JP2002514048A - 短縮型可溶性腫瘍壊死因子ｉ型およびｉｉ型レセプター - Google Patents

短縮型可溶性腫瘍壊死因子ｉ型およびｉｉ型レセプター

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Abstract

(57)【要約】 腫瘍壊死因子の活性を調節する、腫瘍壊死因子結合タンパク質という、タンパク質が開示される。組換え遺伝子工学技法によって腫瘍壊死結合タンパク質を得るためのプロセスもまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 短縮型可溶性腫瘍壊死因子Ｉ型およびII型レセプター 発明の分野 本発明は、炎症の分野に関する。より詳細には、本発明は、短縮型腫瘍壊死因 子レセプター（sTNFR）に関する。 発明の背景 炎症は、機械的損傷、感染、または抗原性刺激によって引き起こされるような 傷害に対する体の防御反応である。炎症が自己抗原のような不適切な刺激によっ て誘導される場合、炎症反応は、病理学的に発現され得、誇張された方法で発現 され、または有害な薬剤の除去後に十分に持続する。このような炎症反応は、特 定のサイトカインの産生を含み得る。 炎症の病因はほとんど理解されないが、炎症の分子的局面に関するかなりの情 報が最近得られている。この調査は、炎症の調停において顕著に現れると考えら れる特定のサイトカインの同定を導いた。サイトカインは、細胞、特にサイトカ イン合成および放出の直ぐの領域（immediate area）における細胞の挙動を改変 する細胞外タンパク質である。腫瘍壊死因子（TNF）は、単球およびマクロファ ージを含む多くの細胞タイプによって産生されるサイトカインのクラスである。 少なくとも２つのTNF、詳細には、TNFアルファ（TNFα）およびTNFベータ（TN Fβまたはリンホトキシン）がこれまでに記載されており、そしてそれぞれはト リマー分子として活性であり、そして架橋レセプターによって細胞シグナルを開 始すると考えられる（Engelmannら(1990)，J．Biol．Chem.，265:14497-14504） 。 証拠のいくつかの情報は、主要な炎症性サイトカインとしてTNF-αおよびTNF- βに関連する。これらの公知のTNFは、感染および傷害のような種々の刺激に対 する炎症性応答に関連する多くの異なる標的細胞における重要な生理学的効果を 有する。タンパク質は、線維芽細胞と滑液細胞の両方に潜在型コラゲナーゼおよ びプロスタグランジンE2を分泌させ、そして骨細胞に骨吸収を刺激させる。これ らのタンパク質は、好中球について内皮細胞の表面接着特性を増加させる。これ らはまた、内皮細胞に凝固活性を分泌させ、そして凝血を溶解するそれらの能力 を減少させる。さらに、これらは、酵素リポタンパク質リパーゼの発現を阻害す ることによって脂質の貯蔵でない方向に脂肪細胞の活性を向け直す。TNFはまた 、肝細胞に「急性期反応物」として公知のタンパク質のクラスを合成させ、これ は発熱物質として視床下部に作用する（Selbyら(1988)，Lancet，1(8583):483； Starnes，Jr.ら(1988)，J．Clin．Invest.，82:1321；Oliffら(1987)，Cell，50 :555；およびWaageら(1987)，Lancet，1(8529):355）。さらに、慢性関節リウマ チを含む炎症の種々の予測動物モデルでの前臨床結果は、TNFの阻害が疾患の進 行および重篤度に主要な衝撃を有し得ることを示唆している（Dayerら(1994)，E uropean Cytokine Network，5(6):563-571およびFeldmannら(1995)，Annals Of The New York Academy Of Sciences，66:272-278）。さらに、TNFのインヒビタ ーでの慢性関節リウマチにおける最近の予備的なヒト臨床試験は、有望な結果を 示している（Rankinら(1995)，British Journal Of Rheumatology，3(4):4334-4 342；Elliottら(1995)，Lancet，344:1105-1110；Takら(1996)，Arthritis and Rheumatism，39:1077-1081；およびPaleologら(1996)，Arthritis and Rheumati sm，39:1082-1091）。 TNFのタンパク質インヒビターが当該技術分野で開示される。EP 308 378は、 発熱患者の尿由来のタンパク質がTNF阻害活性を有することを報告する。このタ ンパク質の効果は、おそらくレセプターのレベルでの競合メカニズムによる。EP 308 378は、そのＮ末端によって特徴づけられるために十分に純粋なタンパク質 を開示する。しかし、この参考文献は、何らDNA配列または組換え産生されたTNF インヒビターを教示しない。 組換え産生したTNFインヒビターはまた、当該技術分野で教示されている。例 えば、EP 393 438およびEP 422 339は、成熟組換えヒト「30kDa TNFインヒビタ ー」（p55レセプターとしておよびsTNFR-Iとしても公知である）および成熟組換 えヒト「40kDaインヒビター」（p75レセプターとしておよびsTNFR-IIとしても公 知である）ならびにその改変した形態、例えば、フラグメント、機能的誘導体、 および改変体のアミノ酸および核酸配列を教示する。EP 393 438およびEP 422 3 39はまた、インヒビターをコードする原因の遺伝子を単離し、適切なベクターお よび細胞タイプで遺伝子をクローニングし、そしてインヒビターを産生するため の遺伝子を発現するための方法を開示する。成熟組換えヒト30kDa TNFインヒビ ターおよび成熟組換えヒト40kDa TNFインヒビターは、TNFを阻害し得ることが証 明されている（EP 393 438、EP 422 339、PCT公開第WO 92/16221号、およびPCT 公開第WO 95/34326号）。 sTNFR-IおよびsTNFR-IIは、神経成長因子レセプター（NGF）、Ｂ細胞抗原CD40 、4-1BB、ラットＴ細胞抗原MRC OX40、Fas抗原、ならびにCD27およびCD30抗原を 含む、レセプターの神経成長因子／TNFレセプタースーパーファミリーのメンバ ーである（Smithら(1990)，Science，248:1019-1023）。細胞表面レセプターの この群の中で最も保存された特徴は、システインリッチな細胞外リガンド結合ド メインであり、これは、約40アミノ酸の４つの繰り返しモチーフに分割され得、 そして良好に保存される位置に４〜６システイン残基を含む（Smithら(1990)， 前出）。 EP 393 438は、40kDa TNFインヒビターΔ51および40kDa TNFインヒビターΔ53 をさらに教示し、これらは全長組換え40kDa TNFインヒビタータンパク質の短縮 型であり、ここで成熟タンパク質のカルボキシル末端で、51または53アミノ酸残 基が、それぞれ除去される。したがって、当業者は、30kDa TNFインヒビターお よび40kDaインヒビターのそれぞれの第４ドメインが、TNF阻害に必要ではないこ とを理解する。実際、種々のグループがこの理解を確認している。30kDaおよび4 0kDa TNFインヒビターのドメイン欠失誘導体が生成され、そして第４ドメインを 含まない誘導体は全TNF結合活性を保持するが、第１、第２、または第３ドメイ ンを含まない誘導体はそれぞれTNF結合活性を保持しない（Corcoranら(1994)，E ur．J．Biochem.，223:831-840；Chih-Hsuehら(1995)，The Journal of Biologi cal Chemistry，270(6):2874-2878；およびScallonら(1995)，Cytokine，7(8):7 59-770）。 30kDa TNFインヒビターおよび40kDa TNFインヒビターによって示される細胞傷 害性の比較的低い阻害（Butlerら(1994)，Cytokine，6(6):616-623）のため、 種々のグループがTNFインヒビタータンパク質のダイマーを作製した（Butlerら( 1994)，前出；およびMartinら(1995)，Exp．Neurol.，131:221-228）。しかし、 ダイマーは、抗体応答を生じ得る（Martinら(1995)，前出；およびFisherら(199 6)，The New England Journal of Medicine，334(26):1697-1702）。 本発明の目的は、機能的に活性な短縮型sTNFRを提供することである。本発明 のこのおよび他の目的は、以下の本明細書の記載から明らかになる。 発明の要旨 本発明は、それぞれsTNFR-IおよびsTNFR-IIの機能的に活性な短縮型に関し、 そして本明細書では「短縮型sTNFR」という。短縮型sTNFRは、第４ドメイン（sT NFR-Iのアミノ酸残基Thr127-Asn161およびsTNFR-IIのアミノ酸残基Pro141-Thr17 9 ）；第３ドメイン（sTNFR-Iのアミノ酸残基Asn111-Cys126およびsTNFR-IIのア ミノ酸残基Pro123-Lys140）の一部を含まない；そして、必要に応じて、第１ド メイン（sTNFR-Iのアミノ酸残基Asp1-Cys19およびsTNFR-IIのアミノ酸残基Leu1- Cys32）の一部を含まない、sTNFR-IおよびsTNFR-IIの改変型である。TNF（例え ば、TNF-αおよび／またはTNF-β）のこれらの新しいインヒビターは、一般的な 適用性を有する。 本発明の短縮型sTNFRは、式R1-[Cys19-Cys103]-R2およびR4-[Cys32-Cys115]-R5 によって表されるタンパク質を含む。これらのタンパク質は、それぞれsTNFR-I およびsTNFR-IIの短縮型である。 「R1-[Cys19-Cys103]-R2」とは、[Cys19-Cys103]がsTNFR-Iの残基19〜103を表 す１つ以上のタンパク質を意味し、このアミノ酸残基番号付け図は、比較を容易 にするために図１（配列番号２）に提供される；ここで、R1は、Cys19のまたは 以下の群から選択されるアミノ末端アミノ酸残基の、メチオニル化または非メチ オニル化アミン基を表し： そして、ここでR2は、Cys103のまたは以下の群から選択されるカルボキシ末端ア ミノ酸残基の、カルボキシ基を表し： およびそれらの改変体、ただし、R1がアミノ酸配列VCPQGKYIHPQNNSICのメチオニ ル化または非メチオニル化アミン基あるいは１〜15残基のそのＮ末端短縮型を表 す場合、R1-[Cys19-Cys103]-R2タンパク質は、式R1-[Cys19-Cys103]-FCCSLCL-R3 を有する付加改変体ではなく、ここでR3は図１のアミノ酸配列Asn111-Asn161の カルボキシル基またはそのカルボキシ末端短縮型を表す。 本発明の代表的短縮型sTNFR-Iは、以下の分子を含む：NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNS IC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH（sTNFR-I 2.6D/C105ともいう）；NH2-MDSVCPQGKYIH PQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH（sTNFR-I 2.6D/C106ともいう）；NH2-MDSV CPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH（sTNFR-I 2.6D/N105ともいう）；NH2 -MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH（sTNFR-I 2.3D/d8ともいう）；NH2-M -[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH（sTNFR-I 2.3D/d18ともいう）；およびNH2-MSIS-[ Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH（sTNFR-I 2.3D/d15ともいう）、メチオニル化または 非メチオニル化のいずれか、ならびにその改変体および誘導体。 「R4-[Cys32-Cys115]-R5」とは、[Cys32-Cys115]がsTNFR-Iの残基Cys32〜Cys1 15 を表す１つ以上のタンパク質を意味し、このアミノ酸残基番号付け図は、比較 を容易にするために図８（配列番号35）に提供される；ここで、R4は、Cys32の または以下の群から選択されるアミノ末端アミノ酸残基の、メチオニル化または 非メチオニル化アミン基を表し： そして、ここでR5は、Cys115のまたは以下の群から選択されるカルボキシ末端ア ミノ酸残基の、カルボキシ基を表し： およびそれらの改変体、ただし、R4がアミノ酸配列TCRLREYYDQTAQMCのメチオニ ル化または非メチオニル化アミン基あるいは１〜15残基のそのＮ末端短縮型を表 す場合、R4-[Cys32-Cys115]-R5は、式R4-[Cys32-Cys115]-APLRKCR-R6を有する付 加改変体ではなく、ここでR6は図８のアミノ酸配列Pro123-Thr179のカルボキシ ル基またはそのカルボキシ末端短縮型を表す。 本発明の１つの局面では、短縮型sTNFRは、グリコシル化または非グリコシル 化の形態で作成され得る。短縮型sTNFRは、組換え遺伝子工学技法によって産生 される。代わりの実施態様では、短縮型sTNFRは、化学的技法または組換えおよ び化学的技法の組み合わせによって合成される。 本発明の別の局面では、短縮型sTNFRは、短縮型sTNFRを水溶性ポリマーに接着 することによって誘導体化され得る。例えば、短縮型sTNFRは、分子の見かけの 分子量を増加させることによって、薬学速度論的性能を改良するために、１つ以 上のポリエチレングリコール分子に結合され得る。 本発明のさらに他の局面は、短縮型sTNFRをコードする種々のポリヌクレオチ ドを含む。適切な核酸配列には、例えば、特に図に示される配列ならびにその縮 重配列および天然に存在する対立遺伝子改変体が含まれる。このような核酸配列 は、真核生物または原核生物の宿主細胞における短縮型sTNFRの発現に使用され 得、ここで発現産物またはその誘導体はTNFの活性を調節するための能力によっ て特徴づけられる。 本発明のさらなる局面は、増幅および／または発現制御配列に作動可能に連結 された短縮型sTNFRをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。原核 生物および真核生物の両方の宿主細胞は、短縮型sTNFRを発現するためにこのよ うなベクターで安定に形質転換またはトランスフェクトされ得る。本発明は、短 縮型sTNFRの組換え産生をさらに含み、ここでこのようなポリヌクレオチドを含 む宿主細胞は、適切な栄養培地中で増殖され、そして、必要に応じて、細胞によ って発現される短縮型sTNFRは、宿主細胞および／または栄養培地から単離され る。 本発明の他の局面は、短縮型sTNFRまたはその誘導体を含む薬学的組成物を含 む。代表的には、短縮型sTNFRまたはその誘導体は、薬学的に受容可能なビヒク ルとともに処方され得る。種々の他の処方物質は、短縮型sTNFRまたはその誘導 体の製造、貯蔵、取り扱い、送達、および／または効力を容易にするために使用 され得る。 本発明の他の局面は、TNFの活性を調節する方法に関する。詳細には、TNF媒介 性疾患（例えば、TNF-αおよび／またはTNF-βによって媒介される疾患）は、短 縮型sTNFRまたはその誘導体の治療的有効量を患者に投与することによって処置 され得る。 短縮型sTNFRをコードするポリヌクレオチドはまた、細胞治療または遺伝子治 療適用に使用され得る。 本発明の短縮型sTNFRは、タンパク質の大規模量の産生に特に適する。例えば 、sTNFR-Iは、アミノ酸配列111〜126（アミノ酸Asn111-Gly126）内の脱アミノ部 位を有する。この部位の不在は、精製されたタンパク質の生化学的安定性を増強 することが予測され、可能な分解産物を減少させそしてより貯蔵安定なタンパク 質を生じる。短縮型sTNFRは、他の既に開示されたTNFインヒビタータンパク質よ りも少ないジスルフィド架橋を有する。例えば、sTNFR-Iは、アミノ酸配列111〜 126内に２つのジスルフィド架橋およびアミノ酸配列127〜161内に３つのジスル フィド架橋を有する；そして、sTNFR-IIは、Cys121とCys139との間、Cys142とCy s157との間、およびCys163とCys178との間に１つのジスルフィド架橋を有する。 ジスルフィド架橋の数の減少は、より多数のこれらの結合がタンパク質の再折り 畳みプロセスを複雑にし得るという点で重要である。驚くべきことに、短縮型sT NFRは、抗原エピトープに対して、他の既に開示されたTNFインヒビタータンパク 質よりも少数の部位を有し（例えば、第１の３つのドメインを有するsTNFR-Iの 短くなった形態が、特定の残基を曝露することによって生じる新しい（neo-）エ ピトープである、実施例IIIを参照のこと）、比較的減少した抗原性を生じ、そ して繰り返した投与でのクリアランス速度に有意な減少を有さない。短縮型sTNF Rの減少した免疫原性は、TNF媒介性疾患、特に慢性炎症性疾患を含む疾患の処置 に適切であることが予測される。 本発明の追加の局面および利点は、以下の説明の考慮によって当業者に明らか であり、これは本発明の実施を詳述する。 図面の簡単な説明 本発明の多くの局面および利点は、図面の検討によって明らかになる。 図１は、全長組換えヒトsTNFR-Iである、Asp1-Asn161をコードする核酸配列（ 配列番号１）を示す。Asp1-Asn161のアミノ酸配列（配列番号２）も示される。 図２は、NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH（sTNFR-I 2.6D/ C105ともいう）をコードする核酸配列（配列番号３）を示す。NH2-MDSVCPQGKYIH PQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOHのアミノ酸配列（配列番号４）も示される。 図３は、NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH（sTNFR-I 2.6 D/C106ともいう）をコードする核酸配列（配列番号５）を示す。NH2-MDSVCPQGKY IHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOHのアミノ酸配列（配列番号６）も示され る。 図４は、NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH（sTNFR-I 2.6D/N 105ともいう）をコードする核酸配列（配列番号７）を示す。NH2-MDSVCPQGKYIHP QNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOHのアミノ酸配列（配列番号８）も示される。 図５は、NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH（sTNFR-I 2.3D/d8とも いう）をコードする核酸配列（配列番号11）を示す。NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC- [Cys19-Cys103]-FNCSL-COOHのアミノ酸配列（配列番号12）も示される。 図６は、NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH（sTNFR-I 2.3D/dl8ともいう）を コードする核酸配列（配列番号９）を示す。NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH のアミノ酸配列（配列番号10）も示される。 図７は、NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH（sTNFR-I 2.3D/dl5ともいう） をコードする核酸配列（配列番号13）を示す。NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL- COOHのアミノ酸配列（配列番号14）も示される。 図８は、成熟組換えヒトsTNFR-IIである、Leu1-Thr179をコードする核酸配列 （配列番号34）を示す。Leu1-Thr179のアミノ酸配列（配列番号35）も示される 。 図９は、実施例IIに記載されるような、Streptococcusの細胞壁誘導された再 活性化モデルにおいて誘導された腫脹の量を示す。 図10は、実施例IIIに記載のような、0.2mg/kgの静脈内注入の２分後の健常ヒ ヒにおけるsTNFR-I 4D/C105dbの血漿プロフィルを示す。 図11は、実施例IIIに記載のような、0.2mg/kgの静脈内注入の２分後の健常ヒ ヒにおけるsTNFR-I 3D/C105dbの血漿プロフィルを示す。 図12は、実施例IIIに記載のような、0.2mg/kgの静脈内注入の２分後の健常ヒ ヒにおけるsTNFR-I 2.6D/C105dbの血漿プロフィルを示す。 図13は、実施例IIIに記載のような、種々のダイマーsTNFR-I構築物の用量とク リアランスとの間の関連を示す。 発明の詳細な説明 本発明は、sTNFR-IおよびsTNFR-IIが、それぞれ、第４ドメインだけでなく第 ３ドメインの一部、および必要に応じて第１ドメインの一部も排除するようにサ イズを減少され得、そして生物学的活性をなお保持しそして減少した抗原性を有 するという予期されない発見に基づく。少なくとも以下の理由のため、これらの 生物学的に活性な短縮型sTNFRまたはその誘導体を産生することは有利であると 考えられる。第１に、これらの分子は、不安定化する可能性のより少ない１つの 脱アミド化部位を有し得る。第２に、これらの分子は、より少ないジスルフィド 架橋を有し、このことは、おそらく再折り畳みおよび精製を容易にする。第３に 、これらの分子は、減少した潜在的な抗原エピトープ部位を有する。 本明細書で使用される場合、用語「短縮型sTNFR」は、以下に記載のように、 式R1-[Cys19-Cys103]-R2またはR4-[Cys32-Cys115]-R5の１つ以上の生物学的に活 性な合成または組換え分子、およびその改変体（挿入、置換、および欠失改変体 を含む）を含む。 用語「生物学的に活性」とは、本明細書で使用される場合、短縮型sTNFRが、 類似のTNF阻害特性を示すことを意味するが、sTNFR-Iおよび／またはsTNFR-IIと 同じ特性のすべてを示し、そして同じ程度に示すことを必ずしも意味しない。一 般に、短縮型sTNFRおよびその誘導体は、TNFを阻害する能力を有する。短縮型sT NFRのバイオアッセイは、以下の実施例IIにさらに記載される。目的の特定のTNF 阻害特性の選択は、短縮型sTNFRの所望の使用に依存する。 本発明の１つの局面では、短縮型sTNFRは、細菌、哺乳動物、または昆虫細胞 系で組換え技法によって有利に産生され得、そしてタンパク質のグリコシル化ま たは非グリコシル化のいずれかの形態であり得る。あるいは、短縮型sTNFRは化 学的に合成され得る。現在好ましい産生方法は、以下により詳細に記載される。 短縮型sTNFRはそれぞれ、代表的には、他のタンパク質性物質（すなわち、非 短縮型sTNFR）が実質的に存在しないように単離および精製され得る。好ましく は、短縮型sTNFRは、短縮型sTNFRの製造に使用される産生技法に起因して存在し 得る他のタンパク質の約80％を含まない。より好ましくは、短縮型sTNFRは、他 のタンパク質の約90％を含まず、特に好ましくは、他のタンパク質の約95％を含 まず、そして最も好ましくは他のタンパク質の約98％より多くを含まない。しか し、以下にさらに詳細に記載されるように、所望のタンパク質が、投与前に他の 活性成分、化学組成物および／または適切な薬学的処方物物質と組み合わされ得 ることが理解される。短縮型sTNFR １つの基本的実施態様では、本発明の短縮型sTNFRは、以下の式によって表さ れる１つ以上のタンパク質およびそれらの改変体であり得る： R1-[Cys19-Cys103]-R2 ここで、[Cys19-Cys103]は、sTNFR-Iの残基19〜103を表し、このアミノ酸残基番 号付けスキームは、比較を容易にするために図１（配列番号２）に提供される； ここで、R1は、Cys19のまたは以下の群から選択されるアミノ末端アミノ酸残基 の、メチオニル化または非メチオニル化アミン基を表し： そして、ここでR2は、Cys103のまたは以下の群から選択されるカルボキシ末端ア ミノ酸残基の、カルボキシ基を表す： ただし、R1がアミノ酸配列VCPQIGKYIHPQNNSICのメチオニル化または非メチオニ ル化アミン基あるいはその１〜15残基のＮ末端短縮型を表す場合、R1-[Cys19-Cy s103]-R2は、式R1-[Cys19-Cys103]-FCCSLCL-R3を有する付加改変体ではなく、こ こでR3は図１のアミノ酸配列Asn111-Asn161のカルボキシル基またはそのカルボ キシ末端短縮型を表す。 他の基本的実施態様では、本発明の短縮型sTNFRは、以下の式によって表され る１つ以上のタンパク質およびそれらの改変体であり得る： R4-[Cys32-Cys115]-R5 ここで、[Cys32-Cys115]はsTNFR-IIの残基Cys32〜Cys115を表し、このアミノ酸 残基番号付けスキームは、比較を容易にするために図８（配列番号35）に提供さ れる；ここで、R4は、Cys32のまたは以下の群から選択されるアミノ末端アミノ 酸残基の、メチオニル化または非メチオニル化アミン基を表し： そして、ここでR5は、Cys115のまたは以下の群から選択されるカルボキシ末端ア ミノ酸残基の、カルボキシ基を表し：ただし、R4がアミノ酸配列TCRLREYYDQTAQMCのメチオニル化または非メチオニル 化アミン基あるいはその１〜15残基のＮ末端短縮型を表す場合、R4-[Cys32-Cys1 15 ]-R5は、式R4-[Cys32-Cys115]-APLRKCR-R6を有する付加改変体ではなく、ここ でR6は図８のアミノ酸残基Pro123-Thr179のカルボキシル基またはそのカルボキ シ末端短縮型を表す。 本発明の他の局面は、メチオニル化されたかまたはメチオニル化されていない かいずれかの、R1-[Cys19-Cys103]-R2およびR4-[Cys32-Cys115]-R5の１つ以上の 改変体を含む。したがって、用語「短縮型sTNFR」は、R1-[Cys19-Cys103]-R2お よびR4-[Cys32-Cys115]-R5の１つ以上の天然に存在する対立遺伝子改変体、およ び、アミノ酸がR1-[Cys19-Cys103]-R2またはR4-[Cys32-Cys115]-R5のアミノ酸配 列内の残基から欠失（「欠失改変体」）、残基に挿入（「付加改変体」）、また は残基に置換（「置換改変体」）されている１つ以上の他の改変体タンパク質を 含む。 アミノ酸配列欠失は、タンパク質の折り畳みを破壊しないように、代表的には 約20アミノ酸残基、より代表的には約１〜10残基、そして最も代表的には約１〜 ５残基の範囲である。Ｎ末端、Ｃ末端、および内部の配列内欠失が考えられる。 総欠失および／または連続欠失の数は、影響を受けるドメインにおけるタンパク 質の三次構造（例えば、システイン架橋）を保存するように選択される。 R1-[Cys19-Cys103]-R2アミノ酸配列内およびR4-[Cys32-Cys115]-R5アミノ酸配 列内の欠失は、細胞表面膜タンパク質の群におけるNGF/TNFレセプターファミリ ーの他のメンバーの配列との低い相同性の領域に作成され得る。R1-[Cys19-Cys1 03 ]-R2アミノ酸配列内およびR4-[Cys32-Cys115]-R5アミノ酸配列内の欠 失は、NGF/TNFレセプターファミリーの他のメンバーの配列と実質的な相同性の 領域で作成され得、そしておそらく生物学的活性を著しく改変する。詳細には、 NGF/TNFレセプターファミリーメンバー中の配列類似性は、ドメイン１の最初の 二つのジスルフィドループ、ドメイン２の全体、およびドメイン３の最初のジス ルフィドループに対応する領域で特異に高い（Bannerら(1993)，Cell，73:431-4 45）。例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2の２つの代表的欠失改変体は、R1-[Cys19( ΔThr20)-Cys103]-R2およびR1-[Cys19(ΔCys19-Lys21)-Cys103]-R2であり、ここ で、R1およびR2は上で定義される。例えば、R4-[Cys32-Cys115]-R5の３つの代表 的欠失改変体は、R4-[Cys32-(ΔCys115)Cys115]-R5；R1-[Cys19(ΔCys115-Lys11 5 )-Cys103]-R2、およびR4-[Cys32-(ΔCys115-Arg113)Cys115]-R5であり、ここで R1およびR2は上で定義される。 アミノ酸配列付加は、長さが１残基から100残基以上の範囲のアミノおよび／ またはカルボキシル末端融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の内部 配列内挿入を含み得る。内部付加は、代表的には約１〜10アミノ酸残基、より代 表的には約１〜５アミノ酸残基、そして最も代表的には約１〜３アミノ酸残基の 範囲であり得る。 アミノ末端付加改変体は、メチオニン（例えば、細菌組換え細胞培養物におけ るタンパク質の直接発現の人工物として）または追加のアミノ酸残基もしくは配 列の付加を含む。アミノ末端挿入のさらなる例は、組換え宿主細胞からのタンパ ク質の分泌を容易にするために、シグナル配列との融合体ならびに他のプレ-プ ロ配列との融合体あるいはシグナル配列および他のプレ-プロ配列との融合体を 含む。天然のsTNFR-IまたはsTNFR-IIシグナル配列を認識およびプロセシングし ない原核生物宿主細胞については、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファ ターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群より 選択される原核生物シグナル配列によって置換され得る。酵母細胞については、 シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼ、α因子、または酸性ホスファタ ーゼリーダー配列の群から選択され得る。哺乳動物細胞発現では、sTNFR-Iまた はsTNFR-IIの天然のシグナル配列（EP 393 438およびEP 422 339）は満足である が、他の哺乳動物シグナル配列も適切であり得る（例えば、他のNGF/TNFレセプ ターファミリーメンバーに由来する配列）。 カルボキシ末端付加改変体は、それぞれsTNFR-IまたはsTNFR-IIの再構成を生 じる１つ以上のアミノ酸残基の付加を含まない。カルボキシ末端付加改変体が、 sTNFR-IまたはsTNFR-IIの第３ドメインまたは第４ドメインの再構築を生じる１ つ以上のカルボン酸残基の付加を含まない。カルボキシ末端付加改変体の例は、 ヒト免疫グロブリンの重または軽鎖の定常ドメインのすべてまたは一部とR1-[Cy s19-Cys103]-R2またはR4-[Cys32-Cys115]-R5との融合体を含むキメラタンパク質 を含む。それぞれの免疫グロブリン部分が、IgG、IgA、IgM、またはIgE、特にIg G、例えばIgG1またはIgG3のような、ヒト免疫グロブリンの重鎖定常領域の第１ ドメイン以外のすべてのドメインを含む、このようなキメラタンパク質が好まし い。TNF結合部分がなおTNFと結合しそして免疫グロブリン部分がその特徴的特性 の１つ以上を示す限り、それぞれの免疫グロブリン部分の任意のアミノ酸が、１ つ以上のアミノ酸が欠失させられ得ること、または１つ以上のアミノ酸と置換さ れ得ること、あるいは１つ以上のアミノ酸が付加され得ることを、当業者は理解 する。 他の群の改変体は、アミノ酸置換改変体である。これらの改変体はそれぞれ、 R1-[Cys19-Cys103]-R2またはR4-[Cys32-Cys115]-R5中の少なくとも１つのアミノ 酸残基が除去され、そしてその位置に異なる残基を挿入されている。置換改変体 は対立遺伝子改変体を含み、これはアミノ酸変化を生じても生じなくてもよい種 集団における天然に存在するヌクレオチド配列変化によって特徴づけられる。当 業者は、可能な変異部位の選択においてポリペプチドの結合または活性部位につ いて公知の任意の情報を使用し得る。 タンパク質の変異誘発のためのアミノ酸残基または領域を同定するための１つ の方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる（CunninghamおよびWe lls(1989)，Science，244,:1081-1085、その開示は参考として本明細書に援用さ れる）。