherer, Sol-gel Science, Academic Press, (1990)所描述的。其他在纳米颗粒上产生层的途径包括表面化学和包封技术，例如在Partch and Brown, J. Adhesion, 67:259-276, 1998; Pekarek et al., Nature, 367:258, (1994); Hanprasopwattana,Langmuir, 12:3173-3179, (1996); Davies, Advanced Materials, 10:1264-1270,(1998)以及其中所引用的文献中所描述的。也可以使用蒸汽沉积技术，参见例如Golmanand Shinohara, Trends Chem. Engin., 6:1-6, (2000)；和美国专利6,387,498号。其他途径包括逐层自组装技术，例如在Sukhorukov et al., Polymers Adv. Tech., 9(10-11):759-767, (1998); Caruso et al., Macromolecules, 32(7):2317-2328, (1998);Caruso et al., J.Amer. Chem. Soc., 121(25):6039-6046, (1999)；美国专利 6,103,379号以及其中所引用的文献中所描述的。
如在美国专利4,589,330号或4,818,542号中所教导的，纳米颗粒可通过接触含有抗原/MHC/共刺激分子复合物的水相、聚合物和非水相，随后蒸发非水相以导致颗粒从水相聚结而形成。用于此制备的优选聚合物是选自以下物质的天然的或合成的共聚物或聚合物：明胶琼脂、淀粉、阿拉伯半乳聚糖、白蛋白、胶原蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)丙交酯聚（ε己内酯）、聚（ε-己内酯-共聚-乳酸）、聚（ε-己内酯-共聚-乙醇酸）、聚（β羟基丁酸）、聚环氧乙烷、聚乙烯、聚（烷基-2-氰基丙烯酸酯）、聚（甲基丙烯酸羟乙酯）、聚酰胺、聚（氨基酸）、聚（2-羟乙基DL-天冬酰胺）、聚（酯脲）、聚（L-苯丙氨酸/乙二醇/1,6-二异氰酸酯）和聚（甲基丙烯酸甲酯）。特别优选的聚合物是聚酯，如聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)丙交酯聚（ε己内酯）、聚（ε-己内酯-共聚-乳酸）和聚（ε-己内酯 -共聚 - 乙醇酸）。用于溶解聚合物的溶剂包括：水、六氟异丙醇、二氯甲烷、四氢呋喃、己烷、苯或六氟丙酮倍半水合物。
纳米颗粒的尺寸可在约1 nm至约1 μm之间变化。在某些实施方式中，纳米颗粒的直径小于约1 μm。在其他实施方式中，纳米颗粒的直径小于约500 nm、小于约400 nm、小于约300 nm、小于约200 nm、小于约100 nm、或小于约50 nm。在另外的实施方式中，纳米颗粒的直径为约1 nm至约10 nm、15 nm、20 nm、25 nm、30 nm、40 nm、50 nm、75 nm或100 nm。在具体的实施方式中，纳米颗粒为约1 nm至约100 nm、约1 nm至约50 nm、约1 nm至约20 nm、或约5 nm至约20 nm。
复合物的尺寸可在约5 nm至约1 μm之间变化。在某些实施方式中，复合物的直径小于约1 μm或小于100 nm。在其他实施方式中，复合物的直径小于约500 nm、小于约400nm、小于约300 nm、小于约200 nm、小于约100 nm、或小于约50 nm。在进一步的实施方式中，复合物为约10 nm至约50 nm、或约20 nm至约75 nm、或约25 nm至约60 nm、或约30 nm至约60 nm，或者在一个方面为约55 nm。
抗原-MHC复合物与纳米颗粒的结合
为了将底物或纳米球结合至抗原-MHC复合物，可使用以下技术。
该结合可通过化学改性底物或纳米颗粒而实现，改性通常涉及在表面上生成“功能基团”，所述功能基团能够结合至抗原-MHC复合物，和/或将底物或纳米颗粒的可选的化学改性的表面与共价或非共价键合的所谓“连接分子”连接，随后使抗原-MHC复合物与所获得的纳米颗粒反应。
术语“连接分子”是指能够与底物或纳米颗粒连接并且能够连接至抗原-MHC复合物的物质。在一些实施方式中，抗原-MHC复合物通过接头/连接物（linker）被结合至纳米颗粒。合适的连接物的非限制性例子包括多巴胺(DPA)-聚乙二醇(PEG)连接物，例如DPA-PEG-NHS酯、DPA-PEG-邻吡啶基-二硫化物(OPSS)和/或DPA-PEG-叠氮化物。其他连接物包括肽连接物、乙二醇、生物素和链霉亲和素。
本文使用的术语“功能基团”并不限于形成共价键的反应性化学基团，而且包括导致与抗原-MHC复合物形成离子相互作用或氢键的化学基团。而且，要注意的是，无法严格区别在表面上生成的“功能基团”以及含有“功能基团”的连接分子，因为有些时候表面的改性需要较小的连接分子（例如乙二醇）与纳米球表面反应。
功能基团或含有功能基团的连接分子可选自氨基、碳酸基、硫醇、硫醚、二硫化物、胍基、羟基、胺基、邻二醇、醛、α-卤代乙酰基、汞官能（mercury organyles）、酯基、酰基卤、酸硫酯、酸酐、异氰酸酯、异硫氰酸酯、磺酸卤化物、亚氨酸酯、重氮乙酸酯、重氮盐、1,2-二酮、膦酸、磷酸酯、磺酸、唑化物、咪唑、吲哚、N-马来酰亚胺、α-β-羰基化合物、芳基卤化物或其衍生物。
其他具有较高分子量的连接分子的非限制性例子是核酸分子、聚合物、共聚物、可聚合连接剂、二氧化硅、蛋白质和相对于底物或纳米颗粒具有相反极性的表面的链样分子。核酸虽然对于连接分子来说具有互补序列，但其可为含有自身核酸分子的亲和分子提供连接。
共价连接物的具体例子包括聚乙二醇（PEG），例如功能化的PEG。如本文使用的，“功能化的PEG”是指包含末端官能团的PEG基团，这些官能团的非限制性例子包括氨基、巯基、硫醚基、羧基等。在本文的表1和2中提供了多种纳米颗粒上的功能化的PEG连接物的非限制性例子，例如，PEG连接物是巯基-PEG- NH2连接物。
在某些实施方式中，本文所述的连接物具有确定的尺寸。在一些实施方式中，连接物小于约10 kD、小于约5 kD、小于约4.5 kD、小于约4 kD、小于约3.5 kD、小于约3 kD、小于约2.5 kD、小于约2 kD、或小于约1 kD。在另外的实施方式中，连接物为约0.5 kD至约5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5或1 kD。在另外的实施方式中，连接物为约1 kD至约4.5、4、3.5、3、2.5、2或1.5 kD。
可聚合连接剂的例子可为丁二炔、苯乙烯丁二烯、乙酸乙烯酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯基化合物、苯乙烯、氧化硅、氧化硼、磷氧化物、硼酸酯、吡咯、聚吡咯和磷酸酯。
