ES2525801T3 - Composiciones y métodos para la prevención y el tratamiento de enfermedades autoinmunes - Google Patents

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Abstract

Un complejo de antígeno-MHC acoplado operativamente a una nanopartícula para uso en un procedimiento para prevenir o tratar diabetes tipo I o tratar pre-diabetes en un paciente, el procedimiento que comprende: administrar a dicho paciente un complejo de antígeno-MHC acoplado operativamente a una nanopartícula en una cantidad suficiente para expandir las células T autorreactivas anti-patogénicas; en el que el antígeno deriva de un antiantígeno involucrado en la etiología de dicha enfermedad; en el que dicha nanopartícula tiene un diámetro menor de 1 μm; y además en el que el componente MHC es un componente MHC de clase I.

Description

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E08731723
11-12-2014
DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para la prevención y el tratamiento de enfermedades autoinmunes
Antecedentes de la invención
I. Campo de la invención
Esta invención realiza composiciones y procedimientos relacionados con inmunología y medicina. En particular la invención se refiere a agentes terapéuticos para el tratamiento de la diabetes.
II. Antecedentes
La vacunación con antígenos se puede utilizar para la inducción de tolerancia de las células T en la autoinmunidad. La administración de proteínas o péptidos autoantigénicos en solución puede atenuar la iniciación y/o progresión de la autoinmunidad en modelos experimentales de enfermedad autoinmune (Wraith et al., 1989; Metzler and Wraith, 1993; Liu and Wraith, 1995; Anderton and Wraith, 1998; Karin et al., 1994). Sin embargo, los ensayos clínicos limitados en seres humanos que emplean estrategias similares, casi invariablemente, han fracasado (Weiner, 1993; Trentham et al., 1993; McKown et al., 1999; Pozzilli et al., 2000; Group, DPT-TDS 2002; Kappos et al., 2000; Bielekova et al, 2000). Esto sugiere que los principios que guían la elección y las condiciones de tratamiento no están bien definidos y, como resultado, son inadecuados para la aplicación humana.
Los trastornos autoinmunes específicos del órgano espontáneos provienen de respuestas complejas contra numerosos epítopos de múltiples antígenos que surgen espontáneamente en una secuencia estocástica y con frecuencia impredecible. Esta complejidad se agrava por el hecho de que los clones de linfocitos que reconocen epítopos idénticos involucran las moléculas de antígeno/complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) dentro de una amplia gama de avidez, cuya concentración se correlaciona con el potencial patógeno (Amrani et al., 2000; Santamaria, 2001; Liblau et al., 2002). En consecuencia, el resultado de cualquier estrategia de inmunización para la prevención de la autoinmunidad es probable que esté influenciada por la elección de el/los autoantígenos, dosis, periodicidad del tratamiento, y la vía y forma de administración..
La diabetes tipo 1 (DM1) en ratones se asocia con las células T CD8+ autorreactivas. Los ratones no obesos diabéticos (NOD) desarrollan una forma de T1D, que se parece mucho a la T1D humana, que resulta de la destrucción selectiva de las células β pancreáticas por las células T que reconocen una lista creciente de autoantígenos (Lieberman y DiLorenzo, 2003). Aunque el inicio de T1D requiere claramente la contribución de las células CD4+, existe una evidencia convincente de que T1D es dependientes de las células T CD8+ (Santamaría, 2001; Liblau et al., 2002). Se ha descubierto que una fracción significativa de las células CD8+ asociadas al islote en los ratones NOD usan TCR Vα17-Jα42 de CDR3 invariante, denominado como `tipo 8.3-TCR' (Santamaria et al., 1995; Verdaguer et al, 1996; Verdaguer et al, 1997;.. DiLorenzo et al, 1998). Estas células, que reconocen los mimotopo NRP-A7 (definidos usando bibliotecas de péptidos combinatorios) en el contexto de del Kd de la molécula MHC (Anderson et al., 1999), ya son un componente significativo de los primeros infiltrados de CD8+ del islote de los NOD (DiLorenzo et al., 1998; Anderson et al, 1999;.. Amrani et al, 2001), son diabetogénicos (Verdaguer et al, 1996;.. Verdaguer et al, 1997), y se dirigen a un péptido de la proteína relacionada con la subunidad catalítica de glucosa-6-fosfatasa específica del islote (IGRP) (Lieberman et al, 2003), una proteína de función desconocida (Arden et al, 1999; Martin et al, 2001). Las células CD8+ que reconocen este péptido (IGRP206-214, similar a NRP-A7) son extraordinariamente frecuentes en la circulación (> 1/200 células CD8+) (Lieberman et al, 2003;.. Trudeau et al, 2003). En particular, la progresión de la insulitis a la diabetes en ratones NOD está invariablemente acompañada por la expansión cíclica de la mezcla de IGRP206-214 –CD8+ reactivos circulantes (Trudeau et al., 2003), y por maduración de la avidez de su contraparte asociada al islote. Más recientemente, se ha demostrado que las células CD8+ asociadas con el islote de los ratones NOD reconocen múltiples epítopos IGRP, lo que indica que IGRP es un autoantígeno dominante para células CD8+, al menos en T1D murina (Han et al., 2005). Las células CD8+ asociadas con el islote de los NOD, en particular las que se encuentran precozmente en el proceso de la enfermedad también reconocen un epítopo de insulina (Ins B15-23 (Wong et al., 1999)).
Los estudios de asociación han sugerido que ciertos alelos HLA de clase I (es decir, HLA A*0201) proporcionan la susceptibilidad a la T1D humana (Fennessy et al., 1994; Honeyman et al., 1995; Tait et al, 1995;.. Nejentsev et al, 1997;. Nakanishi et al, 1999; Robles et al, 2002). Los estudios patológicos han demostrado que las lesiones de insulitis de pacientes recién diagnosticados consisten principalmente en las células T CD8+ ((restringido a HLA clase I) Bottazzo et al., 1985; Atkinson y Maclaren, 1990; Castaño y Eisenbarth, 1990; Hanninen et al., 1992; Itoh et al., 1993; Somoza et al., 1994; Atkinson y Maclaren, 1994; Moriwaki et al., 1999; Imagawa et al, 2001), que son también la población celular predominante en los pacientes tratados mediante el trasplante con isoenjertos de páncreass (de gemelos idénticos) o aloinjertos (de donantes relacionados) (Sibley et al, 1985; Santamaria et al, 1992).
La insulina es un objetivo clave del anticuerpo y la respuesta CD4+, tanto en T1D humana como murina (Wong et al, 1999; Palmer et al, 1983; Chentoufi y Polychronakos, 2002; Toma et al, 2005; Nakayama et al, 2005; Kent et al, 2005). El epítopo de la cadena B de insulina humana hInsBi10-18 se presenta en HLA-A*0201 en las células CD8+ autorreactivas, tanto en los receptores de trasplante de islotes (Pinkse et al., 2005) como en el curso de la enfermedad espontánea (Toma et al., 2005). Además, se han identificados cuatro péptidos adicionales de la
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preproinsulina 1 o 2 de ratón que son reconocidos por las células T CD8+ asociadas al islote de los ratones transgénicos con HLA-A*0201- en el contexto de HLA-A- *0201.
IGRP, que está codificada por un gen (localizado en el cromosoma 2q28-32 (Martin et al, 2001)), que superpone un locus de susceptibilidad T1D, IDDM7 (2q31) (Pociot y McDermott, 2002; Owerbach, 2000), también ha sido recientemente identificado como un autoantígeno de células beta de potencial relevancia en la T1D humana (Takaki et al., 2006). Dos epítopos de unión a HLA-A*0201 de la IGRP humana (hIGRP228-236 y hIGRP265-273) son reconocidos por las células T CD8+ asociadas al islote de los ratones NOD deficientes en MHC de clase I murino que expresan un transgén HLA-A*0201 (Takaki et al., 2006). Cabe destacar que la células T CD8+ asociadas al islote de estos ratones transgénicos HLA-A*0201 'humanizados' fueron citotóxicos para los islotes humanos positivos para HLA-A*0201 (Takaki et al., 2006).
T1D los en ratones NOD se puede prevenir por la expansión de células T CD8+ autorreactivas de baja avidez. La administración de péptidos solubles (sin adyuvante) es una forma efectiva de inducir tolerancia de las células T específicas del antígeno (Aichele et al, 1994;.. Toes et al, 1996). Anteriormente, se demostró que el tratamiento de ratones NOD prediabéticos con maduración de la avidez atenuada de NRP-A7 soluble del subconjunto de CD8+ reactivo con IGRP206-214 mediante la eliminación selectiva de los clonotipos que expresan los TCR con mayor afinidad por el péptido/MHC (Amrani et al., 2000). Estas observaciones plantearon la posibilidad de que la actividad anti-T1D de NRP-A7 también estuvo mediada por la promoción de la ocupación del “nicho de clonotipo de avidez alta" (vaciado por el tratamiento NRP-A7) por clones de “avidez baja” (y potencialmente anti-diabetogénicos). Para probar esta hipótesis, los ligandos peptídicos alterados (APLs) fueron identificados con actividad parcial, completa o super agonista para células T CD8+ reactivas con IGRP206-214 y se comparó su actividad anti-DM1 en un amplio intervalo de la dosis.
El tratamiento crónico con dosis moderadas de un APL de afinidad intermedia (NRP-A7) o altas dosis de un APL de baja afinidad (NRP-I4) proporcionó protección para T1D. Esto se asoció con la acumulación local de células T CD8+ reactivas con IGRP206-214 a expensas de sus contrapartes de avidez alta, que se eliminaron. Inesperadamente, el tratamiento crónico con dosis altas de un APL de afinidad alta (NRP-V7) o el ligando natural (IGRP206-214) solo proporcionaron protección marginal. Sorprendentemente, los islotes de estos ratones no contenían casi I células T CD8+ reactivas con IGRP206-214, sino poblaciones aumentadas de células CD8+ que reconocen otros epítopos de IGRP. Esto llevó a los autores a la conclusión de que la terapia con péptidos en la autoinmunidad puede ser más efectiva cuando se promueve la ocupación del nicho de linfocitos del órgano diana por clones de baja avidez, no patógenos (Han et al., 2005), una predicción respaldada por la modelización matemática (Maree et al., 2006).
Desafortunadamente, este resultado se produjo solo en un intervalo estrecho de dosis y avidez del APL (para los TCR diana), lo que sugiere que la terapia peptídica está mal adaptada para prevenir o curar la T1D. El documento W02004/078909 describe nanopartículas que tienen un complejo de ligando de receptor inmovilizado, especialmente una molécula de MHC que comprende un péptido. El documento US2003/068363 describe complejos que constan esencialmente de un componente MHC aislado y un péptido autoantigénico asociado con el sitio de unión del antígeno del componente MHC.
Por lo tanto, aún se necesitan composiciones adicionales para usar en el tratamiento de la diabetes, así como otras enfermedades autoinmunes.
Compendio de la invención
Puede ser difícil tratar un paciente con péptidos porque, como es el caso de IGRP, esto requeriría varios miligramos de péptidos por dosis. Se contempló la administración de complejos antígeno/MHC, por ejemplo, complejos de péptido/MHC/partículas (sin moléculas coestimuladoras), en partículas. Estos complejos, resulta que son más tolerogénicos que los péptidos solos.
Los aspectos y realizaciones de esta solicitud incluyen el descubrimiento de un nuevo paradigma en el tratamiento de la autoinmunidad. Tradicionalmente, las vacunas se han utilizado para expandir las células T capaces de ofrecer una protección contra agentes patógenos o el cáncer, o para eliminar células T capaces de causar la autoinmunidad. Los aspectos de la presente invención se refieren a un nuevo tipo de "vacuna" que induce selectivamente la expansión de las células CD8+ autorreactivas con propiedades anti-autoinmunes y, al mismo tiempo, la supresión de células CD8+ autorreactivas con propiedades patogénicas (autoinmunes), ambas de acuerdo con la especificidad antigénica de las células T. Las células T CD8+ autorreactivas T anti-autoinmunes (células CD8+ anti-patogénicas) suprimen las respuestas de las células T autorreactivas de manera específica de tejido (después del reclutamiento espontánea en el tejido diana), pero de manera no específica del antígeno (por ejemplo, mediante la supresión local de otra respuestas de células T autorreactivas). Como resultado, el tratamiento con este tipo de vacuna puede prevenir y/o mejorar T1D, así como restaurar la normoglucemia o reducir los niveles de glucosa en ratones NOD hiperglucémicos sin causar inmunosupresión generalizada. Esta estrategia puede ser aplicable al tratamiento de otras enfermedades autoinmunes mediadas por células T y puede ser capaz de prevenir la recurrencia de T1D después del trasplante de los islotes.
De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un complejo de antígeno-MHC acoplado
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operativamente a una nanopartícula para usar en un procedimiento de prevenir o tratar diabetes tipo I o tratar prediabetes en un paciente, el procedimiento que comprende: administrar a dicho paciente un complejo de antígeno-MHC acoplado operativamente a una nanopartícula en una cantidad suficiente para expandir las células T autorreactivas anti-patogénicas; en el que el antígeno deriva de un autoantígeno involucrado en la etiología de dicha enfermedad; en que el que dicha nanopartícula tiene un diámetro menor de 1 m; y además en el que el componente MHC es un componente de MHC de clase I.
De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica para prevenir o tratar diabetes tipo I o tratar pre-diabetes que comprende un complejo de antígeno-MHC acoplado operativamente a una nanopartícula en una cantidad suficiente para expandir las células T autorreactivas no patogénicas; en el que el antígeno deriva de un autoantígeno involucrado en la respuesta inmunitaria; en el que dicha nanopartícula tiene un diámetro menor de 1 m; y además en el que el componente MHC es un componente de MHC de clase I.
Ciertas realizaciones de la presente invención se refieren a complejos o composiciones de antígeno-MHC para usar en los procedimientos de reducir o expandir selectivamente las células T de acuerdo con la especificidad antigénica de las células T. En consecuencia, la presente invención se pueden usar para reducir o eliminar las células T que reconocen autoantígenos, tales como células T específicas de las células β. Como tal, la presente invención se puede usar para prevenir tratar o mejorar la diabetes tipo I o prediabetes. Además, la presente invención se puede usar para expandir las células T deseables, tales como las células T que reconocen los antígenos tumorales, para prevenir tratar y/o mejorar las enfermedades combatidas por estas células T.
Las realizaciones de la invención se dirigen a los complejos o composiciones de antígeno-MHC para usar en los procedimientos de prevenir, o tratar la diabetes tipo I o prediabetes que comprende administrar un complejo de antígeno/MHC complejo/partícula a un sujeto en una cantidad suficiente para expandir las células T autorreactivas no patogénicas o anti-patogénicas. Un antígeno incluye, pero sin limitación el total o parte de un péptido, ácido nucleico, carbohidrato, lípido u otra molécula o compuesto que puede modular la actividad de las células T o poblaciones de células T, cuando en el contexto de un MHC o molécula tipo MHC se acopla a un sustrato.
Las realizaciones de la invención incluyen partículas tolerogénicas que comprenden una nanopartícula acoplada a un complejo de antígeno-MHC. El complejo de antígeno-MHC puede estar acoplado directamente a una partícula o a través de un ligador. Una nanopartícula puede comprender varias capas que a su vez pueden comprender múltiples componentes (por ejemplo, un núcleo de metal con una cubierta o cáscara de otras moléculas que se pueden acoplar más fácilmente al complejo de antígeno-MHC (por ejemplo, estreptavidina o avidina u otras moléculas conocidas usadas para unir restos a nanopartículas). En ciertos aspectos, una nanopartícula comprende un material seleccionado del grupo que consiste en seleniuro de cadmio, titanio, dióxido de titanio, estaño, óxido de estaño, silicio, dióxido de hierro y silicio, óxido de hierro III, plata, níquel, oro, cobre, aluminio, acero, aleación de cobalto-cromo, aleación de titanio, brushita, fosfato tricálcico, alúmina, sílice, zirconio, diamante, poliestireno, caucho de silicona, policarbonato, poliuretanos, polipropilenos, polimetil metacrilato, cloruro de polivinilo, poliésteres, poliéteres, y polietileno. En otros aspectos, una nanopartícula es un metal o partículas magentizable o superparamagnéticas. Las nanopartículas metálicas se pueden formar a partir de precursores de Au, Pt, Pd, Cu, Ag, Co, Fe, Ni, Mn, Sm, Nd, Pr, Gd, Ti, Zr, Si, e In, sus aleaciones binarias, sus aleaciones ternarias y sus compuestos intermetálicos. Véase las Patentes US 7.332,586, 7.326.399, 7.060.121, 6.929.675, 6.846.474, 6.712.997, 6.688.494 para una discusión de las composiciones y los procedimientos relacionados con la producción de nanopartículas.
Ciertos aspectos de la invención incluyen procedimientos y composiciones referentes a composiciones antigénicas que incluyen segmentos, fragmentos o epítopos de polipéptidos, péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos y otras moléculas que provocan o inducen una respuesta antigénica o inmunológica, generalmente denominada como antígenos. En aspectos particulares, el antígeno deriva de, es un imitador de, o es un antígeno autorreactivo y/o complejos autorreactivas de los mismos.
Los antígenos peptídicos incluyen, pero sin limitación hInsB10-18 (HLVEALYLV (SEQ ID NO:1)), hIGRP228-236 (LNIDLLWSV (SEQ ID NO:2)), hIGRP265-273 (VLFGLGFAI (SEQ ID NO:3)), IGRP206-214 (VYLKTNVFL (SEQ ID NO:4)), NRP-A7 (KYNKANAFL (SEQ ID NO:6)), NRP-I4 (KYNIANVFL (SEQ ID NO:7)), NRP-V7 (KYNKANVFL (SEQ ID NO:8)), YAI/Db (FQDENYLYL (SEQ ID NO:9)) y/o INS B15-23 (LYLVCGERG (SEQ ID NO:10)), así como péptidos y proteínas descriptas en la Publicación U.S. 20050202032.
En ciertos aspectos, un antígeno peptídico para usar en el tratamiento de TID es GAD65114-123, VMNILLQYVV (SEQ ID NO:14); GAD65536-545, RMMEYGTTMV (SEQ ID NO:15); GFAFP143-151, NLAQTDLATV (SEQ ID NO:16); GFAP214-222, QLARQQVHV (SEQ ID NO:17); IA-2172-180, SLSPLQAEL (SEQ ID NO:18); IA-2482-490, SLAAGVKLL (SEQ ID NO:19); IA-2805-813, VIVMLTPLV (SEQ ID NO:20); ppIAPP5-13, KLQVFLIVL (SEQ ID NO:21); ppIAPP9-17, FLIVLSVAL (SEQ ID NO:22); IGRP152-160, FLWSVFMLI (SEQ ID NO:23); IGRP211-219, NLFLFLFAV (SEQ ID NO:24); IGRP215-223, FLFAVGFYL (SEQ ID NO:25); IGRP222-230, YLLLRVLNI (SEQ ID NO:26); IGRP228-236, LNIDLLWSV (SEQ ID NO:2); IGRP265-273, VLFGLGFAI (SEQ ID NO:3); IGRP293-301, RLLCALTSL (SEQ ID NO:27); Pro-insulinaL2-10, ALWMRLLPL (SEQ ID NO:28); Pro-insulinaL3-11, LWMRLLPLL (SEQ ID NO:29); Pro-insulinaL6-14, RLLPLLALL (SEQ ID NO:30); Pro-insulinaB5-14, HLCGSHLVEA (SEQ ID NO:31); Pro-insulinaB10-18, HLVEALYLV (SEQ ID NO:1); Pro-insulinaB14-22, ALYLVCGER (SEQ ID NO:32); ProinsulinaB15-24, LYLVCGERGF (SEQ ID NO:33); Pro-insulinaB17-25, LVCGERGFF (SEQ ID NO:34); Pro
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insulinaB18-27, VCGERGFFYT (SEQ ID NO:35); Pro-insulinaB20-27, GERGFFYT (SEQ ID NO:36); ProinsulinaB21-29, ERGFFYTPK (SEQ ID NO:37); Pro-insulinaB25-21, FYTPKTRRE (SEQ ID NO:38); ProinsulinaB27-C5, TPKTRREAEDL (SEQ ID NO:39); Pro-insulinaC20-28, SLQPLALEG (SEQ ID NO:40); Pro-insulinaC25-33, ALEGSLQKR (SEQ ID NO:41); Pro-insulinaC29-A5, SLQKRGIVEQ (SEQ ID NO:42); Pro-insulinaA1-10, GIVEQCCTSI (SEQ ID NO:43); Pro-insulinaA2-10, IVEQCCTSI (SEQ ID NO:44); Pro-insulinaA12-20, SLYQLENYC (SEQ ID NO:45) o sus combinaciones.
En otros aspectos más los antígenos peptídicos asociados con esclerosis múltiple (MS) se pueden usar e incluir: MAG287-295, SLLLELEEV (SEQ ID NO:46); MAG509-517, LMWAKIGPV (SEQ ID NO:47); MAG556-564, VLFSSDFRI (SEQ ID NO:48); MBP110-118, SLSRFSWGA (SEQ ID NO:49); MOG114-122, KVEDPFYWV (SEQ ID NO:50); MOG166-175, RTFDPHFLRV (SEQ ID NO:51); MOG172-180, FLRVPCWKI (SEQ ID NO:52); MOG179-188, KITLFVIVPV (SEQ ID NO:53); MOG188-196, VLGPLVALI (SEQ ID NO:54); MOG181-189, TLFVIVPVL (SEQ ID NO:55); MOG205-214, RLAGQFLEEL (SEQ ID NO:56); PLP80-88, FLYGALLLA (SEQ ID NO:57) o sus combinaciones.
En ciertos aspectos el complejo antígeno-MHC se puede reticular en la nanopartícula. Un procedimiento no limitativo de la conjugación de una nanopartícula a un complejo antígeno-MHC incluye (a) hacer reaccionar un complejo de antígeno-MHC con un agente de reticulación, de este modo se forma un complejo antígeno-MHC agente de reticulación; y (b) hacer reaccionar una nanopartícula con el complejo de la etapa (a). En una realización, el procedimiento comprende concentrar el complejo de la etapa (a) antes de realizar la etapa (b). En otra realización, el agente de reticulación comprende un agente de reticulación heterobifuncional. En aún otra realización, el agente de reticulación comprende DOTA-maleimida (4-maleimidobutiramidobencil-DOTA), SMPT (4- succinimidiloxicarbonil-αmetil-α-(2-piridiltio)tolueno), sulfo-LC-SMPT (sulfosuccinimidil-6-(α-metil-α-(2-piridiltio) toluamido) hexanoato, reactivo de Traut (2-iminotiolano-HCl), o cualquier combinación de los mismos. Véase la publicación de patente 20070059775; las patentes U.S 4.671.958, 4.659.839, 4.414.148, 4.699.784, 4.680.338; 4,569.789; 4,589.071;
7.186.814 y 5,543.391, Solicitud de Patente Europea Núm. 188 256 para una discusión de la conjugación de los complejos a las nanopartículas.
En aspectos particulares, el autoantígeno es un péptido, carbohidrato, o lípido. En ciertos aspectos, un autoantígeno es un fragmento, epítopo, o un péptido de una proteína, carbohidrato, o lípido expresado por ciertas células de un sujeto, tales como células beta pancreáticas, e incluyen, pero sin limitación un fragmento de IGRP, insulina, proteína de GAD o IA-2. Varias de estas proteínas o epítopos se han definido para una variedad de afecciones autoinmunes. El autoantígeno puede ser un péptido, carbohidrato, lípido o similar derivada de un segundo componente endocrino
o neurocrino, tal como las células de Schwann del peri-islote o similares.
En otros aspectos más de esta invención, el componente del complejo de antígeno/MHC/partícula es un componente de polipéptido de MHC de clase I clásico o no clásico. El componente de MHC de clase I puede comprender la totalidad o parte de una molécula de HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, particularmente la totalidad o parte de una molécula de HLA-A, tales como una molécula de MHC clase I HLA-A*0201. El componente de MHC de clase I no clásico puede comprender moléculas tipo CD1 similares. En ciertos aspectos, el complejo antígeno/MHC está acoplado o unido en forma covalente o no covalente a un sustrato (complejo antígeno/MHC/partícula). El sustrato es típicamente una nanopartícula. En particular, la partícula comprende un metal, tal como hierro u óxido de hierro. Los péptidos de la invención pueden acoplarse químicamente a un sustrato y, en particular, acoplarse por medio de un producto químico o un ligador peptídico. Las moléculas CD1 son un ejemplo de moléculas de MHC no clásicas. Las moléculas de MHC no clásicas se caracterizan como no polimórficas, conservada entre especies y portadoras de bosillos de unión al ligando hidrófobos, profundos y estrechos. Estos bolsillos de unión son capaces de presentar glicolípidos y fosfolípidos a las células citolíticas naturales (NKT). Las células NKT representan una única población de linfocitos que co-expresan marcadores de células NK y un receptor de células T semi-invariante (TCR). Estas están implicadas en la regulación de las respuestas inmunológicas asociadas con una amplia gama de enfermedades.
