CZ296835B6 - Zkrácený rozpustný receptor faktoru nekrotizujícího tumory, zpusob jeho prípravy a pouzití, vazebnýprotein, polynukleotid, vektor, bunka, farmaceutická kompozice a zpusob její prípravy a kit - Google Patents

Zkrácený rozpustný receptor faktoru nekrotizujícího tumory, zpusob jeho prípravy a pouzití, vazebnýprotein, polynukleotid, vektor, bunka, farmaceutická kompozice a zpusob její prípravy a kit Download PDF

Info

Publication number
CZ296835B6
CZ296835B6 CZ0000499A CZ499A CZ296835B6 CZ 296835 B6 CZ296835 B6 CZ 296835B6 CZ 0000499 A CZ0000499 A CZ 0000499A CZ 499 A CZ499 A CZ 499A CZ 296835 B6 CZ296835 B6 CZ 296835B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
stnfr
cys
seq
truncated
protein
Prior art date
Application number
CZ0000499A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ499A3 (cs
Inventor
F. Fisher@Eric
III@Carl K. Edwards
L. Kieft@Gary
Original Assignee
Amgen Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc. filed Critical Amgen Inc.
Publication of CZ499A3 publication Critical patent/CZ499A3/cs
Publication of CZ296835B6 publication Critical patent/CZ296835B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0325—Animal model for autoimmune diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

Zkrácený rozpustný receptor faktoru nekrotizujícího tumory (sTNFR) obecného vzorce R.sub.1.n.-[Cys.sup.19.n.-Cys.sup.103.n.]-R.sub.2.n., kde [Cys.sup.19.n.-Cys.sup.103.n.] predstavuje zbytky 19 az 103 sTNFR-I z obrázku 1 (SEQ ID NO:2); R.sub.1.n. predstavuje methionylovanou nebo nemethionylovanou aminoskupinu Cys.sup.19.n. nebo aminoterminálního aminokyselinového zbytku a R.sub.2.n. predstavuje karboxyskupinu Cys.sup.103.n. nebo karboxyskupinu karboxyterminálního aminokyselinového zbytku, kde uvedené sTNFRs mají snízenou antigenicitu ve srovnání s rozpustným TNFR-I obsahujícím první tri domény, a jeho delecní a/nebo substitucní mutein schopný inhibovat TNF, jakoz i konjugát tohoto zkráceného sTNFR s vodorozpustným polymerem a zpusob jeho prípravy a pouzití, vazebný protein, polynukleotid,vektor, bunka, farmaceutická kompozice a zpusob její prípravy a kit.

Description

Oblast techniky
Vynález se týká zkráceného rozpustného receptoru faktoru nekrotizujícího tumory (soluble truncated tumor necrosis faktoc receptor, sTNFR), způsobu jeho přípravy a použití při léčení 10 zánětlivých chorob, polyvalentního vazebného proteinu faktoru nekrotizujícího tumory, polynukleotidu kódujícího tento protein, vektoru a prokaryontní nebo eukaryotní hostitelské buňky obsahující tento polynukleotid, farmaceutické kompozice obsahující uvedený sTNFR a způsobu její přípravy a příslušného kitu.
Dosavadní stav techniky
Zánět je obranná reakce těla na poranění způsobené například mechanickým poškozením, infekcí nebo působením antigenů. Zánětlivá reakce se může projevit patologicky, jestliže je zánět indu20 kován nevhodnými stimuly, jako např. autoantigenem, projevuje se výrazným způsobem nebo přetrvává i po odstranění škodlivého agens. Takováto zánětlivá reakce může zahrnovat produkci určitých cytokinů.
Zatímco etiologie zánětů není doposud zcela objasněna, znalost molekulárních aspektů zánětů 25 byla v poslední době zlepšena. Tento výzkum vedl k identifikaci určitých cytokinů, o kterých se předpokládá, že hrají výraznou roli ve zprostředkování zánětu. Cytokiny jsou extracelulámí proteiny, které modifikují chování buněk, zejména těch buněk, které jsou v nejbližším okolí místa syntézy a uvolňování cytokinů. Faktory nekrotizující tumory (TNFs) tvoří třídu cytokinů produkovaných řadou typů buněk, včetně monocytů a makrofágů.
J iž dříve byly popsány nejméně dva typy TNF, konkrétně TNF alfa (TNF-α) a TNF beta (TNF-β nebo lymfotoxin), oba jsou aktivní jako trimémí molekula a předpokládá se, že iniciují přenos buněčných signálů propojením receptorů (Engelmann et al. (1990), J. Biol. Chem., 265:1449714504).
Řada důkazů naznačuje, že TNF-α a TNF-β jsou hlavními cytokiny zánětu. Tyto známé TNFS mají důležité fyziologické účinky na řadu rozdílných cílových buněk, které se účastní v zánětlivé odpovědi na různé podněty, například při infekci nebo poranění. Proteiny podněcují sekreci latentní kolagenázy a prostaglandinu E2 jak u fibroblastů, tak u synoviálních buněk, a dále způsobují, 40 že buňky osteocytů stimulují resorpci kosti. Tyto proteiny zvyšují povrchové adhezivní vlastnosti endotelových buněk vůči neutrofilům. Také způsobují, že endotelové buňky sekretují koagulační aktivitu a redukují jejich schopnost lyžovat sraženiny. Navíc inhibici exprese enzymu lipoprotein lypázy přesměrovávají aktivitu adipocytů od ukládání lipidů. TNFs také podněcují u hepatocytů syntézu jedné třídy proteinů známých jako „reaktanty akutní fáze“, které působí na hypotalamus 45 jako pyrogeny (Selby et al. (1988), Lancet, 1 (8583): 483; Stamess, Jr. et al. (1988); J. Clin.
Invest., 82:1321; Oliff et al. (1987), Cell, 50:555 a Waage et al. (1987); Lancet, 1 (8529):355). Kromě toho preklinické výsledky na různých zvířecích modelech zánětů (včetně revmatoidní artritidy) naznačují, že inhibice TNF může mít významný dopad na vývoj onemocnění a jeho závažnost (Dayer et al., (1994), European Cytokine Network, 5(6): 563-571 a Feldman et al. 50 (1995), Annals Of The New York Academy Of Sciences, 66:272-278). Navíc i nedávné předběžné klinické zkoušky u lidí s revmatoidní artritidou s inhibitory TNF ukázaly slibní výsledky (Rankin et al. (1995), British Joumal Of Rheumatology, 3(4):4334-4342; Eliott et al. (1995), Lancet, 344:1105-1110; Tak et al. (1996), Arthritis and Rheumatism, 39:1077-1081; a Paleolog et al. (1996), Arthritis and Rheumatism, 39:1082-1091.
Proteinové inhibitory TNF jsoii žě stavil techniky známé; ĚP 0 308 378 uvádí, že protein izolovaný z moči pacientů s horečkou vykazuje aktivitu inhibující TNF. Účinek tohoto proteinu je pravděpodobně dán kompetitivním mechanismem na úrovni receptorů. EP 0 308 378 popisuje protein dostatečně čistý pro to, aby mohl být charakterizován svým N-koncem. Nicméně, odkaz ale nic neříká o jakékoliv sekvenci DNA nebo o rekombinantně produkovaném inhibitoru TNF.
V dosavadním stavu techniky existují údaje o rekombinantně připravených inhibitorech TNF. Například EP 0 393 438 a EP 0 422 339 uvádějí aminokyselinové a nukleotidové sekvence zralého rekombinantního lidského „30kDA inhibitoru TNF“ (známého také jako p55 receptor a jako sTNFR-I) a zralého rekombinantního lidského „40kDa inhibitoru“ (známého také jako p75 receptor a jako sTNFR-II), stejně jako jejich modifikované formy, jako např. fragmenty, funkční deriváty a varianty. EP 0 393 438 a EP 0 422 339 také uvádějí metody izolace genů kódujících tyto inhibitory, klonování příslušných genů ve vhodných vektorech a buněčných typech a expresi genů vedoucí k produkci inhibitorů. Bylo prokázáno, že zralý rekombinantní lidský 30kDA inhibitor TNF a zralý rekombinantní lidský 40kDa inhibitor TNF jsou schopné inhibovat TNF (E“ 0 393 4378, EP 0 422 339, WO 92/16221 a WO 95/34326.
$TNFR-I a sTNFR-I jsou členy receptorové superrodiny nervového růstového faktoru/receptoru rfNF, které zahrnuje receptor nervového růstového faktoru (nerve growth factor receptor, NGF), antigen CD40 B buněk, antigen Fas a antigeny CD27 a CD30 (Smith et al. (1990), Science, 248:1019-1023).
Nejkonzervativnějším znakem v této skupině buněčných povrchových receptorů je na cystain bohatá, extracelulámí doména vázající ligand, která může být rozdělena do čtyř opakujících se motivů o asi 40 aminokyselinách a která obsahuje 4-6 cysteinových zbytků na značně konzervovaných pozicích (Smith et al. (1990), viz výše).
EP 393 438 dále pojednává o 40 kDa inhibitoru TNF označeném Δ51 a 40kDa inhibitoru TNF označeném Δ53, ktěréjsou zkrácenými verzemi rekombinantního 40kDa proteinu inhibitoru TNF o úplné délce, a v nichž jsou odstraněny aminokyselinové zbytky 51 nebo 53 na karboxykonci zralého proteinu. Odborník si uvědomuje, že čtvrtá doména jak 30kDa inhibitoru TNF, tak 40kDa inhibitoru není nutná pro inhibici TNF. Tento fakt byl potvrzen různými výzkumnými skupinami. Byly připraveny varianty 30kDa a 40kDa inhibitoru TNF s odstraněnými doménami se zjištěním, že varianty bez čtvrté domény si zachovávají plnou vazebnou aktivitu pro THF; naproti tomu varianty bez první, druhé nebo třetí domény si TNF vazebnou aktivitu nezachovávají (Corcoran et al. (1994), Eur. J. Biochem., 223:831-840; Chih-Hsueh et al. (1995) The Joumal of Biological Chemistry, 270(6):2874-2878 a Scallon et al., (1995), Cytokine, 7(8)-759-770).
Vzhledem k relativně nízké inhibici cytotoxicity, kterou vykazuje 30kDa inhibitor TNF a 40kDa inhibitor TNF (Butler et. al. (1994), Cytokine, 6(6):616-623), připravily různé skupiny diméry proteinů inhibitorů TNF (Butler et al. 1994, viz výše a Martin et al. (1995), Exp. Neurol., 131:221-228). Diméry mohou ale vyvolat protilátkovou odpověď (Martin et al. (1995), viz výše a Fisher et al. (1996), The New England Joumal of Medicíně, 334(26):1697-1702).
(Dílem předkládaného vynálezu je poskytnou funkčně aktivní zkrácené sTNFRs. Tento a další cíle předkládaného vynálezu budou zřejmé z následujícího popisu.
Podstata vynálezu
Podle prvního aspektu se předmětem vynálezu A) zkrácený rozpustný receptor faktoru nekrotizujícího tumory (sTNFR) obecného vzorce ^-[Cys^-Cys103]-^,
-2CZ 296835 B6 kde [Cys19-Cys103] představuje zbytky 19 až 103 sTNFR-I z obrázku 1 (SEQ ED NO:2); a kde R] představuje methionylovanou nebo nemethionylovanou aminoskupinu Cys19 nebo aminoskupinu aminoterminálního aminokyselinového zbytku ze skupiny
C
IC
SIC
NSIC (SEQ ID NO:15)
NNSIC (SEQ ID NO:16)
QNNSIC (SEQ ID NO:17)
PQNNSIC (SEQ ID NO:18)
HPQNNSIC (SEQ ID NO:19)
IHPQNNSIC (SEQ ID NO:20)
YIHPQNNSIC (SEQ ID NO:21)
KYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:22)
GKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:23)
QGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:24)
PQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:25)
CPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:26)
VCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:27)
SVC PQGKYIH PQNN SIC (SEQ ID NO:28)
DSVCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:29),
a kde R2 představuje karboxyskupinu Cys103 nebo karboxyskupinu karboxyterminálního aminokyselmového zbytku vybraného ze skupiny:
F
FN
FNC
FNCS (SEQ ID N0:30)
FNCSL (SEQ ID NO:31)
FNCSLC (SEQ ID NO:32)
FNCSLCL (SEQ ID NO:33),
-3CZ 296835 B6 kde uvedené sTNFRs mají sníženou ántigenicitu ve srovnání s rozpustným TNFR-I obsahujícím první tři domény, a jeho deleční a/nebo substituční mutein schopný inhibovat TNF, jakož i konjugát tohoto zkráceného s TNFR s vodorozpustným polymerem, s výhodou polyethylenglykolem.
Ve výhodném provedení B) je zkrácený sTNFR definovaný výše vybraný ze skupiny skládající se z sTNFR 2.6D/C105 [NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-CysI03]-FNCSL-COOH], sTNFR-Ι 2.6D/N105 [NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cysl9-Cys103]-FN-COOH], sTNFR-Ι 2.3D/d8 [NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys,03]-FNCSL-COOH], sTNFR-Ι 2.3D/dl5 |NH2MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH) a sTNFR-Ι 2.3D/dl8 [NH2-M-[Cys19-Cys103]FNCSL-COOHJ.
V jiném výhodném provedení C) je zkrácený sTNFR nebo karboxylovém konci fúzován s celou konstantní doménou nebo její částí těžkého nebo lehkého řetězce lidského imunoglobulinu.
Zkrácený sTNFR podle vynálezu může být neglykosylovaný nebo glykosylovaný.
Předmětem vynálezu je dále také polyvalentní vazebný protein faktoru nekrotizujícího tumory (TNFbp) obsahující nejméně jeden zkrácený sTNFR definovaný výše. TNFbp podle vynálezu obsahuje v jednom z výhodných provedení dimér zkráceného sTNFR podle provedení C).
V jiném výhodném provedení má TNFbp obecný vzorec
Ra—X—Rb, kde X obsahuje linker, který je ve vodě rozpustný polymer a Ra a Rb jsou biologicky aktivní molekuly kovalentně vázané na uvedený ve vodě rozpustný polymer, přičemž alespoň jeden z Ra a Rb je zkrácený sTNFR definovaný výše.
Předmětem vynálezu je dále také polynukleotid mající sekvenci kódující zkrácený sTNFR podle i/ynálezu nebo sekvenci k ní komplementární.
Předmětem vynálezu je dále také vektor obsahující výše uvedený polynukleotid operativně připojený k sekvenci řídící expresi.
Předmětem vynálezu je dále také prokaryontní nebo eukaryontní hostitelská buňka obsahující tento polynukleotid nebo vektor.
Předmětem vynálezu je dále také způsob přípravy zkráceného sTNFR, při kterém se kultivuje uvedená hostitelská buňka za podmínek vhodných pro umožnění exprese zkráceného sTNFR hostitelskou buňkou a popřípadě se zkrácený sTNFR izoluje. Hostitelskou buňkou je s výhodou buňka E. coli nebo buňka vaječníku čínského křečka (CHO).
Předmětem vynálezu je také farmaceutická kompozice, obsahující zkrácený sTNFR nebo TNFbp definovaný výše ve spojení s farmaceuticky vhodným nosičem.
Předmětem vynálezu je také použití zkráceného sTNFR podle vynálezu pro výrobu léčiva pro léčení pacientů postižených chorobou zprostředkovanou TNF, jako je diabetes, hyperalgesie, zánětlivá choroba střev, ischemické poškození, reperfúzní poškození nebo revmatická choroba. Revmatická choroba může být zvolena ze souboru sestávajícího z revmatoidní artritidy, osteoartritidy, juvenilní (revmatoidní) artritidy, ankylozující spondylitidy, dermatomyozitidy, lupénkové artritidy, sklerodermie, Sjógrenova syndromu a vaskulitidy.
Předmětem vynálezu je také kit, který obsahuje zkrácený sTNFR nebo TNFbp podle vynálezu.
Další aplikace, které rovněž spadají do rozsahu vynálezu, jsou uvedeny dále.
,·!!,
Vynález se tedy týká funkčně aktivních zkrácených fórem sTNFR-I a sTNFR-Π, které jsou dále zmiňované jako „zkrácený (zkrácené) sTNRF(s)“. Zkrácené sTNRFs jsou modifikované formy $TNFR-I a sTNFR-II, které neobsahují čtvrtou doménu (aminokyselinová rezidua Thr127-Asp161 u sTNFR-I a aminokyselinová rezidua Pro141-Thr179 u sTNFR-II); části třetí domény (aminokyselinová rezidua Asn11'-Cys126 u sTNFR-I a Pro123-Lys140 u sTNFR-II); a které případně neobsahují část první domény (aminokyselinová rezidua Asp'-Cys19 u sTNFR-I a Leu'-Cys32 u sTNFR-II). Tyto nové inhibitory TNF (např. TNF-α a/nebo TNF-β) mají obecné uplatnění.
Zkrácené sTNFRs podle předkládaného vynálezu zahrnují proteiny, které odpovídají vzorci Rj[Cys19-Cys103]-R2 a R4-[Cys32-Cys115]-R5. Tyto proteiny jsou zkrácené formy sTNFR-I a sTNFR-II.
Vzorcem „R)-[Cys19-Cys103]-R2“ se rozumí jeden nebo více proteinů, kde [CysI9-Cys103] odpovídají sTNFR-I reziduím 19 až 103 při číslování aminokyselinových zbytků podle schématu na obrázku 1 (SEQ FD NO:2); kde Rr představuje methionylovanou nebo nemethionylovanou aminoskupinu Cys19 nebo aminokonec některého aminokyselinového zbytku(ů) znásledující skupiny:
C
IC
SIC
NSIC (SEQ ID NO:15)
NNSIC (SEQ ID NO:16)
QNNSIC (SEQ ID NO:17)
PQNNSIC (SEQ ID NO:18)
HPQNNSIC (SEQ ID NO:19)
IHPQNNSIC (SEQ ID NO:20)
YIHPQNNSIC (SEQ ID NO:21)
KYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:22)
GKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:23)
QGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:29)
PQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:25)
CPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:26)
VCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:27)
SVCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:28)
DSVCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:29)
a kde R2 představuje karboxyskupinu Cys103 nebo karboxykonec aminokyselinového zbytku ^braného ze skupiny:
-54® *· τ’* 3
F
FN
FNC
FNCS (SEQ ID NO:30)
FNCSL (SEQ ID NO:31)
FNCSLC (SEQ ID NO:32)
FNCSLCL (SEQ ID NO:33),
a jejich varianty, avšak za předpokladu, že jestliže Rj představuje methionylovanou nebo ne5 methionylovanou aminoskupinu aminokyselinové sekvence VCPQGKYIHPQNNSIC nebo zkrácení N-konce o 1-15 reziduí, pak protein Ri-[Cys19-Cys103]-R2 není variantou Ri-[Cys19Cys103]-FNCSLCL-R3, kde R3 představuje karboxyskupinu aminokyselinové sekvence Ašn1Asn161 z obrázku 1 nebo jejího zkrácení na karboxykonci.
ío Příklady zkráceného sTNFR-I podle předkládaného vynálezu zahrnují následující molekuly: NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-CysI03]-FC-COOH (také zmiňovaná jako sTNFR-I 2.6D/C105); NH2-MDSVPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (také zmiňovaná jako sTNFR-I 2.6D/C106); NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys,9-Cys103]-FN-COOH (také zmiňovaná jako sTNFR-I 2.6D/N105); NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys,03]-FNCSL15 COOH (také zmiňovaná jako sTNFR-I 2.3D/d8); NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (také zmiňovaná jako sTNFR-I 2.3D/dl8) a NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (také zmiňovaná jako sTNFR-I 2.3-D/dl 5) buďto methionylované nebo nemethionylované, a jejich varianty a deriváty.
Vzorcem „R4-[Cys32-Cys115]-R5“ se rozumí jeden nebo více proteinů, kde [Cys32-Cys115] představuje rezidua Cys32 až Cys115 sTNFR-I při číslování aminokyselinových zbytků podle schématu na obrázku 8 (SEQ ID NO:35) a kde R4 představuje methionylovanou nebo nemethionylovanou aminoskupinu Cys32 nebo aminokyselinového, zbytku(ů) aminokonce vybraných ze skupiny:
C
MC
QMC
AQMC
TAQMC
QTAQMC
DQTAQMC
YDQTAQMC
YYDQTAQMC
EYYDQTAQMC
REYYDQTAQMC (SEQ ID NO:36) (SEQ ID NO:37) (SEQ ID NO:38) (SEQ ID NO:39) (SEQ ID ‘NO: 40) (SEQ ID NO:41) (SEQ ID NO:42) (SEQ ID NO:43)
-6CZ 296835 B6
LREYYDQTAQMC (ŠEQ ID NO:44)
RLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:45)
CRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:46)
TCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:47)
STCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:48)
GSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:49)
PGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:50)
EPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:51)
PEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:52)
APEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:53)
YAPE PGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:54)
PYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:55)
TPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO: 56)
FTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:57)
AFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:58)
VAFTPÝAPÉPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:59)
QVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:60)
AQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:61)
PAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:62)
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO: 63),
a kde R5 představuje karboxyskupinu Cys115 nebo karboxyskupinu karboxykonce aminokyselinových zbytků vybraných ze skupiny:
A
AP
APL
APLR (SEQ ID NO:64)
APLRK (SEQ ID NO:65)
APLRKC (SEQ ID NO:66)
APLRKCR (SEQ ID NO:67)
a jejich varianty, avšak ze předpokladu, že jestliže R4 představuje methionylovanou nebo 10 nemethionylovanou aminoskupinu aminokyselinové sekvence TCRLREYYDQTAQMC nebo zkrácení N-konce o 1 až 15 zbytků, pak R4-[Cys32-Cysll5]-R5 není variantou se vzorcem R4[Cys32-Cys115]-APLRKDCR-R6, kde Re představuje karboxyskupinu aminokyselinové sekvence ProI23-Thr179 z obrázku 8 nebo jejího zkrácení na karboxykonci.
Podle jednoho aspektu předkládaného vynálezu molíou být zkrácené sTNFRs připraveny v glykosylované nebo neglykosylované formě. Zkrácené sTNFRs jsou připravovány technikami rekombinantního genového inženýrství. Kromě toho se zkrácené sTNFRs mohou syntetizovat 5 chemickými technikami nebo kombinací rekombinantních a chemických metod.
V jiném aspektu předkládaného vynálezu mhou zkrácené sTNFRs být modifikovány připojením zkrácených STNFRs k ve vodě rozpustnému polymeru. Tak například, zkrácené sTNFRs mohou být konjugovány k jedné nebo více molekulám polyethylenglykolu s cílem zlepšit farmakokine10 tickou účinnost zvětšením zdánlivé molekulové hmotnosti molekuly.
Další aspekt předkládaného vynálezu zahrnuje různé polynukleotidy kódující zkrácené sTNFRs. Vhodné nukleotidová sekvence zahrnují například ty, které jsou konkrétně uvedené na obrázcích, stejně jako degenerované sekvence a jejich přirozeně se vyskytující alelické varianty. Takovéto 15 sekvence nukleových kyselin mohou být použity při expresi zkrácených sTNFRs v eukaryontních nebo prokaryontních hostitelských buňkách, kde jsou produkty exprese nebo jejich deriváty charakterizovány schopností ovlivňovat aktivitu TNF.
Dalším aspektem předkládaného vynálezu jsou vektory obsahující polynukleotidy kódující zkrá20 cené sTNFRs funkčně spojené s amplifikačními sekvencemi a/nebo sekvencemi řídícími expresi.
Jako prokaryontní, tak eukaryotní hostitelské buňky mohou být stabilně transformovány nebo transfekovány takovýmito vektory pro expresi zkrácených sTNFRs. Předkládaný vynález dále zahrnuje rekombinantní produkci zkrácených sTNFRs. Hostitelské buňky obsahující takovéto polynukleotidy jsou pěstovány ve vhodném živném médiu a buňkami exprimované zkrácené 25 sTNFRs jsou případně izolovány z hostitelských buněk a/nebo ze živného média.
Podle dalšího aspektu zahrnuje předkládaný vynález farmaceutické kompozice obsahující zkrácené sTNFRs nebo jejich deriváty. Typicky mohou být zkrácené sTNFRs nebo jejich deriváty připravené ve spojení s farmaceuticky vhodnými nosiči. Pro usnadnění výroby, uskladnění, mani30 pulaci, vpravení a/nebo účinnosti zkrácených sTNFRs a jejich variant se může použít řada pomocných látek.