底物或纳米颗粒的表面可被化学修饰，例如通过结合具有功能性反应基团的膦酸衍生物而改性。这些膦酸或膦酸酯衍生物的一个例子是亚氨基-二(亚甲基膦羧基)碳酸，其可通过“Mannich-Moedritzer”反应合成。这种结合反应可与直接从制备工艺获得的或经预处理（例如用三甲基溴硅烷预处理）的底物或纳米球进行。在第一种情况下，膦酸（酯）衍生物可例如置换仍结合至表面的反应介质的成分。这种置换可在较高温度下被增强。另一方面，三甲基溴硅烷被认为用来对含烷基的、基于磷酸的偶联剂进行脱烷基化，从而为膦酸（酯）衍生物产生新的结合位点。膦酸（酯）衍生物或结合至其上的连接分子可表现出与以上给出的相同的功能基团。底物或纳米球的表面处理的另一个例子涉及在二元醇（例如乙二醇）中加热。应注意的是，如果合成已在二元醇中进行的话，那么这种处理是多余的。在这些情况下，直接获得的合成产物可能显示出所需要的功能基团。但是，这种处理适用于在含N-或P-偶联剂中产生的底物或纳米颗粒。如果这样的底物或颗粒经受使用乙二醇的后处理，那么仍结合至底物的反应介质（例如偶联剂）的成分可被该二元醇取代和/或被脱烷基化。
还可以通过具有第二功能基团的伯胺衍生物来取代仍结合至颗粒表面的含N 偶联剂。底物或纳米颗粒的表面也可涂布有二氧化硅。二氧化硅可实现相对简单的有机分子的化学结合，因为二氧化硅容易与有机连接物（例如三乙氧基硅烷或氯硅烷）反应。纳米颗粒表面也可涂布有均聚物或共聚物。可聚合偶联剂的例子是N-(3-氨基丙基)-3-巯基苯甲脒、3-(三甲氧基甲硅烷基) 丙基酰肼和3-三甲氧基甲硅烷基)丙基马来酰亚胺。可聚合偶联剂的其他非限制性例子在本文有提及。这些偶联剂可单独使用或组合使用，这取决于要生成为涂层的共聚物的类型。
另一种可用于含有氧化过渡金属化合物的底物或纳米颗粒的表面改性技术是通过氯气或有机氯化剂将氧化过渡金属化合物转化成相应的氧氯化物。这些氧氯化物能够与亲核试剂反应，例如通常在生物分子中找到的羟基或氨基基团。这种技术使得产生于蛋白质的直接结合（例如通过赖氨酸侧链的氨基基团而结合）。在用氧氯化物进行表面改性后与蛋白质的结合也可利用双功能连接物（例如马来酰亚胺基丙酸酰肼）来实现。
对于非共价连接技术，特别合适的是具有与底物或纳米球表面的极性或电荷相反的极性或电荷的链型分子。可被非共价地连接至核/壳纳米球的连接分子的例子包括阴离子、阳离子或两性离子表面活性剂、酸性或碱性蛋白质、聚胺、聚酰胺、聚砜或聚羧酸。底物或纳米球与具有功能性反应基团的两亲性试剂之间的输水相互作用可产生所需的连接。特别地，具有两亲性特征的链型分子（例如磷脂或可相互交联的衍生多糖）是有用的。这些分子在表面上的吸附可通过共培养来实现。亲和分子和底物或纳米颗粒之间的结合也可基于非共价自组装键来实现。其一个例子包括作为连接分子的具有生物素的简单探针和连接有抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的分子。
功能基团与生物学分子的偶联反应的方案可在文献中找到，例如"BioconjugateTechniques" (Greg T. Hermanson, Academic Press 1996)。生物学分子（例如MHC分子或其衍生物）可根据有机化学的标准程序共价地或非共价地偶联至连接分子，这些标准程序例如是氧化、卤化、烷基化、酰化、添加、取代或酰胺化。偶联所述共价地或非共价地结合的连接分子的这些方法可在将连接分子偶联至底物或纳米球之前或之后进行。而且，通过温育可影响分子向相应的预处理的底物或纳米颗粒（例如通过三甲基溴硅烷预处理）的直接结合，由于该预处理其表现出改性的表面（例如更高的电荷或极性的表面）。
蛋白质生产
本发明描述了用于本发明的各种实施方式的多肽、肽和蛋白质。例如，特定的肽和它们的复合物被分析了它们的引起或调节免疫响应的能力。在特定的实施方式中，本发明的肽或蛋白质的全部或部分也可根据常规技术在溶液中合成或在固体载体上合成。各种自动合成仪在商业上是可获得的，并且可根据已知的方案使用。参见例如Stewart and Young,Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. Ed., Pierce Chemical Co.l, (1984); Tam etal., J. Am. Chem. Soc., 105:6442, (1983); Merrifield, Science, 232(4748):341-347, (1986); 以及Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meinhofer(Eds.), Academic Press, NY, 1-284, (1979)，通过引用将各篇合并至本文中。替代地，重组DNA技术可被使用，其中编码本发明的肽的核苷酸序列被插入到表达载体中，并被转化或转染至合适的宿主细胞，并在适合表达的条件下培养。
本发明的一个实施方式包括使用向细胞（包括微生物）的基因转移，从而生产蛋白质。感兴趣的蛋白质的基因可被转移至合适的宿主细胞，随后在合适条件下培养细胞。编码几乎任何多肽的核酸都可被使用。重组表达载体的产生以及其中包括的元件对于本领域技术人员来说是已知的，并在本文简要描述。哺乳动物宿主细胞系的例子包括，但不限于，ero和Hela细胞，其他B细胞系和T细胞系（例如CEM、721.221、H9、Jurkat、Raji）以及中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN和MDCK细胞。此外，可选择调节被插入序列的表达或以期望的方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这种修饰（例如糖基化）和加工（例如剪切）对于蛋白质的功能是重要的。不同的宿主细胞具有特征性的和特定的蛋白质翻译后加工和修饰机制。可选择合适的细胞系或宿主系统以确保所表达的外源蛋白的正确的修饰和加工。
许多选择系统可被施用，包括但不限于，HSV胸苷激酶基因、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因和腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因，分别在tk细胞、hgprt细胞或aprt细胞中。而且，抗代谢物耐药性可被用作选择的基础：对于dhfr，其赋予甲氧苄氨嘧啶和氨甲蝶呤耐药性；gpt，其赋予霉酚酸耐药性；neo，其赋予氨基糖苷G418耐药性；和hygro，其赋予潮霉素耐药性。
核酸
本发明可包括编码本发明的蛋白质、多肽、肽的重组多核苷酸，例如编码抗原肽的多核苷酸。
在特别的实施方式中，本发明涉及分离的核酸片段以及含有编码自身抗原和/或MHC分子的核酸序列的重组载体。术语“重组”可与多肽或具体多肽的名称结合施用，它通常是指由核酸分子产生的多肽，该核酸分子在体外被操作或者是这种分子的复制产物。
用在本发明中的核酸片段，无论编码序列本身的长度如何，都可与其他核酸序列结合，因而它们的总体长度可有很大变化，所述其他核酸序列例如是启动子、多腺苷酸化信号、其他限制酶切位点、多克隆位点、其他编码片段等。因此，本发明预期可使用几乎任何长度的核酸片段，总长度优选受限于制备的容易程度以及在预期重组核酸方案中的用途。在一些情况下，核酸序列可与其他异源编码序列一起编码多肽，从而例如可纯化出多肽、运输、分泌、翻译后修饰，或用于实现治疗利益（例如靶定或功效）。标签或其他异源多肽可被添加至经改性的多肽编码序列，其中“异源的”是指不与经改性的多肽相同的多肽。
