WO2010101192A1 - 関節リウマチまたはその関連疾患の予防または治療剤 - Google Patents

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WO2010101192A1
WO2010101192A1 PCT/JP2010/053459 JP2010053459W WO2010101192A1 WO 2010101192 A1 WO2010101192 A1 WO 2010101192A1 JP 2010053459 W JP2010053459 W JP 2010053459W WO 2010101192 A1 WO2010101192 A1 WO 2010101192A1
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hla
rheumatoid arthritis
dimer
amino acid
acid sequence
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PCT/JP2010/053459
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勝実 前仲
喜美子 黒木
茂弘 大戸
悟 小柳
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国立大学法人九州大学
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
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    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
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    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a preventive or therapeutic agent for rheumatoid arthritis or a disease caused by rheumatoid arthritis (rheumatoid arthritis-related disease).
  • HLA-G which is one of the major non-classical major histocompatibility antigens (Major Histocompatibility Complex, MHC), is expressed in a tissue-specific manner unlike classical MHC class I molecules.
  • HLA-G is expressed in the fetal trophoblast on the placenta, which is particularly important during pregnancy, and may be involved in suppressing immunity so that the maternal immune system recognizes the fetus as a foreign body and does not attack it.
  • MHC Major non-classical major histocompatibility antigens
  • HLA-G is expressed in a tissue-specific manner unlike classical MHC class I molecules.
  • HLA-G is expressed in the fetal trophoblast on the placenta, which is particularly important during pregnancy, and may be involved in suppressing immunity so that the maternal immune system recognizes the fetus as a foreign body and does not attack it.
  • HLA-G has been applied in various ways.
  • HLA-G or genetically engineered HLA-G molecules can be
  • the HLA-G receptors reported to date include CD8 molecules expressed mainly on T cells, leukocyte Ig-like receptors B1 / B2 (LILRB1 / LILRB2) expressed on a wide range of immune system cells (Ig-like and transcripts (ILT2 / ILT4), also known as LIR1 / LIR2, and CD85j / CD85d), and KIR2DL4.
  • LILRB1 / LILRB2 leukocyte Ig-like receptors B1 / B2
  • Ig-like and transcripts also known as LIR1 / LIR2, and CD85j / CD85d
  • KIR2DL4DL4 a wide range of immune system cells
  • the immunosuppressive effect by HLA-G is probably performed through LILRB1 and LILRB2.
  • LILR group LILRB1 and LILRB2
  • HLA-G non- Patent Document 1
  • HLA-G molecules exist as dimers by natural oxidation.
  • the formation of this dimer is due to the formation of a disulfide bond between the free cysteine residues of the HLA-G molecule.
  • HLA-G HLA-G monomer
  • HLA-G dimer is a molecule that exists in a living body, like HLA-G. Therefore, although these can be expected as safe anti-inflammatory agents with few side effects (Patent Document 1), the diseases to which the anti-inflammatory agents are applied are wide, and their true effectiveness cannot be understood unless actually conducted in vivo experiments. That is the common recognition of those skilled in the art.
  • the present invention aims to provide a novel pharmaceutical use for HLA-G or its dimer. More specifically, the present invention provides pharmaceutical use of HLA-G or a dimer thereof as a preventive or therapeutic agent for rheumatoid arthritis and diseases caused by rheumatoid arthritis (rheumatoid arthritis-related diseases). With the goal.
  • the present inventors have intensively studied to solve the above problems, and have found new knowledge.
  • the present inventors have found that even when administered locally (intradermal administration to the left foot region), an anti-rheumatoid effect can be obtained throughout the limbs.
  • the dimer preferably dimer
  • the dimer is useful as an active ingredient of an anti-rheumatoid arthritis agent exhibiting excellent drug efficacy and durability in a small amount.
  • the present invention has been completed based on such findings, and includes the following embodiments.
  • Prophylactic or therapeutic agent for rheumatoid arthritis or related diseases (I-1) Rheumatoid arthritis or a disease caused by rheumatoid arthritis comprising HLA-G or a dimer thereof (hereinafter referred to as “rheumatoid arthritis”) Preventive or therapeutic agent (also referred to as "related disease”).
  • the prophylactic or therapeutic agent includes an effective amount at which the prophylactic or therapeutic agent exhibits an “anti-rheumatoid effect”, specifically, HLA-G or a dimer thereof is used for the prevention or treatment of rheumatoid arthritis or a related disease. It is blended in an effective ratio.
  • HLA-G is the protein described in (a) or (b) below: (A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, (B) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids except the 42nd amino acid have been deleted, substituted or added, and a leukocyte Ig-like receptor and / or A protein having a binding activity to CD8.
  • the HLA-G dimer is one in which the HLA-G is linked by an intermolecular disulfide bond between the 42nd cysteine residue of the amino acid sequence of HLA-G (I- The preventive or therapeutic agent described in 1) or (I-2).
  • (I-4) A preparation comprising HLA-G (monomer) as an active ingredient, and a patient suffering from or capable of developing rheumatoid arthritis or a related disease for at least 2 months
  • (I-5) A preparation comprising a dimer of HLA-G as an active ingredient, wherein the patient is suffering from rheumatoid arthritis or a related disease or is capable of developing the disease for at least 3 months.
  • composition comprising HLA-G or a dimer thereof as an active ingredient is suffering from rheumatoid arthritis or related diseases, or A method for preventing or treating rheumatoid arthritis or a related disease, comprising a step of administering an effective amount to a patient who can develop the disease.
  • the “composition” preferably has a form of a pharmaceutical preparation.
  • the “effective amount” means an amount effective for treating rheumatoid arthritis or a related disease or an amount effective for preventing the onset of the disease.
  • HLA-G is the protein described in (a) or (b) below: (A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, (B) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids except the 42nd amino acid have been deleted, substituted or added, and a leukocyte Ig-like receptor and / or A protein having a binding activity to CD8.
  • the HLA-G dimer is the one in which the HLA-G is linked by an intermolecular disulfide bond between the 42nd cysteine residue of the amino acid sequence of HLA-G (I- The method described in 1) or (I-2).
  • composition is a pharmaceutical preparation containing HLA-G (monomer) as an active ingredient, suffering from rheumatoid arthritis or a related disease, or a patient who can develop the disease,
  • composition is a pharmaceutical preparation containing an HLA-G dimer as an active ingredient, and the subject is suffering from rheumatoid arthritis or a related disease, or a patient who can develop the disease.
  • III Use for prevention or treatment of rheumatoid arthritis or related diseases
  • III-1 HLA-G or dimer thereof used for prevention or treatment of rheumatoid arthritis or related diseases, or these
  • a pharmaceutical composition comprising HLA-G or a dimer thereof in a proportion effective for the prevention or treatment of rheumatoid arthritis or related diseases.
  • HLA-G described in (III-1) or a dimer thereof, or a pharmaceutical composition containing the same, wherein HLA-G is a protein described in (a) or (b) below.
  • the HLA-G dimer is one in which the HLA-G is linked by an intermolecular disulfide bond between the 42nd cysteine residue of the amino acid sequence of HLA-G (III- HLA-G described in 1) or (III-2) or a dimer thereof, or a pharmaceutical composition containing the same.
  • the above-mentioned pharmaceutical composition is a preparation containing HLA-G (monomer) as an active ingredient and suffers from rheumatoid arthritis or a related disease thereof, or a patient who can develop the disease,
  • the HLA-G according to any one of (III-1) to (III-3), which has a formulation that is locally administered at least once every three months, preferably once every six months
  • the dimer or a pharmaceutical composition containing the dimer is a preparation containing HLA-G (monomer) as an active ingredient and suffers from rheumatoid arthritis or a related disease thereof, or a patient who can develop the disease.
  • the HLA-G according to any one of (III-1) to (III-3), which has a formulation that is locally administered at least once every three months, preferably once every six months
  • the dimer or a pharmaceutical composition containing the dimer is locally administered at least once every three months, preferably once every six months.
  • the above-mentioned pharmaceutical composition is a preparation comprising an HLA-G dimer as an active ingredient, and at least a patient suffering from rheumatoid arthritis or a related disease or capable of developing the disease,
  • the HLA-G according to any one of (III-1) to (III-3), which has a preparation form that is locally administered once every two months, preferably once every three months
  • (IV) Use for the manufacture of a prophylactic or therapeutic agent for rheumatoid arthritis or related diseases (IV-1) HLA-G or a dimer thereof for the manufacture of a prophylactic or therapeutic agent for rheumatoid arthritis or related diseases use.
  • the prophylactic or therapeutic agent includes an effective amount that the prophylactic or therapeutic agent exerts an “anti-rheumatoid arthritis effect”, specifically, HLA-G or a dimer thereof is used for the prevention or prevention of rheumatoid arthritis or a related disease. It is formulated in a proportion effective for treatment.
  • the HLA-G dimer is one in which the HLA-G is linked by an intermolecular disulfide bond between the 42nd cysteine residue of the amino acid sequence of HLA-G (IV- Use described in 1) or (IV-2).
  • the above-mentioned preventive or therapeutic agent is a preparation containing HLA-G (monomer) as an active ingredient, and suffers from or can develop rheumatoid arthritis or a related disease.
  • HLA-G monomer
  • the above-mentioned prophylactic or therapeutic agent is a preparation containing an HLA-G dimer as an active ingredient, suffering from rheumatoid arthritis or a related disease, or a patient who can develop the disease,
  • HLA-G or a dimer thereof has a novel pharmaceutical use, specifically, a medicament as a prophylactic or therapeutic agent for rheumatoid arthritis or a disease caused by rheumatoid arthritis (a disease associated with rheumatoid arthritis).
  • a medicament as a prophylactic or therapeutic agent for rheumatoid arthritis or a disease caused by rheumatoid arthritis (a disease associated with rheumatoid arthritis).
  • the prophylactic or therapeutic agent for rheumatoid arthritis or related diseases of the present invention contains HLA-G or a dimer thereof, which is an ingredient originally present in the human body, as an active ingredient, and is therefore safe with few side effects. Is expensive.
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present invention is effective for HLA-G by a single local administration of a small amount to a patient suffering from or capable of developing rheumatoid arthritis or a related disease.
  • the anti-rheumatoid arthritis effect can be maintained for at least 20 days, and when using HLA-G dimer as an active ingredient for at least two months, this also means safety.
  • It is a pharmaceutical preparation that is high and less burdensome to patients.
  • HLA-GEC gene (c) HLA-GQCa gene, (d) HLA-GQCb gene, (e) HLA-GQCab gene) encoding HLA-G It is.
  • a step of creating an HLA-GEC gene (b) from the wild type HLA-G gene (a) by total synthesis is performed, followed by the HLA-GEC gene (b) to the HLA-GQCa gene (c), HLA -GQCb gene (d) and HLA-GQCab gene (e) are prepared.
  • the filled area (black area) shown in the HLA-GQCa gene (c), HLA-GQCb gene (d), and HLA-GQCab gene (e) means a modified area.
  • A shows the 0th residue (M: Met) to the 7th residue (M: Met) of a construct in which Met is added to the N-terminus of wild type HLA-G (the N-terminal methionine (Met) is defined as the 0th residue).
  • Y amino acid sequence up to Tyr) and codons corresponding to each amino acid (upper: codon of wild type HLA-G gene, lower: codon of modified HLA-G gene). This corresponds to the painted area in FIG.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence from the 8th residue (F: Phe) to 15th residue (P: Pro) of wild type HLA-G and codons corresponding to each of the amino acids (upper: wild type HLA-G gene). , Lower row: modified HLA-G gene codon). This corresponds to the painted area in FIG.
  • Each HLA-G gene in Fig. 1 ((a) HLA-G gene, (b) HLA-GEC gene, (c) HLA-GQCa gene, (d) HLA-GQCb gene, (e) HLA-GQCab gene) It is a figure which shows the migration pattern of the microbial cell at the time of using.
  • RA score (A) Prepared by incubation (4 ° C) for 10 days without DTT. (B) Prepared by incubation with 2 mM DTT for 3 days (4 ° C.).
  • the criteria for RA score are as follows: (a) findings of arthritis in large joints of limbs and (b) findings of arthritis in small joints of fingers.
  • the experimental result 150 micrograms, 15 micrograms, 1.5 microgram administration
  • the experimental results 150 micrograms, 15 micrograms, 1.5 microgram administration
  • the present invention relates to a preventive or therapeutic agent for rheumatoid arthritis or a related disease, characterized by comprising HLA-G or a dimer thereof as an active ingredient, and a method for using the same.
  • HLA-G Active ingredient (1-1) HLA-G (monomer) HLA-G is one of the non-classical MHCI molecules and has several unique properties that differ from classical MHCI as shown below: (I) A small number of tissues: very limited expression in extravillous trophoblasts, thymic epithelial cells, and some tumors (J. LeMaoult, et al., (2003) Tissue Antigens, 62, 273-84.) (Ii) limited polymorphism (iii) slow transport (iv) relatively limited peptide presentation.
  • HLA-G molecules inhibit the immune response of a wide range of immune cells, including myeloid monocytes, T cells and NK cells, by binding to inhibitory receptors such as leukocyte Ig-like receptor (LILR). Induces immune tolerance.
  • Ig-like receptor LILR
  • the HLA-G targeted by the present invention is preferably human-derived HLA-G.
  • the information such as the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) and the base sequence encoding it (SEQ ID NO: 2) has been published, for example, as “Accession number: AF226990” by NCBI and is already known.
  • the HLA-G targeted by the present invention is not limited to the aforementioned HLA-G (wild-type HLA-G), but the function of the wild-type HLA-G, specifically, leukocyte Ig-like receptors (LILRB1 and LILRB2) And / or one or several amino acids are deleted from the amino acid sequence of the wild type HLA-G (SEQ ID NO: 1) as long as it has binding activity to a receptor of the wild type HLA-G such as CD8. It may be a protein (mutant) consisting of a substituted or added amino acid sequence.
  • a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added (mutant) refers to the function of the wild type HLA-G (leukocyte Ig-like receptor and / or CD8). And a protein obtained by deleting, substituting, or adding amino acids, as long as it has an amino acid sequence that is preferably 95% or more identical to the amino acid sequence of wild type HLA-G (SEQ ID NO: 1). (Mutant). More preferably a protein (mutant) having the amino acid sequence of 96% or more, more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence of wild type HLA-G (SEQ ID NO: 1) (hereinafter referred to as “mutant HLA-G”) ).
  • the mutation site of the mutant HLA-G is an amino acid residue (Val194) important for the binding reactivity with leukocyte Ig-like receptor and / or CD8 in the amino acid sequence of wild-type HLA-G (SEQ ID NO: 1). , Phe195, Asp196, Tyr197, Glu198, Thr200, Gln226, Asp227, Glu229, and Val248).
  • the above mutant HLA-G is a wild type HLA.
  • a mutation (deletion, substitution or addition) is preferably caused at a site other than the 42nd amino acid residue.
  • binding activity to leukocyte Ig-like receptor and / or CD8 is an activity in which HLA-G directly binds to leukocyte Ig-like receptor and / or CD8, and thereby leukocyte Ig-like receptor.
  • it means an activity capable of transmitting a signal via CD8 and exerting an immunoregulatory effect.
  • confirmation of whether or not the mutant HLA-G has binding activity to leukocyte Ig-like receptor and / or CD8 can be performed by, for example, a reporter assay using a T cell hybridoma.