En ciertas realizaciones, las células T expandidas por el tratamiento han sido pre-activado por el proceso de la enfermedad y tienen un fenotipo de memoria. En un aspecto, las células T surgen de precursores autorreactivas que reconocen el epítopo diana con baja avidez. La avidez se puede determinar mediante un ensayo de unión del tetrámero o similar. En un aspecto adicional, el complejo de antígeno/MHC/partícula se administra antes, después o tanto antes como después de la aparición de los síntomas clínicos de la diabetes tipo I o prediabetes. En aún un aspecto adicional, el procedimiento puede incluir una etapa que comprende la evaluación de un parámetro biológico de la diabetes de tipo I o prediabetes, tales como los niveles de azúcar en sangre del sujeto antes y/o después del tratamiento. Los procedimientos de la invención también pueden incluir la evaluación del estado autoinmune de un sujeto, que incluye la evaluación de las respuestas inmunes autorreactivas. En ciertos aspectos, una célula T es una célula T CD4+ o CD8+ o una célula NK T (NKT).
Otras realizaciones de la invención incluyen complejos o composiciones de antígeno-MHC para uso en los procedimientos de la expansión de células T autorreactivas no patogénicas o anti-patogénicas, que comprende administrar un complejo de antígeno/MHC/partícula en una cantidad suficiente para estimular la expansión de una célula T autorreactivas no patogénica o anti-patogénica. En ciertos aspectos de la célula T es un CD8+ o una célula T CD4+ o una célula NKT.
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En todavía otras realizaciones, la invención incluye los complejos o composiciones de antígeno-MHC para usar en los procedimientos para proteger las células de un sujeto, tal como las células de los islotes pancreáticos, de una respuesta a diabetes tipo 1 o prediabetes, que comprende administrar a un sujeto un complejo de antígeno/MHC/partícula en una cantidad suficiente para inhibir la destrucción de las células o tejidos que comprenden las células, en el que el antígeno o molécula antigénica de la que se deriva proviene de un autoantígeno asociado con las células.
Un complejo de antígeno/MHC/partícula se refiere a la presentación de un péptido, carbohidrato, lípido, u otro segmento antigénico, fragmento, o epítopo de una molécula o proteína antigénica (es decir, auto péptido o autoantígeno) sobre una superficie, tal como una nanopartícula. "Antígeno" tal como se utiliza en la presente se refiere al total, parte, fragmento, o segmento de una molécula que puede inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto o una expansión de células no patogénicas.
En ciertos aspectos, el complejo de antígeno/MHC/partícula no necesita ser administrado con un adyuvante con el fin de inducir una respuesta inmunitaria, por ejemplo, una respuesta de anticuerpos. En realizaciones particulares, el complejo de antígeno/MHC/partícula se puede usar en conjunción con técnicas de anticuerpos policlonales y monoclonales bien conocidas para producir un anticuerpo utilizando adyuvante reducido o sin este.
Por "destrucción" o "mata" se entiende que causa la muerte celular por apoptosis o necrosis. La apoptosis o necrosis puede estar mediada por cualquier vía de muerte celular.
Las “células autoinmunes" incluyen, por ejemplo, esplenocitos adultos, linfocitos T, linfocitos B, y células de origen de médula ósea, tales como células presentadoras de antígeno defectuosas de un mamífero, que tienen actividad hacia el organismo del que se deriva la célula autoinmune.
Un "mímico" es un análogo de un ligando o péptido dado, en el que el análogo es sustancialmente similar al ligando. "Sustancialmente similar" significa que el análogo tiene un perfil de unión similar a la del ligando excepto que el mímico tiene uno o más grupos funcionales o modificaciones que colectivamente representan menos de aproximadamente 50%, menos de aproximadamente 40%, menos de aproximadamente 30%, o menos de aproximadamente 20%, del peso molecular del ligando.
Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para conseguir el objetivo pretendido, por ejemplo, la modulación de la actividad de células T o poblaciones de células T. Como se describe en la presente en detalle, la cantidad efectiva, o la dosis, depende del propósito y el antígeno y puede ser determinada de acuerdo con la presente descripción.
Una "células T autorreactivas" es una célula T que reconoce un "auto-antígeno", que es una molécula producida y contenida por el mismo individuo que contiene la célula T.
Una "célula T patogénica" es una célula T que es perjudicial para un sujeto que contiene las células T. Mientras que una célula T no patogénica no es sustancialmente perjudicial para un sujeto, y una célula T anti-patogénica reduce, mejora, inhibe, o invalida el daño de una célula T patogénica.
Los términos "inhibir", "reducir", o "prevenir", o cualquier variación de estos términos, cuando se usan en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva incluyen cualquier disminución o inhibición completa medible para conseguir el resultado deseado.
El uso de la palabra "un" o "una" cuando se usa junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar "uno", pero también es compatible con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno".
A lo largo de esta solicitud, el término "aproximadamente" se utiliza para indicar que un valor incluye la desviación estándar del error para el dispositivo o procedimiento que se emplea para determinar el valor.
El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para significar "y/o" a menos que se indique de forma explícita para referirse solo a alternativas o las alternativas que se excluyen mutuamente, aunque la descripción apoya una definición que se refiere solo a las alternativas e "y/o".
Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, las palabras "que comprende" (y cualquier forma de comprender, como "comprende" y "comprenden"), "que tiene" (y cualquier forma de tener, como "tiene" o "tienen"), “que incluye" (y cualquier forma de incluir, como "incluye" e "incluyen") o " que contiene" (y cualquier forma de contener, como "contiene" y "contienen") son inclusivos o abiertos y no excluyen, elementos o etapas del procedimiento no citados, adicionales.
Descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas aquí presentadas.
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FIGS. 1A-C. Propiedades tolerogénicas de un los complejos de péptido/MHC unidos al sólido. Las inyecciones intravenosas de los complejos de péptido/MHC unidos al sólido en ratones 8.3-NOD induce la reducción de las células T (FIG. 1A), y produce células T CD8+ activadas por el antígeno no reducidas (FIG. 1B) con hiporrespuesta a la estimulación ex-vivo de antígeno (FIG. 1C).
FIG. 2. La administración sistémica de NRP-V7/Kd-np en ratones NOD jóvenes produjo protección para la diabetes. Los ratones NOD se inyectaron por vía intravenosa con 7,5 mg de NRP-V7/Kd np a 4, 6 y 8 semanas de edad y cada tres semanas a partir de este momento hasta las 32 semanas. 85% de los Animales tratados con NRP-V7/Kd np (n = 21) permanecieron libres de diabetes a las 32 semanas, en comparación con 36% y 23% en grupos tratado con np control (n = 25) y no tratado (n = 65), respectivamente.
FIG. 3. Biodistribución de las nanopartículas revestidas con péptido/MHC marcado dentro de 24 horas de una dosis sistémica.
FIG. 4. Niveles de citoquina sérica en ratones NOD tratados con NRP-V7/Kd-np y np biotinilado versus no tratados (n = 5, 5, y 10, respectivamente). Hembras NOD de 10 semanas se inyectaron con dos dosis del np respectivo por semana durante 5 semanas. Los sueros se recogieron 6 horas después de la última inyección y se sometieron a análisis de citoquinas 20-plex usando tecnología de perlas de matriz Luminex.
FIGS. 5A-5E. La administración sistémica de NRP-V7/Kd-np en los ratones NOD produjo la expansión de células T CD8+ positivas para el tetrámero. FIG. 5A, el tratamiento con NRP-V7/Kd-np expandió las células del tetrámero NRP-V7/Kd dentro de la población de las células T CD8+ en la sangre periférica (n = 4) y los infiltrados de islotes. (N = 11), en comparación con los animales tratados con el control-np (n = 4 y 21 para la sangre y de los islotes, respectivamente). FIG. 5B, las células del tetrámero+ expandido en los islotes pancreáticos se unen al péptido/MHC con avidez baja. Kd = 10,21 ± 1,65 nM en animales tratados con NRP-V7/Kd-np, en comparación con el Kd = 4,42 ± 0,87 nM en los animales de control (n = 5 y 12, respectivamente). FIG. 5C y FIG. 5D, el efecto protector de NRP-V7/Kd np es dependiente de la dosis (FIG. 5C) y corresponde al grado de expansión de las células tetrámero NRP-V7/Kd+ en la sangre periférica (FIG. 5D). Los animales se inyectaron con dosis completa (7,5 g por inyección), 1/5 (1,5 g por inyección), o 1/20 (0,375 g por inyección) de np siguiendo esquemas de inyección idénticos (como se describió anteriormente) (n = 21, 12, y 13, respectivamente). FIG. 5E, la expansión de las células T CD8+ del tetrámero NRP-V7/Kd+ es dependiente del número de inyecciones (n = 10). Hembras de diez semanas NOD se inyectaron con 10 dosis completas de NRP-V7/Kd-np en dos inyecciones por semana. Los animales se sangraron después de 4 y 10 inyecciones, y se determinaron los porcentajes de células del tetrámero NRP-V7/Kd+ en la sangre.
FIGS. 6A-6C. Captación específica de péptido/MHC recubierto np por las células T CD8+ cognadas. FIG. 6A y FIG. 6B, los ratones 17.4α/8.3β-N0D (FIG. 6A) o 17.6α/8.3β-NOD (FIG. 6B) no se trataron o se trataron con una inyección única de 10 equivalente de dosis completa de NRPV7/Kd-np y se sacrificaron 20 horas después. Las células esplénicas CD8+, CD4+, CD11c+ y CD11b+ y B220+ se evaluaron para determinar la unión a np sobre la base de MFI del fluoróforo FIAC asociado a np (n = 1 para cada cepa). FIG. 6C, los ratones NOD no se trataron o se trataron con dos dosis completas de NRP-V7/Kd-np cada semana durante 5 semanas, comenzando a las 10 semanas, y se sacrificaron 20 horas después de la última inyección de np. Las células esplénicas CD8+, CD4+, CD11c+ y CD11b+ se evaluaron para determinar la unión a np sobre la base de MFI del fluoróforo FIAC asociado a np (n = 2). Cabe destacar que un pico pequeño de células marcadas con fluorescencia aparece exclusivamente en el subconjunto de células T CD8+.
FIGS. 7A-7D. Administración sistémica de DMK138-146/Db-np en ratones NOD jóvenes produjo la expansión selectiva de células T CD8+ reactivas a DMK138-146 y proporcionó protección para la diabetes. FIG. 7A, Los ratones NOD tratados con DMK138-146/Db-np siguiendo el mismo esquema que en la FIG. 5 exhiben la expansión de células T CD8+ tetrámero+ DMK138-146/Db en la sangre periférica (n = 11) y los infiltrados de islote (n = 13), en comparación con los animales de control (n = 3). FIG. 7B, 72% de los animales tratados con DMK138-146/Db-np permanecieron libres de diabetes las 32 semanas (n = 18). FIG. 7C y FIG. 7D, La expansión de las células CD8+ tetrámero+ es específica del antígeno. El tratamiento con DMK138-146/Db-np no expande células de tetrámero+ NRP-V7/Kd (sangre: n = 4 y 11; islote: n = 21 y 11) (FIG. 7C) y el tratamiento NRP-V7/Kd-np no expande las células de tetrámero+ DMK138-146/Db (sangre: n = 3 y 4; islotes: n = 3 y 2) (FIG. 7D). FIG. 7E, Perfiles de FACS representativos de células T CD8+ de sangre periférica en ratones tratados con nanopartículas. Los ratones recibieron una inyección intravenosa de nanopartículas una vez cada 2-3 semanas, a partir de las 4 semanas. Estas muestras son del ratón al final del tratamiento (=32 semanas).
FIG. 8. Aumento de reclutamiento de células T CD8+ reactivas a IGRP206-214 o DMK138-146 en los islotes pancreáticos después del tratamiento con nanopartículas revestidas con NRP-V7/Kd-o DMK138-146/Db, respectivamente. Los ratones recibieron una inyección intravenosa de nanopartículas una vez cada 2-3 semanas, a partir de las 4 semanas de edad. Estas muestras son del ratón al final del tratamiento (=32 semanas). Las células T CD8+ asociadas al islote se analizaron para determinar la producción de IFN-γ en respuesta a las célula presentadoras de antígeno pulsadas con IGRP206-214-, DMK138-146-, o Insulina-L (INS-L). INS-L se usó como control (tratado con NRP-V7/Kd-np n = 8, tratado con DMK138-146/Db-np n= 5, tratado con control np n = 8 para las respuestas específicas de IGRP- e INS-L, n = 3 para las respuestas específicas de DMK).
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FIGS. 9A-9F. El tratamiento con NRP-V7/Kd-np y DMK138-1461Db-np revierte la hiperglucemia cuando se da en el inicio de la diabetes. FIG. 9A, Sobrevida de ratones NOD con diabetes agua sometidos a los tratamientos np. Los animales que alcanzan o superan 10,5 mM de glucemia se tratan por vía intravenosa con TUM/Kd-np (n = 9), NRPV7/Kd-np (n = 11), o DMK138-146/Db-np (n = 11) dos veces por semana hasta que los animales se consideraron sistemáticamente normoglucémicos (con un nivel de glucemia que se mantiene por debajo del umbral de 10,5 mM durante cuatro semanas ocnsecutivas). FIG. 9B- FIG. 9D, Curvas de glucemia de animales individuales tratados con NRP-V7/Kd-np (FIG. 9B), DMK138-146/Db-np (FIG. 9C) y TUM/Kd-np (FIG. 9D). FIG. 9E, Niveles de glucemia promedio de cada grupo de tratamiento calculado respecto de la duración del régimen de tratamiento. FIG. 9F, Curvas de glucemia de animales individuales tratados con 20 g/día de Mab anti-CD3 MAb (clon 2C11) durante 5 días consecutivos.
FIG. 10. Resultado del retiro del tratamiento. FIG. 10A, La acumulación y declinación de las células de tetrámero+ en la sangre periférica a diferentes puntos de tiempo después del retiro del tratamiento con np. Los animales tratados con NRP-V7/Kd-np y DMK138-146/Db-np presentaron pérdida progresiva de su respectiva población de células T CD8+ tetrámero+ en la periferia después del retiro del tratamiento. FIG. 10B, Recurrencia de diabetes en ratones NOD curados después del retiro del tratamiento. Los animales retirados de los tratamientos se controlaron para la diabetes hasta al menos 50 semanas de edad. FIG. 10C, Curvas de glucemia de animales individuales tratados con NRP-V7/Kd-np y curados después del retiro del tratamiento. FIG. 10D, Curvas de glucemia de animales individuales tratados con DMK138-146/Db-np y curados después del retiro del tratamiento.
FIGS. 11A-11D. Tolerancia a la glucosa en ratones curados. FIG. 11A, IPGTT de animales curados con diabetes aguda en comparación con controles no tratados a 50 semanas (parte superior: curvas de glucosa IPGTT; parte inferior: análisis de área bajo la curva; diabético no tratado n = 7; no diabético no tratado n = 5; tratado con NRPV7/Kd-np n = 4; tratado con DMK138-146/Db-np n = 5). FIG. 11B, Niveles de insulina sérica posprandial de ratones tratados con NRP-V7/Kd-np versus controles diabéticos y no diabéticos no tratados (n = 7, 9, y 7, respectivamente). FIG. 11C, Niveles de insulina sérica IPGTT de ratones tratados con NRP-V7/Kd-np- y DMK138-146/Db-np versus controles diabéticos y no diabéticos no tratados (n 4, 7, y 5). FIG. 11D, Pesos corporales de animales tratados con NRP-V7/Kd-np (n = 5) y no tratados (n = 6) a las 50 semanas.
FIG. 12. Las nanopartículas revestidas con péptido/MHC pueden ‘discriminar' entre células T CD8+ autoreactivas de avidez baja y alta. Los transfectantes TCR diferentes se incubaron con perlas revestidas con NRP-V7/Kd durante 5 o 30 minutos y se tiñeron con mAb anti-CD8. Los histogramas representan el porcentaje de células que habían formado capuchones de CD8 en los tiempos indicados después de la incubación con perlas.
FIGS. 13A-13C. Las células T CD8+ 17.6α/8.3β autorreactivas de baja afinidad son anti-diabetogénicas. FIG. 13A, Frecuencia de diabetes en ratones 17.6α/8.3β-NOD (n = 95) versus 17.4α/8.3β-N0D (n =598). FIG. 13B, Puntuación de insulitis en ratones Tg (n = 6 para 17.6α/8.3β-NOD, n = 3 para 17.4α/8.3β-N0D). FIG. 13C, Frecuencia de diabetes en NOD (n = 56) versus LCMV-NOD (n = 10).
FIGS. 14A-14B. Biología del desarrollo del TCR. 17.6α/8.3β. FIG. 14A, Biología del desarrollo del TCR 17.6α18.3β versus 17.4α/8.3β en ratones Tg. Los paneles superiores son gráficos de puntos representativos de CD4 versus CD8 de los esplenocitos. El panel inferior es la comparación de la tinción de células T CD8+ con tetrámero NRP-V7/Kd. FIG. 14B, Biología del desarrollo de los TCR 17.6α/8.3β frente 17.4α/8.3β en ratones RAG-2/Tg. Los paneles superiores son son gráficos de puntos representativos de CD4 versus CD8 de los esplenocitos. El panel inferior es la comparación de la tinción de células T CD8+ con tetrámero NRP-V7/Kd.
FIG. 15. Frecuencia de la diabetes en ratones 17.6α/8.311-NOD.RAG-2-/- (n = 13) versus 17.4α/8.3β-NOD.RAG-2-/(n = 106).
FIGS. 16A-16B. D Biología del desarrollo del TCR 17.6α/8.3β versus 17.4α/8.3β en ratones TCRα-/- Tg. FIG. 16A, Los paneles superiores son gráficos de puntos representativos de CD4 versus CD8 de los esplenocitos. El panel inferior es la comparación de la tinción de células T CD8+ con tetrámero NRP-V7/Kd. FIG. 16B, Frecuencia de diabetes en ratones 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- (n = 14) versus 17.4α/8.3β- NOD.TCRα-/- (n = 28). Los valores de los paneles FACS del gráfico de puntos corresponden a los porcentajes de las células dentro de cada cuadrante y los valores en los paneles del histograma corresponden a los porcentajes de las células que se tiñeron de positivo (media ± SE).
FIGS. 17A-17J. Las células T CD8+ 17.6α/8.3β se diferencian espontáneamente en células T de memoria con función regulatoria. FIG. 17A, Perfiles FACS representativos de células T CD8+ esplénicas de ratones 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- versus 17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/-. FIG. 17B, Porcentaje de células T CD8+ CD44hi CD122+ dentro del bazo (n = 12 para 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- y n = 9 para 17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/-), PLN (n = 9 para 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- y n = 6 para 17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/-) y BM (n = 4 para 17.6α/8.3β- NOD.TCRα-/- y n = 3 para 17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/-) de ratones TCRα-/- Tg (media+ SE). Los ratones tenían 9-18 semanas. FIG. 17C, Perfil FACS representativo de células T CD8+ esplénicas de ratones 17.6&8.3β-NOD.TCRα-/- teñidos con tetrámero NRP-V7/KD versus Ab anti-CD122. Los valores son media ± SE de cinco experimentos diferentes. FIG. 17D, Análisis fenotípico de células T CD8+ esplénicas naive versus memoria de ratones 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/-. Los datos son representativos de al menos dos experimentos para cada marcador. FIG. 17E, Comparación de tinción de CD122 en
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timocitos CD8+CD4- versus esplenocitos CD8+ de ratones TCRα-/- Tg. Los datos son representativos de cuatro experimentos. FIG. 17F, Captación de BrdU por células T CD8+ esplénicas de ratones TCRα-/- Tg. FIG. 17G, Panel superior: perfil FACS representativo de la proliferación de las células T CD8+ esplénicas de ratones Tg en respuesta a las citoquinas IL-2 y IL-15 (ambas a 100 ng/ml). Panel inferior: Nivel de expansión de células T CD8+ naive versus memoria de ratones 17.6 α/8.3β-NOD.TCRα-/- en respuesta a la diferente concentración de IL-2 y IL-15. Los datos son representativos de al menos tres experimentos. FIG. 17H, Producción de IFN-γ por las células T CD8+ naive esplénicas de los ratones 17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/- versus células T CD8+ naive y memoria de ratones 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- en respuesta a DCs pulsados con 1 g/ml de NRP-A7 después de 24 y 48 horas. FIG. 171, Tinción de IFN-γ intracelular de células T CD8+ naive esplénicas de ratones 17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/- versus células T CD8+ naive y memoria de ratones 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- en respuesta a DCs pulsado con 1 g/ml de NRP-A7 después de 6 horas. FIG. 17J, Producción de IL-2 y proliferación en respuesta a DCs pulsados con 1 µg/ml de NRP-A7 en puntos de tiempo diferentes. Los datos de la FIG. 17H y FIG. 17J son representativos de cuatro experimentos y los datos de la FIG. 171 son representativos de tres experimentos.
FIG. 18. Proliferación de células T CD8+ 17.4α/8.3β marcadas con CFSE. Proliferación de células T CD8+ 17.4α/8.3β marcadas con CFSE en respuesta a DC pulsada con NRP-A7 en presencia de células T CD8+ naive y memoria de ratones 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- (panel superior) o células T CD8+ naive de ratones 17.4α/8.3β-N0D versus LCMV-NOD (panel inferior). Los datos son representativos de al menos cinco experimentos.
FIG. 19. Las células T CD8+ 17.6α/8.3β de memoria matan los APC pulsados con antígeno. FIG. 19A, Citotoxicidad in vitro de las células T CD8+ naive recién aisladas de ratones 17.4α/8.3β- NOD.TCRα-/- versus células T CD8+ naive y memoria de ratones 17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/- contra BM DC pulsado con NRP-A7 y TUM. Los datos son representativos de tres experimentos. Los BM DC purificados se pulsaron con 1 g/ml de NRP-A7 o TUM y marcado con [51Cr] cromato de sodio. Elector: relación deseada = 8:1 (40000 efectores: 5000 células diana). El sobrenadante se recolectó después de 8 horas. FIG. 19B, Ensayo de citotoxicidad in vivo: células B pulsadas con NRP-A7 (CFSE1lo) o pulasadas con TUM (CFSEhi) (paneles superiores) o DC esplénicos recién aislados y de LN (paneles inferiores) se inyectaron en huéspedes Tg en una relación 1:1. Las células B o DC frescos (del bazo y LN) se aislaron usando perlas MACS anti-B220 o anti-CD11c, pulsadas con 10 µg/ml de péptidos durante 2 horas, se lavaron, marcaron con CFSE (TUM: 3 µM CFSE, NRPA7: CFSE) durante 3 minutos a 37°C, se lavaron 3 veces y 45x106 células de cada población se inyectaron en los huéspedes. Después de 18 horas se sacrificaron los ratones y los esplenocitos se analizaron por FACS.
FIGS. 20A-20D. Las células CD8+ tetrámero+ expandidas en NRP-V7/Kd-np- o DMK138-146/Db-np presentan actividad supresora. FIG. 20A, las células CD8+ tetrámero+ expandidas en NRP-V7/Kd expresan altos niveles de CD44; un subconjunto de estas también expresan CD122 (n = 7 y 4 para control versus NRP-V7/Kd-np). FIG. 20B, las células de tetrámero+ expandidas secretan IFNγ pero no IL-2 en respuesta la estimulación antigénica. Se clasificaron los esplenocitos CD8+ positivos para el tetrámero NRP-V7/Kd y negativos, y 20.000 células clasificadas se cultivaron con 10000 de células dendríticas derivadas de BM en presencia de 1 g/ml de péptido NRP-V7. Los sobrenadantes del cultivo se recolectaron a las 24 horas, y se midió la incorporación de [3H]-timidina de 24 a 48 horas. FIG. 20C, Supresión in vitro de proliferación de células T 17.4α/8.3β-CD8+ por células T CD8+ tetrámero+ NRP-V7/Kd o DMK138146/Db expandidas np. El tetrámero NRP-V7/Kd o DMK138-146/Db o células T CD8+ se separaron por FACS y se preactivaron con Mab anti-CD3 unido en placa o cultivados directamente con BMDC pulsados con péptido NRP-V7 o NRP-V7/DMK138-146 durante la noche. Las células T indicadores 17.4α/8.3β-CD8+ marcadas con CFSE se añadieron al cocultivo en una relación de un supresor a un indicador, y la dilución de CFSE se evaluó 48 horas después. Se muestran los perfiles representativos de 3 experimentos. FIG. 20D, Resumen de los experimentos de supresión in vitro mostrados en la FIG. 20C.