药物组合物和施用
本发明提供用于治疗疾病的药物组合物。
药物组合物
抗原-MHC纳米颗粒复合物可以被单独地施用或与组合物中的载体（例如药学上可接受的载体）联合施用。本发明的组合物可通过注射而不经肠道地常规施用，例如静脉内、皮下或肌内注射。适合其他施用模式的其他制剂包括口服制剂。口服制剂包括那些通常使用的赋形剂，例如药学等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物的形式有溶液、悬浮液、片剂、药片、胶囊、缓释制剂或粉末，并且含有约10%至约95%的活性组分，优选为约25%至约70%。含有改变对象的免疫状态的抗原-MHC-纳米颗粒复合物的水性组合物的制备，根据本发明公开的内容，对于本领域技术人员将是熟知的。在某些实施方式中，组合物可被吸入（例如，美国专利6,651,655号，通过引用将其全部内容合并至本文中）。在一个实施方式中，抗原-MHC-纳米颗粒复合物被全身性施用。
通常，本发明的组合物以与给药制剂相容的方式施用，并且施用的量使得是治疗上有效的和免疫上改变的。施用的量取决于要被治疗的对象。需要施用的活性组分的精确的量取决于操作者的判断。但是，合适的剂量范围是每次施用给予十至几百纳克或微克的级别的抗原-MHC-纳米颗粒复合物。合适的初始施用和加强方案也是变化的，但是典型的是先进行初始施用，接下来进行后续施用。
在许多情况下，期望的是多次施用肽-MHC-纳米颗粒复合物，约、至多约或至少约3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。施用间隔时间通常为2天至十二周，更常见的是一至两周间隔。间隔0.25-5年（通常2年）的周期性加强对于维持免疫系统的状态是合乎需要的。施用过程之后可进行发炎免疫响应实验和/或自身调节抗炎T细胞活性实验。
在一些实施方式中，药物组合物被施用至对象。本发明的不同方面涉及向对象施用有效量的抗原-MHC-纳米颗粒复合物组合物。此外，这种组合物可与免疫系统的调节剂结合施用。这种组合物通常被溶解于或分散于药学上可接受的载体或水性介质中。
术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当施用至动物或人时不会产生负面的、过敏性的或其他不良反应的分子实体和成分。如本文所使用的，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这些介质和试剂用于药学上有活性的物质的用途在本领域是熟知的。除非任何常规介质或试剂不与活性成分相容，预期其可用于免疫原性组合物和治疗性组合物中。
合适注射应用的药物形式包括无菌水溶液或分散体；制剂，包括芝麻油、花生油或水性丙二醇；以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。无论如何，该药物形式都必须是无菌的，并且必须是流体从而它能够容易注射。它还应当在制造和存储条件下是稳定的，并且被保存得不受微生物（例如细菌和真菌）的污染。
组合物可被配制成中性形式或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐（与蛋白质的游离氨基酸一起形成），它们是用无机酸形成的，无机酸例如是盐酸、磷酸，或是用有机酸形成，例如是乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。以游离羧酸基形成的盐也可衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，或衍生自有机碱，例如是异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。
载体可为含有例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、乙二醇和液态聚乙二醇等）、它们的合适的混合物以及植物油的溶剂或分散介质。例如，可利用涂层（例如卵磷脂）、如果是分散体的情况下通过维持所需的颗粒尺寸、以及通过利用表面活性剂，可维持合适的流动性。可通过各种抗菌剂和抗真菌剂来防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒等。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。使用试剂延迟吸收成分，例如单硬脂酸铝和明胶，可为注射组合物带来延长的吸收效果。
无菌注射溶液通过将所需量的活性化合物加入具有各种其他以上所列成分（按需要）的合适溶剂中，随后灭菌而制备。溶液的灭菌方式不应减少抗原-MHC-纳米颗粒复合物的治疗性质。通常，分散体通过将各种灭菌的活性组分加入到无菌载体中而制备，所述无菌载体含有碱性分散介质以及所需的来自以上列出的其他组分。如果是利用无菌粉末来制备无菌注射液，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生了活性组分的以及来自之前灭菌溶液的任何额外的期望组分的粉末。溶液灭菌的一种这样的方法是无菌过滤，但是，本发明意在包括不显著降低抗原-MHC-纳米颗粒复合物的治疗性质的任何灭菌方法。涉及高热高压的灭菌方法（例如高压蒸汽灭菌法）可能会损害复合物的三级结构，因而显著降低抗原-MHC-纳米颗粒复合物的治疗性质。
治疗组合物的有效量是基于预期的目的而确定的。术语“单位剂量”或“剂量”是指适合用于对象的物理上分散的单元，每个单元含有预定量的组合物，该预定量被计算出来以产生以上关于其施用所述的期望响应，即，合适的施用途径和方案。施用的量（根据治疗次数和单位剂量）取决于期望的结果和/或保护。组合物的精确的量还取决于医师的判断并且对于每个个体都是特有的。影响剂量的因素包括对象的身体和临床状态、施用途径、预期的治疗目的（减轻症状或治愈）以及特定组合物的效力、稳定性和毒性。配制后，溶液将以与剂量制剂相容的方式施用，并且施用的量使得其是治疗上或预防上有效的。制剂可容易以各种剂量形式施用，例如上述的注射液的类型。
联合疗法
本发明的组合物和相关方法（特别是抗原-MHC-纳米颗粒复合物的施用）也可与传统疗法的施用结合进行。这些疗法包括但不限于阿沃纳斯（Avonex，干扰素β-1a）、倍泰龙（Betaseron，干扰素β-1b）、克帕松（Copaxone，醋酸格拉替雷）、诺安托（Novantrone，米托蒽醌）、利比（Rebif，干扰素β-1a）、Tysabri（那他珠单抗）、Gilenya（芬戈莫德）、格拉默（Glatiramer）、类固醇、环磷酰胺、依木兰（Imuran）、巴氯芬（Baclofen）、深部脑刺激，Ampyra（达伐吡啶）、针灸和物理治疗。
当使用联合疗法时，可使用各种组合，例如抗原-MHC-纳米颗粒复合物施用是“A”，其他试剂是“B”：
。
本发明的肽-MHC-复合物组合物向患者/对象的施用，会根据这类化合物的一般性施用方案进行，并考虑毒性（如有）。预期的是，如果需要的话，会重复治疗循环。还预期的是，各种标准疗法（例如水合）可与所述疗法结合施用。
体外或间接体内施用
本文使用的术语体外施用是指在从患者移出或在患者体外的细胞上进行的操作，包括但不限于培养物中的细胞。术语间接体内施用是指已在体外被操作并随后施用给对象的细胞。术语体内施用包括所有在对象体内进行的操作（包括施用）。