  • T cell hybridomas include NFAT-GFP-introduced reporter cells (mouse T cell hybridomas) expressing a chimeric molecule in which the extracellular domain of LILRB1 or LILRB2 and the transmembrane / intracellular domain of active receptor PILRb are fused. can do.
  • NFAT-GFP-introduced reporter cells mimouse T cell hybridomas
  • a signal through the intracellular domain of PILRb is transmitted, and the transcription factor NFAT is activated.
  • the reporter assay is an assay system that utilizes the expression of GFP induced by the activation of the NFAT.
  • GFP expression indicates that LILRBs and HLA-G are bound, and the appearance of fluorescence due to such GFP expression can be confirmed by flow cytometry.
  • HLA-G is prepared by first constructing a recombinant vector in which a gene encoding the amino acid sequence of HLA-G is incorporated into an expression vector using a known gene recombination technique.
  • the transformation can be carried out by introducing the constructed recombinant vector into a host to obtain a transformant, and culturing this to express and recover the recombinant HLA-G.
  • a gene encoding the amino acid sequence of HLA-G in addition to the gene (SEQ ID NO: 2) encoding the amino acid sequence of wild-type HLA-G (SEQ ID NO: 1), the amino acid sequence of the mutant HLA-G described above A gene encoding can also be used.
  • Gene coding for the mutant HLA-G may be prepared by introducing mutations into DNA sequences of the genes of the wild-type HLA-G, for example, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2 nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) and the like. Specifically, it can be prepared using a mutation introduction kit using site-directed mutagenesis by a known technique such as Kunkel method or Gapped duplex method.
  • kits include QuickChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km Etc .: manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the host used for the preparation of the transformant is not particularly limited as long as it can express HLA-G (wild type HLA-G, mutant HLA-G) from the introduced recombinant vector or the like.
  • HLA-G wild type HLA-G, mutant HLA-G
  • cells derived from various animals such as humans and mice, cells derived from various insects, prokaryotic cells such as Escherichia coli, eukaryotic cells such as yeast, plant cells and the like, known cells that can serve as hosts can be used.
  • the base sequence of the HLA-G gene obtained by modifying all the codons encoding all amino acids of wild type HLA-G so as to be suitable for expression in E. coli includes the sequence shown in SEQ ID NO: 3. Can do.
  • the modified gene is the base sequence (SEQ ID NO: 3), and further (a) the base sequence of the 1st to 18th positions (corresponding to the base sequence encoding the 1st to 6th amino acids in the amino acid sequence of HLA-G) Is replaced with the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, or (b) the base sequence of the 25th to 45th positions (corresponding to the 9-15th amino acid sequence in the amino acid sequence of HLA-G) is sequenced It can be prepared by substituting with the base sequence shown in No. 5 or performing at least one modification.
  • the production of recombinant HLA-G can be performed by a method including a step of culturing the above-described transformant and a step of collecting recombinant HLA-G from the obtained culture.
  • “cultured product” means any of culture supernatant, cultured cells, cultured cells, or disrupted cells or cells.
  • the transformant can be cultured according to a usual method used for host culture.
  • the protein of interest is accumulated in the culture.
  • recombinant HLA-G When recombinant HLA-G is produced extracellularly, use the culture solution as it is, or remove the cells by centrifugation or filtration. Then, if necessary, extract recombinant HLA-G from the culture by extraction with ammonium sulfate precipitation, etc. and, if necessary, dialysis, various chromatography (gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography) Etc.) can be isolated and purified.
  • various chromatography gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography
  • recombinant HLA-G When recombinant HLA-G is produced intracellularly, recombinant HLA-G can be collected by disrupting the cells.
  • HLA-G When HLA-G is contained in the soluble fraction, after disruption, remove cell disruption residues (including cell extract insoluble fraction) as necessary by centrifugation or filtration. The supernatant after removal of the residue is a cell extract soluble fraction and can be a crude protein solution.
  • HLA-G is expressed as inclusion bodies in the insoluble fraction, after disruption, the insoluble fraction is isolated by centrifugation, washed with a buffer containing a surfactant, etc. Remove crushing residue.
  • the obtained inclusion body is solubilized with a buffer containing a denaturing agent such as guanidine or urea, and then the protein is unwound using a dilution method or a dialysis method.
  • the functionally unwound HLA-G can be isolated and purified using various types of chromatography (gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc.).
  • Recombinant HLA-G can be produced not only using a protein synthesis system using transformants, but also using a cell-free protein synthesis system that does not use living cells at all. Can be purified by appropriately selecting means such as chromatography.
  • HLA-G dimer has a cross-linked structure formed between the 42nd cysteine residues in the amino acid sequence constituting the HLA-G monomer, Specifically, the thiol group (SH group) in the cysteine residue is oxidized to form an intermolecular disulfide bond, thereby dimerizing (disulfide bond-type dimer) (see WO2007 / 011044). .
  • the HLA-G dimer may be a homodimer composed of the aforementioned wild-type HLA-Gs or mutant HLA-Gs, or a heteronymer composed of wild-type HLA-G and mutant HLA-G. It may be a mer and is not limited. Preferably, it is a homodimer consisting of wild-type HLA-Gs.
  • the cysteine residue contributing to the intermolecular disulfide bond constitutes the wild type HLA-G. It shall mean the cysteine residue corresponding to the 42nd residue in the amino acid sequence.
  • the HLA-G dimer has a structure in which the binding site to the leukocyte Ig-like receptor and / or CD8 is exposed to the outside when the disulfide bond portion is on the inside, and the binding to these receptors is not possible. It is not hindered by steric hindrance. Therefore, the HLA-G dimer has a structure capable of retaining the same type of function as the HLA-G monomer.
  • the HLA-G dimer preferably has a binding efficiency with leukocyte Ig-like receptor and / or CD8 that is, for example, twice or more as compared with the HLA-G monomer.
  • the binding efficiency can be measured by, for example, a reporter assay using a T cell hybridoma, a surface plasmon resonance analysis, a native gel shift assay, or the like.
  • the HLA-G dimer has a very high binding efficiency with leukocyte Ig-like receptor and / or CD8, and thus can be effectively used for suppressing activation of immune system cells.
  • the disulfide bond-type HLA-G dimer may be obtained by any method, and the acquisition method is not particularly limited.
  • the dimer obtained by the well-known manufacturing method which forms a disulfide bond naturally may be sufficient, and the dimer obtained by the manufacturing method mentioned later which can accelerate
  • a method for promoting the formation of a disulfide bond a method in which a reducing agent is added to the HLA-G monomer can be mentioned.
  • the reducing agent include dithiothreitol (DTT), ⁇ -mercaptoethanol, reduced glutathione, cysteamine, etc. Among them, DTT is particularly preferable.
  • DTT dithiothreitol
  • the reducing agent can attack thiol groups in cysteine residues contributing to disulfide bonds in the dimerization reaction of HLA-G, and promote intermolecular disulfide bond formation between thiol groups by oxidation reaction.
  • the reaction solvent in the dimerization reaction of HLA-G is not limited, but an aqueous solvent containing, for example, Tris-HCl (pH 8.0) and NaCl at an appropriate concentration is preferable. Further, in the production method of the HLA-G dimer, it is preferable that the HLA-G monomer is present at a high concentration, and the concentration is, for example, 0.1 to 10 mg / mL, preferably 5 to 10 mg / mL. mL, particularly preferably about 10 mg / mL. Examples of the method for increasing the concentration of HLA-G include a method of concentrating the HLA-G solution.
  • the final concentration is 0.1 to 10 mM, preferably 1 to 5 mM. It is such a ratio.
  • DTT is used as the reducing agent, about 2 mM is particularly preferable. It is particularly preferable to add a small amount of such a reducing agent in the state where the HLA-G monomer is present at a high concentration as described above. Under such conditions, the production efficiency of the HLA-G dimer is maximized. Can be increased.
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention (hereinafter collectively referred to as “the preparation of the present invention”.
  • the preparation is an embodiment of the composition (pharmaceutical composition) targeted by the present invention. .)
  • HLA-G or a dimer thereof as an active ingredient may be used in the form of various salts, hydrates or the like, if necessary. Further, it may be used in a state where appropriate chemical modification is made in consideration of storage stability (particularly activity maintenance). HLA-G or a dimer thereof may be used in a crystallized state or in a dissolved state.
  • the preparation of the present invention can contain other components besides HLA-G or a dimer thereof as an active ingredient.
  • the other components include various pharmaceutical components (various pharmaceutically acceptable carriers and the like) required depending on the usage (form of use) of the preparation. These other components can be appropriately contained as long as the effects exhibited by the active ingredient of the present invention (the effect of treating rheumatoid arthritis or related diseases, or the effect of preventing the onset of the diseases) are not impaired. .
  • the mixing ratio of HLA-G as an active ingredient or a dimer thereof is not limited, but is an effective amount for treating rheumatoid arthritis or related diseases, or preventing the onset of the disease Therefore, it is preferable that it is blended in an effective amount.
  • the active ingredient is HLA-G
  • it is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 1% by weight or more, and further preferably 10% by weight or more based on the entire preparation.
  • the active ingredient is an HLA-G dimer
  • it is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 1% by weight or more, still more preferably 10% by weight or more based on the whole preparation.
  • HLA-G as an active ingredient or a dimer thereof is preferably purified to have a higher purity. Specifically, for example, a purity of 50% or more is preferable, more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more.
  • the preparation of the present invention can be administered to human or non-human mammals by various administration routes, specifically oral or parenteral (eg, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, intradermal administration, rectal administration, transdermal administration). ).
  • parenteral topical administration such as subcutaneous administration or transdermal administration.
  • the active ingredient HLA-G or a dimer thereof can be used alone, but depending on the administration route, an appropriate pharmaceutically acceptable carrier can be used by a conventional method. It can be formulated into a dosage form.
  • Preferred examples of the dosage form include oral tablets, such as tablets, powders, fine granules, granules, coated tablets, capsules, syrups, and lozenges.
  • oral tablets such as tablets, powders, fine granules, granules, coated tablets, capsules, syrups, and lozenges.
  • parenteral preparations for example, inhalants, suppositories, injections (including drops), ointments, eye drops, eye ointments, nasal drops, ear drops, poultices, lotions, and liposomes An agent etc. are mentioned preferably.
  • Carriers that can be used to formulate these preparations include, for example, commonly used excipients, binders, disintegrants, lubricants, colorants, and flavoring agents, and if necessary, stabilizers, Emulsifier, absorption enhancer, surfactant, pH adjuster, preservative, antioxidant, extender, wetting agent, surfactant, dispersant, buffer, preservative, solubilizer, and soothing agent It is possible to formulate by a conventional method by blending known ingredients that can be used as raw materials for pharmaceutical preparations.
  • Non-toxic ingredients that can be used in the preparation of the present invention include, for example, animal and vegetable oils such as soybean oil, beef tallow, and synthetic glycerides; hydrocarbons such as liquid paraffin, squalane, and solid paraffin; octyldodecyl myristate, and myristin Ester oil such as isopropyl acid; higher alcohols such as cetostearyl alcohol and behenyl alcohol; silicone resin; silicone oil; polyoxyethylene fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene hydrogenated castor oil , And surfactants such as polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymers; hydroxyethyl cellulose, polyacrylic acid, carboxyvinyl polymer, polyethylene glycol, Water-soluble polymers such as livinylpyrrolidone and methylcellulose; lower alcohols such as ethanol and isopropan
  • excipients include lactose, fructose, corn starch, sucrose, glucose, mannitol, sorbit, crystalline cellulose, and silicon dioxide.
  • binders include polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, methyl cellulose, ethyl cellulose, and gum arabic. , Tragacanth, gelatin, shellac, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polypropylene glycol polyoxyethylene block polymer, and meglumine.
  • disintegrants examples include starch, agar, gelatin powder, crystalline cellulose
  • lubricants include calcium carbonate, sodium bicarbonate, calcium citrate, dextrin, pectin, and carboxymethylcellulose / calcium.
  • magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, hydrogenated vegetable oil, and the like that are allowed to be added to pharmaceuticals as colorants include, for example, cocoa powder, mint brain, Aromatic powder, mint oil, Borneolum, cinnamon powder and the like are preferably mentioned, and any of them may be a salt thereof or a hydrate thereof.
  • the active ingredient HLA-G or a dimer thereof is mixed with an excipient, and if necessary, for example, a binder, a disintegrant, a lubricant, a coloring agent, and After adding a flavoring agent etc., it can be set as a powder, a fine granule, a granule, a tablet, a covering tablet, a capsule etc. by a conventional method.
  • a binder for example, a disintegrant, a lubricant, a coloring agent, and After adding a flavoring agent etc., it can be set as a powder, a fine granule, a granule, a tablet, a covering tablet, a capsule etc.
  • a conventional method for example, a conventional method.
  • tablets and granules for example, in addition to sugar coating, if necessary, they can be appropriately coated by other known techniques.
  • a manufacturing method is not limited and can be manufactured by a conventional method.
  • the base material to be used various raw materials usually used for pharmaceuticals, quasi drugs, cosmetics, etc. can be used.
  • Antioxidants, chelating agents, antiseptic / antifungal agents, coloring agents, fragrances and the like can be added. Furthermore, components such as blood flow promoters, bactericides, anti-inflammatory agents, cell activators, vitamins, amino acids, humectants, and keratolytic agents can be added as necessary. In this case, the ratio of HLA-G or its dimer to the carrier is not limited and can be appropriately set between 1 and 90% by weight.
  • Target disease Rheumatoid arthritis or related diseases
  • the preparation of the present invention is used for alleviating or reducing symptoms of rheumatoid arthritis or preventing diseases caused by rheumatoid arthritis (rheumatoid arthritis-related diseases).
  • rheumatoid arthritis is a progressive autoimmune disease characterized by synovial inflammation in joints throughout the body. The symptom initially begins with joint pain, but as it progresses thereafter, the joint deforms and damages to systemic organs such as blood vessels, heart, lungs, skin, and muscles.
  • rheumatoid arthritis For the diagnosis of rheumatoid arthritis, the following classification criteria of the American College of Rheumatology (ACR) are commonly used: 1. Morning stiffness (lasts over 1 hour) 2. Polyarthritis (swelling of at least 3 joints) 3. Swollen hand joints Four. Symmetric joint swelling Five. Rheumatoid nodules 6. Rheumatoid factor (rheumatic factor) positive 7. Typical joint findings on X-ray examination.
  • ACR American College of Rheumatology
  • ⁇ Rheumatoid arthritis can be determined when 4 or more of these 7 items are satisfied.
  • anti-rheumatoid arthritis effect refers to an action that reduces at least “3. swelling of the joints of the hand”, preferably the swelling of the major joints of the hand, among the above seven items. It means to show the effect.
  • anti-rheumatoid arthritis effect or “anti-rheumatoid arthritis effect” includes an action / effect to alleviate the progression of symptoms of rheumatoid arthritis by suppressing joint inflammation.
  • the “rheumatoid arthritis-related disease” means a disease caused by the aforementioned rheumatoid arthritis, in other words, a disease caused by the progression of rheumatoid arthritis symptoms.
  • Such diseases can be prevented from developing by mitigating and reducing the progression of rheumatoid arthritis symptoms (the prevention includes the meaning of delayed onset), and the onset of the disease can be reduced. Can do.