Další aspekt předkládaného vynálezu se vztahuje k metodám ovlivnění aktivity TNF. Konkrétně nemoci zprostředkované TNF (např. nemoci zprostředkovné TNF-α a/nebo TNF-β) mohou být 35 léčeny podáváním terapeuticky účinných množství zkrácených sTNFRs nebo jejich derivátů.
Polynukleotidy kódující krácené sTNFRs se také mohou využít pro aplikaci v buněčné terapii nebo v genové terapii.
Zkrácené sTNFRs podle předkládaného vynálezu jsou vhodné zejména pro produkci proteinu ve velkých množstvích. Například, sTNFR-I má deaminované místo uvnitř aminokyselinové sekvence, 111 až 126 (aminokyseliny Asn11'-Gly126). Předpokládá se, že absence tohoto místa zvyšuje biochemickou stabilitu purifíkovaného proteinu a snižuje možnou degradaci produktu, což se projeví zvýšením stability proteinu při jeho skladování. Zkrácené sTNFRs mají méně disulfído45 vých můstků než ostatní dříve popsané proteiny inhibitorů TNF. Například, sTNFR-I má dva disulfídové můstky uvnitř sekvence aminokyselin 111 až 126 a tři disulfídové můstky uvnitř sekvence aminokyselin 127 až 161; sTNFR-II má pak disulfídový můstek mezi Cys121 a Cys129, Cys142 a Cys157, a Čys163 a Cys178. Snížený počet disulfídových můstků je důležitý proto, že vyšší počet těchto vazeb může komplikovat proces opětovného skládání protein. Je překvapivé, že 50 zkrácené sTNFRs mají méně míst pro antigenní epitopy, což mají ostatní dříve popsané proteiny inhibitorů TNF (např. zkrácená forma sTNFR-I mající první tři domény má nové epitopy (neoepitopy) vzniklé odhalením určitých zbytků, viz. příklad III), což značně snižuje antigenicitu a dále dochází k významnému snížení rychlosti odbourávání (clearance) při opakovaném podávání. Předpokládá se, že snížená imunogenicita zkrácených sTNFRs je vhodná pro léčení onemoc55 nění zprostředkovaných TNF, zahrnujících zejména chronická zánětlivá onemocnění.
ίί
Další aspekty a výhody vynálezu budou odborníkům v ótíSřu zřejmé z následujícího popisu, kde je podrobně popsána provedení předkládaného vynálezu.
Detailní popis vynálezu
Předkládaný vynález je založen na neočekávaném zjištění, že jak u sTNFR-I, tak i sTNFR-II může být zmenšena jejich velikost nejenom odstraněním čtvrté domény, ale také části třetí domény a případně i části první domény při zachování biologické aktivity a snížení antigenicity. Produkce těchto biologicky aktivních zkrácených sTNFRs nebo jejich derivátů se pokládá za výhodnou minimálně z následujících důvodů. Za prvé tyto molekuly mohou být o jedno potenciálně destabilizující deaminované místo méně. Za druhé tyto molekuly mají méně disulfídových můstků což usnadňuje případnou purifikaci a opětovné skládání, Za třetí tyto molekuly mají menší počet míst pro možné antigenní epitopy.
Zde používaný termín „zkrácený(é) sTNFR(s)“ zahrnuje jeden nebo více biologicky aktivních 19 103 32 syntetických nebo rekombinantních molekul vzorce Ri-[Cys -Cys ]-R2 nebo R4-[Cys Cys115]-R5 a jejich varianty (včetně inzerčních, substitučních a delečních), které jsou popsány níže.
Zde používaný termín „biologicky aktivní“ znamená, že zkrácený sTNFR vykazuje podobné TNF inhibiční vlastnosti jako sTNFR-Ι a/nebo sTNFR-Π, i když ne nutně všechny a ne nutně v plném rozsahu. Obecně, zkrácené sTNFRs a jejich deriváty mají schopnost inhibovat TNF. Biotesty zkrácených sTNFRs jsou popsány níže v příkladu II. Výběr konkrétních TNF inhibičních vlastností závisí na požadovaném použití zkráceného sTNFR.
Podle jednoho aspektu předloženého vynálezu zkrácené sTNFRs mohou být výhodně produkovány rekombinantními technikami v bakteriálních, savčích nebo hmyzích buněčných systémech a. mohou být buď v glykosylované nebo neglykosylované formě proteinu. Alternativně mohou být syntetizovány chemicky. Produkční metody preferované v současnosti jsou popsané detailně níže.
Všechny zkrácené sTNFRs mohou být typicky izolovány a purifikovány do značné čistoty & zbavené tak ostatních proteinových materiálů (např. nezkrácených sTNFRs). Výhodně je zkrácený sTNFR z asi 80 % zbaven ostatních proteinů, které mohou být přítomné vzhledem k produkční technice použité při přípravě zkrácených sTNFRs. Výhodněji je sTNFR z si 90 % zbaven ostatních proteinů, zejména když je asi z 95 % zbaven ostatních proteinů a nejvýhodněji pak, když je přibližně z > 98 % zbaven ostatních proteinů. Je však cenné, že požadovaný protein může být před podáváním kombinován s dalšími aktivními složkami, chemickými kompozicemi a/nebo s vhodnými farmaceutickými materiály, jak je podrobněji popsáno níže.
Zkrácené sTNFRs
Zkrácené sTNFRs podle předkládaného vynálezu mohou být jedním nebo více proteiny reprezentovanými následujícím vzorcem:
R1-[Cys19-Cys103]-R2, kde [Cys19-Cys103] představuje rezidua 19 až 103 sTNFR-Ι (při označení aminokyselinových zbytků použitém na obrázku 1 (SEQ ID NO:2)), kde R| představuje methionylovanou nebo nemethionylovanou aminoskupinu Cys19 nebo aminokonce aminokyselinového zbytku(ů) vybraných z následující skupiny:
-9li
I
C
IC
SIC
NSIC (SEQ ID NO:15)
NNSIC (SEQ ID NO:16)
QNNSIC (SEQ ID NO:17)
PQNNSIC (SEQ ID NO:18)
HPQNNSIC (SEQ ID NO:19)
IHPQNNSIC (SEQ ID NO:20)
YIHPQNNSIC (SEQ ID NO:21)
KYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:22)
GKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO: 23)
QGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:24)
PQGKYXHPQNNSIC (SEQ ID NO:25)
CPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:26)
VCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:27)
SVC PQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:28)
DSVCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:29),
a kde R2 představuje karboxyskupinu Cys103 nebo aminokyselinové zbytky karboxykonce vybra5 né z následující skupiny:
F
FN
FNC
FNCS (SEQ ID NO:30)
FNCSL (SEQ ID NO:31)
FNCSLC (SEQ ID NO:32)
FNCSLCL (SEQ ID NO:33),
a jejich varianty, avšak za předpokladu, že jestliže Ri představuje methionylovanou nebo 10 nemethionylovanou aminoskupinu aminokyselinové sekvence VCPQGKYIHPQNNSIC nebo zkrácení N-konce a 1-15 reziduí, pak protein Ri-[Cys19-Cys103]-R2 není variantou R]-[Cys19Cys103]-FNCSLCL-R3, kde R3 představuje karboxyskupinu aminokyselinové sekvence Asn111Asn161 z obrázku 1 nebo jejího zkrácení na karboxykonci.
V dalším základním provedení zkrácené sTNFRs podle předkládaného vynálezu mohou být jedním nebo více proteiny reprezentované následujícím vzorcem:
-10li - »
Í' kde [Cys32-Cys115] reprezentuje rezidua Cys32 až Cys115 sTNFR-II podle schématu číslování aminokyselinových zbytků na obrázku 8 (SEQ ID NO:35), kde R4 představuje methionylovanou 5 nebo nemethionylovanou aminoskupinu Cys32 nebo aminokyselinového zbytku(ů) aminokonce vybraných ze skupiny:
MC
QMC
AQMC I (SEQ ID NO:36)
TAQMC (SEQ ID NO:37)
QTAQMC (SEQ ID NO:38)
DQTAQMC (SEQ ID NO:39)
YDQTAQMC (SEQ ID NO:40)
YYDQTAQMC (SEQ ID NO:41)
EYYDQTAQMC .'(SEQ ID NO:42)
REYYDQTAQMC (SEQ ID NO:43)
LREYYDQTAQMC (SEQ IĎ NO:44)
RLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:45)
CRLREYYTQTAQMC (SEQ ID NO:46)
tcrlreyOdqtaqmc (SEQ ID NO:47)
STCRLRUYYDQTAQMC (SEQ IP NO:48)
GSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:49)
PGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:50)
EPGSTCRLREÝÝDQTAQMC (SEQ ID NO:51)
PEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:52)
AQEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:53)
YAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:54)
PYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:55)
TPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:56)
FTPYAPEPGŠTCSLREYYDQTAQMC (SEQ ID ŇO:57)
AFTPYAPEPGSTCRLREYYDQŤAQMC (SEQ ID NO:58)
VAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO : 59).
-11 ή CZ 296835 Β6
QVAFTPYAQEPGSTCRLREYYDQTAQMC
AQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC
PAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:60) (SEQ ID NO:61) (SEQ ID NO:62) (SEQ ID NO:63), a kde R5 představuje karboxyskupinu Cys115 anebo karboxyskupinu karboxykonce aminokyselinových zbytků vybraných ze skupiny:
A
AP
APL
APLR (SEQ ID NO:64)
APLRK (SEQ ID NO:65)
APLRKC (SEQ ID NO: 66)
APLRKCR (SEQ ID NO:67)
a jejich varianty, avšak za předpokladu, že jestliže R4 představuje inethionylovanou nebo nemethionylovanou aminoskupinu aminokyselinové sekvence TCRLREYYDQTAQMC nebo zkrácení N-konce o 1 až 15 zbytků, pak R4-[Cys32-Cys115]-R5 není variantou se vzorce R4[Cys32-CysI15]-APLRKCR-R€, kde R^ představuje karboxyskupinu aminokyselinové sekvence Pro123-Thr179 z obrázku 8 nebo jejího zkrácení karboxykonce.
Další aspekt předkládaného vynálezu zahrnuje jednu nebo více variant Ri-[Cys19-Cys103]-R2 a R4-[Cys32-Cys32-Cys115]-R5 buď methionylovaných nebo nemethionylovaných. Termín „zkrácený (zkrácené) sTHFR(s)“ tedy zahrnuje jednu nebo více přirozeně se vyskytujících alelických variant R1-[Cys19-Cys103]-R2 a R4-[Cys32-Čys115]-R5 a jednu nebo více dalších variant proteinů, ve kterých byly aminokyselinové zbytky v aminokyselinových sekvencích Ri-[Cys19-Cys103]-R2 a R4-[Cys32-Cys115]-R5 odstraněny („deleční varianty“), včleněny („inzerční varianty“) nebo substituovány („substituční varianty“).
Delece aminokyselinových sekvencí jsou typicky v rozsahu od asi 20 aminokyselinových zbytků; pravidla se ale jedná o asi 1-10 zbytků a nejčastěji o 1-5 zbytků, takže nedojde k narušení kon25 formace proteinu. Jsou zamýšleny delece na N-konci, C-konci a vnitřních intrasekvencí. Počet celkových delecí a/nebo následných delecí je zvolen tak, aby se zachovala terciární struktura proteinu v ovlivněné doméně, např. křížová vazba mezi cysteiny.
Delece uvnitř aminokyselinové sekvence R1-[Cys19-Cys103]-R2 a uvnitř aminokyselinové sek30 vence R4-[Cys32-Cysll5]-R5 se mohou provádět v oblasti nízké homologie se sekvencemi ostatních členů receptorové rodiny NGF/TNF ve skupině buněčných povrchových membránových proteinů. Delece uvnitř aminokyselinové sekvence Rí-[Cys19-Cys,03]-R2 a uvnitř aminokyselinové sekvence R4-[Cys32-Cys115]-R5 se mohou také provádět v oblasti významné homologie se sekvencemi ostatních členů receptorové rodiny NGF/TNF, a pak je větší pravděpodobnost významné modifikace biologické aktivity. Sekvenční podobnost mezi členy receptorové rodiny NGF/TNF je konkrétně zvláště vysoká v oblastech odpovídajících prvním dvěma disulfidovým smyčkám domény 1, celé doméně 2, a první disulfídové smyčce domény 3 (Banner et al. (1993). Cell, 73:431—445). Příkladem dvou delečních variant odvozených od Rl-[Cys19-Cys103]-R2 jsou R1-[Cys19-(AThr20-Cys103]-R2 a R1-[Cys19-(ACys19-Lys21)-Cys103]-R2, kde Rj a R2 odpovídají výše uvedené definici. Příkladem tří delečních variant odvozených do R4-[Cys32-Cys115]-R5 jsou
R4-[Cys32-(ACysI15)Cys115]-R5; R1-[Cys,9-(ACysn5-Lys,15)Cys1,5]-R2 a R4-[Cys32-(ACys'15Arg113)Cysll5]-R5; kde Rj a R2 odpovídá výše uvedené definici.
Adice aminokyselinových sekvencí může zahrnovat fúze na amino- a/nebo karboxykonci v rozsahu délek od jednoho rezidua do jednoho sta nebo více reziduí, stejně jako interní intrasekvenční inzerce jednoho nebo více aminokyselinových reziduí. Interní adice se mohou pohybovat zpravidla v rozsahu 1 až 10 aminokyselinových zbytků, častěji pak v rozsahu 1 až 5 aminokyselinových zbytků a nej častěji pak v rozsahu 1 až 3 aminokyselinových zbytků.
Adiční varianty aminokonce zahrnují přidání methioninu (například jako výsledek přímé exprese proteinu v bakteriálních rekombinantních buněčných kulturách), nebo dalších aminokyselinových reziduí či sekvencí. Další příklad inzerce na aminokonci zahrnuje fúzi signální sekvence, stejně jako nebo s ostatními pre- a prosekvencemi pro usnadnění sekrece proteinu z rekombinantních hostitelských buněk. U prokaryontních hostitelských buněk, které nerozeznávají a nezpracovávají přirozené signální sekvence sTNFR-I nebo s TNFR-II, mohou být signální sekvence nahrazeny prokaryotními signálními sekvencemi vybranými například ze skupiny zahrnující alkalickou fosfátázu, penicilinázu nebo vedoucí sekvenci tepelně odolného enterotoxinu II. U buněk kvasinek mohou být signální sekvence vybrány například ze skupiny zahrnující kvasinkovou invertázu, alfa faktor nebo vedoucí sekvenci kyselé fosfatázy. V savčích buňkách je exprese přirozených signální sekvencí sTNFR-I nebo s TNFR-Π (EP393 438 a EP 422 339) dostatečná, i když i jiné savčí signální sekvence mohou být vhodné (například sekvence odvozené od ostatních členů rodiny NGF/TNF).
Adiční varianty na karboxykonci nezahrnují přidání jednoho nebo více aminokyselinových reziduí, které by vedlo k rekonstrukci, sTNFR-I nebo sTNFR-Π v uvedeném pořadí. Je žádoucí, aby adiční varianty na karboxykonci nezahrnovaly přidání jednoho nebo více karboxykoncových kyselinových reziduí, které by vedly k rekonstrukci třetí nebo čtvrté domény sTNFR-I nebo sTNFR-II. Příkladem adiční varianty na karboxykonci mohou být chimérické proteiny zahrnující fúzi Ri-[Cys19-Cys103]-R2 nebo R4-[Cys32-Cys115]-R5 s celou nebo s částí konstantní domény těžkého nebo lehkého řetězce lidského imunoglobulinu. Jsou preferovány takové chimérické proteiny, ve kterých každá imunoglobulinová část zahrnuje všechny domény kromě první domény konstantní oblasti těžkého řetězce lidského imunoglobulinu, jako jsou IgG, IgA, IgM anebo IgE, zejména pak IgG, např. IgGl nebo IgG3). Pro odborníka v oboru je zřejmé, že jakákoliv aminokyselina každé z imunoglobulinových částí může být deletována nebo substituována s jednou nebo více aminokyselinami, nebo jedna či více aminokyselin může být přidáno potud, pokud se TNF vazebná část stále váže k TNF a imunoglobulinová část vykazuje jednu nebo více svých charakteristických vlastností.
Další skupinou jsou varianty se substitucí aminokyselin. Všechny tyto varianty mají nejméně jeden aminokyselinový zbytek v Ri-[Cysl9-Cys103]-R2 nebo R4-[Cys32-CysI15]-R5 odstraněn a nahrazen odlišným zbytkem na jeho místě. Substituční varianty zahrnují alelické varianty, které jsou charakterizovány změnami v přirozeně se vyskytujících nukleotidových sekvencích v druhové populaci, které mohou nebo nemusí mít za následek změny aminokyselin. Při výběru možnýh míst pro mutace mohou odborníci v oboru použít jakoukoliv známou informaci o vazebném nebo aktivním místě polypeptidu.
Jedna metoda pro identifikaci aminokyselinových zbytků nebo oblastí pro mutagenezi proteinu se nazývá „mutageneze alaninovým vyhlazením,, (alanine scanning mutagenesis) (Cunningham a Wells (1989), Science, 244:1081-1084, jehož popis je zde zahrnut odkazem). V této metodě je identifikován aminokyselinový zbytek nebo skupina cílových zbytků proteinu (např. nabité zbytky, jako např. Arg, Asp, His, Lys a Glu) a nahrazen neutrální nebo negativní nabitou aminokyselinou (nejlépe alaninem nebo polyalaninen) s cílem ovlivnit interakci aminokyselin s okolním vodným prostředím uvnitř nebo vně buňky. Ty zbytky, které vykazují funkční citlivost ksubstitucím, jsou dále analyzovány včleněním dalších nebo jiných zbytků na místo substituce. Tak je předem určeno místo pro zavedení modifikace aminokyselinové sekvence a pro další optimalizaci
provedení mutace v daném místě se může provést alaninové vyhledávání nebo náhodná metageneze a výsledné variantní polypeptidy jsou podrobený šcřééningu na zjištění optimální kombinace požadované aktivity a stupně aktivity.
Místa, která jsou předmětem zájmu pro substituční mutagenezi zahrnují ta místa, kde jsou amhokyseliny vyskytující se vR1-[Cys19-Cys103]-R2 nebo R4-[Cys32-CysI15]-R5 významně odlišné (co se týče podstatné části postranního řetězce, náboje a/nebo hydrofobicity) od sTNFR podobným proteinům, jako jsou např. sTNFRs z různých jiných druhů nebo jiných členů receptorové rodiny NGF/TNF.
Další zájmová místa zahrnují ta, ve kterých jsou určitá rezidua podobná nebo identická s odpovídajícími místy v sTNFR-Ι podobným proteinům a sTNFR-Π podobným proteinům. Takováto místa jsou obecně důležitá pro biologickou aktivitu proteinu. Například zkušený odborník chápe, že před tímto vynálezem nebyl vliv zkrácení sTNFR-Ι a sTNFR-Π na jejich příslušnou trojroz15 měrnou strukturu předvídatelný. Ale na základě zde uvedených výsledků odborník zajisté pochopu', že první principy vývoje strategie pro tvorbu variantních proteinů se mohly částečně zakládat na dříve vysvětlených údajích pro sTNFR-Ι a sTNFR-Π o plné délce. V souvislosti s tím byly objasněny následující informace týkající se sTNFR-Ι (Banner et al. (1993), viz výše a Fu et al. (1995), Protein EnGlneering, 8(12): 1233-1241). Jako potenciálně důležitá pro stabilizaci odpo20 vídající strukturu domény 1, 2 a 3 byla identifikována rezidua Tyr9, Thr39, His55 v doméně 1, rezidua Phe49, Ser63, Asp82 v doméně 2 a rezidua Tyr92 a Ser107 v doméně 3. Rezidua Pro12 a His55 tyla identifikována jako potenciálně vzájemně se ovlivňující se Ser86-Tyr87 na podjednotce C TNF-α. Rezidua Glu45-Phe49 byla identifikována jako podstata smyčky, která potenciálně interaguje s rezidui Leu29-Arg32 podjednotky A TNF-α. Reziduum Gly48 bylo identifikováno jako vzá25 jemně se ovlivňující s Asn19-Pro20 na podjednotce A TNF-ά. Rezidua His58-Leu60 byla identifikována jako důležitý prvek v konformaci prodlouženého řetězce a interakce postranního řetězce se zbytky Arg31-Ala33 na podjednotce A TNF-α byla potenciálně identifikována s reziduem His58 sTNFR-Ι, které se specificky vzájemně ovlivňuje s reziduem Arg31. Rezidua Lys64-Arg66 byla identifikována jako důležitý prvek v konformaci prodlouženého řetězce a bylo zjištěno, že vyka30 zují interakce postranního řetězce a hlavního řetězce s rezidui Ala145-Glu146 a reziduem Glu46 na podjednotce A TNF-α. U rezidua Met69 byla identifikována možná interakce s reziduem Tyr115 na podjednotce A TNF-α. Zjistilo se, že rezidua His94-Phe101 tvoří smyčku, která se vzájemně ovlivňuje s rezidui Thr72-Leu75 a Asn137 podjednotky C TNF-α a s reziduem Trp96 s TNFR-I, specificky se ovlivňujícím s rezidui Ser71-Thr72 a podjednotce C TNF-α, Leu100 sTNFR-Ι, které 35 je v těsné blízkosti s reziduem Asn137 na podjednotce C TNF-α a reziduem Gin102 sTNFR-I, které se vzájemně specificky ovlivňuje s reziduem Pro113 na podjednotce A TNF-α. Pro odborníka v oboru je zřejmé, že nejprve by měla být substitucí modifikována tato místa, a to relativně konzervativním způsobem.
Takovéto konzervativní substituce jsou uvedeny v tabulce 1 pod záhlavím „Preferované substituce“. Jestliže takovéto substituce vyvolají změny biologické aktivity, pak mohou být zavedeny podstatnější substituční změny (Příkladné substituce) a/nebo se mohou provést další adice/delece a poté analýza výsledných produktů.
- 14CZ 296835 B6
TABULKA 1: Substituce.aminokyselin
Původní zbytek Preferované substituce Příkladné substituce
Ala (A) Val Val; Léu; Ile
Arq (R) Lys Lys; Gin; Asn
Asn (N) Gin Gin; His; Lys; Arq
Asp (D) Glu Glu
Cys (C) Ser Ser
Gin (0) Asn Asn
Glu (Ξ) Asp Asp
Glv (G) Pro Pro
His (H) Arq Asn; Gin; Lys; Arq
Ile (I) Leu Leu; Val; Met.; Ala,·: phe; notleucin
Leu (L) Ile norleucin; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Lys (K) Arq Arq;: Gin; Asn
Met (M) Leu Leu; Phe; Ile
Phe (F) Leu Leu; Val; Ile; Ala
Pro (P) Glv Glv
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr Tyr
Tvr (Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser
Val (V) Leu Ile; Leu; Met; Phe; Ala;'hórleucin
Při změnách obdobné povahy se může brát v úvahu hydropatický index aminokyselin. Každé aminokyselině byl přiřazen hydropatický index na základě jejich hydrofobicity a charakteristik náboje. Hodnoty jsou následující: izoleucin (+4,5); valin (+4,2); leucin (+3,8); fenylalanin (+2,8);
cystain/cystein (+2,5); methionin (+1,9); alanin (+1,8); glycin (-0,4); ethreonin (-0,7); serin (—0,8); tryptofan (-0,9); tyrosin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutamát (-3,5); glutamin (—3,5); aspartát (-3,5); asparagin (-3,5); lysin (-3,9) a arginin (-4,5).
Význam hydropatického indexu aminokyselin při porovnávání interaktivních biologických funkcí ío proteinů je odborníkům obecně znám (Kyte a Doolittle (1982), J. Mol. Biol, 157:105-131, jehož popis je zde zahrnut odkazem). Je známé, že určité aminokyseliny mohou být substituovány za jiné s podobným hydropatickým indexem nebo skóre a stále je zachována podobná biologická aktivita. Dělají-li se změny založené na hydropatickém indexu, preferují se substituce aminokyselin, jejichž hydropatický index je v rozsahu ±2, nebo lépe v rozsahu ±1, nebo nejlépe ±0,5.