FIGS. 21A-21C. Las nanopartículas revestidas con péptido/MHC expanden las células T de memoria de avidez baja preexistentes. FIG. 21A, TUM/Kd-np no expande las células de tetrámero+ TUM/Kd (n = 7 y 9, en el bazo). FIG. 21B, NRP-V7/Kd-np no expande las células de tetrámero+ NRP-V7/Kd en el bazo, ganglios linfáticos pancreáticos, médula ósea, y sangre periférica de ratones B10.H-2g7 resistente a diabetes. Ratones H-2g7 de 10 semanas se inyectaron por semana con dosis completas de NRP-V7/Kd-np durante 5 semanas consecutivas y se determinó la frecuencia de células de tetrámero+ (tratado con NRP-V7/Kd-np n = 4, control n = 5). FIG. 21C, La expansión de las células de tetrámero+ NRP-V7/Kd con el tratamiento np es más eficiente en el inicio de la diabetes. En la presente, se comparan los porcentajes de células de tetrámero+ en la sangre periférica de los animales que recibieron 10 dosis completas de NRP-V7/Kd-np a partir de las 4 semanas (n = 9), 10 semanas (n = 10), o en el inicio de la diabetes (n = 3).
FIGS. 22A-22C. El efecto protector del tratamiento con NRP-V7/Kd-np y DMK138-146/Db-np requiere la expansión de células T CD8+ de tetrámero+ preexistentes de avidez baja, FIG. 22A, Diagrama esquemático del constructo NODIGRPK209A5213AKI/KI. FIG. 22A describe las SEQ ID NOS 58 y 4, respectivamente, en orden de aparición. FIG. 22B, respuestas de IFNγ por las células T CD8+ asociadas al islote en cada epitopo de IGRP en dos ratones NOD.IGRPK209A/F213AKI/KI diferentes. FIG. 22C, Falta de expansión de células CD8+ tetrámero+ NRP-V7/Kd en ratones tratado con NOD.IGRPK209A/F213AKI/KI tratados con NRP-V7/Kd-np (n = 8) en el bazo, médula ósea, ganglios linfáticos pancreáticos, y sangre peirférica.
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Descripción detallada de la invención
Observaciones hasta la fecha (Han et al., 2005) sugirieron que, para ser efectiva en la autoinmunidad, la terapia de péptidos puede tener que dirigirse a múltiples especificidades de epítopo. Los inventores razonaron que sería muy poco práctico de lograr esto con péptidos debido a que, en el caso de IGRP solo, esto puede requerir varios miligramos de péptidos por dosis. Debido a que los péptidos son mucho más tolerogénicos (es decir, en cantidades menores) cuando se unen a moléculas de MHC en los APCs fijos (Miller et al., 1979), se contempla que la administración sistémica de los complejos de antígeno/MHC, por ejemplo, complejos de péptido/MHC (sin moléculas coestimuladoras) en partículas podría ser más tolerogénica que los péptidos solos. Este pensamiento se desarrollá a partir de la disponibilidad de un reactivo inicialmente concebido para visualizar la inflamación de los islotes. Los inventores intentaron administrar específicamente una sonda susceptible de examen de imágenes por resonancia magnética (MR) a las células T CD8+ tipo 8.3 (nanopartículas de óxido de hierro revestidas con complejos NRPV7/Kd) circulantes (Moore et al., 2004). En particular, los inventores contemplaron el revestimiento de estas partículas con varios antígenos complejos de antígeno /MHC diferentes como una forma de inducir la eliminación simultánea de múltiples especificidades de células T por debajo del umbral requerido para el desarrollo de DT1. Una de las características del uso de estas nanopartículas para la inducción de la tolerancia era que su prototipo fue aprobado para su uso en humanos para estudios de resonancia magnética.
Sorprendentemente, los inventores encontraron que las nanopartículas revestidas con complejos de antígeno/MHC (complejo de antígeno/MHC/partícula) expandieron, de manera eficiente, consistente y en dosis muy bajas (correspondientes a ~0,6 g de péptido), el tipo de células CD8+ autorreactivas de baja avidez que proporcionaba protección para T1D ratones tratados con APL (Han et al., 2005;. Maree et al, 2006). Otra observación sorprendente fue que estas nanopartículas parecen expandir mezclas preexistentes de células T CD8+ autorreactivas de memoria (es decir, no inducen células T de memoria de novo). Estas mezclas preexistentes están compuestas de forma predominante (si no exclusiva) de clonotipos CD8+ autorreactivos de baja avidez (no patogénico/anti-patogénico). Las contrapartes de avidez alta de estas células T (con actividad patogénica) no sobreviven in vivo como células de memoria, posiblemente, pero sin limitar la invención a ninguna teoría en particular, porque se someten a la muerte celular inducida por activación después a la exposición crónica a su autoantígeno de células beta diana endógeno. Otra observación inesperada fue que estas partículas no necesitan tener que dirigirse a una población predominante de células T CD8+ autorreactivas sea efectivo: se obtuvieron resultados similares con nanopartículas revestidas con un complejo de péptido/MHC subdominante. Además, esta tecnología no requiere el diseño de APL de avidez definida (a diferencia del caso con los péptidos), y por lo tanto tiene el potencial para acomodar cualquier antígeno diana o péptido/MHC diana. Uno de los diversos atributos de esta tecnología es que puede restaurar la normoglucemia en ratones NOD con T1D diagnóstico reciente, a tasas que son al menos comparable, si no mejores, que las obtenidos con el tratamiento de mAb anti-CD3, un enfoque no específico de antígeno que ha mostrado alguna promesa en los ensayos clínicos (Herold et al., 2002;. Keymeulen et al, 2005).
Los inventores han producido complejos de autoantígeno/MHC que, cuando se administran unidos a partículas de óxido de hierro, expanden, de manera eficiente, consistente y en dosis muy bajas (correspondiente a ~0,6 g de péptido), un tipo de células CD8+ que proporcionaba protección contra una afección autoinmune. Las composiciones de la invención se pueden usar para expandir la mezclas preexistentes de células T CD8+ autorreactivas de memoria (es decir, no inducen células T de memoria de novo). Estas mezclas preexistentes están compuestas de forma predominante (si no exclusiva) de clonotipos CD8+ autorreactivos de baja avidez (no patogénico/antipatogénico). Las contrapartes de avidez alta de estas células T (con actividad patogénica) no sobreviven in vivo como células de memoria, y existen predominantemente como células T naive. Las células T naive experimentan la muerte celular después de unirse a los complejos autoantígeno/MHC/partículas en ausencia de coestimulación y por lo tanto la invención elimina las células T naive patogénicas y expanden las células T de memoria antidiabetogénicas.. Las composiciones descritas no necesitan dirigirse a una población predominante de células T CD8+ autorreactivas para ser eficaz. En ciertas realizaciones, las composiciones y los procedimientos se pueden usar para inducir tolerancia a las células T autorreactivas.
I. Composiciones farmacéuticas y administración
La presente invención incluye los complejos o composiciones de antígeno-MHC para usar los procedimientos para prevenir o mejorar diabetes tipo I o prediabetes. Como tal, la invención contempla "vacunas" o modificadores del sistema inmune para su uso en diversas realizaciones. Las composiciones propuestas como adecuadas para usar como una vacuna se pueden preparar a partir de moléculas autorreactivas que incluyen proteínas autorreactivas y sus fragmentos. La invención incluye composiciones que se pueden usar para inducir o modificar una respuesta inmunitaria contra un antígeno autorreactivo, por ejemplo, un polipéptido, un péptido, un carbohidrato, un lípido u otra molécula o fragmento molecular y contra el desarrollo de una afección o enfermedad causada por diabetes tipo I
o prediabetes.
Las composiciones de la invención pueden ser convencionalmente administradas por vía parenteral, por inyección, por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea, o intramuscular. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen las formulaciones orales. Las formulaciones orales incluyen excipientes empleados normalmente tales como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones toman la forma de
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soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen aproximadamente 10% a aproximadamente 95% de componente activo, preferiblemente de aproximadamente 25% a aproximadamente 70%.
Típicamente, las composiciones de la invención se administran de una manera compatible con la formulación de dosis y en una cantidad tal que sea terapéuticamente efectiva e inmunomodificadora. La cantidad a administrar depende del sujeto a tratar. Las cantidades precisas de componente activo para administrar dependen del criterio médico. Sin embargo, los intervalos de dosis adecuados varían del orden de diez a varios cientos de nanogramos o microgramos de complejo de antígeno/MHC/partícula por administración. Los regímenes adecuados para la administración inicial y de los refuerzos también son variables, pero están tipificados por una administración inicial seguida de administraciones posteriores.
La forma de aplicación puede variar ampliamente. Se puede aplicar cualquiera de los métodos convencionales para la administración de una vacuna. Se considera que estos incluyen la aplicación oral sobre una base sólida fisiológicamente aceptable o en una dispersión fisiológicamente aceptable, por vía parenteral, por inyección y similares. La dosis del complejo de antígeno/MHC/partícula dependerá de la vía de administración y variará de acuerdo con el tamaño y la salud del sujeto.
En muchos casos, será deseable tener múltiples administraciones de un complejo de péptido/MHC/partícula, aproximadamente, a lo sumo aproximadamente o al menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más. Las administraciones normalmente variarán de 2 días a intervalos de doce semanas, más habitualmente de una a intervalos de dos semanas. Los refuerzos periódicos a intervalos de 0,5 a 5 años, usualmente dos años, serán convenientes para mantener la condición del sistema inmunológico. El curso de las administraciones puede ser seguido por ensayos para respuestas inmunes autorreactivas y actividad de las células T.
A. Terapia de combinación
Las composiciones y procedimientos relacionados de la presente invención, en particular la administración de un complejo de antígeno/MHC/partícula, también se pueden usar en combinación con la administración de terapias tradicionales. Estos incluyen, pero sin limitación, la administración de inmunosupresores o terapias o tratamientos de modulación.
En un aspecto, se contempla que un complejo de antígeno/MHC/partícula se usa en conjunción con un tratamiento de citoquinas. Alternativamente, la administración del complejo de antígeno/MHC/partícula puede preceder o seguir al otro tratamiento por intervalos que van de minutos a semanas. En realizaciones en las que los otros agentes y/o complejos de antígeno/MHC/partículas se administran por separado, en general se puede asegurar que un período de tiempo significativo no expiró entre el tiempo de cada administración, de tal manera que el agente y el complejo de antígeno/MHC/partícula aún sería capaz de ejercer un efecto combinado ventajosamente sobre el sujeto. En tales casos, se contempla que se pueden administrar ambas modalidades dentro de aproximadamente 12-24 h entre sí y, más preferiblemente, dentro de aproximadamente 6-12 h entre sí. En algunas situaciones, puede ser deseable extender significativamente el período de tiempo para la administración, a pesar de que pasan varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8) entre las respectivas administraciones.
Varias combinaciones se pueden emplear, por ejemplo la administración del complejo antígeno/MHC/partícula es "A" y el agente adicional es "B":
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
La administración de las composiciones de complejos de péptido-MHC de la presente invención a un paciente/sujeto seguirá los protocolos generales para la administración de tales compuestos, tomando en cuenta la toxicidad, si la hay. Se espera que los ciclos de tratamiento se puedan repetir según sea necesario. También se contempla que varias terapias estándar, tales como la hidratación, se pueden aplicar en combinación con la terapia descrita.
B. Composiciones farmacéuticas
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto.
Diferentes aspectos de la presente invención implican la administración de una cantidad efectiva de una composición de omplejo de antígeno/MHC/partícula a un sujeto. Además, tales composiciones se pueden administrar en combinación con modificadores del sistema inmunitario. Tales composiciones generalmente se disuelven o dispersan en un vehículo farmacéuticamente aceptable o medio acuoso.
Las frases "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable"
se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra no
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deseada cuando se administran a un animal, o ser humano. Como se usa en la presente, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares. El uso de tales medios y agentes para los principios activos farmacéuticos es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional es incompatible con los principios activos, se contempla su uso en las composiciones inmunogénicas y terapéuticas.
Los compuestos activos de la presente invención se pueden formular para la administración parenteral, por ejemplo, formulado para inyección por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, o incluso intraperitoneal. La preparación de una composición acuosa que contiene un complejo antígeno/MHC/partícula que modifica condición inmunitaria del sujeto será conocido por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Típicamente, tales composiciones pueden prepararse como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para usar para preparar soluciones o suspensiones después de la adición de un líquido antes de la inyección y, las preparaciones también se pueden emulsionar.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete, o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que se pueda inyectar fácilmente. También debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe estar preservada contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.
Las composiciones se pueden formular en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables, incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.
El vehículo también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede ser causada por varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser provocada por el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se preparan mediante la incorporación de los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferidos son técnicas de secado al vacío y liofilización, que producen un polvo del ingrediente activo, más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo.
La administración de las composiciones de acuerdo con la presente invención será típicamente por medio de cualquier vía común. Esto incluye, pero no se limita a inyección ortotópica, intradérmica, subcutánea, intravenosa. En ciertas realizaciones, una composición de vacuna puede ser inhalada (por ejemplo, Patente, US 6.651.655).
Una cantidad efectiva de la composición terapéutica o profiláctica se determina sobre la base del objetivo pretendido. El término "dosis unitaria" o "dosificación" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas para usar en un sujeto, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de la composición calculada para producir las respuestas deseadas discutidas anteriormente, en asociación con su administración, es decir, la vía y el régimen apropiados. La cantidad a administrar, de acuerdo con el número de tratamientos y la dosis unitaria, depende del resultado y/o la protección deseada. Las cantidades precisas de la composición también dependen del criterio del médico y son peculiares para cada individuo. Los factores que afectan a la dosis incluyen el estado físico y clínico del sujeto, la vía de administración, el objetivo de tratamiento pretendido (alivio de síntomas versus curación), y la potencia, estabilidad y toxicidad de la composición particular. Después de la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosis y en una cantidad tal que sea terapéutica o profilácticamente efectiva. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosis, tales como el tipo de soluciones inyectables descriptas anteriormente.
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C. Administración in vitro o ex vivo
Tal como se utiliza en la presente, el término administración in vitro se refiere a las manipulaciones realizadas en células extraídas de o fuera de un sujeto, que incluyen, pero sin limitación células en cultivo. El término administración ex vivo se refiere a células que han sido manipuladas in vitro, y después se administran a un sujeto. El término administración in vivo incluye todas las manipulaciones realizadas dentro de un sujeto, incluidas las administraciones.
En ciertos aspectos de la presente invención, las composiciones se pueden administrar in vitro, ex vivo o in vivo. En ciertas realizaciones in vitro, las células T autólogas se incuban con composiciones de esta invención. Las células se pueden utilizar para el análisis in vitro, o, alternativamente, para la administración ex vivo.
II. COMPLEJOS DE MHC
Los antígenos, que incluyen los segmentos, fragmentos y otras moléculas derivadas de una especie antigénica, que incluye pero sin limitación péptidos, carbohidratos, lípidos u otras moléculas presentadas por moléculas de MHC clásicas y no clásicas de la invención están típicamente complejadas o acopladas operativamente a una molécula de MHC o derivado de la misma. El reconocimiento del antígeno por los linfocitos T está restringido al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Un linfocito T dado reconocerá un antígeno solo cuando se une a una molécula de MHC particular. En general, los linfocitos T son estimulados solamente en presencia de auto moléculas del MHC, y el antígeno es reconocido como fragmentos del antígeno unido a las automoléculas de MHC auto. La restricción de MHC define la especificidad de los linfocitos T en términos del antígeno reconocido y en términos de la molécula de MHC que se une a su fragmento antigénico (s). En aspectos particulares cierto antígeno se apareará con ciertas moléculas MHC o polipéptidos derivados de estos.
El término "operativamente acoplado” o "revestido" como se usa en la presente, se refiere a una situación en la que el polipéptido individual (por ejemplo, MHC) y componentes antigénicos (por ejemplo, péptido) se combinan para formar el complejo activo antes de la unión en el sitio blanco, por ejemplo, una célula inmune. Esto incluye la situación en la que se sintetizan y expresan de forma recombinante los componentes del complejo de polipéptidos individuales o y posteriormente aislar y combinar para formar un complejo, in vitro, antes de la administración a un sujeto; la situación en la que un polipéptido quimérico o de fusión (es decir, cada componente de proteína diferenciado del complejo está contenido en una única cadena de polipéptido) se sintetiza o expresa en forma recombinante como un complejo intacto. Típicamente, se añaden los complejos de polipéptidos a las micropartículas para producir micropartículas con complejos de polipéptidos adsorbidos o acoplados que tiene una relación de número de moléculas: número de relaciones de partículas de aproximadamente de, al menos aproximadamente o a lo sumo aproximadamente 0,1, 0,5, 1, 10, 100, 500, 1.000 o más para: 1, más típicamente de 0,1: 1 a 50: 1. El contenido de polipéptido de las micropartículas se puede determinar usando técnicas estándares.
A. Moléculas MHC
Los antígenos presentes intracelulares y extracelulares presentan desafíos muy distintos para el sistema inmunitario, tanto en términos de reconocimiento como de respuesta adecuada. La presentación de antígenos a las células T está mediada por dos clases distintas de moléculas de MHC de clase I (MHC-I) y MHC de clase II (MHC-II), que utilizan distintas vías de procesamiento de antígeno. Los péptidos derivados de antígenos intracelulares se presentan a lass células T CD8+ por las moléculas MHC de clase I, que se expresan en prácticamente todas las células, mientras que los péptidos derivados de antígenos extracelulares se presentan a las células T CD4+ por las moléculas MHC-II. Sin embargo, hay ciertas excepciones a esta dicotomía. Varios estudios han demostrado que los péptidos generados a partir de partículas sometidas a endocitosis o proteínas solubles se presentan en las moléculas MHC-I en macrófagos, así como en células dendríticas. En ciertas realizaciones de la invención, un péptido particular derivado de un autoantígeno es identificado y presentado en el complejo de péptido/MHC/ partícula en el contexto de un polipéptido de MHC de clase I o II apropiado. En ciertos aspectos, la composición genética de un sujeto puede evaluarse para determinar cuá polipéptido de MHC es para ser utilizado para un paciente particular y un conjunto particular de péptidos.
También se contemplan las moléculas de MHC no clásicas para usar en los complejos de MHC de la invención. Las moléculas MHC no clásicas son no polimórficas, conservadas entre especies, y poseen bolsillos de unión al ligando hidrófobos, profundos y estrechos. Estos bolsillos de unión son capaces de presentar glicolípidos y fosfolípidos a las células T citolíticas naturales (NKT). Las células NKT representan una única población de linfocitos que co-expresan marcadores de células NK y un receptor de células T semi-invariante (TCR). Ellos están implicados en la regulación de las respuestas inmunes asociadas con una amplia variedad de enfermedades.
B. Componentes antigénicos
Ciertos aspectos de la invención incluyen procedimientos y composiciones referentes a composiciones antigénicas que incluyen segmentos, fragmentos o epítopos de polipéptidos, péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos y otras moléculas que provocan o inducen una respuesta antigénica, se hace referencia generalmente como antígenos. En particular, los autoantígenos, o segmentos o fragmentos antigénicos de dichos autoantígenos, que llevan a la destrucción de una célula por medio de una respuesta autoinmune, pueden ser identificados y utilizados
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en la fabricación de un complejo MHC/partícula descripto en la presente. Tales autoantígenos se pueden presentar en los islotes pancreáticos o células de soporte las células de los islotes pancreáticos. Las realizaciones de la invención incluyen composiciones y procedimientos para la modulación de una respuesta inmunitaria contra una célula particular o un conjunto de células que llevan a cabo una función fisiológica particular.
1. Componentes peptídicos y composiciones proteínicas
Los polipéptidos y péptidos de la invención pueden ser modificados por varias supresiones, inserciones y/o sustituciones de aminoácidos. En realizaciones particulares, los polipéptidos y/o péptidos modificados son capaces de modular una respuesta inmune en un sujeto. Como se utiliza en la presente, una "proteína" o "polipéptido" o "péptido" se refiere a una molécula que comprende al menos cinco residuos de aminoácidos. En algunas realizaciones, se empleauna versión de tipo salvaje de una proteína o péptido, sin embargo, en muchas realizaciones de la invención, una proteína o polipéptido modificado se emplea para generar un complejo de péptido/MHC/ partícula. Un complejo de péptido/MHC/ partícula se puede utilizar para generar una respuesta inmunitaria y/o para modificar la población de células T del sistema inmunitario (es decir, re-educar al sistema inmunitario). Los términos descritos anteriormente se pueden usar indistintamente en la presente. Una "proteína modificada" o "polipéptido modificado" o "péptido modificado" se refiere a una proteína o polipéptido cuya estructura química, en particular su secuencia de aminoácidos, se altera con respecto a la proteína o polipéptido de tipo salvaje. En algunas realizaciones, una proteína o polipéptido o péptido modificado tiene al menos una actividad o función modificada (que reconoce que las proteínas o polipéptidos o péptidos pueden tener múltiples actividades o funciones). Se contempla específicamente que una proteína o polipéptido o péptido modificado puede estar alterada con respecto a una actividad o función y aún retener una actividad o función de tipo salvaje en otros aspectos, tales como la inmunogenicidad o capacidad de interactuar con otras células del sistema inmunitario cuando está en el contexto de un complejo MHC/partícula.
Los péptidos de la invención incluyen cualquier péptido autorreactivo. Los péptidos autorreactivos incluyen, pero sin limitación a hInsBio_18 (HLVEALYLV (SEQ ID NO:1)), hIGRP228_236 (LNIDLLWSV (SEQ ID NO:2)), hIGRP265273 (VLFGLGFAI (SEQ ID NO:3)), IGRP206-214 (VYLKTNVFL (SEQ ID NO:4)), hIGRP206-214 (VYLKTNLFL (SEQ ID NO:5)), NRP-A7 (KYNKANAFL (SEQ ID NO:6)), NRP-I4 (KYNIANVFL (SEQ ID NO:7)), NRP-V7 (KYNKANVFL (SEQ ID NO:8)), YAIJDb (FQDENYLYL (SEQ ID NO:9)) y/o INS B15_ 23 (LYLVCGERG (SEQ ID NO:10)), así como péptidos y proteínas descritas en la publicación U.S. 20050202032. Otros péptidos que se pueden usar en conjunción con invención como péptidos autorreactivos o como péptidos de control incluyen, pero pero sin limitación INS-19 (LYLVCGERI (SEQ ID nO: 11)), TUM (KYQAVTTTL (SEQ ID NO: 12)), y G6Pasa (KYCLITIFL (SEQ ID NO: 13)). En ciertos aspectos, se pueden utilizar 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más péptidos. Los ejemplos de péptidos que se pueden utilizar en conjunción con la presente invención también incluyen los proporcionados en la Tabla 1. Estos péptidos pueden estar asociados con moléculas de partículas /MHC específicos o múltiples péptidos pueden estar asociados con una partícula común y una o más moléculas de MHC. La administración de combinaciones de estos péptidos incluye la administración de una población de partículas que tienen múltiples péptidos unidos y/o la administración de múltiples poblaciones de partículas que tienen cada uno un péptido específico unido o una combinación de tales partículas que incluye partículas con 1, 2, 3, 4, 5, 6, o más péptidos unidos a 1, 2, 3, 4, 5, 6, o más partículas.
Tabla 1A Epítopos restringidos de HLA clase I para T1D
Antígeno
Epítopo HLA Secuencia de aminoácidos Comentarios Referencia
GAD65
114-123 A2 VMNILLQYVV (SEQ ID:14) reactividad detectada en ratones HHD inmunizados y pacientes T1D Blancou et. al. 2007, PaninaBordignon et. al. 1995, Mallone et. al. 2007
536-545
A2 RMMEYGTTMV (SEQ ID NO:15) reactividad detectada en ratones HHD inmunizados y pacientes T1D Blancou et. al. 2007
GFAP
143-151 A2 NLAQTDLATV (SEQ ID NO:16) reactividad detectada en pacientes T1D Ouyang et. al. 2006
214-222
A2 QLARQQVHV (SEQ ID NO:17) reactividad detectada en pacientes T1D Ouyang et. al. 2006
IA-2
172-180 A2 SLSPLQAEL (SEQ ID NO:18) reactividad detectada en pacientes T1D Ouyang et. al. 2006
482-490
A2 SLAAGVKLL (SEQ ID NO:19) reactividad detectada en pacientes T1D Ouyang et. al. 2006
805-813
A2 VIVMLTPLV (SEQ reactividad detectada Blancou et. al.
E08731723
11-12-2014 E08731723
ID NO:20)
en ratones HHD inmunizados con plásmidos y pacientes T1D 2007
ppIAPP
5-13 9-17 A2 A2 KLQVFLIVL (SEQ ID NO:21) FLIVLSVAL (SEQ ID NO:22) reactividad detectada en pacientes T1D reactividad detectada en pacientes T1D Panagiotopoulos et al 2003, Jarchum et. al. 2008 Ouyang et. al.
IGRP
152-160 A2 FLWSVFMLI (SEQ ID NO:23) NLFLFLFAV (SEQ reactividad detectada en pacientes T1D reactividad detectada Ouyang et. al. 2006 Jarchum et. al.