  • rheumatoid arthritis-related diseases include ophthalmic diseases such as Sjogren's syndrome, dry keratoconjunctivitis and resulting dry eye, rheumatoid nodule, perforated sclera softening, episclerosis, and scleritis: Respiratory systems such as interstitial pneumonia, obstructive bronchiolitis, pleurisy, pneumothorax, empyema, airway lesions, pleural lesions, rheumatoid nodules, vascular lesions, and sleep apnea syndrome (temporomandibular joint lesions, cricoid joint lesions) Diseases; epicarditis, symptomatic epicarditis, chronic constrictive pericarditis, valve dysfunction, embolism, conduction disorder, myocardial disorder, aortitis, aortic regurgitation, and aneurysm rupture Gastrointestinal diseases such as AA amyloid
  • the effective dose varies depending on, for example, the degree of rheumatoid arthritis symptoms, age, sex, body weight, dosage form, etc.
  • the active ingredient is HLA-G (monomer)
  • it is 100 to 1000 mg, preferably 450 mg per dose for an adult weighing 60 kg;
  • 10 to 100 mg, preferably 45 mg can be administered per dose to an adult weighing 60 kg.
  • parenteral administration it is preferable to administer locally, for example, subcutaneously or intracutaneously using an injection as described above.
  • the preparation of the present invention can reduce swelling of the joints of the entire limbs and exert an antirheumatic effect by such local administration.
  • the preparation of the present invention has an effect that anti-rheumatoid arthritis action is sustained over a long period of time by a single parenteral administration.
  • a method of administering the preparation of the present invention for example, when the active ingredient is HLA-G (monomer), it is applied at a frequency of at least once every two months, preferably once every half month.
  • the active ingredient is an HLA-G dimer, it is preferable to administer it locally at least once every 3 months, preferably once every 2 months.
  • the dosage form and effective dosage depend on the administration subject, administration route, the nature of the preparation, the condition of the patient, the judgment of the doctor, etc.
  • the active ingredient is HLA-G
  • the active ingredient is an HLA-G dimer
  • the required dose can be appropriately set in a wide range.
  • FIG. 1 is a schematic view showing a process of producing a modified HLA-G gene. Two steps are involved.
  • (a) means the base sequence of the wild-type HLA-G gene (SEQ ID NO: 2), and (b) shows the codons encoding all amino acids (SEQ ID NO: 1) of wild-type HLA-G.
  • SEQ ID NO: 3 the base sequence of an artificially synthesized HLA-G gene (hereinafter referred to as “HLA-GEC gene”) substituted with a codon suitable for expression in E. coli, and
  • HLA-GEC gene an artificially synthesized HLA-G gene substituted with a codon suitable for expression in E. coli
  • (c) represents the HLA-GEC gene.
  • HLA-GEC gene (b) a step of producing an HLA-GEC gene (b) by total synthesis was performed, and then, from the HLA-GEC gene (b), the HLA-GQCa gene (c ), HLA-GQCb gene (d), and HLA-GQCab gene (e) are prepared.
  • HLA-GEC gene (b) The amino acid sequence of wild-type HLA-G (SEQ ID NO: 1) is not changed, and the codons encoding all amino acids are changed to those suitable for expression in E. coli.
  • the HLA-GEC gene (b) (SEQ ID NO: 3) was designed and completely synthesized. At that time, an EcoRV site and an NdeI site were inserted at the 5 ′ end of the HLA-GEC gene, and a HindIII site was inserted at the 3 ′ end.
  • the HLA-GEC gene and pUC57 vector are cleaved with restriction enzymes EcoRV (Takara Bio) and HindIII (TOYOBO), and the HLA-GEC gene and pUC57 vector are ligated using T4DNA ligase (TOYOBO). did.
  • the ligated plasmid was further cleaved with restriction enzymes Ndel (Takara Bio Inc.) and HindIII, and subjected to agarose gel electrophoresis in 40 mM Tris acetate buffer containing 1 mM EDTA, and the HLA-GEC gene fragment was excised. Extraction and purification were performed using quick Gel Extraction Kit (Qiagen).
  • the pGMT7 vector was cleaved with restriction enzymes NdeI and HindIII, and subjected to agarose gel electrophoresis, and the corresponding DNA fragment was excised, extracted and purified. Then, HLA-GEC and pGMT7 vector were ligated using T4 DNA ligase to construct HLA-GEC-pGMT7 plasmid.
  • E. coli BL21 (DE3) pLysS strain was transformed with this HLA-GEC-pGMT7 plasmid, and 2 ⁇ YT medium (0.5% sodium chloride, 1.6% tryptone, 1% dry yeast extract containing 100 mg100 / L ampicillin) was used. (Nakarai Tesque, Inc.)) and cultured at 37 ° C.
  • IPTG IPTG was added so as to be 1 mM, and expression was further induced at 37 ° C. for 4 to 6 hours.
  • sample buffer was added directly to the precipitated cells, and heat treatment was performed at 95 ° C., and then the supernatant was subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis .
  • HLA-GQCa gene (c) and HLA-GQCb gene (d) Preparation of HLA-GQCa gene (c) (SEQ ID NO: 6) and HLA-GQCb gene (d) (SEQ ID NO: 7)
  • HLA-GEC-pGMT7 plasmid As a template, PCR buffer (Promega), deoxyNTP mixture (TOYOBO), 5 'primer (HLA-GQCa gene, SEQ ID NO: 9, HLA- SEQ ID NO: 10 for GQCb gene, 3 ′ primer (SEQ ID NO: 11 for HLA-GQCa gene, SEQ ID NO: 12 for HLA-GQCb gene) (each final concentration 0.2 ⁇ M) and PfuTurboDNA Polymerase (Promega) PCR was performed.
  • a complementary oligonucleotide primer was used as the primer, and the reaction was performed for 25 cycles with denaturation 30 seconds (95 ° C.), annealing 1 minute (60 ° C.), and extension 8 minutes (68 ° C.).
  • each plasmid (HLA-GQCa-pGMT7 or HLA-GQCb-pGMT7) is transformed into E. coli BL21 (DE3) pLysS strain, and HLA-G-producing bacteria (E. Coli / HLA-GQCa-pGMT7 or E .Coli / HLA-GQCb-pGMT7) was obtained.
  • This transformant was cultured at 37 ° C. in 2 ⁇ YT medium (0.5% sodium chloride, 1.6% tryptone, 1% dry yeast extract) containing 100 mg / L ampicillin.
  • IPTG 1 mM
  • expression was further induced at 37 ° C. for 4 to 6 hours.
  • Centrifugation of 1 mL of cultured bacterial solution before induction of IPTG expression and 4 hours after induction of IPTG expression added sample buffer directly to the precipitated cells, heat-treated at 95 ° C., and then subjected the supernatant to SDS polyacrylamide gel electrophoresis. .
  • HLA-GQCab gene (e) (SEQ ID NO: 8) is the same as HLA-GQCa and HLA-GQCb using HLA-GQCa-pGMT7 or HLA-GQCb-pGMT7 as a template. It was made by performing PCR and other operations.
  • HLA-GQCa-pGMT7 is used as a template
  • the oligonucleotide of SEQ ID NO: 10 is the 5 ′ primer
  • the oligonucleotide of SEQ ID NO: 12 is the 3 ′ primer
  • HLA-GQCb-pGMT7 the template
  • the sequence The oligonucleotide No. 9 is used as the 5 ′ primer
  • the oligonucleotide of SEQ ID NO: 11 is used as the 3 ′ primer.
  • IPTG 1 mM
  • expression was further induced at 37 ° C. for 4 to 6 hours.
  • Centrifugation of 1 mL of cultured bacterial solution before induction of IPTG expression and 4 hours after induction of IPTG expression added sample buffer directly to the precipitated cells, heat-treated at 95 ° C., and then subjected the supernatant to SDS polyacrylamide gel electrophoresis. .
  • FIG. 3 shows the genes prepared above (wild type HLA-G gene (a), HLA-GEC gene (b), HLA-GQCa gene (c), HLA-GQCb gene (d)).
  • the image of the electrophoresis which shows the expression condition of HLA-GQCab gene (e) is shown.
  • the cells used for SDS polyacrylamide gel electrophoresis were prepared under the same conditions for all genes, and the amounts used for electrophoresis were also prepared in the same manner.
  • the column (2) in FIG. 3 shows the migration pattern of the cells before the induction of IPTG expression when the wild type HLA-G gene (SEQ ID NO: 2) is used, and the column (3) is 4 hours after the induction of IPTG expression.
  • the migration pattern of microbial cells is shown.
  • the expression of HLA-G remains at the level shown in (3) row arrow.
  • the row (4) in FIG. 3 shows the migration pattern of the cells before the induction of IPTG expression when the HLA-GEC gene (b) (SEQ ID NO: 3) is used, and the row (5) shows the 4 after IPTG expression induction.
  • the migration pattern of bacterial cells over time is shown. (5) If you look at the arrow in the row, you cannot see the band clearly. Therefore, it can be determined that HLA-G is not expressed, or even if it is expressed.
  • the column (6) in FIG. 3 shows the migration pattern of the cells before the induction of IPTG expression when the HLA-GQCa gene (c) (SEQ ID NO: 6) was used, and the column (7) shows the 4 after IPTG expression induction.
  • the migration pattern of bacterial cells over time is shown.
  • column (8) shows the migration pattern of the cells before induction of IPTG expression when HLA-GQCb gene (d) (SEQ ID NO: 7) is used, and column (9) shows 4 hours after induction of IPTG expression.
  • the migration pattern of microbial cells is shown.
  • the HLA-GQCa gene (c) and the HLA-GQCb gene (d) have low codon usage in Escherichia coli compared to the HLA-GEC gene (b). It was confirmed that the expression levels of GQCa (c) and HLA-GQCb (d) increased dramatically.
  • HLA-G solution was measured by ultraviolet absorption, the A280 value was about 67, and the expression level of HLA-G is considered to be about 32 mg / L.
  • human ⁇ 2 microglobulin that forms a complex with HLA-G (added in an amount 5 times the concentration of HLA-G) and 20 mg peptide (RIIPRHLQL) (SEQ ID NO: 13) were added, and refolding buffer (0.1 M Using Tris pH8.0, 0.4M L-arginine, 5mM EDTA, 3.7mM cystamine, 6.4mM cysteamine), the mixture was rewound while stirring at 4 ° C for 48 hours by a general dilution method. And it refine
  • HLA-G was dissolved in a reaction buffer (50 mM D-biotin, 100 mM ATP, 15 ⁇ M BirA) to a concentration of 15 ⁇ M and biotinylated. Biotinylated HLA-G and reaction buffer were separated and purified by gel filtration (Superdex75).
  • HLA-G and LILRB2 were performed using BIAcore2000 (registered trademark) (BIAcoreAB, St Albans, UK).
  • streptavidin was covalently immobilized on a research sensor chip CM5 (BIAcoreAB), and biotinylated HLA-G and negative control BSA were immobilized via the streptavidin.
  • LILRB2 (LIR2) dissolved in HBS-EP running buffer: HBS-EP (10 mM to pH 7.5, 150 mM sodium chloride, 3.4 mM EDTA, 0.005% Surfactant P20) was flowed at 10 ⁇ L / min.
  • the binding response at each concentration was calculated by subtracting the response measured in the control flow cell from the response in the sample flow cell.
  • Coupling constants (Kd) were obtained by ORIGIN5 (Microcal Software) by Scatchard analysis or non-linear curve fitting of standard Langmuir binding isotherms.
  • FIG. 4 is a diagram showing the reaction of LILRB2 (LIR2) to HLA-G or BSA which is a negative control.
  • the solid line shows the case where HLA-G is immobilized on the sensor chip, and the dotted line shows the case where BSA is immobilized on the sensor chip.
  • LILRB2B LIR2
  • FIG. 5 is a diagram showing Kd values of HLA-G and LILRB2 (LIR2). According to FIG. 5, the Kd value is 4.1 ⁇ M.
  • Preparation Example 2 Preparation of disulfide-bonded HLA-G dimer HLA-G (monomer) prepared according to the method of Preparation Example 1 was added to a refolding buffer (0.1 M Tris-HCl (pH 8.0), 0.4 Refolded with M L-arginine, 3.7 mM cystamine, 6.4 mM cysteamine, 5 mM EDTA (M. Shiroishi, et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 100, 8856-61.) . It was then purified by gel filtration (Superdex 75) and ion exchange chromatography (Resource Q).
  • Purified HLA-G was concentrated to 10 mg / mL and after 3-4 hours dithiothreitol (DTT) was added to 5 mM and incubated on ice.
  • Initial crystallization tests were performed on Crystal Screen 1 & 2 (Hampton Research) and Wizard I & II (Art Bobbins) using a crystallization robot Hydra plus one and an intelligent plate. Under the conditions of Wizard II No. 39 (0.1 M CAPS (pH 10.5), 20% PEG8000, 0.2 M NaCl), rod crystals suitable for data collection were obtained at 20 ° C. for 6 days.
  • X-ray diffraction data was collected at the beam line BL38B1 of Spring Eight (Harima, Japan) (Spring 8 (Harima, Japan)). Prior to data collection, the crystals were immersed in a cryoprotectant solution (0.1 M CAPS (pH 10.5), 20% PEG8000, 200 mM NaCl, 20% glycerol) and flash cooled. Using an X-ray wavelength of 1.0000 mm, 3.2 mm diffraction data was obtained at 100 K with the ADSC Qauntum 4RCCD system. Diffraction data was processed and scaled with the HKL2000 program package.
  • a cryoprotectant solution 0.1 M CAPS (pH 10.5), 20% PEG8000, 200 mM NaCl, 20% glycerol
  • HLA-G monomer buffer; 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCI
  • concentration 10 mg / mL was incubated at 4 ° C for 3 days with 2 mM DTT or for 10 days without DTT. .
  • DTT significantly promoted HLA-G dimer formation
  • the free thiol of the HLA-G monomer can be obtained by using 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoate. The amount of groups was measured.
  • the recent crystal structure of the HLA-G Cys42Ser mutant shows that Cys42 is completely exposed to the solvent (CS Clemems, et al., (2005) Proc.cNatl. Acad. Sci., USA, 102, 3360-5), only less than 10% unpaired thiol groups were detected. This indicated that the majority of the unrolled HLA-G free thiol groups were protected by a reducing agent, such as cysteamine, contained in the refolding solution.
  • a high pH (CAPS pH 10.5) was only marginally effective for dimer formation.
  • Experimental example 1 (1) Creation of type II collagen-induced rheumatoid arthritis model mice (1-1) Preparation of Bovine Type II Collagen-Containing Emulsion 0.02M Tris-HCl and 0.15M NaCl (pH 8.0) Buffer were added to bovine type II collagen and dissolved overnight at 4 ° C. under light-shielding conditions. To the first sensitization, an equal amount of Complete Freund's Adjuvant was added and mixed for 5 minutes or more using a homogenizer to prepare a bovine type II collagen-containing emulsion. In addition, 100 ⁇ g of bovine type II collagen is contained in the emulsion 50 ⁇ l / (dosage per animal).
  • an equal amount of Incomplete Freund's Adjuvant was added and mixed for 5 minutes or more using a homogenizer to prepare a bovine type II collagen-containing emulsion.
  • the emulsion 50 ⁇ l / (dose per animal) contains 200 ⁇ g of bovine type II collagen.
  • mice (DBA / 1J male, 6 weeks old, obtained from Charles River) were anesthetized with diethyl ether, and then mouse It was placed in a fixator, and 50 ⁇ l of the bovine type II collagen-containing emulsion prepared above was injected into the skin on the back side of a portion about 3 cm below the ridge of the mouse.
  • mice were again anesthetized with diethyl ether, placed in a mouse fixator, and bovine type II collagen in the skin behind the ridge of the mouse. 50 ⁇ l of the containing emulsion was injected.