在本发明的某些方面，所述组合物可被体外、间接体内或体内施用。在某些体外实施方式中，自体T细胞被与本发明的组合物一起培养。该细胞或组织随后可被用于体外分析或间接体内施用。
实施例
以下实施例是为解释本发明的各种实施方式而给出，并不以任何方式限制本发明。本领域技术人员会容易意识到，本发明易于被改造而实现所提及的目的并获得所提及的优势，以及可从本文隐含得到的其他目的和优势。这些实施例以及所述方法是实施方式的当前代表，并且是示例性的，并不用于限制本发明的范围。对于本领域技术人员来说，可对这些实施例做出变化并且可将其用于其他用途，但这些都属于权利要求的范围定义出的本发明的实质。
实施例1. pMHC纳米颗粒的制备和分析
pMHC制造
使用了两种不同的方法来表达重组的I类pMHC复合物。第一种方法涉及在存在肽的情况下重新折叠在细菌中表达的I类MHC重链和轻链，然后通过凝胶过滤和离子交换层析进行纯化，如(Garboczi, D.N. et al. (1992) Proc Natl. Acad Sci USA 89:3429-3433;Altman, J.D. et al. (1996) Science 274:94-96)所述。第二种方法涉及作为单链构建体在慢病毒转导的freestyle CHO细胞中以高收率表达I类MHC复合物，其中通过柔性的GS接头(Yu, Y.Y. et al. (2002) J Immunol 168:3145-3149)、编码BirA位点（以游离的Cys结束的6xHis标签）的羧基末端接头依次连接编码肽的序列、I类MHC轻链和重链。使用镍柱和阴离子交换色谱从培养基上清液纯化分泌的蛋白，并将其直接用于NP涂布或对其生物素化，以使用荧光染料结合的的链霉制造pMHC四聚体。如通过流式细胞仪测定的，使用代表性单链pMHC复合物（其编码IGRP206-214自身抗原肽或其模拟物NRP-V7）制造的四聚体高效地结合至同源的单克隆自身反应性CD8+ T-细胞，但是不结合至它们的多克隆副本（未示出）。
最初从使用构建物转染的果蝇SC2细胞纯化重组的II类pMHC单体，所述构建物编码分别带有c-Jun或c-Fos亮氨酸拉链的I-Aβ和I-Aα链、以及前述的BirA 和6xHis标签(Stratmann, T. et al. (2000) J Immunol 165:3214-3225, Stratmann, T. et al.(2003) J. Clin. Invest. 112:3214-3225)。因为该方法的收率通常较低并且耗时，申请人开发了在freestyle CHO细胞中的表达系统，该CHO细胞使用编码单顺反子信息的慢病毒转染， 其中复合物的肽-IAβ和IAα链被核糖体跳越P2A序列分开(Holst, J. et al.(2006) Nat Protoc 1:406-417)。如前述的单链I类pMHC构建体一样，将编码BirA位点、6xHis标签和游离的Cys的接头加入至构建体的羧基末端。先后通过镍层析阴离子交换从细胞培养物上清液分离自组装的II类pMHC复合物，并将其用于涂布在NP上或进行处理以用于生物素化和四聚体形成。如通过流式细胞仪测定的，使用编码2.5mi自身抗原肽的代表性II类pMHC复合物生成的II类pMHC四聚体特别地并且有效地被同源的单克隆自身反应性CD4 +T细胞结合。
四聚体染色
使用所述的生物素化的pMHC单体制备结合有PE的TUM-H-2Kd、NRP-V7-H-2Kd、IGRP206-214-H-2Kd、HEL14-22/IAg7和BDC2.5mi/IAg7四聚体(Stratmann, T. et al. (2000) JImmunol 165:3214-3225; Stratmann, T. et al. (2003) J. Clin. Invest. 112:3214-3225; Amrani, A. et al. (2000) Nature 406:739-742)。在4°C下在FACS缓冲液（在PBS中的0.1%叠氮化钠和1% FBS）中使用四聚体(5 ug/mL)对外周血单核细胞、脾细胞和淋巴结CD8+或CD4 + T细胞进行染色1小时，洗涤，并在4°C下使用结合有FITC的抗CD8α或抗CD4 (5µg/mL)和结合有PerCP的抗B220（2 µg/mL；作为“哑（dumb）”门）培育30分钟。将细胞进行洗涤，固定在1% PFA/PBS中并用FACS分析。
合成
如前所述地使用柠檬酸钠化学还原氯化金来合成金纳米颗粒（GNP）(Perrault, S.D.et al. (2009) Nano Lett 9:1909-1915)。简单来说，在剧烈的搅拌之下将2 mL的1%的HAuCl4 (Sigma Aldrich)加入至100 mL H2O，并在油浴中加热溶液。将6 mL（对于14 nmGNP）或2 mL（对于40 nm GNP）的1%柠檬酸钠加入至煮沸的HAuCl4溶液，将其额外搅拌10分钟，然后冷却至室温。通过加入1 uMol的使用–COOH或–NH2基团功能化的巯基-PEG接头(Nanocs, MA)（表1和表2）使GNP稳定化以作为pMHC的受体。用水洗涤聚乙二醇化的GNP以除去游离的巯基-PEG，浓缩，并储存于水中以用于进一步的分析。通过分光光度法并根据比尔定律（Beer’s law）计算NP密度。
通过在存在表面活性剂的情况下在有机溶剂中乙酸铁的热分解，制造SFP系列氧化铁NP（SFP IONP），然后通过聚乙二醇化使溶剂在水性缓冲液中。简单来说，将2 mMol Fe(acac)3 (Sigma Aldrich, Oakville, ON)溶解在10 mL苄基醚和油胺的混合物中，并加热至100oC持续1小时，然后在300oC加热2小时，同时在氮气层的保护下回流。通过加入乙醇沉淀出合成的NP，并重悬于已烷中。为了IONP的聚乙二醇化，将100 mg不同的3.5 kDa DPA-PEG接头（表1中的S1-S5；Jenkem Tech USA）溶解在CHCl3和HCON(CH3)2 (DMF)的混合物中。然后将NP溶液(20 mg Fe)加入至DPA-PEG溶液并在室温下搅拌4小时。通过加入已烷过夜沉淀出聚乙二醇化的SFP NP，然后重悬于水中。通过高速离心(20,000 xg, 30 min)除去微量的聚集体，并将单分散的SFP NP储存在水中以用于进一步的表征和pMHC结合。通过在2NHCL中在A410的分光光度法测定IONP产物中铁的浓度。根据SFP NP的分子结构和直径(Fe3O4; 直径8+1 nm) (Xie, J. et al. (2007) Adv Mater 19:3163; Xie, J. et al.(2006) Pure Appl. Chem. 78:1003-1014)，申请人估计，含有1 mg铁的SFP溶液含有5x1014个NP。