211-219
A2 ID NO:24) en pacientes T1D 2008
215-223
FLFAVGFYL (SEQ ID NO:25) reactividad detectada en pacientes T1D Ouyang et. al. 2006, Jarchum et. al. 2008
222-230
A2 YLLLRVLNI (SEQ ID NO:26) reactividad detectada en pacientes T1D Jarchum et. al. 2008
228-236
LNIDLLWSV (SEQ ID NO:2) reactividad con el correspondiente epitope de IGRP murino (que difieren en 2 aminoácidos) detectados en ratones HDD inmunizados Takaki et. al. 2006
265-273
A2 VLFGLGFAI (SEQ ID NO:3) reactividad detectada en ratones HHD inmunizados y pacientes T1D de inicio reciente Takaki et. al. 2006, Unger et. al. 2007, Jarchum et. al. 2008
293-301
A2 RLLCALTSL (SEQ ID NO:27) reactividad detectada en pacientes T1D Ouyang et. al. 2006
Proinsulina
L2-10 A2 ALWMRLLPL (SEQ ID NO:28) reactividad detectada en ratones HHD inmunizados y pacientes T1D Mallone et. al. 2007, Jarchum et. al. 2007
L3-11
A2 LWMRLLPLL (SEQ ID NO:29) reactividad con el correspondiente epitope de la proinsulina 1 murina (que difiere en 5 aminoácidos) detectada en ratones HHD Jarchum et. al. 2007
L6-14
A2 RLLPLLALL (SEQ ID NO:30) reactividad detectada en pacientes T1D Mallone et. al. 2007
B5-14
A2 HLCGSHLVEA (SEQ ID NO:31) reactividad con el correspondiente epitope de la proinsulina 1 murina (que difiere en 1 aminoácido) detectada en ratones HHD Jarchum et. al. 2007
B10-18
A2 HLVEALYLV (SEQ ID NO:1) reactividad detectada en ratones HHD inmunizados y Toma et. al. 2005, Hassainya et. al. 2005,
11-12-2014 E08731723
pacientes T1D
Pinkse et. al. 2005
B14-22
A3 All ALYLVCGER (SEQ ID NO:32) reactividad detectada en pacientes T1D Toma et. al. 2005
B15-24
A24 LYLVCGERGF (SEQ ID NO:33) reactividad detectada en pacientes T1D Toma et. al. 2005
B17-25
A1 A3 LVCGERGFF (SEQ ID NO:34) reactividad detectada en pacientes T1D Toma et. al. 2005
B18-27
A1 A2, B8, B18 VCGERGFFYT (SEQ ID NO:35) reactividad detectada en pacientes T1D Toma et. al. 2005, Hassainya et. al. 2005,
B20-27
A1, B8 GERGFFYT (SEQ ID NO:36) reactividad detectada en pacientes T1D Toma et. al. 2005
B21-29
A3 ERGFFYTPK (SEQ ID NO:37) reactividad detectada en pacientes T1D Toma et. al. 2005
B25-C1
B8 FYTPKTRRE (SEQ ID NO:38) reactividad detectada en pacientes T1D Toma et. al. 2005
B27-C5
B8 TPKTRREAEDL (SEQ ID NO:39) reactividad detectada en pacientes T1D Toma et. al. 2005
C20-28
A2, SLQPLALEG (SEQ ID NO:40) reactividad detectada en ratones HHD inmunizados con péptido Hassainya et. al. 2005
C25-33
A2 ALEGSLQKR (SEQ ID NO:41) reactividad detectada en ratones HHD inmunizados con péptido Hassainya et. al. 2005
C29-A5
A2 SLQKRGIVEQ (SEQ ID NO:42) reactividad detectada en ratones HHD inmunizados con péptido Hassainya a al. 2005
A1-A10
GIVEQCCTSI (SEQ ID NO:43) reactividad detectada en ratones HHD inmunizados con péptido Hassainya et. al. 2005
A2-A10
IVEQCCTSI (SEQ ID NO:44) reactividad con el correspondiente epitope de la proinsulina 1 murina (que difiere en 1 aminoácido) detectada en ratones HHD Jarchum et. al. 2007
A12-20
SLYQLENYC (SEQ ID NO:45) reactividad detectada en ratones HHD inmunizados con péptido Hassainya et. al. 2005
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insulinoma 2, ppIAPP: proteína precursora del polipéptido amiloide del islote, IGRP: proteína relacionas con la subunidad catalítica de glucosa 6-fosfatasa específica del islote
Tabla 1B Epítopos restringidos de HLA clase I para MS
Antígeno
Epítopo HLA Secuencia de aminoácidos Comentarios Referencia
MAG
287-295 A2 SLLLELEEV (SEQ ID NO:46) Reconocido por las líneas de células T CD8+ generadas de pacientes con MS e individuos sanos Tsuchida et. al. 1994
MAG
509-517 A2 LMWAKIGPV SEQ ID NO:47) Reconocido por las líneas de células T CD8+ generadas de pacientes con MS e individuos sanos Tsuchida et. al. 1994
MAG
556-564 A2 VLFSSDFRI SEQ ID NO:48) Reconocido por las líneas de células T CD8+ generadas de pacientes con MS e individuos sanos Tsuchida et. al. 1994, Jurewicz et. al. 1998
MBP
110-118 A2 SLSRFSWGA (SEQ ID NO:49) reactividad detectada en ratones HHD inmunizados con péptido Mars et. al. 2007
MOG
114-122 A2 KVEDPFYWV (SEQ ID NO:50) reactividad detectada en ratones HHD inmunizados con péptido Mars et. al. 2007
MOG
166-175 A2 RTFDPHFLRV (SEQ ID NO:51) reactividad detectada en ratones HHD inmunizados con péptido Mars et. al. 2007
MOG
172-180 A2 FLRVPCWKI (SEQ ID NO:52) reactividad detectada en ratones HHD inmunizados con péptido Mars et. al. 2007
MOG
179-188 A2 KITLFVIVPV (SEQ ID NO:53) reactividad detectada en ratones HHD inmunizados con péptido Mars et. al. 2007
MOG
188-196 A2 VLGPLVALI (SEQ ID NO:54) reactividad detectada en ratones HHD inmunizados con péptido Mars et. al. 2007
MOG
181-189 A2 TLFVIVPVL (SEQ ID NO:55) reactividad detectada en ratones HHD inmunizados con péptido Mars et. al. 2007
MOG
205-214 A2 RLAGQFLEEL (SEQ ID NO:56) reactividad detectada en ratones HHD inmunizados con péptido Mars et. al. 2007
PLP
80-88 A2 FLYGALLLA (SEQ ID NO:57) Reconocido por las líneas de células T CD8+ generadas de pacientes con MS e individuos sanos Tsuchida et. al. 1994, Dressel et. al. 1997
MBP: proteína básica de mielina, MAG: glicoproteína asociada a mielina, MOG: glicoproteína de oligodendrocito de mielina, PLP: proteína de proteolípido
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En ciertas realizaciones, el tamaño de una proteína o polipéptido (tipo salvaje o modificada), que incluye cualquier complejo de una proteína o péptido de interés y en particular una fusión de MHC/péptido, puede comprender, pero sin limitación 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200,210, 220, 230, 240, 250, 275,300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575,600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500 moléculas amino o más, que incluye cualquier intervalo o valor derivable de las mismas o derivado de las mismas. En ciertos aspectos, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos contiguos, que incluyen los derivados de los mismos, y fragmentos de un autoantígeno, tales como las secuencias de aminoácidos descritas y referidas en la presenta, se pueden usar como antígenos. Se contempla que los polipéptidos pueden mutar por truncamiento, haciéndolos más corto que su correspondiente forma de tipo salvaje, pero también se podrían alterar mediante la fusión o conjugación de una secuencia de proteína heteróloga con una función particular (por ejemplo, para la presentación como un complejo de proteínas, para mejorar la inmunogenicidad, etc.).
Como se usa en este documento, una "molécula de amino" se refiere a cualquier aminoácido, derivado de aminoácido o mimético de aminoácido conocido en la técnica. En ciertas realizaciones, los residuos de la molécula proteínica son secuenciales, sin ninguna molécula no amino que interrumpa la secuencia de residuos de amino de la molécula. En otras realizaciones, la secuencia puede comprender uno o más restos molécula no amino. En realizaciones particulares, la secuencia de residuos de la molécula proteínica puede estar interrumpida por uno o más restos de molécula no amino.
Por consiguiente, el término "composición proteínica" abarca secuencias de la molécula amino que comprenden al menos uno de los 20 aminoácidos comunes de las proteínas sintetizadas de forma natural, o al menos un aminoácido modificado o inusual.
Las composiciones proteínicas se pueden obtener por cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica, que incluyen (i) la expresión de proteínas, polipéptidos, o péptidos a través de técnicas de biología molecular convencionales, (ii) el aislamiento de compuestos proteínicos a partir de fuentes naturales, o (iii) la síntesis química de materiales proteínicos. Las secuencias de nucleótidos, así como las de proteínas, polipéptidos, y péptidos para varios genes se han descrito anteriormente, y se pueden encontrar en las bases de datos informatizadas reconocidos. Una de estas bases de datos es la base de datos de National Center for Biotechnology Information's GenBank y GenPept (en la World Wide Web en ncbi.nlm.nih.gov/). La totalidad o parte de las regiones codificadoras de estos genes se puede amplificar y/o expresar usando las técnicas descritas en la presente o como sería conocido por los expertos en la técnica..
Las variantes de la secuencia de aminoácidos de epítopos autoantigénicos y otros polipéptidos de estas composiciones pueden ser variantes por sustitución, inserción, o supresión. Una modificación en un polipéptido de la invención puede afectar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158,159,160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192,193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342,343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 33, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500 o aminoácidos no contiguos o contiguos de un péptido o polipéptido, en comparación con los de tipo salvaje. Se contempla un péptido
o polipéptido que produce una respuesta autoinmune y en particular una respuesta autoinmune patológica para usar en los procedimientos de la invención.
Las variantes de supresión típicamente carecen de uno o más residuos de la secuencia de aminoácidos nativa o de tipo salvaje. Los residuos individuales se pueden eliminar o se pueden eliminar varios aminoácidos contiguos. Un codón de detención se puede introducir (por sustitución o inserción) en una secuencia de ácidos nucleicos
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codificadora para generar una proteína truncada. Las mutantes por inserción implican típicamente la adición de material en un punto no terminal del polipéptido. Esto puede incluir la inserción de uno o más residuos. También se pueden generar adiciones terminales, llamadas proteínas de fusión.
Las variantes de sustitución típicamente contienen el intercambio de un aminoácido por otro en uno o más sitios
5 dentro de la proteína, y se pueden diseñar para modular una o más propiedades del polipéptido, con o sin la pérdida de otras funciones o propiedades. Las sustituciones pueden ser conservadoras, es decir, un aminoácido se sustituye con uno de forma y carga similar. Las sustituciones conservadoras son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, los cambios de alanina a serina; arginina a lisina; asparagina a glutamina o histidina; aspartato a glutamato; cisteína a serina; glutamina a asparagina; glutamato a aspartato; glicina a prolina; histidina a asparagina o
10 glutamina; isoleucina a leucina o valina; leucina a valina o isoleucina; lisina a arginina; metionina a leucina o isoleucina; fenilalanina a tirosina, leucina o metionina; serina a treonina; treonina a serina; triptofano a tirosina; tirosina a triptofano o fenilalanina; y valina a isoleucina o leucina. Alternativamente, las sustituciones pueden ser no conservadoras de tal manera que se afecta una función o actividad de un polipéptido o péptido, tal como la avidez o afinidad por un receptor celular. Los cambios no conservadores implican típicamente la sustitución de un residuo con
15 una que es químicamente diferente, tal como un aminoácido polar o cargado por un aminoácido no polar o sin carga, y viceversa.
Las proteínas de la invención pueden ser recombinantes, o sintetizarse in vitro. Alternativamente, una proteína recombinante se puede aislar a partir de bacterias u otra célula huésped.
El término "codón funcionalmente equivalente" se utiliza en la presente para referirse a codones que codifican el
20 mismo aminoácido, como los seis codones para arginina o serina, y también se refiere a los codones que codifican aminoácidos biológicamente equivalentes (véase la siguiente Tabla 2).
Tabla 2 Tabla de codones
Aminoácidos
Codones
Alanina
Ala A GCA GCC GCG GCU
Cisteína
Cys C UGC UGU
Ácido aspártico
Asp D GAC GAU
Ácido glutámico
Glu E GAA GAG
Fenilalanina
Phe F UUC UUU
Glicina
Gly G GGA GGC GGG GGU
Histidina
His H CAC CAU
Isoleucina
Ile I AUA AUC A'UU
Lisina
Lys K AAA AAG
Leucina
Leu L WA UUG CUA CUC CUG CUU
Metionina
Met M AUG
Asparagina
Asn N AAC AAU
Prolina
Pro P CCA CCC CCG CCU
Glutamina
Gln Q CAA CAG
Arginina
Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU
Serina
Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU
Treonina
Thr T ACA ACC ACG ACU
Valina
Val V GUA GUC GUG GUU
Triptofano
Tip W UGG
Tirosina
Tyr Y UAC UAU
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También se entenderá que secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos pueden incluir residuos adicionales, tales como aminoácidos N- o C-terminales adicionales, o secuencias de ácidos nucleicos 5' o 3', respectivamente, y sin embargo aún ser esencialmente como expone en una de las secuencias descriptas en la presente, siempre que la secuencia cumpla los criterios establecidos anteriormente, que incluyen el mantenimiento de la actividad biológica de la proteína (por ejemplo, la inmunogenicidad). La adición de secuencias terminales se aplica particularmente a secuencias de ácido nucleico que por ejemplo, pueden incluir diversas secuencias no codificadoras flanqueantes en cualquiera de las porciones 5' o 3’ de la región codificadora.
Se contempla que en las composiciones de la invención, existe entre aproximadamente 0,001 mg y aproximadamente 10 mg de proteína total por ml. Por lo tanto, la concentración de proteína en una composición puede ser aproximadamente, al menos aproximadamente o a lo sumo aproximadamente 0,001, 0,010, 0,050, 0,1, 0,2, 0.3, 0.4, 0,5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 50, 100 g/ml o mg/ml o más (o cualquier intervalo derivable del mismo). De esto, aproximadamente, al menos aproximadamente, o a lo sumo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% puede ser el complejo de péptido/MHC/partícula.
Además, la patente U.S 4.554.101 (Hopp) enseña la identificación y preparación de epítopos de secuencias de aminoácidos primarios sobre la base de la hidrofilicidad. A través de los procedimientos descritos en Hopp, los expertos en la técnica pueden ser capaces de identificar epítopos potenciales del interior de una secuencia de aminoácidos y confirmar su inmunogenicidad. Numerosas publicaciones científicas también se han dedicado a la predicción de la estructura secundaria y a la identificación de epítopos, a partir de análisis de secuencias de aminoácidos (Chou y Fasman, 1974a, b; 1978a, b; 1979). Se puede usar cualquiera de estos, si se desea, para complementar las enseñanzas de Hopp en la patente US 4.554.101.
2. Otros componentes antigénicos
Moléculas distintas de péptidos se pueden usar como antígenos o fragmentos antigénicos en complejo con las moléculas de MHC, tales moléculas incluyen, pero sin limitación hidratos de carbono, lípidos, moléculas pequeñas, y similares. Los hidratos de carbono son componentes importantes de la superficie exterior de una variedad de células. Ciertos hidratos de carbono son características de diferentes etapas de la diferenciación y muy a menudo estos hidratos de carbono son reconocidos por anticuerpos específicos. La expresión de hidratos de carbono distintos puede estar restringida entipos celulares específicos. También se ha demostrado que las respuestas de autoanticuerpos a antígenos endometriales y séricos es una característica común de la endometriosis. Se ha descrito una respuesta de autoanticuerpos en suero en endometriosis a numerosos antígenos previamente identificadas, que incluyen la glicoproteína de 2-Heremans Schmidt y la anhidrasa carbónica, que es específica para un epítopo de hidratos de carbono (Yeaman et al., 2002).
C. Sustratos/Partículas
En cierto aspecto, los complejos de antígeno/MHC están acoplados operativamente a un sustrato. Un sustrato puede estar en forma de una partícula. Las partículas pueden tener una estructura de dimensión variable y conocida indistintamente como una microesfera, micropartícula, nanopartícula, nanosfera, o liposoma. Tales formulaciones de partículas que contienen un complejo de antígeno/MHC pueden formarse por acoplamiento covalente o no covalente del complejo a la partícula.
Por "partícula", "micropartículas", "perla", "microesfera", y equivalentes gramaticales en la presente significas pequeñas partículas diferenciadas que se pueden administrar a un sujeto. En ciertas realizaciones, las partículas son sustancialmente de forma esférica. El término "sustancialmente esférica", como se usa en la presente, significa que la forma de las partículas no se desvía de una esfera en más de aproximadamente 10%. Varios complejos de antígenos o péptidos conocidos de la invención se pueden aplicar a las partículas.
Las partículas típicamente consisten en un núcleo sustancialmente esférico y, opcionalmente, una o más capas. El núcleo puede variar en tamaño y composición. Además del núcleo, la partícula puede tener uno o más capas para proporcionar funcionalidades apropiadas para las aplicaciones de interés. Los espesores de las capas, si están presentes, puede variar de acuerdo con las necesidades de las aplicaciones específicas. Por ejemplo, las capas pueden impartir propiedades ópticas útiles.
Las capas también pueden impartir funcionalidades química o biológicas, denominadas en la presente como capas química o biológicamente activas, y para estas funcionalidades, la capa o capas normalmente pueden variar en espesor desde aproximadamente 0,001 micrómetros (1 nanómetros) a alrededor de 10 micrómetros o más (dependiendo del diámetro de partícula deseado), estas capas generalmente se aplican en la superficie exterior de la partícula.
Las composiciones del núcleo y las capas pueden variar. Los materiales adecuados para las partículas o el núcleo incluyen, pero sin limitación polímeros, cerámicas, vidrios, minerales, y similares. Los ejemplos incluyen, pero sin
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limitación, vidrios estándar y especiales, sílice, poliestireno, poliéster, policarbonato, polímeros acrílicos, poliacrilamida, poliacrilonitrilo, poliamida, fluoropolímeros, silicona, celulosas, silicio, metales (por ejemplo, hierro, oro, plata), minerales (por ejemplo, rubí), nanopartículas (por ejemplo, nanopartículas de oro, partículas coloidales, óxidos metálicos, sulfuros metálicos, seleniuros metálicos, y materiales magnéticos, tales como óxido de hierro), y compuestos de los mismos. El núcleo podría ser de composición homogénea, o un compuesto de dos o más clases de material, de acuerdo con las propiedades deseadas. En ciertos aspectos, se usarán nanopartículas metálicas. Estas partículas o nanopartículas metálicas pueden formarse a partir Au, Pt, Pd, Cu, Ag, Co, Fe, Ni, Mn, Sm, Nd, Pr, Gd, Ti, Zr, Si, e In, precursores, sus aleaciones binarias, sus aleaciones ternarias y sus compuestos intermetálicos. Véase la Patente U.S 6.712.997.
Como se indicó anteriormente, la partícula puede, además del núcleo, incluir una o más capas. Los objetivos para la inclusión de capas en la micropartícula pueden variar. Alternativamente, la superficie de la partícula se puede funcionalizar directamente. Una capa puede proporcionar superficies adecuadas para la fijación de funcionalidades químicas para los sitios de unión o acoplamiento químico.
Las capas se pueden producir en las micropartículas en una variedad de maneras conocidas por los expertos en la técnica. Los ejemplos incluyen las técnicas de química sol-gel, tal como se describe en Iler (1979); Brinker y Scherer (1990). Enfoques adicionales para la producción de capas de partículas incluyen técnicas de química y encapsulación de superficie, tales como las descritas en Partch y Brown (1998); Pekareket al. (1994); Hanprasopwattana (1996); Davies (1998); y sus referencias. Las técnicas de deposición de vapor también se pueden utilizar; véase, por ejemplo Golman y Shinohara (2000); y la Patente U.S, 6.387.498. Sin embargo, otros enfoques incluyen técnicas de auto-ensamblaje de la capa-bicapa tales como los descritos en Sukhorukov et al. (1998); Caruso et al. (1998); Caruso et al. (1999); Patente U.S 6.103.379 y las referencias allí citadas.
Las partículas se pueden formar mediante el contacto de una fase acuosa que contiene el complejo antígeno/MHC y un polímero y una fase no acuosa, seguido por evaporación de la fase no acuosa para causar la coalescencia de las partículas de la fase acuosa como se enseña en las Patentes US 4.589.330 o 4.818.542. Los polímeros preferidos para tales preparaciones son copolímeros o polímeros naturales o sintéticos seleccionados del grupo que consiste de agar gelatina, almidón, arabinogalactano, albúmina, colágeno, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, glicólido-L (-) láctido poli (epsilon-caprolactona, poli (ácido epsilon-caprolactona-CO-láctico), poli (ácido epsilon-caprolactona-COglicólico), poli (ácido β-hidroxi butírico), óxido de polietileno, polietileno, poli (alquil-2-cianoacrilato), poli (metacrilato de hidroxietilo), poliamidas, poli (aminoácidos), poli (2-hidroxietil DL-aspartamida), poli (éster urea), poli (Lfenilalanina/ etilenglicol/1,6-diisocianatohexano) y poli (metacrilato de metilo). Los polímeros particularmente preferidos son poliésteres, tales como ácido poliglicólico, ácido poliláctico, glicólido-L (-) láctido poli (epsiloncaprolactona, poli (ácido epsilon-caprolactona-CO-láctico) y poli (ácido epsilon-caprolactona-CO-glicólico. Los ddisolventes útiles para disolver el polímero incluyen: agua, hexafluoroisopropanol, cloruro de metileno, tetrahidrofurano, hexano, benceno, o sesquihidratado hexafluoracetona.
El término "micropartículas" como se usa en la presente, se refiere a una partícula de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 150 m de diámetro, más preferiblemente de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 30 m de diámetro, y de máxima preferencia de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 10 m de diámetro. Preferiblemente, la micropartícula será de un diámetro que permita la administración parenteral o en la mucosa sin ocluir agujas y capilares. El tamaño de micropartícula se determina fácilmente mediante técnicas bien conocidas en la materia, tales como espectroscopia de correlación de fotones, difractometría láser y/o microscopía electrónica de barrido. El término "partícula" también se puede usar para indicar una micropartícula según se define en la presente. Para un panorama general de los sistemas de administración de proteínas, Banga, Therapeutic Peptides y Proteins: Formulation, Processing, y Delivery Systems, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, Pa., 1995. Los sistemas de partículas incluyen microesferas, micropartículas, microcápsulas, nanocápsulas, nanoesferas y nanopartículas. Las partículas, microesferas y microcápsulas más pequeñas de aproximadamente 1 se denominan generalmente como nanopartículas, nanoesferas y nanocápsulas, respectivamente. Las micropartículas son típicamente alrededor de 100 m de diámetro y se administran por vía subcutánea o intramuscular (véase, Kreuter, 1994; Tice y Tabibi, 1992).
D. Acoplamiento de los complejos de antígeno-MHC de acoplamiento con la nanopartícula
Con el fin de acoplar el sustrato o partículas a los complejos de antígeno-MHC se pueden aplicar las siguientes técnicas.
La unión puede ser generado por la modificación química del sustrato o de partículas que típicamente implica la generación de "grupos funcionales" en la superficie, dichos grupos funcionales son capaces de unirse a un complejo antígeno-MHC, y/o unir la superficie en forma opcional modificada químicamente de la superficie o partícula modificada con las llamadas de "moléculas de unión" unidas de modo covalente o no covalente seguido de la reacción del complejo antígeno-MHC con las partículas obtenidas.
El término "molécula ligadora” significa una sustancia capaz de ligarse con el sustrato o partícula y también es capaz de ligarse a un complejo antígeno-MHC.
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El término "grupos funcionales" como se san anteriormente en la presente esta restringido a los grupos químicos reactivos que forman enlaces covalentes, sino que también incluye grupos químicos que conducen a una interacción iónica o enlaces hidrógeno con el complejo antígeno-MHC. Por otra parte, cabe señalar que una distinción estricta entre "grupos funcionales" generados en la superficie y las moléculas ligadoras que llevan "grupos funcionales" no es posible, ya que a veces la modificación de la superficie requiere la reacción de moléculas ligadoras más pequeños tales como etilenglicol con la superficie de la partícula.
Los grupos funcionales o las moléculas ligadoras que los portan se pueden seleccionar de grupos amino, grupos ácido carbónico, tioles, tioéteres, disulfuros, guanidino, grupos hidroxilo, grupos amina, dioles vecinales, aldehídos, grupos alfa-haloacetilo, organilos de mercurio, grupos éster, haluro de ácido, tioéster de ácido, anhídrido de ácido, isocianatos, isotiocianatos, haluros de ácido sulfónico, imidoésteres, diazoacetatos, sales de diazonio, 1,2-dicetonas, ácidos fosfónicos, ésteres de ácido fosfórico, ácidos sulfónicos, azolidas, imidazoles, indoles, N-maleimidas, compuestos de carbonilo insaturados alfa-beta, arilhaluros o sus derivados.