  • mice 14 mice with an RA score of 3 on day 13 after booster sensitization were “early rheumatoid arthritis group”, and mice with an RA score of 3 or 4 on day 28 after boost (14 The following experiment was performed on these two groups.
  • the RA score is shown in Table 2 based on (a) findings of arthritis in large joints of limbs (see Fig. 7 (a)) and (b) findings of arthritis in small joints of fingers (see Fig. 7 (b)).
  • the maximum is 10 points (maximum swelling of the upper is 5 points + maximum is the total swelling of the finger joints is 5 points), and the total of the limbs is 40 points.
  • evaluation and scoring were performed by one specific judge by the blind method.
  • Solution (PBS) containing G monomer (1.5 ⁇ g, 15 ⁇ g, 150 ⁇ g / per animal) or solution containing HLA-G dimer (1.5 ⁇ g, 15 ⁇ g, 150 ⁇ g / per mouse) prepared in Preparation Example 2 (per mouse) PBS) and control (PBS solution) were intradermally administered from the left foot joint to the toe using a 1 ml syringe with a 30G needle.
  • the inhibitory effect on joint swelling by single administration of HLA-G was 15 ⁇ g / single dose for dimer, 150 ⁇ g / single dose for monomer. It was found that the effect was sustained for at least 2 months.
  • the inhibitory effect on joint swelling with a single administration of HLA-G was sufficiently observed at 1.5 ⁇ g for the dimer and 15 ⁇ g for the monomer, and the effect was at least It was found to last for more than 50 days.
  • HLA-G administration exerts an inhibitory effect on joint swelling between the “early-onset rheumatoid arthritis group” that seems to have a higher disease susceptibility and the “late-onset rheumatoid arthritis group” that seems to have a lower disease susceptibility.
  • HLA-G dimer is effective over a long period of time by a single administration of HLA-G dose several times less than that of the monomer.
  • both HLA-G monomer and HLA-G dimer were administered locally to the foot (local administration) to suppress joint swelling throughout the limbs. .
  • Experimental example 2 The “rheumatoid arthritis onset group” prepared in the same manner as in Experimental Example 1 was divided into two groups (10 mice in each group), whereas the HLA-G monomer prepared in Preparation Example 1 (35 ⁇ g / per mouse)
  • the contained solution (PBS) or control (PBS solution) was intradermally administered from the left foot joint to the toe using a 1 ml syringe with a 30G needle.
  • the administration was started from the 13th day after the booster sensitization, and then continuously administered once a day for 5 days. From the start of administration to the 11th day, the “rheumatoid arthritis onset group” was observed every day, and RA scores were recorded for the extremities (adopted blind method).
  • FIG. 9 shows the RA score results from the start of administration to the 11th day for the HLA-G monomer administration group and the control (PBS solution) group.
  • HLA-G monomer and HLA-G dimer were applied to both ears and ears of mice sensitized with Ascaris extract (Ascaris antigen) to produce immediate and delayed dermatitis (Ascaris antigen-induced dermatitis) ) was examined.
  • ⁇ Test method> A 7-week-old BALB / cAnNCrlCrlj mouse (male) manufactured by Charles River was intraperitoneally administered with 0.5 ml of a mixture of 800 ⁇ g / ml DNP-Ascaris and an equal amount of aluminum hydroxide gel suspension for sensitization. On the 13th day after sensitization, each group (control (PBS) group, HLA-G monomer group, HLA-G dimer group) was divided into groups so that the average body weight was almost uniform. On the day, 0.01 ml each of DNP-Ascaris solution, which was 1 mg / ml using physiological saline, was administered into the inner skin of both ears to induce dermatitis.
  • PBS control
  • HLA-G monomer group HLA-G dimer group
  • the HLA-G dimer showed no statistically significant difference in the thickness (average value) of the auricle compared to the control group, but was lower after 1 and 4 hours than after 24 and 48 hours. showed that. In the right ear results, a significant low value was observed 4 hours after induction. On the other hand, with the HLA-G monomer, the thickness (average value) of the auricle 1 hour after induction was statistically significantly lower than that of the control group. Although it was not significant after 4 hours, it was low, but no effect was observed after 24 and 48 hours.
  • the dermatitis suppression effect was observed for a relatively short time (1 hour or 4 hours) after the induction, but the dermatitis suppression effect was no longer observed after 24 and 48 hours after the induction. There wasn't.
  • HLA-G HLA-G monomer, dimer
  • Ascaris antigen-induced dermatitis model animals it shows that it is necessary to administer several times in succession.
  • the anti-inflammatory effect of HLA-G (HLA-G monomer, dimer) on model animals of rheumatoid arthritis was found to persist for at least 50 days with a single dose and to persist over a long period of time.
  • SEQ ID NO: 3 shows the base sequence of the HLA-G gene obtained by modifying the base sequence of the wild type HLA-G gene so as to be suitable for expression in E. coli.
  • SEQ ID NO: 4 is the base sequence used to replace the first to 18th base sequences of SEQ ID NO: 3;
  • SEQ ID NO: 5 is used to replace the 25th to 45th base sequences of SEQ ID NO: 3
  • SEQ ID NO: 6 is the base sequence obtained by replacing the 1st to 18th base sequences with the base sequence shown by SEQ ID NO: 4 in the base sequence of SEQ ID NO: 3;
  • SEQ ID NO: 7 is the base sequence of SEQ ID NO: 3 A base sequence obtained by substituting the 25th to 45th base sequences with the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence; and
  • SEQ ID NO: 8 represents the first to 18th base sequences in the base sequence of SEQ ID NO: 3 And the 25th to 45th nucleotide sequences are substituted with the nu
  • SEQ ID NOs: 9 and 11 show the 5 ′ primer base sequence or 3 ′ primer base sequence used when PCR is performed using HLA-GQCb-pGMT7 as a template.
  • SEQ ID NOs: 10 and 12 show the 5'-primer base sequence or the 3'-primer base sequence used when PCR is performed using HLA-GQCa-pGMT7 as a template.
  • SEQ ID NO: 13 shows the amino acid sequence of the peptide used in Preparation Example 1 (5).

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Abstract

本発明は、HLA-Gまたはその二量体を有効成分とする、関節リウマチまたは関節リウマチに起因して生じる疾患（関節リウマチ関連疾患）の予防または治療剤に関する。ここでHLA-Gとしては下記（a）または（b）に記載するタンパク質を好適に用いることができる： （a）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、 （b）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第42番目のアミノ酸を除く、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ白血球Ig様受容体及び／又はCD8との結合活性を有するタンパク質。

Description

関節リウマチまたはその関連疾患の予防または治療剤
　本発明は、関節リウマチまたは関節リウマチに起因して生じる疾患（関節リウマチ関連疾患）の予防または治療剤に関する。
　ヒト非古典的主要組織適合性抗原（Major Histocompatibility Complex, MHC）の一つであるHLA-Gは、古典的MHCクラスI分子とは異なり、組織特異的に発現する。HLA-Gは、特に、妊娠の際に重要となる胎盤上の胎児側の栄養膜に発現し、母体の免疫系が胎児を異物と認識して攻撃しないよう免疫を抑制することに関わることが知られている。このような知見に基づいて、HLA-Gは様々な応用がなされており、例えば、HLA-Gまたは遺伝子工学的に改良を加えたHLA-G分子を、不妊治療、臓器移植時の拒絶反応の抑制、自己免疫疾患の治療等に用いることが試みられている。
　今日までに報告されているHLA-Gの受容体としては、主にＴ細胞に発現するCD8分子、幅広い免疫系細胞において発現する白血球Ig様受容体B1/B2（LILRB1/ LILRB2）（Ig-like transcript（ILT2/ ILT4）、LIR1/ LIR2、およびCD85j/ CD85dとしても知られている。）、およびKIR2DL4を挙げることができる。HLA-Gによる免疫抑制効果は、おそらくLILRB1及びLILRB2を介して行われていると考えられる。このような、HLA-Gとその受容体との結合を詳細に解析した例としては、LILR群（LILRB1及びLILRB2）とHLA-Gとの相互作用に関する、本発明者らによる報告がある（非特許文献１）。
　ところで、HLA-G分子は、自然酸化により二量体として存在することが知られている。この二量体の形成は、HLA-G分子が有するフリーのシステイン残基が、分子間でジスルフィド結合を形成することによる。本発明者らの研究により、かかる二量体は、HLA-G単量体（以下、単に「HLA-G」または「単量体」という）よりも上記免疫抑制性受容体群と強く結合することにより極めて強いシグナル伝達能力を有すること、具体的には、そのシグナル伝達能力は、単量体のシグナル伝達能力と比較して100倍程度高いことが判明している（非特許文献２、特許文献１）。
　かかるHLA-G二量体は、HLA-Gと同様に、生体内に存在する分子である。従って、これらは副作用の少ない安全な抗炎症剤として期待できるものの（特許文献１）、抗炎症剤の適用疾患は広く、その真なる有効性は実際にin vivo実験をしてみなければ分からないというのが、当業者の共通した認識である。
WO 2007/011044
M. Shiroishi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., National Academy of Sciences,2003, Vol.100, No.15, p8856-8861） M. Shiroishi et al., Journal of Biological Chemistry, The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc., 2006, Vol.281, No.15, p.10439-10447