-15CZ 296835 B6
Odborníkům je také známé, že substituce podobných aminokyselin může být efektivně provedena na základě hydrofilicity, zejména tehdy, když biologicky funkční ekvivalentní protein nebo peptid takto vytvořený je zamýšlen pro použití k imunologickým účelům tak, jak je tomu v tomto 5 případě.
Patent US 4 554 101 (jehož popis je zde zahrnut odkazem) uvádí, že největší místní průměrná hydrofilicita proteinu (určovaná hydrofilicitou svých přilehlých aminokyselin) koreluje sjeho imunogenicitou a antigenicitou, tj. s biologickými vlastnostmi proteinu.
Jak je detailně uvedené v patentu US 4 554 101, byly jednotlivým aminokyselinovým zbytkům přiřazeny následující hodnoty hydrofilicity: arginin (+3,0); lysin (+3,0); aspartát (+3,0 ± 1); glutamát (+3,0 ± 1); serin (+0,3); asparagin (+0,2); glutamin (+0,2); glycin (0); threonin (-0,4); prolin (-0,5 ±1); alanin (-0,5); histidin (-0,5); cystein (-1,0); methionin (-1,3); valin (-1,5); leucin 15 (-1,8); izoleucin (-1,8); tyrosin (-2,3); fenylalanin (-2,5) a tryptofan (-3,4).
Dělají-li se změny založené na podobné hodnotě hydrofilicity, preferují se substituce aminokyselin, jejichž hodnoty hydrofilicity jsou v rozsahu ±2, nebo lépe v rozsahu ±1, nebo nejlépe ±0,5.
Patent US 4 554 101 také popisuje identifikaci a přípravu epitopů z primární aminokyselinové sekvence na základě hydrofilicity. Metodou uvedenou v patentu US 4 554 101 by byl odborník schopen identifikovat epitopy uvnitř sekvence aminokyselin, jako jsou zde popsané sTNFR sekvence. Tyto oblasti jsou zde uváděny jako „epitopové vnitřní oblasti“ (epitopic core regions).
Řada vědeckých publikací byla zaměřena na předpověď sekundární struktury a identifikaci epitopů analýzou sekvence aminokyselin (Chou a Fasman (1974), Biochemistry 13 (2): 222-245; Chou a Fasman, Biochemistry, 113 (2):211-222; Chou a Fasman, (1978) Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol, 47-45-148; Chou a Fasman, Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 a Chou ai Fasman (1979), Biophys. J., 26:367-384 (jejichž popisy jsou zde zahrnuty odkazem). Kromě toho jsou v současnosti k dispozici počítačové programy pro pomoc s předpovědí antigenních částí a epitopové vnitřní oblasti proteinů. Příkladem jsou programy založené na Jameson-Wolfově analýze (Jameson a Wolf (1998); Comput. Appl. Biosci., 4(1):181-186 a Wolf et al. (1988), Comput. Appl. Biosci., 4(1):187-191, jejichž popisy jsou zde zahrnuty odkazem), program pepPlot(R) (Brutlag et al. (1990), CABS, 6:237-245 a Weinbergen et al. (1985), Science,
228:740-742, jejichž popis je zde zahrnut odkazem) a ostatní nové programy pro předpověď terciární struktury proteinů (Fetrow a Bryant (1993), Biotechnology, 11:479-483, jehož popis je zde zahrnut odkazem).
Očekává se, že konzervativní modifikace aminokyselinových sekvencí (a odpovídající modifika40 ce kódujících sekvencí nukleových kyselin) vR]-[Cys19-Cys103]-R2 nebo R4-[Cys32-Cys115]-R5 poskytnou modifikovanému proteinu podobné funkční a chemické charakteristiky.
Naproti tomu se může dosáhnout významné modifikace ve funkci a/nebo chemické charakteristice R]-[Cys19-Cysl03]-R2 nebo R4-[Cys32-Cys115]-R5 výběrem substitucí, které se výrazně liší 45 svým vlivem na zachování: (a) struktury polypeptidové kostry v oblasti substituce (například šroubovicové konformace nebo konformace listu), (b) náboje nebo hydrofobicity proteinu v cílovém místě, (c) převážně části postranního řetězce. Přirozeně se vyskytující rezidua jsou rozdělena do skupin založených na vlastnostech postranního řetězce:
1) hydrofóbní: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) neutrální hydrofilní: Cys, Ser, Thr;
3) kyselé: Asp, Glu;
4) zásadité: Asn, Gin, His, Lys, Arg;
5) rezidua, která ovlivňují orientaci řetězce: Gly, Pro; a
6) aromatické: Trp, Typr, Phe.
Nekonzervativní substituce mohou zahrnovat výměnu člena jedné z těchto skupin za jiného. 5 Takovéto záměny reziduí mohou být vneseny do oblastí Ri-[CysI9-Cys!O3]-R2 a R4-[Cys32Cys115]-R5, které jsou homologní nebo nehomologní s jinými členy rodiny receptorů NGF/TNF.
Specifické mutace sekvencí Ri-[Cys19-Cys103]-R2 nebo R4-[Cys32-Cys1!5]-R5 mohou zahrnovat substituci nepřirozené(non-native) aminokyseliny na N-konci, C-konci nebo na jakémkoliv ío místě proteinu, které je modifikováno přidáním N-vázaného nebo O-vázaného karbohydrátu.
Takovéto modifikace mohou být zvláště užitečné, například při přidání aminokyseliny (např. cysteinu), což je výhodné pro připojení ve vodě rozpustného polymeru při tvorbě derivátů, jak je popsáno dále. Příklad je vidět na obrázku 5, kde přirozeně se vyskytující Asn105 v sTNFR-I je zaměněn za Cys pro usnadnění připojení molekuly polyethylenglykolů (příklad I).
Sekvence Ri-[CysI9-Cys103]-R2 nebo R4-[Cys32-Cys115]-R5 může být dále modifikována s cílem piřidat glykosylační místo nebo odstranit N-vázané nebo O-vázané glykosylační místo. Asparaginové rozpoznávací místo pro glykosylační připojení zahrnuje tripeptidovou sekvenci, která je specificky rozpoznána příslušným buněčným glykosylačním enzyme. Tyto tripeptidové sekvence 20 jsou Asn-Xaa-Thr nebo Asn-Xaa-See, kde Xaa může být jakákoliv aminokyselina jiná než Pro.
Prokázaná nebo předpovězená asparaginová rezidua sTNFR-I existují na pozicích 14, 105 a 111. Prokázaná nebo předpovězená asparaginová rezidua sTNFR-II existují na pozicích 149 a 171. Pro modifikaci nebo přidání N-vázaných nebo O-vázaných glykosylačních míst se může provést řada aminokyselinových substitucí nebo delecí a výsledkem je protein s pozměněnou glykosylací.
Ve specifickém provedení jsou varianty v podstatě homologní s aminokyselinovou Rr~[Cys19Cys103]-R2 nebo R4-[Cys32-Cys115]-R5. Termín „v podstatě homologní“, jak je zde použit, znamená stupeň homologie, který přednostně přesahuje 70 %, nebo lépe je vyšší než 80 %, vyšší než 90 % a nejlépe je dokonce vyšší než 95 %. Procento homologie zde popsané se vypočítá jako 30 procento aminokyselinových zbytků nalezených v menší ze dvou sekvencí, které se shodují s identickými aminokyselinovými rezidui v porovnávané sekvenci, přičemž se v délce 100 aminokyselin mohou zavést čtyři mezery (gaps) pro usnadnění tohoto porovnání tak, jak je uvedeno vDayhoff (1972), v Atlas of Protein Sequences and Structure, 5:124, National Biochemical Research Foumdation, Washington, D.C., jehož popis je zde zahrnut odkazem. Jako v podstatě 35 homologní jsou také zahrnuty zkrácené sTNFRs, které mohou být izolovány díky křížové reakci protilátek se sekvencí aminokyselin v SEQ ID NO:2 a SEQ ID NO: 35, v u vedeném pořadí, nebo jejichž geny mohou být izolovány pomocí hybridizace s DNA SEQ ID NO:1 nebo SEQ ID NO:34, nebo s jejich segmenty.
Příklady sTNFRs podle předkládaného vynálezu zahrnují následující molekuly: NH2MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH (také uváděná jako sTNFR-I 2.6D/C105); NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-€OOH (také uváděná jako sTNFR-I 2.6D/C106); NH2-MDSVCPQGKYIHPQNISIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH (také uváděná jako sTNFR-I 2.6D/N105); NH2-MYIHPQNNSIC-[Gys19-Cys103]-FNCSL45 COOH (také uváděná jako sTNFR-I 2.3D/d8); NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COH (také uváděná jako sTNFR-I 2.3D/dl5), buďto methionylované nebo nemethionylované, a jejich varianty 2i deriváty.
Příprava variant zkrácených sTNFRs je popsána podrobněji níže. Takovéto varianty se mohou 50 připravit zavedením odpovídajících nukleotidových změn do DNA kódující zkrácené sTNFRs nebo in vitro chemickou syntézou požadovaných zkrácených sTNFRs. Odborníci dále zajisté pochopí, že se může provést mnoho kombinací delecí, inzercí a substitucí za předpokladu, že výsledné sTNFRs jsou biologicky aktivní.
Techniky mutageneze pro záměnu, inzerci nebo deleci jednoho nebo více vybraných aminokyselinových reziduí jsou odborníkům Známé (např. patent US 4 518 584, jehož popisuje zde zahrnut odkazem). Při konstrukci každé varianty sekvence aminokyselin se uplatní dvě základní proměnné, a to umístění mutačního místa a povaha mutace. Při návrhu každé varianty bude umístění 5 každé mutace a její povaha záviset na modifikované biochemické charakteristice (či modifikovaných biochemických charakteristikách). Každé mutační místo může být modifikováno individuálně nebo v sérii, např. (1) nejprve substitucí s výběry konzervativních aminokyselin a poté s radikálnějším výběrem v závislosti na dosaženém výsledku, (2) odstraněním cílového aminokyselinového rezidua, nebo (3) včleněním aminokyselinových reziduí do sousedství vybraného místa.
Chemicky modifikované deriváty nebo zkrácené sTNFRs může odborník připravit zde popsaným postupem. Konjugáty se mohou připravit použitím glykosylovaných, neglykosylovaných nebo deglykosylovaných zkrácených sTNFRs. Typicky se použijí neglykosylované zkrácené sTNFRs. Mezi vhodné chemické sloučeniny pro úpravu zkrácených sTNFRs patří ve vodě rozpustné poly15 mery.
Ve vodě rozpustné polymery jsou žádoucí, protože protein, ke kterému jsou připojeny, nebude precipitovat ve vodném prostředí, jako například ve fyziologickém prostředí. Je žádoucí, aby polymer byl farmaceuticky přijatelný pro přípravu terapeutických produktů nebo směsí. Odborník 20 bude schopný vybrat příslušný polymer v závislosti na úvaze, zda konjugát polymer/protein bude použit terapeuticky, a v kladném případě je volba zvažována vzhledem k žádoucí dávce, cirkulační době a odolnosti k proteolýze.
Mezi vhodné, klinicky akceptovatelné, ve vodě rozpustné polymery patří, bez omezení, poly25 ethylenglykol (PEG), polyethylenglykolpropionaldehyd, kopolymery ethylenglykolu/propylenglykolu, monomethoxypolyethylenglykol, karboxymethylcelulóza, dextran, polyvinylalkohol (PVA), polyvinylpyrrolidon, poly-1,3-dioxalan, poly-l,3,6-trioxan, kopolymer ethylenu/anhydridu kyseliny maleinové, poly(P-aminokyseliny) (buď homopolymer nebo náhodné kopolymery), poly-(n-vinylpyrrolidon) polyethylenglykol, homopolymery polypropylenglykolu (PPG) a další 30 polyalkylenové oxidy, kopolymery polypropylenoxid/ethylenoxidu, polyoxyethylované polyoly (POG) (např. glycerol), polyoxyethylovaný sorbitol nebo polyoxyethylovaná glukóza, kolonové kyseliny (colonic acids, produkt E. coli) nebo jiné karbohydrátové polymery, Ficoll nebo dextran a jejich směsi.
Polyethylenglykolem se zde rozumí jakákoliv z forem, která byla použita k přípravě derivátů jiných proteinů, jako např. mono-(C|-C10)alkyloxy- nebo aryloxypolyethylenglykol. Vzhledem ke své stabilitě ve vodě může při výrobě být vhodný polyethylenglykolpropionaldehyd.
Každý z ve vodě rozpustných polymerů může mít jakoukoliv molekulovou hmotnost a může být 40 rozvětvený nebo nerozvětvený. Tyto ve vodě rozpustné polymery mají obvykle průměrnou molelailovou hmotnost v intervalu přibližně 2 kDa až přibližně 100 kDa (termín „přibližně“ naznačuje, že v preparátech ve vodě rozpustných polymerů se vyskytují některé molekuly s vyšší nebo naopak nižší molekulovou hmotností, než je uvedená molekulová hmotnost). Preferovaná průměrná molekulová hmotnost ve vodě rozpustných polymerů se pohybuje mezi přibližně 5 kDa až 45 přibližně 50 kDa, lépe mezi přibližně 12 kDa až přibližně 40 kDa a nejlépe mezi přibližně 20 kDa aiž přibližně 35 kDa.
Obecně platí, že čím vyšší je molekulová hmotnost nebo čím více je daný polymer rozvětvený, tím vyšší je poměr polymer:protein. V závislosti na požadovaném terapeutickém profilu (např. 50 délka postupného uvolňování; vlivy, existují-li, na biologickou aktivitu; snadno manipulace;
stupeň nebo absence antigenicity a jiné známé účinky ve vodě rozpustných polymerů na terapeutické proteiny) se mohou použít polymery o jiných velikostech.
Každý z ve vodě rozpustných polymerů by měl být k proteinu připojen s ohledem na ovlivnění 55 funkčních nebo antigenních domén proteinu. Obecně lze říci, že derivatizace může být provedena
-18•vryt» * ''♦v
CŽ 296835 B6
z;a podmínek vhodných pro reakci proteinu s aktivovanou molekulou polymeru. Mezi aktivovatelné skupiny polymeru, které móhóu být použity pro připojení polymeru k aktivním zbytkům na proteinu, patří skupina: sulfonová, maleinimidová, sulfhydrylová, thiolová, triflátová, tresylátová, azidirinová, oxiranová a 5-pyridylová.
Obvykle jsou ve vodě rozpustné polymery připojený k proteinu na a- nebo ε-aminoskupinách aminokyselin nebo k reaktivní thiolové skupině, avšak je rovněž zamýšleno připojení skupiny ve vodě rozpustného polymeru k jakékoliv reaktivní skupině proteinu, která je za vhodných reakčních podmínek dostatečně reaktivní pro připojení ke skupině polymeru rozpustnému ve vodě. Polymer rozpustný ve vodě může tudíž být kovalentně navázán k proteinu prostřednictvím reaktivních skupin, jako například volné aminoskupiny nebo karboxylové skupiny. Aminokyselinové zbytky s volnou aminoskupinou mohou zahrnovat lysinová rezidua a N-koncové aminokyselinové zbytky. Aminokyseliny s volnou karboxylovou skupinou mohou zahrnovat zbytky kyseliny asparagové, zbytky kyseliny glutamové a zbytky aminokyselin na C-konci. Aminokyselinami s reaktivní thiolovou skupinou mohou být cysteinová rezidua.
Postupy pro přípravu proteinů konjugovaných s polymery rozpustnými ve vodě budou obecně zahrnovat následující kroky: (a) reakci proteinu s polymerem rozpustným ve vodě za podmínek, kdy se protein připojí k jednomu nebo více ve vodě rozpustných polymerům, (b) získání reakčního produktu. Reakční podmínky pro každou konjugaci mohou být zvoleny z podmínek v současnosti známých nebo z podmínek v budoucnu vyvinutých, nicméně tyto podmínky by měly být zvoleny tak, aby se vyloučilo nebo omezilo působení reakčních podmínek, jako je teplota, rozpouštědla nebo hodnota pH, které by mohly inaktivovat modifikovaný protein. Obecně lze říci, že se optimální reakční podmínky pro reakce určí případ od případu na základě známých parametrů a požadovaného výsledku. Například, čímž větší bude poměr ve vodě rozpustný polymer/protein vkonjugátu, tím větší bude procento konjugovaného produktu. Optimální poměr (ve smyslu účinnosti reakce, takže nedochází k přebytku nezreagovaného proteinu nebo polymeru) může být určen takovými faktory, jako je stupeň derivatizace (např. mono-, di—, tri- atd.), molekulová hmotnost vybraného polymeru, to, zda je polymer rozvětvený nebo nerozvětvený, a použité reakční podmínky. Poměr ve vodě rozpustného proteinu (např. PEGu) ku proteinu bude obecně v rozsahu 1:1 až 1:100. Z každé směsi se může získat standardními purifíkačními technikami, jakými jsou například mimo jiné dialýza, vysolování, ultrafiltrace, iontová výměnná chromatografíe, gelová filtrační chromatografíe a elektroforéza, jeden nebo více purifikovaných konjugátů.
Může se vyskytnout požadavek na protein chemicky modifikovaný na N-konci. Ve vodě rozpustný polymer může být zvolen na základě molekulové hmotnosti, větvení atd., podílu ve vodě rozpustného polymeru k proteinovým (nebo peptidovým) molekulám v reakční směsi, typu prováděné reakce a způsobu získání zvoleného proteinu na N-koncově chemicky modifikovaném proteinu. Způsobem k získání proteinu chemicky modifikovaného na N-konci (tj. oddělením takového produktu od ostatních monoderivatizovaných složek, je-li to nezbytné) může být purifikace proteinu chemicky modifikovaného na N-konci z populace chemicky modifikovaných proteinových molekul. Selektivní chemická modifikace na N-konci se může provést redukční alkylací, která využije rozdíl reaktivitu odlišných typů primárních aminoskupin (lysin oproti N-konci) dostupných v určitém proteinu pro deprivatizaci daného proteinu. Za vhodných reakčních podmínek se dosáhne v podstatě selektivní derivatizace proteinu na N-konci s polymerem obsahujícím karbonylovou skupinu. Například je možné selektivně připojit ve vodě rozpustný polymer k N-konci proteinu provedením reakce při pH, které umožní využít výhodu rozdílů v hodnotách pak mezi εaminoskupinou lysinových zbytků a ci-aminoskupinou N-koncové aminokyseliny daného proteinu. Takovouto selektivní derivatizací se řídí připojení ve vodě rozpustného polymeru k proteinu: konjugace s polymerem se uskuteční přednostně na N-konci proteinu a nedochází k významné modifikaci ostatních reakčních skupin, jako třeba aminoskupin na lysinovém postranním řetězci. Při redukčním alkylaci může být ve vodě rozpustný polymer stejného typu, jak je popsáno výše, a měl by mít jednu reaktivní aldehy
-19L ' - .
dovou skupinu použitelnou k vazbě na proteinu. Může se použít polyethylenglykolpropionaldehyd obsahující jednu reaktivní aldehydovou skupinu.
Předkládaný vynález se konkrétně zabývá chemicky upravenými proteiny, které obsahují mono5 nebo póly- (např. 2-4) PEG složky. Pegylace může být provedena jakoukoliv reakcí v současnosti za tímto účelem používanou. Postupy sloužící k přípravě pegylovaného proteinového produktu zpravidla zahrnují tyto kroky: (a) reakci proteinového produktu s polyethylenglykolem (například s reaktivním esterem nebo aldehydovým derivátem PEGu) za podmínek, které umožní připojení proteinu k jedné nebo více molekulám polyethylenglykolu; a (b) získání reakčního proto duktu (reakčních produktů). Obecně lze říci, že optimální reakční podmínky těchto reakcí se stanoví případ od případu na základě známých parametrů a požadovaném výsledku.
Odborníkům je známo množství způsobů pro připojení polymeru rozpustného ve vodě k proteinu. Například přihláška EP 0 401 384, jejíž popis je zde zahrnut odkazem; viz také Malik et al. 15 (1992), Exp. Hematol., 20:1028-1035; Francis (1992); Focus on growth Factors, 3(2):4-10 (publikováno Mediscript, Mountain Court, Friem Bamet Lané, London N20 OLD, UK); přihlášky EP 0 154 316; EP 0 401 384; WO 92/16221; WO 95/34326; a ostatní zde citované publikace, které se vztahují kpegylacím, jejichž popis je zde zahrnut odkazem.
Pegylace se může konkrétně provést acylační reakcí nebo alkylační reakcí s reaktivní molekulou polyethylenglykolu. Mezi proteinové produkty podle předkládaného vynálezu patří pegylované proteiny s navázanou (navázanými) molekulou (molekulami) polyethylenglykolu, kde je (jsou) tato (tyto) molekula (molekuly) připojena (připojeny) prostřednictvím acylových nebo alkyloAých skupin. Takovéto produkty mohou být monopegylované nebo poly-pegylované (např.
obsahují 2-6 a výhodně 2-5 PEG skupin). PEG skupiny jsou obecně připojené k proteinu na ariebo ε-aminoskupinách aminokyselin, nicméně do rozsahu vynálezu rovněž spadá připojení těchto PEG skupin k jakékoliv aminoskupině připojené k proteinu, která je dostatečně reaktivní na to, aby mohlo být za vhodných reakčních podmínek připojena kPEG skupině.
Pegylace acylací obecně zahrnuje reakci aktivního esterového derivátu polyethylenglykolu (PEG) s proteinem. Polymer (polymery) vybraný pro acylační reakci by měl mít jednu reaktivní esterovou skupinu. Pro pegylaci se může použít jakákoliv známá nebo následně objevená reaktivní PEG molekula. Preferovaným aktivovaným PEG esterem je PEG esterifíkovaný s N-hydroxysukcinimidem (NHS). „Acylací“ se zde bez jakýchkoliv omezení rozumí následující typy vazeb 35 mezi terapeutickým proteinem a polymerem rozpustným ve vodě, jakým je např. PEG: amidová, karbamátová, uretanová a podobné (viz Chamow (1994), Bioconjugate Chem., 5 (2):133-140; jehož popis je zde zahrnut odkazem). Jako reakční podmínky mohou být zvoleny jakékoliv podmínky v současnosti používané nebo v budoucnosti objevené, nicméně je třeba se vyhnout podmínkám, jako například teplotě, rozpouštědlu a hodnotě pH, které by vedly k inaktivaci modifi40 kovaných proteinů.
Výsledkem pegylace acylací bude zpravidla polypegylovaný protein. Ve výhodném provedení je spojující vazbou vazba amidová. Rovněž je výhodné, aby výsledný produkt byl v podstatě pouze (např. z více než 95 %) mono-, di- nebo tri-pegylován. Nicméně, může také dojít ke vzniku 45 některých produktů s vyšším stupněm pegylace v množstvích závislých na použitých specifických reakčních podmínkách. Je-li to žádoucí, mohou se ze směsi oddělit čistší pegylované produkty (zejména od nezreagovaných reaktantů) standardními purifíkačními postupy, mezi které patří například: dialýza, vysolování, ultrafíltrace, iontová výměnná chromatografíe, gelová filtrační chromatografíe a elektroforéza.
Pegylace alkylací obecně zahrnuje reakci koncového aldehydového derivátu PEGu s proteinem za přítomnosti redukčního činidla. Pro reakci redukční alkylací by vybraný protein (proteiny) měl(y) mít jednu reaktivní aldehydovou skupinu. Příkladem reaktivního PEG aldehydu je polyethylenglykolpropionaldehyd, který je ve vodě stabilní, nebo jeho mono Cl až C10 alkyloxy 55 nebo aryloxy deriváty (viz patent US 5 252 714, jehož popis je zde zahrnut odkazem).
-20CZ 296835 B6
Výsledkem pegylace alkylací může také být protein s více PEG molekulami (poly-pegylovaný). Kromě toho je možné ovlivnit reakční podmínky s cílem podstatně upřednostnit pegylaci jenom na α-aminoskupině na N-konci proteinu (tj. proteinu s jednou PEG molekulovou, mono-pegylo5 váný protein). V obou případech (monopegylace nebo polypegyláce) jsou PEG skupiny výhodně připojeny k proteinu přes -CH2-NH- skupinu. Pokud jde o -CH2- skupinu, tento typ vazby je zde zmiňován jako „alkylová“ vazba.