Los ejemplos no limitantes para otras moléculas ligadoras con pesos moleculares más altos son moléculas de ácidos nucleicos, polímeros, copolímeros, agentes de acoplamiento polimerizables, sílice, proteínas y moléculas tipo cadena que tienen una superficie con la polaridad opuesta con respecto al sustrato o partícula. Los ácidos nucleicos pueden proporcionar un enlace a moléculas de afinidad que contienen moléculas de ácido nucleico mismas, aunque con una secuencia complementaria con respecto a la molécula de enlace.
Como ejemplos de agentes de acoplamiento polimerizables, se pueden citar diacetileno, butadieno estireno, acetato de vinilo, acrilato, acrilamida, compuestos de vinilo, estireno, óxido de silicona, óxido de boro, óxido de fósforo, boratos, pirrol, polipirrol y fosfatos
La superficie del sustrato o partícula se puede modificar químicamente, por ejemplo por la unión de derivados de ácido fosfónico que tienen grupos funcionales reactivos. Un ejemplo de estos ácidos fosfónicos o derivados de éster de ácido fosfónico es ácido iminobis(metilenfosfono) carbónico que puede sintetizarse de acuerdo a la reacción "Mannich-Moedritzer". Esta reacción de unión se puede realizar con sustrato o partícula obtenidos directamente del proceso de preparación o después de un pre-tratamiento (por ejemplo con bromuro de trimetilsililo). En el primer caso el derivado de ácido (éster) por ejemplo puede desplazar los componentes del medio de reacción que todavía están unidos a la superficie. Este desplazamiento se puede mejorar a temperaturas más altas. Por otra parte, se considera que el bromuro de trimetilsililo desalquila los agentes complejantes basados en fósforo que contiene el grupo alquilo, de este modo se crean nuevos sitios de unión para el derivado de ácido (éster) fosfónico. El derivado de ácido fosfónico (éster) o las moléculas ligadoras unidas al mismo, pueden presentan los mismos grupos funcionales indicados anteriormente. Un ejemplo adicional de tratamiento de la superficie del sustrato o partícula consiste en calentar en un diol tal como etilenglicol. Cabe señalar que este tratamiento puede ser redundante si la síntesis ya procedió en un diol. Bajo estas circunstancias, el producto de síntesis obtenido directamente es probable que muestre los grupos funcionales necesarios. Este tratamiento sin embargo es aplicable al sustrato o partícula que se produjeron en agentes complejantes que contienen P o -N. Si tal sustrato o de partículas se someten a un tratamiento posterior con etilenglicol, los componentes del medio de reacción (por ejemplo, agente complejante) que aún están unidos a la superficie se pueden reemplazar con el diol y/o se pueden desalquilarse.
También es posible reemplazar agentes complejantes que tienen N todavía unidos a la superficie de la partícula por los derivados de aminas primarias que tienen un segundo grupo funcional. La superficie del sustrato o de partículas también se puede recubrir con sílice. La sílice permite una conjugación química relativamente simple de las moléculas orgánicas ya que el sílice reacciona fácilmente con los ligadores orgánicos, tales como trietoxisilano o clorosilano. La superficie de la partícula también puede estar recubierta por homo- o copolímeros. Los ejemplos de agentes de acoplamiento polimerizables son N- (3-aminopropil) -3- mercaptobenzamidina, 3-(trimetoxisilil) propilhidrazida y 3- trimetoxisilil) propilmaleimida. Otros ejemplos no limitativos de agentes de acoplamiento polimerizables se mencionan en la presente. Estos agentes de acoplamiento se pueden usar solo o en combinación de acuerdo con el tipo de copolímero para como un revestimiento.
Otra técnica de modificación de la superficie que se puede utilizar con sustratos o partículas que contienen compuestos de metales de transición de tipo óxido es la conversión de los compuestos de metales de transición oxidados por gas cloro o agentes de cloración orgánicos a los oxicloruros correspondientes. Estos oxicloruros son capaces de reaccionar con nucleófilos, tales como grupos hidroxi o amino como a menudo se encuentran en las biomoléculas. Esta técnica permite la generación de una conjugación directa con las proteínas, por ejemplo, por medio del grupo amino de las cadenas laterales de lisina. La conjugación con proteínas después de la modificación superficial con oxicloruros se puede efectuar también mediante el uso de un ligador bi-funcional, tal como hidrazida del ácido maleimidopropiónico.
Para las técnicas de enlace no covalentes, las moléculas de tipo cadena que tiene una polaridad o carga opuesta a la del sustrato o superficie de la partícula son particularmente adecuados. Los ejemplos para ligar moléculas que no se puede unir covalentemente a las nanopartículas núcleo/cubierta implican tensioactivos aniónicos, catiónicos o iónicos bipolares, proteínas ácidas o básicas, poliaminas, poliamidas, polisulfona o ácido policarboxílico. La interacción hidrófoba entre el sustrato o partícula y reactivo anfifílico tiene un grupo reactivo funcional puede generar la unión necesaria. En particular, las moléculas de tipo cadena con carácter anfifílico, tales como fosfolípidos o
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polisacáridos derivatizados, que se pueden reticular entre sí, son útiles. La absorción de estas moléculas en la superficie se puede lograr mediante coincubación. La unión entre la molécula de afinidad y el sustrato o partícula también se basar en enlaces no covalentes, de auto-organización. Un ejemplo de los mismos involucra las sondas de detección simples con biotina como molécula ligadora y las moléculas acopladas con avidina o estrepdavidina.
Los protocolos para reacciones de acoplamiento de grupos funcionales a las moléculas biológicas se pueden encontrar en la literatura, por ejemplo en "Bioconjugate Techniques" (Greg T. Hermanson, Academic Press 1996). La molécula biológica (por ejemplo, molécula de MHC o derivado de la misma) se puede acoplar a la molécula de unión, covalente o no covalente, de conformidad con los procedimientos estándar de química orgánica tales como la oxidación, halogenación, alquilación, acilación, adición, sustitución o amidación. Estos procedimientos para el acoplamiento de la molécula ligadora unida en forma covalente o no covalente se pueden aplicar antes del acoplamiento de la molécula ligadora de unión al sustrato o partícula o posteriormente. Además, es posible, por medio de incubación, efectuar una unión directa de moléculas al sutrato o partículas correspondientemente pretratados (por ejemplo con bromuro de trimetilsililo), que muestran una superficie modificada debido a este pretratamiento (por ejemplo, una mayor carga o superficie polar).
E. PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA
La presente invención describe polipéptidos, péptidos y proteínas para usar en diversas realizaciones de la presente invención. Por ejemplo, los péptidos específicos y sus complejos se analizan en cuanto a su capacidad para provocar o, modular una respuesta inmunitaria. En realizaciones específicas, la totalidad o parte de los péptidos o proteínas de la invención también se pueden sintetizar en solución o sobre un soporte sólido de acuerdo con técnicas convencionales. Varios sintetizadores automáticos están disponibles en el comercio y se pueden usar de acuerdo con protocolos conocidos. Véase, por ejemplo, Stewart y Young (1984); Tam et al. (1983); Merrifield (1986); y Barany y Merrifield (1979). Alternativamente, la tecnología de ADN recombinante se puede emplear en la que una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de la invención se inserta en un vector de expresión, se transformada o transfecta en una célula huésped apropiada y se cultiva en condiciones adecuadas para la expresión.
Una realización de la invención incluye el uso de la transferencia de genes a las células, que incluyen microorganismos, para la producción de proteínas. El gen para la proteína de interés se puede transferir a células huésped apropiadas, seguido por cultivo de células bajo las condiciones apropiadas. Se puede emplear un ácido nucleico que codifica prácticamente cualquier polipéptido. La generación de vectores de expresión recombinantes, y los elementos incluidos en el mismo, son conocidos para los expertos en la técnica y se discuten brevemente en la presente. Los ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos incluyen, pero sin limitación células VERO y HeLa, otras líneas de células B y T, tales como CEM, 721.221, H9, Jurkat, Raji, así como líneas de células de ovario de hámster chino, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, células RIN y MDCK. Además, se puede elegir una cepa de célula huésped que modula la expresión de las secuencias insertadas, o que modifica y procesa el producto génico de la manera deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos proteicos puede ser importante para la función de la proteína. Diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento postraduccional y la modificación de proteínas. Las líneas celulares o sistemas huésped apropiados se pueden elegir para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña expresada.
Se pueden usar numerosos sistemas de selección que incluyen, pero sin limitación HSV timidina quinasa, hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa, y adenina fosforribosiltransferasa, en células tk, hgprt-o aprt-, respectivamente. Además, la resistencia anti-metabolito se puede utilizar como la base de selección: para dhfr, que confiere resistencia a la trimetoprima y metotrexato; gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico; neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G418; e higro, que confiere resistencia a higromicina.
F. ÁCIDOS NUCLEICOS
La presente invención puede incluir polinucleótidos recombinantes que codifican las proteínas, polipéptidos, péptidos de la invención. Las secuencias de ácidos nucleicos para autoantígenos y las moléculas de MHC para la presentación de los autoantígenos, se incluyen y se pueden utilizar para preparar un complejo de péptido/MHC.
Como se usa en esta solicitud, el término "polinucleótido" se refiere a una molécula de ácido nucleico que, o bien es recombinante o se ha aislado libre de ácido nucleico genómico total. Dentro del término "polinucleótido" se incluyen los oligonucleótidos (100 residuos de ácidos nucleicos o menos de longitud), vectores recombinantes, que incluyen, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus, y similares. Los polinucleótidos incluyen, en ciertos aspectos, secuencias reguladoras, sustancialmente aislada lejos de sus genes de origen natural o secuencias que codifican proteínas. Los polinucleótidos pueden ser ARN, ADN, análogos de los mismos, o una combinación de los mismos.
A este respecto, el término "gen", "polinucleótido", o "ácido nucleico" se usa para referirse a un ácido nucleico que codifica una proteína, polipéptido o péptido (que incluyen cualquier secuencias requerida para la transcripción, modificación pos-traduccional, o localización adecuadas). Como será entendido por los expertos en la materia, este término abarca secuencias genómicas, casetes de expresión, secuencias de ADNc, y segmentos de ácidos
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nucleicos manipulados genéticamente más pequeños que expresan, o pueden ser adaptados para expresar, proteínas, polipéptidos, dominios, péptidos, proteínas de fusión, y mutantes. Un ácido nucleico que codifica el total o parte de un polipéptido puede contener una secuencia de ácidos nucleicos contigua que codifica el total o una porción de un polipéptido de las siguientes longitudes: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 9000, 10000, o más nucleótidos, nucleósidos, o pares de base. También se contempla que un polipéptido particular de una especie dada puede ser codificado por ácidos nucleicos que contienen variaciones naturales que tienen secuencias de ácidos nucleicos ligeramente diferentes pero, no obstante, codifican una proteína, polipéptido o péptido igual o sustancialmente similar.
En realizaciones particulares, la invención se refiere a segmentos de ácidos nucleicos aislados y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ácidos nucleicos que codifican un autoantígeno y/o una molécula de MHC. El término "recombinante" se puede usar en conjunción con un polipéptido o el nombre de un polipéptido específico, y esto generalmente se refiere a un polipéptido producido a partir de una molécula de ácido nucleico que ha sido manipulado in vitro, o que es un producto de replicación de una molécula tal molécula.
Los segmentos de ácido nucleico usados en la presente invención, independientemente de la longitud de la propia secuencia codificadora, se pueden combinar con otras secuencias de ácidos nucleicos, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiple, otros segmentos de codificación, y similares, de modo que su longitud total puede variar considerablemente. Por tanto, se contempla que se puede emplear un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud, la longitud total preferiblemente está limitada por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ácido nucleico recombinante previsto. En algunos casos, una secuencia de ácido nucleico puede codificar una secuencia de polipéptidos con secuencias codificadoras heterólogas adicionales, por ejemplo para permitir la purificación, transporte, secreción, modificación pos-traduccional del polipéptido, o para beneficios terapéuticos tales como localización selectiva o eficacia. Una marca u otro polipéptido heterólogo se pueden añadir a la secuencia que codifica un polipéptido modificado, en el que "heterólogo" se refiere a un polipéptido que no es el mismo que el polipéptido modificado.
III.
PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Y TERAPÉUTICOS
A.
Respuestas inmunitarias y ensayos
Como se discutió anteriormente, la invención se refiere a provocar o modificar una respuesta inmunitaria en un sujeto contra un autoantígeno. La respuesta o condición inmunitaria resultante pueden proteger contra o tratar un sujeto que tiene, se sospecha que tiene, o en riesgo de desarrollar una enfermedad o los síntomas relacionados con una respuesta autoinmune.
1. Inmunoensayos
La presente memoria descriptiva describe la implementación de las pruebas serológicas para evaluar si y en qué medida está presente una respuesta inmunitaria, inducida, provocada o modificado por un complejo de péptido/MHC/partícula. Hay muchos tipos de inmunoensayos que se pueden implementar. Los inmunoensayos abarcados por la presente invención incluyen, pero sin limitación, los descritos en la patente US 4.367.110 (ensayo de sándwich de anticuerpo monoclonal doble) y la patente US 4.452.901 (transferencia Western). Otros ensayos incluyen la inmunoprecipitación de ligandos e inmunocitoquímica marcados, tanto in vitro como in vivo.
Un procedimiento para cuantificar el número de células T CD8+ específicas de antígeno circulante es el ensayo de tetrámero. En este ensayo, un epítopo específico se une a las formas tetraméricas sintéticas de moléculas MHC de clase I marcadas con fluorescencia. Dado que las células T CD8+ reconocen antígenos en forma de péptidos cortos unidos a moléculas de clase I, las células con el receptor de la célula T apropiadas se unirán a los tetrámeros marcados y se pueden cuantificar por citometría de flujo. Aunque este procedimiento es menos laborioso que un ensayo ELISPOT, el ensayo de tetrámero mide solo la unión, no la función. No todas las células que se unen a un antígeno particular necesariamente se activan. Sin embargo, se ha demostrado la correlación entre los ensayos de ELISPOT, tetrámero, y citotoxicidad (Goulder et al., 2000).
Los inmunoensayos son generalmente ensayos de unión. Ciertos inmunoensayos preferidos son los diversos tipos de ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (MA) o ensayos basados en perlas, tal como la tecnología Luminex®, son conocidos en la técnica. La detección inmunohistoquímica que usa secciones de tejido también es particularmente útil.
En un ejemplo de ELISA, los anticuerpos o antígenos se inmovilizan sobre una superficie seleccionada, tal como un pocillo en una placa de microtitulación de poliestireno, tira reactiva, o soporte de la columna. Luego, una composición de prueba sospechosa de contener el antígeno o el anticuerpo deseado, tal como una muestra clínica, se añade a los pocillos. Después de la unión y el lavado para eliminar los complejos inmunes no unidos
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específicamente, se pueden detectar el antígeno o anticuerpo unido. La detección se consigue generalmente mediante la adición de otro anticuerpo, específico para el antígeno o el anticuerpo deseado, que está ligado a una marca detectable. Este tipo de ELISA es conocido como un "ELISA sándwich". La detección también se puede lograr mediante la adición de un segundo anticuerpo específico para el antígeno deseado, seguido de la adición de un tercer anticuerpo que tiene afinidad de unión por el segundo anticuerpo, el tercer anticuerpo está ligado a un marcador detectable. Las variaciones sobre técnicas de ELISA son conocidas por los expertos en la técnica.
Los ensayos ELISA de competición también son posibles en los que las muestras de prueba compiten por la unión con cantidades conocidas de antígenos o anticuerpos marcados. La cantidad de especies reactivas en la muestra desconocida se determina mediante la mezcla de la muestra con la especie marcada conocida antes o durante la incubación con los pocillos recubiertos. La presencia de especies reactivas en la muestra actúa para reducir la cantidad de especie marcada disponibles para la unión al pocillo y por lo tanto reduce la señal final.
Independientemente del formato utilizado, los ELISA tiene ciertas características en común, tales como revestimiento, incubación o unión, lavado para eliminar especies no unidas específicamente, y la detección de los complejos inmunes ligados.
Los antígenos o anticuerpos también pueden estar unidos a un soporte sólido, tal como en forma de placa, perlas, tiras reactivas, membrana o matriz de la columna, y la muestra para analizar se aplica al antígeno o anticuerpo inmovilizado. En el revestimiento de una placa con un antígeno o anticuerpo, generalmente se incubarán los pocillos de la placa con una solución de antígeno o anticuerpo, o bien durante la noche o durante un período determinado. Los pocillos de la placa a continuación, se lavarán para eliminar el material adsorbido incompletamente. Cualquier superficie disponible restante de los pozos después se "reviste" con una proteína inespecífica que es antigénicamente neutra con respecto al antisuero de prueba. Estos incluyen albúmina de suero bovino (BSA), caseína, y soluciones de leche en polvo. El revestimiento permite el bloqueo de sitios de adsorción no específicos sobre la superficie de inmovilización y reduce así el fondo causado por la unión no específica de antisuero sobre la superficie.
En los ELISA, es más habitual usar un medio de detección secundario o terciario en lugar de un procedimiento directo. Por lo tanto, después de la unión del antígeno o anticuerpo al pocillo, revestimiento con un material no reactivo para reducir el fondo, y lavado para eliminar el material no unido, la superficie de inmovilización se pone en contacto con la muestra clínica o biológica para analizar en condiciones eficaces para permitir la formación del complejo inmune (antígeno/anticuerpo). La detección del complejo inmunológico después requiere un ligando de unión o anticuerpo secundario marcado, o un ligando de unión secundario o anticuerpo en conjunción con un anticuerpo terciario marcado o tercer ligando de unión.
B. Evaluación de las respuestas o afecciones autoinmunes Además de la utilización de proteínas, polipéptidos, péptidos y/o para tratar o prevenir una enfermedad autoinmune, la presente memoria descriptiva describe el uso de estos polipéptidos, proteínas, y/o péptidos en una variedad de maneras, incluyendo la detección de la presencia de autoantígenos o una afección autoinmune para diagnosticar la presencia de ciertas poblaciones o condiciones de células autorreactivas. Un procedimiento para detectar la presencia de autorreactividad implica las etapas de obtener una muestra de un individuo, por ejemplo, a partir de sangre, saliva, tejidos, hueso, músculo, cartílago, o piel. Después del aislamiento de la muestra, los ensayos de diagnóstico que utilizan los polipéptidos, proteínas, y/o péptidos de la presente invención se pueden llevar a cabo para detectar la presencia de autorreactividad, y tales técnicas de ensayo para determinarla en una muestra son bien conocidos para los expertos en la técnica e incluyen procedimientos tales como ensayos de tetrámeros, inmunoensayos, transferencia Western y/o ensayos ELISA.
Como se usa en la presente la frase "respuesta inmunitaria" o su equivalente "respuesta inmunológica" se refiere al desarrollo de una respuesta celular (mediada por células T específicas de antígeno o sus productos de secreción) dirigida contra un autoantígeno o un epítopo relacionado de un autoantígeno. Una respuesta inmunitaria celular es provocada por la presentación de epítopos polipeptídicos en asociación con moléculas MHC de clase I o clase II, para activar las células T CD4+ auxiliares específicas de antígeno y/o células T citotóxicas CD8+. La respuesta también puede implicar la activación de otros componentes.
Para los propósitos de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, los términos "epítopo" y "determinante antigénico" se utilizan indistintamente para referirse a un sitio en un antígeno al que las células B y/o T responden o reconocen. Los epítopos de las células B pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos típicamente son retenidos para la exposición a disolventes desnaturalizantes mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario típicamente se pierden tras el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo incluye normalmente al menos 3, y más usualmente, al menos 5 o 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los procedimientos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen cristalografía de rayos X, por ejemplo, y de resonancia magnética nuclear de 2 dimensiones. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols (1996). Las células T reconocen epítopos continuos de aproximadamente nueve aminoácidos para las células CD8 o aproximadamente 13-15 aminoácidos para las células CD4. Las células T que reconocen el epítopo pueden identificarse mediante ensayos in vitro que miden la proliferación dependiente de antígeno, que se determina por incorporación de 3H-timidina por las células T activadas en respuesta a un epítopo
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(Burke et al., 1994), por destrucción dependiente del antígeno (ensayo de linfocitos T citotóxicos, Tigges et al., 1996)
o mediante la secreción de citoquinas. La presencia de una respuesta inmunológica mediada por células puede determinarse mediante ensayos de proliferación (células T CD4+) o ensayos de CTL (linfocitos T citotóxicos).
Tal como se usa en la presente y en las reivindicaciones, los términos "anticuerpo" o "inmunoglobulina" se usan indistintamente y se refieren a cualquiera de varias clases de proteínas estructuralmente relacionadas que funcionan como parte de la respuesta inmunitaria de un animal o receptor, estas proteínas incluyen IgG, IgD, IgE, IgA, IgM y las proteínas relacionadas.
Opcionalmente, un autoantígeno o preferiblemente un epítopo de un autoantígeno, se puede conjugar químicamente, o expresar como una proteína de fusión con otras proteínas, tales como MHC y proteínas relacionadas con MHC.
Tal como se utiliza en la presente, los términos "agente inmunogénico" o "inmunógeno" o "antígeno" se usan indistintamente para describir una molécula capaz de inducir una respuesta inmunológica contra sí misma en la administración a un receptor, ya sea sola, en combinación con un adyuvante, o presentada en un vehículo de exposición.
V. EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se dan con el propósito de ilustrar diversas realizaciones de la invención. Un experto en la técnica apreciará fácilmente que la presente
invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetivos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como los objetos, fines y ventajas inherentes de la presente. Los presentes ejemplos, junto con los métodos descritos en la presente son actualmente representativos de realizaciones preferidas, son ejemplos de la invención..
EJEMPLO 1
PROTECCIÓN T1D POR TRATAMIENTO CON NANOPARTÍCULAS REVESTIDAS CON PÉPTIDO/MHC
Protección de la Diabetes por el tratamiento con nanopartículas súper paramagnéticas revestidas con monómeros NRP-V7/Kd. Para estudiar si las nanopartículas revestidas con NRP-V7/Kd son tolerogénicas in vivo, se trataron ratones 8.3-TCR transgénicos (también denominados como ratones 8.3-NOD o Vα17.4+ TCR-TG más adelante) con varias inyecciones i.v de un pequeño volumen de partículas (5 l, que portan 0,6 g de NRP-V7, una vez cada 3 días). Las mezclas de células T CD8+ esplénicas reactivas a IGRP206-214 de alta avidez trangénicas de estos ratones se redujeron significativamente en tres dosis (las relaciones CD8:CD4 esplénicas cayeron de -4 a -1) (FIG 1A). Las pocas células T CD8+ no suprimidas mostraron signos de activación previa determinada mediante la evaluación de la expresión CD44 (FIG. 1B) y fueron hiporreceptivas a la estimulación antigénica in vitro, lo que sugiere que habían sido anergizadas por el tratamiento (FIG. 1 C).
Para estudiar la efectividad de la 'multiplexación', las perlas paramagnéticas (denominadas en la presente como "perlas", "nanopartículas", o "np" se revistieron con 6 diferentes monómeros de péptidos/MHC. Las cohortes de ratones NOD de tipo salvaje se trataron con una mezcla de estas perlas, con perlas revestidas con un péptido control (TUM)/Kd, o con perlas revestidas con NRP-V7/Kd (se esperaba que, como NRP-V7, las revestidas con NRP-V7/Kd reducirían la mezcla entera reactiva con IGRP206-21, sin ofrecer una protección diabetes (Han et al., 2005)). Sorprendentemente, a diferencia de los ratones tratados con perlas no revestidas, las perlas revestidas con avidina-biotina (también denominadas en la presente como "biotina-np"), perlas revestidas con TUM /Kd o péptido solo NRP-V7 Kd (Han et al. 2005), los ratones NOD tratados con perlas revestidas con NRP-V7/Kd (una vez cada 23 sem) fueron altamente protegidos de TID (FIG. 2).
Expansión sistémica de los clonotipos de baja avidez por el tratamiento con nanopartículas super-paramagnéticas revestidas con monómeros NRP-V7/Kd. Los estudios que emplean perlas marcadas radiactivamente indicaron que su distribución en el tejido dentro de las 24 horas de una sola inyección era sistémics, en todas las edades examinadas, como se esperaba dado su pequeño tamaño (FIG. 3). Las mediciones de los niveles de varias citoquinas y quimioquinas en el suero de los ratones tratados indicaron además que el tratamiento np no indujo una "tormenta de citoquinas" (es decir, aumento de los niveles séricos de citoquinas resultantes de la estimulación de diversos tipos de células inmunológicas, que incluyen las células T CD8+ reactivas con NRPV7 (FIG. 4).