この方法では、タンパク質のアミノ酸残基または標的残基群が、同定さ れ（例えば、Arg、Asp、His、Lys、またはGluのような荷電残基）、そして細胞 の内または外の周囲水性環境とのそのアミノ酸の相互作用をもたらすために、中 性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニ ン）によって置換される。次いで、置換に対する機能的感受性を示す残基は、置 換の部位で追加または代わりの残基を導入することによって純化される(refine) 。したがって、アミノ酸配列改変を導入するための部位は予め決定され、そして 、所定の部位で変異の性能を最適にするために、アラニンスキャニングまたはラ ンダム変異誘発が行われ得、そして得られる改変体ポリペプチドが、所望の活性 および活性の程度の最適な組み合わせについてスクリーニングされ得る。 置換変異誘発のための目的の部位は、R1-[Cys19-Cys103]-R2またはR4-[Cys32- Cys115]-R5に見出されるアミノ酸が、他の種々の種のまたはNGF/TNFレセプター ファミリーの他のメンバーのsTNFRのようなsTNFR様タンパク質とは、側鎖バルク 、電荷、および／または疎水性の点で実質的に異なる部位を含む。 目的の他の部位は、特定の残基が、このようなsTNFR-I様タンパク質およびsTN FR-II様タンパク質の残基と類似するかまたは同一である部位を含む。このよう な位置は、一般的に、タンパク質の生物学的活性に重要である。例えば、当業者 は、本発明の前に、sTNFR-IおよびsTNFR-IIを短縮することのそれぞれの三次元 構造に対する効果が予測可能ではなかったことを理解している。しかし、本明細 書で開示された結果があれば、当業者は、改変体を作成するためのストラテジー を開発することの第１原理が、sTNFR-IおよびsTNFR-IIの全長について既に明ら かにされた情報に部分的に頼り得ることを認める。したがって、以下の情報は、 sTNFR-Iに関して明らかにされでいる（Bannerら(1993)，前出、およびFuら(1995 )，Protein Engineering，8(12):1233-1241）。ドメイン１における残基Tyr9、T hr39、His55、ドメイン２における残基Phe49、Ser63、Asp82、ならびにドメイン ３における残基Tyr92、およびSer107は、それぞれ、ドメイン１、２、および３ の構造の安定化に潜在的に重要であると同定されている。残基Pro12およびHis55 は、TNFαのサブユニットＣ上のSer86-Tyr87と潜在的に相互作用すると同定され ている。残基Glu45-Phe49は、TNFαサブユニットＡの残基Leu29-Arg32と潜在的 に相互作用するループに存在すると同定されている。残基Gly48は、TNFαのサブ ユニットＡ上のAsn19-Pro20と潜在的に相互作用すると同定されている。残基His58 -Leu60は、伸長された鎖コンフォメーションに存在すると同定されており、そ してTNFαのサブユニットＡ上の残基Arg31-Ala33との側鎖相互作 用を有すると同定されている。sTNFR-Iの残基His58は、残基Arg31と特異的に相 互作用する。残基Lys64-Arg66は、伸長された鎖コンフォメーションに存在する と同定されており、そしてTNFαのサブユニットＡ上の残基Ala145-Glu146および 残基Glu46との側鎖および主鎖相互作用を有すると同定されている。残基Met69は 、TNFαのサブユニットＡ上の残基Tyr115と潜在的に相互作用すると同定されて いる。残基His94-Phe101は、TNFαのサブユニットＣの残基Thr72-Leu75およびAs n137と相互作用するループを形成すると同定されている。sTNFR-Iの残基Trp96は 、TNFαのサブユニットＣ上の残基Ser71-Thr72と特異的に相互作用し、sTNFR-I のLeu100は、TNFαのサブユニットＣ上の残基Asn137と密接して存在し、そしてs TNFR-Iの残基Gln102は、TNFαのサブユニットＡ上の残基Pro113と特異的に相互 作用する。したがって、当業者は、まず第一に、これらの部位が、比較的保存さ れた様式の置換によって改変されるべきであることを認識する。 このような保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで表１に示される。この ような置換が生物学的活性の変化を生じるならば、より実質的な変化（「代表的 置換」）が導入され得、そして／または他の付加／欠失が行われ得、そして得ら れる産物がスクリーニングされる。 等しい性質のこのような変化を作成することにおいて、アミノ酸のハイドロパ シーインデックスが考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に 基づくハイドロパシーインデックスが帰属されており、これらは、イソロイシン (+4.5)；バリン(+4.2)；ロイシン(+3.8)；フェニルアラニン(+2.8)；システイン ／シスチン(+2.5)；メチオニン(+1.9)；アラニン(+1.8)；グリシン(-0.4)；トレ オニン(-0.7)；セリン(-0.8)；トリプトファン(-0.9)；チロシン(-1.3)；プロリ ン(-1.6)；ヒスチジン(-3.2)；グルタミン酸(-3.5)；グルタミン(-3.5)；アスパ ラギン酸(-3.5)；アスパラギン(-3.5)；リジン(-3.9)；およびアルギニン(-4.5) である。 タンパク質における相互作用的な生物学的機能に関するハイドロパシーアミノ 酸インデックスの重要性は、一般的に当該技術分野で理解される（KyteおよびDo olittle(1982)，J．Mol．Biol.，157:105-131、その開示は参考として本明細書 に援用される）。あるアミノ酸が、類似のハイドロパシーインデックスまたはス コアを有する他のアミノ酸に置換され得、そしてなお類似の生物学的活性を保持 することが公知である。ハイドロパシーインデックスに基づく変化を作成するこ とにおいて、ハイドロパシーインデックスが±2以内であるアミノ酸の置換が好 ましく、±1以内である置換が特に好ましく、そして±0.5以内である置換がさら により特に好ましい。 本発明の場合のように、特に、置換によって生成される生物学的機能等価なタ ンパク質またはペプチドが免疫学的実施態様における使用を意図する場合、類似 のアミノ酸の置換が、ハイドロパシーを基準として効果的に作成され得ることも 理解される。 米国特許4,554,101（その開示は参考として本明細書に援用される）は、隣接 アミノ酸のハイドロパシーによって調節される場合、タンパク質の最大局所平均 親水性が、免疫原性および抗原性と、すなわち、タンパク質の生物学的特性と相 関することを述べる。 米国特許4,554,101に詳述されるように、以下の親水性値は、アミノ酸残基に 帰属されている：アルギニン(+3.0)；リジン(+3.0)；アスパラギン酸(+3.0±1) ；グルタミン酸(+3.0±1)；セリン(+0.3)；アスパラギン(+0.2)；グルタミン(+0 .2)；グリシン(0)；トレオニン(-0.4)；プロリン(-0.5±1)；アラニン(-0.5)； ヒスチジン(-0.5)；システイン(-1.0)；メチオニン(-1.3)；バリン(-1.5)；ロイ シン(-1.8)；イソロイシン(-1.8)；チロシン(-2.3)；フェニルアラニン(-2.5)； トリプトファン(-3.4)。 類似の親水性値に基づく変化を作成することにおいて、親水性値が±2以内で あるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内である置換が特に好ましく、そして±0 .5以内である置換がさらにより特に好ましい。 米国特許4,554,101はまた、親水性を基準として一次アミノ酸配列からのエピ トープの同定および調製を教示する。米国特許4,545，101に開示される方法によ って、当業者は、本明細書に開示されたsTNFR配列のようなアミノ酸配列内から エピトープを同定することができる。これらの領域はまた、「エピトープコア領 域」ともいう。 多くの科学刊行物は、アミノ酸配列の分析からの、二次構造の予測、およびエ ピトープの同定に向いている(ChouおよびFasman(1974)，Biochemistry，13(2):2 22-245；ChouおよびFasman，Biochemistry，113(2):211-222；ChouおよびFasman (1978)，Adv．Enzymol．Relat．Areas Mol．Biol.，47:45-148；ChouおよびFasm an，Ann．Rev．Biochem.，47:251-276、およびChouおよびFasman(1979)，Biophy s．J.，26:367-384、これらの開示は参考として本明細書に援用される）。さら に、コンピュータプログラムが、現在、タンパク質の抗原性部分およびエピトー プコア領域を予測することの補助に利用可能である。例としては、Jameson-Wolf 分析に基づくプログラム（IamesonおよびWolf（1998)，Comput．Appl．Biosci. ，4(1):181-186、およびWolfら(1988)，Comput．Appl．Biosci.，4(1):187- （Brutlagら（1990）CABS，6:2:37-245、およびWeinbergerら(1985)，Science，228 :740-742、これらの開示は参考として本明細書に援用される）、およびタン パク質三次構造予測のための他の新しいプログラム（FetrowおよびBryant(1993) ，BIOTECHNOLOGY，11:479-Z183、この開示は参考として本明細書に援用される） が挙げられる。 R1-[Cys19-Cys103]-R2およびR4-[Cys32-Cys115]-R5のアミノ酸配列に対する保 存的改変（およびコードする核酸配列に対する対応する改変）は、改変されたタ ンパク質に類似の機能的および化学的特徴を有するタンパク質を産生することが 予測される。 逆に、R1-[Cys19-Cys103]-R2およびR4-[Cys32-Cys115]-R5の機能的および／ま たは化学的特徴における実質的な改変は、(a)例えば、シートまたはヘリカルコ ンフォメーションのような、置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、(b) 標的部位でのタンパク質の電荷または疎水性、あるいは(c)側鎖のバルク、を維 持することの効果が著しく異なる置換を選択することによって達成され得る。天 然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づく群に分けられる： 1)疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile； 2)中性親水性：Cys、Ser、Thr； 3)酸性：Asp、Glu； 4)塩基性：Asn、Gln、His、Lys、Arg； 5)鎖配向に影響を及ぼす残基：Gly、Pro；および 6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。 非保存的置換は、これらの群の１つのメンバーの別のものへの交換を含み得る 。このような置換された残基は、他のNGF/TNFレセプターファミリーメンバーと 相同または非相同であるR1-[Cys19-Cys103]-R2およびR4-[Cys32-Cys115]-R5の領 域に導入され得る。 R1-[Cys19-Cys103]-R2およびR4-[Cys32-Cys115]-R5の配列の特異的変異は、Ｎ 末端で、Ｃ末端で、あるいはＮ連結したまたはＯ連結した炭水化物の付加によっ て改変されるタンパク質の任意の部位で、非天然アミノ酸の置換を含み得る。こ のような改変は、例えば、アミノ酸（例えば、システイン）の付加において、特 に有用であり得、これは、以下に記載のように、誘導体を形成するために水溶性 ポリマーの連結に有利である。例えば、sTNFR-Iの天然に存在するAsn105がポリ エチレングリコール分子の付加を容易にするためにCysに変化される図５を参照 のこと（実施例Ｉ）。 さらに、R1-[Cys19-Cys103]-R2およびR4-[Cys32-Cys115]-R5の配列は、グリコ シル化部位を付加するため、あるいは、Ｎ連結またはＯ連結したグリコシル化部 位を欠失させるために改変され得る。アスパラギン連結したグリコシル化認識部 位は、適切な細胞グリコシル化酵素によって特異的に認識されるトリペプチド配 列を含む。これらのトリペプチド配列は、Asn-Xaa-ThrまたはAsn-Xaa-Serのいず れかであり、ここで、Xaaは、Pro以外の任意のアミノ酸であり得る。sTNFR-Iの 証明されたまたは予測されたアスパラギン残基は、位置14、105、および111に存 在する。sTNFR-IIの証明されたまたは予測されたアスパラギン残基は、位置149 および171に存在する。種々のアミノ酸置換または欠失は、Ｎ連結またはＯ連結 グリコシル化部位を改変または付加するために作成され得、改変されたグリコシ ル化を有するタンパク質を生じる。 特定の実施態様では、改変体は、R1-[Cys19-Cys103]-R2またはR4-[Cys32-Cys1 15 ]-R5のアミノ酸に実質的に相同である。用語「実質的に相同」とは、本明細書 で使用される場合、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらにより 好ましくは90％以上、または最も好ましくはちょうど95％である相同性の程度を 意味する。本明細書で記載される場合の相同性の割合は、100アミノ酸の長さに おける４つのギャップがその整列で補助するために導入され得る場合に、比較さ れる配列中の同一のアミノ酸残基とともに整列する、２つの配列のより小さい方 に見られるアミノ酸残基の割合として算出される。これは、Dayhoff(1972)，Atl as of Protein Sequence and Struclure，5:124，National Biochemical Resear ch Foundation，Washington，D.C.に記載され、その開示は参考として本明細書 に援用される。それぞれ配列番号２および配列番号35のアミノ酸配列に対する抗 体との交差反応性によって単離され得る、あるいはその遺伝子が配列番号１もし くは配列番号34のDNAとのまたはそのセグメントとのハイブリダイゼーションに よって単離され得る短縮型sTNFRも、実質的に相同として含まれる。 本発明の代表的sTNFRは、以下の分子を含む：NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys1 9 -Cys103]-FC-COOH（sTNFR-I 2.6D/C105ともいう）；NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC- [Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH（sTNFR-I 2.6D/C106ともいう）；NH2-MDSVCPQGKYIH PQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH（sTNFR-I 2.6D/N105ともいう）；NH2-MYIHPQN NSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH（sTNFR-I 2.3D/d8ともいう)；NH2-M-[Cys19-C ys103]-FNCSL-COOH（sTNFR-I 2.3D/d18ともいう）；およびNH2-MSIS-[Cys19-Cys103 ]-FNCSL-COOH（sTNFR-I 2.3D/dl5ともいう）、メチオニル化または非メチオ ニル化のいずれか、ならびにその改変体および誘導体。 改変体短縮型sTNFRの産生は、以下にさらに詳細に記載される。このような改 変体は、短縮型sTNFRをコードずるDNAに適切なヌクレオチド変化を導入すること によって、あるいは所望の短縮型sTNFRのインビトロ化学合成によって調製され 得る。最終短縮型sTNFRが生物学的に活性であるならば、欠失、挿入、および置 換の多くの組み合わせが作成され得ることが、当業者に理解される。 １つ以上の選択されたアミノ酸残基の置換、挿入、または欠失についての変異 誘発技法は、当業者に周知である（例えば、米国特許第4,518,584号、その開示 は参考として本明細書に援用される）。各アミノ酸配列改変体の構築、変異部位 の位置、および変異の性質において２つの主要な変数がある。各改変体を設計す ることにおいて、各変異部位の位置および変異の性質は、改変される生化学的特 徴に依存する。各変異部位は、例えば、(1)達成された結果に依存して、最初に 保存的アミノ酸選択で次いでよりラジカルな選択で置換すること、(2)標的アミ ノ酸残基を欠失すること、または(3)所定の部位に隣接するアミノ酸残基を挿入 することによって、個々にまたは連続して改変され得る。 短縮型sTNFRの化学的に改変された誘導体は、本明細書の開示によれば、当業 者によって調製され得る。結合体は、グリコシル化、非グリコシル化、または脱 グリコシル化した短縮型sTNFRを使用して調製され得る。代表的には、非グリコ シル化短縮型sTNFRが使用される。短縮型sTNFRの誘導体化に適切な化学部分は水 溶性ポリマーを含む。 それぞれが付着されるタンパク質が水性環境（例えば、生理学的環境）で沈殿 されないので、水溶性ポリマーが望ましい。好ましくは、ポリマーは、治療産物 または組成物の調製に薬学的に受容可能である。ポリマー／タンパク質結合体が 、治療に使用されるかどうかについてのような考慮、そしてそうであれば、所望 の用量、循環時間、およびタンパク質分解に対する抵抗性に基づいて、当業者は 、所望のポリマーを選択し得る。 適切な、臨床的に受容可能な、水溶性ポリマーには、ポリエチレングリコール （PEG）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール ／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ-ポリエチレングリコール 、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール（PVA） 、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、 エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ(β-アミノ酸)（ホモポリマーまた はランダムコポリマーのいずれか）、ポリ(n-ビニルピロリドン）ポリエチレン グリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー（PPG）、および他のポリ アキレ冫オキシド、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポ リオキシエチル化ポリオール（POG）（例えば、グリセロール）、および他のポ リオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、またはポリオ キシ エチル化グルコース、コロン酸、または他の炭水化物ポリマー、Ficollまたはデ キストラン、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。 本明細書で使用される場合、ポリエチレングリコールとは、モノ-(C1-C10)ア ルコキシ-またはアリールオキシ-ポリエチレングリコールのような、他のタンパ ク質を誘導体化するために使用されている形態のいずれかを含むことを意味する 。ポリエチレングリコールプロビオンアルデヒドは、水中での安定性のため製造 における有利点を有し得る。 水溶性ポリマーはそれぞれ、任意の分子量であり得、そして分枝または非分枝 であり得る。水溶性ポリマーはそれぞれ、代表的には、約２kDA〜約100kDaの間 の平均分子量を有する（用語「約」は、水溶性ポリマーの調製において、いくつ かの分子が記載された分子量よりも多いまたは幾分少ない量である）。各水溶性 ポリマーの平均分子量は、好ましくは約５kDaと約50kDaとの間、より好ましくは 約12kDaと約40kDaとの間、および最も好ましくは約20kDaと約35kDaとの間である 。 一般に、分子量が高いほどまたは分枝が多いほど、ポリマー：タンパク質比が 高い。所望の治療プロフィル（例えば、持続放出の期間；あるならば、生物学的 活性における効果；取り扱いの容易さ；抗原性、および治療タンパク質における 水溶性ポリマーの他の公知の効果の程度または欠如）に依存して、他のサイズが 使用され得る。 水溶性ポリマーはそれぞれ、タンパク質の機能的または抗原性ドメインにおけ る効果を考慮して、タンパク質に付加されるべきである。一般的に、化学的誘導 体化は、タンパク質を活性化されたポリマー分子と反応させるために使用される 任意の適切な条件下で行われ得る。水溶性ポリマーを１つ以上のタンパク質に連 結するために使用され得る活性化基は、以下を含む：スルホン、マレイミド、ス ルフィドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジジリン、オキシラ ン、および5-ピリジル。 水溶性ポリマーはそれぞれ、一般的に、アミノ酸のαまたはε-アミノ基ある いは反応性チオール基でタンパク質に付加されるが、水溶性基が、適切な反応条 件下で水溶性基に付加されるために十分に反応性である、タンパク質の任意の反 応性基に付加され得ることも意図される。したがって、水溶性ポリマーは、遊離 アミノまたはカルボキシル基のような反応性基によってタンパク質に共有結合さ れ得る。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基は、リジン残基およびＮ末端アミノ 酸残基を含み得る。遊離カルボキシル基を有する残基は、アスパラギン酸残基、 グルタミン酸残基、およびＣ末端アミノ酸残基を含み得る。反応性チオール基を 有する残基は、システイン残基を含む。 水溶性ポリマーと結合したタンパク質を調製する方法は、それぞれ一般的に、 (a)タンパク質が１つ以上の水溶性ポリマーに付加される条件下で水溶性ポリマ ーとタンパク質を反応させる工程、および(b)反応産物を得る工程を包含する。 各結合についての反応条件は、当該技術分野で公知の条件またはその後に開発さ れた条件のいずれかから選択され得るが、改変されるタンパク質を不活性化する 温度、溶媒、およびpHレベルのような反応条件への曝露を避けるまたは制限する ように選択されるべきである。一般に、反応のための最適反応条件は、公知のパ ラメータおよび所望の結果に基づいて場合次第で決定される。例えば、水溶性ポ リマー：タンパク質結合体の比が大きいほど、結合した産物の割合が大きい。最 適比（過剰の未反応タンバク質またはポリマーがない点での反応の効率に関して ）は、誘導体化の所望の程度（例えば、モノ、ジ、トリなど）、ポリマーが分枝 であろうが非分枝であろうが選択されたポリマーの分子量、および使用される反 応条件のような因子によって決定され得る。水溶性ポリマー（例えば、PEG）の タンパク質に対する比は、一般的に1:1〜1001の範囲である。１つ以上の精製さ れた結合体は、特に、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、 ゲル濾過クロマトグラフィー、および電気泳動を含む標準的精製技法によって、 各混合物から調製され得る。 Ｎ末端が化学的に改変されたタンパク質が、特に所望され得る。分子量、分枝 化など、反応混合物中のタンパク質（またはペプチド）分子に対する水溶性ポリ マーの比率、行われる反応のタイプ、および選択されたＮ末端が化学的に改変さ れたタンパク質を得る方法によって、水溶性ポリマーが選択され得る。Ｎ末端が 化学的に改変されたタンパク質調製物を得る方法（すなわち、必要であれば他の １つの誘導体化した部分からこの部分を分離すること）は、化学的に改変された タンパク質分子の集団からＮ末端が化学的に改変されたタンパク質物質の精製に よってであり得る。選択的Ｎ末端化学的改変は、特定のタンパク質における誘導 体化に利用可能な一次アミノ基（リジン対Ｎ末端）の種々のタイプの差のある反 応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得る。適切な反応条件下で、 カルボニル基含有ポリマーとのＮ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体 化が達成される。例えば、リジン残基のε-アミノ基とタンパク質のＮ末端残基 のα-アミノ基との間のpKa差を利用させるpHで反応を行うことによって、タンパ ク質のＮ末端に水溶性ポリマーを選択的に付加させ得る。このような選択的誘導 体化によって、タンパク質への水溶性ポリマーの付加が制御される：ポリマーと の結合は、タンパク質のＮ末端で主として起こり、そしてリジン側鎖アミノ基の ような他の反応性基の顕著な改変は生じない。還元的アルキル化を使用して、水 溶性ポリマーは、上記のタイプであり得、そしてタンパク質にカップリングする ために単一の反応性アルデヒドを有するべきである。単一の反応性アルデヒドを 含む、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが使用され得る。 本発明は、モノまたはポリ（例えば、２〜４）PEG部分を含むように化学的に 誘導体化されたタンパク質を特に意図する。PEG化（pegylation）は、当該技術 分野で公知のPEG化反応のいずれかによって行われ得る。PEG化タンパク質産物を 調製する方法は、一般的に、(a)それによってタンパク質が１つ以上のPEG基に付 加されるようになる条件下で、ポリエチレングリコール（例えば、PEGの反応性 エステルまたはアルデヒド誘導体など）とタンパク質産物とを反応させる工程、 および(b)反応産物（単数または複数）を得る工程、を包含する。一般に、この 反応に最適な反応条件は、公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて場合次 第で決定される。 当業者に利用可能な多くの付加方法がある。例えば、EP 0 401 384を参照のこ と（その開示は参考として本明細書に援用される）；Malikら(1992)，Exp．Hema tol.，20:1028-1035；Francls(1992)，Focus on Growth Factors，3(2):4-10，( Mediscript，Mountain Court，Friern BarnetLane，London N20 OLD，UKによっ て刊行)；EP 0 154 316；EP 0 401 384；WO 92/16221；WO 95/34326；およびPEG 化に関する本明細書で引用される他の刊行物も参照のこと（これらの開示は、参 考として本明細書に援用される）。 PEG化は、特に、反応性ポリエチレングリコール分子とのアシル化反応または アルキル化反応によって行われ得る。従って、本発明によるタンパク質産物は、 PEG基（単数または複数）がアシルまたはアルキル基を介して付加されるPEG化タ ンパク質を含む。このような産物は、モノPEG化またはポリPEG化（例えば、２〜 ６、および好ましくは２〜５のPEG基を含む）され得る。PEG基は、一般的に、ア ミノ酸のα-またはε-アミノ基でタンパク質に付加されるが、PEG基が、適切な 反応条件下でPEG基に付加されるようになるために十分に反応性である、タンパ ク質に付加される任意のアミノ基に付加され得ることも意図される。 アシル化によるPEG化は、一般的に、タンパク質とポリエチレングリコール(PE G）の活性エステル誘導体とを反応させる工程を包含する。アシル化反応につい て、選択されたポリマー（単数または複数）は、単一の反応性エステル基を有す るべきである。任意の公知のまたは後で発見される反応性PEG分子は、PEG化反応 を行うために使用され得る。好ましい活性化PEGエステルは、N-ヒドロキシスク シンイミド（NHS）にエステル化されたPEGである。本明細書で使用される場合、 「アシル化」は、治療タンパク質とPEGのような水溶性ポリマーとの間の以下の タイプの結合を含むことを意図するが、これらに限定されない：アミド、カーバ メート、ウレタンなど（Chamow(1994)，Bioconjugate Chem.，5(2):133-140を参 照のこと（その開示は参考として本明細書に援用される））。反応条件は、PEG 化技術で公知の条件、または後で開発される条件のいずれかから選択され得るが 、改変されるタンパク質を不活性化する温度、溶媒、およびpHのような条件を避 けるべきである。 アシル化によるPEG化は、一般的に、ポリPEG化されたタンパク質を生じる。好 ましくは、接続結合はアミドである。また好ましくは、得られる産物は、実質的 に単独に（例えば、＞95％）モノ、ジ、またはトリPEG化される。しかし、より 高い程度のPEG化を有するいくつかの種は、使用される特定の反応条件に依存す る量で形成され得る。所望であれば、さらに精製されたPEG化種は、とりわけ、 透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラ フィー、および電気泳動を含む、標準的精製技法によって、混合物（特に未反応 種）から分離され得る。 アルキル化によるPEG化は、一般的に、還元剤の存在下でタンパク質とPEGの末 端アルデヒド誘導体を反応させる工程を包含する。還元的アルキル化反応につい ては、選択されるポリマー（単数または複数）は、単一の反応性アルデヒド基を 有するべきである。例示的な反応性PEGアルデヒドは、ポリエチレングリコール プロピオンアルデヒド（これは、水安定性である）、またはそのモノC1-C10アル コキシもしくはアリールオキシ誘導体である（米国特許第5,252,714号を参照の こと（その開示は参考として本明細書に援用される））。 アルキル化によるPEG化はまた、ポリPEG化タンパク質を生じ得る。さらに、タ ンパク質のＮ末端のα-アミノ基でのみのPEG化（すなわち、モノPEG化タンパク 質）を実質的に優先するための反応条件を操作し得る。モノPEG化またはポリPEG 化のいずれの場合においても、PEG基は、好ましくは、-CH2-NH-基を介してタン パク質に付加される。特に-CH2-基に関して、このタイプの結合は、本明細書で は「アルキル」結合という。 モノポリマー／タンパク質産物の実質的に均一な集団を産生するための還元的 アルキル化は、一般的に、(a)タンパク質のアミノ末端のα-アミノ基の選択的修 飾を可能にするために適切なpHで、還元的アルキル化条件下で反応性PEG分子と タンパク質とを反応させる工程、および(b)反応産物（単数または複数）を得る 工程、を包含する。モノPEG化された産物を産生するための還元的アルキル化に よる誘導体化は、リジンアミノ基とＮ末端のα-アミノ基との間のpKa差を利用す る（pKaは、50％のアミノ基がプロトン化されそして50％がプロトン化されないp Hである）。 反応は、リジン残基のε-アミノ基とタンパク質のＮ末端残基のα-アミノ基と の間のpKa差の利用を可能にするpHで行われる。一般に、pHがより低いならば、 タンパク質に対してより多くの過剰のポリマーが所望される（すなわち、Ｎ末端 α-アミノ基の反応性が低いほど、最適条件を達成するために必要とされるポリ マーが多い）。pHがより高いならば、ポリマー：タンパク質比はさほど大きい必 要がない（すなわち、利用可能な反応性基が多いほど、必要とされるポリマー分 子は少ない）。本発明の目的のために、pHは、一般的に、３〜９、好ましくは３ 〜６の範囲内に入る。還元的アルキル化については、還元剤は、水溶液中で安定 であるべきであり、そして好ましくは、還元的アルキル化の最初のプロセスで形 成されるシッフ塩基のみを還元し得る。適切な還元剤は、水素化ホウ素ナトリウ ム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミン ボラン、およびピリジンボランから選択され得る。特に適切な還元剤は、シアノ 水素化ホウ素ナトリウムである。溶媒、反応時間、温度、および産物の精製の手 段のような他の反応パラメータは、タンパク質の水溶性ポリマーでの誘導体化に 関する刊行された情報に基づいて、場合次第で決定され得る。 このような選択的誘導体化によって、タンパク質への水溶性ポリマー（アルデ ヒドのような反応性基を含む）の付加が制御される：ポリマーとの結合は、主と してタンパク質のＮ末端で起こり、そしてリジン側鎖アミノ基のような他の反応 性基の有意な修飾は生じない。調製物は、代表的には90％以上のモノポリマー／ タンパク質結合体、およびさらに代表的には95％以上のモノポリマー／タンパク 質結合体であり、観察される分子の残りは未反応である（すなわち、ポリマー部 分を含まないタンパク質）。 