Redukční alkylace sloužící k přípravě v podstatě homogenní populace produktu monopolymer/10 protein bude obvykle zahrnovat následující kroky: (a) reakci proteinu s reaktivní molekulovou
PEG za podmínek pro redukční alkylací a při pH umožňujícím selektivní modifikaci oc-aminoskupiny na aminokonci daného proteinu, a (b) získání reakčního produktu (produktů). Příprava derivátů redukční alkylací pro produkci produktů s jednou molekulovou PEG využívá rozdílů v hodnotách pak mezi aminoskupinami lysinu a α-aminoskupinou na N-konci (hodnota pak 15 odpovídá hodnotě pH, při kterém je 50 % aminoskupin protonizováno a 50 % protonizováno není).
Tato reakce je prováděna při hodnotě pH, která umožní využít rozdílů v hodnotách pKa mezi εaminoskupinami lysinových reziduí a α-aminoskupinou rezidua na N-konci proteinu. Obecně 20 lze říci, že při nižších pH bude žádoucí použít větší nadbytek polymeru vzhledem k proteinu (tj.
čím méně reaktivní je N-koncová α-aminoskupina, tím větší množství polymeruje nutno použít k dosažení optimálních podmínek). Jestliže je hodnota pH vyšší, nemusí být poměr polymer ku proteinu tak vysoký (tj. jsou dostupné reaktivnější skupiny, takže je zapotřebí méně molekul polymeru). Pro účely předkládaného vynálezu bude hodnota pH zpravidla v rozsahu 3-9, a ve 25 výhodném provedení 3-6. Pro redukční alkylací by redukční činidlo mělo být stabilní ve vodných roztocích a ve výhodném provedení by redukční činidlo také mělo být schopné redukovat pouze Schiffovu bázi vytvořenou v počátku procesu redukční alkylace. Vhodná redukční činidla mohou být vybrána zborohydridu sodného (tetrahydroboritan sodný), kyanoborohydridu sodného, dimethylaminboranu, trimethylaminboranu a pyridinboranu. Zvláště vhodným redukčním činid30 lem je kyanoborohydrid sodný. Ostatní reakční parametry, jako je například rozpouštědlo, reakční čas, teplota a způsob purifikace produktu, mohou být určeny případ od případu na základě publikovaných informací týkajících se přípravy derivátů proteinů s polymery rozpustnými ve vodě.
Při takovéto selektivní přípravě derivátů probíhá připojení ve vodě rozpustného polymeru (který obsahuje reaktivní skupinu, jako například aldehyd) k proteinu. Konjugace s polymerem proběhne přednostně na N-konci proteinu a nedojde k významné modifikaci ostatních reaktivních skupin, jako jsou aminoskupiny lysinovéhó postranního řetězce. Preparát bude typicky tvořen z více než 90 % konjugátem homopolymer/protein (zpravidla z více než 95 % konjugátem monopoly40 rner/protein), přičemž ostatní pozorovatelné molekuly budou nezreagované (tj. protein postrádající molekulu polymeru).
Specifickým provedením podle předkládaného vynálezu je použití nevětvené monomethoxypolyethylenglykolaldehydové molekuly s průměrnou molekulovou hmotností buď přibližně 45 20kDa, nebo přibližně 33 kDa (např. v rozmezí 30 kDa až 35 kDa), nebo terciárního butyl polyethylenglykolaldehydu s průměrnou molekulovou hmotností přibližně 33 kDa (např. v rozmezí 30 kDa až 35 kDa) konjugovaných redukčních alkylací k sTNFR-Ι 2.6D/N105.
Pegylace také může být specificky provedena s použitím ve vodě rozpustných polymerů obsahu50 jících alespoň jednu reaktivní hydroxyskupinu (např. polyethylenglykol), které mohou reagovat s činidlem nesoucím reaktivní karbonylovou, nitrilovou nebo sulfonovou skupinu pro přeměnu hydroxylové skupiny na reaktivní Michaelův akceptor. Tím se vytvoří „aktivovaná spojka“ (linker) použitelná k modifikaci nejrůznějších proteinů za účelem poskytnutí zlepšených biologických aktivních konjugátů. Termín „reaktivní karbonyl, nitril nebo sulfon“ znamená karbonylo-21 3' •1«, vou, nitrilovou nebo sulfonovou skupinu, ke které je připojena dvouhlíková skupina nesoucí na druhém uhlíku reaktivní místo pro specifickou reakci s triolovou skupinou (WO 92/16221).
Aktivované spojky mohou být monofunkční, bifunkční nebo multifunkční. Užitečnými činidly nesoucími reaktivní sulfonovou skupinu, které mohou být použité v těchto postupech jsou, bez omezení, chlorsulfon, vinylsulfon a divinylsulfon.
V jednom provedení je ve vodě rozpustný polymer aktivován Michaelovým akceptorem. WO 95/13312 popisuje (kromě jiného) ve vodě rozpustné, sulfonem aktivované polyethylenglykoly, které jsou vysoce selektivní pro vazbu ke triolovým skupinám namísto aminoskupin na molekulách nebo na površích. Tyto deriváty PEGu jsou v delším časovém intervalu odolné vůči hydrolýze ve vodném prostředí při hodnotách pH přibližně 11 nebo méně, a mohou vytvářet vazby s molekulami za tvorby konjugátů, které jsou rovněž stabilní vůči hydrolýze. Vazba, kterou jsou konjugovány PEGy a biologicky aktivní molekula, zahrnuje sulfonovou skupinu připojenou ke thiolové skupině a má strukturu PEG-SO2-CH2-CH2-S-W, kde symbol W představuje biologicky aktivní molekulu a kde činidlem nesoucím sulfonovou skupinu je vinylsulfon nebo aktivní ethylsulfon. Dvěma zvláště užitečnými homobifunkčními deriváty jsou PEG-bis-chlorsulfon a. PEG-bis-vinylsulfon.
PCT Mezinárodní přihláška č. US 96/19459 (WO 97/32607), jejíž popis je zde zahrnut odkazem, uvádí postup přípravy sulfonem aktivovaných linkerů získáním sloučeniny s reaktivní hydroxylovou skupinou a přeměnou také hydroxylové skupiny na reaktivní Michaelův akceptor, čímž je vytvořena aktivovaná spojka, přičemž jako rozpouštědlo se při konverzi použije tetrahydrofuran (THF). PCT Mezinárodní přihláška č. US 96/19459 (WO 97/32607), jejíž popis je zde zahrnut odkazem, uvádí postup pro purifikaci aktivovaných spojen, který využívá chromatografii s hydrofobními interakcemi k separaci linkerů podle velikosti a funkčnosti koncové skupiny.
Předkládaný vynález se konkrétně zabývá následujícími prokaryontně exprimovanými molekulami, chemicky pozměněnými tak, aby obsahovaly póly- (např. 2 až 4) PEG složky, kterými jsou: sTNFR-I 2.6D/C105, sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR-I 2.6D/N105, sTNFR-I 2.3D/d8, sTNFR-I 2.3D/dl8 a sTNFR-Ι 2.3D/dl5, buďto methionylované, nebo nemethionylované a jejich varianty.
Polyvalentní forma (formy)
Může se také připravit polyvalentní forma (formy), tj. molekuly obsahující více než jednu aktivní složku. V jednom provedení může mít molekula TNF ligandu více vazebných míst pro faktor nekrotizující tumory (např. kombinace zkráceného sTNFR produktu). Molekula má dále nejméně jedno vazebné místo pro faktor nekrotizující tumory a (v závislosti na požadovaných vlastnostech polyvalentní formy) nejméně jedno vazebné místo pro jinou molekulu (např. kombinace nejméně jednoho zkráceného sTNFR produktu a nejméně jednoho antagonisty receptoru interleukinu-1 („IL-lra“), jak je popsáno dále.
N dalším provedení se také mohou vytvořit polyvalentní formy, např. chemickým spojením nejméně jednoho zkráceného sTNFR produktu s jinou sloučeninou, výhodně jiného zkráceného produktu sTNFR, s jakoukoliv klinicky akceptovatelnou spojkou (linkerem) (např. ve vodě rozpustným polymerem, jak je popsáno dále). V zásadě by spojka neměla dodávat novou imunogenicitu (vzhledem k novým aminokyselinovým reziduím nebo pozměňovat hydrofobicitu a nábojovou rovnováhu struktury tak, aby došlo ke škodlivému ovlivnění její biodistribuce a odbourávání.
Jestliže jsou takovéto polymery použity jako spojky, mohou jimi být homopolymery, náhodné nebo blokové kopolymery a terpolymery založené na výše uvedených monomerech, nerozvětvené nebo rozvětvené, substituované nebo nesubstituované. Polymer může mít jakoukoliv délku
-22 ' SKF^^rřl^s-rrFre^.
nebo molekulovou hmotnost, avšak tyto charakteristiky mohou ovlivnit biologické vlastnosti. Průměrná molekulová hmotnost polymerů zvláště vhodná ke snížení rychlosti odbourávání ve farmaceutických aplikacích se pohybuje v rozmezí 2000 až 35 000 daltonů. Pro optimalizaci nebo vytvoření požadovaných biologických aktivit může být délka polymeru navíc rozmanitá.
Mezi aktivované skupiny, které se mohou požít pro připojení ve vodě rozpustného polymeru ke dvěma nebo více proteinům, patří následující: skupina sulfonová, maleinová, sulfhydrylová, thiolová, triflátovák, tresylátová, azidirinová, oxiranová a 5-pyridylová.
ío Ve specifickém případě se mohou bifunkční nebo multifuknční aktivované spojky s alespoň jedním Michaelovým akceptorem připravit podle patentové přihlášky US 08/473 809 a purifíkovat podle patentové přihlášky US 08/611 918.
Aktivní složky mohou být připojeny použitím konvenčních připojovacích technik (viz PCT 15 publikovaná přihláška WO 92/1622 a viz PCT publikovaná přihláška WO 95/34326, jejichž popis je zde zahrnut odkazem). Kromě toho PCT publikovaná přihláška WO 92/16221 popisuje přípravu různých dimenzovaných sTNFR-I inhibitorových molekul, např. dimerizovaný cl05 sTNFR-I. Příkladný polyvalentní vazebný protein k faktoru nekrotizujícím tumory, který má vzorec (sTNFR-I 2.6D/C106)2-(20kDa PEG), je uveden v příkladu I.
V jiném provedení může bivalentní molekula sestávat ze dvou tandemových opakování zkrácených sTNFR produktů oddělených oblastí polypeptidového linkeru. Volba polypeptidových spojek je podobná návrhu vložení krátké smyčky sekvencí mezi domény u De novo navrhovaných proteinů (Mutter (1998), TIBS, 13:260-265 a Regan a DeGrado (1988), Science, 241:976-978, 25 jejichž popis je zde zahrnut odkazem). Ukázalo se, že spojka vhodné pro jednořetězcové protilátky je účinná pro vytvoření dimérické formy rekombinantního lidského sTNFR-Π (Neve et al. (1996), Cytokine, 8(5):365-370, jehož popis je zde zahrnut odkazem). Několikrát odlišných konstruktů spojen bylo připraveno (a úspěšně použito u protilátek); nejúspěšnější funkční spojky mají velikost mezi 12 až 25 aminokyselinami (aminokyseliny mající nereaktivní postranní skupi30 ny, např. alanin, serin a glycin), které společně vytváří hydrofilní sekvenci s několika opačně n abitými zbytky pro zvýšení rozpustnosti a jsou flexibilní (Whitlow a Filpula (1991), Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2:97—105 a Brigido et al. (1993), j. Immunol., 150:469479, jejichž popis je zde zahrnut odkazem).
V jiném provedení mohou být zkrácené sTNFRs chemicky připojené kbiotinu a konjugáty biotin/zkrácené sTNFRs se dále mohou vázat na avidin, čímž vznikne tetravalentní molekula avidin/biotin/zkrácený sTNFR. Zkrácené sTNFR mohou být také kovalentně připojené k dinitrofénolu (DNP) nebo k tetranitrofenolu (TNP) a výsledný konjugát je precipitován s anti-DNP nebo s anti-TNP IgM za tvorby dekamémích konjugátů s hodnotou valence 10 pro TNF vazebná 40 místa.
Ještě v dalším provedení se mohou připravit rekombinantní fúzní proteiny se zkráceným sTNFR, kde každá rekombinantní chimérická molekula má sekvenci sTNFR takovou, jak je popsáno výše, kterou jsou substituovány buďto jedna, nebo obě imunoglobulinové molekuly těžkých 45 ai lehkých řetězců, a mající celé nebo části konstantních domén, avšak nejméně jednu konstantní doménu, těžkého nebo lehkého řetězce lidského imunoglobulinu. Tak například, každý takovýto chimérický zkrácený sTNFR/IgGl fúzní protein může být připraven ze dvou chimérických genů: chiméry zkrácený s TNFr/lidský kapa lehký řetězec (zkrácený sTNFR/Ck) a chiméry zkrácený sTNFR/lidský gama-1 těžký řetězec (zkrácený sTNFR/Cg-1). Po transkripci a translaci dvou 50 chimérických genů, jak je popsáno dále, mohou genové produkty být uspořádány do jedné chimérické molekuly, ve které se zkrácený sTNFR chová jako bivalentní. Další podrobnosti vztahující se ke konstrukci takovýchto chimérických molekul jsou uvedeny v patentu US 5 116 964, PCT publikované přihlášce WO 89/09622, PCT publikované přihlášce WO 91/16437 a EP 0 315 062, jejichž popis je zde zahrnut odkazem.
-23i
Ještě v dalším provedení mohou být připraveny rekombinantní fúzní proteiny se zkráceným sTNFR, kde každá rekombinantní chimérická molekula má sTNFR sekvenci popsanou výše a alespoň část regionu 186-401 osteoprotegrinu (OPG), jak je popsáno v Evropské patentové přihlášce č. 96309363.8, zveřejněné jako EP 870023.
Polynukleotidy
Předkládaný vynález také poskytuje polynukleotidy, které kódují zkrácené sTNFRs. Na základě uvedeného popisu a s použitím tabulky univerzálních kodonu, může průměrný odborník snadno určit všechny nukleotidové sekvence, které kódují aminokyselinové sekvence zkrácených sTNFRs. V současnosti preferované sekvence nukleových kyselin zahrnují ty polynukleotidové sekvence, které kódují sTNFR-Ι 2.6D/C105, sTNFR-Ι 2.6D/C106, sTNFR-Ι 2.6D/N105, sTNFR-Ι 2.3D/d8, sTNFR-Ι 2.3D/dl8 a sTNFR-Ι a 2.3D/dl5. Příklady různých polynukleotid jsou uvedeny na obrázcích 2, 3, 4, 5, 6 a 7.
Pro přípravu těchto polynukleotidů a pro expresi kódovaných proteinů se mohou použít techniky rekombinantní exprese, provedené ve shodě s popisy vysvětlenými dále. Tak například, vložením sekvence nukleové kyseliny, která kóduje zkrácený sTNFR, do vhodného vektoru, může odborník v oboru snadno vytvořit velké množství požadované nukleotidové sekvence. Tyto sekvence mohou být dále použity pro přípravu detekční sond nebo amplifikačních primerů. Alternativně může být polynukleotid kódující zkrácený sTNFR včleněn do expresních vektorů. Zavedením expresních vektorů do vhodného hostitele se může produkovat požadovaný zkrácený sTNFR ve velkých množstvích.
Jak je popsáno v dalším textu, existuje množství dostupných systémů hostitel/vektor použitelných ke zmnožení požadovaných nukleotidových sekvencí a/nebo k produkci zkrácených sTNFRs. Tyto systémy zahrnují, bez omezení, plastidové, virové a inzerční vektory a prokaryontní a eukaryontní hostitele. Odborník může přizpůsobit systém hostitel/vektor, který je schopný propagace nebo exprese heterologní DNA, pro produkci nebo expresi sekvencí podle předkládaného vynálezu.
Kromě toho odborníci dále zajisté pochopí na základě předkládaného popisu, že nové sekvence nukleových kyselin zahrnují degenerované sekvence nukleových kyselin kódující zkrácené sTNFRs, které mají sekvence uvedené v sekci Obrázky, a ty sekvence nukleových kyselin, které hybridizují (přednostně za stringentních hybridizačních podmínek) s komplementárními sekvencemi zmíněných sekvencí nukleových kyselin (Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, strany 387-389). Příkladnými stringentnírni hybridizačními podmínkami jsou podmínky hybridizace vpufru 4x SSC při 62-67 °C následovaná promýváním po dobu asi jedné hodiny v 0,1 x SSC při 62-67 °C. Jiným příkladem stringentních hybridizačních podmínek je provedení hybridizace v 45-55% formamidu, 4x SSC při 40—45 °C. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají sekvence DNA, které hybridizují k sekvencím nukleových kyselin vyznačených na obrázcích 1 a 9 za mírnějších hybridizačních podmínek a které kódují zkrácené sTNFRs. Příklady takovýchto méně stringentních hybridizačních podmínek jsou 4 x SSC při 45-55 °C nebo hybridizace s 30-40% formamidem při 40-45 °C.
Předkládaný vynález také poskytuje rekombinantní konstrukty DNA obsahující DNA vektoru spolu se sekvencemi DNA kódujícími zkrácené sTNFRs. V každém takovémto DNA konstruktu je sekvence nukleové kyseliny kódující zkrácený sTNFR (s nebo bez signálních peptidů) operativně spojena s vhodnou řídicí nebo regulační sekvencí schopnou řídit replikaci a/nebo expresi zkráceného sTNFR ve vybraném hostiteli.
-24CZ 296835 B6
Rekombinantní exprese
Příprava polynukleotidů
Sekvence nukleových kyselin kódující zkrácené sTNFRs mohou být snadno získány různými postupy zahrnujícími, bez omezení, chemickou syntézu, screening knihovny cDNA nebo genomové knihovny, screening expresní knihovny a/nebo PCR amplifíkaci cDNA. Tyto a jiné metody, použitelné pro izolaci takových sekvencí nukleových kyselin, jsou uvedeny v Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989); Ausubel et al., eds Current Protocols in Molecular biology, Current Protocols Press, (1994); a Berger and Kimme, Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, Vol. 152, Academis Press, lne., San Diego, CA, (1987), jejichž popis je zde zahrnut odkazem.
Chemická syntéza sekvencí nukleových kyselin, které kódují zkrácené sTNFRs, může být provedena s použitím v oboru dobře známých postupů, které uvádí například Engels et al., (1989) Algew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 a Wells et al., (1985), Gene, 34:315, jejichž popis je zde zahrnut odkazem. Zmíněné postupy zahrnují, mimo jiné, syntézy nukleových kyselin s použitím fosfotriesterové, fosforamiditové a H-fosfonátové metody. Dlouhé sekvence nukleových kyselin, například sekvence delší než přibližně 100 nukleotidů, mohou být syntetizovány ve formě několika fragmentů. Fragmenty mohou potom být spojeny ligaci dohromady tak, že vytvářejí sekvence nukleových kyselin kódující zkrácené sTNRFs. Výhodným provedením je syntéza na polymerním nosiči s použitím standardní fosforamiditové chemie.
Jinou možností získání příslušné sekvence nukleových kyselin je screening vhodné knihovny cDNA (tj. knihoven připravených z jedné nebo více tkáňového zdroje, o kterých se předpokládá, že exprimují daný protein), nebo genomové knihovny (tj. knihovny připravené z celkové genomové DNA). Zdrojem pro cDNA knihovnu je obvykle tkáň z jakéhokoliv druhu, ve které se předpokládá exprese požadovaného proteinu, ve které se předpokládá exprese požadovaného proteinu v dostatečných množstvích. Zdrojem pro genomovou knihovnu může být jakákoliv tkáň nebo tkáně z jakéhokoliv savce nebo jiného druhu, ve které se předpokládá, že nese gen kódující 2;krácený sTNFR.
Hybridizační média mohou být testována na přítomnost DNA kódující zkrácený sTNFR s použitím jedné nebo více nukleotidových sond (oligonukleotidy, cDNA nebo fragmenty genomové DNA, které mají přijatelný stupeň homologie s cDNA nebo klonovaným genem), které budou selektivně hybridizovat s cDNA nebo s genem (geny) přítomnými v knihovně. Typické sondy použité pro screening kódují malou oblast sekvence DNA ze stejného nebo podobného druhu, kterým je druh, ze kterého byla připravena knihovna. Sondy mohou být také degenerované, jak je popsáno dále.
Hybridizace se obvykle provádí hybridizací (annealing) oligonukleotidové sondy nebo cDNA ke klonům za takových podmínek stringence, které brání nespecifickým vazbám, ale které umožňují navázání těch klonů, jež vykazují značný stupeň homologie se sondou nebo primerem. Typické stringentní hybridizační a promývací podmínky závisí částečně na velikosti cDNA nebo oligonukleotidové sondy (tj. počtu nukleotidů) a na tom, zdaje sonda degenerovaná. Při volbě hybridizačního média je také zvažována pravděpodobnost identifikace daného klonu (tj., zdaje testována cDNA nebo genomová knihovna).
Jestliže je jako hybridizační sonda použit fragment DNA (jako například cDNA), jsou typickými hybridizačními podmínkami podmínky popsané v Ausubel et al. (1994), eds., viz výše. Po hybridizaci je hybridizační médium odmyto za vhodných stringentních podmínek, které závisí na řadě faktorů, jako jsou velikost sondy, očekávaná homologie sondy a klonu, testované hybridizační
-25 CZ 296835 B6 médium, počet testovaných klonů a podobně. Příklady stringentních promývacích roztoků, které mají zpravidla nízkou iontovou sílu a jsou používány při rélátivně vysokých teplotách, jsou následující: 0,015 M NaCl, 0,05 M citronan sodný a 0,1% SDS při 55-65 °C; jiný promývací roztok má složení 1 mM Na2EDTA, 40 mM NaHPO4, pH 7,2 a 1 % SDS při teplotě přibližně 40-50 °C;
další promývací roztok má složení 0,2 x SSC a 0,1 % SDS při teplotě přibližně 50-65 °C.
Existují rovněž ukázkové protokoly pro stringentní promývací podmínky, jestliže jsou to screening hybridizačních médií použity oligonukleotidové sondy. První protokol například využívá 6 x SSC s 0,05 % pyrofosfátu sodného při teplotě přibližně mezi 35-63 °C v závislosti na délce io sondy. Například sondy o 14 bázích jsou promývány při 35-40 °C, sondy o 17 bázích při 4550 °Č, sondy o 20 bázích při 52-57 °C a sondy o délce 23 bází při 57-63 °C. Jestliže je pozorována vysoká intenzita nespecifických vazeb pozadí, může být teplota zvýšena o 2-3 °C. Druhý protokol využívá k promývání tetramethylamonium chlorid (TMAC). Jeden takový promývací roztok má složení 3 M TMAC, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 a 0,2 % SDS.
Jinou vhodnou metodou pro získání vhodných sekvencí nukleových kyselin je polymerázová řetězová reakce (PCR). Při této metodě je za použití enzymu reverzní transkriptázy připravena cDNA zpoly(A)+RNA nebo celkové RNA. Následně jsou přidány ktéto cDNA dva primery, typicky komplementární ke dvěma odděleným oblastem cDNA (oligonukleotidy), kódující zkrá20 cený sTNFR, spolu s polymerázou, jako je např. Taq polymeráza, která amplifikuje oblast cDNA mezi dvěma primery.
Oligonukleotidové sekvence zvolené jako sondy nebo primery by měly být přiměřeně dlouhé a dostatečně specifické tak, aby se minimalizovala tvorba nespecifických vazeb, ke kterým může 25 docházet během screeningu nebo PCR amplifikace. Konkrétní sekvence sond nebo primerů je zpravidla založená na konzervovaných nebo vysoce homologních sekvencích oblastí. Sondynebo primery mohou být případně zcela nebo částečně degenerované, tj. mohou například obsahovat směs sond/primerů, kde všechny kódují stejnou aminokyselinovou sekvenci, avšak s využitím různých kodonů. Alternativou k přípravě degenerovaných sond je umístění inosinu do některých 30 nebo do všech pozic kodonů, které jsou mezidruhově odlišné. Oligonukleotidové sondy nebo primery mohou být připraveny postupy chemické syntézy DNA, jak bylo popsáno výše.