De modo más interesante, sin embargo, los ratones tratados con perlas revestidas con NRP-V7/Kd habían aumentado significativamente las mezclas de células CD++ tetrámero+ NRP-V7/Kd circulantes e intra-islote al final del período de seguimiento (32 semanas), en comparación con las de los animales no diabéticos de edades correspondientes tratados con nanopartículas de control (FIG. 5A). Notablemente, las células T CD8+ intra-islote de ratones tratados con nanopartículas NRP-V7/Kd se unieron a los tetrámeros NRP-V7/Kd con avidez significativamente menor (mayor Kd) que las encontradas en los islotes de los ratones de control, lo que sugiere que la tratamiento de nanopartículas había promovido la expansión de los clonotipos patogénicos de baja avidez a expensas de sus contrapartes patogénicos de alta avidez (FIG. 5B). Estos efectos fueron dependientes de la dosis, ya que los ratones tratados con dosis más bajas estaban mucho menos protegidos de la diabetes (FIG. 5C) y tenían
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porcentajes menores de células T CD8+ tetrámero+ en los islotes y el bazo (FIG. 5D, y los datos no se muestran).
Además, los efectos de cada dosis parecieron ser acumulativos, porque los ratones que recibieron 10 dosis consecutivas de nanopartículas (dos/semana a partir de las 10 semanas de edad) tenían porcentajes significativamente más altos de células T CD8+ tetrámero+ circulantes que aquellos que recibieron sólo 4 dosis (también a partir de las 10 semanas de edad; FIG. 5E).
Los resultados anteriores sugirieron que las np revestidas de NRP-V7/K/Kd fueron reconocidas específicamente y captadas por las células T CD8+ reactivas con NRP-V7 (a través de su TCR). Para investigar esto, los inventores evaluaron la presencia de fluorescencia verde (unido a la molécula avidina del complejo de np péptido-MHC) en diferentes subpoblaciones de esplenocitos de ratones NOD que expresan un TCR reactivo con NRP-V7 transgénico, así como ratones NOD no transgénicos de tipo salvaje. Dentro de 24-40 horas de la inyección np NRP-V7/Kd, la fluorescencia verde solo se pudo detectar en el subconjunto de células T CD8+ de los ratones transgénicos TCR (FIG. 6A) y, en mucha menor medida, en el subconjunto de células T CD8+ T de ratones no transgénicos (FIG. 6B). No se pudo detectar acumulación fluorescencia verde detectable en los subconjuntos de células T CD4+, B, CD11b+, o CD11c+ esplénicas cualquier tipo de ratones (Figs. 6A y 6B).
Propiedades anti-diabetogénicos de las nanopartículas súper paramagnéticas revestidas con un complejo de péptido autoantigénico subdominante/MHC (DMK138-146/Db). Los inventores investigaron si los efectos protectores de la vía terapéutica anterior eran una peculiaridad de las células T CD8+ reactivas con NRP-V7 (un subconjunto de células T autorreactivas prevalentes en los ratones NOD), o un fenómeno aplicable a otras especificidades autoantigénicas, menos dominantes. Para este fin, los ratones se trataron con perlas revestidas con un péptido que se deriva de otro autoantígeno que es presentado por Db y está dirigido por una mezcla mucho menor de células T CD8+ autorreactivas diabetogénicas (residuos 138-146 de la distrofia miotónica quinasa; DMK ; denominado en la presente como "DMK138-146/Db) (Lieberman et al, 2004). Como fue el caso con nanopartículas revestidas con complejos NRP-V7/Kd, el tratamiento de ratones NOD con nanopartículas revestidas de DMK138-146/Db causaron expansiones significativas de células T CD8+ reactivas con DMK138-146/Db circulantes, esplénicas y del islote (FIG. 7A) y proporcionaron una protección de diabetes significativa (FIG. 7B). La expansión de células T in vivo fue específica de antígeno ya que las nanopartículas revestidas con DMK138-146/Db no expandieron las células T CD8+ reactivas con NRP-V7 (FIG. 7C) y las nanopartículas revestidas con NRP-V7/Kd no expandieron las células T reactivas con DMK138-146/Db (FIG. 7D). FIG. 7E muestra los perfiles de tinción FACS representativos.
El reclutamiento alterado de otras especificidades de células T CD8+ autorreactivas con IGRP en los islotes de los ratones tratados con nanopartículas revestidas con NRP-V7/KD- o DMK138-146/Db. A continuación, los inventores investigaron si el reclutamiento de las células T CD8+ reactivas con NRP-V7- y/or DMK138-146/Db de baja avidez expandida por nanopartícula altera el reclutamiento de otras especificidades de células T autorreactivas con células beta en los islotes, como fue el caso en los animales tratados con APL (Han et al. 2005). Esto se hizo mediante la comparación de la capacidad de respuesta de las células T CD8+ asociadas al islote de ratones tratados con nanopartículas control, revestidas con NRP-V7/Kd- o DMK138-146/Db en un panel de 76 epítopos diferentes así como DMK138-146. Como se esperaba, debido a que estos contenían frecuencias aumentadas de clonotipos reactivos con NRP-V7-o DMK138-146/Db, las células T CD8+ asociadas al islote de ratones tratados con nanopartículas revestidas con NRP-V7/Kd y DMK138-146/Db produjeron significativamente más IFN-γ en respuesta a NRP-V7 y DMK138-146, respectivamente, que los aislados de ratones control (FIG. 8). Notablemente, hubo reducciones significativas en el número de epítopos capaces estimular respuestas significativas de IFN-γ por las células T CD8+ asociadas al islote de ratones tratados con Nanopartículas revestidas con NRP-V7/Kd o DMK138146/Db, en comparación con los de los ratones tratados con nanopartículas de control, lo que sugiere alteración del reclutamiento y/o acumulación (Tabla 3).
Tabla 3. Reactividad de las células T CD8+ asociadas al islote en un panel de epítopos de IGRP en ratones tratados con nanopartículas de control o nanopartículas revestidas con monómeros de NRP-V7/Kd o DMK138-146/Db. Los ratones recibieron una inyección intravenosa de nanopartículas una vez cada 2-3 semanas, a partir de las 4 semanas de edad. Estas muestras son de los ratones al final del tratamiento (~32 semanas). Las células T CD8+ asociadas al islote se analizaron para determinar la producción de IFN-γ en respuesta a las células presentadoras de antígeno pulsado por péptido y se contó el número de respuestas positivas (>50 pg/ml) y negativas (<50 pg/ml)
Tratamiento Control
% Positivo 20 80 % Negativo # Positivo 138 # Negativo 546 N 9
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7 93 28 352 5
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5 95 15 289 4
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Las nanopartículas revestidas con NRP-V7/Kd o DMK138-146/Db inducen altas tasas de la remisión de diabetes ren ratones NOD recién diabéticos. La efectividad del tratamiento durante la etapa de pre-diabético impulsó la investigación sobre la capacidad de la terapia de nanopartículas para restaurar la normoglucemia en ratones diabéticos recién diagnosticados. Las cohortes de ratones se controlaron dos veces por semana para los niveles de glucosa en sangre y se consideraron hiperglucémico ≥ 10,5 mM de glucosa en sangre. Los ratones se aleatorizaron en los ratones que recibieron las nanopartículas revestidas con TUM/Kd o nanopartículas revestidas con NRP-V7/Kd (dos inyecciones semanales). La mitad de una unidad de insulina subcutánea también se administró una vez al día a ratones que muestran glucosuria, para reducir el estrés de las células beta y promover la regeneración de las células beta. Cohortes adicionales de ratones recibieron nanopartículas revestidas por DMK138-146/Db. El tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-CD3 (20 g /d durante 5 días), que se ha demostrado que induce la remisión estable en un porcentaje variable de animales en diferentes estudios, se utilizó como control positivo. Como se muestra en las Figs. 9A y 9B, 9 de 11 ratones tratados con partículas revestidas con NRP-V7/Kd se volvieron normoglucémicos dentro de 5 a 12 semanas de tratamiento. Los dos ratones que no se curaron fueron los únicos dos que recibieron la primera dosis de tratamiento cuando sus niveles de glucosa en sangre fueron> 18 mM/1, lo que sugiere que la efectividad puede requerir la presencia de una masa crítica de células beta residuales. Asimismo, 8 de 11 ratones tratados con nanopartículas revestidas con DMK138-146/Db se volvieron normoglucémicos (Figs. 9A y 9C), los otros tres presentan niveles oscilantes de glucosa en sangre que no alcanzaron 20 mM durante un período de tiempo extendido (FIG. 9C). En contraste, sólo 1 de 9 ratones que recibieron las nanopartículas revestidas con TUM/Kd de controlno progresaron a la hiperglucemia manifiesta (Figs. 9A y 9D). La FIG. 9E compara los niveles glucemia promedio en cada grupo de ratones después de cada inyección de nanopartículas. La FIG. 9F muestra los resultados del tratamiento con mAb anti-CD3, una estrategia inmunoterapéutica no específica de antígeno que ha demostrado previamente que también es capaz de restaurar la normoglucemia en ratones con diabetes aguda (grupo control positivo); 4 de 6 ratones se volvieron normoglucémicos. Cuando se toma en conjunto, estos resultados sugieren que la efectividad de una estrategia terapéutica de nanopartículas específica del antígeno es comparable a la de una estrategia no específica de antígeno que ha demostrado ser exitosa en ratones y, más recientemente, los pacientes diabéticos humanos (Keymeulen et al., 2005; Herold et al., 2002)..
Para investigar si los efectos del tratamiento en ratones diabéticos fueron de larga duración, como se ve en animales pre-diabéticos, el tratamiento se retiró después de 4 semanas consecutivas de normoglucemia y siguió a los ratones por la recurrencia de la diabetes. Los efectos del tratamiento sobre el tamaño de la mezcla tetrámero positivo circulante se evaluaron en el retiro del tratamiento, 4 semanas más tarde y en el momento de la hiperglucemia recurrente. Hubo una disminución en el tamaño de la mezcla de células T reactivas con el tetrámero circulante 4 semanas después del cese del tratamiento, como se esperaba (FIG. 10A), y, presumiblemente como resultado, ~3045% de los ratones diabéticos que habían sido curado desarrolló hiperglucemia recurrente entre 4 y 14 semanas después (Figs. 10B y 10C). Esto sugirió que la reactivación de la mezcla de células T autorreactivas de baja avidez expandida, ya sea por autoantígeno endógeno (es decir, en animales pre-diabéticos) o por inyecciones de refuerzo de las nanopartículas (es decir, en animales diabéticos con una masa de células beta severamente reducida) puede se necesaria para la protección a largo plazo. Se obtuvieron resultados similares en los ratones que habían sido tratados con nanopartículas revestidas con DMK138-146/Db (FIGS. 10A, 10B, y 10D).
Las pruebas de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTTs) en ratones no tratados diabéticos y no diabéticos curados confirmó que los primeros tenían curvas de tolerancia de glucosa casi idénticas a las mostradas por los animales no diabéticos no tratados y significativamente mejores que las correspondientes a ratones diabéticos (FIG. 11A). Además, los animales curados tenían niveles postprandiales de insulina en suero que fueron estadísticamente comparables a los observados en los ratones no tratados no diabéticos y significativamente más altos que los correspondientes a los animales diabéticos no tratados (FIG. 11B). De acuerdo con estos datos, los niveles séricos de insulina IPGTT de ratones tratados con NRP-V7/Kd-np y DMK138-146/Db-np eran similares a los de los ratones no diabéticos y significativamente mejor que los de los animales diabéticos no tratados (FIG. 11 C). Los animales curados tenían pesos corporales normales a las 50 semanas de edad (> 25 semanas después de la inversión de la hiperglucemia), en comparación con los de los ratones no tratados no diabéticos de la edad correspondiente (FIG. 11D).
Las nanopartículas revestidas con péptido/MHC puede ‘discriminar’ efectivamente entre las células T CD8+ autorreactivas de alta y baja avidez. La mayor parte de las células reactivas a IGRP206-214 emplean cadenas de Vα17-Jα42 de CDR3 invariantes pero cadenas de VDJβ heterogéneas. La 'maduración de la avidez' de este subconjunto de células T durante la diabetogénesis se asocia con los cambios en el uso de 3 elementos Vα17 diferentes. Se confirmó que estos 3 elementos proporcionan diferencias en la avidez de unión al ligando (Vα17.5>Vα17.4> Vα17.6) en los estudios de transfectantes de TCRαβ que expresan las 3 cadenas de Vα17-Jα42 de CDR3 invariante en el contexto de una cadena de TCRβ única (Han et al., 2005). Para investigar si las nanopartículas revestidas con péptido/MHC en efecto pueden dirigir en forma diferencial las células T que reconocen e ligando con diferente avidez, se evaluó la capacidad de las nanopartículas revestidas con NRP-V7/Kd de inducir “adición de capuchón' de las moléculas CD8 en estos transfectantes. Más de 60% de las células Vα17.5+, pero menos de 20% de las células Vα17.4+ o Vα17.6+,habían formado capuchones en 5 min de incubación con las perlas revestidas con NRPV7/Kd. El 30 minutos, el porcentaje de células Vα17.4 con capuchones se aproximó al que se observa para las células Vα17.5+, pero este número permaneció más bajo de 20% para las células Vα17.6+ (FIG. 12). Estos resultados demuestran que las perlas revestidas con NRP-V7/Kd en efecto pueden discriminar entre las
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células T de alta y baja avidez y proporcionar una explicación en cuanto a por qué estas nanopartículas suprimen en forma preferencial los clonotipos de alta avidez naive. Sin embargo, estos no explican por qué estas partículas expanden los clonotipos de baja avidez, en particular si se asume que también se puede esperar que el ligamiento del TCR en ausencia de coestimulación (por el péptido/MHC sobre las nanopartículas) reduzca, más que expanda los clonotipos de avidez baja.
Las células CD8+ que expresan el TCR Vα17.6/8.3β de afinidad baja son antidiabetogénicas. Para investigar su las células T CD8+ autorreactivas de avidez baja tienen propiedades antidiabetogénicas in vivo, el TCR Vα17.6/8.3β reactivo con IGRP206-214 de afinidad baja se expresaron en forma transgénica en los ratones NOD (denominados en la presente como `Vα17.6+'; que tiene ~10 veces menor afinidad que el 8.3-TCR (Vα17.4+); Teyton y Santamaria, datos no publicados). Se ha demostrado que este TCR promueve la selección positiva de las células CD8+, pero claramente menos que el 8.3-TCR (Vα17.4+) (Han et al., 2005). Como resultado, los ratones Vα17.6+ TCR-TG contienen menos timocitos y esplenocitos CD8+ reactivos con el tetrámero CDNRP-V7 que los ratones Vα17.4+ TCR-TG. Además, las células CD8+ tetrámeros+ (alta y baja) de los ratones Vα17.6+ TCR-TG secretan menos IFNγ (y IL-2) que los derivados de los ratones Vα17.4+ TCR-TG después de la estimulación con el péptido in vitro, y son destructores ineficientes de los blancos de RMA-SKd pulsados con NRP-V7, compatible con su baja avidez para el ligando (Han et al., 2005; y datos no mostrados). De modo más importante, estos ratones están casi totalmente protegidos de la diabetes (solo 2 de 70 hembras han desarrollado T1D) e insulitis [puntuaciones de <0,4 versus >3 (de un máximo de 4) en los ratones Vα17.6+ versus Vα17.4+ TCR-TG, respectivamente (P<0,012)] (FIG. 13A y FIG. 13B).
Esto está en marcado contraste con lo que ocurre en los ratones NOD que expresa un TCR no autorreactivo irrelevante que reconoce un epítopo LCMV (ratones NOD LCMV TCR-TG). Como se informó anteriormente por Serreze et al. (2001), y confirmó mediante el uso en la presente, estos ratones desarrollan TiD esencialmente como los ratones NOD de tipo salvaje y reclutan células CD8+ reactivas a IGRP206-214 endógenas en los islotes (totalmente ausente en los islotes de ratones Vα17.6+ TCR-TG) (FIG. 13C). Por lo tanto, a diferencia de los TCR Vα17.4+ y LCMV (pro-diabetogénico y neutral, respectivamente), el TCR Vα17.6+ parece tener propiedades antidiabetogénicas.
No obstante el hecho de que la mayoría de las células T TG de estos ratones Vα17.6+ TCR-TG se unen tetrámeros débilmente o en absoluto, una fracción de las células que salen del timo se une al tetrámero con alta avidez aparente (es decir, con un alto mfi) (FIG. 14A). Los inventores sospechan que las células T CD8+ tetrámero-bajo (lo y tetrámero-negativo de estos ratones se originan de timocitos CD4+CD8+ que expresan el TCR TG pero se someten a selección positiva en los TCR endógenos (es decir, cadenas TCRα). Las células tetrámero hi, por otro lado, se pueden originar de los timocitos CD4+ CD8+ que sólo expresan las cadenas TCRαβ TG y, debido a su baja afinidad por el péptido/MHC, sólo puede someterse a la selección positiva si expresan niveles más altos del TCR TG que el normal. Esta interpretación se apoya en la observación de que, en ratones que expresan el Vα17.6+ TCR en un fondo RAG-24, las únicas células que maduran son aquellos que unen el tetrámero con alta avidez (FIG. 14B). Es importante destacar que estos dos tipos de ratones RAG-2-/- TCR-TG desarrollan diabetes con una incidencia similar (FIG. 15). Por lo tanto, los inventores sospechan que las células T CD8+ tetrámero-lo y tetrámero que maduran en ratones RAG-2 Vα17.6 TCR-TG inhiben el potencial diabetogénico de sus contrapartes de tetrámero hi (que causan la diabetes en ratones RAG-/- TCR-TG). Estos resultados se reprodujeron en las poblaciones de ratones Vα17.6 TCR-TG que llevan una deficiencia endógena TCR-Cα que impide la expresión de las cadenas TCRCα endógenas (es decir, no transgénico) (Figs. 16A y 16B).
Los ratones Vα17.6+ (pero no Vα17.4+) TCR-TG generan espontáneamente una mezcla de células CD8+ de memoria con actividades inmunosupresoras. Los estudios citofluorométrico de las células T CD8+ tetrámeropositivas contenidas en los diferentes órganos linfoides de ratones Vα17.6+ TCR-TG y ratones Vα17.6 TCR-TG deficientes en TCR-Cα revelaron la presencia de mezclas ampliadas de células CD8+ CD44hi y CD44hiCD122+en comparación con los ratones Vα17.4+ TCR-TG en el bazo, los ganglios linfáticos y, especialmente, la médula ósea, un reservorio conocido de células T de memoria (Figs. 17A y 17B). Es importante destacar que esto ocurre principalmente dentro del el subconjunto de tetrámero-bajo, pero no en el de tetrámero alto, que no contiene células CD 122+ (FIG. 17C). Estas células expresan marcadores descritos en ambos linfocitos de memoria centrales y efectores (FIG. 17D), están y se hallan predominantemente en los órganos linfoides periféricos, pero no timo, lo que sugiere un origen periférico (FIG. 17E). Además, los ensayos de incorporación de BrdU sugirieron que proliferan in vivo (FIG. 17F).
(FIG. 17F). Funcionalmente, estas células tipo memoria se comportan claramente como las células T de `memoria`, ya que las células CD8+ Vα17.6+ (pero no Vα17.4+) TCR-TG esplénicas purificadas proliferan vigorosamente en respuesta a IL-2 o IL-15 en la ausencia de APC yl antígeno (FIG. 17G). Además, producen rápidamente IFN-gamma después de la estimulación con antígeno in vitro (Figs. 17H y 171). Sin embargo, estas no proliferan ni producen interleuquina 2 después de la estimulación antigénica in vitro (FIG. 17J). Este perfil funcional recuerda mucho al de subconjunto de células regulador T CD4+ CD25+ regulador (supresor). En conjunto, estos datos sugieren que las células CD8+ Vα17.6+ (pero no Vα17.4+) TCR-TG tienen una mayor capacidad de convertirse en células T de memoria de larga vida (después de uno o más encuentros con el antígeno), presumiblemente capaz de-sobrevivir indefinidamente en respuesta a señales homeostática, incluso en ausencia del antígeno.
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Estas observaciones llevaron a los inventores a sospechar que la `aptitud’ homeostática superior de estas células T de memoria de baja avidez, de otro incapaces de matar las células beta, contribuye a su actividad anti-diabetogénico (es decir, al proporcionar una ventaja competitiva respecto de sus clonotipos destructores de células beta de mayor avidez, pero principalmente naive y/o mediante la inhibición de su activación). Para evaluar este último, se evaluó la capacidad de las células T CD8+ CD122+ y CD122-Vα17.6+ TCR-TG por su capacidad de inhibir la proliferación de células T CD8+ esplénicas marcadas con CFSE de los ratones NOD Vα17.4+ TCR-TG. Como se muestra en la FIG. 18, las células T CD8+ CD122+ (pero no CD122-) Vα17.6+ TCR-TG inhibieron casi completamente la proliferación de sus contrapartes de células T naive de avidez mayor.
En consonancia con la idea de que la mezcla expandida de forma espontánea de células T CD8+ autorreactivas de avidez baja de memoria (CD122+) en ratones Vα17.6+ TCR-TG es anti-diabetogénica, el tratamiento sistémico (iv) de los ratones Vα17.6+ y Vα17.4+ TCR-TG con DC pulsado con NRPV7, un mAb agonista contra CD40, o un mAb agonista contra el 4-1BB (para aumentar la activación/sobrevida de las células T CD8+), indujo el inicio rápido de la diabetes en ratones NOD Vα17.4+ G Voc17.4+ TCR-TG, pero fueron incapaces de provocar la enfermedad en ratones Vα17.6+ TCR-TG (Tabla 4).
Tabla 4. Los tratamientos que promueven el desarrollo y la expansión de las células T de memoria precipitan el inicio agudo de la diabetes en ratones NOD 17,4α/8.3b-TG, pero no en los ratones NOD 17.6a/8.3b-TG.
Tratamiento
Huésped Incidencia de diabetes Inicio de diabetes Día (s.e.)
mAb anti-CD40 agonista
17.4 NOD 17.6 NOD 4/4 0/3 10,5 (4,6) -
mAb anti-4-1BB agonista
17.4 NOD 17.6 NOD 3/3 0/2 2,3 (1,5) --
Pulsado con NRP-V7
17.4 NOD N.A. --
Células dendríticas
17.6 NOD 0/3 -
3 inyecciones de mAb anti-CD40 o mAb anti-4-1BB 100 g i.p. con intervalos de 3-4 días
2 inyecciones de 106 DC derivadas de médula ósea activadas con LPS pulsadas con 100 g/ml de NRP-V7
Los ratones fueron seguidos para la diabetes por lo menos 8 semanas después de la última inyección
La capacidad de las células T CD8+ CD122+ Vα17.6+ TCR-TG para suprimir las respuestas de células T diabetogénicas cognadas y no cognadas (es decir, dirigidas contra péptidos autoantigénicos diferentes que el péptido autoantigénico blanco de estas células T- IGRP206-214 supresoras llevó a la inventores a sospechar que estas podrían efectuar su actividad supresora dirigiéndose a las células presentadoras de antígeno (APC). Los ensayos de citotoxicidad (liberación de 51Cromo) que emplean DC pulsadas con péptido como células blanco y células T CD8+ CD122+ o CD122-Vα17.6+ y CD122- Vα17.4+ TCR-TG como efectores indicaron que el primero, pero no el último fueron capaces de lisar específicamente DC pulsadas con NRP-V7 in vitro (FIG. 19A). Los inventores confirmaron que esto también es válido in vivo. Se transfundieron números iguales de células B pulsadas con NRP-V7 y TUM (marcados con concentraciones bajas y altas del colorante CFSE, respectivamente) en ratones Vα17.6+ TCR-TG y Vα17.4+ TCR-TG y un día más tarde se sacrificaron los huéspedes para investigar que células habían sobrevivido la transferencia. Como se muestra en la figura. 19B, mientras que las células B pulsadas con NRP-V7 solo sobrevivieron en los ratones Vα17.4+ TCR-TG, las células B pulsadas con el péptido control negativo TUM sobrevivió en ambas cepas TCR-TG. Prácticamente se obtuvieron resultados idénticos cuando se usaron DASM en lugar de las células B, como APC (FIG. 19B). Estos datos sugieren que las células T CD8+ CD1221 Vα17.6+ TCR-TG de baja avidez suprimieron las respuestas de células T diabetogénicas cognadas y no cognadas mediante APC cargadas con autoantígeno.
Las nanopartículas revestidas con NRP-V7/Kd inducen la expansión de las células CD8+ autorreactivas de memoria de avidez baja (intermedio tetrámero) en ratones NOD tipo salvaje. Las observaciones anteriores en ratones NOD Vα17.6+ TCR-TG fueron que recuerda mucho a lo que se observó en los ratones NOD tratados con nanopartículas revestidas con péptido/MHC: desaparición de clonotipos de alta avidez y la expansión y el reclutamiento de las células T CD8+ de baja avidez, reclutamiento alterado de otras especificidades reactivas con el epítopo de IGRP en los islotes, y la protección contra la diabetes.