本発明の特定の実施態様は、還元的アルキル化によってsTNFR-I 2.6D/N105に 結合した、約20kDaまたは約33kDaのいずれかの平均分子量（例えば、30kDaと35k Daとの間）を有する非分枝モノメトキシ-ポリエチレングリコールアルデヒド、 あるいは約33kDaの平均分子量（例えば、30kDaと35kDaとの間）を有する３級ブ チルポリエチレングリコールアルデヒドである。 PEG化はまた、詳細には、少なくとも１つの反応性ヒドロキシ基を有する水溶 性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）を介して行われ得、これは反応 性カルボニル、ニトリル、またはスルホン基を有する試薬と反応され得、ヒドロ キシル基を反応性マイケルアクセプターに変換し、それによって種々のタンパク 質を修飾することに有用な「活性化リンカー」を形成し、改良された生物学的に 活性な結合体を提供する。「反応性カルボニル、ニトリル、またはスルホン」と は、カルボニル、ニトリル、またはスルホン基由来の第２の炭素におけるチオー ル特異的カップリングに対する反応性部位を有する、２つの炭素基が結合された 、カルボニル、ニトリル、またはスルホン基を意味する（WO 92/16221）。 活性化リンカーは、一官能性、二官能性、または多官能性であり得る。この方 法で使用され得る反応性スルホン基を有する有用な試薬には、クロロスルホン、 ビニルスルホン、およびジビニルスルホンが挙げられるが、これらに限定されな い。 特定の実施態様では、水溶性ポリマーは、マイケルアクセプターで活性化され る。WO 95/13312は、とりわけ、分子上および表面上のアミノ部分の代わりにチ オール部分とカップリングすることに高度に選択的である水溶性のスルホン活性 化PEGを記載する。これらのPEG誘導体は、約11以下のpHでの水性環境中で長い期 間にわたり加水分解に対して安定であり、そして加水分解的に安定でもある結合 体を形成するために分子との連結を形成し得る。それによってPEGおよび生物学 的に活性な分子がカップリングされる連結には、チオール部分にカップリングさ れるスルホン部分が挙げられ、そしてこれは構造PEG-SO2-CH2-CH2-S-Wを有し、 ここでWは生物学的に活性な分子を表し、そしてスルホン部分はビニルスルホン または活性エチルスルホンである。２つの特に有用なホモ二官能性誘導体は、PE G-bis-クロロスルホンおよびPEG-bis-ビニルスルホンである。 PCT国際特許出願第US96/19459号（その開示は参考として本明細書に援用され る）は、反応性ヒドロキシル基を有する化合物を得、そして変換のための溶媒と してテトラヒドロフラン（THF）を使用して、活性化リンカーを形成するために ヒドロキシル基を反応性マイケルアクセプターに変換することによる、スルホン 活性化リンカーの製造方法を教示する。PCT国際特許出願第US96/19459号（その 開示は参考として本明細書に援用される）は、サイズおよび末端基の官能性に基 づいてリンカーを分離するために、疎水性相互作用クロマトグラフィーを利用す る、活性化リンカーを精製するプロセスを教示する。 詳細には、本発明は、モノまたはポリ（例えば、２〜４）PEG部分を含むよう に化学的に誘導体化された以下の原核生物で発現された分子を意図する：sTNFR- I 2.6D/C105、sTNFR-I 2.6D/C106、sTNFR-I 2.6D/N105、sTNFR-I 2.3D/d8、sTNF R-I 2.3D/d18、およびsTNFR-I 2.3D/d15（メチオニル化または非メチオニル化の いずれか）、ならびにその改変体および誘導体。多価形態 多価形態（単数または複数）、すなわち、１より多くの活性部分を含む分子が 、構築され得る。１つの実施態様では、分子は、TNFリガンドに対する複数の腫 瘍壊死因子結合部位を有し得る（例えば、短縮型sTNFR産物の組み合わせ）。さ らに、分子は、少なくとも１つの腫瘍壊死因子結合部位、および、多価形態の所 望の特徴に依存して、別の分子の少なくとも１つの結合部位を有し得る（例えば 、以下に記載のような、少なくとも１つの短縮型sTNFR産物および少なくとも１ つのインターロイキン-1レセプターアンタゴニスト（「IL-lra」）の組み合わせ ）。 １つの実施態様では、多価形態は、例えば、少なくとも１つの短縮型sTNFR産 物および別の部分、好ましくは別の短縮型sTNFR産物を、任意の臨床的に受容可 能なリンカー（例えば、上記のような、水溶性ポリマー）と、化学的にカップリ ングすることによって構築され得る。原則として、リンカーは、新しい免疫原性 を与えるべきでなく、そして新しいアミノ酸残基によって、その生体分布および クリアランスに有害な影響を与えるように構造の疎水性および電荷バランスを変 化させるべきではない。 リンカーとして使用される場合、このようなポリマーは、直鎖もしくは分枝、 置換、もしくは非置換の、上記に列挙するモノマーに基づく、モノポリマー、ラ ンダムまたはブロックコポリマー、およびテルポリマー(terpolymer)であり得る 。ポリマーは、任意の長さまたは分子量であり得るが、これらの特徴は生物学的 特性に影響を与え得る。薬学的適用においてクリアランス速度を減少させるため に特に有用なポリマー平均分子量は、2,000〜35,000ダルトンの範囲にある。さ らに、ポリマーの長さは、所望の生物学的活性を最適にするかまたは与えるため に変化され得る。 ２つ以上のタンパク質に水溶性ポリマーを連結するために使用され得る活性化 基は、以下を含む：スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフ レート、トレシレート、アジジリン、オキシラン、および5-ピリジル。 特定の実施態様では、少なくとも１つの反応性マイケルアクセプターを有する 二官能性または多官能性活性化リンカーは、米国特許出願第08/473,809号に従っ て調製され得、そして米国特許出願第08/611,918号に従って精製され得る。 活性部分は、従来のカップリング技法を使用して連結され得る（PCT公開公報 第WO 92/16221号およびPCT公開公報第WO 95/34326号を参照のこと（これらの開 示は参考として本明細書に援用される））。さらに、PCT公開公報第WO 92/16221 号は、種々のダイマー化されたsTNFR-Iインヒビター分子（例えば、ダイマー化 されたc105 sTNFR-I）の調製を記載する。式(sTNFR-I 2.6D/C106)2-(20kDa PEG) を有する例示的な多価腫瘍壊死因子結合タンパク質が、実施例Ｉに開示される。 あるいは、二価分子は、ポリペプチドリンカー領域によって分離される短縮型 sTNFR産物の２つのタンデムリピートからなり得る。ポリペプチドリンカーの設 計は、タンパク質のデノボ設計におけるドメイン間の短いループ配列の挿入に設 計が類似する（Mutter(1988)，TIBS，13:260-265、ならびにReganおよびDeGrado (1988)，Science，241:976-978（これらの開示は参考として本明細書に援用され る））。一本鎖抗体に適切なリンカーが、組換えヒトsTNFR-IIのダイマー形態を 産生するために効果的であることが示されている（Neveら(1996)，Cytokine，8( 5) :365-370（その開示は参考として本明細書に援用される））。いくつかの異な るリンカー構築物が組み立てられており、そして抗体に有用であることが示され ている；最も機能的リンカーは、12アミノ酸から25アミノ酸まで（非反応性側鎖 基を有するアミノ酸、例えば、アラニン、セリン、およびグリシン）サイズが変 化し、これらはともに親水性配列を構成し、溶解性を増強するために少しの反対 に荷電した残基を有し、そして可撓性である（WhitlowおよびFilpula(1991)，Me thods:A Companion to Methods in Enzymology，2:97-105、およびBrigidoら(19 93)，J．Immunol.，150:469-479（これらの開示は参考として本明細書に援用さ れる））。 別の実施態様では、短縮型sTNFRは、ビオチンに化学的にカップリングされ得 、そして結合されたビオチン／短縮型sTNFRは次いでアビジンに結合させられ、 四価アビジン／ビオチン／短縮型sTNFR分子を生じる。短縮型sTNFRはまた、ジニ トロフェノール（DNP）またはトリニトロフェノール（TNP）に共有結合され得、 そして得られる結合体は、TNF結合部位に対する10の原子価を有する十価結合体 を形成するために抗DNPまたは抗TNP-IgMとともに沈殿され得る。 さらに別の実施態様では、短縮型sTNFRを有する組換え融合タンパク質もまた 、産生され得、ここで各組換えキメラ分子は、免疫グロブリン分子の重鎖および 軽 鎖のいずれかまたは両方の可変ドメインが置換され、そしてヒト免疫グロブリン の重鎖または軽鎖の定常ドメインのすべてまたは一部、しかし少なくとも１つの 定常ドメインを有する、上記のような、sTNFR配列を有する。例えば、各々のこ のようなキメラ短縮型sTNFR/IgG1融合タンパク質は、以下の２つのキメラ遺伝子 から産生され得る：短縮型sTNFR/ヒトκ軽鎖キメラ（短縮型sTNFR/Ck）および短 縮型sTNFR/ヒトγ-1重鎖キメラ（短縮型sTNFR/Cg-1）。２つのキメラ遺伝子の転 写および翻訳の後、以下に記載のように、遺伝子産物は、二価に提示される短縮 型sTNFRを有する単一のキメラ分子に組み立てられ得る。このようなキメラ分子 の構築に関するさらなる詳細は、米国特許第5,116,964号、PCT公開公報第WO 89/ 09622号、PCT公開公報第WO 91/16437号、およびEP 315062（これらの開示は参考 として本明細書に援用される）に開示される。 なおさらなる実施態様では、短縮型sTNFRを有する組換え融合タンパク質もま た産生され得、ここで各組換えキメラ分子は、上記のようなsTNFR配列、および 欧州特許出願第96309363.8号に記載のようなオステオプロテゲリン（osteoprote gerin）（OPG）の領域186〜401の少なくとも一部を有する。ポリヌクレオチド 本発明は、さらに、短縮型sTNFRをコードするポリヌクレオチドを提供する。 本明細書の記載に基づいて、そして普遍的なコドン表を使用して、当業者は、短 縮型sTNFRのアミノ酸配列をコードするすべての核酸配列を容易に決定し得る。 ここで好ましい核酸配列は、sTNFR-I 2.6D/C105、sTNFR-I 2.6D/C106、sTNFR-I 2.6D/N105、sTNFR-I 2.3D/d8、sTNFR-I 2.3D/d18、およびsTNFR-I 2.3D/d15をコ ードするポリヌクレオチドを含む。種々のポリヌクレオチドの例は、図２、３、 ４、５、６、および７に示される。 以下に記載の説明に従って行われる組換え発現技法は、これらのポリヌクレオ チドを産生するためおよびコードされるタンパク質を発現するために続けられ得 る。例えば、適切なベクターに短縮型sTNFRをコードする核酸配列を挿入するこ とによって、当業者は、大量の所望のヌクレオチド配列を容易に産生し得る。次 いで、配列は、検出プローブまたは増幅プライマーを生成するために使用され得 る。あるいは、短縮型sTNFRをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターに 挿入され得る。適切な宿主に発現ベクターを導入することによって、所望の短縮 型sTNFRは大量に産生され得る。 本明細書でさらに記載されるように、所望の核酸配列の増殖および／または短 縮型sTNFRの産生に利用可能な多くの宿主／ベクター系がある。これらには、プ ラスミド、ウイルス、および挿入ベクター、ならびに原核生物および真核生物宿 主が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、本発明の配列を産生また は発現させるために異種DNAを増殖または発現し得る宿主／ベクター系を適用し 得る。 さらに、本発明の開示の点で、新規核酸配列は、図面に記載の配列を有する短 縮型sTNFRをコードする縮重核酸配列、およびこれらの核酸配列の相補物に（好 ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）ハイブリダイ ズする核酸配列を含む（Maniatisら(1982)，Molecular Cloning(A Laboratory M anual)，Cold Spring Harbor Laboratory，387〜389頁）ことは当業者によって 認識される。代表的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、62〜 67℃にて４×SSCでのハイブリダイゼーション、次いで約１時間62〜67℃にて0.1 ×SSCでの洗浄である。あるいは、代表的なストリンジェントハイブリダイゼー ション条件は、40〜45℃にて45〜55％ホルムアミド４×SSCでのハイブリダイゼ ーションである。緩やかなハイブリダイゼーション条件下で図１および９に記載 の核酸配列にハイブリダイズし、そして短縮型sTNFRをコードするDNA配列も含ま れる。このような緩やかなストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の 例は、45〜55℃にて４×SSC、または40〜45℃にて30〜40％ホルムアミドでのハ イブリダイゼーションである。 短縮型sTNFRをコードするDNA配列とともにベクターDNAを含む組換えDNA構築物 も、本発明によって提供される。各このようなDNA構築物では、短縮型sTNFRをコ ードする核酸配列（シグナルペプチドを含むまたは含まない）は、選択された宿 主において短縮型sTNFRの複製および／または発現を指向し得る適切な発現制御 配列または調節配列と、作動可能に関連する。組換え発現 ポリヌクレオチドの調製 短縮型sTNFRをコードする核酸配列は、化学合成、cDNAまたはゲノムライブラ リースクリーニング、発現ライブラリースクリーニング、および／またはcDNAの PCR増幅を含むが、これらに限定されない種々の方法で容易に得られ得る。これ らの方法およびこのような核酸配列を単離するために有用である他の方法は、以 下に記載される：Sambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，(1989)；Ausubel ら編，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols Press，( 1994)；ならびにBergerおよびKimmel，Melhods in Enzymology:Gulde to Molecu lar Cloning Techniques，152巻，Academic Press，Inc.，San Diego，CA，(198 7)、これらの開示は参考として本明細書に援用される。 短縮型sTNFRをコードする核酸配列の化学合成は、Engelsら(1989)，Angew．Ch em．Intl．Ed.，28:716-734およびWellsら(1985)，Gene，34:315（これらの開示 は参考として本明細書に援用される）に記載のような、当該技術分野で周知の方 法を使用して達成され得る。これらの方法には、特に、核酸配列合成のホスホト リエステル、ホスホルアミダイト、およびH-ホスホネート法が挙げられる。大き な核酸配列、例えば、約100ヌクレオチド長より大きな配列は、いくつかのフラ グメントとして合成され得る。次いで、フラグメントは、短縮型sTNFRをコード する核酸配列を形成するように一緒に連結され得る。好ましい方法は、標準的な ホスホルアミダイト化学を使用するポリマー支持合成である。 あるいは、適切な核酸配列は、適切なcDNAライブラリー（すなわち、タンパク 質を発現すると考えられる１つ以上の組織ソースから調製されたライブラリー） またはゲノムライブラリー（全ゲノムDNAから調製されたライブラリー）をスク リーニングすることによって得られ得る。cDNAライブラリーのソースは、代表的 には、妥当な量で所望のタンパク質を発現すると考えられる任意の種由来の組織 である。ゲノムライブラリーのソースは、短縮型sTNFRをコードする遺伝子を有 すると考えられる任意の哺乳動物または他の種由来の任意の１つまたは複数の組 織であり得る。 ハイブリダイゼーション培地は、ライブラリーに存在する１つまたは複数のcD NAまたは遺伝子と選択的にハイブリダイズする１つ以上の核酸プローブ（クロー ニングされるcDNAまたは遺伝子に対する受容可能なレベルの相同性を有するオリ ゴヌクレオチド、cDNA、またはゲノムDNAフラグメント）を使用して、短縮型sTN FRをコードするDNAの存在についてスクリーニングされ得る。代表的には、この ようなスクリーニングに使用されるプローブは、ライブラリーが調製される種と 同じまたは類似の種からDNA配列の小さい領域をコードする。あるいは、プロー ブは、本明細書に記載のように、縮重され得る。 ハイブリダイゼーションは、代表的には、非特異的結合を抑制するがプローブ またはプライマーとの有意なレベルの相同性を有するクローンの結合を可能にす るストリンジェンシーの条件下で、オリゴヌクレオチドプローブまたはcDNAをク ローンにアニールすることによって達成される。代表的なハイブリダイゼーショ ンおよび洗浄ストリンジェンシー条件は、cDNAまたはオリゴヌクレオチドプロー ブのサイズ（すなわち、長さでのヌクレオチドの数）、およびプローブが縮重す るかどうかに一部依存する。クローンを同定する見込みはまた、ハイブリダイゼ ーション培地を設計するときに考慮される（例えば、cDNAまたはゲノムライブラ リーがスクリーニングされるかどうか）。 DNAフラグメント（例えば、cDNA）がプローブとして使用される場合、代表的 なハイブリダイゼーション条件には、Ausubelら(1994)編，前出に記載のような 条件が含まれる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション培地は、 プローブサイズ、クローンに対するプローブの予測される相同性、スクリーニン グされるハイブリダイゼーション培地、スクリーニングされるクローンの数など のようないくつかの因子に依存して、適切なストリンジェンシーで洗浄される。 イオン強度が通常低くそして比較的高い温度で使用される、ストリンジェントな 洗浄溶液の例は、以下の通りである：このようなストリンジェント洗浄の１つは 、55〜65℃にて0.015M NaCl、0.1005Mクエン酸ナトリウム、および0.1％SDSであ り；このようなストリンジェントな洗浄のもう１つは、約40〜50℃にて1mM Na2E DTA、40mM NaHPO4、pH7.2、および１％SDSであり；そして他のストリンジェント 洗浄の１つは、約50〜65℃にて0.2×SSCおよび0.1％SDSである。 オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイゼーション培地をスクリーニング するために使用されるストリンジェントな洗浄条件についての代表的プロトコル もある。例えば、第１のプロトコルは、プローブの長さに依存して、約35℃と63 ℃との間の温度で0.05％ピロリン酸ナトリウムとともに６×SSCを使用する。例 えば、14塩基プローブは35〜40℃で、17塩基プローブは45〜50℃で、20塩基プロ ーブは52〜57℃で、そして23塩基プローブは57〜63℃で洗浄される。温度は、バ ックグラウンドの非特異的結合が高く現れる場合、２〜３℃上昇され得る。第２ のプロトコルは、洗浄に塩化テトラメチルアンモニウム（TMAC）を使用する。こ のようなストリンジェント洗浄溶液の１つは、3M TMAC、50mM Tris-HCl、pH8.0 、および0.2％SDSである。 適切な核酸配列を得るための別の適切な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR） である。この方法では、cDNAは、酵素の逆転写酵素を使用してポリ(A)+RNAまた は全RNAから調製される。次いで、代表的には短縮型sTNFRをコードするcDNAの２ つの別々の領域に相補的な、２つのプライマー（オリゴヌクレオチド）は、Taq ポリメラーゼのようなポリメラーゼとともにcDNAに添加され、そしてポリメラー ゼは、２つのプライマー間のcDNA領域を増幅する。 プローブまたはプライマーとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、スク リーニングまたはPCR増幅の間に生じ得る非特異的結合の量を最少にするように 、適切な長さおよび十分に明瞭であるべきである。プローブまたはプライマーの 実際の配列は、通常、保存されたまたは高度に相同な配列または領域に基づく。 必要に応じて、プローブまたはプライマーは、完全にまたは部分的に縮重し得る 、すなわち同じアミノ酸配列をコードするすべてであるが、そのようにするため に種々のコドンを使用して、プローブ／プライマーの混合物を含み得る。縮重プ ローブを調製することの代わりは、種によって変化するコドン位置のいくつかま たはすべてにイノシンを配置することである。オリゴヌクレオチドプローブまた はプライマーは、上記のように、DNAについての化学合成法によって調製され得 る。 上記のように、改変体配列は、図２、３、４、５、６、および７の配列と比較 して、１つ以上のヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入を含み、そして 野生型アミノ酸配列と比較してアミノ酸配列改変体の発現を生じる天然（例えば 、 対立遺伝子改変体）または合成配列である。合成改変体配列の調製はまた、当該 技術分野で周知であり、そして、例えば、Sambrookら(1989)，前出およびWells ら(1985)，Gene，34:315（これらの開示は参考として本明細書に援用される）に 記載される。ベクター 短縮型sTNFRをコードするDNAは、さらなるクローニング（DNAの増幅）または 発現のためのベクターに挿入され得る。適切なベクターは、商業的に入手可能で あるか、またはベクターは特別に構築され得る。適切なベクターの選択または構 築は、(1)DNA増幅またはDNA発現に使用されるかどうか、(2)ベクターに挿入され るDNAのサイズ、および(3)ベクターで形質転換される所定の宿主細胞に依存する 。 ベクターはそれぞれ、選択された宿主細胞による所望のタンパク質の発現を指 向、制御、あるいは達成し得る、その後の発現制御配列または調節配列の１つ以 上に作動可能に連結される、所望のタンパク質をコードする核酸配列を含む。各 ベクターは、その機能（DNAの増幅またはDNAの発現）および所定の宿主細胞との 適台性に依存して、種々の成分を含む。ベクター成分は、一般的に、以下の１つ 以上を含むが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つ以上の選 択遺伝子またはマーカー遺伝子、プロモーター、エンハンサーエレメント、転写 終結配列など。これらの成分は、天然ソースから得られ得るか、または公知の手 順によって合成され得る。 適切な原核生物クローニングベクターの例には、λ誘導体のようなバクテリオ ファージ、またはE．coliからのプラスミド（例えば、pBR322、colE1、pUC、F因 られる。他の適切な発現ベクター（それらの多くのタイプが以下に記載の宿主細 胞について当該技術分野で公知である）はまた、この目的に使用され得る。シグナル配列 シグナル配列をコードする核酸は、短縮型ｓＴＮＦＲをコードする配列の5'に 挿入され得、例えば、これはベクターの成分であり得、あるいは短縮型ｓＴＮＦ Ｒをコードする核酸の一部であり得る。sTNFR-IおよびsTNFR-IIの天然のシグナ ル配列をコードする核酸が、公知である（EP 393438およびEP 422339）。複製起点 発現およびクローニングベクターはそれぞれ、一般的に、１つ以上の選択され た宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。クローニング ベクターでは、この配列は、代表的には、宿主染色体DNAから独立したベクター の複製を可能にする配列であり、そして複製起点または自律複製配列を含む。こ のような配列は周知である。プラスミドpBR322からの複製起点は、ほとんどのグ ラム陰性菌に適切であり、そして種々の起点（例えば、SV40、ポリオーマ、アデ ノウイルス、VSV、またはBPV）は、哺乳動物細胞においてクローニングベクター に有用である。一般的には、複製起点は、哺乳動物発現ベクターに必要ではない （例えば、SV40起点は、初期プロモーターを含むので、しばしば、単独で使用さ れる）。選択遺伝子 発現およびクローニングベクターはそれぞれ、代表的には、選択遺伝子を含む 。この遺伝子は、形質転換された宿主細胞が選択培養培地で増殖される場合、形 質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要な「マーカー」タンパク質をコー ドする。ベクターで形質転換されない宿主細胞は選択遺伝子を含まず、そしてし たがってこれらは培養培地中で生存しない。代表的な選択遺伝子は、(a)抗生物 質または他のトキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセー ト、またはテトラサイクリンに対する耐性を与えるか、(b)栄養要求性欠失を補 うか、または(c)培養培地から利用可能でない重要な栄養を供給するタンパク質 をコードする。 他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は 、増殖に重要なタンパク質の産生により多くの需要がある遺伝子が組換え細胞の 継続世代の染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に適 切な選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）およびチミ ジ ンキナーゼを含む。細胞形質転換体は、形質転換体のみがベクターに存在するマ ーカーによって生存するために独特に適応する選択圧下に置かれる。選択圧は、 培地中の選択薬剤の濃度が連続して変化し、それによって選択遺伝子および短縮 型sTNFRをコードするDNAの両方の増幅を導く条件下で、形質転換された細胞を培 養することによって負荷される。結果として、増加した量の短縮型sTNFRは、増 幅したDNAから合成される。 例えば、DHFR選択遺伝子で形質転換された細胞は、最初に、DHFRの競合アンタ ゴニストであるメトトレキセートを含む培養培地中で形質転換体のすべてを培養 することによって同定される。野生型DHFRが使用される場合、適切な宿主細胞は 、DHFR活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣細胞株である（Urlaubおよび Chasin(1980)，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，77(7):4216-4220、その開示は参 考として本明細書に援用される）。次いで、形質転換された細胞は、増加したレ ベルのメトトレキセートに曝される。これは、DHFR遺伝子の複数コピー、および 付随して、短縮型sTNFRをコードするDNAのような発現ベクターに存在する他のDN Ａの複数コピーの合成を導く。プロモーター 発現およびクローニングベクターはそれぞれ、代表的には宿主生物によって認 識されるプロモーターを含み、そして短縮型sTNFRをコードする核酸配列に作動 可能に連結される。プロモーターは、短縮型sTNFRをコードする遺伝子のような 、特定の核酸配列の転写および翻訳を制御する構造遺伝子（一般的に、約100〜1 000bp以内）の開始コドンの上流（5'）に位置する非翻訳配列である。プロモー ターは、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターの２つのクラスの１つに 便宜上分類され得る。誘導性プロモーターは、栄養の存在または非存在あるいは 温度の変化のような、培養条件のいくつかの変化に応じて、その制御下でDNAか らの増加したレベルの転写を開始する。種々の可能性のある宿主細胞によって認 識される多数のプロモーターが周知である。プロモーターは、制限酵素消化によ ってソースDNAからプロモーターを除去し、そして所望のプロモーター配列を挿 入することによって、短縮型sTNFRをコードするDNAに作動可能に連結され得る。 天 然のsTNFR-Iプロモーター配列またはsTNFR-IIプロモーター配列は、短縮型sTNFR をコードするDNAの増幅および／または発現を指向するために使用され得る。し かし、天然のプロモーターと比較して発現されるタンパク質のより多くの転写お よびより高い収量を可能にするならば、そして使用のために選択されている宿主 細胞系に適合可能であるならば、異種プロモーターが好ましい。例えば、他のNG F/TNFファミリーメンバーの天然のプロモーター配列のいずれか１つが、短縮型s TNFRをコードするDNAの増幅および／または発現を指向するために使用され得る 。 原核生物宿主との使用に適切なプロモーターには、β-ラクタマーゼおよびラ クトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ、トリプトファン（trp）プ ロモーター系；細菌発光（luxR）遺伝子系、およびtacプロモーターのようなハ イブリッドプロモーターが挙げられる。他の公知の細菌プロモーターも適切であ る。それらのヌクレオチド配列は、公表されており、それによって、当業者が、 任意の必要とされる制限部位を供給するのに必要なリンカーまたはアダプターを 使用して、所望のDNA配列にそれらを連結することが可能である。 酵母宿主との使用に適切なプロモーター配列も、当該技術分野で周知である。 哺乳動物宿主細胞との使用に適切なプロモーターは周知であり、そして、ポリオ ーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、 ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウ イルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくは、シミアンウイルス40（SV40 ）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられる。他の適切 な哺乳動物プロモーターには、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショック プロモーターおよびアクチンプロモーターが挙げられる。エンハンサーエレメント 発現およびクローニングベクターはそれぞれ、代表的には、短縮型sTNFRをコ ードするDNA配列の高等真核生物による転写を増加させるためのエンハンサー配 列を含む。エンハンサーは、通常約10〜300bpの長さの、その転写を増加させる ためにプロモーターに作用するDNAのシス作用性エレメントである。エンハンサ ーは、相対的に配向および位置に非依存性である。これらは、転写ユニットの5' および3'に見出されている。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとともに有 利に利用される。哺乳動物遺伝Ｔ由来の利用可能ないくつかのエンハンサー配列 は公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテ イン、およびインスリン）。さらに、SV40エンハンサー、サイトメガロウイルス 初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイル スエンハンサーのようなウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性 化のための代表的なエンハンサーエレメントである。エンハンサーは、短縮型sT NFRをコードするDNAの5'または3'の位置でベクターにスプライスされ得るが、代 表的には、プロモーターから5'の部位に位置する。転写終結 真核生物宿主細胞で使用される発現ベクターのそれぞれは、代表的には、転写 の終結のためおよびmRNAを安定化するために必要な配列を含む。真核生物のDNA またはcDNAの5'および時には3'非翻訳領域由来のこのような配列は、一般に利用 可能である。これらの領域は、短縮型sTNFRをコードするmRNAの非翻訳部分にお けるポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含 む。ベクター構築物 上記の成分の１つ以上を（短縮型sTNFRをコードするコード配列とともに）含 む適切なベクターの構築は、標準的連結技術によって達成される。単離されたプ ラスミドまたはDNAフラグメントは、必要とされるベクターを生成するために所 望の順で、切断され、調整され、そして再連結トされる。