Jak je popsáno výše, variantní sekvence je přírodní (např. alelická varianta) nebo syntetická sekvence, která obsahuje jednu nebo více nukleotidových substitucí, delecí a/nebo inzercí při srovná35 ní se sekvencí uvedenou na obrázcích 2, 3, 4, 5, 6 a 7, a jež vede k expresi aminokyselinové sekvence variant při porovnání s původní (wild type) aminokyselinovou sekvencí. Příprava syntetických variantních sekvencí je odborníkům dobře známá a je popsána například v Sambrook et al. (1989), viz výše a Wells et al. (1985), Gene, 34:315, jejichž popis je zde zahrnut odkazem.
Vektory
DNA kódující zkrácené sTNFRs může být za účelem dalšího klonování (amplifikace DNA) nebo 2:a účelem exprese vložena do vektorů. Vhodné vektory jsou komerčně dostupné nebo se mohou 45 speciálně připravit. Výběr nebo konstrukce vhodného vektoru bude záviset (1) na tom, zda bude vektor použit k amplifikaci DNA nebo k expresi DNA; (2) na velikost DNA vkládané do vektoru; (3) na zamýšlené hostitelské buňce, která bude tímto vektorem transformována.
Každý z vektorů obsahuje sekvenci nukleových kyselin, která kóduje požadovaný protein, funkč50 ně spojenou s jednou nebo více sekvencemi řídícími expresi nebo regulačními, schopnými řídit nebo jinak ovlivňovat expresi požadovaného proteinu vybranou hostitelskou buňkou. Každý vektor obsahuje různé komponenty v závislosti na jeho funkci (amplifikace DNA nebo exprese DNA) a jeho kompatibilitě se zamýšlenou hostitelskou buňkou. Komponenty vektoru zpravidla zahrnují, bez omezení, jednu nebo více z následujících sekvencí: signální sekvence, počátek 55 replikace, jeden nebo více selekčních a markerových genů, promotory, zesilovací prvky, sekven-26CZ 296835 B6 ce pro ukončení transkripce a podobně. Tyto komponenty mohou být získány z přirozených zdrojů, nebo mohou být syntetizovány známými postupy.
Příkladem vhodných prokaryontních klonovacích vektorů mohou být bakteriofágy, jako např.
bakteriofágy odvozené od lambdy, nebo plastidy z E. coli. (např. bpR322, colEl, pUC, F-faktor, a. plastidy odvozené od plastidů Bluescript® (Stratagene, LaJolla, CA)). Pro uvedené účely může být použita řada dalších vhodných typů expresních vektorů známých v oboru, používaných pro hostitelské buňky popsané v dalším textu., které jsou odborníkům známá.
Signální sekvence
Nukleová kyselina kódující signální sekvenci může být vložena na 5' konci sekvence kódující krácený sTNFR, například může být součástí vektoru, nebo může být částí nukleové kyseliny kódující zkrácený sTNFR. Nukleové kyseliny kódující přirozené signální sekvence sTNFR-I 15 a sTNFR-Π jsou známé (EP 393 438 a EP 422 338).
Počátek replikace
Každý z expresních a klonovacích vektorů obvykle obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která 20 umožňuje replikaci vektoru v jedné nebo více vybraných hostitelských buňkách. V klonovacím vektoru tato sekvence obvykle umožňuje replikaci tohoto vektoru nezávisle na replikaci chromozomální DNA hostitele a zahrnuje počátky replikace nebo autonomně se replikující sekvence. Takovéto sekvence jsou dobře známá. Počátek replikace z plazmidu bpR322 je vhodný pro většinu gram-negativních bakterií a různé počátky replikace (např. SV40, polyoma, adenovirus, VSV 25 nebo BVP) jsou vhodné pro klonování vektorů v savčích buňkách. U savčích expresních vektorů není obvykle počátek replikace potřebný (např. počátek replikace SV40 se často používá pouze proto, že obsahuje časný promotor).
Selekční gen
Jak expresní, tak klonovací vektory typicky obsahují nějaký selekční gen. Tento gen kóduje protein „selekčního markéru“ (značky), nezbytný pro použití nebo růst transformovaných hostitelských buněk, jestliže jsou pěstovány v selekčním kultivačním médiu. Hostitelské buňky, které nejsou daným vektorem transformované, nebudou obsahovat selekční gen a proto nebudou přeží35 vat v kultivačním médiu. Typické selekční geny kódují proteiny které: (a) propůjčují rezistenci vůči antibiotikům nebo jiným toxinům, např. vůči ampicilinu, neomycinu, methotrexátu nebo tetracyklinu; (b) komplementují autotrofhí defícience buněk; nebo dávají životně důležité živiny, Izteré nejsou z kultivačních médií dostupné.
Jiné selekční geny mohou být použity pro amplifíkaci exprimovaných genů. Amplifikace je proces, při kterém jsou geny nutné k produkci proteinu nezbytného pro růst opětovně tandemově opakovány v chromozómech následujících generací rekombinantních buněk. Příklady vhodných selekčních markérů pro savčí buňky zahrnují dihydrofolát reduktázu (DHFR) a thymidin kinázu. Transformované buňky jsou vystaveny selekčnímu tlaku, kterému jsou schopny přizpůsobit se 45 a přežít pouze transformované buňky, a to díky markérům přítomným ve vektorech. Selekčního tlaku je dosaženo kultivací transformovaných buněk za podmínek, při kterých je koncentrace selekčního agens v médiu postupně měněna, což vede k amplifíkaci jak selekčních genů, tak DNA kódující zkrácené sTNFRs. Výsledkem je syntéza zvýšeného množství zkrácených sTNFRs z amplifikované DNA.
Například, buňky transformované selekčním genem pro DHFR jsou nejprve identifikovány kultivací všech transformantů v kultivačním médiu obsahujícím methotrexát, kompetitivní antagonista DHFR. Při použití divokého typu DHFR jsou vhodnými hostitelskými buňkami linie buněk z vaječníku křečka, deficientní v aktivitě DHFR (Urlaub a Chasin (1980), Proč nati. Acad. Sci., USA, 55 77(7):4216-4220, jehož popis je zde zahrnut odkazem). Transformované buňky jsou následně
-27CZ 296835 B6 \ystaveny zvýšeným hladinám methotrexátu. To vede k syntéze mnohočetných kopií genu pro DHFR a současně s tím k syntéze mnohočetných kopií jiných DNA obsažených v expresním vektoru, jako například DNA kódující zkrácený sTNFR.
Promotory
Jak expresní, tak klonovací vektory typicky obsahují promotor, který je rozpoznáván hostitelským organismem a je funkčně připojen k sekvenci nukleové kyseliny kódující zkrácený sTNFR. Promotor je netranslatovaná sekvence umístěná proti směru transkripce (5') od start kodonu strukturního genu (zpravidla v rozsahu 100 až 1000 bp), která řídí transkripci a translaci dané sekvence nukleové kyseliny, jako například sekvence kódující zkrácený sTNFR. Promotor může týt běžně zařazen do jedné ze dvou tříd, tj. do třídy inducibilních promotorů, nebo konstitutivních promotorů. Inducibilní promotor spouští zvýšenou transkripci DNA pod svým řízením jako odpověď na určité změny kultivačních podmínek, jako je například přítomnost nebo absence nějaké nutriční složky, nebo změna teploty. Je známá celá řada promotorů rozpoznávaných řadou potenciálních hostitelských buněk. Promotor může být funkčně připojen k DNA kódující zkrácený sTNFR tak, že je restrikční enzymy odstraněn promotor ze zdrojové DNA a je včleněna požadovaná promotorová sekvence. Přirozená promotorová sekvence sTNFR-Ι nebo promotorová sekvence sTNFR-Π může být použita k řízení amplifíkace a/nebo exprese DNA kódující zkrácený sTNFR. Ve výhodném provedení se ale upřednostňuje heterologní promotor, a to za předpokladu, že umožňuje ve srovnání s nativním promotorem dosažení silnější transkripce a větších výtěžků exprimovaného proteinu a že je tento promotor kompatibilní se zvoleným hostitelským buněčným systémem, který byl vybrán k použití. K řízení amplifíkace a/nebo exprese DNA kódující zkrácené sTNFRs může být například použita jakákoliv z nativních promotorových sekvencí ostatních členů rodiny NGF/TNF.
Promotory vhodné pro použití u prokaryontních v hostitelů zahrnují beta-laktamázový a laktózový promotorový systém; promotor alkalické fosfatázy; tryptofanový (trp) promotorový systém; systém genu bakteriální luminiscence (luxR) a hybridní promotory, jako například promotor tac. Jiné známé bakteriální promotory jsou rovněž použitelné. Jejich nukleotidové sekvence byly publikovány a odborník v oboru bude tudíž schopen s použitím linkerů nebo adaptorů, jestliže je nutné doplnit požadovaná restrikční místa, připojit tyto promotory k dané sekvenci (sekvencím).
Vhodné promotorové sekvence pro použití v hostitelských buňkách kvasinek jsou v současnosti také dobr známé. Promotory vhodné pro použití v savčích buňkách jsou v současnosti rovněž 2námé a zahrnují sekvence získané z genomu virů, jakými jsou například polyoma virus, virus drůbežích neštovic (fowlpox virus), adenovirus (jako např. adenovírus 2), bovinní papilloma virus, ptačí sarkomový virus), cytomegalovirus, retrovirus, virus žloutenky typu B a ve výhodném provedení opičí virus 40 (SV40). Další vhodnými savčími promotory jsou heterologní savčí promotory, například promotory proteinů tepelného šoku („heat-shock promoters“) a promotor aktinu.
Zesilovače
Expresní a klonovací vektory obvykle obsahují zesilující sekvenci, která u vyšších eukaryot vede k zvýšení intenzity transkripce sekvence DNA kódující zkrácený sTNFr. Zesilovače transkripce jsou elementy DNA fungující v pozici cis, které jsou obvykle dlouhé 10 až 300 bp, a které ovlivňují promotor tak, aby docházelo ke zvýšení intenzity transkripce. Zesilovače jsou relativně orientačně a pozičně nezávislé. Mohou se nalézat jak v pozici jak ve směru 5', tak v pozici ve směru 3' transkripční jednotky. Kvasinkové zesilovače jsou výhodně využívány s kvasinkovým promotory. Je známo několik sekvencí zesilovačů dostupných ze savčích genů (např. genů kódujících globin, elastázu, albumin, alfa fetoprotein, a inzulín). Dalšími příklady zesilujících prvků pro aktivaci eukaryontních promotorů jsou virové zesilovače, jako například zesilovač SV40, 2:esilovač časného promotoru cytomegaloviru, zesilovač polyoma viru a zesilovače adenovirů.
: %-y
I když zesilovač může být jak na 3', tak na 5' konci DNA kódující zkrácený sTNFR, typicky je umístěn na 5' pozici od promotoru.
Ukončení transkripce
Každý z expresních vektorů použitých v eukaryotních hostitelských buňkách zpravidla obsahuje sekvenci nezbytnou pro ukončení transkripce a ke stabilizaci mRNA. Takovéto sekvence jsou běžně dostupné z 5' a někdy z 3' netranslatováných oblastí eukaryontních DNA nebo cDNA. Tyto oblasti obsahují nukleotidové segmenty transkribované jako polyadenolované fragmenty io v netranslatované části mRNA kódující zkrácený sTNFR.
Konstrukce vektoru
Konstrukce vhodného vektoru, obsahujícího jednu nebo více z dříve zmíněných složek (společně 15 se sekvencí kódující zkrácený sTNFR), se dosáhne standardní ligační technikou. Izolované plazmidy nebo fragmenty DNA jsou rozštěpeny, upraveny a v požadovaném pořadí ligovány ta, aby se vytvořil požadovaný vektor. Za účelem ověření správnosti vytvořené sekvence konstruktu může být ligační směs použita k transformaci E. coli a úspěšné transformanty mohou být selektovány pomocí známých postupů popsaných výše. Následně jsou z transformovaných buněk 20 připravena větší množství příslušného vektoru a štěpením restrikčními endonukleázami a/nebo sekvencí je potvrzena přítomnost požadované konstruktu.
Také se může v savčích buňkách použít vektor sloužící k transientní expresi DNA kódující zkrácený sTNFR. Obecně lze říci, že transientní exprese zahrnuje použití expresního vektoru, který je 25 schopen účinně se replikovat v hostitelské buňce a tím dochází k akumulaci mnoha kopií tohoto expresního vektoru v dané hostitelské buňce, a následně se syntetizují vysoké hladiny požadovaného proteinu kódovaného expresním vektorem. Každý transientní expresní systém, skládající se z: expresního vektoru a hostitelské buňky, umožňuje snadnou pozitivní identifikaci proteinů kódovaných klonovanými cDNA, jakož i rychlý screening takovýchto proteinů z hlediska jejich poža30 človaných biologických nebo fyziologických vlastností, například identifikace biologicky aktivního zkráceného sTNFR.
Hostitelské buňky
Do rozsahu vynálezu rovněž spadá množství rekombinantních hostitelských buněk, které obsahují sekvence nukleových kyselin použitelných k expresi požadovaného proteinu. Příkladné prokaryontní a eukaryotní hostitelské buňky zahrnují buňky bakteriální, savčí, hmyzí, buňky hub ai kvasinek a buňky rostlinné.
Prokaryontní hostitelské buňky zahrnují, bez omezení, eubakterie, jako například gram-pozitivní nebo gram-negativní organismy (např. E. coli (HB101), DH5a, DH10 a MC1061); zástupce rodu Bacillus, jako je B. subtilis; zástupce rodu Pseudomonas, jako P. aeruginosa; poddruhy Streptomyces', Salmonella typhimurium nebo Serratia marcescans. V charakteristickém provedení může být požadovaný protein exprimován nE. coli.
Mimo prokaryontních hostitelských buněk mohou být jako hostitelské buňky vhodné pro expresi zkrácených sTNFRs použity eukaryontní mikroby, jako např. vláknité houby nebo kvasinky. Z nichž eukaryontních hostitelských mikroorganismů se nejčastěji používá Saccharomyces cerevisiae (pekařské kvasince), nicméně dobře popsané a snadno dostupné jsou i jiné rody, druhy 50 a kmeny.
Zkrácené sTNFRs mohou být exprimované v glykosylované formě jakoukoliv z velkého počtu vhodných hostitelských buněk odvozených z mnohobuněčných organismů. Takovéto hostitelské buňky jsou schopné komplexního zpracování a glykosylačních aktivit. Většinou může být použita 55 jakákoliv buněčná kultura z vyšších eukaryontních buněk, a to jak buněk obratlovců, tak bez-29-4·'»· obratlových, včetně buněk rostlinných a hmyzíčh. V charakteristickém provedení vynálezu může být požadovaný protein exprimován s využitím buněk baculovirů.
Mohou se použít buňky obratlovců, protože jejich množení v kultuře (tkáňové kultury) je dobře 5 známé. Příklady vhodných linií savčích hostitelských buněk zahrnují, bez omezení, například linii odvozenou z opičích ledvin CV1 transformovanou SV40 (COS—7), linii z embryonálních lidských ledvin (buňky 293 nebo buňky 293 subklonované pro růst v suspenzní kultuře), buňky z ledvin křeččích mláďat a buňky z vaječníků křečků. Dalšími vhodnými savčími buněčnými liniemi jsou, bez omezení, buňky HeLa, myší buňky L-292 buňky, linie 3T3 odvozené z myší ío Swiss, Balb-c nebo NIH a křeččí buněčné linie BHK nebo HaK. V charakteristickém provedení vynálezu může být požadovaný protein exprimován v buňkách COS.
Hostitelská buňka může být transfekovaná a ve výhodném provedení transformována s požadovanou nukleovou kyselinou, a to za vhodných podmínek umožňujících expresi této nukleové 15 kyseliny. Výběr vhodných hostitelských buněk a způsoby transformace, kultivace, amplifikace, testování (screeningu) a produkce a purifikace produktu jsou odborníkům v oboru dobře známé (Gething a Sambrook (1981), Nátuře, 293:620-625 nebo alternativně Kafman et al. (1985), Mol. Cell. Biol., 5(7):1750-1759, nebo patent US 4 419 446, jejichž popisy jsou zde zahrnuty odkazem). Například pro savčí buňky bez buněčné stěny se může použít postup využívající precipitaci 20 s fosforečnanem vápenatým. Může být rovněž použita elektroporace, mikroinjekce a jiné známé techniky.
Zkrácené sTNFRs mohou být rovněž produkovány homologii rekombinaci nebo pomocí rekombinantních postupů využívajících zavedení řídicích prvků do buněk, které již obsahují DNA 25 kódující zkrácené sTNFRs. Homologní kombinace je technika původně vyvinutá k cílené modifikaci genů (targeting) pro produkci nebo opravu mutací v transkripčně aktivních genech (Kucherlapati (1989), Prog. in Nucl. Acid Res. And Mol. Biol, 36:301, jehož popis je zde zahrnout odkazem). Základní technika byla vyvinuta jako metoda pro zavedení specifických mutací do specifických oblastí savčího genomu (Thomas et al. (1986), Cell, 44:419-428; Thomas a Capecchi 30 (1987), Cell, 51:503-512 a Doetschman et al. (1988), Proč. Nati. Acad. Sci., 85:8583-8587, jejichž popis je zde zahrnut odkazem), nebo pro opravu specifických mutací uvnitř defektivního genu (Doetschman et al. (1987), Nátuře, 330:576-578, jehož popis je zde zahrnut odkazem). Příklady takových postupů jsou popsané v patentu US 5 272 071; WO 92/01069; WO 93/03183; WO 94/12650 a WO 94/1560, jejichž popis je zde zahrnut odkazem.
Při homologní rekombinaci může být DNA sekvence určená k včlenění do genomu směrována do určité oblasti genu, který je předmětem zájmu, připojením k směrující (targeting) DNA. Směrújící DNA je sekvence DNA, která je komplementární (homologní) k oblasti genomové DNA. V průběhu procesu replikace se malé úseky směrující DNA, které jsou komplementární ke speci40 fické oblasti tenomu, dostanou do kontaktu s rodičovským řetězcem genomové DNA. Obecnou vlastností DNA zavedené do buněk je její schopnost hybridizace a následné rekombinace s jinými částmi endogenní DNA, a to prostřednictvím sdílených homologních oblastí. Jestliže je takový komplementární řetězec připojen k oligonukleotidu obsahujícímu mutaci nebo odlišnou sekvenci DNA, je také začleněn do nově syntetizovaného řetězce, jako výsledek rekombinace. 45 Důsledkem korekce při syntéze DNA („proofreadingu“) je, že tato nová sekvence může sloužit jako templát. Přenášená DNA je tak začleněna do genomu.
Jestliže je sekvence určitého genu známé (například sekvence nukleové kyseliny pro zkrácený sTNFR), může být sekvence řídící expresi (úsek DNA komplementární ke zvolené oblasti genu) 50 syntetizována nebo získána jiným způsobem, jako například vhodným restrikčním štěpením nativní DNA ve specifických místech ohraničujících oblast zájmu. Tento úsek slouží jako směrující sekvence po vložení do buňky a bude hybridizovat ke své homologní oblasti uvnitř genomu. Nastane-li tato hybridizace buněk replikace DNA, bude zmíněný úsek DNA a jakákoliv další sekvence k němu připojená fungovat jako Okazakiho fragment a bude přepsán (backstitched) do 55 nově syntetizovaného dceřiného řetězce DNA.
-30CZ 296835 Β6
Κ úsekům směrující DNA jsou připojeny oblasti DNA, které mohou interagovat s expresí zkráceného sTNFR. Tak například, do genomu příslušně hostitelské buňky je vložen prvek promotor/zesilovač, supresor nebo exogenní prvek modulující transkripci, a to v blízkosti a v orientaci 5 vhodné k ovlivnění transkripce DNA kódující požadovaný zkrácený sTNFR. Tento řídicí prvek nekóduje zkrácený sTNFR, ale místo toho řídí transkripci části DNA přítomné v genomu hostitelské buňky. Exprese zkráceného sTNFR není tudíž dosaženo transfekcí DNA, která kóduje sTNFR, ale použitím zacilující DNA (obsahující úseky homologií k oblastem endogenního genu, který je předmětem zájmu) připojené k regulačním segmentům DNA, jež poskytují sekvenci io endogenního genu potřebné rozpoznávané signály pro transkripci zkráceného sTNFR.
Kultivace hostitelských buněk
2'působy kultivace jednotlivých typů rekombinantních hostitelských buněk používaných k pro15 dukci požadovaného proteinu se budou lišit v závislosti na mnoha faktorech a úvahách; optimální výrobní výstup pro danou situaci bude odborníkům zřejmý bez přílišného experimentování. Rekombinantní hostitelské buňky jsou kultivovány ve vhodném médiu a exprimovaný zkrácený sTNFR je případně získán, izolován a purifíkován z kultivačního média (nebo z buněk, jestliže je exprimován intracelulámě) s využitím vhodných, odborníkům známých prostředků.
Konkrétně, každá z rekombinantních buněk použitých k produkci požadovaného zkráceného sTNFR může být pěstována v médiu vhodném k indukci promotorů, selekci vhodných rekombinantních hostitelských buněk, nebo k amplifikaci genu kódujícího požadovaný zkrácený sTNFR. Do kultivačních médií mohou být (je-li to nezbytné) přidány hormony a/nebo jiné růstové faktory 25 (například inzulín, transferin nebo epidermální růstový faktor), soli (chlorid sodný, vápník, hořčík a fosfát), pufry (například HEPES), nukleosidy (například adenosin a thymidin), antibiotika (například gentamicin), stopové prvky (definované jako anorganické sloúčeniny zpravidla přítomné v konečných koncentracích v řádu mikromolů) a glukóza nebo jiný zdroj energie. Odborníkům je rovněž zřejmé, že do kultivačních médií mohou být ve vhodných koncentracích přidány 30 rovněž další sloučeniny. Odborníci rovněž dobře znají vhodné podmínky kultivace, jako je například teplota, pH a podobně, zvolených hostitelských buněk.
Farmaceutické přípravky
Farmaceutické přípravky budou obecně obsahovat terapeuticky účinné množství zkrácených sTNFRs a chemicky modifikovaných derivátů zkrácených sTNFRs (společně v této přihlášce označované jako „zkrácený(é) sTNFR produkty(y)“) spolu s přísadou vehikula (nosiče). Vehikulum ve výhodném provedení zahrnuje jednu nebo více farmaceuticky a fyziologicky přijatelných látek pro formaci přípravků ve směsi se zkráceným(i) produktem(y) sTNFR(s) a látkou pro řízené 40 uvolňování.