申请人随后开发了新的IONP设计，该设计使得能够在完全没有表面活性剂的情况下，同样通过热分解，但是在一个步骤中，形成聚乙二醇化的IONP（PF系列IONP）。在该新颖的设计中，PEG分子同时被用作还原剂和表面活性剂。在典型的反应中，在100oC下将3 gPEG (2 kDa)缓慢地融化在50 mL圆底烧瓶中，然后与7 mL的苄基醚和2 mMol Fe(acac)3混合。剧烈地搅拌反应1小时，然后伴随着回流加热至260oC持续额外的2小时。将反应混合物冷却至室温，转移至离心管并与30 mL水混合。通过在2,000xg离心30分子，除去不溶性物质。通过穿过Amicon-15过滤器(MWCO 100 kDa, Millipore, Billerica, MA)的超滤，除去游离的PEG分子。申请人能够产生IONP，其中尽管不是所有的PEG分子都进行了测试，但测试了大部分的PEG分子（表1，P1-P5）。IONP的尺寸根据在热分解反应中使用的PEG接头的官能团（表1和2）而变化。可以使用磁性（MACS）柱(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)或IMag细胞分离系统(BD BioSciences, Mississauga, ON)容易地纯化NP。在室温下或在4oC下将纯化的IONP储存在水中或各种缓冲液（pH 5-10）中，其中检测不到任何聚集体。如上用于SFP NP的描述地计算NP密度。
的pMHC结合
通过在存在1-乙基-3- [3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）的情况下酰胺键的形成，实现将pMHC结合至用带有远端-NH2或COOH基团的PEG接头制造的NP。首先将带有–COOH基团的NP (GNP-C、SFP-C和PF-C，表2)溶解在20 mM MES缓冲液（pH 5.5）中。将N-羟基硫代琥珀酰亚胺（磺基-NHS，Thermo scientific，Waltham，MA，终浓度10 mM）和EDC（Thermoscientific，Waltham，MA，终浓度1 mM）加入至NP溶液。在室温下搅拌20分钟之后，将NP溶液逐滴加入至含有溶解在20 mM硼酸盐缓冲液（pH 8.2）中的pMHC单体的溶液。将混合物搅拌额外的4小时。为了将pMHC结合至NH2-功能化的NP（GNP-N、SFP-N和PF-N，表2），首先将pMHC复合物溶解在20 mM MES缓冲液（pH 5.5，含有100 mM NaCl）中。然后将磺基-NHS(10 mM)和EDC (5 mM)加入至pMHC溶液。然后将活化的pMHC分子加入至在20 mM硼酸盐缓冲液（pH8.2）中的NP溶液，并在室温下搅拌4小时。
为了将pMHC结合至马来酰亚胺-功能化的NP（SFP-M 和PF-M, 表2和图1C），首先在室温下通过三丁基膦(TBP, 1 mM)孵育pMHC分子4小时。然后将被工程化以编码自由的羧基末端Cys残基的pMHC与在40 mM磷酸盐缓冲液（pH 6.0，含有2 mM EDTA）中的NP、150 mMNaCl混合，并在室温下孵育过夜。通过马来酰亚胺基团和Cys残基之间形成的碳-硫键共价地将pMHC与NP结合。
使用点击化学来将pMHC或亲和素结合至通过酰胺基团功能化的NP（SFP-Z，表2）。对于该反应，首先通过二苯并环辛烯（dibenzocyclooctyl , DBCO, Click ChemistryTools, Scottdale, AZ）试剂在室温下孵育pMHC或亲和素分子2小时。通过过夜透析除去游离的DBCO分子。然后通过SFP-Z孵育pMHC-DBCO或亲和素-DBCO结合体2小时，导致形成pMHC或亲和素分子与NP之间的三唑键。
通过大量的透析（针对PBS，pH 7.4，在4oC穿过300 kDa分子量截止膜（Spectrumlabs）），除去在不同的pMHC-NP结合反应中未结合的pMHC复合物。替代地，通过磁力分离纯化结合有pMHC的IONP。通过穿过Amicon Ultra-15单元(100 kDa MWCO)的超滤，浓缩结合的NP，并储存在PBS中。
电子显微镜、动态光散射、DLS和小角度电子束衍射
首先通过透射电子显微镜(TEM, Hitachi H7650)估算未结合的和结合有pMHC的NP的核尺寸和分散度。使用动态光散射(DLS)来确定pMHC-NP的流体力学尺寸、zeta电位和单分散性，其中使用ZetaSizer仪器 (Malvern, UK)。使用小角度电子束衍射(SEBD)评估NP的PF系列的氧化铁核心的化学性质。
傅里叶变换红外光谱
使用傅里叶变换红外光谱(FTIR)评估PF系列IONP设计的表面化学性质。使用ATR（衰减全反射）模式上的Nicolet FTIR分光光度计，得到锚定在PF-NP表面的对照PEG和PEG的FTIR光谱。在4 cm-1光谱分辨率、平均256次扫描，记录每个光谱。识别PEG骨架C-O-C基团及其远端pMHC-受体官能团的伸缩振动特征。
琼脂糖凝胶电泳
为了快速评估NP电荷随着聚乙二醇化或pMHC涂层的变化，将NP在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳。根据整体表面电荷，聚乙二醇化的NP迁移到负极或正极。进行考马斯亮蓝染色来确认NP和pMHC的共同迁移。
天然和变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳
将结合有pMHC的NP进行天然-PAGE (10%)和SDS-PAGE (12%)分析，以确认在pMHC-NP制剂中不存在游离的（未结合的）pMHC，并确认在NP的表面上存在完整的三分子pMHC复合物。
效价测量
为了评估结合至单个NP上的pMHC单体的数量（pMHC效价），我们使用不同的方法测量了pMHC-NP制剂的pMHC浓度，这些方法包括Bradford测定（Thermo Scientific）、氨基酸分析（在水解的pMHC-NP制剂中17个不同的氨基酸的基于HPLC的量化）（University ofToronto）、通过质谱以及转换为pMHC分子数量和NP数量的比例的值进行的斑点ELISA和签名肽分析。简单来说，在“斑点ELISA”方法中，依次将结合了pMHC的NP和未结合的NP以及pMHC单体溶液（作为标准）稀释在PBS中，然后吸收至在多孔过滤板中的PVDF膜(PALLCorporation)。使该平板在室温下部分干燥，然后使用pMHC特异性一级抗体（即，用于涂布有I类pMHC的NP的抗-β2M和抗- Kd抗体，2M2和SF1-1.1克隆，BioLegend, San Diego, CA）孵育，然后使用结合有HRP或AP的二级抗体孵育。在进行酶显色反应时，将孔的内容物转移至常规的ELISA板的孔中，然后使用平板读数仪在450 nm测量它们的吸收。对于签名肽质谱方法，通过质谱鉴别pMHC特异性的胰蛋白酶肽（对于Kd复合物，签名肽为TWTAADTAALITR，对于I-Ag7复合物，签名肽为AQNSELASTANMLR）。使用稳定同位素(AQUA肽合成, SigmaAldrich)标记对应的合成肽。然后将同位素标记的肽依次稀释至既定的浓度，然后和结合有pMHC的NP混合以用于胰酶消化。将该混合物进行质谱(Agilent QTOF6520)以量化标记有同位素的签名肽与未标记的签名肽的比例，其作为pMHC浓度的读出。因为由这些不同的方法生成的值是相似的，出于简单和方便，所以Bradford测定（使用未结合的NP作为空白）成为所选的方法。
体外pMHC-NP的激动活性