正確な配列が構築され たことを確認するために、連結混合物は、E．coliを形質転換するために使用さ れ得、そして成功した形質転換体は、上記のような公知の技法によって選択され 得る。次いで、多量の形質転換体由来のベクターが調製され、制限エンドヌクレ アーゼ消化によって分析され、および／または所望の構築物の存在を確認するた めに配列決定される。 哺乳動物細胞で短縮型sTNFRをコードするDNAの一過性発現を提供するベクター もまた使用され得る。一般に、一過性発現は、宿主細胞が、発現ベクターの多く のコピーを蓄積し、そして次に、発現ベクターによってコードされる高レベルの 所望のタンパク質を合成するような、宿主細胞中で効率的に複製し得る発現ベク ターの使用を含む。適切な発現ベクターおよび宿主細胞を含む、各一過性発現系 は、クローニングされたDNAによってコードされるタンパク質の好都合の陽性同 定、ならびに所望の生物学的または生理学的特性についてのこのようなタンパク 質の迅速なスクリーニング、すなわち、生物学的に活性な短縮型sTNFRを同定す ることを可能にする。宿主細胞 それぞれが所望のタンパク質を発現することにおける使用のための核酸配列を 含む、種々の組換え宿主細胞のいずれかがまた、本発明によって提供される。代 表的な原核生物および真核生物の宿主細胞としては、細菌細胞、哺乳動物細胞、 真菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または植物細胞が挙げられる。 原核生物宿主細胞としては、グラム陰性生物体またはグラム陽性生物体のよう な真正細菌（例えば、E．coli（HB101、DH5a、DH10、およびMC1061））；B．sub tilisのようなBacilli；P．acruginosaのようなPseudomonas種；Streptomyces s pp.；Salmonella typhimurium；またはSerratia marcescansが挙げられるが、こ れらに限定されない。特定の実施態様として、所望のタンパク質がE．coli中で 発現され得る。 原核生物宿主細胞に加え、糸状菌または酵母のような真核微生物は、短縮型sT NFRの発現に適切な宿主であり得る。Saccharomyces cerevisiae、すなわち普通 のパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も普通に使用されるが、多くの 他の属、種、および系統が周知であり、そして普通に利用可能である。 短縮型sTNFRは、多細胞生物に由来する多くの適切な宿主細胞のいずれか１つ によってグリコシル化した形態で発現され得る。このような宿主細胞は、複雑な プロセシングおよびグリコシル化活性が可能である。原則として、このような培 養物が、脊椎動物細胞を含むか、植物細胞および昆虫細胞を含む無脊椎動物細胞 を含むかのいずれにせよ、任意の高等真核生物細胞培養物が使用され得る。特定 の実施態様として、所望のタンパク質がバキュロウイルス細胞で発現され得る。 培養物（組織培養物）中での脊椎動物細胞の増殖が周知の手順であるので、脊 椎動物細胞が使用され得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、SV40によ って形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7）、ヒト胚腎臓株（293細胞または懸 濁培養物中での増殖のためにサブクローニングされた293細胞）、ベビーハムス ター腎臓細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞が挙げられるが、これら に限定されない。他の適切な哺乳動物細胞株としては、HeLa、マウスL-929細胞 、Swissに由来する3T3株、Balb-cマウスまたはNIHマウス、およびBHKハムスター またはHaKハムスターの細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。特定の 実施態様として、所望のタンパク質がCOS細胞で発現され得る。 宿主細胞は、トランスフェクトされ、そして好ましくは核酸の発現を可能にす る適切な条件下で所望の核酸で形質転換され得る。適切な宿主細胞、および形質 転換、培養、増幅、スクリーニング、ならびに産物の産生および精製のための方 法の選択は、当該分野で周知である（GethlngおよびSambrook(1981)，Nature，2 93 :620-625、あるいは、Kaufmanら(1985)，Mol．Cell．Biol.，5(7):1750-1759 、または米国特許第4,419,446号、これらの開示は参考として本明細書に援用さ れる）。例えば、細胞壁を有さない哺乳動物細胞について、リン酸カルシウム沈 降法が使用され得る。エレクトロポレーション、マイクロインジエクション、お よび他の公知の技法もまた使用され得る。 短縮型sTNFRが、相同組換えによるか、または短縮型sTNFRをコードするDNAを 既に含む細胞に導入された制御エレメントを利用する組換え産生方法で産生され 得ることもまた可能である。相同組換えは、転写活性遺伝子において変異を誘導 または訂正するために標的遺伝子について最初に開発された技法である（Kucher lapati(1989)，Prog．in Nucl．Acid Res．and Mol．Biol.，36:301、この開示 は参考として本明細書に援用される）。基本的技法は、哺乳動物ゲノムの特定の 領域に特定の変異を導入するための方法として（Thomasら(1986)，Cell，44:419 -428；ThomasおよびCapecchi(1987)，Cell，51:503-512、およびDoetschmanら(1 988)，Proc．Natl．Acad．Sci.，85:8583-8587、これらの開示は参考として本明 細書に援用される）、または欠損遺伝子内の特定の変異を訂正するために （Doetschmanら(1987)，Nature，330:576-578、その開示は参考として本明細書 に援用される）開発された。代表的技法は、米国特許第5,272,071号；WO 92/010 69；WO 93/03183；WO 94/12650、およびWO 94/31560に記載され、これらの開示 は参考として本明細書に援用される。 相同組換えによって、ゲノム中に挿入されるDNA配列は、標的DNAに付着するこ とによって目的の遺伝子の特定の領域へ向けられ得る。標的DNAは、ゲノムDNAの 領域に相補的（相同）なDNAである。ゲノムの特定の領域に相補的である標的DNA の小片は、DNA複製プロセスの間に親鎖と接触して置く。細胞内に挿入されてい るDNAの一般的特性は、共有した相同領域によって内因性DNAの他の片とハイブリ ダイズしそれによって組換えすることである。この相補鎖は、変異またはDNAの 異なる配列を含むオリゴヌクレオチドに付着される場合、これはまた組換えの結 果として新しく合成された鎖中に組み込まれる。プルーフリーディング機能の結 果として、DNAの新しい配列をテンプレートとして供することが可能である。し たがって、転移されたDNAはゲノム中に組み込まれる。 短縮型sTNFRの核酸配列のように、特定の遺伝子の配列が公知である場合、発 現制御配列（遺伝子の選択された領域に相補的な一片のDNA）は、合成され得る か、そうでなければ、例えば、目的の領域の境界をつける特定の認識部位で天然 のままのDNAの適切な制限によって得られる。この小片は、細胞内への挿入の際 の標的配列として役立ち、そしてゲノム内のその相同領域にハイブリダイズする 。このハイブリダイゼーションはDNA複製中に生じる場合、DNAのこの小片、およ びそれに付着される任意の付加的配列は、岡崎フラグメントとして作用し、そし てDNAの新しく合成された娘鎖に返し縫い(backstitch)される。 短縮型sTNFRの発現と相互作用し得るDNAの領域は、標的DNAのこれらの小片へ 付着される。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサー、 または外因性転写調節エレメントは、所望の短縮型sTNFRをコードするDNAの転写 に影響を及ぼすために十分な近接および配向において、所定の宿主細胞のゲノム 中に挿入される。制御エレメントは、短縮型sTNFRをコードしないが、代わりに 宿主細胞ゲノムに存在するDNAの一部を制御する。したがって、短縮型sTNFRの発 現は、短縮型sTNFRをコードするDNAのトランスフェクションによってではなく、 むしろ短縮型sTNFRの転写のための認識可能なシグナルを有する内因性遺伝子配 列を提供するDNA調節セグメントとカップリングした（目的の内因性遺伝子と相 同の領域を含む）標的DNAの使用によって達成され得る。宿主細胞を培養する工程 所望のタンパク質の産生のための１つ以上の組換え宿主細胞のそれぞれを培養 するための方法は、多くの因子および理由に依存して変化する；所定の状況に最 適な産生手順は、最小の実験によることが当業者に明らかである。このような組 換え宿主細胞は、適切な培地で培養され、次いで、発現された短縮型sTNFRは、 必要に応じて、培養培地から（または、細胞内で発現される場合、細胞から）当 業者に公知の適切な手段によって回収され、単離され、そして精製される。 詳細には、所望の短縮型sTNFRを産生するために使用される組換え細胞のそれ ぞれは、プロモーターを誘導するか、適切な組換え体宿主細胞を選択するか、ま たは所望の短縮型sTNFRをコードする遺伝子を増幅するために適切な培地中で培 養され得る。この培地は、ホルモンおよび／もしくは他の増殖因子（例えば、イ ンスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリ ウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝液（例えば、HEPES) 、ヌクレオシド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ゲ ンタマイシン）、微量元素（マイクロモル範囲での最終濃度で通常存在する無機 化合物として定義される）、ならびにグルコースまたは他のエネルギー源ととも に必要に応じて補充され得る。他の追加物はまた、当業者に理解されるように、 適切な濃度で含まれ得る。温度、pHなどのような、適切な培養条件もまた、選択 された宿主細胞との使用について当業者に周知である。 次いで、得られる発現産物は、当該技術分野で公知の手順を使用してほぼ同質 まで精製され得る。代表的な精製技法は、EP 393 438およびEP 422 339に教示さ れ、これらの開示は参考として本明細書中に援用される。薬学的組成物 薬学的組成物はそれぞれ、一般的に、治療的有効量の短縮型sTNFRおよび化学 的に改変された短縮型sTNFRの誘導体（集団で、「短縮型sTNFR産物」）をビヒク ルと混合して含む。ビヒクルは、好ましくは、１つ以上の薬学的および生理学的 に受容可能な処方物物質を、短縮型sTNFR産物および制御放出物質と混合して含 む。 ビヒクル中の一次溶媒は、事実上、水性または非水性のいずれかであり得る。 さらに、ビヒクルは、好ましくは5〜6.5の間、およびより好ましくは5.5〜6.0の 間のpHを改変または維持するための他の薬学的受容可能な賦形剤（例えば、クエ ン酸塩、リン酸塩、およびグリシンのようなアミノ酸のような緩衝剤）；凍結乾 燥した処方物のためのバルク剤（例えば、マンニトールおよびグリシン）；浸透 圧（例えば、マンニトールおよび塩化ナトリウム）；界面活性剤（例えば、ポリ ソルベート20、ポリソルベート80、トリトン、およびプルローニク(pluronic)； 粘性；澄明性；色；無菌性；安定性（例えば、スクロースおよびソルビトール） ；抗酸化剤（例えば、亜硫酸ナトリウムおよび亜硫酸水素ナトリウム）；保存剤 （例えば、安息香酸およびサリチル酸）；処方物の香り；香味剤および希釈化剤 ；解離速度（例えば、溶解剤またはアルコール、ポリエチレングリコール、およ び塩化ナトリウムのような可溶化剤）；放出速度；乳化剤；懸濁化剤；溶媒；充 填剤；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または薬学的アジュバントを含み 得る。非経口的徐放出処方物、吸入霧、経口活性処方物、または坐剤のような他 の有効な投与形態もまた考えられる。組成物はまた、バルク浸食ポリマー（例え ば、ポリ(乳酸−コーグリコール酸)（PLGA）コポリマー、PLGAポリマー混合物、 PEGのブロックコポリマー、ならびに乳酸およびグリコール酸、ポリ(シアノアク リレート)）；表面浸食ポリマー（例えば、ポリ(無水物)およびポリ(オルトエス テル)）；ヒドロゲルエステル（例えば、プルローニクポリオール、ポリ(ビニル アルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、無水マレイン酸-アルキルビニルエーテ ルコポリマー、セルロース、ヒアルロン酸誘導体、アルギン酸塩、コラーゲン、 ゼラチン、アルブミン、ならびに澱粉およびデキストラン）、ならびにその組成 物系：あるいはリポソームまたはマイクロスフェアの調製物のような、微粒子調 製物を含み得る。このような組成物は、本発明のタンパク質および誘導体の物理 的状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの 速度に影響を及ぼし得る。所望のタンパク質に最適な薬学的処方物は、投与経路 および所望の用量に依存して当業者により決定される。代表的な薬学的組成物は 、Remington's Pharmaceutical Sciences，18版(1990)，Mack Publishing Co.， Easton，PA 18042，1435-1712頁；GombotzおよびPettlt(1995)，Bioconjugate C hem.，6:332-351；Leone-Bayら(1995)，Journal of Medicinal Chemistry，38:4 263-4269；Haasら(1995)，Clinical Immunology and Immunopathology，76(1):9 3；WO 94/06457；WO 94/21275；FR 2706772、およびWO 94/21235に開示され、こ れらの開示は参考として本明細書中に援用される。 特定の持続放出組成物は、以下の供給者から入手可能である：Depotech（Depo foamTM、多小胞リポソーム）；Alkermes（ProLeaseTM、PLGAマイクロスフェア） 。本明細書中で使用される場合、ヒアルロナン（hyaluronan）とは、ヒアルロナ ン、ヒアルロン酸、その塩（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム）、エステル、エ ーテル、酵素的誘導体、および架橋したゲル、ならびにヒアルロン酸の化学改変 した誘導体（例えば、ヒラン（hylan））を含むことを意図する。ヒアルロナン の代表的形態は、PeyronおよびBalazs(1974)，Path．Biol.，22(8):731-736；Is daleら(1991)，J．Drug Dev.，4(2):93-99；Larsenら(1993)，Journal of Biome dical Materials Research，27:1129-1134；Namikiら(1982)，International Jo urnal of Clinical Pharmacology，Therapy and Toxicology，20(11):501-507； Meyerら(1995)，Journal of Controlled Release，35:67-72；Kikuchiら(1996) ，Osteoarthritis and Cartilage，4:99-110；Sakakibaraら(1994)，Clinical O rthopaedics and Related Research，299:282-292；MeyersおよびBrandt(1995) ，22(9):1732-1739；Laurentら(1995)，Acta Orthop Scand，66(266):116-120； Casconeら(1995)，Biomaterials，16(7):569-574；Yerashalmiら(1994)，Archiv es of Biochemistry and Biophysics，313(2):267-273；Bernatchezら(1993)，J ournal of Biomedical Materials Research，27(5):677-681；Tanら(1990)，Aus tralian Journal of Biotechnology，4(1):38-43；GombotzおよびPettit(1995) ，Bioconjugate Chem.，6:332-351；米国特許第4,582,865号、第4,605,691号、 第4,636,524号、第4,713,448号、第4,716,154号、第4,716,224号、第4,772,419 号、第4,851,521号、第4,957,774号、第4,863,907号、第5,128, 326号、第5,202,431号、第5,336,767号、第5,356,883号；欧州特許出願第0 507 604 A2号および第0 718 312 A2号；ならびにWO 96/05845に開示され、これらの 開示は参考として本明細書に援用される。特定のヒアルロナン組成物は、以下の 供給者から入手可能である：BioMatrix，Inc．Ridgefield，NJ(SynviscTM，ヒラ ン流体およびヒランゲルの90:10混合物)；Fidia S.p.A.，Abano Terme，Italy(H yalganTM，雄鶏とさか由来のヒアルロン酸のナトリウム塩(約500,000〜約700,00 0MW))；Kaken Pharmaceutical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan(ArtzTM，雄鶏とさか由 来のヒアルロン酸の１％溶液、約700,000MW)；Pharmacia AB，Stockholm，Swede n(HealonTM，雄鶏とさか由来のヒアルロン酸，約４×106MW)；Genzyme Corporat ion，Cambridge，MA(SurglcoatTM，組換えヒアルロン酸)；Pronova Biopolymer ，Inc．PortsmouLh，NH(ヒアルロン酸FCH，Strcptococcus zoocpidemicusの培養 物から調製された高分子量（例えば、約1.5〜2.2×106MW）ヒアルロン酸；ヒア ルロン酸ナトリウムMV，約1.0〜1.6×106MW、およびヒアルロン酸ナトリウムLV ，約1.5〜2.2×106MW)；Calbiochem-Novabiochem AB，Lautelfingen，Switzerla nd(Hyaluronic Acid，Streptococcus sp.から調製されたナトリウム塩(1997会社 カタログ番号385908))；Intergen Company，Purchase，NY(雄鶏とさか由来のヒ アルロン酸，＞１×106MW)；Dlosynth Inc.，Chicago，IL；Amerchol Corp.，Ed ison，NJ、およびKyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd.，Tokyo，Japan。 一旦薬学的組成物が処方されると、溶液、懸濁液、ゲル、乳化液、固体、また は脱水されたかもしくは凍結乾燥された粉末として、滅菌バイアル中に貯蔵され 得る。このような処方物は、用事調製形態でまたは投与前に再構成を必要とする （例えば、凍結乾燥した）形態でのいずれかで貯蔵され得る。 特定の実施態様では、本発明は、単回用量投与単位を生成するためのキットに 関する。このキットは、それぞれ、乾燥したタンパク質を有する第１の容器およ び水性処方物を有する第２の容器の両方を含み得る。本発明の範囲内に含まれる キットは、単一および複数の部屋に分かれた予め充填されたシリンジ；代表的な osyringe、二室の予め充填されたlyosyringe）は、Vetter GmbH，Ravensburg，G ermanyから入手可能である。用途 短縮型sTNFR産物は、研究試薬としてならびに治療および診断薬剤として有用 であり得る。したがって、短縮型sTNFRは、組織または器官試料中の天然のsTNFR -IまたはsTNFR-IIの量を定量するため、あるいはTNFを発現する細胞を決定およ び／または単離するためにインビトロおよび／またはインビボ診断アッセイに使 用され得る（Scallonら(1995)，前出）。組織または器官のアッセイでは、125I- 短縮型sTNFRの標準化した結合曲線と比較して、TNFに対する非標識の天然のsTNF R-IまたはsTNFR-I結合のため、TNFに対する125I-短縮型sTNFR結合からの放射活 性がほとんどない。同様に、125I-短縮型sTNFRの使用は、種々の細胞タイプにお けるTNFの存在を検出するために使用され得る。 本発明はまた、抗体の生成における短縮型sTNFR産物および得られる抗体（詳 細には、天然のsTNFR-IまたはsTNFR-IIにも結合する抗体を含む）の使用を意図 する。R1-[Cys19-Cys103]-R2アミノ酸配列内またはR4-[Cys32-Cys115]-R5アミノ 酸配列内のエピトープのような、短縮型sTNFRに結合する抗体が、開発され得る 。当業者は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、または組換え抗体を得 るために周知の公表された手順を使用し得、これらは、本発明のアミノ酸配列に よってコードされる種々のタンパク質を特異的に認識し、そして結合する。次い で、このような抗体は、全長の成熟30kDa TNFインヒビターおよび全長の成熟40k Da TNFインヒビターを精製および特徴づけるために使用され得る。 本発明はまた、TNFによって媒介される特定の疾患および医学的症状（その多 くは炎症性疾患として特徴づけられ得る）の処置の方法に関する。疾患または医 学的症状は、自発的または実験的疾患が、体液であるいは体内の疾患または徴候 の病巣に隣接する組織でのTNFのレベルの上昇に関連する場合に、「TNF媒介性疾 患」であると考えられる。TNF媒介性疾患はまた、以下の２つの条件によって認 識され得る：(1)疾患に関連する病理学的所見は、TNFの投与によって動物で実験 的に模倣され得る、および(2)疾患の実験的動物モデルで誘導される病理は、TNF の作用を阻害する薬剤での処置によって阻害または廃止され得る。多くのTNF媒 介性疾患は、これらの３つの状態のうちの２つを満たし、そして他は３つの状態 のすべてを満たす。それぞれが本発明の方法に従って処置され得る、TNF媒介性 疾患、ならびに関連の続発症、およびそれに付随する症状の非排除リストは、成 人呼吸窮迫症候群；悪質液／食欲不良；ガン（例えば、白血病）；慢性疲労症候 群；移植片対宿主拒絶；痛覚過敏；炎症性腸疾患；神経炎症性疾患；脳虚血（外 傷、てんかん、出血、または発作の結果としての脳損傷、これらのそれぞれは神 経変性を導き得る）を含む、虚血／再潅流損傷；糖尿病（例えば、若年性１型糖 尿病）；多発性硬化症；眼疾患；疼痛；膵炎；肺線維症；リウマチ病（例えば、 慢性関節リウマチ、骨関節炎、苦年性（リウマチ様）関節炎、血清陰性多発関節 炎、強直性脊椎炎、ライテル症候群および反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患 性関節炎、多筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、血管炎、脳血管炎、シェ ーグレン症候群、リウマチ熱、多軟骨炎およびリウマチ性多筋痛および巨大細胞 動脈炎）；敗血症性ショック；放射線治療からの副作用；全身性エリテマトーデ ス；一過性下顎骨関節疾患；甲状腺炎および組織移植である。 短縮型sTNFR産物はそれぞれ、上で定義されたように、リウマチ性疾患（例え ば、ライム病、若年性（リウマチ様）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマ チ様関節炎、およびstaphylococcal誘導（「敗血症性」）関節炎）を含むTNF媒 介性疾患の処置のための治療的有効量で患者に投与され得る。用語「患者」は、 動物（例えば、ネコ、イヌ、およびウマ）ならびにヒトを含むことが意図される 。 短縮型sTNFR産物は、局所、腸内、または非経口投与によって投与され得、こ れには、静脈内、筋肉内、動脈内、莢膜内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔 内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、室内、および 胸骨内注射および注入が挙げられるが、これらに限定されない。短縮型sTNFR産 物はまた、経口投与によって投与され得るか、または粘膜を通って、すなわち、 全身送達のために鼻内、舌下、頬側、または直腸内に投与され得る。 短縮型sTNFR産物が、関節内、皮下、筋肉内、または静脈内注射によって投与 されることが好ましい。さらに、短縮型sTNFR産物は、投与の期間にわたって血 液中で所望のレベルの短縮型sTNFR産物を連続的に提供するように、連続注入（ 例えば、一定または間欠性の移植されたまたは外部注入フロー調節デバイス） によって投与され得る。これは、好ましくは、例えば、浸透ミニポンプのような ミニポンプによる、連続注入によって達成される。これらの方法では、薬物の量 が所望のレベルで維持されることを確実にし得、そして血液試料を取りそして血 流中の薬物の量をモニターし得る。種々のポンプは、MiniMed Inc，Sylmar，CA （例えば、MT507)およびAlza Corp.，Palo Alto，CA(例えば、Alzet浸透ポンプ 、モデル2ML I)のような供給者から市販で入手可能である。 連続的またはほぼ連続的な投与の他の態様が実施され得ることも意図される。 例えば、化学的誘導体化は、所定の投与法に基づく予測可能な量で、血流中の連 続的存在の効果を有するタンパク質の持続放出形態を生じ得る。 関節の炎症性症状（例えば、骨関節炎、乾癬性関節炎、およびリウマチ様関節 炎）を含む、TNF媒介性疾患の処置のために短縮型sTNFR産物を使用する態様は、 ヨーロッパ特許出願567566に記載され、その教示は参考として本明細書に援用さ れる。限定されないが例示として、１つの特定の実施態様では、短縮型sTNFR産 物は、リウマチ様関節炎および骨関節炎の処置のために関節内に投与され得る。 限定されないが例示として、別の特定の実施態様では、短縮型sTNFR産物は、リ ウマチ様関節炎、炎症性腸疾患、悪質液／食欲不良、または多発性硬化症の処置 のために皮下または筋肉内に投与され得る。限定されないが例示として、なおさ らなる特定の実施態様では、短縮型sTNFR産物は、外傷、てんかん、出血、また は発作の結果としての脳損傷の処置のために静脈内に投与され得；あるいは外傷 の結果としての脳損傷の処置のために脳室内に投与され得る。関節炎の処置のた めに好ましい態様には、(1)関節炎の発赤を抑制または治療するために必要とさ れる場合、定期的に与えられる短縮型sTNFR産物の単回関節内注射、および(2)短 縮型sTNFR産物の定期的皮下注射が含まれる。敗血症性ショックの処置の開始は 、敗血症または敗血症の可能性が診断された後できるだけ早く開始しなければな らない。例えば、処置は、外科手術または事故あるいは敗血症性ショックが始ま る危険を有し得る何らかの他の事象の直後に開始され得る。成人呼吸窮迫症候群 の処置に好ましい態様には、(1)短縮型sTNFR産物の単回または複数回気管内投与 、および(2)短縮型sTNFR産物のボーラスまたは連続的静脈内注入が含まれる。 別の実施態様では、細胞治療、例えば、短縮型sTNFRを産生する細胞の移植も また意図される。本発明のこの実施態様は、短縮型sTNFRの生物学的に活性な形 態を合成および分泌し得る細胞を患者に移植する工程を包含し得る。短縮型sTNF Rを産生するこのような細胞は、短縮型sTNFRを正常に産生しないが短縮型sTNFR を産生するように改変されている細胞であり得るか、あるいは短縮型sTNFRを産 生する能力が、短縮型sTNFRの発現および分泌に適切なポリヌクレオチドでの形 質転換によって増大されている細胞であり得る。外来種の短縮型sTNFRを投与す ることによって患者における潜在的免疫学的反応を最小にするために、細胞が、 患者（例えば、ヒト）と同じ種であるか、または細胞が、免疫認識に対するバリ アを提供する物質でカプセル化されるか、あるいは細胞が、例えば、精巣、眼、 または中枢神経系において、免疫学的に特典のある解剖学的位置に配置されるこ とが好ましい。 ヒトまたは非ヒト動物細胞は、短縮型sTNFRの放出を可能にするためであるが 、患者の免疫系によってもしくは周辺組織からの他の有害な因子によって細胞の 破壊を防止するために、生体適合性の半透過性ポリマー封入体または膜中で、患 者に移植され得る。あるいは、短縮型sTNFRを産生するためにエクスビボで形質 転換された患者自身の細胞は、このような封入体なしで患者に直接移植され得る 。生きている細胞の膜封入体化のための方法論は、当業者に熟知しており、そし て封入体化された細胞の調製および患者でのそれらの移植が達成され得る。 さらに別の実施態様では、インビボ遺伝子治療もまた包含され、ここでは、短 縮型sTNFRをコードする核酸配列は患者に直接導入される。例えば、短縮型sTNFR をコードする核酸配列は、アデノ随伴ウイルスベクターのような適切な送達ベク ターとともにまたはなしで、核酸構築物の局所注射によって標的細胞に導入され る。代わりのウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、アデノウイルス ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびパピローマウイルスベクター が挙げられるが、これらに限定されない。物理的導入は、所望の核酸構築物また は所望の核酸配列を含む他の適切な送達ベクターの局所注射、リポソーム媒介輸 送、直接注射（裸のDNA）、レセプター媒介導入（リガンド−DNA複合体）、ある いはマイクロパーティクルボンバードメント（遺伝子銃）によって、インビボで 達成され得る。 代表的な細胞および遺伝子治療技法は、米国特許第4,892,538号；米国特許第5 ,011,472号；米国特許第5,106,627号；DE 4219626、WO 94/20517、および96/227 93に開示され、これらの開示は参考として本明細書に援用される。 投与の方法に関わりなく、TNF媒介性疾患の処置は、疾患の徴候を減少または 緩和するために有効な短縮型sTNFRの用量または全投与方法を必要とする。適切 な投与量を決定することにおける他の因子には、処置または予防される疾患また は状態、疾患の重篤度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別、および医学的症 状が含まれ得る。処置に適切な投与量を決定するために必要な計算のさらなる工 夫は、特に、本明細書に開示された投与量情報およびアッセイの点で、当業者に よって日常的に行われる。投与量はまた、適切な用量−応答データと組合わせて 使用される投与量を決定するための公知のアッセイの使用によって決定され得る 。特定の用量は、患者の大体の体重または体表面積に従って計算される。 投与の頻度は、使用される処方物中の短縮型sTNFRの薬物動態学的パラメータ に依存する。短縮型sTNFRは、１回または重篤なおよび長期障害の場合に投与さ れ得、少ない頻度の投与で毎日投与され得、あるいは最初のボーラス投与に続い て連続投与または持続送達で投与され得る。非経口投与の場合、非経口単位用量 は、例えば、それぞれ10mgまで、一般的には15mgまで、およびより一般的には20 mgまでであり得る。関節腔に投与される場合、薬学的組成物は、好ましくは、例 えば、等張リン酸緩衝化生理食塩水に溶解した約5mg/ml〜10mg/mlの短縮型sTNFR の用量を含む、例えば、３〜10mlシリンジからの単回注射として投与される。調 製物は、例えば、７〜10日毎に１回の頻度で関節腔に投与され得る。このような 方法では、投与は、例えば、必要ならば容量を変化しながら４〜５回連続的に行 われる。 いくつかの場合では、短縮型sTNFR産物は、他の治療への補助薬として、およ びまた、処置される徴候に適切な他の薬学的処方物とともに投与され得る。短縮 型sTNFR産物および１つ以上の伝統的または新しい抗炎症薬物のいずれかは、別 々にまたは組み合わせて投与され得る。 短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タンパク質）および１つ以 上のさらなる抗炎症薬物のいずれかは、別々にまたは組み合わせて投与され得 る。