Primární rozpouštědlo ve vehikulu může být svým charakterem vodné nebo nevodné. Vehikulum může navíc obsahovat další farmaceuticky přijatelné látky pro úpravu nebo udržování hodnot pH v rozmezí 5 až 6,5, nebo ve výhodném provedení v rozmezí 5,5 až 6 (jedná se například o pufry, 45 jako citrátový, fosfátový, a aminokyseliny, jako je glycin); plniva pro lyofilizované přípravky (například mannitol a glycin); látky k modifikaci nebo udržování osmolarity (např. mannitol nebo chlorid sodný); povrchově aktivní látky (např. polysorbát 20, polysorbát 80, Triton a Pluronic); viskozity; čirosti; barvy; sterility; stability (např. sacharóza a sorbitol); antioxidanty (např. siřičitan sodný a hydrogensiřičitan sodný); konzervační látky (např. kyselina benzoová a kyselina 50 salicylová); látky pro vůni přípravku; ochucovadla a ředicí činidla; látky ovlivňující rychlost rozpouštění (například solubilizáty a solubilizující látky, jako například alkoholy, polyethylenglykoly a chlorid sodný); látky ovlivňující rychlost uvolňování; emilzifikátory; suspenzní činidla; rozpouštědla; plniva; aplikační vehikula; zřeďovadla; pomocné látky (excipienty) a/nebo farmaceutické adjuvans. Rovněž lze formulovat další účinné formy podání, jako například parenterální 55 pomalu se uvolňující přípravek, inhalační mlhy, orálně aktivní přípravky, nebo čípky. Přípravky
-31 CZ 296835 B6 mohou také zahrnovat zvláštní formy polymerních sloučenin, jako například polymery erodující (rozpadající se) v celém objemu (například kopolymery kyselina polymléčná/kyselina polyglykolová (PLGA), polymerní směsi PLGA, blokové kopolymery polyethylenglykolu (PEG) a kyseliny mléčné a glykolové, poly(kyanoakryláty); polymery erodující (rozpadající se) v povrchové vrstvě (například poly(anhydridy) a poly(orthoestery)); estery hydrogelů (například polyoly Pluronic, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, kopolymery anhydrid kyseliny maleinové/alkylvinylether, celulóza, deriváty kyseliny hyaluronové, alginát, kolagen, želatina, albumin a škroby a dextrany) a jejich kompozitní směsi; neb přípravky na bázi liposomů nebo mikrokuliček. TakoA'éto přípravky mohou ovlivňovat fyzikální stav, stabilitu, rychlost uvolňování in vivo a rychlost odbourávání (clearance) in vivo proteinů a derivátů podle vynálezu. Optimální složení farmaceutického přípravku pro požadovaný protein bude odborníkem stanoveno! v závislosti na způsobu podávání a požadovaném dávkování. Příklady farmaceutických přípravků jsou uvedeny vRemmgton's Pharmaceutical Sciences, 18* Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, strany 1435-1712; Gombotz and Pettit (1995), Bioconjugate Chem.; 6:332-351; LeoneBay, et al. (1995), Journal of Medicinal Chemistry, 38:4263-4269; Haas, et al. (1995), Clinical Immunology and Immunopathology, 76(1):93, WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772 a WO 94/21235, jejichž popis je zde zahrnut odkazem. ;
Specifické směsi pro řízené uvolňování jsou dostupné od následujících výrobců: Depotech (Depofoam™, multivesikulámí liposomy); Alkermes (ProLease™ mikrokuličky PLGA). V předmětném popise výraz hyaluronam zahrnuje hyaluronan, kyselinu hyaluronóvou, její soli (například hyluronát sodný), estery, ethery, enzymatické deriváty a zesíťované gely kyseliny hyaluronové (například hylan). Příklady forem hyaluronanu jsou uvedené vPeyrón and Balazs (1974), Path. Bio., 22(8):731-736; Isdale et al. (1991), J. Drug Dev., 4(2):93-99; Larsen et al., (1993), Journal of Biomedical Materials Research, 27:1129-1134; Namiki, et al. (1982), International Journal of Clinical Pharmacology, Therapy and Toxicology, 20 (11):501-507; Meyer et al. (1995), Journal of Controlled Release, 35:67-72; Kikuchi et al. (1996), Osteoarthritis and Cartilage, 4:99-110; Sakakibara et al. (1994); Clinical Orthopaedics and Related Research, 299:282-292; Meywers a Brandt (1995), 22(9): 1732-1739; Laurent et al, (1995); Acta Orthop Scand, 66(266): 116-120; Cascone et al. (1995); Biomaterials, 16(7):569-574; Yerashalmi ět al. (1994); Archives of Biochemistry and Biophysics, 313(2):267-273; Bematchez et al. (1993); Journal of Biomedical Materials Research, 27(5):677-681; Tan et al. (1990), Australian Journal of Biotechnology, 4(l):38-43; Gombotz a Pettit (1995), Bioconjugate Chem. 6: 332-351; patenty US 4 582 865, US 4 605 691, US 4 636 524, US 4 713 448, US 4 716 154, US 4 716 224, US
772 419, US 4 851 521, US 4 957 774, US 4 863 907, US 5 128 326, US 5 202 431, US
336767,US5356883; Evropské patentové přihlášky EP 0 507 604 (A2) a EP 0718312 (A2); a WO 96/05845, jejichž popis je zde zahrnut odkazem. Specifické hyaluronanové směsi jsou dostupné od následujících dodavatelů: BioMatrix, lne. Ridgefield, NJ (Synvisc™, směs hylanu ve formě kapaliny a hylanu ve formě gelu v poměru 90:10); Fidia S.p.A. Abano Terme, Italy (Hyalgan™, sodná sůl kyseliny haluronové pocházející z hřebíčků kohoutů (molekulová hmotnost přibližně 500 000 až asi 700 000)); Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan (Artz™, 1% roztok kyseliny hyaluronové pocházející z hřebíčků kohoutů o molekulové hmotnosti přibližně 700 00); Pharmacia AB, Stockholm, Sweden (Healon™, kyselina hyaluronová pocházející z hřebíčků kohoutů o molekulové hmotnosti přibližně 4 x 106); Genzyme Corporation, Cambridge, MA (Surgicoat™, rekombinantní kyselina hyaluronová); Pronova Biopolymer, lne. Portsmouth, NH (kyselina hyaluronová FCH, vysokomolekulámí (molekulová hmotnost přibližně 1,5 až 2,2 x 106) připravená z kultur Streptococcus zeooepidemicus; hyaluronát sodný MV (molekulová hmotnost přibližně 1,0 až 1,6 x 106) a hyaluronát sodný LV (molekulová hmotnost přibližně 1,5 až 2,2 x 106); Calbiochem-Novabiochem AB, Lautelfmgen, Switzerland (kyselina hyaluronová, sodná sůl (katalogové číslo 385908 v katalogu z roku 1997) připravená ze Streptococcus sp.y, Intergen Company, Purchase, NY (kyselina hyaluronová pocházející z hřebínků kohoutů o molekulové hmotnosti přibližně 1 x 106); Diosynth lne., Chicago, IL; Amerchol Corp., Edison, NJ and Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan.
CZ 296835 Β6
Jakmile byl farmaceutický přípravek formulován, může být tento skladován ve sterilních ampulkách ve formě roztoku, suspenze, gelu, emulze, pevné látky nebo ve formě dehydratovaného nebo lyofilizovaného prášku. Přípravky mohou být skladovány buď ve formě určené k přímému použití, nebo ve formě (například lyofilizované) vyžadující před vlastní aplikací rekombinaci.
Ve výhodném provedení je provedení vynálezu směrováno k používání souprav (kitů) sloužících k přípravě jednotlivých aplikačních dávek. Zmíněné soupravy mohou obsahovat dvě nádobky: první obsahující vysušený protein a druhou obsahující kapalný přípravek. Soupravami spadajícími do rozsahu tohoto vynálezu jsou jednokomorové nebo vícekomorové předplněné injekční střílo kačky, příkladně přeplněné injekční stříkačky (např. kapalné stříkačky (liquid syringes), lyostříkačky, jako např. Lyo-Ject®, dvoukomorové předplněné lyostříkačky) které jsou dostupné od A/etter GmbH, Ravensburg, Německo.
Použití
Zkrácené sTNFR produkty mohou být užitečné jako látky pro výzkum nebo jako teoretické a diagnostické látky. Zkrácené sTNFrs se mohou použít v in vitro a/nebo in vivo diagnostických testech pro kvantifikaci množství přirozeného sTNFR-Ι neb sTNFR-Π ve vzorcích tkání nebo orgánů, nebo ke stanovení a/nebo izolaci buněk, které exprimují TNF (Scallon et al., (1995) viz 20 výše). V testech tkání nebo orgánů bude, ve srovnání se standardní vazebnou křivkou 125Izkrácených sTNFRs, méně 125I radioaktivity ze zkrácených sTNFRs vázajících se na TNF díky neznačenému přirozenému sTNFR-Ι nebo sTNFR-Π vázajícímu se na TNF. Podobně 125Izkrácené sTNFRs se mohou použít pro detekci přítomnosti TNF v různých typech buněk.
Tento vynález rovněž zahrnuje použití zkrácených sTNFr produktů pro tvorbu protilátek a výsledné protilátky (konkrétně včetně těch, které se budou vázat také na přirozený sTNFR-I nebo sTNFR-II). Je možné připravit protilátky, které se vážou ke zkráceným sTNFRs, jako například k epitopům uvnitř aminokyselinové sekvence Ri-[Cys19-Cys1Ď3]-R2, nebo uvnitř aminokyselinové sekvence R4-[Cys32-Cys115]-R5. Odborník v oboru může použít dobře známé 30 publikované postupy k získání monoklonálních a polyklonálních protilátek nebo rekombinantních protilátek, které specificky rozpoznávají a vážou se na různé proteiny, kódované aminokyselinovými sekvencemi podle předkládaného vynálezu. Takovéto protilátky se potom mohou použít k purifikaci a charakterizaci zralého, 30kDa TNF inhibitoru o plné délce a zralého 40kDa TNF inhibitoru o plné délce.
Předkládaný vynález se také vztahuje ke způsobům léčby určitých nemocí a léčebných stavů (z nichž mnohé mohou být charakterizovány jako zánětlivé onemocnění),· jež jsou zprostředkovány TNF. Onemocnění nebo léčebný stav se pokládá za „onemocnění zprostředkované TNF“, jestliže je spontánní nebo experimentální onemocnění spojeno se zvýšenými hladinami TNF 40 v tělních tekutinách nebo tkáních přiléhajících k místu onemocnění nebo s jejich indikací uvnitř těla. Onemocnění zprostředkovaná TNF mohou být také rozpoznána za následujících podmínek: (1) patologické nálezy spojené s chorobou mohou být napodobeny experimentálně na zvířatech podáváním TNF a (2) patologický stav indukovaný na experimentálních zvířecích modelech onemocnění může být inhibován nebo odstraněn použitím látek, které inhibují působení TNF. 45 Mnoho onemocnění zprostředkovaných TNF splňuje dvě z těchto tří podmínek, jiné pak splňují všechny tři podmínky. Neúplný seznam onemocnění zprostředkovaných TNF spolu s odpovídajícími následnými stavy a symptomy, které všechny mohou být léčeny metodami podle předkládaného vynálezu, zahrnuje: syndrom respiračních potíží u dospělých; kachexie/anorexie; rakovina (např. leukemie); syndrom chronické únavy; odmítnutí štěpu hostitelem; hyperalgesie; 50 zánětlivé onemocnění střev; zánětlivá neurální onemocnění; ischemické/reperfůzní poškození, včetně mozkové ischemie (poškození mozku jako výsledku traumatu, epilepsie, krvácení nebo mrtvice, což ve všech případech může vést k neurodegeneracím); diabetes (např. juvenilní diabetes mellitus typu 1); roztroušená skleróza; oční onemocnění) bolest; pankreatitida; plicní fibróza; revmatoidní onemocnění (např. revmatoidní artritida, osteoartritida, juvenilní (revmatoidní) artri55 tida, séronegativní polyartritida, ankylozující spondylitida, Reiterův syndrom a reaktivní artritida,
-33 CZ 296835 B6 lupénková artritida, enteropatická artritida, polymyozitida, dermatomyozitida, sklerodermie, systematická skleróza, vaskulitida, mozková varkulitida, Sjórgenův syndrom, revmatická horečka, polychondritida a revmatická polymyalgie a arteritida velkých buněk; septický šok, vedlejší účinky radiační terapie; systémový lupus erythematodes; temporální onemocnění kloubu mandibuly;
tyroiditida a transplantace tkání.
Zkrácené sTNFR produkty mohou být podávány pacientům v terapeuticky účinných množstvích i pro léčbu onemocnění zprostředkovaných TNF (jako jsou definovány výše), včetně například revmatických onemocnění (jako je Lymeská nemoc, juvenilní (revmatoidní) artritida, osteoartri10 tida, lupénková artritida, revmatoidní artritida a stafylokoky vyvolaná („septická“) artritida.
Termínem „pacient“ jsou myšlena jako zvířata (např. kočky, psi, koně), tak lidé.
Zkrácený sTNFR produkt může být podáván lokálně, enterálně a parenterálně včetně (a nikoliv t pouze) podání intravenózní, intramuskulámí, intraarteriální, intrathekálni, intrakapsulámí, intra- < 15 orbitální, intrakardiální, intradermální, intraperitoneální, transtracheální, subkutánní, subkutikulámí, intraaartikulámí, subkupsulámí, subarachnoidální, intraspinální, intraventrikulámí a intrastemální injekcí a infuzi. Zkrácený sTNFR produkt může být také podáván perorálně nebo přes mykózní membrány, tj, intranasálně, sublinguálně, bukálně nebo rektálně; vždy se jedná o systémovou aplikaci.
Preferuje se, když jsou zkrácené sTNFR produkty aplikovány intraaartikálání, subkutánní, intramuskulámí nebo intravenózní injekcí. Zkrácené sTNFr produkty mohou být také podávány kontinuální infuzi (například implantované nebo externí infuzní zařízení s regulací nebo stálý nebo přerušovaný průtok) tak, aby bylo zajištěno kontinuální dosažení požadované hladiny zkráceného 25 sTNFr produktu v krvi po dobu podávání. Přednostně se toho dosahuje prostředky kontinuální infuze, např. minipumpou, jak oje osmotická minipumpa. Při těchto způsobech je zajištěno, že množství léčívaje udržováno na požadované úrovni a je možné odebírat vzorky krve a sledovat množství léčiva v krevním oběhu. Komerčně jsou dostupné různé typy pump od dodavatelů, jako je MiniMed lne., Sylmar, CA (např. MT507) a AlzaCorp., Palo Alto, CA (např. osmotická 30 pumpa Alzet, model 2MLI).
Rovněž jsou uvažovány jiné způsoby kontinuálního nebo téměř kontinuálního dávkování. Např. chemické úpravy mohou vést k formám s postupným uvolňováním proteinu, což vede kjeho stálé přítomnosti v krevním oběhu v předvídaném množství založeném ria určeném dávkovém 35 režimu.
Způsoby použití zkrácených sTNFR produktů pro léčbu onemocnění zprostředkovaných TNF zahrnujících zánětlivé stavy kloubů (např. osteoartritidu, lupénkovou, artritidu a revmatoidní artritidu) jsou popsány v Evropské patentové přihlášce EP 567 566, jejíž obsah je zde uveden 40 odkazem. V konkrétním případě mohou být zkrácené sTNFR produkty (například při léčení revmatoidní artritidy a osteoartritidy) podávány intraartikulámě. V jiném specifickém případě (při léčení revmatoidní artritidy, zánětlivého onemocnění střev, kachexie/anorexie nebo roztroušené sklerózy) mohou být zkrácené sTNFR produkty aplikovány subkutánně nebo intramuskulámě. V dalším specifickém případě, který však neomezuje rozsah vynálezu,' mohou být zkrácené 45 sTNFR produkty podávány intravenózně pro léčbu poškození mozku jako následku traumatu, epilepsie, krvácení nebo mrtvice. Mezi preferované způsoby léčby artritidy patří: (1) jednotlivé intraartikulámí injekce zkráceného sTNFR produktu podávaného opakovaně podle potřeby pro prevenci nebo pro léčení propuknuvší artritidy a (2) opakované subkutánní injekce zkráceného sTNFR produktu. Zahájení léčby při septickém šoku by .mělo začít co možná nejdříve po sepsi, 50 nebo když je nebezpečí sepse diagnostikováno. Léčba může být, například; zahájena bezprostředně po chirurgickém zákroku, nebo po nehodě, nebo po jakékoliv jiné události, se kterou je spojené riziko septického šoku. Mezi preferované způsoby léčby při syndromu dýchacích potíží u dospělých: (1) jednotlivá nebo vícenásobná intratracheální aplikace zkrácených sTNFr produktů a (2) jednorázová dávka (bolus) nebo nepřetržitá intravenózní infuze zkrácených sTNFR pro55 duktů. :
-34CZ 296835 Β6
Dalším provedením vynálezu je buněčná terapie, například implantace buněk produkujících zkrácené sTNFR. Podle tohoto provedení podle předkládaného vynálezu jsou pacientovi implantovány buňky, které jsou schopné syntetizovat a vylučovat biologicky aktivní formu zkráceného sTNFr. Takovýmito buňkami produkujícími zkrácené sTNFRs mohou být buňky, které normálně sTNFR neprodukují, ale které byly modifikovány pro produkci zkráceného sTNFR, nebo to mohou být buňky, jejichž schopnost produkovat zkrácený sTNFŘ byla získána transformací polynukleotidem vhodným pro expresi a sekreci zkráceného sTNFR. Aby se minimalizovala potenciální imunologická reakce pacientů po podání zkráceného sTNFR odlišných druhů, preferuje se, když jsou buňky ze stejného druhu jako pacient (například člověk), nebo když jsou buňky opouzdřeny materiálem, který poskytne zábrana proti jejich rozpoznáváním imunitním systémem, nebo když jsou buňky umístěny do imunologicky zvláštní anatomické polohy, jako např. do varlat, oka nebo centrálního nervového systému.
Lidské nebo jiné buňky mohou být implantované pacientům v biokompatibilních, semipermeabilních polymemích obalech nebo membránách, které umožní uvolňování zkráceného sTNFR, a však zabrání destrukci těchto produkčních buněk pacientovým imunitním systémem nebo jinými škodlivými faktory z okolních tkání. Nebo se mohou vlastní buňky pacienta, transformované mimo organismus (ex vivo) tak, aby produkovaly zkrácený sTNFr, implantovat pacientovi přímo bez takovýchto obalů. Metodologie zapouzdření živých buněk membránou je odborníkům v oboru známá, takže se může provést příprava opouzdřených buněk a jejich implantace pacientům.
N jiném případě je možné provádět genovou terapii in vivo, kdy se sekvence nukleové kyseliny kódující zkrácený sTNFr vnese přímo do pacienta. Například sekvence nukleové kyseliny, kódující zkrácený sTNFR, je vnesena do cílových buněk místní injekcí konstruktu nukleové kyseliny (s nebo bez vhodného doporučujícího vektoru, například adenoasociovaného virového vektoru). Dalšími vektory mohou být bez omezení, vektory odvozené od retrovirů, adenovirů, viru herpes simplex a papilloma viru. Fyzického přenosu se může dosáhnout in vivo lokální injekcí konstruktu požadované nukleové kyseliny nebo jiného vhodného transportního vektoru obsahujícího požadovanou sekvenci nukleových kyselin, liposomy zprostředkovaným přenosem, přímou injekcí (obnažená DNA), receptorem zprostředkovaným přenosem komplexem ligand-DNA) nebo bombardováním mikročásticemi (gene gun).
Příklady technik buněčné a genové terapie jsou uvedeny v patentu US 4 892 538; patentu US 5 011 472; patentu US 5 106 627; DE 4219626, WO 94/20517 a WO 96/22793, jejichž popis.je zde zahrnut odkazem.
Bez ohledu na způsob podání vyžaduje léčba chorob zprostředkovaných TNF dávkový nebo celkový dávkový režim zkráceného sTNFR, který je účinný pro omezení či zmírnění symptomů onemocnění. Další faktory významné při stanovení vhodného dávkování mohou zahrnovat onemocnění nebo stav, který má být léčen, nebo kterému se dá předejít, závažnost onemocnění, způsob podávání, věk, pohlaví a léčebný stav pacienta. Další zpřesnění výpočtů nezbytných pro stanovení vhodné dávky pro léčení je odborníky v oboru prováděno rutinně, zejména ve světle informací o dávkování v testech zde obsažených. Dávka může být také stanovena s použitím známých zkoušek pro určení dávkování použitých ve spojení s vhodnými údaji o odpovědi na dávky. Specifická dávka je kalkulována podle přibližně tělesné váhy nebo tělesného povrchu pacienta.
Frekvence dávkování závisí na farmakokinetických parametrech zkráceného sTNFr v použitém přípravku. Zkrácený sTNFR může být podán jedenkrát, nebo v případě vážných a dlouhotrvajících potíží může být podáván denně v méně frekventovaných dávkách, nebo může být podáván s počátečním bolusem následovaným kontinuálními dávkami nebo postupným uvolňováním. Při parenterálním podávání může mít každá dávka například až 10 mg, nebo spíše až 15 mg, nebo ještě výhodněji než 20 mg. Při podání do kloubní dutiny je farmaceutický přípravek přednostně aplikován jako jedna injekce (např. 3-10 ml injekční stříkačkou obsahující dávku mezi 5 mg/ml
-35 CZ 296835 Β6 až 10 mg/ml) zkráceného sTNFr rozpouštěného v roztoku izotonického, fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku. Přípravek může být aplikován do kloubní dutiny například jednou za 7 až lO dní. Takovýmto způsobem se provádí aplikace například 4 až 5 x, přičemž se dávka se může, je-li to nezbytné, měnit.
V některých případech mohou být zkrácené sTNFr produkty podávány jako doplněk k jiné terapii a také s jinými farmaceutickými přípravky vhodnými pro léčenou indikaci. Zkrácený šTNFR pra dukt a jakákoliv z tradičních nebo nových protizánětlivých látek (nebo více těchto látek) mohou být podávány samostatně nebo v kombinaci.
/.'krácené sTNFR produkty (např. proteiny Ri-[Cys19-Cys103]-R2) a jakákoliv z doplňkových protizánětlivých látek (nebo více těchto látek) mohou být podávány samostatně nebo v kombinaci. Informaci o následujících sloučeninách je možné nalézt v The Měrek Manual of Diagnosis and Therapy, Sixteenth Edition, Měrek, Sharp & Dohme Research Laboratories, Měrek & Co, Rahway, NJ (1992), a v Pharmaprojects, PJB Publications Ltd.
Současná léčba chorob zprostředkovaných TNF, jako jsou definovány výše, včetně akutních a chronických zánětů, jako jsou revmatická onemocnění, (např. Lymská nemoc, juvenilní (revmatoidní) artritida, osteoartritida, lupénková artritida, revmatoidní artritida, a stafylokoky vyvolaná („septická“) artritida) zahrnuje v první linii použití léčiv pro kontrolu bolesti a zánětu, klasifikovaných jako nesteroidní protizánětlivá léčiva (NSAIDs - non-steroidal anti-inflammatory drugs). Druhotná léčba zahrnuje kortikosteroidy, pomalu působící antirevmatická léčiva (SAARDs - slow acting antirheumatic drugs), nebo léky modifikující onemocnění (DM - disease modifying).