Para evaluar si las células T CD8+ expandidas en perlas en ratones NOD de tipo salvaje eran células T memoria de
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baja avidez de larga vida, los inventores analizaron la presencia de marcadores de memoria (CD44 y CD122) en las células T CD8+ positivas para el tetrámero NRP-V7/Kd contenidas en el bazo y la médula ósea de los ratones tratados con nanopartículas revestidas con NRP-V7/Kd. Las poblaciones expandidas de células de tetrámero positivo contenidas en el bazo y la médula ósea de estos ratones contenían aumento de porcentajes de células T CD8+ CD44hi y CD44hiCD122+, particularmente en la médula ósea (FIG. 20A), lo que confirma el tratamiento con nanopartículas NRP-V7/Kd aumenta el tamaño de las mezclas de células T tetrámero+ CD44hi y tetrámero+ CD44hiCD122+.
Funcionalmente, las células T tipo memoria que se expanden por la terapia in vivo con nanopartículas revestidas con NRP-V7/Kd se comportan como las células T CD8+ CD122+ Vα17.6± TCR-TG de memoria que se acumulan de forma espontánea en ratones Vα17.6+ TCR-TG: estas no producen IL-2 ni proliferan, sin embargo, producen altos niveles de IFN-gamma en respuesta a la estimulación antigénica in vitro (figura 20B.). De modo más importante, después de la activación con el mAb anti-CD3 y la IL-2, estas células T tipo memoria suprimieron de manera eficiente la proliferación de células T CD8+ Vα17.4+ TCR-TG respondedoras marcadas con CFSE in vitro (FIG. 20C). La supresión no era simplemente debido a la competencia por el péptido, debido a que las células T CD8+ Vα17.4+ TCR-TG respondedoras marcadas con CFSE tampoco proliferaron en presencia de las células T tipo memoria expandidas por el tratamiento con nanopartículas revestidas con DMK138-146/Db (FIG. 20D).
Las nanopartículas revestidas con péptido/MHC expanden las células T de memoria preexistentes de baja avidez. Varias observaciones sugieren que las nanopartículas revestidas con péptido/MHC no generan células T de memoria de novo, sino que más bien expanden las mezclas preexistentes de células T de memoria: (i) tratamiento de ratones NOD con nanopartículas revestidas con TUM/Kd no indujeron la expansión sistémica de células T CD8+ reactivas con TUM (que reconocen un antígeno específico de tumor, no expresado en los ratones NOD; FIG. 21A);
(ii) El tratamiento de ratones B10.H2g7, que no desarrollan ni diabetes ni insulitis, con nanopartículas revestidas con NRP-V7/Kd no indujo una expansión significativa del subconjunto de células T CD8+ tetrámero NRP-V7/Kd+ en todos los órganos linfoides examinados (FIG. 21B); (iii) la expansión sistémica de células T CD8+ reactivas con el tetrámero en ratones NOD tratados con nanopartículas fue significativamente más efectiva cuando comenzó en el inicio de la diabetes que en la etapa pre-diabética (FIG 21C.); y (iv) a diferencia de las células T CD8+ naive, que tienden a experimentar apoptosis después del ligamiento con TCR en ausencia de coestimulación, las células T CD8+ memoria de son independientes de la coestimulación para el crecimineto.
Para investigar la hipótesis anterior formalmente, los inventores se preguntaron si las nanopartículas revestidas con IGRP206-214/Kd podrían expandir las células T CD8+ reactivas con IGRP206-214/Kd en una cepa NOD dirigida por un gen que expresa una forma mutante de IGRP en el que los dos residuos de contacto de TCR de IGRP206-214 han sido reemplazados con alaninas (K209a y F213A) (FIG.22A). Los alelos específicos (denominados en la presente Flex1 o NOD.IGRPK2o9A/F213AKI/KI) se sometieron a retrocruza en el ancestro NOD (de 129) utilizando el enfoque de velocidad congénica, para garantizar la homocigosidad para alelos NOD en todos los loci Idd. Debido a que las células T CD8+ que maduran en estos ratones con genes dirigidos nunca están expuestos a IGRP206-214 in vivo, estos ratones no pueden generar espontáneamente células T CD8+ de memoria reactivas a IGRP206214/Kd. A pesar de que estos ratones desarrollan la diabetes y la insulitis (no mostrado), sus células T CD8+ asociadas al islote reconocen epítopos en IGRP, pero están completamente desprovistas de clonotipos CD8+ reactivos a IGRP206-214. De modo más importante, los ratones NOD homocigotas para Flex1 tratados con dosis óptimas de partículas revestidas con IGRP206-214/Kd no contenían mezclas expandidas de células T CD8+ reactivas con IGRP206-214/Kd en sus órganos linfoides (FIG. 22B). Estos datos proporcionan una prueba formal de que las nanopartículas revestidas con péptido/MHC expanden las mezclas preexistentes de células T de memoria con propiedades supresoras y no pueden generar células T de memoria de novo.
Debido a que los clonotipos de baja avidez (es decir, en ratones Vα17.6+ TCR-TG) parecen ser más eficientes en la generación de la progenie de células T de memoria que sus contrapartes de alta avidez (es decir, en ratones Vα17.4+ TCR-TG) durante la diabetogénesis, se concluyó que las partículas revestidas con péptido/MHC actúan mediante la inducción de la supresión de los clonotipos de alta avidez naive y la expansión de las pequeñas mezclas clonotipos de memoria preexistentes de avidez baja.
EJEMPLO 2
PRUEBA DE LA CAPACIDAD DE LAS NANOPARTÍCULAS DE ÓXIDO DE HIERRO REVESTIDAS CON COMPLEJOS DE PÉPTIDO/HLA RELEVANTES PARA LA DIABETES TIPO 1 HUMANA PARA RESTAURAR LA NORMOGLUCEMIA
Ratones "humanizados" que expresan transgenes HLA y complejos de péptido/HLA disponibles para los estudios propuestos. Como se mencionó anteriormente, los péptidos derivados de la insulina e IGRP son objetivos principales de de las células T CD8+ en los ratones NOD de tipo salvaje. La evaluación de las moléculas de MHC humanas (antígenos leucocitarios humanos (HLA), presentó péptidos derivados de estos dos autoantígenos durante la diabetogénesis está siendo investigada en ratones NOD- transgénicos HLA ‘humanizados’'. Los estudios se centraron inicialmente en HLAA*0201, una molécula MHC que se expresa en casi un 50% de ciertos grupos étnicos. Este estudio emplea la cepa designada NOD.β2nulo.HHD, que carece del gen de macroglobulina β2 murino y
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expresa el constructo quimérico monocatenario HHD (Pascolo et al., 1997). Este constructo codifica β2m humana unida covalentemente a los dominios α1 y α2 de HLA-A*0201 humana, y los dominios α3, de transmembrana, y citoplasmáticos de H-2Db murino. Aunque la cepa expresa solo las moléculas de HLA-A*0201, y no la MHC de clase I murina endógena es susceptible a la diabetes, con un 55% de hembras de 30 semanas de edad (Takaki et al., 2006). Dos epítopos de IGRP humana (hIGRP228-236 y hIGRP265-273) que se unen a HLA-A*0201 son reconocidos por las células T CD8+ asociadas al islote de estos ratones y las células T CD8+ aisladas de los islotes de ratones NOD.β2nulo.HHD son citotóxicos para los islotes positivos para HLA-A*0201 humano (Takaki et al, 2006). Los tetrámeros de péptido/HLA-A*0201 se obtuvieron usando uno de estos péptidos. Para facilitar la unión de estos tetrámeros por las moléculas de CD8 murino, el dominio α3 (unión a CD8) ddel complejo HLA-A*0201 fue reemplazado con el de la molécula H-2Kb murino. Los resultados de estos estudios han establecido la utilidad de estos ratones para la identificación de células T restringidas en HLA-A*0201 y autoantígenos de células beta de potencial relevancia para T1D humana (Takaki et al., 2006). Sobre la base de la divulgación actual, se pueden identificar los péptidos humanos que están dirigidos por las células T restringidas en HLA-A*0201 de pacientes T1D. Además, el inventores han generado ratones NOD que expresan HLA-A*1101, HLA-B*0702, o HLA-Cw*0304. Estos ratones también tienen murino β2m sustituido por β2m humana mediante el cruzamiento con la cepa NOD.β2nulo.h β2m (Hamilton-Williams et al., 2001). Los tres transgenes de HLA se expresan bien, y los tres de las cepas transgénicas HLA son susceptibles a la diabetes. Tomados en conjunto los HLA de estos animales "humanizados" son representativos de los cuatro diferentes supertipos de HLA HLA-A2, HLA-A3, HLA-B7, y HLA-C1, respectivamente (Sidney et al., 1996; Doytchinova et al, 2004).. Las frecuencias génicas de los alelos HLA-A*1101, HLA-B*0702, o HLA-Cw*0304 pueden ser tan altas como 23%, 11%, o 10%, respectivamente, en función del grupo étnico examinados (Cao et al., 2001). La cobertura de la población puede ser más del 90%, de acuerdo con el g rupo étnico considerado, cuando se dirigen los cuatro supertipos (Sidney et al., 1996; Doytchinova et al., 2004; Cao et al., 2001). Esta consideración es importante en lo que se refiere a la traducción de estos estudios a los seres humanos. Estos animales, así como la cepa de NOD descrita anteriormente NOD.β2nulo.HHD están disponibles para estudios posteriores.
En este ejemplo los inventores proponen un diseño para trasladar estas observaciones en ratones NOD de tipo salvaje a ratones NOD transgénicos HLA 'humanizados'. El objetivo es investigar si el tratamiento con nanopartículas revestidas con varios complejos de péptido/HLA diferentes que se dirigen a mezclas de células T CD8+ autorreactivas relevantes para T1D humana puede proteger a los ratones de la diabetes, así como restaurar la normoglucemia en sus contrapartes recién diagnosticados. Los inventores han demostrado que el tratamiento repetido de los ratones NOD con pequeñas dosis de nanopartículas revestidas con moléculas de H-2Kd o H-2Db que presentan epítopos dirigidos por especificidades de células T CD8+ autorreactivoas prevalentes y no prevalentes, respectivamente, indujo la expansión específica de péptido de las células T CD8+ de memoria autorreactivas de baja avidez que eran capaces de prevenir el desarrollo de T1D en ratones NOD de tipo salvaje y de restaurar la normoglucemia en ratones NOD diabéticos recién diagnosticados. Aquí los inventores presentan un enfoque traslacional para identificar combinaciones de péptido/HLA relevante para T1D para usar en la T1D humana. Específicamente, los inventores contemplan que las nanopartículas revestidas con diferentes complejos de péptido autoantigénico relevante para T1D /HLA-A*0201 proporcionarán protección y cura de la T1D en ratones NOD.β2nulo.HHD (que expresan HLA-A*0201).
Los expertos en la técnica pueden usar esta descripción para emplear con otros epítopos relacionados con otras enfermedades autoinmunes, utilizando composiciones y procedimientos similares a los usados con insulina y/o epítopos de IGRP presentados por otras moléculas de HLA en ratones transgénicos HLA 'humanizados' a las células T CD8+ asociadas al islote, para incluir otras composiciones y métodos. Un experto será capaz de identificar las condiciones de tratamiento mínimas y el tipo de complejos de péptido/HLA que proporcionarán beneficios terapéuticos máximos, así como el requerimiento de la existencia pre-terapéutica de células T CD8+ de memoria de avidez baja para el éxito terapéutico y la identificación de combinaciones de péptido/HLA adicionales que abarcan tantos individuos de diferentes grupos étnicos como sea posible.
Síntesis de nanopartículas. Las nanopartículas se sintetizan y caracterizan en los niveles físicos y químicos esencialmente como se describió anteriormente (Moore et al., 2004), pero utilizando monómeros de péptido/HLAA*0201 biotinilados. La molécula de MHC del complejo se compone de microglobulina β2 humana y una forma quimérica de LA-A*0201 humano H en la que los dominios α1 y α2 se fusionan con el dominio α3 de H-2Kb murino (para facilitar el reconocimiento por la molécula de CD8 murina). Como péptidos autoantigénicos, se usan varios derivados diferentes de insulina e IGRP (tales como, por ejemplo, hInsB10-18, hIGRP228-236 y hIGRP265-273) que se han demostrado que son reconocidos por las células T CD8+ asociadas al islote en el contexto de HLA¬A*0201. Los monómeros de péptido/HLA-A*0201 biotinilados se añaden en una relación molar de 4 moles de biotina por mol de avidina. Las proteínas biotiniladas se añaden en múltiples porciones (aproximadamente 0,4 moles de biotina por avidina) durante un período de 24 horas a 4 ° C con agitación lenta (10 rpm). Las sondas resultantes se purificaron en una columna de separación magnética (Milteny Biotec). Un monómero constituido por un péptido de unión a HLAA*0201 no relacionado complejado con moléculas de HLA-A*0201 se utiliza para la síntesis de la sonda de control negativo. Se miden el tamaño de las nanopartículas, capacidad de relajación (cambio en la velocidad de relajación por mM), el número de sitios de unión de biotina, y el contenido de hierro y proteína.
Administración de nanopartículas. Cohortes de 10-15 ratones hembra NOD.β2nulo.HHD se tratan con nanopartículas revestidas con cada uno de los diferentes complejos de péptido/HLA mencionados anteriormente o
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un control negativo del complejo de péptido (gripe)/HLA (0,01, 0,05, 0,1, 0,5 y 1 g de equivalentes de péptido, una dosis cada 3 semanas de 4 a 30 semanas de edad, o dos dosis/semana a partir de las 10 semanas de edad durante 5 semanas consecutivas). La expansión periférica de las células T CD8+ específicas de antígeno están documentados por la tinción de células mononucleares de sangre con mAb anti-CD8 y tetrámeros de péptidos/MHC (antes del inicio del tratamiento y en la retirada del tratamiento). Los ratones se sacrificaron en el inicio de la hiperglucemia o al final del estudio. Los ratones individuales se estudiaron mediante citometría de flujo multicolor para detectar la presencia de células T CD8+ tetrámero+ de memoria centrales y/o efectoras (CD69-, CD44hi, CD62Lhi o CD62L lo, CD122+, Ly6C+) tetrámero+ T CD8+ en diferentes órganos linfoides (bazo, ganglios linfáticos), médula ósea (un reservorio conocido de células T de memoria), hígado, pulmón e islotes. Se mide la avidez de unión del tetrámero como se ha descrito (Han et al, 2005;.. Amrani et al, 2000). Los inventores contemplan que el tratamiento induce la expansión sistémica de las células T CD8+ tetrámero+ de memoria centrales y/o efectoras de baja avidez y la acumulación preferencial (pero no exclusiva) de estas células T en la médula ósea, ganglios linfáticos pancreáticos (PLNs) e islotes.
Administración de dosis múltiples del complejo de péptido/MHC. En otro estudio, las cohortes de ratones se tratan con uno, dos, tres o cuatro inyecciones de una dosis efectiva, que los inventores contemplan que sea similar para todos los complejos que exhiben eficacia terapéutica en otros estudios (a las 4, 7, 10 y 13 sem). Se espera que la protección requiera una o más de una dosis (para expandir la mezcla de células T de memoria de avidez baja por encima del umbral de protección) y que población de células T CD8+ de memoria tetrámero+ expandida desaparece progresivamente de la circulación para acumularse en la médula ósea, PLNs e islotes.
Administración de complejos de péptido/MHC en el inicio de la hiperglucemia. Los ratones se tratan en el inicio de la hiperglucemia (> 10,5 mM/1) con un protocolo de tratamiento más agresivo de nanopartículas (1-5 g de equivalentes peptídicos dos veces a la semana durante 5 semanas). Los controles negativos y positivos recibirán nanopartículas revestidas con un complejo de péptido irrelevante/HLA o mAb anti-CD3 (una inyección iv diaria de 20 g durante 5 días (Haller, 2005)), respectivamente. Los ratones se sangraron inmediatamente antes de la iniciación del tratamiento para evaluar los porcentajes basales de las células T CD8+ tetrámero positivo en la circulación. La reversión de la T1D se considerará cuando los valores de glucosa en sangre se estabilizan a <10 mm/1 durante al menos 4 semanas, momento en el cual se retirará el tratamiento. Los ratones se sangraron de nuevo para confirmar la presencia de mezclas de las células T CD8+ tetrámero positivo circulantes expandidas significativamente. Los animales son seguidos durante al menos unas 8-12 semanas adicionales para asegurar la remisión estable. Los ratones se sacrifican al final del período de observación para establecer la persistencia a largo plazo de las mezclas de células T CD8+ tetrámero positivo de memoria expandidas en diferentes órganos linfoides y no linfoides. El tejido pancreático también se recogerá para su análisis histológico. Se espera que la remisión a largo plazo esté asociada con la presencia de numerosos pequeños islotes desprovistos de infiltración de células mononucleares. Es decir, a diferencia de la situación en los ratones pre-diabéticos donde se espera que el tratamiento promueva la ocupación de los islotes inflamados por las células T de memoria `protectoras, se predice que los tratamientos en ratones diabéticos promuevan la acumulación de las células T de memoria protectoras en los ganglios linfáticos pancreáticos (además de otros reservorios de células T de memoria), pero no en los islotes (presumiblemente islotes recién nacidos que carecen de potencial inflamatorio).
Las partículas revestidas de péptido/HLA actúan mediante la inducción de la supresión de clonotipos naive de avidez alta. Los inventores contemplan que las células T CD8+ autorreactivas de avidez baja tienden a acumularse como células de memoria durante la progresión de la T1D (en pequeñas cantidades) y que las partículas revestidas de péptidos/HLA actúan mediante la inducción de la supresión de los clonotipos naive de avidez alta (debido a la activación de TCR sin coestimulación) y la expansión de las pequeñas mezclas de clonotipos de avidez baja de memoria preexistentes (independiente de la coestimulación-). En parte, esto se deduce de la observación de que el tratamiento de ratones con un complejo de péptido irrelevante (de una antigénico tumoral, (TUM/H-2Kd) no indujo la expansión periférica de células T CD8+ reactivas al tetrámero TUM/Kd por encima del fondo (véase más arriba). Estas células CD8+ autorreactivas de memoria de avidez baja entonces inhiben la activación de sus contrapartes naive de avidez alta (presumiblemente menos ajustada) al competir por los recursos estimulantes (es decir, antígeno/MHC en las DC, citoquinas, etc.). En efecto, hay evidencia en otros sistemas que las células de memoria pueden competir efectivamente con las células T naive por las señales homeostáticos (es decir, IL-15) (Tan et al., 2002). Al hacer contactos estables con las DC cargadas de autoantígenos en los PLNs, estos clonotipos de memoria de avidez baja prevalentes también pueden inhibir la activación de otras especificidades de células T autorreactivas.
Manifestación de la expansión de las células T (y actividad anti-diabetogénica) de las nanopartículas revestidas con el péptido/HLA requiere la expresión de autoantígeno blanco endógeno en las células beta. La expresión de autoantígenos blanco endógenos se considera que es la fuente del estímulo que induce la formación de mezclas de células CD8+ autorreactivas de memoria de avidez baja que posteriormente se expandieron con el tratamiento de nanopartículas. Una deficiencia de IGRP se introducirá en ratones NOD.β2mnulo.HHD. Estos ratones se tratan con nanopartículas revestidas con hIGRP228-236 (reacción cruzada con mIGRP228-236) y hIGRP265-273 (idéntico al mIGRP mIGRP265-273)/HLA-A*0201 (Takaki et al., 2006). Dos clones ES que llevan un alelo IGRP condicional están disponibles para los inventores y actualmente están experimentando la eliminación de un casete de neomicina por transfección transitoria de Cre, antes de generar quimeras competentes de la línea germinal. Los alelos específicos se someterán a retrocruza con los ratones NOD.β2mnulo.HHD (de la cepa 129) utilizando el enfoque de
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velocidad congénica, para garantizar la homocigosidad para los alelos NOD en todos los loci Idd. Los ratones NOD.β2mnulo.IGRPnulo.HHD resultantes se tratan con dosis óptimas de nanopartículas revestidas con los dos complejos de IGRP/HLA. Los inventores contemplan que el tratamiento no inducirá la expansión/reclutamiento de las correspondientes células CD8+ reactivas para péptido hIGRP/HLA.
Si la expresión de IGRP es prescindible para el desarrollo de la diabetes (se sabe que la falta de expresión IGRP no es letal, ya que las ratas no lo expresan) y los ratones desarrollan espontáneamente la diabetes, también se predice que el tratamiento de nanopartículas no protegerá los ratones contra la T1D (no habrá células T CD8+ de memoria reactivas con IGRP). En contraste, el tratamiento con partículas revestidas con complejos de HLA-A*0201 y epítopos de insulina inducirá la expansión de las correspondientes mezclas de células T de memoria y serán protectoras, ya que los ratones continuarán expresando la insulina.
Es posible que los tipos de nanopartículas para analizar en la presente no inducirán expansiones de células T significativas en todos los ratones. Esto probablemente dependerá de si la población de células T correspondiente ha experimentado previamente la activación in vivo antes de la iniciación del tratamiento. Puede ser útil/necesario estudiar cohortes adicionales de ratones tratados con combinaciones de varios tipos de nanopartículas diferentes. Obviamente, es concebible que, contrariamente a nuestra predicción, el tratamiento de nanopartículas podría ser capaz de inducir la formación de novo de mezclas de células T de memoria de avidez baja. En este caso, sin embargo, los inventores contemplan que estas células no serán protectoras debido a que no serán capaces de participar en los complejos de IGRP/HLA-A*0201 endógenos en las DC en los ratones NOD.β2mnulo.IGRPnulo.HHD tratados.
Ratones que expresan hIGRP. Los inventores han generado varias líneas de ratones que expresan un transgén de IGRP humano dirigido por promotor de insulina de rata y han comparado los niveles de expresión del transgén humano en cada una de estas líneas con las del locus que codifica mIGRP endógeno por RT-PCR de tiempo real. Aunque los niveles de expresión del transgén fueron muy variables de línea a línea, los niveles de expresión fueron consistentes entre los diferentes individuos dentro de las líneas individuales. En una de estas líneas (# 1114) los niveles de expresión de hIGRP eran equivalentes a los de mIGRP.
Los inventores introducirán este transgén RIP-hIGRP en ratones NOD.β2mnulo.IGRPnulo.HHD y hβ2m/HLAA*1101, HLA-B*0702, o NOD.β2mnulo.IGRPnulo transgénico HLACw*0304 para identificar epítopos adicionales en hIGRP que son blancos de las respuestas de células T CD8+ en el contexto de estos cuatro alelos HLA diferentes. Las células T CD8+ asociadas al islote de estos ratones se analizarán para determinar la reactividad frente a la bibliotecas de HLA-A*0201, HLA-A*1101, HLA-B*0702 y los péptidos de hIGRP de unión a HLA-Cw*0304.
00195] Las correspondientes nanopartículas revestidas con el complejo de péptido/HLA posteriormente se analizarán para determinar la eficacia anti-diabetogénica, en los correspondientes ratones hβ2m/HLA-A*1101, HLAB*0702, o NOD.β2mnulo.IGRPnulo transgénico HLACw*0304. El objetivo general de este ejercicio es expandir el repertorio de combinaciones péptido/HLA que podrían ser utilizadas para tratar el mayor número de pacientes posible.
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Referencias Patente de Estados Unidos 4.367.110 Patente de Estados Unidos 4.452.901 Patente de Estados Unidos 4.554.101 Patente de Estados Unidos 4.589.330 Patente de Estados Unidos 4.818.542 Patente de Estados Unidos 6.103.379 Patente de Estados Unidos 6.387.498 Patente de Estados Unidos 6.651.655 Patente de Estados Unidos 6.712.997 Publicación 20050202032 Aichele et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:444-448, 1994. Amrani et al., J. Immunology, 167:655-666, 2001. Amrani et al., Nature, 406:739-742, 2000. Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:9311-9316, 1999. Anderton and Wraith, Eur. J. Immunol., 28:1251-1261, 1998. Arden et al., Diabetes, 48:531-539, 1999. Atkinson and Maclaren, N. Engl. J. Med., 331:1428-1436, 1994. Atkinson and Maclaren, Sci. Am., 7:62-67, 1990. Banga, In: Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems, Technomic Pub. Co.,
Inc., Lancaster, Pa., 1995. Barany and Merrifield, In: The Peptides, Gross and Meienhofer (Eds.), Academic Press, NY, 1-284, 1979. Bielekova et al., Nat. Med., 6:1167-1175, 2000. Bottazzo et aL, N. Engl. J. Med., 313:353-360, 1985. Brinker and Scherer, In: Sol-gel Science, Academic Press, 1990. Burke et al.„ J. Inf. Dis., 170:1110-1119, 1994. Cao et al., Hum. Immunol., 62:1009, 2001. Caruso et al., Macromolecules, 32(7):2317-2328, 1999. Caruso, J. Amer. Chem. Soc., 121(25):6039-6046, 1999. Castano and Eisenbarth, Annu Rev. Immunol., 8:647-679, 1990. Chentoufi and Polychronakos, Diabetes, 51:1383, 2002. Chou and Fasman, Adv. Enzymol., 47:45-148, 1978a. Chou and Fasman, Annu. Rev. Biochem., 47:251-276, 1978b. Chou and Fasman, Biochemistry, 13(2):211-222, 1974a. Chou and Fasman, Biochemistry, 13(2):222-245, 1974b. Chou and Fasman, Biophys. J., 26(3):385-399, 1979. Davies, Advanced Materials, 10:1264-1270, 1998..