以下の化合物についての情報は、The Merck Manual of Diagnosis and Ther apy,第16版，Merck，Sharp & Dohme Research Laboratories，Merck & Co.，Rah way，NJ(1992)、およびPharmaprojects，PJB PublicationsLtd.で見出され得る 。 リウマチ性疾患（例えば、ライム病、若年性（リウマチ様）関節炎、骨関節炎 、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、およびブドウ球菌誘導（「敗血症性」）関 節炎）のような急性および慢性炎症を含む、上で定義されたような、TNF媒介性 疾患の現在の処置には、非ステロイド抗炎症薬物（NSAID）として分類される疼 痛および炎症の制御のための第１の系統の薬物が挙げられる。第２の処置には、 副腎皮質ステロイド遅延作用抗リウマチ薬物（SAARD）または疾患改変（DM）薬 物が挙げられる。 特定の実施態様では、本発明は、リウマチ性疾患（例えば、ライム病、若年性 （リウマチ様）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、およびst aphylococcal誘導（「敗血症性」）関節炎）のような急性および慢性炎症を含む 、上で定義されたような、TNF媒介性疾患；および移植片対宿主病の処置のため の、短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タンパク質）および任意 の１つ以上のNSAIDの使用に関する。NSAIDは、その抗炎症作用が、少なくとも一 部は、プロスタグランジン合成の阻害によるものである（GoodmanおよびGilman 「The Pharmacological Basis of Therapeutics」，MacMillan,第７版(1985)） 。NSAIDは、９つの群に特徴づけられ得る：(1)サリチル酸誘導体；(2)プロピオ ン酸誘導体；(3)酢酸誘導体；(4)フェナム酸誘導体；(5)カルボン酸誘導体；(6) 酪酸誘導体；(7)オキシカム；(8)ピラゾール；および(9)ピラゾロン。 特定の実施態様では、本発明は、１つ以上のサリチル酸誘導体、そのプロドラ ッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、 処置後、または同時処置）、短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2 タンパク質）の使用に関する。このようなサリチル酸誘導体、そのプロドラッグ エステルおよび薬学的に受容可能な塩は、アセタミノサロール、アロキシピリン 、アスピリン、ベノリレート、ブロモサリゲニン、アセチルサリチル酸カルシウ ム、トリサリチル酸マグネシウムコリン、ジフルシナル、エテルサレート、フ ェンドサル、ゲンチジン酸、サリチル酸グリコール、サリチル酸イミダゾール、 アセチルサリチル酸リジン、メサラミン、サリチル酸モルホリン、1-ナフチルサ リチル酸、オルサラジン、パルサルミド、アセチルサリチル酸フェニル、サリチ ル酸フェニル、サプセタミド、サリチルアミドO-酢酸、サルサレート、およびス ルファサラジンを含む。類似の鎮痛および抗炎症特性を有する構造的に関連する サリチル酸誘導体はまた、この群に包含されることが意図される。 特定の実施態様では、本発明は、任意の１つ以上のプロピオン酸誘導体、その プロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩と組み合わせた（処置前、処 置後、または同時処置）、短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タ ンパク質）の使用に関する。プロピオン酸誘導体、そのプロドラッグエステル、 および薬学的に受容可能な塩は、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、バ クロキシ酸（bucloxic acid）、カルプロフェン、デキンドプロフェン、フェノ プロフェン、フルノキサプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン（fl urbiprofen）、フルクロプロフェン、イブプロフェン、イブプロフェンアルミニ ウム、イブプロキサム、インドプロフェン、イソプロフェン、ケトプロフェン、 ロキソプロフェン、ミロプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピケトプ ロフェン、ピメプロフェン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、プロチジン酸 、プリドキシプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸、およびチオキサプ ロフェンを含む。類似の鎮痛および抗炎症特性を有する構造的に関連するプロピ オン酸誘導体はまた、この群に包含されることが意図される。 特定の実施態様において、本発明は、１つ以上の酢酸誘導体、そのプロドラッ グエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処 置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タン パク質）の使用に関する。酢酸誘導体、そのプロドラッグエステルおよび薬学的 に受容可能な塩として、以下が挙げられる：アセメタシン、アルクロフェナク、 アムフェナク、ブフェキサマク、シンメタシン、クロピラク、デルメタシン、ジ クロフェナクナトリウム、エトドラク、フェルビナク、フェンクロフェナク、フ ェンクロラク、フェンクロジン酸、フェンチアザク、フロフェナク、グルカメタ シン、イブフェナク、インドメタシン、イソフェゾラク、イソキセパク、ロナゾ ラク、メチアジン酸、オキサメタシン、オキシピナク、ピメタシン、プログルメ タシン、スリンダタ、タルメタシン、チアラミド、チオピナク、トルメチン、ジ ドメタシン、およびゾメピラク。類似の鎮痛性特性および抗炎症特性を有する構 造的に関連する酢酸誘導体もまた、この群に包含されることが意図される。 特定の実施態様において、本発明は、１つ以上のフェナム酸誘導体、そのプロ ドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置 前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2 タンパク質）の使用に関する。フェナム酸誘導体、そのプロドラッグエステル および薬学的に受容可能な塩として、以下が挙げられる：エンフェナム酸、エト フェナメート、フルフェナム酸、イソニキシン、メクロフェナム酸、メクロフェ ナム酸ナトリウム、メドフェナム酸、メファナム酸、ニフルム酸、タルニフルメ ート、テロフェナメート、トルフェナム酸、およびウフェナメート。類似の鎮痛 性特性および抗炎症特性を有する構造的に関連するフェナム酸誘導体もまた、こ の群に包含されることが意図される。 特定の実施態様において、本発明は、１つ以上のカルボン酸誘導体、そのプロ ドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置 前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2 タンパク質）の使用に関する。カルボン酸誘導体、使用され得るそのプロドラ ッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩として、以下が挙げられる：クリダナ ク、ジフルニサル、フルフェニサル、イノリジン、ケトロラク、およびチノリジ ン。類似の鎮痛性特性および抗炎症特性を有する構造的に関連するカルボン酸誘 導体もまた、この群に包含されることが意図される。 特定の実施態様において、本発明は、１つ以上の酪酸誘導体、そのプロドラッ グエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処 置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タン パク質）の使用に関する。酪酸誘導体、そのプロドラッグエステルおよび薬学的 に受容可能な塩として、以下が挙げらる：ブマジゾン、ブチブフェン、フェンブ フェン、およびキセブシン。類似の鎮痛性特性および抗炎症特性を有する構造的 に関連する酪酸誘導体もまた、この群に包含されることが意図される。 特定の実施態様において、本発明は、１つ以上のオキシカム、そのプロドラッ グエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処 置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タン パク質）の使用に関する。オキシカム、そのプロドラッグエステルおよび薬学的 に受容可能な塩として、以下が挙げられる：ドロキシカム、エノリカム、イソキ シカム、ピロキシカム、スドキシカム、テノキシカム、および4-ヒドロキシル-1 ,2-ベンゾチアジン1,1-ジオキシド4-(N-フェニル)-カルボキサミド。類似の鎮痛 性特性および抗炎症特性を有する構造的に関連するオキシカムもまた、この群に 包含されることが意図される。， 特定の実施態様において、本発明は、１つ以上のピラゾール、そのプロドラッ グエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処 置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タン パク質）の使用に関する。ピラゾール、使用され得るそのプロドラッグエステル および薬学的に受容可能な塩として、以下が挙げられる：ジフェナミゾール、お よびエピリゾール。類似の鎮痛性特性および抗炎症特性を有する構造的に関連す るピラゾールもまた、この群に包含されることが意図される。 特定の実施態様において、本発明は、１つ以上のピラゾロン、そのプロドラッ グエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処 置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タン パク質）の使用に関する。ピラゾロン、使用され得るそのプロドラッグエステル および薬学的に受容可能な塩として、以下が挙げられる：アパゾン、アザプロパ ゾン、ベンズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、モラゾン、オキシフ ェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピペブゾン、プロピルフェナゾン、ラミフェ ナゾン、スキシブゾン、およびチアゾリノブタゾン。類似の鎮痛性特性および抗 炎症特性を有する構造的に関連するピラゾロンもまた、この群に包含されること が意図される。 特定の実施態様において、本発明は、１つ以上の以下のNSAIDのいずれかと組 み合わせた（処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R1- [Cys19-Cys103]-R2タンパク質）の使用に関する：ε-アセタミドカプロン酸、S -アデノシルメチオニン、3-アミノ-4-ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、アニト ラザフェン、アントラフェニン、ベンダザク、ベンザダクリジネート、ベンジダ ミン、ベプロジン、ブロペラモル、ブクロメ、ブフェゾラク、シプロクアゾン、 クロキシメート、ダジダミン、デボキサメト、デトミジン、ジフェンピラミド（ difenpiramide）、ジフェンパイラミド（difenpyramide）、ジフィサラミン、ジ タゾール、エモルファゾン、ファネチゾールミシレート、フェンフルミゾール、 フロクラフェニン、フルミゾール、フルニキシン、フルプロクアゾン、フォピル トリン、フォスフォサル、グアイメサル、グアイアゾレン、イソニシキルン（is onizirn）、レフェタミンHCl、レフルノミド、ロフェミゾール、ロチファゾール 、リジンクロニキシネート、メセクラゾン、ナブメトン、ニクチンドール、ニメ スリド、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサセプロルム、オキサパドール、 パラニリン、ペリソキサル、クエン酸ペリソキサル、ピフォキシム、ピプロキセ ン、ピラゾラク、ピルフェニドン、プロクアゾン、プロキサゾール、チエラビン Ｂ、チフラミゾール、チメガジン、トレクチン、トルパドール、トリプタミド、 ならびに、480156S、AA861、AD1590、AFP802、AFP860、AI77B、AP504、AU8001、 BPPC、BW540C、CHINOIN1127、CN100、EB382、EL508、F1004、FK-506、GV3658、I TF182、KCNTEI6090、KME4、LA2851、MR714、MR897、MY309、ON03144、PR823、PV 102、PV108、R830、RS2131、SCR152、SH440、SIR133、SPAS510、SQ27239、ST281 、SY6001、TA60、TAI-901(4-ベンゾイル-1-インダンカルボキシル酸)、TVX2706 、U60257、UR2301、およびWY41770のような会社コード番号によって命名された もの。上記のNSAIDと類似の鎮痛性特性および抗炎症特性を有する構造的に関連 するNSAIDもまた、この群に包含されることが意図される。 特定の実施態様において、本発明は、リウマチ性疾患（例えば、ライム病、若 年性（リウマチ様）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、およ びstaphylococcal誘導（「敗血症性」）関節炎）のような急性および慢性の炎症 を含む、上で定義されたようなTNF媒介性疾患；および多発性硬化症の処置のた めの、１つ以上の副腎皮質ステロイド、そのプロドラッグエステルまたは薬学的 に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または同時に）、 短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タンパク質）の使用に関す る。副腎皮質ステロイド、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な 塩として、以下が挙げられる：ヒドロコルチゾン、およびヒドロコルチゾン由来 である化合物（例えば、21-アセトキシプレグネノロン、アルクロメラゾン、ア ルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ベタメタゾンベレ ラート、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾル、クロベタゾールプロ ピオネート、クロベタゾン、酪酸クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノ ル、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾル、デフラザコン、デソニド、 デスオキシメラゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフ ルプレドネート、エノキソロン、フルアザコルト、フルクロロニド、フルメタゾ ン、フルメタゾンピバレート、フルニゾリド、フルシノロンアセトニド、フルオ シノニド、フルオロシノロンアセトニド、フルオコルチンブチル、フルオコルト ロン、フルオロコルトロンヘキサノエート、ジフルコルトロンベレラート、フル オロメトロン、フルペロロンアセテート、フルプレドニデンアセテート、フルプ レドニゾロン、フルランデノリド、ホルモコルタール、ハルシノニド、ハロメタ ゾン、ハロプレドンアセテート、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、酢酸 ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコ ルチゾン21-コハク酸ナトリウム、ヒドロコルチゾンテブテート、マジプレドン 、メドリゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニコロン、モメタゾンフロエート 、パラメタゾン、プレドニカルバート、プレドニゾロン、プレドニゾロン21-ジ エドリアミノ酢酸、プレドニゾロンリン酸ナトリウム、プレドニゾロンコハク酸 ナトリウム、プレドニゾロン21-m-スルホ安息香酸ナトリウム、プレドニゾロン2 1-ステアログリコール酸ナトリウム、プレドニゾロンテブテート、プレドニゾロ ン21-トリメチル酢酸、プレドニデン、プレドニバル、プレドニリジン、プレド ニリデン21-ジエチルアミノ酢酸、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリ アムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニド、およびトリアムシノロ ンヘキサセトニド）。類似の鎮痛性特性および抗炎症特性を有する構造的に関連 する副腎皮質ステロイドもまた、この群に包含されることが意図される。 特定の実施態様において、本発明は、リウマチ性疾患（例えば、ライム病、若 年性（リウマチ様）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、およ びstaphylococcal誘導（「敗血症性」）関節炎）のような急性および慢性の炎症 を含む、上で定義されたようなTNF媒介性疾患；および多発性硬化症の処置のた めの、１つ以上の遅延作用性抗リウマチ薬物（SAARD）または疾患改変抗リウマ チ薬物（DMARD）、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のい ずれかと組み合わせた（処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（ 例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タンパク質）の使用に関する。SAARDまたはDMARD 、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩として、以下が挙げら れる：アロカプレイドナトリウム、アウラノフィン、アウロチオグルコース、ア ウロチオグリカニド、アザチオプリン、ブレキナルナトリウム、ブシラミン、3- アウロチオ-2-プロパノール-1-スルホネートカルシウム、クロラムブシル、クロ ロキン、クロブザリト、クプロキソリン、シクロホスファミド、シクロスポリン 、ダプゾン、15-デオキシスペルグアリン、ジアセレイン、グルコサミン、金塩 （例えば、シクロキン金塩、チオマリン酸金ナトリウム、チオ硫酸金ナトリウム ）、ヒドロキシクロロキン、ヒドロキシ尿素、ケブゾン、レバミゾル、ロベンザ リト、メリチン、6-メルカプトプリン、メトトレキセート、ミゾリビン、ミコフ ェノレートモフエチル、ミオラル、ニトロゲンマスタード、D-ペニシルアミン、 ピリジノルイミダゾル（例えば、SKNF86002およびSB203580）、ラパマイシン、 チオール、チモポイエチン、およびビンクリスチン。類似の鎮痛性特性および抗 炎症特性を有する構造的に関連するSAARDまたはDMARDもまた、この群に包含され ることが意図される。 特定の実施態様において、本発明は、急性および慢性の炎症を含む、上で定義 されたようなTNF媒介性疾患の処置のための、１つ以上のCOX2インヒビター、そ のプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた （処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103 ]-R2タンパク質）の使用に関する。COX2インヒビター、そのプロドラッグエ ステルまたは薬学的に受容可能な塩の例は、例えば、セレコキシブ（celecoxib ）を含む。類似の鎮痛性特性および抗炎症特性を有する構造的に関連するCOX2イ ンヒビターもまた、この群に包含されることが意図される。 特定の実施態様において、本発明は、急性および慢性の炎症を含む、上で定義 されたようなTNF媒介性疾患の処置のための、１つ以上の抗菌剤、そのプロドラ ッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（処置前、 処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タ ンパク質）の使用に関する。抗菌剤として、例えば、アンピシリン、アモキシシ リン、アウレオマイシン、バシトラシン、セフタジジム、セフトリアキソン、セ フォタキシム、セファクロル、セファレキシン、セフラジン、シプロフロキサシ ン、クラブラン酸（clavulanic acid）、クロキサシリン、ジクロキサシラン、 エリスロマイシン、フルクロキサシラン、ゲンタマイシン、グラミシジン、メチ シラン、ネオマイシン、オキサシラン、ペニシリン、およびバンコマイシンが挙 げられる。類似の鎮痛性特性および抗炎症特性を有する構造的に関連する抗菌剤 もまた、この群に包含されることが意図される。 特定の実施態様において、本発明は、急性および慢性の炎症を含む、上で定義 されたようなTNF媒介性疾患の処置のための、１つ以上の以下の化合物のいずれ かと組み合わせた（処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例え ば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タンパク質）の使用に関する：顆粒球コロニー刺激因 子；サリドマイド；BN 50730；テニダップ；E 5531；チアパファントPCA 4248； ニメスリド；パナピル；ロリプラム；RP 73401；ペプチドT；MDL 201,449A；(1R ,3S)-シス-1-[9-(2,6-ジアミノプリニル)]-3-ヒドロキシ-4-シクロペンテン塩酸 ；(1R,3R)-トランス-1-[9-(2,6-ジアミノ)プリン]-3-アセトキシシクロペンタン ；(1R,3R)-トランス-1-[9-アデニル)-3-アジドシクロペンタン塩酸；および(1R, 3R)-トランス-1-[6-ヒドロキシ-プリン-9-イル)-3−アジドシクロペンタン。 特定の実施態様において、本発明は、急性および慢性の炎症を含む、上で定義 されたようなTNF媒介性疾患の処置のための、１つ以上のさらなるTNFインヒビタ ーのいずれかと組み合わせた(処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産 物（例えば、R1−[Cys19-Cys103]-R2タンパク質）の使用に関する。TNFインヒビ ターは、以下の化合物を含む、TNFのインビボ合成または細胞外放出をブロック する化合物およびタンパク質を含む。 さらなるTNFインヒビターは、抗TNF抗体（例えば、MAK 195F Fab抗体（Holler ら(1993)，第１回International Symposium on Cytokines in Bone Marrow Tra nsplantation，147；CDP 571抗TNFモノクローナル抗体（Ranklnら(1995)，Briti sh Journal of Rheumatology，34:334-342、その開示は参考として本明細書に援 用される）；BAY X 1351マウス抗腫瘍壊死因子モノクローナル抗体（Kieftら(19 95)，第７回European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Dis eases，9、その開示は参考として本明細書に援用される）；CenTNF cA2抗TNFモ ノクローナル抗体（Elliottら(1994)，Lancet，344:1125-1127およびElliottら( 1994)，Lancet，344:1105-1110、その開示は参考として本明細書に援用される） を含む。 特定の実施態様において、本発明は、可溶性組換えヒトFas抗原またはその組 換え型（WO 96/20206およびMountzら，J．Immunology，155:4829-4837；およびE P 510 691、これらの開示は参考として本明細書に援用される）と組み合わせた （処置前、処置後、または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103 ]-R2タンパク質）の使用に関する。WO 96/20206は、分泌されたヒトFas抗原 （天然および組換え、Ig融合タンパク質を含む）、可溶性組換えヒトFas抗原を コードするための遺伝子を単離する方法、適切なベクターおよび細胞タイプで遺 伝子をクローニングする方法、およびインヒビターを産生するために遺伝子を発 現させる方法を開示する。EP 510 691は、可溶性Fas抗原を含むヒトFas抗原をコ ードするDNA、このDNAを発現するベクター、およびこのベクターでトランスフェ クトされた形質転換体を教示する。非経口投与される場合、Fas抗原融合タンパ ク質の用量は、それぞれ、一般的に、１μg/kg〜100μg/kgである。 特定の実施態様において、本発明は、リウマチ性疾患（例えば、ライム病、若 年性（リウマチ様）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、およ びstaphylococcal誘導（「敗血症性」）関節炎）のような急性および慢性の炎症 を含む、上で定義されたようなTNF媒介性疾患；外傷、てんかん、出血、または 発作の結果としての脳損傷；および多発性硬化症の処置のための、１つ以上のイ ンターロイキン-１インヒビターのいずれかと組み合わせた（処置前、処置後、 または同時に）、短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タンパク質 ）の使用に関する。インターロイキン-１インヒビターのクラスは、以下に記載 のような、IL-1raのようなインターロイキン-１レセプターアンタゴニスト（I L-1に対する細胞レセプターの活性化を特異的に抑制し得る任意の化合物）を含 む；抗IL-1レセプターモノクローナル抗体（例えば、EP 623674、その開示は参 考として本明細書に援用される）；可溶性IL-1レセプターのようなIL-1結合タン パク質（例えば、米国特許第5,492,888号、米国特許第5,488,032号、米国特許第 5,464,937号、米国特許第5,319,071号、および米国特許第5,180,812号、これら の開示は参考として本明細書に援用される）；抗IL-1モノクローナル抗体（例え ば、WO 9501997、WO 9402627、WO 900637L米国特許第4935343号、EP 364778、EP 267611、およびEP 220063、これらの開示は参考として本明細書中に援用される ）；IL-1レセプター補助タンパク質、例えば、WO 96/23067（その開示は参考と して本明細書に援用される）；およびIL-1のインビボ合成または細胞外放出をブ ロックする他の化合物およびタンパク質。 インターロイキン-１レセプターアンタゴニスト（IL-1ra）は、インターロイ キン-１の天然のインヒビターとして作用するヒトタンパク質である。好ましい レセプターアンタゴニスト、ならびにその製造方法および使用方法は、米国特許 第5,075,222号（本明細書では'222特許という）；WO 91/08285；WO 91/17184；A U 9173636；WO 92/16221；WO 93/21946；PCT国際特許出願第US97/02131（これは 、(a)有効量の制御放出ポリマー（例えば、ヒアルロン酸）および(b)有効量のIL -1raを含む薬学的組成物を教示する）；WO 94/06457；WO 94/21275；FR 2706772 ；WO 94/21235；DE4219626、WO 94/20517；およびWO 96/22793に記載され、これ らの開示は参考として本明細書に援用される。タンパク質は、グリコシル化なら びに非グリコシル化したIL-1レセプターアンタゴニストを含む。 詳細には、それぞれ同じDNAコード配列に由来する、３つの好ましい形態のIL- 1ra（IL-1raα、IL-1raβ、およびIL-1rax）は、Hannumらによって「Interleuki n-1 Inhibitors」と題される米国特許第5,075,222号に開示および記載される。 本明細書で'222特許という、この米国特許は、特に、参考として本明細書に援用 される。３つすべてのこれらのインターロイキン-1インヒビターは、類似の機能 的および免疫学的活性を有する。IL-1インヒビター、特にIL-1raを産生する方法 も、'222特許に開示される。１つの開示された方法は、ヒト単球からインヒビタ ーを単離する工程（天然に産生される場合）を包含する。第２の開示された方法 は、IL-1raをコードする遺伝子を単離する工程、適切なベクターおよび細胞タイ プで遺伝子をクローニングする工程、IL-1raを産生するために遺伝子を発現させ る工程、およびIL-1raを採取する工程を包含する。後者の方法は、一般的に組換 えDNA方法の代表例であり、本発明の好ましい方法である。特定の実施態様では 、IL-1raは、E．coliでの発現の結果としてN-末端メチオニル基を含む。本発明 はまた、改変されたIL-1raを含む。改変されたIL-1raは、例えば、システイン残 基が、天然に存在するインヒビダーのアミノ酸配列中の１つ以上の部位のアミノ 酸に関して置換されている、このようなインヒビターのムテインを含む。次いで 、このようなムテインは、IL-1ra PEG種を作出するために、機能化されたポリエ チレングリコール（PEG）単位または他のスルフヒドリル含有ポリエーテルと、 部位選択的に反応し得る。PCT公開公報第WO 92/16221号は、多くの改変されたIL -1ra種およびこのようなPEG改変ざれたインヒビターの製造方法を開示する。 インターロイキン-1インヒビターの追加のクラスは、IL-1に対する細胞レセプ ターの活性化を特異的に抑制し得る化合物を含む。このような化合物は、可溶性 レセプターおよびモノクローナル抗体のような、IL-1結合タンパク質を含む。こ のような化合物はまた、レセプターに対するモノクローナル抗体を含む。 インターロイキン-1インヒビターのさらなるクラスは、IL-1のインビボ合成お よび／または細胞外放出をブロックする化合物およびタンパク質を含む。このよ うな化合物は、IL-1遺伝子の転写またはIL-1プレタンパク質のプロセシングに影 響を与える薬剤を含む。 上記は、例示のためであり、そして当業者に公知であるか、または本明細書に 記載のガイドラインを使用して当業者が到達し得る、これらの抗炎症化合物と同 時に使用される他の処置を排除しない。 投与の容易さおよび投与量の均一性のために単位投与形態で追加の抗炎症化合 物の組成物を処方することは、特に有利である。本明細書で使用される場合、「 単位投与形態」とは、処置される哺乳動物被験体についての単一の投与量として 適した物理的に別個の単位をいい、各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共 に、所望の治療効果を生じるように算出された所定の量の追加の抗炎症化合物を 含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意 およびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張およ び吸収遅延剤などを含み、これらは、活性成分とならびに投与の熊様および処方 物の他の成分と適合性であり、そしてレシピエントに有害でない。このような媒 体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である（例えば、Remjngton's Phar maceutical Sciences，18版(1990)，Mack Publishing Co.，Easton，PA 18042， 1435-1712頁を参照のこと、その開示は参考として本明細書に援用される）。補 足の活性成分も組成物に組み込まれ得る。 経口治療投与については、迫加の抗炎症化合物が賦形剤とともに組み込まれ得 、そして摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁 液、シロップ、オブラートなどの形態で使用され得るか、あるいは食餌中の食物 とともに直接組み込まれ得る。錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどはまた、以 下のものを含み得る：トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、またはゼ ラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、 アルギン酸などのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；ス クロース、ラクトース、またはサッカリンのような甘味剤；あるいはペパーミン ト、冬緑油、またはサクラもしくはオレンジ香味のような香味剤。単位投与形態 がカプセルである場合、上記のタイプの物質の他に、液体キャリアを含み得る。 種々の他の物質が、コーティングとして、あるいは投与単位の物理的形態を他に 改変するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルは、セラック 、糖または両方でコーティングされ得る。もちろん、任意の単位投与形態を調製 することに使用される任意の物質は、薬学的に純粋であり、そして用いられる量 で実質的に非毒性でなければならない。さらに、追加の抗炎症化合物は、持続放 出調製物および処方物に組み込まれ得る。このような治療に有用な組成物中の追 加の抗炎症化合物の量は、適切な投与量が得られるような量である。 非経口治療投与については、それぞれの追加の抗炎症化合物は、滅菌注射用溶 液とともに組み込まれ得る。滅菌注射用溶液は、以下に列挙される（必要とされ る）種々の他の成分とともに、適切な薬学的に受容可能なキャリア中に必要とさ れる量で追加の抗炎症化合物を組み込み、次いで滅菌濾過することによって、調 製され得る。分散剤の場合では、それぞれは、基本分散媒体および上に列挙され るものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に、追加の抗炎症化合 物を組み込むことによって、調製され得る。滅菌注射用溶液の場合には、それぞ れは、追加の抗炎症化合物の粉末、および必要に応じて、その既に滅菌濾過され た溶液からの任意の追加の所望の成分を組み込むことによって調製され得、ここ で、粉末は任意の適切な技法（例えば、真空乾燥および凍結乾燥）によって調製 される。 追加の抗炎症化合物の特定の用量は、患者の大体の体重または表面積に従って 算出される。適切な投与量を決定することにおける他の要因は、処置または予防 される急性または慢性の炎症性疾患または症状、疾患の重篤度、投与経路、なら びに患者の年齢、性別、および医学的症状を含む。上記の処方物のそれぞれを含 む処置のための適切な投与量を決定するために必要な計算のさらなる工夫は、当 業者によって日常的に行われる。投与量はまた、適切な用量-応答データと関連 して使用される投与量を決定するための公知のアッセイの使用によって決定され 得る。 したがって、例えば、リウマチ性疾患（例えば、ライム病、若年性（リウマチ 様）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、およびstaphylococc al誘導（「敗血症性」）関節炎）のような特定の急性または慢性の炎症性疾患を 処置するために選択された迫加の抗炎症化合物の用量が、所望の治療効果を達成 するために変化され得ることは、本発明の範囲内である。追加の抗炎症化合物の １つが副作用(side effect)を有する場合、それは、組み合わせ治療の交替の処 置期間中患者に与えられ得る。例えば、慢性的なメトトレキセート処置は、胃腸 、肝臓、骨髄、および肺の毒性に関連する（Sandovalら(1995)，British Journa l of Rheumatology，34:49-56、その開示は参考として本明細書に援用される） 。 疾患の改善をモニターするための試験は、例えば、炎症に対する全身応答の決 定に関する特定の試験を含み得、これは、赤血球沈降速度（ESR）および急性期 反応体（APR）を含む。観察は、罹患身体部の腫脹などから行われる。患者の強 直および把握(grip)（適用可能な場合）および疼痛の減少における改善もまた観 察される。患者の症状が安定であるならば、毎週同じ投与量で再処置されそして 毎週評価される。患者の症状が安定であるならば、処置は続けられ得る。処置の ６カ月後、骨格の解剖学的変化は、例えば、Ｘ線撮影法による放射線イメージン グによって決定される。 各期間の最後で、患者は再度評価される。処置前および処置後の放射線医学的 評価、ESRおよびAPR、の比較は、処置の効能を示す。処置の効能および患者の症 状に従って、投与量は、処置の期間にわたり増加または一定に維持され得る。 好ましくは、本発明は、リウマチ性疾患（例えば、ライム病、若年性（リウマ チ様）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、およびstaphyloco ccal誘導（「敗血症性」）関節炎）のような、上で定義された急性または慢性の 炎症性疾患および症状を処置または予防するために、必要に応じて以下の組み合 わせの１つを用いる方法に関する：短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys10 3 ]-R2タンパク質）およびメトトレキセート；短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cy s19-Cys103]-R2タンパク質）、メトトレキセート、およびIL-1インヒビター、好 ましくはIL-1ra；短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タンパク質 ）および任意の１つ以上のメトトレキセート、免疫抑制剤（例えば、シクロスポ リン）、シプロフロキサシン、Fas抗原、およびIL-1インヒビター、好ましくはI L-1ra；短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タンパク質）およびメ トトレキセートおよび免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン）；短縮型sTNFR産 物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タンパク質）およびメトトレキセートおよび シプロフロキサシン；ならびに短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2 タンパク質）およびメトトレキセートおよびIL-1インヒビター、好ましくはIL- 1ra；短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タンパク質）および任意 の１つ以上のメトトレキセート、スルファサジン、およびヒドロキシクロロキン ；短縮型STNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タンパク質）、メトトレキ セート、およびヒドロキシクロロキン；ならびに短縮型sTNFR産物（例えば、R1- [Cys19-Cys103]-R2タンパク質）、メトトレキセート、およびスルファサジン。 特定の好ましい実施態様では、本発明の方法は、上で定義された（例えば、ラ イム病、若年性（リウマチ様）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ様関 節炎、およびstaphylococcal誘導（「敗血症性」）関節炎ならびにそれに付随す る徴候）リウマチ性疾患を処置するために、必要に応じて、メトトレキセートお よび／またはIL-1インヒビター（例えば、IL-1ra）および／または可溶性組換え ヒトFas抗原と組み合わせた（処置前、処置後、または同時処置）、短縮型sTNFR 産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タンパク質、必要に応じて持続放出処方物 （例えば、ヒアルロナン）中に処方される）の投与（例えば、関節内、皮下、ま たは筋肉内）を包含する。 特定の好ましい実施態様では、本発明の方法は、それぞれが神経変性を導き得 る、外傷、てんかん、出血、または発作の結果としての脳損傷を処置するために 、必要に応じて、組織プラスミノーゲンアクチベーターおよび／またはIL-1イン ヒビター（例えば、IL-1ra）と組み合わせた（処置前、処置後、または同時処置 ）、短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タンパク質、必要に応じ て持続放出処方物（例えば、ヒアルロナン）中に処方される）の投与（例えば、 静脈内または脳室内）を包含する。 特定の好ましい実施態様では、本発明の方法は、多発性硬化症を処置するため に、必要に応じて、１つ以上の副腎皮質ステロイド、シクロスポリン、FK-506、 またはインターフェロン（例えば、αインターフエロン、βインターフェロン、 γインターフェロン、またはコンセンサスインターフェロン）および／またはIL -1raと組み合わせた（処置前、処置後、または同時処置）、短縮型sTNFR産物（ 例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タンパク質、必要に応じて持続放出処方物（例え ば、ヒアルロナン）中に処方される）の投与（例えば、皮下または筋肉内）を包 含する。 特定の好ましい実施態様では、本発明の方法は、炎症性腸疾患を処置するため に、必要に応じて、G-CSFおよび／またはIL-1raと組み合わせた（処置前、処置 後、または同時処置）、短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タン パク質、必要に応じて持続放出処方物（例えば、ヒアルロナン）中に処方される ）の投与（例えば、皮下または筋肉内）を包含する。 特定の好ましい実施態様では、本発明の方法は、悪液質／食欲不良を処置する ために、必要に応じて、レプチン、MarinolTM、またはMegaceTMと組み合わせた （処置前、処置後、または同時処置）、短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19- Cys103]-R2タンパク質、必要に応じて持続放出処方物（例えば、ヒアルロナン） 中に処方される）の投与（例えば、皮下または筋肉内）を包含する。 特定の好ましい実施態様では、本発明の方法は、アルツハイマー病を処置する ために、必要に応じて、NSAID（例えば、インドメタシン）および／またはIL-1 インヒビター（例えば、IL-1ra）と組み合わせた（処置前、処置後、または同時 処置）、短縮型sTNFR産物（例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タンパク質、必要に 応じて持続放出処方物（例えば、ヒアルロナン）中に処方される）の投与（例え ば、皮下、脳室内、または莢膜内）を包含する。 特定の好ましい実施態様では、本発明の方法は、ガン（例えば、白血病）；糖 尿病（例えば、若年性１型糖尿病）；移植片対宿主拒絶；肝炎；脳虚血（それぞ れが神経変性を導き得る、外傷、てんかん、出血、または発作の結果としての脳 損傷）を含む虚血／再潅流損傷；神経炎症性疾患；上で定義された（例えば、ラ イム病、若年性（リウマチ様）関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ様関 節炎、およびstaphylococcal誘導（「敗血症性」）関節炎）のようなリウマチ性 疾患；および組織移植を処置するために、必要に応じて、可溶性組換えヒトFas 抗原と組み合わせた（処置前、処置後、または同時処置）、短縮型sTNFR産物（ 例えば、R1-[Cys19-Cys103]-R2タンパク質、必要に応じて持続放出処方物（例え ば、ヒアルロナン）中に処方される）の投与（例えば、皮下、脳室内、または莢 膜内）を包含する。 本発明の他の局面および利点は、以下の例示の実施例の考慮で理解される。 実施例 以下の実施例に記載の多くの手順または適切な代わりの手順についての標準的 方法は、例えば、Sambrookら(1989)，前出およびAusubelら(1990)，前出のよう な分子生物学の広く認識されたマニュアルで提供される。読者の便宜のために、 「mL」は、ミリリットルをいい、「L」はリットルをいう。実施例Ｉ 以下の実施例は、短縮型の組換え可溶性TNFR-Iの種々の形態の産生を教示す る：NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH（sTNFR-I 2.6D/C105） ；NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH（sTNFR-I 2.6D/C106） ；NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH（sTNFR-I 2.6D/N105）；N H2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH（sTNFR-I 2.3D/d8）；NH2-M-[Cys1 9 -Cys103]-FNCSL-COOH（sTNFR-I 2.3D/d18）；およびNH2-MSIS-[Cys19-Cys103]- FNCSL-COOH（sTNFR-I 2.3D/d15）。 Ａ．DNAの調製： Ｉ．sTNFR-I 2.6D/C106 sTNFR-I 2.6D/C106のPCR増幅を、テンプレートとしてクローンλ-gt107ctnfbp （EP 422339）に由来のクローン化cDNAおよび以下のPCRプライマーを使用して行 う： OLIGO#1およびOLIGO#2は、NdeIおよびHindIIIをコードし、そしてそれぞれ、 短縮型遺伝子の5'および3'末端にアニールする。PCR増幅は、25サイクルで行わ れ；各サイクルは、94℃にて30秒の変性、55℃にて15秒のアニーリング、および 72℃にて１分の伸長からなる［Model 2400熱サイクラー（Perkin-Elmer Cetus， Norwalk，CT）］。PCR産物を、製造者の指示に従ってQIAquickTM PCR Purificat ion Kit(QIAGEN，Chatsworth，CA)を使用して精製する。精製されたPCR産物を、 NdeIおよびHindIIIで切断し、次いで製造者の指示に従ってQIAquickTM Gel Extr action Kit(QIAGEN，Chatsworth，CA)を使用してゲル精製する。ゲル単離された PCR産物を、pAMG11に連結し（WO 95/26746）、そしてFM15 E．coli細胞（ATCC 5 5765）中に形質転換する。 ２．sTNFR-I 2.6D/C105 sTNFR-I 2.6D/C105のPCR増幅を、テンプレートとしてのsTNFR-I 2.6D/C106プ ラスミドDNAおよび以下のPCRプライマーを使用して行う： OLIGO#3およびOLIGO#4は、BamHIおよび変異N(105)C次いで停止コドンをコード する。OLIGOを、連結のための新しいBamHI部位の組込みのためのテンプレートの 周囲に完全に伸長するように設計する。PCR増幅は、35サイクル；10サイクル（ 各サイクルは、92℃にて10秒の変性、55℃にて30秒のアニーリング、および68℃ にて４分の伸長からなる）；次いで25サイクル（各サイクルは、92℃にて10秒の 変性、55℃にて30秒のアニーリング、および68℃にて４分＋20秒の伸長からなる ）で行われる［Model 2400熱サイクラー（Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT） ］。PCR産物を、製造者の指示に従ってQIAquickTM Gel Extraction Kit(QIAGEN ，Chatsworth，CA)を使用してゲル精製し、BamHIで切断し、フェノール／クロロ ホルム抽出し、そしてエタノール沈殿する。次いで、これを再懸濁し、pAMG11に 連結し、そしてFM15 E．coli細胞中に形質転換する。 ３．sTNFR-I 2.6D/C105 sTNFR-I 2.6D/N105のPCR増幅を、テンプレートとしてのsTNFR-I 2.6D/C106プ ラスミドDNAおよび以下のPCRプライマーを使用して行う： OLIGO#5およびOLIGO#6は、NdeIおよびBamHIをコードし、そしてそれぞれ短縮 型遺伝子の5'および3'末端にアニールする。PCR増幅は、30サイクルで行われ； 各サイクルは、95℃にて45秒の変性、65℃にて１分のアニーリング、および72℃ にて２分の伸長からなる［Model 2400熱サイクラー（Perkin-Elmer Cetus，Norw alk，CT）］。 PCR産物を、製造者の指示に従ってWizardTM DNA Clean-Up System(Promega，M adison，WI)を使用して精製する。精製されたPCR産物を、NdeIおよびBamHIで切 断し、フェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿する。次いで、 これを再懸濁し、pAMG11に連結し、そしてFM15 E．coli細胞中に形質転換する。 本発明の記載に基づいて、当業者は、種々の物質および方法が、宿主細胞（例 えば、E．coliおよび他の細菌）中での適切な発現について容易に使用または適 用され得ることを理解する。 ４．sTNFR 2.3D/d18 ；sTNFR-I 2.3D/d8；およびsTNFR-I 2.3D/d15 sTNFR-I 2.3D/d18；sTNFR-I 2.3D/d8；およびsTNFR-I 2.3D/d15のPCR増幅を、 テンプレートとしてのsTNFR-I 2.6D/C106プラスミドDNAおよび以下のPCRプライ マーを使用して各々行う： OLIGO#7、OLIGO#9、およびOLIGO♯11はそれぞれ、NdeIをコードし、そしてOLI GO#8、OLIGO#10、およびOLIGO♯12はそれぞれ、HindIIIをコードする。PCR増幅 は、25サイクルで行われ；各サイクルは、95℃にて45秒の変性、65℃にて１分の アニーリング、および72℃にて２分の伸長からなる［Model 2400熱サイクラー（ Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT）］。PCR産物を、製造者の指示に従ってWiza edTM DNA Clean-Up System(Promega，Madison，WI)を使用して精製する。精製さ れたPCR産物を、NdeIおよびHindIIIで切断し、フェノール／クロロホルム抽出し 、そしてエタノール沈殿する。これらを再懸濁し、pAMG11に連結し、そしてFM15 E．coli細胞中に形質転換する。 Ｂ．E．coliでの産生： 最初に、sTNFR-I 2.6D/N105、sTNFR-I 2.6D/C105 sTNFR-I 2.6D/C106、sTNFR- I 2.3D/d18、sTNFR-I 2.3D/d8、およびsTNFR-I 2.3D/d15についての所望の構築 物を有する所望の組換えE．coliクローンの１つの少量の新たに培養した接種物 を、凍結したグリセロールストックシードアンプルの全体の含量（約1.5mL）を5 00mLのLuriaブロスを含む２Ｌフラスコ中に移すことによって開始する。培養物 を、37℃にて350rpmで操作する旋回振盪機でインキュベートする。培養物の密度 を、660nmでの吸光度（OD660）を測定することによって決定する。シード培養 培地を含む15Ｌ産生発酵槽に無菌的に移す。 産生発酵のためのバッチ培地および発酵条件は、Sniff(1993)，「A Chemicall y-Defined Medium for the Overproduction of a Recombinant Protein in E．c oli」学位論文，Colorado State Universityに記載されるような複合培地発酵条 件である。一般的に、参考文献は、カゼイン加水分解物、塩、グリセリン、およ び消泡剤を含む複合培地の使用を教示し、これらは発酵槽中で滅菌される。タン クを40℃より低くまで冷却した後、濾過滅菌した微量ミネラルおよび塩酸チアミ ンを添加する。 培地の温度が37℃で安定である場合、培地に、シード培養物を接種する。培養 増殖を、OD660を測定することによってモニターする。培養物を、5M水酸化ナト リウムおよび5M塩酸の自動的添加によって、6.0のpHで維持する。OD660が9.5と1 0.5との間である場合、培養物を、滅菌イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシ ド（IPTG）の0.50mMの最終濃度までの無菌添加によって誘導する。培養物を、増 殖の停止時に採取する。 培養培地および増殖条件は、以下を除いて、Sniff(1993)、前出に記載される 通りである：硫酸アンモニウム(2.0g/L)およびL-システイン塩酸塩１水和物（1. 0g/L）を培地に添加する；塩酸テトラサイクリンを培地から省く；pHを、水酸化 ナトリウムのみで7.0に維持するのではなく、水酸化ナトリウムおよび塩酸で6.0 に維持する；増殖温度を37℃に上昇させる；インデューサー濃度は、0.15mMから 0.50mM IPTGへと増加させた；そして採取基準は、誘導後の時間ではなく増殖の 停止に基づく。 発酵の完了時に、細胞を、500mLボトル中に遠心分離で採取する。細胞を、10, 000rpmにて30分間、遠心分離によってペレットにする。回収した細胞ペーストを 、50mM Trisおよび５mM EDTAから構成されるpH8.0の破壊緩衝液中に15％固体ま で希釈する。次いで、懸濁した細胞を、8000psi圧で３回操作するホモジナイザ ー（APV Gaulin，Inc.，Everett，MA）に溶液を通過させることによって溶解す る。次いで、ホモジネートを、10,000rpmで30分間遠心分離して、封入体（IB） を回収する。IBを、破壊緩衝液に再懸濁し、そして10,000rpmにて30分間溶液を ３回目の遠心分離によって、洗浄する。IBを、脱イオン水に再懸濁し（1:1比） 、そして２回目の洗浄について10,000rpmにて30分間最後の遠心分離をする。各 タンパク質について回収し洗浄した封入体を、可溶化、再折り畳み、および精製 のために準備する。各操作は、約200〜250gのIBを得る。 代わりの実施態様では、短縮型sTNFR-1は、以下のように発酵され得る： 最初に、sTNFR-I 2.6D/N105またはsTNFR-I 2.6D/C106についての所望の構築物 を有する所望の組換えE．coliクローンの１つの少量の新たに培養した接種物を 、凍結したグリセロールストックシードアンプルの全体の含量（約1.5mL）を500 mLの10g/L BBL酵母抽出物、pH7.0を含む２Ｌフラスコ中に移すことによって開始 する。培養物を、33℃にて300rpmで操作する旋回振盪機でインキュベートする。 培養物の密度を、600nmでの吸光度（OD600）を測定することによって決定する。 L）を、７Ｌの滅菌増殖培地を含む15Ｌ産生発酵槽に無菌的に移す。 産生発酵は、フィード-バッチプロセスを用いる。バッチ培地は、酵母抽出物 、塩、および消泡剤を含む複合培地であり、これらは発酵槽中で滅菌される。タ ンクを40℃以下まで冷却した後、濾過滅菌した微量ミネラル、グルコース、硫酸 マグネシウム、およびヘキサメタホスフェートを添加する。２つのフィードを用 い、第１は、炭素含有フィード（グルコース／硫酸マグネシウム）であり、そし て第２は酵母抽出物を含む窒素フィードである。 バッチ培地の温度が33℃で安定である場合、培地に、シード培養物を接種する 。培養増殖を、OD600を測定することによってモニターする。培養物を、水酸化 アンモニウムおよび48.7％クエン酸の自動的添加によって、7.0のpHで維持する 。OD600が8.0と12.0との間である場合、フィードＩを、指数フィード速度を使用 して開始する。OD600が30と40との間である場合、フィード2を、一定のフィード 速度を使用して開始する。OD600が67〜83に達すると、培養物を、滅菌自己イン デューサー（ホモセリンラクトン）の0.6mg/Lの最終濃度までの無菌添加によっ て誘導する。フィードＩおよびIIの両方の速度を、誘導では一定速度に変化させ る。培養物を、誘導の16±2時間後に採取する。 発酵の完了時に、細胞を、500mLボトル中に遠心分離で採取する。細胞を、10, 000rpmにて30分間、遠心分離によってペレットにする。回収した細胞ペーストを 、50mM Trisおよび５mM EDTAから構成されるpH8.0の破壊緩衝液中に15％固体ま で希釈する。次いで、懸濁した細胞を、8000psi圧で３回操作するホモジナイザ ー（APV Gaulin，Inc.，Everett，MA）に溶液を通過させることによって溶解す る。次いで、ホモジネートを、10,000rpmで30分間遠心分離して、封入体（IB） を回収する。IBを、破壊緩衝液に再懸濁し、そして10,000rpmにて30分間溶液を ３回目の遠心分離によって、洗浄する。IBを、脱イオン水に再懸濁し（1:1比） 、そして２回目の洗浄について10,000rpmにて30分間最後の遠心分離をする。回 収し洗浄した封入体を、可溶化、再折り畳み、および精製のために準備する。 Ｃ．可溶化／再折り畳み： 各10Ｌ発酵全体からの洗浄したIBを、800mLの可溶化緩衝液（50mM Tris、8M尿 素、160mMシステインpH9.5）で可溶化する。可溶化混合物のpHを、10N NaOHで9. 5に調整し、そして２〜３時間室温で撹拌する。各操作は、約200〜250gのIBを得 た。 各可溶化混合物を、冷Renaturation Buffer（50mM Tris、1.1M尿素）中1:20に 希釈する。各最終容量は、約16Ｌである。その後、各混合物を、6N HClでpH9.7 に調整し、そして２〜３日間４℃でゆっくり撹拌する。 次いで、各混合物のpHは、氷酢酸および6N HClで5.0に調整する。各混合物で は、Beckman Model J2-HS遠心機で10,000×gでの遠心分離によって取り出される 沈殿物を形成する。次いで、各物質を、５μmおよび0.22μmフィルターを通して 濾過する。 Ｄ．精製： 再折り畳み物質を、IX-1 SP-Sepharose Big BeadTMカラム（Pharmacia Biotec h，Inc.，Piscataway，NJ）でのカラム精製のために準備する。IX-1 SP-Sepharose Big BeadTM カラム（4.4cm×20cm） 緩衝液Ａ 緩衝液Ｂ 25mMアセテート 25mMアセテート 50mM NaCl 375mM NaCl pH5.0 pH5.0 カラムを、各再折り畳み物質の別々のローディングの前に、４〜５カラム容量 の緩衝液Ａで平衡化する。再折り畳み物質を、精製のためにカラム上に別々にロ ードする。各ローディングについて、カラムを、樹脂１リットル当たり12グラム を越えないタンパク質をロードする。次いで、各ローディングについて、カラム を３〜４カラム容量の緩衝液Ａで洗浄する(U.V.がベースラインに戻るまで)。各 ローディングについて、タンパク質を、50〜375mM NaClで行う塩グラジエントを 増加させる直線的８カラム容量を使用して、カラムから溶出する。各ローディ ングについて全体のタンパク質ピークを、１つのプールに集める。U.V.吸光度が ピーク最大の約20％まで上昇したときに、各タンパク質ピークの収集を始める。 U.V.吸光度がピーク最大の約50％に達するかまたは吸光度の減少が止まるかのい ずれか早い場合に、プールすることを停止する。 流速− 平衡化、洗浄について7.5cv/時間 ローディングについて15cv/時間 溶出について６cv/時間 各カラム精製を４℃にて行う。 各IX-1プールを、Toyo PearlTM Butyl 650M HICカラム（Toso Haas，Philadel phia，PA）での精製のために準備する。300mL −Toyo Pearl ButylTM 650Mカラム（4.4cm×20cm） 緩衝液Ａ 希釈緩衝液 緩衝液Ｂ 20mM NaPO4 40mM Na NaPO4 Milli Q H2O 1.8M NaCl，pH6.0 4M NaCl pH6.0 カラムを、各IX-1プール物質の別々のローディングの前に４〜５カラム容量の 緩衝液Ａで平衡化する。各IX-1プールを希釈緩衝液で1:1に希釈し、そしてpHを6 .0に調整する。各ローディングについて、希釈したIX-1プールをカラム上にロー ドする。各ローディングについて、カラムを、樹脂１リットル当たり10グラムを 越えないタンパク質でロードする。各ローディングについて、カラムを３カラム 容量の緩衝液で洗浄する。各ローディングについて、タンパク質を、1.8M NaCl からH2Oで行う塩グラジエントを減少させる直線的８カラム容量でカラムから溶 出する。各タンパク質ピークの収集を、U.V.吸光度がピーク最大の約15〜20％ま で上昇したときに開始する。U.V.吸光度がピーク最大の約50％に達するかまたは 吸光度の減少が止まるいずれかより早い場合に、プールすることを停止する。 流速− 平衡化、ローディング、および洗浄について６cv/時間 溶出について３cv/時間 各カラム精製を、室温で行う。 各HICプールを、濃縮／ダイアフィルトレーションのために準備する。濃縮／ダイアフィルトレーション（C/D） １sq ft PLCCTM再生セルロース、5,000M.W.カットオフメンブレン（Milli-Por e，Bedford，MA）を、各HICプールについてのC/D工程に使用する。各HICプール を、約200mLまで濃縮し、次いで電導率が＜４mm時間になるまで、６〜７容量の2 0mM NaPO4 pH6.0に対してダイアフィルトレートする。 各濃縮／ダイアフィルトレーション工程を室温で行う。 次いで、各C/Dプールを、IX-2‐365mL SP-Sepharose HPTMカラム（Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，NJ）での精製のために準備する。IX-2 ‐365mL SP-Sepharose HPTMカラム（5cm×18.5cm） 平衡化緩衝液 緩衝液Ａ 緩衝液Ｂ 20mM Na NaPO4 20mM NaPO4 20mM NaPO4 pH6.0 pH6.3 50mM NaCl pH6.8 カラムを、各C/Dプールの別々のローディングの前に４カラム容量の平衡化緩 衝液で平衡化する。各C/Dプールを、樹脂１リットル当たり８グラムを越えない タンパク質を使用してカラムにロードする。各ローディングについて、カラムを ３カラム容量の平衡化緩衝液で、次いで３カラム容量の緩衝液Ａで洗浄する。各 ローディングについて、タンパク質を、6.3〜6.8のpHグラジエントおよび０〜50 mM NaCl（緩衝液Ｂ）で行う塩グラジエントからなる直線的８カラム容量グラジ エントで、カラムから溶出する。プールすることを、ピークの前側が1.0 O.D.を 越えたときに開始し、そして後ろ側のピーク最大の50％で停止する。 代わりの実施態様では、短縮型sTNFR-1は、以下のように、可溶化され、再折 り畳みされ、そして精製され得る： C.1 可溶化／再折り畳み： 洗浄したIBを、8M尿素、60mM Tris、100mMシステインで可溶化し、6.5M尿素、 50mM Tris、および80mMシステイン、pH9.4、および５〜10mg/mL短縮型sTNFR-1の 最終濃度を得る。（後者は、g/Lベースでの洗浄したIB中の短縮型sTNFR-Iの量の 定量に基づく。）物質を、室温で90分間撹拌し、次いで冷（４〜８℃）０.85M尿 素、50mM Tris、pH9.8（pH測定を４〜８℃で行った）中に1:10に希釈することに よって再折り畳みする。 再折り畳み溶液を、４〜８℃にて24〜72時間撹拌する。この時間の最後に、氷 酢酸（約20mM）を添加し、そしてpHを5.0に調整する。形成する沈殿物を遠心分 離によって除去し、そして上清を、第１のカラムをローディングするために蓄え る。 D.1 精製 澄明にした酸沈殿プールを、20mM酢酸ナトリウム、75mM NaCl、pH5.0で平衡化 されているSP-Sepharose Big BeadTMカラム（Pharmacia Biotech，Inc.，Piscat away，NJ）にロードする。カラムに、ベッド容量１Ｌ当たり15gを越えない短縮 型sTNFR-1をロードする。ローディング後、カラムを、３カラム容量の20mM酢酸 ナトリウム、75mM NaCl、pH5.0で洗浄し、そして20mM酢酸ナトリウム、pH5.0中7 5mM〜450mM NaClの直線的９カラム容量グラジエントで溶出する。全体のSP-Seph arose Big BeadTMカラム（SP-BB）工程を、４〜８℃で行う。 必要であれば、SP-BBプールを、2M NaCl、60mM酢酸塩、pH4.5で1:1に希釈し、 そしてpHを4.5に調節する。希釈したSP-BBプールを、1M NaCl、30mM酢酸塩、pH4 .5で平衡化されているToyopearlTM Butyl 650Mカラム（Toso Haas，Philadelphi a，PA）にロードする。カラムに、ベッド容量１リットル当たり約10〜13グラム の短縮型sTNFR-1をロードする。