　本発明は、HLA-Gまたはその二量体について新規な医薬用途を提供すること目的とする。より具体的には、本発明は、HLA-Gまたはその二量体について、関節リウマチおよび関節リウマチに起因して生じる疾患（関節リウマチ関連疾患）の予防または治療剤としての医薬用途を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行い、新たな知見を見出すに至った。
　具体的には、HLA-G（単量体）およびその二量体をそれぞれII型コラーゲン誘導型関節リウマチモデルマウスに投与したところ、単量体およびその二量体のいずれにも優れた抗関節リウマチ作用が認められ、しかも単量体に比べて二量体のほうがより低濃度で抗関節リウマチ作用を発揮することを見出した。さらに単量体を用いて、５日間に亘って連続投与する場合と初日に１回投与（単回投与）する場合とでその効果を比較したところ、単回投与で十分に抗関節リウマチ効果が得られることが判明し、引き続き二量体について調べてみたところ、その抗関節リウマチ効果は単回投与日から少なくとも約２ヶ月間も持続することを確認した。加えて、本発明者らは、局所投与（左足局所への皮内投与）でも四肢全体にわたって抗関節リウマチ効果が得られることが判明し、これらのことから、本発明者らは、HLA-Gまたはその二量体（好ましくは二量体）は、少量で優れた薬効と持続性を発揮する抗関節リウマチ剤の有効成分として有用であることを確認した。
　本発明は、かかる知見に基づいて完成したものであり、下記の実施態様を包含するものである。
　（Ｉ）関節リウマチまたはその関連疾患の予防または治療剤
（I-1）HLA-Gまたはその二量体を有効成分とする、関節リウマチまたは関節リウマチに起因して生じる疾患（以下、「関節リウマチ関連疾患」ともいう）の予防または治療剤。当該予防または治療剤には、当該予防または治療剤が「抗関節リウマチ作用」を発揮する有効量、具体的にはHLA-Gまたはその二量体が関節リウマチまたはその関連疾患の予防または治療に有効な割合で配合されている。
　（I-2）HLA-Gが下記（a）または（b）に記載するタンパク質である、（I-1）に記載する予防または治療剤：
（a）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第42番目のアミノ酸を除く、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ白血球Ig様受容体及び／又はCD8との結合活性を有するタンパク質。
　（I-3）HLA-G二量体が、HLA-G のアミノ酸配列の第42番目のシステイン残基間で、HLA-G同士が分子間ジスルフィド結合により連結されたものである、（I-1）または（I-2）に記載する予防または治療剤。
　（I-4）HLA-G（単量体）を有効成分とする製剤であって、関節リウマチ若しくはその関連疾患に罹患しているか、または当該疾患を発症し得る患者に、少なくとも２か月間に１回、好ましくは半年に１回の割合で局所投与される製剤形態を有するものである、（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載する予防または治療剤。
　（I-5）HLA-Gの二量体を有効成分とする製剤であって、関節リウマチ若しくはその関連疾患に罹患しているか、または当該疾患を発症し得る患者に、少なくとも３か月間に１回、好ましくは２ヶ月に1回の割合で局所投与される製剤形態を有するものである、（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載する予防または治療剤。
　（II）関節リウマチまたはその関連疾患の予防または治療方法
（II-1）HLA-Gまたはその二量体を有効成分とする組成物を、関節リウマチ若しくはその関連疾患に罹患しているか、または当該疾患を発症し得る患者に、有効量投与する工程を有する、関節リウマチ若しくはその関連疾患の予防または治療方法。なお、ここで「組成物」とは、好ましくは医薬製剤の形態を有するものである。また「有効量」とは、関節リウマチ若しくはその関連疾患の治療のために有効な量、または当該疾患の発症を予防するために有効な量を意味する。
　（II-2）HLA-Gが下記（a）または（b）に記載するタンパク質である、（II-1）に記載する方法：
（a）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第42番目のアミノ酸を除く、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ白血球Ig様受容体及び／又はCD8との結合活性を有するタンパク質。
　（II-3）HLA-G二量体が、HLA-G のアミノ酸配列の第42番目のシステイン残基間で、HLA-G同士が分子間ジスルフィド結合により連結されたものである、（I-1）または（I-2）に記載する方法。
　（II-4）上記組成物がHLA-G（単量体）を有効成分とする医薬製剤であって、関節リウマチ若しくはその関連疾患に罹患しているか、または当該疾患を発症し得る患者に、少なくとも２か月間に１回、好ましくは半年に１回の割合で局所投与する工程を有する、（II-1）乃至（II-3）のいずれかに記載する方法。
　（II-5）上記組成物がHLA-Gの二量体を有効成分とする医薬製剤であって、関節リウマチ若しくはその関連疾患に罹患しているか、または当該疾患を発症し得る患者に、少なくとも３か月間に１回、好ましくは２ヶ月に１回の割合で局所投与する工程を有する、（II-1）乃至（II-3）のいずれかに記載する方法。
　（III）関節リウマチまたはその関連疾患の予防または治療のための使用
（III-1）関節リウマチまたはその関連疾患の予防または治療の為に使用されるHLA-G若しくはその二量体、またはこれらをHLA-Gまたはその二量体を関節リウマチまたはその関連疾患の予防または治療に有効な割合で含有する医薬組成物。
　（III-2）HLA-Gが下記（a）または（b）に記載するタンパク質である、（III-1）に記載するHLA-G若しくはその二量体、またはこれを含有する医薬組成物。
　（III-3）HLA-G二量体が、HLA-G のアミノ酸配列の第42番目のシステイン残基間で、HLA-G同士が分子間ジスルフィド結合により連結されたものである、（III-1）または（III-2）に記載するHLA-G若しくはその二量体、またはこれを含有する医薬組成物。
　（III-4）上記医薬組成物がHLA-G（単量体）を有効成分とする製剤であって、関節リウマチ若しくはその関連疾患に罹患しているか、または当該疾患を発症し得る患者に、少なくとも３か月間に１回、好ましくは半年に１回の割合で局所投与される製剤形態を有するものである、（III-1）乃至（III-3）のいずれかに記載するHLA-G若しくはその二量体、またはこれを含有する医薬組成物。
　（III-5）上記医薬組成物がHLA-Gの二量体を有効成分とする製剤であって、関節リウマチ若しくはその関連疾患に罹患しているか、または当該疾患を発症し得る患者に、少なくとも２か月間に１回、好ましくは３ヶ月に１回の割合で局所投与される製剤形態を有するものである、（III-1）乃至（III-3）のいずれかに記載するHLA-G若しくはその二量体、またはこれを含有する医薬組成物。
　（IV）関節リウマチまたはその関連疾患の予防または治療剤の製造のための使用
（IV-1）関節リウマチまたはその関連疾患の予防若しくは治療剤を製造する為のHLA-G若しくはその二量体の使用。なお、当該予防または治療剤には、当該予防または治療剤が「抗関節リウマチ作用」を発揮する有効量、具体的にはHLA-Gまたはその二量体が関節リウマチまたはその関連疾患の予防または治療に有効な割合で配合される。
　（IV-2）HLA-Gが下記（a）または（b）に記載するタンパク質である、（IV-1）に記載する使用。
　（IV-3）HLA-G二量体が、HLA-G のアミノ酸配列の第42番目のシステイン残基間で、HLA-G同士が分子間ジスルフィド結合により連結されたものである、（IV-1）または（IV-2）に記載する使用。
　（IV-4）上記予防若しくは治療剤がHLA-G（単量体）を有効成分とする製剤であって、関節リウマチ若しくはその関連疾患に罹患しているか、または当該疾患を発症し得る患者に、少なくとも３か月間に１回、好ましくは半年に１回の割合で局所投与される製剤形態を有するものである、（IV-1）乃至（IV-3）のいずれかに記載する使用。
　（IV-5）上記予防若しくは治療剤がHLA-Gの二量体を有効成分とする製剤であって、関節リウマチ若しくはその関連疾患に罹患しているか、または当該疾患を発症し得る患者に、少なくとも２か月間に１回、好ましくは３ヶ月に１回の割合で局所投与される製剤形態を有するものである、（IV-1）乃至（IV-3）のいずれかに記載する使用。
　本発明によれば、HLA-Gまたはその二量体について、新規な医薬用途、具体的には関節リウマチまたは関節リウマチに起因して生じる疾患（関節リウマチ関連疾患）の予防または治療剤としての医薬用途を提供することができる。本発明の関節リウマチまたはその関連疾患の予防または治療剤は、本来ヒトの生体内に存在する成分であるHLA-Gまたはその二量体を有効成分とするものであるため、副作用が少なく安全性が高い。しかも、本発明の予防または治療剤は、関節リウマチ若しくはその関連疾患に罹患しているか、または当該疾患を発症し得る患者に対して、少量を単回局所投与することで、HLA-Gを有効成分とする場合は少なくとも２０日間、HLA-Gの二量体を有効成分とする場合は少なくとの２か月もの間、抗関節リウマチ効果を持続させることができるので、この意味でも安全性が高く、患者への負担の少ない医薬製剤である。
HLA-Gをコードする改変遺伝子（(b)HLA-GEC遺伝子、(c)HLA-GQCa遺伝子、(d)HLA-GQCb遺伝子、(e)HLA-GQCab遺伝子）を作成する過程を示した概略図である。まず、全合成により野生型HLA-G遺伝子（a)からHLA-GEC遺伝子(b)を作成する工程が行われ、続いて、HLA-GEC遺伝子(b)からHLA-GQCa遺伝子(c)、HLA-GQCb遺伝子(d)、及びHLA-GQCab遺伝子(e)を作成する工程が行われる。なお、図中、HLA-GQCa遺伝子(c)、HLA-GQCb遺伝子(d)、及びHLA-GQCab遺伝子(e)中に示す塗りつぶし領域（黒領域）は、改変領域を意味する。 （a）は野生型HLA-GのN末端にMetを付加したコンストラクト(N末端のメチオニン(Met)を第０残基とする)の第0残基（Ｍ：Met）から第7残基（Ｙ：Tyr）までのアミノ酸配列とそのアミノ酸それぞれに対応するコドン（上段：野生型HLA-G遺伝子のコドン、下段：改変型HLA-G遺伝子のコドン）を示す。図１の(c)の塗りつぶし領域に相当する。（b）は野生型HLA-Gの第８残基（Ｆ：Phe）から第１５残基（Ｐ：Pro）までのアミノ酸配列とそのアミノ酸それぞれに対応するコドン（上段：野生型HLA-G遺伝子のコドン、下段：改変型HLA-G遺伝子のコドン）を示す。図１の(d)の塗りつぶし領域に相当する。 図１の各HLA-G遺伝子（(a)HLA-G遺伝子、(b)HLA-GEC遺伝子、(c)HLA-GQCa遺伝子、(d)HLA-GQCb遺伝子、(e)HLA-GQCab遺伝子）を用いた場合の菌体の泳動パターンを示す図である。 HLA-G（実線）又はネガティブコントロールであるBSAに対するLILRB2（LIR2）（点線）の反応を示す図である。 HLA-GとLILRB2（LIR2）のKd値（4.1μＭ）を示す図である。 HLA-G二量体の形成の有無を、Superdex 200 10/300を用いたゲル濾過クロマトグラムで観察した結果を示す。Ｄは二量体ピークを、Ｍは単量体ピークを示す。縦軸は波長280nmでの吸光度（Absorbance at 280nm[mAU]）を、横軸は溶出容量（ml）を意味する。（Ａ）DTTを伴わずに10日間インキュベーション（4℃）して調製。（Ｂ）2mM DTTとともに3日間インキュベーション（4℃）して調製。 ＲＡスコアの基準とする、(a)手足の大関節における関節炎の所見と、(b)指の小関節における関節炎の所見を示す。 「関節リウマチ早期発症群」に関する実験結果（150μg、15μg、1.5μg投与）と、「関節リウマチ後期発症群」に関する実験結果（150μg、15μg、1.5μg投与）を示す。 HLA-G単量体（monomer）（―●―）と比較対照のためにPBS（コントロール）（―▲―）を、それぞれ「関節リウマチ発症群」に５日間連続して投与した場合の、ＲＡスコアを経時的に示した結果を示す（実験例２）。
　本発明は、HLA-Gまたはその二量体を有効成分とすることを特徴とする、関節リウマチまたはその関連疾患の予防または治療剤、並びにその用法に関する。
　（１）有効成分
（1-1）HLA-G（単量体）
　HLA-Gは、非古典的MHCI分子の１つであり、以下に示すように古典的MHCIとは異なる幾つかの独特な特性を有している：
（i）少数の組織：絨毛外栄養膜、胸腺上皮細胞、及び一部の腫瘍に非常に限定された発現（J. LeMaoult, et al.,(2003) Tissue Antigens, 62, 273-84.）
（ii）限定的な多型性
（iii）遅い輸送
（iv）比較的限定的なペプチド提示。
　HLA-G分子は、白血球Ig様受容体（LILR）などの阻害性受容体への結合により、骨髄系単球細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞をはじめとする広範な免疫細胞の免疫応答を阻害し、免疫寛容を誘導する。
　本発明が対象とするHLA-Gは、好ましくはヒト由来のHLA-Gである。そのアミノ酸配列（配列番号１）およびそれをコードする塩基配列（配列番号２）などの情報は、例えばNCBIに「Accession number：AF226990」として公表されており、既に公知である。
　本発明が対象とするHLA-Gは、前述するHLA-G（野生型HLA-G）に限定されず、野生型HLA-Gの機能、具体的には白血球Ig様受容体（LILRB1及びLILRB2）及び／又はCD8などの野生型HLA-Gの受容体に対して結合活性を有する限り、当該野生型HLA-Gのアミノ酸配列（配列番号１）のうち、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質（変異型）であってもよい。
　ここで「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質（変異型）」とは、上記野生型HLA-Gの機能（白血球Ig様受容体及び／又はCD8との結合活性）を備え、且つ野生型HLA-Gのアミノ酸配列（配列番号１）と好ましくは９５％以上同一のアミノ酸配列を有することを限度として、アミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるタンパク質（変異型）を意味する。より好ましくは野生型HLA-Gのアミノ酸配列（配列番号１）と９６％以上同一、さらに好ましくは９８％以上同一のアミノ酸配列を有するタンパク質（変異型）（以下、「変異型HLA-G」という）である。
　当該変異型HLA-Gの変異部位は、野生型HLA-Gのアミノ酸配列（配列番号１）において、白血球Ig様受容体及び／又はCD8との結合反応性に重要とされるアミノ酸残基（Val194, Phe195, Asp196, Tyr197, Glu198, Thr200, Gln226, Asp227, Glu229, Val248）以外の部位で行われる必要がある。
　また、HLA-G二量体を形成するためにはHLA‐G分子間のジスルフィド結合に寄与するシステイン残基（Cys42）の存在が重要であるため、上記変異型HLA-Gは、野生型HLA-Gのアミノ酸配列（配列番号１）において、第42番目のアミノ酸残基以外の部位で変異（欠失、置換又は付加）を生じているものであることが好ましい。
　ここで、「白血球Ig様受容体及び／又はCD8との結合活性」とは、HLA-Gが白血球Ig様受容体及び／又はCD8と直接結合する活性であって、これにより白血球Ig様受容体あるいはCD8を介してシグナルを伝達し、免疫制御効果を発揮することができる活性を意味する。
　なお、変異型HLA-Gが、白血球Ig様受容体及び／又はCD8との結合活性を有するか否かの確認は、例えば、Ｔ細胞ハイブリドーマを用いたレポーターアッセイなどにより行うことができる。かかるＴ細胞ハイブリドーマとしては、LILRB1またはLILRB2の細胞外ドメインと活性型受容体PILRbの膜貫通・細胞内ドメインを融合させたキメラ分子を発現したNFAT-GFP導入レポーター細胞（マウスＴ細胞ハイブリドーマ）を例示することができる。この場合、HLA-GがLILR受容体に結合すると、PILRbの細胞内ドメインを介したシグナルが伝達され、転写因子NFATが活性化される。レポーターアッセイは、当該NFATの活性化によりGFPの発現が誘導されることを利用したアッセイ系である。GFP発現は、LILRBsとHLA-Gとが結合したことを示すが、かかるGFP発現による蛍光の出現はフローサイトメトリーで確認することができる。
　HLA-Gの調製は、まず、公知の遺伝子組換え技術を用いて、HLA-Gのアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現ベクター等に組込んだ組換えベクターを構築し、次いで、公知の各種形質転換法により、構築した組換えベクターを宿主に導入して形質転換体を得、これを培養することにより、組換えHLA-Gを発現させ、回収することにより行うことができる。
　ここでHLA-Gのアミノ酸配列をコードする遺伝子としては、野生型HLA-Gのアミノ酸配列（配列番号１）をコードする遺伝子（配列番号２）のほか、前述した変異型HLA-Gのアミノ酸配列をコードする遺伝子を用いることもできる。