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11-12-2014
DiLorenzo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:12538-12543, 1998. Doytchinova et al., J. Immunol., 172:4314, 2004. Epitope Mapping Protocols (1996 Fennessy et al., Diabetologia, 37:937-945, 1994. Golman and Shinohara, Trends Chem. Engin., 6:1-6, 2000.
5 Goulder et al. J. Exp. Med., 192:1819-1832, 2000. Group, D.P.T.-T.D.S, N. Engl. J. Med., 346:1685-1691, 2002. Haller et al., N. Engl. J. Med., 353:2086-2087, 2005. Hamilton-Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:11533, 2001. Han et al., J. Clin. Invest., 115:1879 2005. Han et al., Nat. Med., 11:645-652, 2005.
10 Hanninen et al., J. Clin. Invest., 90:1901-1910, 1992. Hanprasopwattana, Langmuir, 12:3173-3179, 1996 Honeyman et al., Mol. Med., 1(5):576-582, 1995. Iler In: Chemistry of Silica, John Wiley & Sons, 1979. Imagawa et al., Diabetes, 50:1269-1273, 2001.
15 Itoh et al.,' Clin. Invest., 92:2313-2322, 1993. Kappos et al., Nat. Med., 6:1176-1182, 2000. Karin et al., J. Exp. Med., 180:2227-2237, 1994. Kent et al., Nature, 435:224-228, 2005. Keymeulen et al. N Engl. J. Med., 352(25):2598-608, 2005.
20 Kreuter, In: Colloidal Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., NY., 219-342, 1994. Liblau et al., Immunity, 17:1-6, 2002. Lieberman and DiLorenzo, Tissue Antigens, 62:359-377, 2003. Lieberman et al., J. Immunol., 173:6727, 2004. Lieberman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:8384-8388, 2003.
25 Liu and Wraith, Int. Immunol., 7:1255-1263, 1995. Maree et al., Int. Immunol., 18:1067-1077, 2006. Martin et al., J. Biol. Chem., 276:25197-25207, 2001. McKown, et al., Arthritis Rheum., 42:1204-1208, 1999. Merrifield, Science, 232(4748):341-347, 1986. Metzler and Wraith, Int. Immunol., 5:1159-1165, 1993.
30 Miller et al., J. Exp. Med., 149:758-766, 1979. Moore et al., Diabetes, 53:1459-1466, 2004. Moriwaki et al., Diabetologia, 42:1332-1340, 1999. Nakanishi et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 84:3721-3725, 1999. Nakayama et al., Nature, 435:220-224, 2005.
35 Nejentsev et al., Diabetes, 46:1888-1895, 1997. Owerbach, Diabetes, 49:508-512, 2000. Palmer et al., Science, 222:1337-1339, 1983.
E08731723
11-12-2014
Partch and Brown., J. Adhesion, 67:259-276, 1998. Pascolo et al., J. Exp. Med., 185:2043, 1997. Pekarek et al., Nature, 367:258, 1994. Pinkse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:18425-18430, 2005. Pociot and McDermott, Genes Immun., 3:235-249, 2002. Pozzilli, et al., Diabetologia, 43:1000-1004, 2000. Robles et al., Clin. Immunol., 102:117-224, 2002. Santamaria et al., Diabetes, 41:53-61, 1992. Santamaria et al., J. Immunol., 154:2494, 1995. Santamaria, Curr. Opin Immunol., 13:663-669, 2001. Serreze et al., Diabetes, 43:505, 1994. Serreze et al., Diabetes, 50:1992-2000, 2001. Sibley et al., Lab. Invest., 53:132-144, 1985. Sidney et al., Hum. Immunol., 45:79, 1996. Somoza et al., J. Immunol., 153:1360-1377, 1994. Stewart and Young, In: Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. ed., Pierce Chemical Co., 1984. Sukhorukov et al.,
Polymers Adv. Tech., 9(10-10:759-767, 1998. Tait et al., Hum. Immunol., 42:116-124, 1995. Takaki et al., J. ImmunoL, 176:3257-3265, 2006. Tam et al., J. Am. Chem. Soc., 105:6442, 1983. Tan et al., 1 Exp. Med., 12:1523-1532, 2002. Tice & Tabibi, In: Treatise on Controlled Drug Delivery, Kydonieus (Ed.), Marcel Dekker, Inc. NY, 315-339, 1992. Tigges et al., J. Immunol., 156(10):3901-3910, 1996. Toes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7855-7860, 1996. Toma et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:10581-10585, 2005. Trentham, et al., Science, 261:1727-1730, 1993. Trudeau et al., J. Clin. Invest., 111:217-223, 2003. Verdaguer et al., J Immunology, 157:4726-4735, 1996. Verdaguer et al., J. Exp. Med., 186:1663-1676, 1997. Weiner, Science, 259:1321-1324, 1993. Wong et al., Nat. Med., 5:1026-1031, 1999. Wraith et al., Cell, 59:247-255, 1989. Yeaman et al., Ann. NY Acad. Sci., 955:174-182, 2002.

Claims (16)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
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    REIVINDICACIONES
    1. Un complejo de antígeno-MHC acoplado operativamente a una nanopartícula para uso en un procedimiento
    para prevenir o tratar diabetes tipo I o tratar pre-diabetes en un paciente, el procedimiento que comprende: administrar a dicho paciente un complejo de antígeno-MHC acoplado operativamente a una nanopartícula en una cantidad suficiente para expandir las células T autorreactivas anti-patogénicas;
    en el que el antígeno deriva de un antiantígeno involucrado en la etiología de dicha enfermedad; en el que dicha nanopartícula tiene un diámetro menor de 1 m; y además en el que el componente MHC es un componente MHC de clase I.
  2. 2.
    Una composición farmacéutica para usar en la prevención o tratamiento de la diabetes tipo I o tratamiento de pre-diabetes que comprende un complejo de antígeno-MHC acoplado operativamente a una nanopartícula en una cantidad suficiente para expandir células T autorreactivas no patogénicas;
    en el que el antígeno deriva de un autoantígeno involucrado en una respuesta autoinmune; en el que dicha nanopartícula tiene un diámetro menor de 1 m; y además en que el componente MHC es un componente de MHC de clase I.
  3. 3.
    El complejo o composición para usar de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el antígeno es un péptido, un carbohidrato, un lípido, o una combinación de estos.
  4. 4.
    El complejo o composición para usar de la reivindicación 1 or reivindicación 2, en el que el autoantígeno es un epítopo de un antígeno expresado por las células beta pancreáticas.
  5. 5.
    El complejo o composición para usar de la reivindicación 4, en que el autoantígeno es una proteína relacionada con la subunidad catalítica de glucosa-6-fosfatasa específica del islote, insulina, ácido glutámico decarboxilasa o proteína IA-2.
  6. 6.
    El complejo o composición para usar de la reivindicación 4, en el que el autoantígeno es un epítopo derivado de un componente endocrino o neurocrino.
  7. 7.
    El complejo o composición para usar de la reivindicación 6, en el que el componente endocrino o neuroendocrino es las células de Schwann del peri-islote.
  8. 8.
    El complejo o composición para usar de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el componente de MHC de clase I comprende el total o parte de una molécula de HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G o CD
    1.
  9. 9.
    El complejo o composición para usar de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el componente de MHC de clase I comprende el total o parte de una molécula de HLA-A.
  10. 10.
    El complejo o composición para usar de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el componente de MHC de clase I comprende el total o parte de una molécula de MHC de clase I HLA-A*0201.
  11. 11.
    El complejo o composición para usar de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que la nanopartícula comprende un metal.
  12. 12.
    El complejo o composición para usar de la reivindicación 11, en el que el metal es hierro.
  13. 13.
    El complejo o composición para usar de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el complejo de antígeno-MHC está unido de modo covalente a la nanopartícula.
  14. 14.
    El complejo o composición para usar de la reivindicación 13, en el que el complejo se une a la nanopartícula por medio de un ligador.
  15. 15.
    El complejo o composición para usar de la reivindicación 14, en el que el ligador es un ligador peptídico.
  16. 16.
    El complejo o composición para usar de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que las células T expandidas por el tratamiento han sido preactivadas por la diabetes tipo I y tiene un fenotipo de memoria.
    38
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Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2804472T3 (es) 2005-12-13 2021-02-08 Harvard College Estructuras para trasplante celular
US20140105980A1 (en) * 2012-10-11 2014-04-17 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating multiple sclerosis and related disorders
EP2842570B1 (en) * 2007-03-07 2020-05-06 UTI Limited Partnership Compositions and methods for the prevention and treatment of autoimmune conditions
WO2009002401A2 (en) 2007-06-21 2008-12-31 President And Fellows Of Harvard College Scaffolds for cell collection or elimination
US9370558B2 (en) 2008-02-13 2016-06-21 President And Fellows Of Harvard College Controlled delivery of TLR agonists in structural polymeric devices
EP2254602B1 (en) 2008-02-13 2018-11-21 President and Fellows of Harvard College Continuous cell programming devices
DE102008033175A1 (de) 2008-07-15 2010-01-21 Merck Patent Gmbh Siliciumdioxid-Nanopartikel und deren Verwendung zur Vakzinierung
JP2012515722A (ja) * 2009-01-20 2012-07-12 ノースウェスタン ユニバーシティ 抗原特異的寛容の誘導のための組成物および方法
WO2010101192A1 (ja) * 2009-03-03 2010-09-10 国立大学法人九州大学 関節リウマチまたはその関連疾患の予防または治療剤
US8728456B2 (en) * 2009-07-31 2014-05-20 President And Fellows Of Harvard College Programming of cells for tolerogenic therapies
EA201592264A1 (ru) * 2009-08-26 2016-08-31 Селекта Байосайенсиз, Инк. Композиции, которые индуцируют хелперное действие т-клеток
ES2661978T3 (es) 2010-05-26 2018-04-04 Selecta Biosciences, Inc. Vacunas multivalentes de nanovehículos sintéticos
JP2013535963A (ja) 2010-07-15 2013-09-19 テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド Ｍｈｃクラスｉｉと糖尿病関連自己抗原性ペプチドとの天然型複合体に対するｔ細胞受容体様特異性を有する単離された高親和性実体
JP2013538555A (ja) 2010-07-15 2013-10-17 テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド Ｍｈｃクラスｉｉとグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ｇａｄ）自己抗原性ペプチドとの天然型複合体に対するｔ細胞受容体様特異性を有する単離された高親和性実体
CN105497883A (zh) * 2010-09-29 2016-04-20 乌第有限合伙公司 使用生物相容性的生物可吸收纳米球治疗自身免疫病的方法
US11202759B2 (en) 2010-10-06 2021-12-21 President And Fellows Of Harvard College Injectable, pore-forming hydrogels for materials-based cell therapies
JP2014502258A (ja) 2010-10-22 2014-01-30 ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート， インコーポレイテッド 免疫反応を抑制するためにプログラムされた制御性ｔ細胞の発見
US9511151B2 (en) * 2010-11-12 2016-12-06 Uti Limited Partnership Compositions and methods for the prevention and treatment of cancer
US20130323319A1 (en) 2010-11-12 2013-12-05 Getts Consulting And Project Management Modified immune-modulating particles
US9675561B2 (en) 2011-04-28 2017-06-13 President And Fellows Of Harvard College Injectable cryogel vaccine devices and methods of use thereof
EP2701745B1 (en) 2011-04-28 2018-07-11 President and Fellows of Harvard College Injectable preformed macroscopic 3-dimensional scaffolds for minimally invasive administration
CN107261154A (zh) 2011-04-29 2017-10-20 西莱克塔生物科技公司 致耐受性合成纳米载体
JP6062426B2 (ja) 2011-06-03 2017-01-18 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ インサイチュー抗原生成癌ワクチン
FR2977800B1 (fr) 2011-07-13 2014-03-14 Sanofi Pasteur Composition vaccinale avec des nanoparticules d'hydroxyde d'aluminium
CN109172819A (zh) 2011-07-29 2019-01-11 西莱克塔生物科技公司 产生体液和细胞毒性t淋巴细胞（ctl）免疫应答的合成纳米载体
US9023416B2 (en) * 2012-01-27 2015-05-05 Cartilast II LLC Preservation of the biological activity of undenatured type II collagen
US10988516B2 (en) * 2012-03-26 2021-04-27 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating inflammation
ES2773895T3 (es) 2012-04-16 2020-07-15 Harvard College Composiciones de sílice mesoporosa para modular las respuestas inmunitarias
ES2738481T3 (es) 2012-06-21 2020-01-23 Univ Northwestern Partículas peptídicas conjugadas
US10548957B2 (en) * 2012-09-28 2020-02-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Targeted expansion of Qa-1-peptide-specific regulatory CD8 T cells to ameliorate arthritis
US9603948B2 (en) 2012-10-11 2017-03-28 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating multiple sclerosis and related disorders
IL292823B2 (en) 2013-03-13 2023-11-01 Cour Pharmaceuticals Dev Company Secondary vaccine particles for the treatment of inflammation
AU2014262163A1 (en) 2013-05-03 2015-11-19 Selecta Biosciences, Inc. Delivery of immunosuppressants having a specified pharmacodynamic effective-life and antigen for the inducation of immune tolerance
CN112933218A (zh) 2013-06-04 2021-06-11 西莱克塔生物科技公司 非免疫抑制性抗原特异性免疫治疗剂的重复施用
US20160129133A1 (en) 2013-06-24 2016-05-12 Nexlmmune, Inc. Compositions and methods for immunotherapy
KR20230008909A (ko) 2013-08-13 2023-01-16 노쓰웨스턴유니버시티 펩티드-접합된 입자
KR20160077202A (ko) 2013-11-04 2016-07-01 유티아이 리미티드 파트너쉽 지속적 면역요법을 위한 방법 및 조성물
JP6502374B2 (ja) 2014-03-13 2019-04-17 ウニヴェルズィテート バーゼル ミエリン関連糖タンパク質に対するＩｇＭ抗体に結合する炭水化物リガンド
JP7348708B2 (ja) 2014-04-30 2023-09-21 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 組み合わせワクチン装置および癌細胞を殺滅する方法
EP3186274B1 (en) 2014-08-27 2021-10-06 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Intracellular osteopontin regulates the lineage commitment of lymphoid subsets
WO2016032334A1 (en) * 2014-08-28 2016-03-03 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Cd94/nkg2a and/or cd94/nkg2b antibody, vaccine combinations
EP3189138A4 (en) 2014-09-07 2018-04-18 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuating gene editing anti-viral transfer vector immune responses
EP3237003B1 (en) 2014-12-24 2021-08-11 NexImmune, Inc Nanoparticle compositions and methods for immunotherapy
US11786457B2 (en) 2015-01-30 2023-10-17 President And Fellows Of Harvard College Peritumoral and intratumoral materials for cancer therapy
JP7094533B2 (ja) 2015-04-10 2022-07-04 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 免疫細胞捕捉デバイスおよびその製造および使用方法
BR112017023853A2 (pt) * 2015-05-06 2018-07-17 Uti Limited Partnership composições de nanopartícula para terapia sustentada.
AU2016270823B2 (en) 2015-06-01 2020-09-03 California Institute Of Technology Compositions and methods for screening T cells with antigens for specific populations
WO2017046172A1 (en) 2015-09-16 2017-03-23 Universität Basel Carbohydrate ligands that bind to antibodies against glycoepitopes of glycosphingolipids
CN115531609A (zh) 2016-02-06 2022-12-30 哈佛学院校长同事会 重塑造血巢以重建免疫
AU2017295704B2 (en) 2016-07-13 2023-07-13 President And Fellows Of Harvard College Antigen-presenting cell-mimetic scaffolds and methods for making and using the same
CA3055936A1 (en) 2017-03-11 2018-09-20 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions related to combined treatment with anti-inflammatories and synthetic nanocarriers comprising an immunosuppressant
CA3056630A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
AU2018248961B2 (en) * 2017-04-07 2024-06-20 Uti Limited Partnership Assay to measure the potency of receptor-ligand interactions in nanomedicines
EP3630809A1 (en) * 2017-05-23 2020-04-08 Bruttel, Valentin Combinations of mhc class ib molecules and peptides for targeted therapeutic immunomodulation
CN111010866A (zh) 2017-05-24 2020-04-14 潘迪恩治疗公司 靶向免疫耐受性
JP7436372B2 (ja) * 2017-11-29 2024-02-21 ユーティアイ・リミテッド・パートナーシップ 自己免疫性疾患を治療する方法
US10174091B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
AU2020279240A1 (en) 2019-05-20 2021-12-23 Pandion Operations, Inc. MAdCAM targeted immunotolerance
US11981715B2 (en) 2020-02-21 2024-05-14 Pandion Operations, Inc. Tissue targeted immunotolerance with a CD39 effector
CN114689866A (zh) * 2020-12-30 2022-07-01 广州市微米生物科技有限公司 一种视神经脊髓炎抗体检测试剂
CN113866399A (zh) * 2021-11-03 2021-12-31 上海交通大学医学院附属仁济医院 肝脏酮体在急性胰腺炎病情监测和治疗上的应用

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4367110A (en) 1979-07-02 1983-01-04 Toppan Printing Co. Decorative laminate and a manufacturing method therefor
US4452901A (en) 1980-03-20 1984-06-05 Ciba-Geigy Corporation Electrophoretically transferring electropherograms to nitrocellulose sheets for immuno-assays
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
FR2504010B1 (fr) * 1981-04-15 1985-10-25 Sanofi Sa Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation
GB2097032B (en) 1981-04-22 1984-09-19 Teron International Urban Dev A combined ceiling air and services distribution system mechanical chasse and structural roof member
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
DE3377484D1 (en) 1982-04-19 1988-09-01 Nissan Motor Method for controlling reduction ratio of continuously variable transmission with acceleration compensation
US4818542A (en) 1983-11-14 1989-04-04 The University Of Kentucky Research Foundation Porous microspheres for drug delivery and methods for making same
US4542225A (en) * 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4659839A (en) 1984-10-10 1987-04-21 Mallinckrodt, Inc. Coupling agents for radiolabeled antibody fragments
EP0188256B1 (en) 1985-01-14 1991-08-21 NeoRx Metal radionuclide labeled proteins for diagnosis and therapy
US4680338A (en) 1985-10-17 1987-07-14 Immunomedics, Inc. Bifunctional linker
US4699784A (en) * 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
US5258499A (en) * 1988-05-16 1993-11-02 Vestar, Inc. Liposome targeting using receptor specific ligands
US6106840A (en) * 1988-06-23 2000-08-22 Anergen, Inc. MHC conjugates useful in ameliorating autoimmunity
US5543390A (en) * 1990-11-01 1996-08-06 State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education, Acting For And On Behalf Of The Oregon Health Sciences University Covalent microparticle-drug conjugates for biological targeting
EP0630255B1 (en) * 1991-04-23 2002-12-18 Anergen, Inc. Mhc conjugates useful in ameliorating autoimmunity
JPH07508503A (ja) * 1992-02-27 1995-09-21 ザ・ボード・オブ・トラステイーズ・オブ・ザ・リランド・スタンフオード・ジユニア・ユニバーシテイ 自己免疫性糖尿病のための初期抗原（ｅａｒｌｙ　ａｎｔｉｇｅｎ）
IL113139A0 (en) * 1994-03-28 1995-06-29 Nycomed Imaging As Diagnostic compositions comprising imaging agents encapsulated in liposomes
US6103379A (en) 1994-10-06 2000-08-15 Bar-Ilan University Process for the preparation of microspheres and microspheres made thereby
US20050003431A1 (en) * 1996-08-16 2005-01-06 Wucherpfennig Kai W. Monovalent, multivalent, and multimeric MHC binding domain fusion proteins and conjugates, and uses therefor
AU3896699A (en) 1998-05-07 1999-11-23 Regents Of The University Of California, The Use of neglected target tissue antigens in modulation of immune responses
US7807377B2 (en) * 1998-10-20 2010-10-05 Salvatore Albani Method of isolating antigen-specific T cells employing artificial antigen presenting cells
US6150022A (en) 1998-12-07 2000-11-21 Flex Products, Inc. Bright metal flake based pigments
WO2001024764A2 (en) 1999-10-06 2001-04-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cell targeting compositions and methods of using the same
US6585947B1 (en) 1999-10-22 2003-07-01 The Board Of Trustess Of The University Of Illinois Method for producing silicon nanoparticles
US6651655B1 (en) 2000-01-18 2003-11-25 Quadrant Technologies Limited Inhaled vaccines
US6797514B2 (en) * 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) * 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
KR100379250B1 (ko) * 2000-12-04 2003-04-08 한국과학기술연구원 나노 단위 크기의 금속 입자가 함유된 고분자 복합 소재및 그 제조 방법
DE10117858A1 (de) * 2001-04-10 2002-10-24 Gsf Forschungszentrum Umwelt MHC-Tetramere
US20070129307A1 (en) * 2001-06-22 2007-06-07 The University Of British Columbia Insulin epitopes for the treatment of type 1 diabetes
EP1399740A2 (en) * 2001-06-22 2004-03-24 The University of British Columbia Type 1 diabetes diagnostics and therapeutics
WO2003051278A2 (en) 2001-07-10 2003-06-26 North Carolina State University Nanoparticle delivery vehicle
DE10144252A1 (de) * 2001-08-31 2003-03-27 Fraunhofer Ges Forschung Nanopartikel mit daran immobilisiertem biologisch aktivem TNF
ATE403751T1 (de) 2001-11-09 2008-08-15 Nanosphere Inc Biokonjugat-nanopartikelsonden
CA2860702C (en) * 2001-12-17 2019-02-26 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of inflammatory bowel disease
US6688494B2 (en) * 2001-12-20 2004-02-10 Cima Nanotech, Inc. Process for the manufacture of metal nanoparticle
US7285289B2 (en) * 2002-04-12 2007-10-23 Nagy Jon O Nanoparticle vaccines
DE10310261A1 (de) * 2003-03-05 2004-09-23 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Identifizierung von Antigen-Epitopen
US6929675B1 (en) 2003-04-24 2005-08-16 Sandia Corporation Synthesis metal nanoparticle
US8758767B2 (en) * 2003-05-20 2014-06-24 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Antigens targeted by prevalent pathogennic T cells in type 1 diabetes and uses thereof
US7060121B2 (en) 2003-06-25 2006-06-13 Hsing Kuang Lin Method of producing gold nanoparticle
WO2006080951A2 (en) 2004-07-01 2006-08-03 Yale University Targeted and high density drug loaded polymeric materials
US20070059775A1 (en) * 2005-03-29 2007-03-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Synthesis and conjugation of iron oxide nanoparticles to antibodies for targeting specific cells using fluorescence and MR imaging techniques
US7326399B2 (en) * 2005-04-15 2008-02-05 Headwaters Technology Innovation, Llc Titanium dioxide nanoparticles and nanoparticle suspensions and methods of making the same
WO2008115641A2 (en) * 2007-02-15 2008-09-25 Yale University Modular nanoparticles for adaptable vaccines
EP2842570B1 (en) * 2007-03-07 2020-05-06 UTI Limited Partnership Compositions and methods for the prevention and treatment of autoimmune conditions
US20100151031A1 (en) 2007-03-23 2010-06-17 Desimone Joseph M Discrete size and shape specific organic nanoparticles designed to elicit an immune response
WO2009040811A2 (en) 2007-09-24 2009-04-02 Bar-Ilan University Polymer nanoparticles coated by magnetic metal oxide and uses thereof
US8629098B2 (en) 2008-01-15 2014-01-14 Yale University Compositions and methods for adoptive and active immunotherapy
WO2009111588A1 (en) 2008-03-04 2009-09-11 Liquidia Technologies, Inc. Immunomodulator particles and methods of treating
WO2010080032A2 (en) 2009-01-09 2010-07-15 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut Bead-assisted viral transduction
GB0922066D0 (en) 2009-12-17 2010-02-03 Univ Belfast Modulator
CN105497883A (zh) * 2010-09-29 2016-04-20 乌第有限合伙公司 使用生物相容性的生物可吸收纳米球治疗自身免疫病的方法
US9511151B2 (en) * 2010-11-12 2016-12-06 Uti Limited Partnership Compositions and methods for the prevention and treatment of cancer
US20130128138A1 (en) * 2011-11-18 2013-05-23 Shenzhen China Star Optoelectronics Technolog Co., LTD. Flat Panel Display Device, Stereoscopic Display Device, Plasma Display Device

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