ローディング後、カラムを、３カラム容量の1M NaCl、30mM酢酸塩、pH4.5で洗浄し、そして30mM酢酸塩、pH4.5中の1M〜0M NaCl の直線的８カラム容量グラジエントで溶出する。 Butyl 650Mカラムからの精製した短縮型sTNFR-1画分をプールし、水で1:5に希 釈し、そして30mM酢酸塩、pH4.5で平衡化されているSP-Sepharose High Perform anceTMカラム（SP-HP）（Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，NJ）上にロー ドする（約15g/Lベッド容量を越えないローディング）。次いで、カラムを、３ カラム容量の30mM酢酸塩、pH4.5で洗浄し、そして30mM酢酸塩、pH4.5中の100・M 〜400mM NaClで行う直線的12カラム容量グラジエントで溶出する。精製した短縮 型sTNFR-1画分をプールし、そしてNaOHでpH5.0に調節する。 Ｃ．PEG化： １．sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) の調製 50mM酢酸ナトリウム、pH4中のsTNFR-2.6D/N105（3.5mg/ml）の冷却した（４℃ ）撹拌した溶液に、３倍モル過剰のt-BuPEG（モノ-t-ブトキシ-ポリエチレング リコール、平均MW＝33kDa、Shearwater Polymers，Inc.）を添加する。NaCNBH3 を添加して、20mMの最終濃度にし、そして反応混合物を７℃にて18〜24時間撹拌 する。 反応の経過中のタンパク質改変の程度を、0.7ml/分にて0.1Mリン酸ナトリウム 緩衝液pH6.9、0.5MNaCLおよび10％エタノールで溶出するTSKG3000swXLカラム（T oso Haas，Montgomeryville，PA）を使用するSEC HPLC（Toso Haas，Montgomery ville，PA）によってモニターする。 反応混合物のpHを、1M HClで約3.5に調節し、そして反応混合物を水で希釈し て、1.5mg/mlの最終タンパク質濃度にする。 sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)を、SP Sepharose HP 16/10TMイオン交換 クロマトグラフィー（Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，NJ）を使用する ことによって、過剰のt-BuPEGおよび他の反応副産物から分離する。 反応混合物を、カラム上にロードし、そして未反応t-BuPEGを、３カラム容量 の開始の緩衝液Ａ（20mM酢酸ナトリウム、pH4.0）で溶出する。sTNFR-I 2.6D/N1 05-t-BuPEG(33kDa)を、０〜30％緩衝液Ｂ（20mM酢酸塩、pH4.0中の1M NaCl）の 直線的20カラム容量グラジエントを使用して溶出する。溶出物を280nmでモニタ ーする。sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)を含む各画分を、４〜20％プレキャ ストしたグラジエントゲル（Novex，San Diego，CA）を使用してSDS-PAGEによっ て分析する。SDS-PAGE分析結果に基づいて、画分をプールし、濃縮し、そして滅 菌濾過する。精製したsTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)の各最終プールを、SD S-PAGEおよびSEC HPLCによって再度分析する。このタンパク質を、10mMリン酸ナ トリウム、pH6.5および20mMNaCl中に処方する。 ２．sTNFR-I 2.6D/N105-33kDa(MePEG) の調製 sTNFR-2.6D/N105（4mg/ml）の冷却した（７℃）撹拌した溶液に、pHが5.0にな るまで10％酢酸を添加する。この溶液に、15mM NaCNBH3および２倍モル過剰のt- ブトキシPEG（t-ブトキシポリエチレングリコール、平均MW＝33kDa、Shearwater Polymers，Inc.）を添加する。反応混合物を、同じ温度で簡単に撹拌し、次い で約18時間インキュベートする。 18時間後、反応混合物中のタンパク質濃度を、クエン酸でpH3.0に調節する。 sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33kDa)を、SP Sepharose HPTMカラム（Pharmacia B iotech，Inc.，Piscataway，NJ）を使用するイオン交換クロマトグラフィーによ って、過剰のMePEGおよび他の反応副産物から分離する。 反応混合物を、カラム上にロードし（8mg/ml樹脂を越えない）、そして未反応 MePEGを、３カラム容量の開始の緩衝液Ａ（20mMクエン酸ナトリウム、pH3.0）で 溶出する。sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33kDa)を、20mMクエン酸塩、pH3.0中の0.1 〜0.5M NaClの直線的な16カラム容量グラジエントを使用して溶出する。溶出物 を280nmでモニターする。sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33kDa)を含む各画分を、４ 〜20％プレキャストしたグラジエントゲル（Novex，San Diego，CA）を使用して SDS-PAGEによって分析する。SDS-PAGE分析結果に基づいて、画分をプールし、濃 縮し、そして滅菌濾過する。精製したsTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33kDa)の各最終 プールを、SDS-PAGEによって再度分析する。精製したsTNFR-I 2.6D/N105-MePEG( 33kDa)を５〜20mg/mLに濃縮し、そしてPBS、pH6.5（10mMリン酸ナトリウム、35 〜100mM NaCl）または20mM酢酸塩、100mM NaCl、pH5.0のいずれか中に処方する 。 ３．sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(20kDa) の調製 sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33kDa)の調製のための工程Ａの手順を、MePEG（モ ノ-メトキシ-ポリエチレングリコール、平均MW＝20kDa、Shearwater Polymers， Inc.）を、MePEG（モノ-メトキシ-ポリエチレングリコール、平均MW＝33kDa、Sh earwater Polymers，Inc.）に置換することを除いて、実質的に繰り返す。この タンパク質を、10mMリン酸ナトリウム、pH6.5および20mM NaCl中に処方する。 ４．追加の結合体の調製 sTNFR-2.6D/N105の追加の結合体を、以下のタイプのPEGアルデヒド（Shearwat er Polymers，Inc.）を使用することを除いて、実質的にsTNFR-I 2.6D/N105-MeP EG(33kDa)のように調製する： 直線状単官能性− MW 5kDa、6kDa、および57kDa； 分枝状単官能性− MW 10kDa、20kDa、および40kDa； 直線状二官能性− MW 8kDaおよび20kDa； 分枝状三官能性− MW 10kDa。 これらのタンパク質を、10mMリン酸ナトリウム、pH6.5および20mM NaCl中に処方 する。 ５．代わりのPEG化方法 代わりの実施態様では、短縮型sTNFR-1分子は、以下の技法によってPEG化およ び精製され得る： SP-HP溶出物（pH5.0に調節した３〜５mg/mL）を、１モルのsTNFR-I 2.6D/N105 当たり２モルのポリエチレングリコール（例えば、MePEGまたはt-BuPEG）（１グ ラムのsTNFR-I 2.6D/N105当たり約５グラムのt-BuPEG）と反応させる。ポリエチ レングリコールの溶解後、10〜20mMシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、そ して溶液を７〜15℃にて一晩インキュベートする。PEG化反応の最後に（約18時 間）、反応を、10mMグリシンを添加することによって停止する。 PEG化混合物を、必要であればpH4.0に調節した、４容量の50mM酢酸塩、pH4.0 で希釈し、そして50mM酢酸塩、pH4.0で平衡化されているSP-HPカラム上にロード する。カラムに、ベッド容量Ｉリットル当たり約８グラムを越えないsTNFR-2.6D /N105をロードする。ローディング後、カラムを３カラム容量の平衡化緩衝液で 洗浄し、そして50mM酢酸塩、pH4.0中の直線的０〜0.3M NaClグラジエントで溶出 する。sTNFR-2.6D/N105-30kDaモノPEG化画分を集め、pH5.0に調節し、濃縮し、 そして等張処方緩衝液にダイアフィルター(diafllter)する。すべての精製工程 を室温にて行う。タンパク質を、PBS、pH6.5（10mMリン酸ナトリウム、35〜100m M NaCl）または20mM酢酸塩、10mM NaCl、pH5.0のいずれかに処方する。 ６．sTNFR-I 2.6D/C105 ダンベルおよびsTNFR-I 2.6D/C106ダンベルの調製 スルホン活性化ポリエチレングリコール（1995年6月7日に出願された米国特許 出願第08/473,809号および1996年3月6日に出願された米国特許出願第08/611,918 号に実質的に従って調製および精製される）［PEG-20,000-bis−ビニルスルホン ］を使用して、還元および反応条件を除いて、PCT公開公報第WO 95/34326号に記 載の方法に実質的に従って、タンパク質をダイマー化する。タンパク質を、ポリ エチレングリコールの付加の前に、５〜６℃、pH7.6でタンパク質１モル当たり ４モルのDTTで還元する。すべての反応を、30％グリセロールの存在下で行う。 ダイマー化したタンパク質を、sTNFR-I 2.6D/C105dbおよびsTNFR-I 2.6D/C106db と呼ぶ。各タンパク質を、PBS、pH6.5（10mMリン酸ナトリウム、35〜100mM NaCl ）または20mM酢酸塩、100mM NaCl、pH5.0のいずれかに処方する。 ７．比較用sTNFR-I分子の調製 (1)．sTNFR-I 4D/N105を、EP422339に記載のように調製する。sTNFR-I 4D/N105- t-BuPEG(33kda)を、sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)のPEG化についての上記 の手順に実質的に従ってsTNFR-I 4D/N105をPEG化することによって調製する。sT NFR-I 4D/N105-t-MePEG(33kda)を、sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33kDa)のPEG化に ついての上記の手順に実質的に従ってsTNFR-I 4D/N105をPEG化することによって 調製する。sTNFR-I 4D/C105およびsTNFR-I 4D/C105dbを、PCT公開公報第WO 95/3 4326号に記載のように調製する。このタンパク質を、10mMリン酸ナトリウム、pH 6.5および20mM NaCl中に処方する。 (ii)．sTNFR-I 4D/C105-33kDa(MePEG)を、反応がsTNFR-Iの１モル当たり1.3モル のDTTとpH7.5にて約５〜６時間起こり、次いでSP-SepharoseTM FFカラムでのDTT の除去およびタンパク質１モル当たり1.5〜3モルのPEGとの少なくとも15時間室 温でのPEG化を行うことを除いで、sTNFR-1 2.6D/C105-33kDa(MePEG)のPEG化につ いての上記の手順に実質的に従って、4D/C105をPEG化することによって調製する 。このタンパク質を、PBS、pH6.5（10mMリン酸ナトリウム、35〜100mM NaCl）ま たは20mM酢酸塩、100mM NaCl、pH5.0のいずれかに処方する。 (iii)．sTNFR-I 3D/N105（sTNFR-I 4D/N105のＣ末端34アミノ酸の短縮）を、以 下のように調製する。PCR増幅を、テンプレートとしてsTNFR-I 4D/N105、ならび にそれぞれNdeIおよびHindIIIをコードするOLIGO#13およびOLIGO#14を使用して 行い、そしてそれぞれ短縮型遺伝子の5'および3'末端にアニールする。PCR増幅 を、25サイクルについて行う：各サイクルは、94℃にて30秒の変性、60℃にて15 秒のアニーリング、および72℃にて１分の伸長からなる［Model 2400熱サイクラ ー（Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT）］。PCR産物を、QIAquickTM PCR Purif ication Kit(QIAGEN，Chatsworth，CA)を使用して精製する。精製したPCR産物を 、NdeIおよびHindIIIで切断し、次いでQIAquickTM Gel Extraction Kit(QIAGEN ，Chatsworth，CA)を使用してゲル精製する。ゲル単離したPCR産物を、pAMG11に 連結し、そしてFM15 E．coli細胞に形質転換する。 このタンパク質を、10mMリン酸ナトリウム、pH6.5および20mM NaCl中に処方す る。 (iv)．sTNFR-I 3D/C105（sTNFR-I 4D/C105のＣ末端34アミノ酸の短縮）を、テン プレートがsTNFR-I 4D/C105であることを除いて、sTNFR-I 3D/N105と実質的に同 様に調製する。sTNFR-I 3D/C105を、PBS、pH6.5（10mMリン酸ナトリウム、35〜1 00mM NaCl）または20mM酢酸塩、100mM NaCl、pH5.0のいずれかに処方する。 (v)．sTNFR-I 3D/C105dbを、sTNFR-I 4D/C105の代わりにsTNFR-I 3D/C105を開始 物質として使用することを除いて、sTNFR-I 4D/C105dbと実質的に同様に調製す る。sTNFR-I 3D/C105dbを、PBS、pH6.5（10mMリン酸ナトリウム、35〜100mM NaC l）または20mM酢酸塩、100mM NaCl、pH5.0のいずれかに処方する。実施例II 種々の形態の短縮型組換え可溶性TNFR-Iを、それらがTNF活性を阻害する能力 について評価する。 Ａ．WEHI細胞傷害性アッセイ： WEHIアッセイは、インビトロ細胞増殖アッセイである（Edwardsら(1991)，End ocrinology，128:989-996）。細胞株は、TNF-αに感受性である（すなわち、TN Ｆ-αは細胞傷害性である）。TNF-αインヒビターの存在下では、細胞は、細胞 傷害効果から防御され、したがって増殖し得る。 プロトコル： TNF感受性WEHI 164クローン13細胞（ATCC，Rockville，MD）を、５％ウシ胎児 血清（Hyclone，Ogden，UT）およびペニシリン50U/mL：ストレプトマイシン50mg /mLを補充したRPMI（Gibco，GrandIsland，NY）培地中、20×104細胞/mLの濃度 で懸濁する。この細胞懸濁液の100μLを、平底96ウェルマイクロタイタープレー トの各ウェルにいれ、そして細胞を５％CO2中37℃にて４〜６時間接着させる。 各ウェルに、10μLの0.0060mg/mLアクチノマイシン-D（Sigma Chemical Co.，St ．Louis，MO）を添加する。50ng/mlで10μLの組換えヒトTNFα（5ng/mlの最終濃 度）を、各ウェルに添加する。連続希釈した２倍濃度の種々のsTNFR形態（sTNFR -I 2.6D/C106、sTNFR-I 4D/C105、およびsTNFR-I 4D/C105db）をPBSで希釈し、 次いで組換えヒトTNF-αの添加後に、接着WEHI 164細胞を含む２組のウェル（10 μL/ウェル）に添加する。WEHI-164クローン13細胞を、５％CO2中で37℃にて18 時間インキュベートする。インキュベーション後、有機染料MTTテトラゾリウム( 3-[4,5-ジメチルチオゾール-2-イル]2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド：S igma Chemical Co.，St．Louis，MO）の２mg/mLの10mLを添加し、そして細胞を さらに４〜６時間インキュベートする。細胞を、50μL DMF/SDS溶液（20％SDSお よび50％N,Nジメチルホルムアミド、pH4.7）の添加によって溶解する。すべての MTT結晶が溶解するまで、DMF/SDS溶液を数回ピペットで上下させ、そして細胞を さらに２〜22時間インキュベートする。吸光度（abs）を570でのVmaxリーダーで 読む。特異的細胞傷害性のパーセントを、以下の式を使用して光学密度から算出 する：％特異的細胞傷害性＝100％×［abs（細胞＋培地）−abs（細胞＋試料） ］／abs（細胞＋培地）−abs（細胞＋TX−100）］。各試料中のTNFのユニットの 数を、既に記載のように、マウス標準の特異的細胞傷害性のパーセントを使用し て決定する。 WEHIアッセイ結果を、以下の表２にまとめる： WEHIアッセイの結果に基づいて、インビトロバイオ効率の点で、sTNFR-I 2.6D /C106とsTNFR-I 4D/C105との間の顕著な差はない。 Ｂ．L929細胞傷害性アッセイ： L929細胞傷害性アッセイは、TNF-α-感受性殺傷の細胞傷害性も評価するイン ビトロ細胞増殖アッセイである（Parmelyら(1993)，J．Immunol.，151:389-396 ）。細胞株はTNF-αに感受性である（すなわち、TNF-αは細胞傷害性である）。 可溶性TNF-αインヒビターの存在下、細胞は細胞傷害性効果から防御され、した がって増殖し得る。 プロトコル： L929細胞株を、アメリカンタイプカルチャーコレクション(カタログ番号CCLl ，NCTCクローン929，L株のクローン，結合組織，マウス)から得る。増殖に使用 される培地は、10％FBS＋１％L-グルタミン溶液＋１％ペニシリン−ストレプト マイシン溶液を補充したRPMI Medium 1640である。 96-ウェルマイクロタイタープレート（Corning）をアッセイで使用し、そして 内側の60ウェルのみを利用する。標準および試験試料を、同じプレート上で３つ 組で試験する。 アッセイで使用されるTNFαは、R&D Systems(Minneapolis，MN)からである。 アッセイで使用されるTNFαの最終濃度は、すべてのアッセイウェルで1ng/mLで ある。 アッセイ希釈剤は、L929増殖培地、10ng/mLのTNFα、および10μg/mLのアクチ ンマイシンD（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）。 プレートを、XTT/MEN溶液（1.5mg/mL XTT＋75mM MEN）を使用して採取する。 １日目に、細胞をアッセイプレートにプレートする。細胞懸濁液をトリプシン 処理し、そして3.33×104細胞/mLで細胞を再懸濁することによって調製する。こ の細胞懸濁液の180mLを、アッセイプレートの内側の60ウェルのそれぞれに入れ る。200mLの増殖培地を、アッセイにおけるエバポレーションアーチファクトを 避けることを助けるために、外側の36ウェルに分散する。プレートを、ホイルで カバーして通気をなくし、約１時間室温に放置する。アッセイプレートを、37± 2℃高湿度5±1％CO2インキュベーター中に置く。プレートを、sTNFR-I連続希釈 の添加前に約20〜22時間インキュベートする。 ２日目、sTNFR-I 4D/N105標準および試験試料を調製する：希釈sTNFR-I 4D/N1 05標準、および約2.0mg/mLの濃度までの試験試料（または別の適切な濃度）。０ ng/mL（アッセイ希釈のみ）点を含む、約1.0×106ng/mL〜1.0×10-3ng/mLの範囲 の10点の希釈曲線を得るために、この濃度の連続希釈を作成する。他の濃度が 適切であるならば、それらが使用され得る。各アッセイプレートに三連で1000μ Lの各希釈を添加する。連続希釈アリコートをアッセイプレートに移した後、37 ±2℃高湿度5±1％CO2インキュベーター中で20±1時間プレートをインキュベー トする。 ３日目、50μL/ウェルのXTT/MEN溶液を、アッセイプレートの内側の60ウェル に添加する。プレートを、37±２℃高湿度5±1％CO2インキュベーター（Falcon ，New York，New York）中で24±0.5時間インキュベートする。 ４日目、アッセイプレートの光学密度（O.D.）を、ELISAプレートリーダー（S pectraMAX，Beckman Instruments，Inc.，Fullerton，CA）で450nm−（マイナス ）650nmで読む。4.000 ODの値が、これらの波長でプレート中のウェルについて 得られるならば、プレートは、490nm−650nmですぐに再読されるべきであり、そ して490nm−650nmデータが、計算に使用されるべきである。 標準用量−応答曲線対対数を、４パラメータロジスティック曲線適合を使用し て作成する。標準曲線から算出される未知試料の元の濃度を算出し、そして標準 についてのED50および標準曲線適合についての相関係数を算出する。 結果： L929細胞傷害性アッセイ結果を以下の表３にまとめる： データは、sTNFR-I 4D/C105dbならびにsTNFR-I 2.6D/C105dbおよびsTNFR-I 2. 6D/C106dbが、活性であり、そして標準と比較した場合かなり用量応答を有する ことを示す。データはまた、sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa)およびsTNFR-I 2. 6D/C105-t-BuPEG(33kDa)が、活性でほぼ２対数低いが、それにも関わらず、sTNF R-I 4D/C105dbと比較した場合、このアッセイで活性であることを示す。 これらのデータは、sTNFR-I 3D/C105dbが活性であり、そしてED50値が、sTNFR -I 4D/C105db（実行＃1)、sTNFR-I 2.6D/C105db（実行＃1）、およびsTNFR-I 2. 6D/C106db（実行#1）の範囲にあることを示す。データはまた、sTNFR-I 3D/N105 が、sTNFR-I 4D/C105内部標準よりも活性でないことを示す。 Ｃ．Streptococcus細胞壁誘導した再活性化モデル： ラットアッセイにおける関節炎のStreptococcus細胞壁誘導した再活性化モデ ルを、公知のプロトコルを使用して完成する（Esserら(1985)，Arthritis And R heumatlsm，28:1402-1411およびMakarovら(1996)，Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，93:402-406）。 プロトコル： それぞれ175〜185グラムの体重の雌Lewisラット（Charles River Laboratorie s，Inc.，Wilmington，MA）に、ペプチドグリカン−ポリサッカライド（SCW）（ Lee Laboratory，Grayson，GA）を含むstreptococcusの細胞壁産物の滅菌懸濁液 を、関節当たり1.5mg/10mgの用量で、右足首関節に関節内注射する。生理食塩水 を、コントロールを提供するために反対側の関節に注射する。SCWの関節内注射 は、注射の１〜２日後にピークとなる関節の腫脹を伴う比較的短期の急性関節炎 を生じる。急性炎症反応が消散した20日の期間の後、SCWを、ラット当たり200mg /200mLの用量で静脈内注射によって再度投与する。SCWの２回目の投与は、SCWを 既に注射された足首関節において炎症を再活性化するために十分であり、そして 生理食塩水注射した足首にほとんど効果がない。SCWの静脈内注射後の72時間の 期間中に炎症の程度を評価するために、足首関節の大きさを、関節炎の再活性化 の後の０、24、36、48、および72時間に、後側足首の足首カリパス測定次いで組 織学（例えば、炎症、パンヌス形成、軟骨傷害、および骨傷害）について反対の 後側足採取によって測定する。， 結果： 投与した場合のsTNFR-I 2.6D/C106dbの効果を、関節炎の再活性化中の関節腫 脹の発達について試験する。インヒビターおよびビヒクルを、SCWでの再活性化2 4時間前に単回静脈内注射でそれぞれ投与する。 sTNFR-I 2.6D/C106dbは、再活性化後２および３日目にすべて４用量でならび に１日目に１用量（1.5mg/kg）を除くすべての用量において、分散（ANOVA）フ る統計学的に有意な効能を証明する。腫脹のこの減少は、再活性化の１日前に始 まり再活性化の３日後までの毎日0.5mg/kgの用量（すなわち、8.8nM）で与えら れるsTNFR-I 4D/C105dbの陽性コントロールに匹敵する。sTNFRはまた、腫脹の量 が全体として３日を越えると考えられる場合、有意な効能を示す。曲線下面積（ AUC）は、すべての用量で用量−応答相関関係を示す（例えば、図９を参照のこ と、ここでsTNFR-I 2.6D/C106dbは「sTNFR-I 2.6D」といい、そしてsTNFR-I 4D/ C105dbは「sTNFR-I 4D」という）。 sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)は、モデルの中で疾患コントロール群と比 較した場合、足首幅および組織学的指標の顕著な減少を示す。 Ｄ．D-ガラクトサミン／リポポリサッカライドモデル： D-ガラクトサミン（D-GalNH2）/リポポリサッカライド（LPS）モデル（Parmel yら(1993)，前出）は、致死率のインビボの非常にTNF-α-依存的動物モデルであ る。さらに、MRL-1pr/1pr自己免疫マウスは、LPS-またはSEB-誘導されたTNF-α に非常に感受性であることが示されている（Mountzら(1995)，J．Immunol.，155 :4829-4837）。 プロトコル： 一晩の絶食後、６〜８週齢の雌MRL-lpr/lprマウス（Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME）に、以下の薬理学的試薬でI.P.投与する：Hank's平衡化塩溶液(Gib co Laboratories，Inc.，Grand Island，NY)に懸濁した25mgのD-GalNH2(SigmaCh emical Co.，St．Louis,MO)(50mg/mL)；および滅菌のエンドトキシンを含まない リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）(25mg/マウス)中のE．coli血清型0127:B8(Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)または正常生理食塩水中のSEB（Toxin Technolo gies，Sarasota，FL）(50mg/マウス)からのリポポリサッカライド（LP 統計学的ソフトウエアで生成したED50曲線を得るために、連続２倍希釈（mg/kg 投与量）で投与する。致死率は、投与後＋48時間まで続く。 結果： 以下の表４に示すように、sTNFR-I 2.6D/C106dbが上記のようにLPS/DGalNH2投 与の１時間前に投与される場合、48時間でのED50（すなわち、50％防御に必要な sTNFR-I 2.6D/C106dbの用量）は、約50μg/kgである（N=8個々のマウス）。sTNF R-I 4D/C105dbとの比較では、この形態が致死率を抑制する能力に有意な（P＞0. 05）差はない（ED50=約50μg/kg；N=8個々のマウス）。 データは、sTNFR-I 2.6D/C106dbが、sTNFR-I4D/C105dbと比較して等しい活性 を有するが、sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)は、約400μg/kgC7)ED50(n=5個 々のマウス）を有するこのモデルではあまり活性でないことを示す。さらに、sT NFR-I 2.6D/N105-MePEG(20kDa分枝)およびsTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(40kDa分枝) の活性は、このモデルであまり活性ではない。 Ｅ．アジュバント誘導関節炎モデル： アジュバントによって、ラットにおいて誘導されるリウマチ様関節炎は、ヒト リウマチ様関節炎と多くの類似点を有する。この実験の目的は、短縮型sTNFRの 全身投与が、マウスにおけるアジュバント誘導関節炎の病理において緩和作用を 有することを証明することである。 プロトコル： 少なくとも200gの体重の雄Lewisラット（５〜７/群）（Charles River Labora tories，Inc.，Wilmington，MA）にSQカテーテルをカニュレーションし、そして 数日間回復させる。次いで、これらを注入ケージに入れ、そして生理食塩水注入 を開始する前１週間順応させる。 ０日目に、すべてのラットに、合成アジュバント、N,N-ジオクチルデシルデシ ル-N',N-ビス(2-ヒドロキシエチル)プロパンジアミン、50mg/mlが添加される100 μlのフロイント完全アジュバント（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）を注 射する。８日目に、種々の群のラットに、sTNFR-I 4D/C105およびsTNFR-I 2.6D/ N105の連続SQ注入によって投与する。 結果を表５に記載する。 驚くべきことに、sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)およびsTNFR-I 4D/C105d bは、Lewisラットにおけるアジュバント関節炎にかなり抗関節炎活性であるが、 sTNFR-I 4D/C105dbは、WEHI-164およびL929インビトロ細胞傷害性アッセイなら びにLPS/GalNモデルにおいてより強力である。 Ｆ．コラーゲン誘導関節炎モデル： ラットにおけるII型コラーゲン誘導関節炎は、ヒト慢性関節リウマチに多くの 類似点を有する。この実験の目的は、短縮型sTNFRの全身投与が、ラットおよび マウスにおけるII型コラーゲン誘導関節炎の病理を緩和する効果を有することを 証明することである。 ラットプロトコル： 雌Lewisラット（Charles River Laboratories，Inc.，Wilmington，MA）にSQ カニューレを移植し、そして連続注入のためのテザリング（tethering）に順応 させる。続いて、フロイント不完全アジュバント中のウシII型コラーゲンで免疫 する。免疫後13、14、または15日目に、樹立した関節炎を有する動物を、各８動 物の群にランダムに分ける。実験群に、７日間、表６に記載のように、ビヒクル または種々の用量のsTNFR-Iを注入する。足炎症を、足首関節の毎日のカリパス 測定によって評価する。７日目に、動物を安楽死させ、そして足を、炎症のイン デックスとしての重量決定のために集める。足首および膝関節を、関節炎パラメ ータの組織病理学的評価のために集める。 結果を表６Ａに記載する。 興味深いことに、ラット樹立コラーゲンモデルでは、すべての処置群は、効能 がほぼ同じである（例えば、曲線形状、30〜59％の範囲の曲線下面積（AUC）の 阻害パーセント(%)、および40〜64％の範囲の足重量阻害）。処置をしない群は 、関節炎のこのモデルにおいて他とは統計学的に異なる。 マウスプロトコル： 雄DBA/1（Jackson Laboratories，Inc.，Bar Harbor，ME）を、フロイント不 完全アジュバント中のウシII型コラーゲン（Sigma Chemical Co.，St．Louls，M O）で免疫する。免疫後24、25、および26日目に、樹立した関節炎を有する動物 を、各８動物の群にランダムに分ける。実験群に、連続する３日間（＋27、＋28 、＋29日）、生理食塩水またはsTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33kDa)のいずれかを、 IP経路によって１日２回投与する。足炎症を、足首関節の毎日のカリパス測定に よって評価する。＋34日目に、動物を安楽死させ、そして炎症のインデックスと しての重量の決定のために足を集める。足首および膝関節を、関節炎パラメータ の組織病理学的評価のために集める。 結果を表６Ｂに記載する。 Ｇ．LPS-誘導TNF-α産生の連続注入ラットモデル： sTNFR-I 2.6D/C105dbおよびsTNFR-I 2.6D/C106db、sTNFR-I 2.6D/N105およびs TNFR-I 4D/N105を、48時間連続注入（１mg/kg）のために、製造者の指示に従っ て、AlzetTMミニポンプ（Alza Corp.