V charakteristickém provedení je předkládaný vynález zaměřen na použití zkráceného sTNFR produktu (například proteinu R]-[Cys19-Cys103]-R2) a jakéhokoliv jednoho nebo více zNSAID píro léčbu onemocnění zprostředkovaných TNF, jak jsou definována výše, včetně akutních a chronických zánětů, jako jsou revmatické choroby (např. Lymská nemoc, Juvenilní (revmatoidní) artritida, osteoartritida, lupénková artritida, revmatoidní artritida a stafylokoky vyvolaná („septická) artritida); odmítání štěpu příjemcem. Protizánětlivý účinek NSAIDs je alespoň částečně založen na inhibici syntézy prostaglandinů (Goodman and Gilman v „The Pharmacological Basid of Therapeutics,“ MacMillan, 7tth Edition (1985)). NSAIDs mohou být rozděleny do devíti skupin: (1) deriváty kyseliny salicylové; (2) deriváty kyseliny propionové; (3) deriváty kyseliny octové; (4) deriváty kyseliny fenamové (fenamic acid); (5) deriváty kyseliny karboxylové; (6) deriváty kyseliny máselné; (7) oxikamy; (8) pyrazoly a (9) pyrazolony.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití zkráceného sTNFR produktu (například proteinu Ri-[Cys19-Cys103]-R2 v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více deriváty kyseliny salicylové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné deriváty kyseliny salicylové, jejich prekur2:ory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: acetaminosalol, aloxiprin, aspirin, benorylát, bromosaligenin, acetylsalicylát, vápenatý, cholin magnézium trisalicylát diflusinal, etersalat, fendosal, kyselinu geltisovou, glykol salicylát, imidazol salicylát, lysin acetylsalicylát, inesalamin, morfolin salicylát, 1-naftylsalicylát, olsalazin, parsalmid, fenylacetylsalicylát, fenylsalicylát, salasalazin, Do této kyseliny rovněž patří strukturně podobné deriváty kyseliny salicylové vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno s použitím zkráceného TNF produktu (například proteinu Ri-[Cys19-Cys1O3]-R2) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více deriváty kyseliny propionové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné deriváty kyseliny propionové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: alminoprofen, benoxaprofen, kyselinu bukloxovou, karprofen, dexindoprofen, fenoprofen, flunoxaprofen, flúprofen, flurbiprofen, furkloprofen, ibuprofen, ibuprofen aluminum, ibuproxam, indoprofen, isoprofen, ketoprofen,
-36CZ 296835 B6 loxoprofeň, miroprofen, naproxen, oxaprozin, piketoprofen, pimeprofen, pirprofen, pranoprofen, kyselinu protizinovou, pyridoxiprofen, suprofen, kyselinu tiaprofenovou a tioxaprofen. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné deriváty kyseliny propionové vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití zkráceného TNF produktu (například proteinu R1-[Cys19-Cys103]-R2) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více deriváty kyseliny octové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné deriváty kyseliny octové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: acemetacin; alclofenak,,amfeňak, bufexamak, cinmetacin, klopirak, delmetacin, diklofenak sodný, etodolak, felbinak, fénklofenak, fenklorak, kyselinu fenklozovou, fentiazak, furofenak, glukametacin, ibufenak, indómethacin, isofezolak, isoxepak, lonazolak, kyselinu metiazinovou, oxametacin, oxpinak, pimetacin, proglumetacin, sulindak, talmetacin, tiaramid, tiapinak, tolmetin, zidometacin s zomepirak. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné deriváty kyseliny octové vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití zkráceného TNF produktu (například proteinu Ri-[Cys19-Cys103]-R2) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více deriváty kyseliny fenamové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné deriváty kyseliny fenamové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: kyselinu enfenamovou, etofenamát, kyselinu flufenamovou, isonixin, kyselinu meklofenamovou, meklofenámát sodný, kyselinu medofenamovou, kyselinu mefanamovou, kyselinu niflumovou, talniflumát, terofenamát, kyselinu tolfenamovou a ufenamát. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné deriváty kyseliny fenomové vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití zkráceného TNF produktu (například proteinu R1-CysI9-Cys103]-R2) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více deriváty kyseliny karboxýlové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné deriváty kyseliny karboxýlové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: clidanak, diflunisal, flufenisal, inoridin, ketorolak a tinoridin. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné deriváty kyseliny kařboxylové vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směřováno k použití zkráceného TNF produktu (například proteinu R1-Cys19-Cys103]-R2) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více deriváty kyseliny máselné, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné deriváty kyseliny máselné, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: bumadizon, butibufen, fenbufen a xenbucin. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné deriváty kyseliny máselné vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití zkráceného TNF produktu (například proteinu R]-Cys19-Cys103]-R2) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více oxikamy, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné oxikamy, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: droxikam, enolikam, isoxikam, piroxikam, sudoxikam, tenoxikam a 4hydroxyl-l,2-benzothiazin l,l-dioxid-4-(N-fenyl)-karboxamid. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné oxikamy vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedené vynálezu je směrováno k použití zkráceného TNF produktu (například proteinu Ri-[Cys19~Cys103]-R2) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více pyrazoly, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přija-37-
CZ 296835 Β6 telnými solemi. Zmíněné pyrazoly, jejich prekurzóry ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: difenamizol a epirzol. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné pyrazoly vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití zkráceného TNF produktu (například proteinu Ri-Cys19-Cys103]-R2 v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více pyrazolony, jejich prekurzóry ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné pyrazolony, jejich prekurzóry ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: apazon, azapropazon, benzpiperylon, feprazon, mofebutazon, morazon, 10 oxyfenbutazon, fenylbutazon, pipebuzo, propylfenazon, ramifenazon, suxibuzon a thiazolinobutazon. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné pyrazoly vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití zkráceného TNF produktu (napřík15 lad proteinu Ri-[Cys19-Cysi03]-R2) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více z následujících NSAIDs: kyselina ε-acetamidokapronová, S-adenosylmethionin, kyselina 3-ammo-4-hydroxymáselná, amixetrin, anitrazafen, antrafenin, benzdazak, bendaza lysinát, benzydamin, beprozin, broperamol, bukolom, bufezolak, benzydamin, beprozin, broperamol, bukolom, bufezolak, ciproquazon, kloxamát, dazidamin, deboxamet, detomidin, 20 difenpiramid, difenpyramid, difisalamin, ditazol, emorfazon, fanetizol mesylát, fenflumizol, floktafenin, flumizol, flunixin, fluproquazon, fopirtolin, fosfosan, guaimesal, guaimesal, guaiazolen, isonixim, lefetamin, HC1, leflunomid, lofemizol, lotifazol, lysin klonixinát, meseklazon, nabumeton, niktindol, nimesulid, orgotein, orpanoxin, oxaceprolm, oxapadol, paranylin, perisoxal, perisoxal citrát, pifoxim, piproxen, pirazolak, pirfenidon, proquazon, proxazol, thielavin B, 25 tiriflairiizol, timegadin, tolektin, tolpedol, tryptamid a sloučeniny označené firemními kódovými čísly, jako 480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382, EP508, F1044, EK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KMÉ4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ONO3144, PR823, PV102, PV108, R83O, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI30 901 (kyselina 4-benzoyl-l-indankarboxylová), TVX2706, U60257, UR2301 a WY41770.
Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné NSAIDs vykazující analgetické a protizánětlivé účinky obdobné, jako mají výše uvedené NSAIDs.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití zkrácených sTNFR produktů 35 (například proteinu Ri-Cys19-Cys103]-R2) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více s jedním nebo více kortikosteroidy, prekurzóry jejich esterů nebo farmaceuticky akceptovatelnými solemi pro léčbu TNF zprostředkovaných onemocnění (jak jsou definována výše), včetně akutního a chronického zánětu, jako jsou revmatická onemocnění (např. Lymská nemoc, juvenilní (revmatoidní) artritida, osteoartritida, lupénková artritida, revma40 toidní artritida a stafylokoky vyvolaná („septická“) artritida); a roztroušená skleróza. Kortikosteroidy, jejich prekurzóry ve formě esterů nebo jejich farmaceuticky akceptovatelné soli zahrnují hydrokortison a sloučeniny, které jsou odvozené od hydrokortisonu, jako například 21-acetoxypregnenolon, alklomerasón, ageston, amcinonid, beklomethason, betamethason, valerát betarnethasonu, budenosid, chlorprednison, klobetasol, propionát, klobetasolu, klobetason, butyrát 45 Idobetasonu, klokortolon, kloprednol, kortikosteron, kůrtison, kortivazol, deflazakon, desonid, desoximerason, dexamethason, diflorason, diflukortolon, difluprednát, enoxolon, fluazakort, flukloronid, flumethason, pivalát, flumethasonu, flunisolid, flucinolon acetonid, flucinonid, fluorocinolon acetonid, butyl fluokortin, fluokortolon, fluorokortolon, hexanoát, diflukortolon valenát, fluorometholon, fluperolon acetát, flupredniden acetát, fluprednisolon, flurandenolid, 50 formokortal, halcinonid, halometason, haloprednon acetát, hydrokortamát, hydrokortison, hydrokortison acetát, hydrokortison butyrát, hydrokortison fosfát, sodná sůl hydrokortison 21sukcinátu, hydrocortison tebutát, mezipredon, medryson, meprednison, methylprednikolon, nometason furoát, paramethason, prednikarbát, prednisolon, prednisolon 21-diedryaminoacetát, sodná sůl prednisolon fosfátu, sodná sůl prednisolon sukcinátu, sodná sůl 21-tm-sulfobenzoátu, 55 sodná sůl prednisolon 21-stearoglykolátu, prednisolon tebulát, prednisolon 21-trimethylacetát,
-38CZ 296835 B6 prednison, prednival, prednyliden, prednyliden 21-diethylaminoacetát, tixokortol, tramcinolon, triamcinolon acetonid, triamcinolon benetonid a triamcinolon hexacetonid. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné kortikosteroidy vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrována k použití zkrácených sTNFR produktů (například proteinu R+-Cys19-Cys103]-R2) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo současná léčba) s jedním nebo více pomalu účinkujícím antirevmatickým léčivem (slow-acting antirheumatic drug, SAAED) nebo antirevmatickým léčivem modifikujícím onemocnění (disease 10 modifying antirheumatic drug, DMARDS), jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky akceptovatelnými solemi pro léčbu TNF zprostředkovaných onemocnění (jak jsou definovaná výše), včetně akutního chronického zánětu, jako jsou revmatická onemocnění (např. Lymská nemoc, juvenilní (revmatoidní) artritida, osteoartritida, lupénková artritida, revmatoidní artritida a stafylokoky vyvolaná („septická“) artritida); a roztroušení skleróza. SAADs nebo DMARDs, 15 jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: allokupreid sodný auranofin, aurothioglukózu, aurothioglykanid, azathioprin, brequinar sodný, bucillamin, 3aurothio-2-propanol-l-sulfonát vápenatý, chlorambucil, chloroquin, klobuzarit, kuproxolin, cyklofosfamid, cyklosporin, dapson, 15-deoxyspergualin, diacerein, glukosám in, soli zlata (např. zlatá sůl cykloquinu, thiomalát sodnozlatý, thiosíran sodnozlatý), hydroxýchloroquin, hydróxy20 močovinu, kebuzon, levamisol, lobenzarit, melittin, 6-merkaptopurin, methotrexát, mizoribin, mykofenolát mofetin, myoral, dusíkatý yperit (nitrogen, mustard), D-penicillamin, imidazoly pyridinolu, jako například SKN86002 a SB203580, rapamycin, thioly, thýmopoietin vincristin. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné SAARds nebo DMARDs vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití zkrácených sTNFR produktů (například proteinu R]-[Cys19-Cys103]-R2) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více inhibitory COX2, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky akceptovatelnými solemi pro léčbu TNF zprostředkovaných onemocnění (jak jsou 30 definované výše), včetně akutního a chronického zánětu. Inhibitory COX2, jejich prekurzory ve formě esterů nebo jejich farmaceuticky akceptovatelné soli zahrnují podobně inhibitory COX vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití zkrácených sTNFR produktů 35 (například proteinu R1-[Cys19-Cys103]-R2 v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více bakteriostatiky (antimicrobials), prekurzory jejich esterů nebo farmaceuticky akceptovatelnými solemi pro léčbu TNF zprostředkovaných onemocnění (jak jsou definované výše), včetně akutního a chronického zánětu. Bakteriostatika, jejich prekurzory ve formě esterů nebo jejich farmaceuticky akceptovatelné soli zahrnují například ampicilin, 40 amoxycilin, aureomycin, bacitracin, ceftazimid, ceftriaxon, cefotaxim, cefachlor, cefalexin, cefradin, ciprofloxacin, kyselinu klavulanovou (clavulanic acid), kloxacilin, dikloxacilan, erythromycin, flukloxacilan, gentamicin, gramicidin, methicilan, neomycin, oxacilan, penicilín a vancomycin. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobná bakteriostatika vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití zkrácených sTNFR produktů (například proteinu R1-[Cys19-Cys103]-R2) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jednou nebo více z následujících sloučenin pro léčbu onemocnění zprostředkovaných TNF (jak jsou definována výše), včetně akutních a chronických zánětů: faktor stimulu50 jící růst kolonií granulocytů, thalidomid, BN 50730, tenidap, E 5531, tiapafant PCA 4248, nimesulid, panavir, rolipram, RP 73401, peptid T, MDL 201, 449A, (lR,3S)-cis-l-[9-(2,6-diaminopurinyl)]-3-hydroxy-4-cyklopenten hydrochlorid, (IR, 3R)-trans-l-[9-(2,6-diamino)purin]-3acetoxycyklopentan, (lR,3R)-trans-l-[9-adenyl)-3-azidocyklopentan hydrochlorid a (1R,3R)1rans-l-(6-hydroxy-purin-9-yl)-3-azidoxyklopentan.
CZ 296835 B<5
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno' k použití zkrácených sTNFR produktů (například proteinu R1-[Cys19-Cys103]-R2) v kombináci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více dalšími inhibitory TNF pro léčbu onemocnění zprostředkovaných TNF (jak jsou definována výše), včetně akutních a chronických zánětů. Inhibitory TNF zahrnují sloučeniny a chronických zánětů. Inhibitory TNF zahrnují sloučeniny a proteiny, které blokují in vivo syntézu nebo extracelulámí uvolňování TNF, včetně následujících sloučenin.
Další inhibitory TNF zahrnují protilátky proti TNF, např. Fab fragment protilátky MAK 195F Fab (Holler et al. (1993), ls( Intemational Symposium on Cytokines in Bone Marrow Transplantation, 147; monoklonální protilátka CDP 571 proti TŇF (Rankin et al. (1995), Britis Joumal of Rheumatology, 34:334-342 (jejichž popis je zde zahrnut odkazem); myší monoklonální protilátka proti faktoru nekrotizujícímu tumor ΒΑΥ X 1351 (Kieft et al. (1995), 7th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 9, jehož popis je zde zahrnut odkazem; monoklonální protilátka CenTNF cA2 proti TNF (Elíiot et al. (1994), Lancet, 344:1125-1127 a Eliott et al. (1994), Lancet, 344:1105-1115-1110, jejichž popis je zde zahrnut odkazem).
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití zkrácených sTNFr produktů (například proteinu Ri-[Cys19-Cys103]-R2 v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s rozpustným rekombinantním lidským antigenem Fas nebo s rekombinantními verzemi tohoto antigenu (We 96/20206 a Mountz et al., J. Immunology, 155:4829-4837 a EP 0 510 691), jejichž popis je zde zahrnut odkazem. WO 96/20206 popisuje sekretovaný lidský antigen Fas ((přirozený a rekombinantní, včetně Ig fúzního proteinů), způsoby izolace genů, zodpovědných za kódování rozpustného rekombinantního lidského antigenu Fas, způsoby klonování genu ve vhodných vektorech a vhodných typech buněk a způsoby exprese genu pro produkci inhibitorů. EP 0 510 691 popisuje DNA kódující lidský antigen Fas, včetně rozpustného antigenu Fas, vektory exprimující uvedené DNA a transformanty transfekoýané vektorem. Při parenterálním podávání se dávky fúzního proteinu s antigenem Fas pohybují v rozmezí od 1 mikrogramu/kg do 100 mikrogramů/kg. [
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití zkrácených sTNFr produktů (například proteinu R1-[Cys19-Cys103]-R2) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více inhibitory interleukinu-1 pro léčbu onemocnění zprostředkovaných TNF (jak jsou definována výše) včetně akutního a chronického zánětu, jako jsou revmatická onemocnění (např. Lymská nemoc, juvenilní (revmatoidní) artritida, osteoartritida, lupénková artritida, revmatoidní artritida a stafylokoky vyvolaná („septická“) artritida); poškození mozku jako následek traumatu, epilepsie, krvácení nebo mrtvice; a roztroušená skleróza. Třídy inhibitorů interleukinu-1 zahrnují antagonisty receptoru interíeukinu-1 (jakákoliv sloučenina schopná specificky bránit aktivaci buněčných receptorů pro IL-1), jako je IL-lra, jak je popsáno dále; monoklonální protilátky proti receptoru IL-1 (např. ÍEP 623 674, jehož popis je zde zahrnut odkazem); IL-1 vazebné proteiny, jako např. rozpustné receptory IL-1 (např. patent US 5 492 888, patent US 5 488 032, patent US 5 464 937, patent US 5 319 071 a patent US 5 180 812, jejichž popis je zde zahrnut odkazem); monoklonální protilátky proti IL·-! (např. WO 95/01997, WO 94/02627, WO 90/06371, patent US 4 ^35 343, EP 0 364 778, EP 0 267 611 a EP 0 220 063, jejichž popis je zde zahrnut odkazem); doplňkové proteiny receptoru 11^1, např. WO 96/23067 (jehož popis je zde zahrnut odkazem) a ostatní sloučeniny a proteiny, které blokují in vivo syntézu nebo extracelulámí uvolňování IL-1.
jkntagonistou receptoru IL-1 (IL-lra) je lidský protein, který působí jako přirozený inhibitor interleukinu-1. Preferovaní antagonisté receptoru spolu se způsobem jejich přípravy a použití jsou popsané v patentu US 5 075 222 (zde odkazováný jako '222 patent); WO 91/08285; WO 91/17184; AU 9173636; WO 92/16221; WO 93/21946; PCT Mezinárodní přihláška č. US 97/02131 (publikovaná jako EP 0 904 112), která uvádí farmaceutické kompozice zahrnující (a) účinné množství polymeru pro řízené uvolňování (např. kyselina hyaluronová) a (b) účinné množství IL-lra; WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772; WO 94/21235; DE 4219626, WO
94/20517; a WO 96/22793, jejichž popis je zde zahrnut odkazem. Proteiny zahrnují glykosylované stejně jako neglykosylované antagonisty IU-1 receptorů.
Patent US 5 075 222 (Hannum et al., o názvu „Interleukin-1 inhibitors“) popisuje konkrétně tři preferované formy IL-lra (ILlraa, IL-lraP a IL-lrax), z nichž každá je odvozená ze stejné DNA kódující sekvence. Tento patent US (uváděný zde jako ,222 patent) je zde uveden záměnou za přenesení jeho celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Všechny tři inhibitory interleukinu-1 mají podobné funkční a imunologické aktivity. V '222 patentu jsou také uvedeny způsoby produkce inhibitorů IL-1, zejména IL-lras. Jedna z popsaných metod zahrnuje izolaci inhibitorů 10 z lidských monocytů (kde jsou přirozeně produkovány). Druhá z popsaných metod zahrnuje izolaci genu zodpovědného za kódování IL-lras, klonování genu ve vhodných vektorech a typech buněk, expresi genu vedoucí k produkci IL-lras a získání IL-lras. Preferovanou metodou tohoto vynálezu je druhá z metod, která je obecným příkladem rekombinantních DNA postupů.
V charakteristickém provedení obsahuje IL-lra methionylovou skupinu na N-konci jako důsle15 dek exprese v E. coli. Předkládaný vynález také zahrnuje modifikovaný IL-lras. Modifikovaný
IL-lras zahrnuje, například, muteiny takovýchto inhibitorů, ve kterých je cysteinový. zbytek nahrazen za aminokyselinu v jedné nebo více pozicích aminokyselinové sekvence přirozeně se vyskytujícího inhibitoru. Takovéto muteiny mohou potom místně selektivně reagovat s funkcionalizovánými jednotkami polyethylenglykolů (PEG) nebo s jinými polyethery obsahujícími 20 sulfhydrylové skupiny za tvorby různých typů IL-lra PEG. PCT přihláška WO 92/16221 uvádí řadu modifikovaných IL-lra typů a způsoby přípravy těchto inhibitor modifikovaných sPEGem.
Další třída inhibitorů interleukinu-1 zahrnuje sloučeniny schopné specificky bránit aktivaci buněčných receptorů IL-1. Mezi takovéto sloučeniny patří IL-1 vazebné proteiny, jako jsou roz25 pustné receptory a monoklonální protilátky. Rovněž jsou zahrnuty monoklonální protilátky proti receptorům.
Další třída inhibitorů interleukinu-1 zahrnuje sloučeniny a proteiny, které blokují in vivo syntézu a/nebo extracelulámí uvolňování IU-1. Jedná se o látky, které zahrnují agens ovlivňující trans30 lcripci IL-1 genů nebo úpravu pre-proteinu IL-1.
Výše uvedené příklady jsou jedním z příkladů využití vynálezu a nevylučují jiné způsoby využitelného léčebného postupu, který je prováděn souběžně s aplikací těchto protizánětlivých sloučenin a které je odborníků v oboru znám, nebo který by mohl být odborníky v oboru vyvozen z po35 pásu předmětného vynálezu.
Je zvláště výhodné formulovat přípravky obsahující doplňkové protizánětlivé sloučeniny ve formě jednotlivých dávek, a to za účelem snadné aplikace a rovnoměrného dávkování. Termín „forma jednotlivé dávky, jak je zde míně, označuje fyzicky oddělené jednotky vhodné jako jednotko40 vé dávky aplikované léčenému savci, kdy každá jednotka obsahuje přesně stanovené množství doplňkových protizánětlivých sloučenin vypočítané tak, aby spolu s požadovaným farmaceutickým nosičem vyvolalo požadovaný terapeutický účinek. Termín „farmaceuticky přijatelný nosič“, jak je chápán v této přihlášce, zahrnuje jakékoliv z rozpouštědel, disperzní média, obalová agens, antimikrobiální a antifungální činidla, izotonická a absorpci zpomalující činidla a po45 dobně, která jsou kompatibilní s aktivní složkou, se způsobem podání a s dalšími složkami přípravku a která nejsou pro příjemce škodlivá. Použití takovýchto agens a médií je odborníkům v oboru známé (viz, například, Remington‘s Pharmaceutical Sciencs, 18th Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, strany 1435-1712, jehož popis je zde zahrnut odkazem). Do farmaceutického přípravku mohou rovněž být začleněny další aktivní látky.
Za účelem orální terapeutické aplikace může být doplňková protizánětlivé sloučenina formulována s pomocnými látkami (excipienty) a použita ve formě tablet k polknutí, bukálních tablet, pastilek, tobolek, elixírů, suspenzí, sirupů, oplatek a podobně, nebo může být přímo začleněna do přijímané potravy. Tablety, pastilky, pilulky, tobolky a další formy mohou také obsahovat násle55 dující složky: pojivo, jako například tragant, arabská guma (accacia), kukuřičný škrob nebo želá-41 CZ 296835 B6 tinu; pomocné látky, jako například fosforečnan vápenatý; rozvolňovala, jako je kukuřičný škrob, kyselina alginová a podobně; mazivo (lubrikant), jako stearan hořečnatý; sladidlo, jako je sacharóza, laktóza nebo sacharin; nebo ochucovadlo, jako peprmint, libavkový olej, višňovou nebo pomerančovou příchuť. Je-li jednotlivá dávka ve formě tobolek, může kromě výše zmíněných 5 látek rovněž obsahovat kapalný nosič. K povrchové úpravě nebo za účelem jiných modifikací formy jednotlivých dávek mohou být použity nejrůznější další materiály. Tak například tablety, pilulky nebo tobolky mohou být potažené šelakem, cukrem nebo oběma současně. Veškerý materiál používaný při přípravě jakékoliv formy jednotlivých dávek by samozřejmě měl být ve farmaceutické čistotě a v používaném množství v podstatě netoxický. Navíc může být doplňková proti10 zánětlivá sloučenina začleněna do přípravku pro řízené uvolňování léčiva. Množství těchto doplňkových protizánětlivých sloučenin v dané terapeuticky užitečné směsi je volené tak, aby se dosáhlo vhodné dávky.
Za účelem parenterální terapeutické aplikace může být doplňková protizánětlivá sloučenina 15 formulována spolu se sterilním roztokem vhodným pro injekční aplikaci. Sterilní roztok vhodný pro injekce může být připraven včleněním požadovaného množství doplňkové protizánětlivé látky, spolu s dalšími složkami vyjmenovanými dále v textu, do vhodného, farmaceuticky přijatelného nosiče a s následnou sterilizací provedenou za účelem přípravy disperzí může být doplňková protizánětlivá sloučenina včleněna do sterilního vehikula, které obsahuje základní disperzní 20 médium a další požadované ingredience vybrané ze seznamu zvedaného výše. Sterilní roztoky vhodné pro injekční aplikaci mohou být připraveny začleněním doplňkové protizánětlivé sloučeniny ve formě prášku a (případně) jakékoliv další požadované ingredience z předchozí přípravy jejího sterilního roztoku filtrací, přičemž prášek se připraví jakýmkoliv vhodným způsobem (např. vakuovým sušením nebo lyofilizací).
Specifická dávka doplňkové protizánětlivé sloučeniny je vypočítána podle přibližné tělesné váhy nebo tělesného povrchu pacienta. Mezi další faktory zohledňované při stanovení vhodného dávkování patří povaha léčeného nebo předcházeného akutního nebo chronického zánětlivého onemocnění nebo patologického stavu, závažnost tohoto onemocnění, způsob aplikace a věk, 30 pohlaví a zdravotní stav pacienta. Odborníci snadno provedenou další zpřesnění výpočtů nezbytných ke stanovení vhodného dávkování při léčbě zahrnující aplikaci jakéhokoliv z výše uvedených přípravků. Dávkování se také může stanovit pomocí známých testů pro určení dávky použitých spolu s odpovídajícími údaji o reakci organismu na podávanou dávku.