在37°C下使用连续稀释的结合了pMHC的NP或对照NP孵育来自TCR-TG小鼠的FACS分选的脾CD8 +细胞（2.5 x105个细胞/mL）24-48小时。通过ELISA检测上清液的IFNγ。用1 mCi的[3H]-胸苷对培养的细胞进行脉冲，在24小时之后收割以测量[3H]结合。
治疗
使用在PBS中的涂布有pMHC的NP静脉注射一组10周龄的雌性NOD小鼠，每周两次并持续5周（总共10次剂量）。通过所述的流式细胞仪(Tsai, S. et al. (2010) Immunity 32:568-580) (以及Clemente-Casares et al., submitted)评估血、脾、淋巴结和/或骨髓中四聚体+ CD8+或CD4+ T-细胞群的尺寸的增加以及它们的表型特征。在其他实验中，使用pMHC-NP每周两次地静脉注射显示出血糖水平>11 mM 2天的小鼠，并监控血糖升高，直至血糖正常稳定（4周）。每日评估动物的糖尿，并在3+时皮下注射给予人胰岛素低精蛋白（每日1IU）。
统计分析
通过双尾Student’s t, Mann-Whitney U, Chi-Square或双向ANOVA测试比较数据。统计学显著性假设P < 0.05。
小鼠
NOD/Lt小鼠来自Jackson Lab (Bar Harbor, ME). 17.4α/8.3 (8.3-NOD), 17.6α/8.3α (17.6-NOD)，BDC2-5-NOD小鼠已经有描述(Katz, J.D. et al. (1993) Cell 74:1089-1100; Verdaguer, J. et al. (1997) J Exp Med 186:1663-1676; Han, B. etal. (2005) J Clin Invest 115:1879-1887)。
实施例2. T1D-相关的II类pMHC的制造
在真核细胞（S2或CHO细胞）中制造几种不同的T1D相关和不相关（即阴性对照）的肽/I-Ag7复合物。使用由这些单体制剂产生的四聚体的研究证实了这些单体作为正确地折叠的pMHC复合物被分泌进上清液。图2提供了例子。
通过使用T1D相关的II类pMHC-NP进行处理的NOD小鼠中的高血糖的逆转
使用7.5 µg的涂布了II类pMHC的NP每周两次地处理糖尿病NOD小鼠。在正常血糖4周时，认为小鼠被治愈，在该点停止处理。如图3所示，虽然在90-100%的小鼠（n=29只小鼠）中2.5mi/I-Ag7-、IGRP128-145/I-Ag7-和IGRP4-22/I-Ag7-NP逆转了高血糖，但是使用HEL14-22/I-Ag7-NP（一种外来pMHC）的处理没有效果。在停止处理之后>30周的被治愈的小鼠中的腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)得出的曲线，与年龄匹配的非糖尿病的未处理的对照非常相似，并且和在未经处理的急性糖尿病NOD小鼠中得到的曲线显著不同（图4）。因此，涂布有T1D相关的II类pMHC的NP在糖尿病小鼠中恢复了葡萄糖稳态。
相关的II类pMHC-NP扩增同源记忆TR1自身调节性CD4+ T细胞
与对糖尿病发病或年龄匹配的非糖尿病的未处理的动物的研究相比，通过使用2.5mi/I-Ag7-NP进行处理的已经血糖正常的50周龄糖尿病小鼠的血、脾、胰淋巴结（PLN）、肠系膜淋巴结（MLN）和骨髓的研究，显示了2.5mi/I-Ag7四聚体+ CD4+细胞的百分比显著升高（图5）。CD4+ T-细胞扩增是抗原特异性的（图5）。扩增的节奏、大小和分布与被测试的三种T1D相关的II类pMHC-NP相似（图6）。在所有这些群体中的NP扩增的四聚体+细胞对比四聚体+细胞的表型分析显示了记忆样TR1表型（图7，上），其具有近期描述(Gagliani, N. et al. (2013)Nature Medicine 19:739-746) (FIG. 7, bottom)的TR1-特异性标记物的共表达：CD62low/CD44high/ ICOS+/CD25–/FoxP3–/表面TGFβ+/ CD49b+/LAG3+。在表达FoxP3启动子-eGFP的NOD小鼠中，确认了这些细胞不是FoxP3+，其中所有pMHC-NP-扩增的细胞都是eGFP-阴性的（未示出）。
与这些表型数据一致，从经pMHC-NP处理的小鼠分选的四聚体+ CD4+细胞，通过几乎完全分泌IL-10并且较低程度地分泌IFNγ，对同源肽脉冲的DC进行响应（图8以及未示出的）。重要地，来自经pMHC-NP处理的供体的纯化的CD4+ 而非CD8+ T细胞抑制NOD中的T1D。使用II类pMHC-NP处理转移有糖尿病性脾的scid小鼠和的宿主被100%保护>100天（未示出）。
与其四聚体副本不同，这些II类pMHC-NP扩增的四聚体+细胞抑制非同源T细胞向肽脉冲的DC繁殖（提呈由响应子和四聚体+ TR1细胞靶定的肽）。相对于接收抗-IFNγ或鼠-IgG（未示出）的培养物，向培养物加入抗-IL10或抗-TGFβ mAb，部分地阻止了该抑制。最重要地，使用IGRP4-22或2.5mi/I-Ag7-NP和阻断的抗-IL-10、抗-TGFβ 或抗-IFNγ mAb或鼠-IgG处理的糖尿病小鼠的研究（图9）显示，通过II类pMHC-NP的正常血糖的恢复需要IL-10和TGFβ但不需要IFNγ。但是，在自发性糖尿病NOD.Il10–/­–和NOD.Ifng–/–小鼠中的研究显示，IL-10和IFNγ的表达对于响应于II类pMHC-NP而扩增的TR1细胞的发展来说是必须的；在这些小鼠中，pMHC-NP治疗扩增了Th2样细胞(NOD.Ifng–/–)或IFNγ+/IL-4+/IL10–细胞(NOD.Il10–/­–小鼠)。在糖尿病IGRP–/– NOD小鼠（不能诱导（prime）IGRP-反应性T细胞）中的研究显示，这些小鼠不响应IGRP4-22/I-Ag7-NP（没有T细胞扩增或正常血糖的恢复）是因为这些小鼠缺少被诱导IGRP4-22的细胞。相反地，使用2.5mi/I-Ag7-NP处理的所有糖尿病IGRP–/–NOD小鼠都被治愈（未示出）。所以，与I类pMHC-NP相似，II类pMHC-NP通过扩增疾病诱导的调节记忆而发挥作用，但是不能重新开始（de novo）诱导这些响应，因为它们缺少共刺激信号。
最后，使用牛痘病毒(rVV)的研究显示，通过II类pMHC-NP处理的NOD小鼠能够容易地清除急性病毒感染（图10A）。与此一致，被处理的小鼠能够对助剂中的模型抗原产生抗体反应（图10B）。
实施例3. 单特异性II类pMHC-NP减少EAE的严重程度。
申请人然后测试了基于II类pMHC-NP的纳米药物在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中的治疗潜力。该模型被用在尽可能严格的测试中：从而研究相对于防止或阻断EAE的发展，pMHC-NP是否能够逆转已经建立的EAE。这并非小问题。EAE中的介入的近期综述表明，超过400次研究的<1%在EAE诱导之后的21日开始治疗(Holst, J. et al. (2006) NatProtoc 1:406-417)；报道的数据是在小鼠中获得的，其中在EAE诱导之后21日开始治疗，并且被改善的疾病以剂量依赖的方式来打分（图11）。