，Palo Alto，CA）で、IV頚部移植する。EL ISA（Genzyme，Cambrldge，MA）によって測定された血清TNF-αレベルは、高用 量LPSチャレンジの＋２時間後にコントロールと比較して著しく減少する。実施例III ：免疫原性研究 種々の形態の短縮型組換え可溶性TNFR-Iを、いくつかの動物モデルにおける免 疫原性について評価する。 Ａ．齧歯類： sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)およびsTNFR-I 4D/C105db（コントロール ）を、雌Sprague Dawleyラット（Charles Rivers Labs，Wilmington，MA）(n＝6 〜8/群）に対する実験の１および５日目に皮下投与する（4mg/kg）。後眼窩血液 試料を、最初の投与の21日後まで毎週集める。試料を、IgMおよびIgG抗体産生に ついて評価する。 表７に見られるように、+１日目および+５日目に皮下（SC）投与されたsTNFR- I 4D/C105dbは、あるとしても非常に弱い抗体力価を有するsTNFR-I 2.6D/N105-t -BuPEG(33kDa)よりも、+21日までの間、より高いラット抗sTNFR-I IgG抗体力価 を記録する。+21日を通してラット抗sTNFR-I IgM抗体を発現するラットで、免疫 原性において類似の傾向も観察される。sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)は、+ 21日までの間はラット抗sTNFR-I IgM抗体を生じない。 Ｂ．Papio anubis： 研究の第１部、Ａ相の目的は、健常ヒヒに21日あけて２回IV投与した場合に、 sTNFR-I 4D/C105db（0.2mg/kg体重［BW］）、sTNFR-I 3D/C105db（0.2mg/kg BW ）、またはsTNFR-I 2.6D/C105db（0.2mg/kg BW）それぞれのいずれかのファーマ コキネティクスおよび免疫原性を決定することである。 第１部の研究は、２つの相に分かれる。第１部、Ａ相は、２つの注射に応じて 健常ヒヒにおいて異なるsTNFR-I構築物のファーマコキネティクスおよび免疫原 性を決定することに関する。12匹のヒヒを３群に分ける。麻酔と同時に、各群に 、sTNFR-I 4D/C105db、sTNFR-I 3D/C105db、またはsTNFR-I 2.6D/C105dbのいず れかの0.2mg/kg BWを投与する。３匹のヒヒを各期間研究する。動物を21日間追 跡し、次いでタンパク質の第２の同一のIV注射を投与し、そしてさらに21日間研 究する。ファーマコキネティクスおよび免疫原性を、その後に間隔をおいて決定 する。 研究の第１部、Ｂ相は、TNFα媒介致死率の十分に樹立されたモデル（Espatら ，J．Surg．Res.，59:153-158，1995）におけるこれらの調製物の効能を評価す ることに関する。致死的E．coli菌血症を、５〜10×1010cfu/kgの生E．coliの投 与によって、４つの群の16動物で誘導する。プラセボ群を、sTNFR-I 4D/C105db( 0.2mg/kg体重［BW］）、sTNFR-I 3D/C105db（0.2mg/kg BW）、または１mg/kg BW で投与されたsTNFR-I 2.6D/C105dbのいずれかでIV前処置されたヒヒと比較する 。 第１部の研究の両方の相において、若い成熟雄および雌ヒヒPapio anubis（6 〜11kg）（Biomedical Research Foundation，San Antonio，TX）を一晩絶食さ せる。動物をケタミン（10mg/kg、i.m.）で麻酔をかけ、そして頭部静脈を経皮 的にカニューレ挿入する。麻酔を、35mg/kgまでのペントバルビタールナトリウ ムの最初の投与、次いで3〜51ng/kg/時間のペントバルビタールナトリウムの反 復注射によって維持する。上方の気道を、折り返しした気管内チューブの配置に よって確保し、そして動物は自発呼吸を維持する。カテーテルを、大腿動脈中に 経皮的に配置し、これは繰り返しの全身的動脈血サンプリング、ならびにDatasc ope 2000麻酔モニター（Datascope，San Antonio，TX）心臓モニターによって心 拍数および平均動脈血圧の連続的モニタリングを可能にする。動脈血試料を、時 々採取し、EDTAまたはヘパリンで抗凝固し、そして採血後すぐに氷で冷却する。 血漿画分を、４℃での遠心分離によって分離し、そしてアッセイするまで−70℃ で保存する。中心温度を、直腸プローブによってモニターする。内在Foleyタイ プ泌尿器カテーテルを、尿採取を可能にするためにおよび尿産出およびクレアチ ニンクリアランスをモニターするために配置する。血液動力学的パラメータを、 15分毎にモニターする。すべての動物に、維持静脈内液として0.9％塩化ナトリ ウム（4ml/kg）を投与する。Ｂ相研究では、以下の生理学的基準の２つが適合す るならば、動物にさらなる液体（15分毎に10ml/kg）を投与する：1)平均動脈圧 が30％を超えて下がる；2)心拍数が30％を超えて増加する；および3)尿産出が＜ 1ml/kg/時間に下がる。ベースライン血液サンプリングおよび平衡化させるため の少なくとも１時間の待機期間の後、タンパク質の注入を開始する。 研究の第１部Ａ相では、組換えタンパク質を、頭部静脈を介して注入し、そし てすべてのカテーテルを取り出した後８時間動物を観察し、そして動物を21日間 ケージに戻す。24および48時間ならびに３、５、８、11、16、および21日に、動 物を、IMケタミン（10mg/kg）で短時間麻酔し、そして静脈血試料を得る。21日 目に、動物を再麻酔し、タンパク質の２回目の注射をし、そして０日目に行った 完全な手順をさらに21日間繰り返し、そのとき動物を安楽死させる。 第１部Ｂ相研究では、E．coliの注入の１時間前、４匹の動物を、プラセボま たは上記の構築物の１つのいずれかを投与するために、ランダムに割り当てる。 すべてのカテーテルを取り出した８時間の期間動物を観察し、動物をケージに戻 し、そして致死に対するその後の生存；菌血症を観察する。過度の不快にある動 物を安楽死させる。過度の不快を、IACUCによって定義する：1)過去12時間にわ たり座位または立位を維持できない、2)過去12時間内に食餌または水を摂取でき ない、3)カテーテル部位からの制御できない出血、または4)外部刺激に対する非 応答性。静脈血試料を、-1、0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、24時 間、48時間、ならびに3、5、8、11、16、および21日目に得る。21日目に、生存 している動物を安楽死させる。 投与された組換えタンパク質に対するPapio抗体の存在を、サンドイッチELISA によって決定する。非常に簡単には、sTNFR-1構築物を、ELISAプレート上にコー ティングし（1μg/ml）、そして希釈したヒヒ血漿（1.50〜1:100,000）（100μL ）を添加する。試料を洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合し たプロテインＡを添加し（0.5μg/ml）、そしてアッセイをTMBで可視化する。 結果（第I部）： 血漿半減期は、３つの構築物間で著しく異なった。消失曲線を、モデル非依存 的方法を使用して決定し、そして見かけの半減期を、一般的に８〜172時間の間 で評価する。未処置の動物では、血漿半減期は、4.0ドメイン構築物で処置した ヒヒで最長であり（29時間）、そしてsTNFR-I 3D/C105db（24.7時間）およびsTN FR-I 2.6D/C105db（21.5時間）で処置したヒヒで続いて減少する。差は、統計学 的には有意であるが、ほんの26％である。 予期できないことに、それぞれのヒヒに対するタンパク質の第２の投与後、血 漿半減期は非常に短くなる傾向があり、これはより迅速なクリアランスを示す。 半減期のこの減少は、48％短くなる（p＜0.01）sTNFR-I 4D/Cl05dbを投与されて いるヒヒにおいて最も明らかである［10］。半減期の減少は、sTNFR-I 3D/C105d bで処置したヒヒにおいて中間であり（31％）［図11］、そしてsTNFR-I 2.6D/C1 05dbを投与した動物において最小である（14％）［図12］。半減期の減少は、sT NFR-I 2.6D/C105dbで処置したヒヒにおいて統計学的に差はない。 調製物はすべてヒヒにおいて免疫原性である。しかし、免疫原性の頻度は、sT NFR-I 4D/C105dbで処置したヒピで最大であり、sTNFR-I 3D/C105dbで処置した動 物で中間であり、そしてsTNFR-I 2.6D/C105dbを投与した動物で最低である（表 ８）。 抗体応答は、一般的には、構築物の投与後約８日目に発現し、そして21日の研 究期間を押して存在する。さらに、抗体応答は、タンパク質構築物の第２の注射 に対する応答の間により強くなる傾向がある。 sTNFR-I 4D/C105dbが投与されているヒヒの４匹すべてが抗体を発現し、sTNFR -I 3D/C105dbが投与されている４匹の動物のうちの２匹が抗体を発現し、そして sTNFR-I 2.6D/C105dbが投与されている４匹のヒヒのうち１匹が抗体を発現する 。Kruskall-Wallis ANOVAによっで、抗体応答の程度（対数変換した）は、時間 の関数として３つの群間で有意に異なる（ｐ＜0.05）。ポストホック分析は、抗 体応答の有意な差が、主として、sTNFR-I 4D/C105dbおよびsTNFR-I 2.6D/C105db が投与されている動物の間であり、sTNFR-I 3D/C105dbで処置した動物からは中 間（および有意でない）応答であることを示唆する。 抗体の発現と２回の21日研究中のクリアランスの変化との間の相関関係が観察 される（ｐ＜0.01）。予期できないことではないが、構築物の第１の投与後に強 力な抗体応答を発現する動物では、タンパク質は、第２の投与後により迅速にク リアランスされる。第１と第２の注射間のクリアランスの変化を、抗体応答を発 現した動物（n＝7）と発現しなかった動物（n＝5）との間で比較する［図13］。 ヒヒの血漿中で検出される抗体を、ME-180細胞株での直接細胞傷害性およびL- 929アッセイでの中和能力について、選択した数の動物で評価する。細胞傷害性 も中和も、これらの構築物のいずれかを生成する抗体で見られない。 第１部Ａ相ヒヒ研究では、最も強い抗体応答を発現する動物はまた、第２の投 与後に構築物のクリアランスの最も迅速な増加を有する。したがって、このよう な所見は、抗体応答が生物学的半減期、およびこのように構築物の治療効率を減 少させ得、そして用量調節が必要とされ得ることを示唆する。しかし、構築物が ２回目に投与される場合、抗体の存在に対してなんら有害な臨床的応答はないよ うである。したがって、半減期または効率に著しい影響を及ぼすことのない、こ のような構築物を免疫原性を減少させるように改変するための治療成果は、有害 な反応の危険性よりもむしろ、主として、増加する用量調節の必要性を減少させ ることに関する。第１部Ｂ相結果： 最後に、未処置のヒヒにおいて、３つの構築物はすべて、1.0mg/kg BWの用量 で投与した場合、E．coli菌血症後のサイトカイン媒介損傷を予防することにほ ぼ等しく有効である。それぞれ、４匹のプラセボ処置したヒヒのうちの１匹が生 存する；４匹のsTNFR-I 4D/C105dbおよびsTNFR-I 3D/C105db処置したヒヒのうち の４匹が生存する；そして４匹のsTNFR-I 2.6D/C105db処置したヒヒのうちの３ 匹が生存する。３つの構築物はすべて、TNFα生物活性を抑制し、そして過剰の 中和能力を提供する。 第II部： ヒヒにおける第II部研究の特定の目的は、種々のsTNFR-I構築物への動物の反 復曝露（すなわち、３回の別々の注射）が、さらなる免疫原性および半減期の減 少を生じるかどうかを決定することである。さらに、この研究を、sTNFR-I 2.6D /C105dbおよびsTNFR-I 4D/C105db、ならびにsTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) およびsTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa)を含む、いくつかのsTNFR-I構築物の免 疫原性およびファーマコキネティクスを比較するように設計する。最後に、この 研究を、抗体応答の臨床的有意性を評価しそしてTNFα-媒介損傷攻撃（E．coli 菌血症）に対するその後の応答におけるクリアランスを変更するように設計する 。 0、21、および42日目に、ヒヒに種々の構築物（それぞれ、sTNFR-I 4D/C105db 、sTNFR-I 2.6D/C105db、sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)、またはsTNFR-I4D /N105-t-BuPEG(33kDa)）の0.2mg/kgをI.V.投与する。+63日目に、ヒヒに2.0mg/k g BWのそれぞれの構築物を投与する。+65日目に（すなわち、48時間後）、ヒヒ に、上の第Ｉ部に概説されるように、E．collの致死用量で攻撃する。第II部の 主な所見は以下の通りである： 結果（第II部）： 一般的に、ドメインの数に関わりなく、未処置のヒヒでは、sTNFR-I 4D/N105- t-BuPEG(33kDa)およびsTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)は、sTNFR-I 4D/C105d bおよびsTNFR-I 2.6D/C105dbよりも長い半減期を有する。半減期は、ダイマーの PEG化形態についての10〜20時間と比較して、モノPEG-f5sTNFR-I形態については 30〜35時間の範囲である。さらに、sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa)およびsTNF R-I 4D/C105dbは、未処置の動物においてsTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)お よびsTNFR-I 2.6D/C105dbよりも長い半減期を有する。 sTNFR-I 4D/C105dbおよびsTNFR-I 2.6D/C105dbはまた、sTNFR-I 2.6D/C105db での免疫原性の減少に対する適度な傾向を伴い、免疫原性である。しかし、TNFR -I 4D/Cl05dbのみが反復投与でのクリアランスの減少を示す。sTNFR-I 4D/N105- t-BuPEG(33kDa)および2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)は、抗原性でもなく、クリアラ ンス速度が反復投与で著しく変化もしない。 +21日、+42日、および+61日目に、異なる化台物で処置した各ヒヒ（N＝3）か ら得た血清を、捕獲抗原として異なる構築物を使用することによって、他の構築 物に対する免疫反応性（サンドイッチ捕獲ELISAによる）についてインビトロで 評価する。例えば、+21日目（表９）に2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)を投与したヒ ヒから得た血清は、sTNFR-I 4D/C105db、sTNFR-I 4D/N105を捕獲抗原としてELIS Aプレート上で使用する場合に、これらの化合物のいずれとも「反応」しない。 陽性反応は、＞1:400力価の抗体応答である。+42および+61日目からのデータ を表10および11に示す。重要なことには、sTNFR-I 4D/C105db捕獲抗原に対して 試験した場合、2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)で既に処置した１匹のヒヒから得た血 清との、インビトロでの陽性反応がある（表11）。 構築物に既に３回曝露したヒヒでは、TNFα媒介損傷応答への効率は、(1)sTNF R-I 4D/C105db、(2)sTNFR-I 2.6D/C105db、(3)sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa) 、および(4)2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)で最大である（生存する、多系器官不全 （MSOF）、血清IL-6、およびWBC応答によって決定される場合）。「警告」は、 この研究が、種々の構築物のTNF中和能力の差を考慮しないことである。 Ｃ．チンバンジー： この研究の目的は、チンパンジーに１カ月の期間にわたってI.V.経路によって 繰り返し注射される種々のsTNFR-I形態の免疫原性を評価することである。この 研究で試験されるsTNFR-I形態は、sTNFR-12.6D/C105db、sTNFR-I 4D/C105db、sT NFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33kDa)、sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)、およびsT NFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa)である。処置群当たり合計３匹のチンパンジーで ある。 この研究の投与法／パラメータは以下の通りである：各チンパンジーに、４週 間、月曜日および金曜日の週に２回、0.1mg/kgで静脈内ボーラス注射として試験 物質を投与する（総計８用量）。投与容量は、供給される試験物質の濃度に依存 して変動する。５mLの血清試料を、処置前の０日目に各動物から得る。追加の血 清試料を、7、14、2Lおよび28日目の薬物投与直前に得る。 チンパンジー免疫原性生データを、表12に示す。 +28日目までに、sTNFR-I 4D/C105dbまたはsTNFR-I 2.6D/C105dbのいずれかで 処置したすべての動物（N＝3）は、それぞれ1:12,800または1;3200として観察さ れる最も高い力価で、陽性反応（ELISAによって測定される）を記録する（表12 ）（注：実験のこの部分では、すべての「免疫する」抗原を、ELISAプレートに 固定した対応する捕獲抗原として使用する）。sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa) で処置した１匹の動物は、+21および+28日目に陽性抗体反応を有する（表12）。 重要なことには、sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33kDa)またはsTNFR-I 2.6D/N105-t- BuPEG(33kDa)のいずれかで処置した動物は、実験全体を通して抗sTNFR-I抗体を 発現することが観察されない（表12）。 上のヒヒ実験の項に記載のように、+28日目に種々のsTNF-RI形態で処置した各 チンパンジー（N＝3）を、捕獲抗原としてsTNF-RI形成を使用することによって 他の構築物に対して（ELISAによって）免疫反応性についてインビトロで評価す る。陽性反応は、＞1:400力価の抗体応答である。重要なことには、sTNFR-I 2.6 D/N105-t-BuPEG(33kDa)を投与したチンパンジーから得た血清は、sTNFR-I 4D/C1 05db、sTNFR-I 4D/N105が捕獲抗原としてELISAプレート上で使用される場合、こ れらの化合物のいずれとも「反応」しない（表13）。 これはまた、sTNFR-I 4D/C105db、sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33kDa)、またはs TNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa)のいずれかで処置した動物で観察される（表13 ）。実施例IV EAEは、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）のような神経抗原での遺伝的に感受 性の動物の感作から生じるCNSの急性または慢性再発炎症性脱ミエリン病である 。EAEは、当該技術分野で受け入れられており、そして急性ヒトMSについての動 物モデルでしばしば使用される。 雌Lewisラット（Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME）に麻酔をかけ、そ して5mg/mlのMycobacterium tuberculosis H37Ra(Difco Lab MI)を含む等容量の 完全フロイントアジュバント（CFA）とともに、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS） に溶解した完全フロイントアジュバント中のミエリン塩基性タンパク質（MBP） を含む0.1mLの乳化液で、左後足の足跡に、０日目に免疫する。コントロールラ ットに、左後足の足跳に、MBPを含まない0.1mlのPBS/CFA乳化液を投与する。 臨床疾患の評価は、従来の０〜５評価システムに基づく。評点のスペクトルは ：０、正常；0,5、尻尾緊張力の部分的消失；１、尻尾緊張力の感染消失；２、 一方の後足の引きずり；３、両方の後足の麻痺；４、罹患；および５、死亡であ る。sTNFR-I構築物またはビヒクルのすべての注射を、免疫後９日目に開始して １日おきに１mg/kg S.C.で投与する。すべての動物を21日目に終了させる。結果 を、２つの形態、時間の関数としての臨床的重篤度スコアで表し、そして疾患の 全体の経過にわたる各ラットについての積分した臨床的スコアを、毎日の臨床的 スコア対時間の曲線下面積として産出する。積分した臨床的スコアについての処 置した群の値を、Mann-Whitney試験を使用してコントロール群の値に対して統計 学的に比較する。 ビヒクル処置した動物は、約10日目に疾患が発症し、16日目に疾患がピークに なり、次いで減退する。sTNFR-I 4D/C106dbは、ビヒクル処置した動物と比較し た場合、臨床的徴候が約73％減弱する。sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33kDa)もまた 、臨床的徴候を約85％減弱する。sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33kDa)およびsTNFR- I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)は、臨床的徴候を減弱することにおいて等しく強力で ある（それぞれ、64％および57％）。 結論として、短縮型sTNFRは、MSのこの動物モデルにおいて臨床的結果のいく つかを媒介することに有効であるようである。 本発明は、一般的におよび好ましい実施態様に関しての両方で上で記載されて いるが、他の変更および改変を、上の記載を考慮して当業者が行うことが理解さ れる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ６０／０３７，７３７ (32)優先日 平成９年１月23日(1997．1．23) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０３９，３１４ (32)優先日 平成９年２月７日(1997．2．7) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０３９，７９２ (32)優先日 平成９年３月４日(1997．3．4) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 エドワーズ，カール ケイ. アメリカ合衆国 コロラド 80301，スー ペリア，サウス ピットキン アベニュー 1620 (72)発明者 キーフト，ギャリー エル. アメリカ合衆国 コロラド 80303，ボー ルダー，コルビー ドライブ 2970

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．以下の式を有する短縮型sTNFR： R1-[Cys19-Cys103]-R2 ここで、[Cys19-Cys103]とは、sTNFR-Iの残基19〜103を表し、該アミノ酸残基番 号付け図は、比較を容易にするために図１（配列番号２）に提供される； ここで、R1は、Cys19のまたは以下の群から選択される１つまたは複数のアミノ 末端アミノ酸残基の、メチオニル化または非メチオニル化アミン基を表す： そして、ここでR2は、Cys103のまたは以下の群から選択されるカルボキシ末端ア ミノ酸残基の、カルボキシ基を表し： ならびにそれらの改変体および誘導体、ただし、R1がアミノ酸配列VCPQGKYIHPQN NSICのメチオニル化または非メチオニル化アミン基あるいは１〜15残基のそのＮ 末端短縮型を表す場合、R1-[Cys19-Cys103]-R2は、式R1-[Cys19-Cys103]-FCCSLC L-R3を有する付加改変体ではなく、ここで、R3は図１のアミノ酸残基Asn111-Asn161 のカルボキシル基または図１のAsn111-Asn161のカルボキシ末端短縮型を表す 。 ２．sTNFR-I 2.6D/C105、sTNFR-I 2.6D/C106、sTNFR-I 2.6D/N105、sTNFR-I 2 .3D/d8、sTNFR-I 2.3D/d18、およびsTNFR-I 2.3D/d15、またはその改変体もしく は誘導体からなる群より選択される、請求項１に記載の腫瘍壊死結合タンパク質 。 ３．以下の式を有する短縮型sTNFR： R4-[Cys32-Cys115]-R5 ここで、[Cys32-Cys115]は、成熟全長40kDa TNFインヒビターの残基Cys32〜Cys1 15 を表し、該アミノ酸残基番号付け図は、比較を容易にするために図８（配列番 号35）に提供される； ここで、R4は、Cys32のまたは以下の群から選択される１つまたは複数のアミノ 末端アミノ酸残基の、メチオニル化または非メチオニル化アミン基を表し： そして、ここでR5は、Cys115のまたは以下の群から選択されるカルボキシ末端ア ミノ酸残基の、カルボキシ基を表し： およびそれらの改変体、ただし、R4がアミノ酸配列TCRLREYYDQTAQMCのメチオニ ル化または非メチオニル化アミン基あるいは１〜15残基のそのＮ末端短縮型を表 す場合、R4-[Cys32-Cys115]-R5は、式R4-[Cys32-Cys115]-APLRKCR-R6を有する付 加改変体ではなく、ここでR6は図８のアミノ酸残基Pro123-Thr179のカルボキシ ル基または図８のPro123-Thr179のカルボキシ末端短縮型を表す。 ４．前記アミノ酸配列がグリコシル化されていない、請求項１〜３のいずれか 一項に記載の腫瘍壊死結合タンパク質。 ５．前記アミノ酸配列がグリコシル化される、請求項１〜３のいずれか一項に 記載の腫瘍壊死結合タンパク質。 ６．前記タンパク質が、水溶性ポリマーに結合される、請求項１〜５のいずれ か一項に記載の腫瘍壊死結合タンパク質。 ７．請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの腫瘍壊死結合タン パク質を含む、多価腫瘍壊死結合タンパク質。 ８．式R1-X-R2を有する多価腫瘍壊死結合タンパク質： ここで、Xはリンカーを含み、ここで該リンカーは水溶性ボリマーであり；そし て R1およびR2は、該水溶性ポリマーに共有結合される生物学的に活性な分子であり 、ここでR1およびR2の少なくとも１つは、請求項１〜６のいずれか一項に記 載の腫瘍壊死結合タンパク質である。 ９．前記水溶性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項８に記載の 多価腫瘍壊死結合タンパク質。 １０．前記タンパク質が、sTNFR-I 2.6D/C105dbおよびsTNFR-I 2.6D/C106dbか らなる群より選択される、請求項９に記載の多価腫瘍壊死結合タンパク質。 １１．TNF媒介性疾患を処置することにおける使用のための、請求項１〜１０ のいずれか一項に記載の腫瘍壊死結合タンパク質。 １２．関節炎を処置することにおける使用のための、請求項１〜１０のいずれ か一項に記載の腫瘍壊死結合タンパク質。 １３．請求項１〜３のいずれか一項に記載の腫瘍壊死結合タンパク質をコード するポリヌクレオチド。 １４．以下から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる腫瘍壊死因 子結合タンパク質を含む、核酸配列： (a) 図２に示されるcDNA配列； (b) 図３に示されるcDNA配列； (c) 図４に示されるcDNA配列； (d) 図５に示されるcDNA配列； (e) 図６に示されるcDNA配列； (f) 図７に示されるcDNA配列； (g) (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、および(f)のコード領域またはその一部におい て縮重である配列； (h) (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、および(g)にハイブリダイズする配列； および (i) (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、および(h)に相補的である配列、た だし、該核酸は、式R1-[Cys19-Cys103]-FCCSLCL-R3を有するタンパク質をコード しない、ここで[Cys19-Cys103]はsTNFR-Iの残基19〜103を表し、該アミノ酸残基 番号付け図は、比較を容易にするために図１（配列番号２）に提供され；ここで 、R1は、NNSICを含むアミノ酸配列のメチオニル化または非メチオニル化アミン 基を表し、そしてR3は図１のアミノ酸残基Asn111-Asn161のカルボキシル基また は図１のAsn111-Asn161のカルボキシ末端短縮型を表す。 １５．図２、３、４、５、６、または７に記載の配列あるいはその一部を有す るポリヌクレオチド。 １６．発現制御配列に作動可能に連結された請求項１３〜１５のいずれか一項 に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。 １７．請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、原 核生物または真核生物宿主細胞。 １８．適切な栄養培地中で請求項１７に記載の宿主細胞を増殖する工程、およ び、必要に応じて、該細胞または該栄養培地から該短縮型sTNFRを単離する工程 を包含する、方法。 １９．前記宿主細胞がE．coliである、請求項１８に記載の腫瘍壊死結合タン パク質の産生方法。 ２０．前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１８に 記載の腫瘍壊死因子結合タンパク質の産生方法。 ２１．以下の工程を包含する方法： (a) 請求項１７に記載の原核生物または真核生物宿主細胞を培養する工程； (b) 該宿主細胞による短縮型sTNFRの発現を可能にする条件下で該宿主細胞を 維持する工程；および (c) 必要に応じて、該宿主細胞によって発現される該短縮型sTNFRを単離する 工程。 ２２．請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の外因性ポリヌクレオチドを含 む原核生物または真核生物宿主細胞の組換え発現産物である、腫瘍壊死結合タン パク質。 ２３．請求項１〜１０のいずれか一項に記載の腫瘍壊死因子結合タンパク質を 、薬学的に受容可能なビヒクルどともに含む、薬学的組成物。 ２４．請求項１８に記載の方法に従って産生される腫瘍壊死因子結合タンパク 質を、薬学的に受容可能なビヒクルとともに含む、薬学的組成物。 ２５．請求項２１に記載の方法に従って産生される腫瘍壊死因子結合タンパク 質を、薬学的に受容可能なビヒクルとともに含む、薬学的組成物。 ２６．請求項２３〜２５に記載の薬学的組成物を患者に投与する工程を包含す る、TNF媒介性疾患を処置する方法。 ２７．前記TNF媒介性疾患が関節炎である、請求項２６に記載の方法。 ２８．薬学的組成物を調製する方法であって、治療的有効量の請求項１〜１０ のいずれか一項に記載の腫瘍壊死因子結合タンパク質が、１つ以上の薬学的に受 容可能なビヒクルと混合される、方法。 ２９．TNF媒介性疾患を処置するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記 載の腫瘍壊死因子結合タンパク質の使用。 ３０．関節炎を処置するための、請求項２９に記載の腫瘍壊死因子結合タンパ ク質の使用。 ３１．請求項１〜１０のいずれか一項に記載の腫瘍壊死因子結合タンパク質お よび生理学的に受容可能な溶媒を有する第２の容器を含む水性タンパク質処方物 を調製するためのキット。
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