　変異型HLA-Gをコードする遺伝子は、野生型HLA-Gの遺伝子のDNA配列に変異を導入して調製すればよく、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons　(1987-1997）等に記載の部位特異的変異導入法に準じて調製することができる。具体的には、Kunkel法やGapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異導入法を利用した変異導入用キットを用いて調製することができる。当該キットとしては、例えば、QuickChangeTM Site‐Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site‐Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super　Express Km等：タカラバイオ社製）等が好ましく挙げられる。
　形質転換体の作成に使用される宿主は、導入された組換えベクター等からHLA-G（野生型HLA-G、変異型HLA-G）を発現し得るものであれば、特に限定はされず、例えば、ヒトやマウス等の各種動物に由来する細胞、各種昆虫に由来する細胞、大腸菌などの原核細胞、酵母などの真核細胞、植物細胞等、宿主となりえる公知の細胞が使用できる。
　但し、宿主として大腸菌を用いる場合、培養液１Lあたりの発現産物の収量が2-3mgと、HLA-G（野生型HLA-G、変異型HLA-G）の発現効率が極めて低いという問題がある。かかる問題は、HLA-G のアミノ酸配列をコードする遺伝子として、HLA-G（野生型HLA-G、変異型HLA-G）の全アミノ酸をコードするコドンをすべて大腸菌での発現に適するように改変し、且つ開始コドンから下流の領域（野生型HLA-GのN末端にMetを付加したコンストラクト(N末端のメチオニン(Met)を第０残基とする)の0～15番目の領域）にある塩基配列をさらに特定の塩基配列で改変してなる遺伝子（以下、「改変遺伝子」という）を用いることによって解消することができる。具体的には、野生型HLA-Gの全アミノ酸をコードするコドンをすべて大腸菌での発現に適するように改変してなるHLA-G遺伝子の塩基配列としては、配列番号３に示す配列を挙げることができる。上記改変遺伝子は、当該塩基配列（配列番号３）において、さらに（ａ）第1～18番目（HLA-Gのアミノ酸配列において1～6番目のアミノ酸をコードする塩基配列に相当する）の塩基配列を配列番号４に示す塩基配列で置換するか、または（ｂ）第25～45番目（HLA-Gのアミノ酸配列において9～15番目のアミノ酸をコードする塩基配列に相当する）の塩基配列を配列番号５に示す塩基配列で置換するか、いずれか少なくとも１つの改変を行うことによって調製することができる。配列番号３に示す塩基配列において、（ａ）の改変を有する改変遺伝子の塩基配列を配列番号６に、（ｂ）の改変を有する改変遺伝子の塩基配列を配列番号７に、また（ａ）と（ｂ）の両方の改変を有する改変遺伝子の塩基配列を配列番号８に、それぞれ示す。
　当該改変遺伝子を用いると、大腸菌を宿主とした場合でも、培養液1Lあたり約30mgもの多くのHLA-Gを回収することが可能となる（調製例１参照）。
　組換えHLA-Gの製造は、具体的には、上述の形質転換体を培養する工程と、得られる培養物から組換えHLA-Gを採取する工程とを含む方法により行うことができる。ここで、「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。上記形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。目的のタンパク質は、上記培養物中に蓄積される。
　組換えHLA-Gが細胞外に生産される場合は、培養液をそのまま使用するか、遠心分離やろ過等により細胞を除去する。その後、必要に応じて硫安沈澱による抽出等により、培養物中から組換えHLA-Gを採取し、さらに必要に応じて透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフイニティクロマトグラフィー等）を用いて単離精製することができる。
　組換えHLA-Gが細胞内に生産される場合は、細胞を破砕することにより組換えHLA-Gを採取することができる。可溶性画分にHLA-Gが含まれる場合は、破砕後、遠心分離や濾過などにより、必要に応じて細胞の破砕残渣（細胞抽出液不溶性画分を含む）を除く。残渣除去後の上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、粗精製したタンパク質溶液とすることができる。一方、不溶性画分に封入体としてHLA-Gが発現する場合は、破砕後、遠心分離により不溶性画分を単離し、界面活性剤等を含んだバッファーで洗浄、遠心を繰り返すことにより、細胞の破砕残渣を取り除く。得られた封入体はグアニジンや尿素などの変性剤を含むバッファーで可溶化した後、希釈法や透析法を利用した蛋白質の巻き戻しを行う。機能的に巻き戻ったHLA-Gの精製は各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフイニティクロマトグラフィー等）を用いて単離精製することができる。
　また、組換えHLA-Gの産生は、形質転換体を用いたタンパク質合成系のほか、生細胞を全く使用しない無細胞タンパク質合成系を用いて行うこともでき、産生された組換えHLA-Gは、クロマトグラフィー等の手段を適宜選択して精製することができる。
　（1-2）HLA-G二量体
　HLA-G二量体は、HLA-G単量体を構成するアミノ酸配列中の第42番目のシステイン残基間で架橋構造が形成されることにより、詳しくは当該システイン残基中のチオール基（ＳＨ基）が酸化されて分子間ジスルフィド結合を形成することにより、二量体化したものである（ジスルフィド結合型二量体）（WO2007/011044参照）。
　HLA-G二量体は、前述する野生型HLA-G同士又は変異型HLA-G同士からなるホモニ量体であってもよいし、または野生型HLA-Gと変異型HLA-Gからなるヘテロニ量体であってもよく、限定はされない。好ましくは野生型HLA-G同士からなるホモニ量体である。なお、HLA-G二量体の構成単位であるHLA-G単量体が変異型HLA-Gである場合、上記分子間ジスルフィド結合に寄与するシステイン残基は、野生型HLA-Gを構成するアミノ酸配列中の第42番目の残基に相当するシステイン残基を意味するものとする。
　また、HLA-G二量体は、ジスルフィド結合部分を内側とした場合、白血球Ig様受容体及び／又はCD8との結合部位を外側に露出した構造を有し、これらの受容体との結合が立体障害により妨げられないものである。そのため、HLA-G二量体は、HLA-G単量体と同種の機能を保持しうる構造を有する。
　HLA-G二量体は、白血球Ig様受容体及び／又はCD8との結合効率が、HLA-G単量体に比べて、例えば２倍以上であることが好ましい。結合効率は、例えば、Ｔ細胞ハイブリドーマを用いたレポーターアッセイ、表面プラズモン共鳴解析、ネイティブゲルシフトアッセイなどにより測定することができる。このように、HLA-G二量体は、白血球Ig様受容体及び／又はCD8との結合効率が非常に高いため、免疫系細胞の活性化抑制に有効に用いることができる。
　ジスルフィド結合型HLA-G二量体は、どのような方法で得られるものであってもよく、その取得方法に特に限定はされない。例えば、ジスルフィド結合を自然に形成させる公知の製法で得られる二量体でもよいし、ジスルフィド結合の形成を促進させうる後述する製法で得られる二量体でもよい。
　ジスルフィド結合の形成を促進させる方法としては、HLA-G単量体中に、還元剤を添加する方法を挙げることができる。ここで、還元剤としては、例えばジチオトレイトール（DTT）、β－メルカプトエタノール、還元型グルタチオン、システアミンなどが挙げられ、中でもDTTが特に好ましい。当該還元剤は、HLA-Gの二量体化反応において、ジスルフィド結合に寄与するシステイン残基中のチオール基を攻撃し、酸化反応によるチオール基同士の分子間ジスルフィド結合形成を促進させうる。
　HLA-Gの二量体化反応における反応溶媒としては、限定はされないが、例えば、Tris-HCl（pH 8.0）及びNaCl等を適当な濃度で含む水性溶媒が好ましい。また、HLA-G二量体の製法においては、HLA-G単量体を高濃度に存在させておくことが好ましく、その濃度としては、例えば、0.1～10mg/mL、好ましくは5～10mg/mL、特に好ましくは10mg/mL程度である。HLA-Gを高濃度にする方法としては、例えば、HLA-G溶解液を濃縮する方法が挙げられる。
　さらに、当該製法においては、還元剤の添加量はHLA-G単量体に対して少量使用することが好ましく、例えば、量としては、最終濃度が0.1～10mM、好ましくは1～5 mMとなるような割合である。還元剤としてDTTを用いる場合は、特に２mM程度が好ましい。このような還元剤の少量添加は、前述のようにHLA-G単量体を高濃度に存在させた状態において行うことが特に好ましく、かかる条件において、HLA-G二量体の産生効率を最も高めることができる。
　（２）製剤形態
　本発明の予防または治療剤（以下、これを総称して「本発明の製剤」という。当該製剤は、本発明が対象とする組成物（医薬組成物）の一態様である。）において有効成分となるHLA-Gまたはその二量体は、必要に応じて各種塩や水和物等の状態で用いられてもよい。また、保存安定性（特に活性維持）を考慮して適当な化学的修飾がなされた状態で用いられてもよい。またHLA-Gまたはその二量体は、結晶化状態で用いられてもよいし、溶解状態で用いられてもよい。
　本発明の製剤は、有効成分としてHLA-Gまたはその二量体を含む以外、他の成分を含むことができる。他の成分としては、当該製剤の用法（使用形態）に応じて必要とされる製薬上の各種成分（薬学的に許容し得る各種担体等）が挙げられる。これらの他の成分は、本発明の有効成分により発揮される効果（関節リウマチ若しくはその関連疾患の治療効果、または当該疾患の発症を予防する効果）が損なわれない範囲で適宜含有することができる。
　本発明の製剤において、有効成分であるHLA-Gまたはその二量体の配合割合は、限定はされないが、関節リウマチ若しくはその関連疾患の治療のための有効量、または当該疾患の発症を予防するための有効量、配合されていることが好ましい。例えば、有効成分がHLA-Gである場合は、製剤全体に対して0.01重量％以上であることが好ましく、より好ましくは1重量％以上、さらに好ましくは10重量％以上である。有効成分がHLA-G二量体である場合は、製剤全体に対して0.01重量％以上であることが好ましく、より好ましくは1重量％以上、さらに好ましくは10重量％以上である。有効成分の含有割合が上記範囲を満たすことにより、本発明の抗関節リウマチ作用を発揮することができる。
　また、有効成分としてのHLA-Gまたはその二量体は、より高純度となるように精製されたものであることが好ましい。具体的には、例えば50％以上の純度が好ましく、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上である。
　本発明の製剤は、ヒト又は非ヒト哺乳動物に対し、種々の投与経路、具体的には、経口又は非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、皮内投与、直腸投与、経皮投与）で投与することができる。好ましくは皮下投与や経皮投与などの非経口的な局所投与である。
　従って、有効成分であるHLA-Gまたはその二量体は、単独で用いることも可能であるが、上記投与経路に応じて、慣用される方法により薬学的に許容し得る担体を用いて適当な剤形に製剤化することができる。
　好ましい剤形としては、経口剤では、例えば、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、及びトローチ剤等が好ましく挙げられる。また、非経口剤では、例えば、吸入剤、坐剤、注射剤（点滴剤を含む）、軟膏剤、点眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤、及びリポソーム剤等が好ましく挙げられる。
　これら製剤の製剤化に用い得る担体としては、例えば、通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、及び矯味矯臭剤のほか、必要に応じて、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、及び無痛化剤等が挙げられ、医薬品製剤の原料として用いることができる公知の成分を配合して常法により製剤化することが可能である。
　本発明の製剤に使用可能な無毒性の成分としては、例えば、大豆油、牛脂、及び合成グリセライド等の動植物油；流動パラフィン、スクワラン、及び固形パラフィン等の炭化水素；ミリスチン酸オクチルドデシル、及びミリスチン酸イソプロピル等のエステル油；セトステアリルアルコール、及びベヘニルアルコール等の高級アルコール；シリコン樹脂；シリコン油；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、及びポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤；ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、及びメチルセルロース等の水溶性高分子；エタノール、及びイソプロパノール等の低級アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、及びポリエチレングリコール等の多価アルコール（ポリオール）；グルコース、及びショ糖等の糖；無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、及びケイ酸アルミニウム等の無機粉体；塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム等の無機塩；精製水等が挙げられ、いずれもその塩またはその水和物であってもよい。
　賦形剤としては、例えば、乳糖、果糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、及び二酸化ケイ素等が、結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン・ブロックポリマー、及びメグルミン等が、崩壊剤としては、例えば、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、及びカルボキシメチルセルロース・カルシウム等が、滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、及び硬化植物油等が、着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、例えば、ココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、及び桂皮末等が、それぞれ好ましく挙げられ、いずれもその塩又はそれらの水和物であってもよい。
　本発明の製剤が経口製剤の場合は、有効成分であるHLA-Gまたはその二量体に、賦形剤、さらに必要に応じ、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、及び矯味矯臭剤等を加えた後、常法により、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、及びカプセル剤等とすることができる。錠剤及び顆粒剤の場合には、例えば、糖衣するほか、必要に応じ、その他の公知の手法で適宜コーティングすることもできる。シロップ剤及び注射用製剤等の場合は、例えば、ｐＨ調整剤、溶解剤、及び等張化剤等、並びに必要に応じて溶解補助剤、及び安定化剤等を加えて、常法により製剤化することができる。また、外用剤の場合は、製法は限定されず、常法により製造することができる。使用する基剤原料としては、医薬品、医薬部外品、及び化粧品等に通常使用される各種原料を用いることが可能であり、例えば、動植物油、鉱物油、エステル油、ワックス類、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン油、界面活性剤、リン脂質類、アルコール類、多価アルコール類、水溶性高分子類、粘土鉱物類、及び精製水等の原料が挙げられ、必要に応じ、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、キレート剤、防腐防黴剤、着色料、及び香料等を添加することができる。さらに必要に応じて、血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、及び角質溶解剤等の成分を配合することもできる。この場合、担体に対するHLA-Gまたはその二量体の割合は、限定はされず、１～９０重量％の間で適宜設定することができる。
　（３）対象疾患：関節リウマチまたはその関連疾患
　本発明の製剤は、関節リウマチの症状緩和若しくは軽減、または関節リウマチに起因して生じる疾患（関節リウマチ関連疾患）の予防に用いられる。
　ここで関節リウマチは、全身の関節における滑膜の炎症を特徴とする進行性の自己免疫疾患である。その症状は、初期は関節痛から始まるが、その後進行が進むと、関節の変形や、血管、心臓、肺、皮膚、筋肉といった全身臓器にも障害が及ぶようになる。
　なお、関節リウマチかどうかの診断には、下記に示すアメリカリウマチ学会（ACR）の分類基準が、一般的に使用されている：
1．朝のこわばり（1時間以上持続する）
2．多関節炎（少なくとも３領域以上の関節の腫れ）
3．手の関節の腫れ
4．対称性の関節の腫れ
5．リウマトイド結節
6．リウマトイド因子（リウマチ因子）陽性
7．レントゲン検査で典型的な関節所見。
　これら７項目のうち、４項目以上を満たす場合に、関節リウマチと判断することができる。
　本発明において「抗関節リウマチ作用」、または「抗関節リウマチ効果」とは、上記７項目のうち、少なくとも「3.手の関節の腫れ」、好ましくは手の大関節の腫れを減少させる作用または効果を発揮することを意味する。本発明において「抗関節リウマチ作用」、または「抗関節リウマチ効果」には、関節炎症を抑えることによって関節リウマチの症状進行を緩和する作用・効果が含まれる。
　また本発明において「関節リウマチ関連疾患」とは、前述する関節リウマチに起因して生じる疾患、言い換えると関節リウマチの症状進行に伴って生じる疾患を意味する。かかる疾患は、関節リウマチの症状進行を緩和し軽減することによって、その発症を予防（当該予防には、発症遅延の意味も含まれる）することができ、またその疾患の発症程度を軽減することができる。