实施例4. 涂布有II类pMHC的NP的合成和质量控制
申请人开发了最佳的氧化铁NP设计，它不采用表面活性剂来进行合成，并且得到高度稳定的、单分散的制剂，它能够以最佳的pMHC负载进行装载。虽然可以使用数种不同的pMHC涂布化学方法（图12A），但是申请人经常使用通过结合了马来酰亚胺的PEG来功能化的NP，它接收高效价的pMHC（高达多于60个pMHC/NP），这些pMHC被工程化来编码在其羧基末端的游离的Cys。通过数种质量控制检查来处理这些II类pMHC-NP，以确定每个NP的pMHC效价（斑点ELISA、氨基酸分析）、NP密度、NP电荷和NP尺寸（如由TEM确定的金属核；以及如通过动态光散射（DLS）确定的流体动力学直径）。图12B示出了代表性的TEM图像，图12C示出了未涂布pMHC的NP和涂布了pMHC的NP的DLS图。典型的剂量方案涉及每次剂量施用1-50 µg的总pMHC（涂布NP）（约2 uL的制剂稀释在100 uL的PBS中）。
实施例5. 使用涂布了II类pMHC的NP进行治疗
上述数据与申请人先前在使用I类pMHC-NP治疗的小鼠中得到的数据一致：II类pMHC-NP扩增同源的记忆调节T细胞（在该实施例中为TR1），这些T细胞通过局部的装载了自身抗原的APC抑制其他自身抗原肽的提呈(Amrani, A. et al. (2000) Nature 406:739-742)。
已经报道，人类TR1 CD4+ T细胞克隆杀死专业的APC的一些亚型（例如树突状细胞）(Amrani, A. et al. (2000) Nature 406:739-742)。因此，申请人研究了响应于II类MHC-NP治疗而扩增的抗原特异性TR1细胞是否通过杀死装载了自身抗原的APC而抑制自身免疫。通过将经2.5mi或GPI肽脉冲并且标记有PKH26（经2.5mi脉冲的DC）或CFSE（经GPI脉冲的DC）的DC的1:1混合物灌注进在之前5周内已经接受了10次剂量的2.5mi/IAg7-NP的NOD小鼠或没有接受任何处理的NOD小鼠，来进行以上研究。7天后杀死宿主，以比较在两种不同的宿主中PKH26+细胞与CFSE+细胞的比例。如图13A所示（上部），没有观察到任何差异，这表明响应于pMHC-NP治疗而扩增的TR1 CD4+ T-细胞不杀死表达抗原的DC。
为了研究这是所用的APC类型（一种DC）的特性还是其他APC类型的一般特征，重复以上实验，但是相对于DC，使用脾B细胞。出乎意料地，申请人发现，经2.5mi脉冲的B细胞的数量在已经使用涂布了2.5mi/IAg7-NP的NP处理的宿主中扩增（而非减少）（图13A，下部）。这是意料之外的，因为根据本领域的现有技术，预期的是相反的结果（与其经GPI脉冲的副本相比，经2.5mi脉冲的B细胞选择性和特异性地减少）。
然后通过比较经2.5mi/IAg7-NP处理的小鼠与未经处理的对照的胰腺癌（PLN）和肠系膜（MLN）淋巴结中的B细胞的绝对数量和百分比，申请人查明了是否能够报导II类pMHC-NP处理的这种B细胞扩增效果。如图13B所示，经II类pMHC-NP处理的NOD小鼠的PLN中的B细胞的百分比显著增加，但在MLN中缺没有。在未经处理的NOD小鼠中没有观察到PLN与MLN的这些差异，这表明，这些效果是pMHC-NP治疗的结果。可以注意到，在单个小鼠的PLN中的2.5mi-特异性的TR1 CD4+ T-细胞的频率和PLN相关的B细胞的频率之间存在统计学上显著的相关性，这表明，经pMHC-NP处理的NOD小鼠的B细胞向PLN的招募的增加，是由响应于MHC-NP治疗而扩增的2.5mi-特异性TR1 CD4+ T细胞驱动的。
总体上，这些数据提出了这样的可能性，即响应于MHC-NP治疗而扩增的B细胞可能是B调节细胞，它是获得了响应于与被pMHC-NP扩增的TR1 CD4+ T细胞的同源相互作用而产生IL-10的能力的B细胞。这种情况假定，2.5mi-特异性TR1 CD4+ T细胞诱导未分化的嗜铬粒蛋白A-特异性B细胞（嗜铬粒蛋白A是2.5mi表位的天然抗原来源）向产生IL-10的Breg细胞的分化和扩增，所述特异性B细胞已经捕获了嗜铬粒蛋白A并因此在其表面上提呈对应的2.5mi/IAg7 pMHC复合物。
为了检验该假设，申请人将来自一株NOD小鼠（其两个IL10基因位点中的一个携带在终止密码子和外显子5的多聚腺苷酸化信号（11）之间的异种基因包IRES-eGFP的定向插入）的经2.5mi脉冲的或经GPI脉冲的B细胞（标记有PKH26）灌注进经2.5mi/IAg7-NP处理的NOD宿主或未经处理的NOD宿主。
在转移之后七天，测定了宿主中供体PKH26+ B-细胞的流式细胞仪表型（图13C，上部面板）。如图13C所示（中部和下部面板），相当一部分的供体B细胞表达编码IL10的eGFP并且CD5+和CD1d都高。这是Breg细胞的三个关键的标记物(Xie, J. et al. (2007) AdvMater 19:3163; Xie, J. et al. (2006) Pure Appl. Chem. 78:1003-1014)。这仅在经2.5mi脉冲的B细胞中观察到，而在经阴性对照肽（GPI）脉冲的B细胞中观察不到，并且仅在经pMHC-NP处理的小鼠中发生。重要地，该效果是（至少部分是）由IL-10 pMHC-NP-扩增的TR1 CD4+ T细胞介导的，因为在缺乏IL-10的NOD宿主中观察不到这种响应。
综上所述，这些数据证明了，II类pMHC-NP治疗诱导抗原特异性的B细胞分化和扩增为B调节细胞。
显示了具有调节特性的B淋巴细胞的存在的数据的描述可以在追溯到1974年的文献中找到。与响应于II类pMHC-NP治疗而扩增的TR1 CD4+ T细胞相似，Breg细胞表达免疫抑制性细胞因子，其包括IL-10和TGFb，以及能够通过同源的、由II类pMHC驱动的细胞间相互作用并以抗原依赖性和高度特异性的方式抑制致病的自身反应性T细胞和B细胞的其他分子(Xu, C. et al. (2007) Polymer International 56:821-826)。虽然已经显示了不同的刺激能够在体外以及在小得多的程度上在体内诱导Breg形成，但是尽申请人所知，目前没有治疗方法能够在体内诱导和扩增抗原特异性的Breg细胞。通过诱导高度疾病特异性的TR1 CD4+ T-细胞，申请人证明了基于II类pMHC的纳米药物也诱导疾病特异性的Breg细胞。因为Breg细胞也能促进效应子分化为TR1 CD4+ T-细胞，基于II类pMHC的纳米药物释放深厚和持久的免疫抑制性反应，该反应是高度抗原特异性的并因此能够选择性地抑制自身免疫反应而不损害全身免疫。
实施例6. 通过乙酰丙酮铁的热分解及其生物结合而合成表面功能化的氧化铁纳米颗粒
熔化PEG。加入苄基醚和乙酰丙酮铁。在1050C加热1小时之后，将温度升高至2600C并回流。约2小时之后，铁纳米颗粒形成并且溶液的颜色变黑。将反应冷却至室温并加入一些水来从反应容器提取纳米颗粒。通过Miltenyi Biotec LS磁性柱纯化纳米颗粒。在6.2-6.5的缓冲pH（0.15M NaCl和2mM EDTA）下加入蛋白质和铁纳米颗粒，在室温下搅拌12-14小时，并通过Miltenyi Biotec LS磁性柱纯化结合了蛋白质的颗粒，从而制备氧化铁纳米颗粒蛋白质结合物。