　かかる関節リウマチ関連疾患としては、具体的には、シェーグレン症候群、乾燥性角結膜炎およびそれによるドライアイ、リウマトイド結節、穿孔性強膜軟化症、上強膜炎、および強膜炎等の眼科疾患：間質性肺炎、閉塞性細気管支炎、胸膜炎、気胸、膿胸、気道病変、胸膜病変、リウマチ結節、血管病変、および睡眠時無呼吸症候群（顎関節病変、輪状披裂関節病変）等の呼吸器系の疾患；心外膜炎、症候性心外膜炎、慢性収縮性心膜炎、弁機能障害、塞栓症、伝導障害、心筋障害、大動脈炎、大動脈弁閉鎖不全、および動脈瘤破裂等の心臓系の疾患；慢性炎症によるAAアミロイドーシスやリウマトイド血管炎による虚血性腸炎などの消化管系疾患；関節リウマチに合併するシェーグレン症候群による間質性腎炎、間質性腎病変、蛋白尿、続発性アミロイドーシス、関節リウマチに合併するAAアミロイドーシスによる糸球体病変（膜性腎症）などの腎臓系疾患；頚椎変形による脊髄障害、腱滑膜炎による圧迫性神経障害、関節リウマチに合併する血管炎による多発性単神経炎などの神経系疾患；リウマトイド結節、皮膚血管炎（白血球破砕性血管炎）、および虚血性皮膚潰瘍などの皮膚科系の疾患；貧血（小球性低色素性貧血）、脾腫、白血球（好中球のみ）減少をきたしたフェルティー症候群等の血液系の疾患を例示することができる。また合併症として多いのは、間質性肺炎、血管炎、およびシェーグレン症候群である。
　（４）投与方法
　本発明の製剤を非経口投与（例えば注射投与）する場合、その有効な投与量は、例えば、関節リウマチの症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態等に応じて異なり、限定はされないが、例えば、有効成分がHLA-G（単量体）である場合は、体重60kgの成人に対して１回あたり、100～1000mg、好ましくは450mg；また有効成分がHLA-G二量体である場合は、体重60kgの成人に対して１回あたり、10～100mg、好ましくは45mgを投与することができる。
　非経口投与としては、前述するように注射剤を用いて皮下または皮内などに局所投与されることが好ましい。実験例で示すように、本発明の製剤は、かかる局所投与により、四肢全体の関節の腫れを低減し、抗関節リウマチ作用を発揮することができる。また本発明の製剤は、実験例に示すように、１回の非経口投与により、長期間に亘って抗関節リウマチ作用が持続するという効果がある。このため、本発明の製剤の投与方法としては、例えば、有効成分がHLA-G（単量体）である場合は、少なくとも２か月に１回、好ましくは半月に１回の頻度で、局所投与することが好ましく；また有効成分がHLA-G二量体である場合は、少なくとも３か月に１回、好ましくは２か月に１回の頻度で、局所投与することが好ましい。
　また本発明の製剤を経口投与する場合、その投与形態及び有効な投与量は、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、及び医師の判断等に左右されるものであり、限定はされないが、例えば、有効成分がHLA-Gである場合は、体重60kgの成人に対して１回あたり、100～1000mg、好ましくは450mg；また有効成分がHLA-G二量体である場合は、体重60kgの成人に対して１回あたり、10～100mg、好ましくは45mgを投与することができる。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は適宜広範に設定することができる。
　以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　〔調製例１〕 HLA-G（単量体）の調製
　図１は、改変型HLA-G遺伝子を作製する過程を示した概略図である。二つの工程が含まれる。なお、図１中、(a)は野生型HLA-G遺伝子の塩基配列（配列番号２）を意味し、(b)は野生型HLA-Gの全アミノ酸（配列番号１）をコードするコドンを大腸菌での発現に適したコドンに置換した人工合成HLA-G遺伝子（以下、「HLA-GEC遺伝子」とする）の塩基配列（配列番号３）を意味し、（c）はHLA-GEC遺伝子の5’末端領域（アミノ酸1-6番目に相当する領域）を改変した遺伝子（HLA-GQCa遺伝子）の塩基配列（配列番号６）、(d)はHLA-GEC遺伝子の5’末端領域（アミノ酸9-15番目に相当する領域）を改変した遺伝子（HLA-GQCb遺伝子）の塩基配列（配列番号７）、(e)はHLA-GEC遺伝子の5’末端領域（アミノ酸1-6番目と9-15番目に相当する領域）を改変した遺伝子（HLA-GQCab遺伝子）の塩基配列（配列番号８）を意味する（図２参照）。
　まず、全合成によりHLA-GEC遺伝子（b）を作製する工程が行われ、続いて、HLA-GEC遺伝子（b）から、当該HLA-GECの5’末端をそれぞれ改変したHLA-GQCa遺伝子（c）、HLA-GQCb遺伝子（d）、およびHLA-GQCab遺伝子（e）を作成する工程が行われる。
　（１）HLA-GEC遺伝子（b）の作成
　野生型HLA-Gのアミノ酸配列（配列番号１）は変わらないようにして、全アミノ酸それぞれをコードするコドンを大腸菌での発現に適したものに変えたHLA-GEC遺伝子（b）（配列番号３）を設計し、全合成した。その際、HLA-GEC遺伝子の5’末端にEcoRVサイト及びNdeIサイトを、3’末端にHindIIIサイトを挿入した。
　次に、HLA-GEC遺伝子とpUC57ベクターを制限酵素EcoRV(タカラバイオ社製)、HindIII（TOYOBO社製）で切断し、HLA-GEC遺伝子とpUC57ベクターをT4DNAリガーゼ（TOYOBO社製）を用いて連結した。次に、連結したプラスミドをさらに制限酵素Ndel(タカラバイオ社製)、HindIIIで切断し、１mM EDTAを含む40mMトリス酢酸緩衝液にてアガロースゲル電気泳動を行い、HLA-GEC遺伝子断片を切り出し、QIA quick Gel Extraction Kit（キアゲン社製）を用いて抽出・精製した。同様に、pGMT7ベクターを制限酵素NdeI、HindIIIで切断し、アガロースゲル電気泳動を行い、該当するDNA断片を切り出し、抽出・精製した。そして、HLA-GECとpGMT7ベクターを、T4DNAリガーゼを用いて連結し、HLA-GEC-pGMT7プラスミドを構築した。次に、このHLA-GEC-pGMT7プラスミドで、大腸菌BL21（DE3）pLysS株を形質転換し、100mg /Lのアンピシリンを含む2×YT培地（0.5％塩化ナトリウム、1.6％トリプトン、１％乾燥酵母エキス（以上ナカライテスク社製））中で、37℃で培養した。
　次に、培養懸濁液がOD600=0.4～0.6に達した時点で、１mMとなるようにIPTGを添加し、さらに37℃で4～6時間発現誘導した。IPTG発現誘導前及びIPTG発現誘導後4時間の培養菌液lmLを遠心分離後、沈殿した菌体に直接サンプルバッファーを加え、95℃で加熱処理した後、上清をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動した。
　（２）HLA-GQCa遺伝子（c）、およびHLA-GQCb遺伝子（d）の作成
　HLA-GQCa遺伝子（c）（配列番号６）及びHLA-GQCb遺伝子（d）（配列番号７）の作成には、まずHLA-GEC-pGMT7プラスミドを鋳型にして、PCR用緩衝液（Promega社製）、deoxyNTP混合液（TOYOBO社製）、5’側プライマー（HLA-GQCa遺伝子の場合は配列番号９，HLA-GQCb遺伝子の場合は配列番号１０）、3’側プライマー（HLA-GQCa遺伝子の場合は配列番号１１，HLA-GQCb遺伝子の場合は配列番号１２）（それぞれ最終濃度0.2μM）及びPfuTurboDNA Polymerase（Promega社製）を加え、PCRを行った。その際、プライマーは相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、反応は変性30秒(95℃)、アニール1分(60℃)、エクステンション8分(68℃)にて25サイクル行った。
　次に、PCR産物にDpnI（NEB社製）を加え、37℃で１時間反応させ、鋳型を除去し、アガロースゲル電気泳動を行い、PCR産物の存在を確認した。そして、DNAシークエンサーで塩基配列を確かめ、HLA-GQCa-pGMT7プラスミド及びHLA-GQCb-pGMT7プラスミドを得た。
　次いで、それぞれのプラスミド（HLA-GQCa-pGMT7又はHLA-GQCb-pGMT7）を大腸菌BL21（DE3）pLysS株に形質転換し、HLA-Gを生産する菌(E.Coli/ HLA-GQCa-pGMT7又はE.Coli/ HLA-GQCb-pGMT7)を得た。この形質転換体を100mg/Lのアンピシリンを含む2×YT培地（0.5％塩化ナトリウム、1.6％トリプトン、１％乾燥酵母エキス）中で37℃で培養した。その後、培養懸濁液がOD600=0.4～0.6に達した時点で、１mMとなるようにIPTGを添加し、さらに37℃で4～6時間発現誘導した。ＩPTG発現誘導前及びIPTG発現誘導後4時間の培養菌液１mLを遠心分離後、沈殿した菌体に直接サンプルバッファーを加え、95℃で加熱処理した後、上清をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動した。
　（３）HLA-GQCab遺伝子（e）の作成
　HLA-GQCab遺伝子（e）（配列番号８）は、HLA-GQCa-pGMT7又はHLA-GQCb-pGMT7を鋳型にして、HLA-GQCa及びHLA-GQCb同様のPCR及びその他の操作を行うことによって作成した。HLA-GQCa-pGMT7を鋳型にする場合は、配列番号１０のオリゴヌクレオチドを5’側プライマー、配列番号１２のオリゴヌクレオチドを3’側プライマーとし、HLA-GQCb-pGMT7を鋳型にする場合は、配列番号９のオリゴヌクレオチドを5’側プライマー、配列番号１１のオリゴヌクレオチドを3’側プライマーとする。HLA-GQCab-pGMT7を得た後、上記と同様に形質転換を行い、培養した。
　その後、培養懸濁液がOD600=0.4～0.6に達した時点で、１mMとなるようにIPTGを添加し、さらに37℃で4～6時間発現誘導した。ＩPTG発現誘導前及びIPTG発現誘導後4時間の培養菌液１mLを遠心分離後、沈殿した菌体に直接サンプルバッファーを加え、95℃で加熱処理した後、上清をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動した。
　（４）発現の確認
　図３に、上記で作成した各遺伝子（野生型HLA-G遺伝子(a)、HLA-GEC遺伝子(b)、HLA-GQCa遺伝子（c）、HLA-GQCb遺伝子（d）、HLA-GQCab遺伝子（e））の発現状況を示す電気泳動の画像を示す。また、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に用いた菌体の調製は、全遺伝子とも同一条件で行い、泳動に供した量も同一に調製している。
　図３の(1)列は、マーカーの分子量を示す。マーカーの分子量より、図３の(3)列、（5）列、(7)列及び(9)列の矢印部は、HLA-Gの分子量である約32kDaとなる部分を示す。
　図３の(2)列は、野生型HLA-G遺伝子（配列番号２）を用いた場合のIPTG発現誘導前の菌体の泳動パターンを示し、(3)列は、IPTG発現誘導後４時間の菌体の泳動パターンを示す。HLA-Gの発現は（3)列矢印部に示されている程度に留まっている。
　図３の(4)列は、HLA-GEC遺伝子(b)（配列番号３）を用いた場合のIPTG発現誘導前の菌体の泳動パターンを示し、(5)列は、IPTG発現誘導後4時間の菌体の泳動パターンを示す。（5)列の矢印部を見ると、バンドがはっきりと確認できない。そのため、HLA-Gは発現していないか、例え、発現していたとしてもわずかであると判断できる。
　図３の(6)列は、HLA-GQCa遺伝子（c）（配列番号６）を用いた場合のIPTG発現誘導前の菌体の泳動パターンを示し、(7)列は、IPTG発現誘導後4時間の菌体の泳動パターンを示す。また、(8)列は、HLA-GQCb遺伝子（d）（配列番号７）を用いた場合のIPTG発現誘導前の菌体の泳動パターンを示し、(9)列は、ＩPTG発現誘導後4時間の菌体の泳動パターンを示す。(7)列及び(9)列の矢印部によれば、野生型HLA-G遺伝子を用いた場合の(3)列部の矢印部及びHLA-GEC遺伝子を用いた場合の(5)列部の矢印部と比較して、明らかに発現量が増大している。また、HLA-GQCaを用いた場合のIPTG発現誘導前である(6)列とIPTG発現誘導後4時間である(7)列とを比較すると、明らかにIPTG発現誘導後の(7)列部の矢印部にタンパク質が発現している。HLA-GQCbを用いた場合の(8)列及び(9)列に関しても同様である。図２で示したように、HLA-GEC遺伝子（b）と比較して、HLA-GQCa遺伝子（c）及びHLA-GQCb遺伝子（d）の大腸菌におけるコドン使用頻度は低いにもかかわらず、HLA-GQCa（c）及びHLA-GQCb(d)の発現量は飛躍的に増大することが確認された。
　（５）HLA-Gの再構成及び精製
　IPTGを添加して発現誘導した菌体懸濁液を遠心分離機にかけ菌体を集め、Resuspension　buffer （50mMトリスpH8.0，100mM　塩化ナトリウム）を加え、懸濁し、超音波破砕で菌体を破砕した後、遠心分離して封入体を得た。この封入体をTriton wash buffer（0.5％TritonX-100、50mMトリスpH8.0，100mM塩化ナトリウム）及びResuspension buffer（50mM　トリスpH8.0,100mM塩化ナトリウム）で十分洗浄した後に、6.0M Guanidine solution（6.0Mグアニジン、50mMメスpH6.5，10mM MEDTA）で可溶化した。この時点で、HLA-G溶液を紫外吸光法により測定したところ、Ａ280値が約67であり、HLA-Gの発現量はおよそ32mg/Lであると考えられる。次に、HLA-Gと複合体を形成するヒトβ2ミクログロブリン（HLA-Gの５倍の濃度の量を添加）と20mgペプチド（RIIPRHLQL）（配列番号１３）を添加し、Refolding buffer（0.1M トリスpH8.0, 0.4M L-アルギニン、5mM EDTA、3.7mM シスタミン、6.4mMシステアミン）を用いて一般的な希釈法で4℃、48時間撹件しながら巻き戻した。そして、ゲルろ過（superdex75）及びイオン交換クロマトグラフィー（ResourceQ）により精製した。
　次に、Reaction buffer（50mM D-biotin、l00mM ATP、15μM BirA）に15μMとなるようにHLA-Gを溶解させ、ビオチン化した。ゲルろ過（Superdex75）によりビオチン化HLA-Gとreaction bufferを分離し、精製した。
　（６）活性測定
　BIAcore2000（登録商標）（英国、セントオールバンズのBIAcoreAB）を使用し、HLA-GとLILRB2 (LIR2)の表面プラズモン共鳴実験を行った。まず、研究用センサーチップCM5（BIAcoreAB）上に、ストレプトアビジンを共有結合で固定化し、そのストレプトアビジンを介して、ビオチン化HLA-GとネガティブコントロールであるBSAを固定化した。次に、ランニングバッファーであるHBS-EP(10mMへペスpH7.5, 150mM塩化ナトリウム、3.4mM EDTA、0.005% Surfactant P20)に溶解したLILRB2 (LIR2)を10μL/分で流した。各濃度での結合応答は、サンプルフローセルにおける応答から対照フローセルにおいて測定された応答を減算することによって計算した。結合定数（Kd）は、ORIGIN5（Microcal Software）によって、スキャッチャード分析又は標準ラングミュア結合等温線の非線形カーブフィッティングによって得た。
　図４は、HLA-G又はネガティブコントロールであるBSAに対するLILRB2 (LIR2)の反応を示す図である。実線はHLA-Gをセンサーチップに固定化した場合を示し、点線はBSAをセンサーチップに固定化した場合を示す。図４によれば、BSAと比較して、LILRB2 (LIR2)はHLA-Gに結合している。図５は、HLA-GとLILRB2 (LIR2)のKd値を示す図である。図５によれば、Kd値は4.1μMである。これは、野生型HLA-G遺伝子を用いてHLA-Gを発現させた場合のHLA-GとLILRB2 (LIR2)との表面プラズモン共鳴実験の結果（Shiroishi et al.,（2003) Proc. Natl. Acad. Sci., USA．（論文中で、ILT4D1D2と示されているものとLILRB2 (LIR2)は同一のものである））と一致していた。
　〔調製例２〕 ジスルフィド結合型HLA-G二量体の調製
　調製例１の方法に従って作成したHLA-G（単量体）を、リフォールディングバッファ（0.1M Tris-HCl（pH8.0）、0.4M L-アルギニン、3.7mM シスタミン、6.4mM システアミン、5mM　EDTA）でリフォールドした（M. Shiroishi, et al.,(2003) Proc. Natl. Acad. Sci., U S A, 100，8856-61.）。その後、それをゲル濾過（Superdex 75）及びイオン交換クロマトグラフィー（Resource Q）により精製した。精製されたHLA-Gを10mg/mLまで濃縮し、３～４時間後、ジチオトレイトール（DTT）を5mMまで添加し、氷上でインキュベートした。初期結晶化試験は、結晶化用ロボットHydra plus oneおよびインテリプレートを使用して、Crystal Screen 1＆2（Hampton Research）、Wizard I&II（Art Bobbins）で行った。Wizard II No.39の条件（0.1M CAPS（pH10.5）、20％　PEG8000、0.2M NaCl）下、６日間、２０℃で、データ収集に適する棒型結晶を得た。