要理解的是，虽然本发明已通过优选实施方式和任选的特征进行具体公开，但本领域技术人员可想象到对所具体描述的发明做出修改、改进和变化，并且这些修改、改进和变化被认为是在本发明的范围之内。本文提供的材料、方法和实施例是优选实施方式的代表，是示例性的，并且并非意在限制本发明的范围。
本发明已在本文进行宽泛和概括性的描述。落入所公开的上位概念的较窄的种类和下位群体也构成本发明的一部分。这包括对本发明进行一般性描述，但设定前提或消极限制以从种类物中移除任何主题内容，而不论陪排除的内容是否明确地在本文提及。
此外，当以马库什群组的形式描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员会意识到，本发明也据此以该马库什群组的任何单个成员或成员的子群组的形式描述。
权利要求中使用的术语“或”，除非另有明确说明仅指择一方案或这些替代方案相互排斥之外，是指“和/或”，即使公开的内容支持指代择一方案和“和/或”的定义。
如在本说明书和权利要求书中使用的，术语“包括”（以及任何语法形式的包括）、“具有”（以及任何语法形式的具有）、“包含”（以及任何语法形式的包含）或“含有”（以及任何语法形式的含有）是包容性和开放性的，并且不排除其他的、未列举的元素或方法步骤。
在本文的全文中，通过标识引用来引用了多种公开文献、专利和公开的专利说明书。所有本文提及的公开文献、专利申请、专利和其他文献都明确地通过引用以其整体合并至本文中，如同每个都单独通过引用合并到本文中一样。如果存在冲突，则以本发明的说明书（包括定义）为准。
表1. 功能化的PEG接头
表2.纳米颗粒设计和pMHC 结合能力。

Claims (31)

1.一种用于扩增和/或发展对象中的Tr1细胞和/或B调节细胞的群体的复合物，所述复合物包括纳米颗粒和疾病相关的抗原-MHCII复合物，其中所述纳米颗粒的直径选自：从约1nm至约100 nm的直径；从约1 nm至约50 nm的直径或从约1nm至约20 nm或从约5nm至约100nm的直径，并且其中抗原-MHCII复合物与纳米颗粒的数量的比例是从约10:1至约1000:1。
2.根据权利要求1所述的复合物，其中所述复合物的抗原-MHCII密度为从约0.05pMHC/100 nm2的纳米颗粒的表面积至约25 pMHC/100 nm2的纳米颗粒的表面积。
3.根据权利要求1或2所述的复合物，其中所述抗原来源于涉及自身免疫反应的自身抗原或其模拟物，并且任选地其中所述自身抗原是来自由胰腺β细胞、IGRP、胰岛素、GAD、IA-2或髓鞘少突胶质蛋白（MOG）表达的抗原的表位。
4.根据权利要求1-3的任一项所述的复合物，其中所述纳米颗粒是非脂质体的和/或具有固体核心，所述核心优选是金核心或氧化铁核心。
5.根据权利要求1-3的任一项所述的复合物，其中所述抗原- MHCII被共价地或非共价地连接至所述纳米颗粒。
6.根据权利要求1-4的任一项所述的复合物，其中所述抗原- MHCII通过尺寸小于5 kD的接头被共价地连接至所述纳米颗粒。
7.根据权利要求1-6的任一项所述的复合物，其中所述纳米颗粒是生物可吸收的和/或生物可降解的。
8.根据权利要求1-6的任一项所述的复合物，其中纳米颗粒复合物包含的抗原-MHCII复合物与纳米颗粒的比例为从约10:1至约100:1。
9.根据权利要求5所述的复合物，其中所述接头包括聚乙二醇。
10.根据权利要求1-9的任一项所述的复合物，其中所述抗原-MHCII复合物是相同的或不同的。
11.根据权利要求9或10所述的复合物，其中所述接头是相同的或不同的。
12.一种组合物，其包含治疗有效量的任一项前述权利要求所述的复合物、以及载体。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述载体是药学上可接受的载体。
14.一种制造、制备或获得任一项前述权利要求所述的复合物的方法，所述方法包括将抗原-MHCII复合物涂布或复合至纳米颗粒上。
15.一种在有需要的对象中以抗原特异性的方式促进Tr1细胞和/或B调节细胞的形成、扩增和招募的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的权利要求1-11的任一项所述的复合物或权利要求12或13所述的组合物。
16.一种在有需要的对象中治疗或防止病毒感染或自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的权利要求1-11的任一项所述的复合物或权利要求12或13所述的组合物，前提条件是所述抗原是自身免疫相关的自身抗原。
17.根据权利要求14-16的任一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
18.根据权利要求15或17所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自糖尿病、糖尿病前期、多发性硬化或多发性硬化相关的疾病，前提条件是所述抗原与将要被治疗的自身免疫性疾病相关。
19.一种试剂盒，其包括权利要求1-11的任一项所述的复合物或权利要求11或12所述的组合物、以及使用说明。
20.一种制造氧化铁纳米颗粒的方法，所述方法包括热分解乙酰丙酮铁。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述氧化铁纳米颗粒是可溶于水的。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述热分解包括单一步骤的反应。
23.根据权利要求20-22的任一项所述的方法，其中所述热分解在存在功能化的PEG分子的情况下发生。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述热分解在存在苄基醚的情况下进行。
25.根据权利要求20或21所述的方法，其中用于所述热分解的温度为约80℃至约300℃、或约80℃至约200℃、或约80℃至约150℃、或约100℃至约250℃、或约100℃至约200℃、或约150℃至约250℃、或约150℃至约250℃。
26.根据权利要求20-25的任一项所述的方法，其中所述热分解进行约1小时至约2小时。
27.根据权利要求20-26的任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒在PBS中在约4℃下是稳定的，没有任何可检测的降解或聚集。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述纳米颗粒能够稳定至少6个月。
29.根据权利要求20-28的任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括通过磁性柱纯化所述纳米颗粒。
30.一种制造纳米颗粒复合物的方法，所述方法包括将pMHC与由权利要求20-29的任一项所述的方法获得的氧化铁纳米颗粒接触，从而提供纳米颗粒复合物。
31.根据权利要求30所述的方法，所述方法进一步包括通过磁性柱纯化所述纳米颗粒。
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