　Ｘ線回折データは、スプリングエイト（播磨、日本）（Spring 8（Harima，Japan））のビームラインBL38B1で収集した。データ収集前、結晶を凍結防止剤溶液（0.1M CAPS（pH10.5）、20％ PEG8000, 200mM NaCl, 20％グリセロール）に浸漬し、フラッシュ冷却した。1.0000ÅのＸ線波長を使用して、ADSC Qauntum 4RCCDシステムで、100Ｋで、3.2Å回折データを得た。回折データは、HKL2000プログラムパッケージで処理し、スケーリングした。これらの結晶は、単位格子寸法ａ＝94.70Å、ｂ＝127.85Å、ｃ＝72.60Åで、斜方品系空間群P21212に属する。データ収集統計を表１に示す。その結晶構造を分子置換により解明した。分子間Cys42-Cys42ジスルフィド結合についての電子密度マップが明瞭に観察されたため、HLA-G（野生型HLA-G）のジスルフィド結合型二量体がこの条件下で結晶化したことがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　結晶化ドロップ中のHLA-Gのジスルフィド結合型二量体形成を助長する要因を特定するために、二量体形成条件を検査した。10mg/mLまで濃縮したHLA-G単量体（バッファー；20mM　Tris-HCl（pH8.0）、l00mM NaCI）を４℃で３日間、2mM DTTとともに、又は10日間、DTTを伴わずにインキュベートした。これらの混合物をゲル濾過により分析し、その結果、DTTの添加によりHLA-G二量体形成が有意に促進されて形成されることが判明した（図６ＡおよびＢ）。
　次に、巻き戻したHLA-G分子の遊離システインが保護されているか否かを明らかにするため、5,5’‐ジチオビス2-ニトロベンゾエートを使用することによりHLA-G単量体の遊離チオール基の量を測定した。HLA-G Cys42Ser突然変異体の最近の結晶構造は、Cys42が溶媒に完全に曝露されていることを示しているが（C.S. Clemems, et al.,(2005) Proc. Natl. Acad. Sci.,  USA,102,3360-5）、10％未満の対になっていないチオール基しか検出されなかった。これは、巻き戻されたHLA-Gの大部分の遊離チオール基が、リフォールデイング溶液中に含まれる還元剤、例えばシステアミンにより保護されていることを示していた。高いｐＨ（CAPS pH10.5）は、二量体形成にはわずかにしか有効でなかった。
　これらの結果により、低濃度のDTTが、還元剤により保護された遊離チオール基を攻撃することによってジスルフィド結合の形成を助長することが示された。
　実験例１
（１）II型コラーゲン誘導型関節リウマチモデルマウスの作成
(1-1) ウシII型コラーゲン含有エマルジョンの調製
　ウシII型コラーゲンに0.02M Tris-HCl、0.15M NaCl (pH8.0) Bufferを加え、４℃、遮光条件下で一晩かけて溶解した。これに初回感作の際には等量のComplete Freund’s Adjuvantを加えて、ホモジナイザーを用いて５分以上混合し、ウシII型コラーゲン含有エマルジョンを調製した。なお、当該エマルジョン50μl/（１匹あたりの投与量）中には100μgのウシII型コラーゲンが含まれている。他方、追加感作の際には等量のIncomplete Freund’s Adjuvantを加えて、ホモジナイザーを用いて５分以上混合し、ウシII型コラーゲン含有エマルジョンを調製した。なお、当該エマルジョン50μl/（１匹あたりの投与量）中には200μgのウシII型コラーゲンが含まれている。
　(1-2) II型コラーゲン誘導型関節リウマチモデルマウスの作成
　(i)初回感作
　マウス（DBA/1Jオス6週齢、チャールスリバー社から入手）５２匹を、ジエチルエーテルで麻酔した後、マウス固定器に入れ、マウスの尾根部より約3cm下の部分の裏側の皮内に、上記で調製したウシII型コラーゲン含有エマルジョン50μlを注入した。
　(ii)追加感作
　上記初回感作から2週間後、再度上記のマウス５２匹を、ジエチルエーテルで麻酔した後、マウス固定器に入れ、マウスの尾根部の裏側の皮内にウシII型コラーゲン含有エマルジョン50μlを注入した。
　（iii）II型コラーゲン誘導型関節リウマチモデルマウスの判定
　追加感作後、毎日（月～金）四肢のRAスコアを観察記録し、ほぼ同一スコアのマウスが揃うのを確認した（II型コラーゲン誘導型関節リウマチモデルマウス）。
　追加感作から13日目にRAスコアが3に達したマウス（14匹）を「関節リウマチ早期発症群」、また追加感作から28日目にRAスコアが3または４に達したマウス（14匹）を「関節リウマチ後期発症群」とし、これらの２群に対して、下記の実験を行った。
　なお、RAスコアは、(a)手足の大関節における関節炎の所見（図７(a)参照）と、(b)指の小関節における関節炎の所見（図７(b)参照）から、表２に示す規準に従って得点化し、その得点の総数を、対象とする関節リウマチモデルマウス１匹あたりのRAスコアとする。具体的には、手足の甲の腫れ（所見Ａ＝３点、所見Ｂ＝４点、所見Ｃ＝５点）、および指関節の腫れ一本につき１点として得点化した。すなわち、四肢一本につき、最大で１０点（甲の腫れ最大で５点＋指関節の腫れ合計で最大５点）、四肢合計で最大４０点となる。なお、評価および得点化は盲検法により特定の１名の判定者によって行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（２）関節リウマチの治療効果の確認
　上記で作成した「関節リウマチ早期発症群」（n=14）、および「関節リウマチ後期発症群」（n=14）に、調製例１で調製したHLA-G単量体（1.5μg、15μg、150μg/１匹当たり）含有溶液（PBS）、または調製例２で調製したHLA-G二量体（1.5μg、15μg、150μg/１匹当たり）含有溶液（PBS）、コントロール（PBS溶液）を、30G針をつけた1ml容量のシリンジを用いて、左足の関節からつま先に向けて皮内投与した。なお、投与は、「関節リウマチ早期発症群」については、追加感作から13日目に、「関節リウマチ後期発症群」については、追加感作から28日目に行った。投与後、毎日観察し、四肢についてRAスコアを記録した（盲検法採用）。「関節リウマチ早期発症群」（n=14）に関する実験結果と、「関節リウマチ後期発症群」（n=14）に関する実験結果を、図８に示す。
　図８から分かるように、「関節リウマチ早期発症群」に対しては、1.5μg/匹投与ではHLA-G単量体およびHLA-G二量体のいずれもコントロール（PBS）と変わらず関節が腫脹しており、抑制効果は認められなかった。しかし、15μg/匹投与では、HLA-G単量体およびHLA-G二量体のいずれも関節腫脹を抑えており、なかでも二量体は単量体よりも抑制効果が強く、しかも単量体よりも長期間に亘って抑制することが判明した。また150μg/匹投与では、HLA-G単量体も二量体のいずれもコントロール（PBS）に比べて顕著に関節腫脹を抑えることが確認された。
　以上より、「関節リウマチ早期発症群」において、HLA-G単回投与による関節腫脹に対する抑制効果は、二量体の場合15μg/単回投与量、単量体の場合150μg/単回投与量で十分認められ、その効果は少なくとも2か月程度持続することがわかった。
　また図８から分かるように、「関節リウマチ後期発症群」に対しては、150μg/匹投与および15μg/匹投与では、HLA-G単量体およびHLA-G二量体の両方ともコントロール（PBS）に比べて顕著に関節腫脹を抑えていた。1.5μg/匹投与では、HLA-G二量体による関節腫脹に対する抑制効果は認められたが、HLA-G単量体ではコントロールと変わらず関節が腫脹しており、抑制効果は認められなかった。
　以上より、「関節リウマチ後期発症群」においては、HLA-G単回投与での関節腫脹に対する抑制効果は二量体の場合1.5μg、単量体の場合15μgで十分認められ、その効果は少なくとも50日以上持続することがわかった。
　これらの結果より、疾患感受性がより高いと思われる「関節リウマチ早期発症群」と疾患感受性が低いと思われる「関節リウマチ後期発症群」とでは、関節腫脹に対する抑制効果を発揮するHLA-G投与量に差があり、疾患感受性が低い場合は、より少量のHLA-G投与で済むことがわかった。また、HLA-G二量体は単量体に比べ数倍以上少ないHLA-G投与量の単回投与により長期間にわたって効果が得られることがわかった。また、この実験から、HLA-G単量体およびHLA-G二量体は、いずれも足局所に皮内投与することで（局所投与）、関節腫脹を四肢全体にわたって抑制することが確認できた。
　実験例２
　実験例１と同様に作成した「関節リウマチ発症群」を二群に分け（各群10匹）、これに対して、調製例１で調製したHLA-G単量体（35μg/１匹当たり）含有溶液（PBS）またはコントロール（PBS溶液）を、30G針をつけた1ml容量のシリンジを用いて、左足の関節からつま先に向けて皮内投与した。なお、投与は、追加感作から13日目から開始し、その後５日間にわたって１日１回連続投与した。投与開始から11日目まで、「関節リウマチ発症群」を毎日観察し、四肢についてRAスコアを記録した（盲検法採用）。HLA-G単量体投与群とコントロール（PBS溶液）群について、投与開始から11日目までのRAスコア結果を図９に示す。
　この結果からわかるように、HLA-G単量体を１日１回の割合で５日間連続して投与することで関節腫脹が抑制されることが確認されたが、さらにHLA-G単量体の投与をやめた５日以降も関節腫脹抑制効果が持続していた。このことから、HLA-G単量体を単回投与することで、持続的に関節腫脹抑制効果（関節リウマチ治療効果）が得られるものと考えられる。前述する実験例１の結果は、この予想の適否を確認し、支持するものである。
　対照実験例１
　HLA-G単量体およびHLA-G二量体をアスカリス抽出物（アスカリス抗原）で感作したマウスの両耳耳介に塗布し、即時性および遅発性の皮膚炎（アスカリス抗原誘発皮膚炎）に対する効果を検討した。
　＜試験方法＞
　チャールスリバー社の7週齢BALB/cAnNCrlCrljマウス（雄）腹腔内に800μg/ml　DNP－アスカリスと等量の水酸化アルミニウムゲル懸濁液の混合液0.5mlを投与し、感作した。感作後13日に、各群（コントロール（PBS）群、HLA-G単量体群、HLA-G二量体群）の平均体重がほぼ均一になるように群分けし、感作後14日に生理食塩液を用いて1mg/mlとしたDNP-アスカリス溶液0.01mlずつを両耳耳介内側皮内に投与し、皮膚炎を誘発した。
　PBSおよびHLA-G（単量体）（160μg/ml）、HLA-G二量体（16μg/ml）を、0.02mlずつ両耳耳介の内側の皮膚に、誘発前3時間及び誘発後4時間に1回の計2回塗布した。左右両耳耳介の厚さの測定は、誘発前日、誘発後1，4，24及び48時間に各1回測定し、それぞれの誘発前日の耳介の厚さを引いて増加値を算出した。また、感作後13日に1回、誘発後48時間の観察終了後に体重を測定した。
　＜結果＞
　HLA-G二量体では、耳介に厚さ（平均値）にコントロール群と比較して統計学的有意差は認められなかったが、24、48時間後に比べ１、4時間後には低値を示した。右耳の結果では、誘発後4時間で有意な低値が認められた。一方、HLA-G単量体では、誘発後1時間の耳介に厚さ（平均値）がコントロール群に比べて統計的有意に低値を示した。4時間後も有意ではないが低値を示した一方、24時間、48時間後に効果は認められなかった。
　なお、HLA-G単量体、二量体ともにマウスの一般症状および体重においてHLA-G投与による副作用は認められなかった。
　以上示すように、誘発後から比較的短時間（1時間または4時間）の間では皮膚炎抑制効果が認められたが、誘発後24時間および48時間後には、もはや皮膚炎抑制効果は認められなかった。
　この結果は、アスカリス抗原誘発皮膚炎モデル動物に対してHLA-G（HLA-G単量体、二量体）が炎症抑制効果を示す期間は短く、その効果を持続させるには、マウスへの投与を連続して複数回行う必要があることを示している。しかしながら、上記結果に基づく予測に反して、関節リウマチのモデル動物に対しては、実験例１および２に示すように、HLA-G（HLA-G単量体、二量体）の炎症抑制効果は、単回投与で少なくとも50日間持続し、長期にわたって持続することが判明した。
　配列番号３は野生型HLA-G遺伝子の塩基配列を大腸菌での発現に適するように改変してなるHLA-G遺伝子の塩基配列を示す。配列番号４は、配列番号３の第1～18番目の塩基配列を置換するために使用した塩基配列；配列番号５は、配列番号３の第25～45番目の塩基配列を置換するために使用した塩基配列；配列番号６は、配列番号３の塩基配列において第1～18番目の塩基配列を配列番号４で示す塩基配列で置換されてなる塩基配列；配列番号７は、配列番号３の塩基配列において第25～45番目の塩基配列を配列番号５で示す塩基配列で置換されてなる塩基配列；および配列番号８は配列番号３の塩基配列において第1～18番目の塩基配列を配列番号４で示す塩基配列で置換され、且つ第25～45番目の塩基配列を配列番号５で示す塩基配列で置換されてなる塩基配列をそれぞれ示す。
　配列番号９と１１は、HLA-GQCb-pGMT7を鋳型にしてＰＣＲする場合に使用する5’側プライマーの塩基配列または3’側プライマーの塩基配列を示す。配列番号１０と１２は、HLA-GQCa-pGMT7を鋳型にしてＰＣＲする場合に使用する5’側プライマーの塩基配列または3’側プライマーの塩基配列を示す。配列番号１３は、調製例１（５）で使用したペプチドのアミノ酸配列を示す。

Claims (15)

  1. HLA-Gまたはその二量体を有効成分とする、関節リウマチまたは関節リウマチに起因して生じる疾患の予防または治療剤。
  2. HLA-Gが下記（a）または（b）に記載するタンパク質である、請求項１に記載する予防または治療剤：
    （a）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （b）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第42番目のアミノ酸を除く、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ白血球Ig様受容体及び／又はCD8との結合活性を有するタンパク質。
  3. HLA-G二量体が、HLA-G のアミノ酸配列の第42番目のシステイン残基間で、HLA-G同士が分子間ジスルフィド結合により連結されたものである、請求項１または２に記載する予防または治療剤。
  4. HLA-G（単量体）を有効成分とする製剤であって、関節リウマチ若しくは関節リウマチに起因して生じる疾患に罹患しているか、または当該疾患を発症し得る患者に、少なくとも２か月間に１回の割合で局所投与される製剤形態を有するものである、請求項１または２に記載する予防または治療剤。
  5. HLA-Gの二量体を有効成分とする製剤であって、関節リウマチ若しくは関節リウマチに起因して生じる疾患に罹患しているか、または当該疾患を発症し得る患者に、少なくとも３か月間に１回の割合で局所投与される製剤形態を有するものである、請求項１または２に記載する予防または治療剤。
  6. HLA-Gまたはその二量体を有効成分とする組成物を、関節リウマチ若しくは関節リウマチに起因して生じる疾患に罹患しているか、または当該疾患を発症し得る患者に、有効量投与する工程を有する、関節リウマチ若しくは関節リウマチに起因して生じる疾患の予防または治療方法。
  7. HLA-Gが下記（a）または（b）に記載するタンパク質である、請求項６に記載する方法：
    （a）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （b）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第42番目のアミノ酸を除く、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ白血球Ig様受容体及び／又はCD8との結合活性を有するタンパク質。
  8. HLA-G二量体が、HLA-G のアミノ酸配列の第42番目のシステイン残基間で、HLA-G同士が分子間ジスルフィド結合により連結されたものである、請求項６または７に記載する方法。
  9. 上記組成物がHLA-G（単量体）を有効成分とする医薬製剤であって、関節リウマチ若しくは関節リウマチに起因して生じる疾患に罹患しているか、または当該疾患を発症し得る患者に、少なくとも２か月間に１回の割合で局所投与する工程を有する、請求項６または７に記載する方法。
  10. 上記組成物がHLA-Gの二量体を有効成分とする医薬製剤であって、関節リウマチ若しくは関節リウマチに起因して生じる疾患に罹患しているか、または当該疾患を発症し得る患者に、少なくとも３か月間に１回の割合で局所投与する工程を有する、請求項６または７に記載する方法。
  11. 関節リウマチまたは関節リウマチに起因して生じる疾患の予防または治療の為に使用されるHLA-G若しくはその二量体、またはこれらをHLA-Gまたはその二量体を関節リウマチまたはその関連疾患の予防または治療に有効な割合で含有する医薬組成物。
  12. HLA-Gが下記（a）または（b）に記載するタンパク質である、請求項１１に記載するHLA-G若しくはその二量体、またはこれを含有する医薬組成物。
  13. HLA-G二量体が、HLA-G のアミノ酸配列の第42番目のシステイン残基間で、HLA-G同士が分子間ジスルフィド結合により連結されたものである、請求項１１または１２に記載するHLA-G若しくはその二量体、またはこれを含有する医薬組成物。
  14. 上記医薬組成物がHLA-G（単量体）を有効成分とする製剤であって、関節リウマチ若しくは関節リウマチに起因して生じる疾患に罹患しているか、または当該疾患を発症し得る患者に、少なくとも３か月間に１回の割合で局所投与される製剤形態を有するものである、請求項１１または１２に記載するHLA-G若しくはその二量体、またはこれを含有する医薬組成物。
  15. 上記医薬組成物がHLA-Gの二量体を有効成分とする製剤であって、関節リウマチ若しくは関節リウマチに起因して生じる疾患に罹患しているか、または当該疾患を発症し得る患者に、少なくとも２か月間に１回の割合で局所投与される製剤形態を有するものである、請求項１１または１２に記載するHLA-G若しくはその二量体、またはこれを含有する医薬組成物。
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