Do rozsahu tohoto vynálezu tudíž například spadá skutečnost, že lze měnit dávky doplňkových protizánětlivých sloučenin zvolených za účelem léčby daného akutního nebo chronického zánětlivého onemocnění, jako například revmatických chorob (např. Lymská nemoc, juvenilní (revmatoidní) artritida, osteoartritida a stafylokoky vyvolaná („septická“) artritida), a to tak, aby bylo dosaženo požadovaného terapeutického účinku. Jestliže některá z doplňkových protizánětlivých 40 látek vykazuje vedlejší účinky, může se při kombinované terapii podávat pacientům během období alternativní léčby. Například chronická léčba methotrexátem je spojena s toxickými účinky na gastrointestinální trakt, játra, kostní dřeň a plíce (Sandoval et al., (1995) British Joumal of Rheumatology, 34:49-56, jehož popis je zde zahrnut odkazem).
Testy sledující zlepšení onemocnění mohou zahrnovat specifické testy, při kterých je například stanovována systémová odpověď organismu na zánět, přičemž tyto testy zahrnují sledování rychlosti sedimentace erytrocytů (ESR - erytrocyte sedimentation rate) a výskyt reaktantů akutní fáze (APR - acute phase reactant). Jsou rovněž pozorovány otoky, atd. postižených částí těla. Rovněž jsou u pacienta sledovány ústup ztuhlosti a zlepšení úchopu (je-li použitelné) a zmírnění 50 bolesti. Jestliže je pacientův stav stabilizovaný, je mu podávána stejná dávka jednou týdně a rovněž jedno týdně je hodnocen jeho stav. Za předpokladu, že stav pacienta je stabilní, může se v léčbě pokračovat. Po šesti měsících léčby jsou anatomické změny na kostře vyhodnoceny nějakou radiologickou zobrazovací metodou, například rentgenografií.
-42CZ 296835 B6
Na konci každého období je pacient znovu hodnocen. Srovnání výsledků radiologických vyšetření, hodnot ESR a APR před a po léčbě ukazuje na účinnost léčby. V závislosti na účinnosti léčby a. stavu pacienta může být dávkování v dalším průběhu léčby zvýšeno nebo zachováno na stejné úrovni.
Ve výhodném provedení je předkládaný vynález směrován k využití způsobů léčby s využitím volitelně jedné z následujících kombinací, a to za účelem léčby nebo prevence akutních nebo chronických zánětlivých onemocnění a stavů (jak jsou definovány výše), jako jsou revmatická onemocnění (např. Lymská nemoc, juvenilní (revmatoidní) artritida, osteoartritida, lupénková 10 artritida, revmatoidní artritida a stafylokoky vyvolaná („septická“) artritida): zkrácený produkt sTNFR (např. protein R1-[Cys19-CysIO3]-R2) a methotrexát; zkrácený produkt sTNFR (např. protein R1-[Cysl9-Cys103]-R2), methotrexát a inhibitor IL-1, přednostně IL-lra; zkrácený produkt sTNFR (např. protein Ri-[Cys19-Cys103]-R2) a jedna nebo více látek ze skupiny zahrnující methotrexát, imunosupresivum (například cyklosporin), ciprofloxacin, antigen Fas a inhibitor 15 IL-1, přednostně IL-lra; zkrácený produkt sTNFR (např. protein Ri-[Cys19-Cys103]-R2)
a. methotrexát a imunosupresivum (např. cyklosporin); zkrácený produkt sTNFR (např. protein Ri-[Cys19-Cys103]-R2) methotrexát a cyprofloxacin; a zkrácený produkt sTNFR (např. protein R!-[Cys19-Cys103]-R2), methotrexát a inhibitor IL-1, přednostně IL-lra; zkrácený produkt sTNFR (např. protein Ri-[Cysl9-Cys103]-R2) a jedna nebo více látek ze skupiny zahrnující 20 methotrexát, sulfasazin a hydroxychloroquin; zkrácený produkt sTNFR (např. protein R]-[Cys19Cys103]-R2), methotrexát a hydroxychloroquin; zkrácený produkt sTNFR (např. protein Rj[Cys19-Cys103]-R2), methotrexát a sulfasazin.
V charakteristickém výhodném provedení zmíněný způsob léčby zahrnuje podání (např. intra25 artikulámí, subkutánní nebo intramuskulámí) zkráceného produktu sTNFR (např. protein R]- [Cys19-Cys103]-R2) případně formulovaného spolu s polymerem v přípravku s řízeným uvolňováním (např. hyaluronanem) volitelně v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s methotrexátem a/nebo inhibitorem IL-1 (např. IL-lra) a/nebo s rozpustným lidským rekombinantním antigenem Fas, a to za účelem léčby revmatických onemocnění, jak je uvedeno 30 výše (např. Lymská nemoc, juvenilní (revmatoidní) artritida, osteoartritida, lupénková artritida, revmatoidní artritida a stafylokoky vyvolaná („septická“) artritida) a symptomů s nimi spojených.
V charakteristickém výhodném provedení zmíněný způsob léčby zahrnuje podání (např. intravenózní nebo intravertikulámí) zkráceného produktu sTNFr (např. proteinu Ri-[Cys19-Cys103]-R2), a volitelně formulovaného spolu s polymerem pro řízené uvolňování (např. hyaluronanem)), volitelně v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s tkáňovým aktivátorem plasminogenu a/nebo IL-1 inhibitorem (např. IL-lra), a to za účelem léčby poškození mozku, které je důsledkem traumatu, epilepsie, krvácení nebo mrtvice, kde každý z těchto stavů může vést k neurodegeneraci.
40
V charakteristickém výhodném provedení zmíněný způsob léčby zahrnuje podání (např. subkutánní nebi intramuskulámí) zkráceného produktu sTNFR (např. proteinu Ri-[Cys19-Cys103]-R2) volitelně formulovaného spolu s polymerem pro řízené uvolňování (např. hyaluronanem)), volitelně v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jednou nebo více sloučeninami ze skupiny zahrnující kortikosteroidy, cyklosporin, FK-506, nebo nějaký interferon ( např. alfa interferon, beta interferon, gama interferon nebo konsensus interferon a/nebo IL-lra, a to za účelem léčby roztroušené sklerózy.
V charakteristickém výhodném provedení zmíněný způsob léčby zahrnuje podání (např. subku50 tánní nebo intramuskulámí) zkráceného produktu sTNFR (např. proteinu R]-[Cys19-Cys103J-R2 volitelně formulovaného spolu s polymerem pro řízené uvolňování (např. hyaluronanem), volitelně v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s G-CSF a/nebo IL-lra, a to za účelem léčby zánětlivého onemocnění střev.
-43CZ 296835 B6
Ν charakteristickém výhodném provedení zmíněný způsob léčby zahrnuje podání (např. subkutánní nebo intramuskulámí) zkráceného produktu sTNFR (např. proteinu Ri-[Cys19-Cys103]-R2) volitelně formulovaného spolu s polymerem pro řízené uvolňování (např. hyaluronanem)), volitelně v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s leptinem, Merinolem 5 (Marinol™) nebo Megacem (Megace™), a to za účelem léčby kachexie/anorexie.
V charakteristickém výhodném provedení zmíněný způsob léčby zahrnuje podání (např. subkutánní, intraventrikulámí nebo intrathekální) zkráceného produktu sTNFR (např. proteinu Ri[CI9-Cys1O3]-R2) volitelně formulovaného spolu s polymerem pro řízené uvolňování (např.
hyaluronanem)), volitelně v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) sNSAID (např. indometacinem a/nebo inhibitorem IL-1 (např. IL-lra), a to za účelem léčby Alzheimerovy choroby.
V charakteristickém výhodném provedení zmíněný způsob léčby zahrnuje podání (např. subku15 tánní, intraventrikulámí nebo intrathekální) zkráceného produktu sTNFr (např. proteinu Rj- [Cys19-Cys103]-R2) volitelně formulovaného spolu s polymerem pro řízené uvolňování (např. hyaluronanem)), volitelně v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s propustným rekombinantním lidským antigenem Fas, a to za účelem léčby rakoviny (např. leukémií); diabetes (dětské diabetes mellitus typu 1); odmítnutí štěpu hostitelem; hepatitidy;
ischemického/reperfúzního poškození, včetně mozkové ischemie (poškození mozku jako následek traumatu, epilepsie, krvácení nebo mrtvice, které mohou všechny vést k neurodegeneraci); zánětlivých neurologických onemocnění; revmatických onemocnění, jak jsou vymezena výše (např. Lymská nemoc, juvenilní revmatoidní) artritida, osteoartritida, lupénková artritida, revmatoidní artritida a stafylokoky vyvolaná „septická“) artritida a při transplantaci tkání.
Další aspekty a výhody předkládaného vynálezu budou zřejmé pro zvážení dále uvedených ilustrativních příkladů provedení.
Přehled obrázků na výkresech
Další aspekty a výhody předkládaného vynálezu budou zřejmé po shlédnutí obrázků, kde:
Obrázek 1 zobrazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEQ ID NO: 1) kódující Asp'-Asn161, rekom35 binantní lidský sTNFR-I o plné délce. Rovněž je zobrazena sekvence aminokyselin Asp1Asn161(SEQ ID NO:2).
Obrázek 2 zobrazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEQ ID NO:3) kódující NH2MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys’9-Cys30)-FC-COOH (také uváděný jako sTNFR-I 40 2.6D/C105). Zobrazena je také sekvence aminokyselin NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC|Cys19-Cys30]-FC-COOH (SEQ ID NO:4).
Obrázek 3 zobrazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEQ ID NO:5) kódující NH2MDSVCPQGKYIHPQNNIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (uváděný také jako sTNFR-I 45 2.6D/C106). Zobrazena je také sekvence aminokyselin NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC|'Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (SEQ ID NO:6).
Obrázek 4 zobrazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEQ ID NO:7) kódující NH2MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[CyS19-Cys,03]-FN-COOH (uváděný také jako sTNFR-I 50 2.6D/N105). Zobrazena je také sekvence aminokyselina NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC[Cys19-Cys103]-FN-COOH (SEQ ED NO:8).
Obrázek 5 zobrazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEQ ED NO: 11) kódující NH2MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (uváděný také jako sTNFR-I 2.3D/d8).
CZ 296835 B6 ’
Zobrazena je také sekvence aminokyselin NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSLCOOH (SEQ ID NO:12).
Obrázek 6 zobrazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEQ ID NO:9) kódující NH2-M-[Cys195 Cys103]-FNCSL-COOH (uváděný také jako sTNFR-I 2:3D/dl 8). Zobrazena je také sekvence aminokyselin NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (SEQ ID NO: 10).
Obrázek 7 zobrazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEQ ID NO: 13) kódující NH2-MSIS-[Cys19Cys103]-FNCSL-COOH (uváděný také jako sTNFR-I 2.3D/dl5). Zobrazena je také sekvence ío aminokyselin NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (SEQ ID NO: 14).
Obrázek 8 zobrazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEQ ID NO:34) kódující Leu1-Thr179 zralého rekombinantního lidského sTNFR-Π. Zobrazena je také sekvence aminokyselin Leu’-Thr179 (SEQ ID NO:35).
Obrázek 9 znázorňuje roztok otoku indukovaného v modelu reaktivace indukované streptokokovou buněčnou stěnou tak, jak je uvedeno v popise příkladu II.
Obrázek 10 zobrazuje plazmatické profily sTNFR-I 4D/C103db u zdravých pacientů po dvou 20 minutách intravenózní infúze 0,2 mg/kg tak, jak je uvedeno v popise příkladu III.
Obrázek 11 zobrazuje plazmatické profily sTNFR-I 3D/C105db u zdravých paviánů po dvou minutách intravenózní infúze 0,2 mg/kg tak, jak je uvedeno v popise příkladu III.
Obrázek 12 zobrazuje plazmatické profily sTNFR-I 2.6D/C105db u zdravých paviánů po dvou minutách intravenózní infúze 0,2 mg/kg tak, jak je uvedeno v popise příkladu III.
Obrázek 13 zobrazuje vztah mezí dávkou a odbouráváním (clearancí) různých dimémích konstruktů sTNFR-I tak, jak je uvedeno v popise příkladu III.
Příklady provedení vynálezu
Standardní metody (nebo vhodné alternativní metody) použitelné v postupech popsaných v násle35 dujících příkladech jsou popsány v obecně uznávaných manuálech molekulární biologie, jako například v publikacích Sambrook et al. (1989), viz výše, a Ausubel et al. (1990), viz výše. Pro porozumění čtenáře uvádíme, že “mL” se týká mililitrů a “L” se týká litrů.
Příklad I
Následující příklad popisuje produkci různých forem zkráceného rekombinantního rozpustného rfNFR-I:
lNH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH (sTNFR-I 2,6D/C105); NH2MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (sTNFR-I 2,6D/C106); NH2MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-CysI03]-FN-COOH (sTNFR-I 2,6D/N105); NH2MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (sTNFR-I 2,3D/d8); NH2-M-[Cys19-Cys103]FNCSL-COOH (sTNFR-I 2,3D/dl8) a NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (sTNFR-I
2,3D/dl5).
ί CZ 296835 B6
A. Příprava DNA:
»
1. sTNFR-Ι 2.6D/C106 5 ‘ . Byla prováděna PCR amplifikace sTNFR-Ι 2.6D/C106 s použitím klonované DNA odvozené ' z klonu lambda-gtl07ctnfbp (EP 422 339), jako tepmlátu, a s použitím následujících PCR primerů:
5' OLIGO#1: (SEQ ID NO:68)
5’-GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3'
3' OLIGO#2: (SEQ ID NO:69)
5’-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3’
C)LIGO#1 a OLIGO#2 obsahují místa Ndel a NindlII hybridizují na 5' konci (OLIGO#1) a 3' konci (OLIGO#2) zkráceného genu v uvedeném pořadí. PCR amplifikace probíhala v cyklech; každý cyklus se skládal ze 30 sekund při 94 °C denaturace, 15 sekund při 55 °C hybridizace 15 primerů a 1 minuty při 72 °C elongace [v termocykléru typu 2400 (Perkin-Elmer Cetus,
Norwalk, CT)J. Produkt PCR byl přečištěn pomocí soupravy QIAquick™ PCR Purifícation Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA) podle návodu výrobce. Přečištěný produkt PCR byl štěpen s enzymy Ndel a NindlII a poté byl izolován z gelu pomocí soupravy QLAquick™ Gel Extraction Kit (QUIGEN, Chatsworth, CA) podle návodu výrobce. Produkt PCR izolovaný z gelu byl ligo20 ván do vektoru pMAGll (WO 95/26746), jehož prostřednictvím byl transformací vnesen do buněk E. coZz FM 15 (ATCC 55765).
2. STNFR-12.6D/C105
Byla prováděna PCR amplifikace sTNFR-Ι 2.6D/C105 s použitím DNA plazmidu sTNFR-I 2.6D/C106, jako templátu, a s použitím následujících PCR primerů:
OLIGO#3: (SEQ ID NO:70)
5’-ACTCGA GGATCCGCGGATAAATAAGTAACGATCCGGTCCA-3';
OLIGO&4: (SEQ ID NO:71)
5'-CAGGTCGGATCCTATCÁGCAGAAGCACTGGAAAAGGTTTTC-3’ '‘
OLIGO#3 a OLIGO#4 obsahují BamHI místo a mutaci N(105)C následovanou terminačním kodonem. Primery jsou navrženy tak, aby úplné amplifikace matrice zajistila nové BamHI místo vhodné pro ligaci. PCR amplifíkační reakce probíhala ve 35 cyklech; prvních 10 cyklů se skládalo z 10 sekund při 92 °C denaturace, 30 sekund při 55 °C hybridizace primerů a 4 minut při 68 °C elongace; následovalo 25 cyklů, z nichž každý sestával z 10 sekund při 92 °C denaturace, '
30 sekund při 55 °C hybridizace primerů a 4 minut + 20 sekund při 68 °C elongace [v termocykléru typu 2400 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)]. Produkt PCR byl přečištěn z gelu pomocí soupravy QIAquick™ PCR Purifícation Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA) podle návodu výrobce a štěpen s enzymem BamHI, extrahován směsí fenol/chloroform a precipitován s ethanolem. Poté byl resuspendován, ligován do vektoru pAMGl 1 a vnesen transformací do. buněkE. coli FM 15.
-46ί * V5? ř* Γ -1 ’ 'T7W
3. STNFR-12.6D/N105 ?
Byl prováděna PCR amplifikace sTNFRI 2.6D/N105 s použitím DNA plazmidů sTNFR-I 5 2.6D/C106, jako templátu, a s použitím následujících PCR primerů: !
5' 0LIG0#5: (SEQ ID NO:72)
5'-GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3’
3' 0LIG0#6: (SEQ ID NO:73).
5'-CGCGGATCCCTATTAATTGAAGCACTGGAAAAGG-Ξ’
OLIGO#5 a OLIGO#6 obsahující místa Ndel a BamHI a hybridizují s 5' koncem (OLIGO#5) a 3' ío koncem (OLIGO#6) zkráceného genu. PCR amplifikační reakce probíhala ve 30 cyklech; každý cyklus se skládal ze 45 sekund při 95 °C denaturace, jedné minuty při 65 °C hybridizace primerů a dvou minut při 72 °C elongace [v termocykléru typu 2400 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)J.
PCR produkt byl přečištěn pomocí soupravy Wizard™ Clean-Up Systém (Promega, Madison, WI) dle návodu výrobce. Přečištěný PCR produkt byl štěpen s enzymy Ndel a BamHI, extra-, hován směsí fenol/chloroform a precipitován s ethanolem. Poté byl resuspendován, ligován do vektoru pAMGl 1 a vnesen transformací do buněk E. coli FM15.
Odborníci v oboru si jsou vědomi, že na základě popisu tohoto vynálezu mohou k expresi ve vhodné hostitelské buňce (např. E. coli a jiné bakterie) být použity nebo upraveny rozmanité genetické materiály a metody.
4. STNFR 2.3D/d 18; sTNFR-Ι 2.3D/d8 a sTNFR-Ι 2.3D/d 15
PCR amplifikace sTNFR-Ι 2.3D/dl8, sTNFR-Ι 2.3D/d8 a sTNFR-Ι 2.3D/dl5 byla po každé provedena s použitím DNA plazmidů 2.6DP/C106, jako templátu, a s použitím následujících PCR primerů:
PCR primery pro sTNFR-Ι 2.3D/d8: i
5’ OLIGO#7: (SEQ ID NO:74)
5‘-CCCCATATGTATATCCACCCTCAAAATÁAT-3’
3' OLIGO#8: (SEQ ID NO:75)
5'-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3’
PCR primery pro sTNFR-Ι 2.3D/dl5:
35 1 5' OLIGO#9: (SEQ ID NO:76) f
5’-CCCCATATGTCGATTAGCTGTACCAAGTGCCACAAAGG-31
3’ OLIGO#10: (SEQ ID NO:77)
5'-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3· ‘
I.
ř
PCR primery pro sTNFR-12.3 Ď/d 18:
5' OLIGO#11: (SEQ ID NO:78)
5’-CCCCATATGTGTACCAAGTGCCACAAAGGA-31
3’ OLIGO#12: (SEQ ID NO:79)
5'-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3'
Každý zprimerů OLIGO&7, OLIGO&9 a OLIGO&11 obsahuje místo Ndél a každý zprimerů C)LIGO#8, OLIGO#10 a OLIGO#12 obsahuje HindlII místo. PCR amplifikační reakce probíhala v 250 cyklech; každý cyklus se skládal ze 45 sekund při 95 °C denaturace, jedné minuty při 65 °C hybridizace primerů a dvou minut při 72 °C elongace [v termocykléru typu 2400 (PerkinElmer Cetus, Norwalk, CT)]. PCR produkty byly přečištěny pomocí soupravy Wizard™ Cleanío Up Systém (Promega, Medison, WI) dle návodu výrobce. Přečištěné PCR produkty byly štěpeny s enzymy Ndel a BamHI, estrahovány směsí fenol/chloroform a precipitovány s ethanolem. Poté byly resuspendovány, ligovány do pAMGl 1 a vneseny transformací do buněkE. coli FM15.
B. Produkce v E. coli:
Příprava malého množství čerstvého inokula vybraného rekombinantního kmene E. coli nesoucího požadovaný konstrukt sTNFR-Ι 2.6D/N105, sTNFR-Ι 2.6D/C105, sTNFR-Ι 2.6D/C106, sTNFR-Ι 2.3D/dl8, sTNFR-Ι 2.3D/d8 a s TNFR-12.3D/dl8 kultivací, byla započata přenesením celého obsahu zmražené glycerolové konzervy v zásobní ampuli (asi 1,5 ml) do 2 litrové nádoby, 20 která obsahuje 500 ml živné půdy Luria (LB). Bakteriální kultura byla inkubována při teplotě °C na rotační třepačce při 350 ot./min. Hustota kultury byla stanovována měřením absorbance při 660 nm (OD660). Inokulační kultura byla pěstována až do hustoty, kdy OD660 byla > 2,0. N tomto okamžiku bylo 125 ml kultury asepticky přeneseno do produkčního fermentoru o objemu 15 litrů, který obsahoval 10 litrů sterilního média.
Produkční médium a podmínky fermentace pro vlastní produkci popisuje jako komplexní médium a podmínky fermentace Sniff (1993), “A Chemicelly-Defíned Medium for the Overproduction of a Recombinat Protein in E. colF, thesis, Colorado Statě. University. Obecně, uvedený odkaz uvádí použití komplexního média obsahujícího hydrolyzát kaseinu, soli, glycerola prostře30 dek proti pěnění, které je sterilizováno ve fermentoru. Po ochlazení fermentoru na teplotu nižší než 40 °C jsou přidány stopové minerály a thiamin hydrochlorid, které byly předem sterilizovány filtrací.
Po ustálení teploty média na 37 °C bylo toto médium naočkováno inokulem Růst kultury byl 35 sledován měřením OD660. pH kultury bylo udržováno na hodnotě 6,0 automatickým přidáváním 5M hydroxidu sodného a 5M kyseliny chlorovodíkové, když se OD660 pohybovala v rozmezí hodnot 9,5 až 10,5, byla kultura indukována aseptickým přidáním sterilního izopropyl β-D thiogalaktopyranozidu (IPTG) do konečné koncentrace 0,50 mM. Kultura byla sklizena pro zastavení růstu.
Kultivační médium a podmínky růstu byly použity v podobě, kterou uvádí Sniff (1993), viz výše, s následujícími výjimkami: do média byl přidán síran amonný 2,0 g/1) a L-cystein hydrochlorid monohydrát (1,0 g/1), tetracyklin hydrochlorid byl vynechán, pH bylo udržováno na hodnotě 6,0 pomocí hydroxidu sodného a kyseliny chlorovodíkové, místo hodnoty 7,0 udržované pouze 45 hydroxidem sodný, teplota kultivace byla zvýšena na 37 °C, koncentrace induktoru byla zvýšena z 0,15 mM na 0,50 mM IPTG, a doby sklizně byla stanovena k zastavení růstu, nikoliv v závislosti na době, která uplynula od indukce.
-48CZ 296835 B6
Po ukončení fermentace byla bákteriální buňky sklizeny centrifugací v 500ml kyvetách. Buňky byly sedimentovány do pelety centrifugací při 10 000 ot./min. po dobu 30 minut. Kašovitá bakteriální peleta byla naředěna na hustotu 15 % pevných částic v lytickém pufru složeném z 50 mM Iris a 5 M EDTA, pH 8,0. Resuspendované buňky byly poté lyžovány trojnásobným protlačením suspenze homogenizátorem (APV Gaulin, lne., Everett, MA) při tlaku 57 MPa (8 000 psi). Homogenát byl pak centrifugován při 10 000 ot./min po dobu 30 minut pro získání inkluzních · tělísek (inclusion bodies, IBs). Inkluzní tělíska byla promyta resuspendováním v lytickém pufru a třetí centrifugací roztoku při 10 000 ot./min 30 minut. Po resuspendování IBs v deionizované vodě (v poměru 1:1) byla naposledy IBs centrifugována při 10 000 ot./min 30 minut, jako druhé promytí. Promytá inkluzní tělíska každého z proteinů tak byla připravena k rozpouštění, renaturaci a purifíkaci. Každá várka poskytla výtěžek přibližně 200-250 g IBs.
V jiném alternativním provedení může být zkrácený sTNFR-I připraven fermentací podle jiného postupu:
Příprava malého množství čerstvého inokula kultivací vybraného rekombinantního kmene E. coli nesoucího požadovaný konstrukt sTNFR-I 2.6D/N105 nebo sTNFR-I 2.6D/C106, byla zahájena přenesením celého obsahu zmražené glycerolové konzervy v zásobní ampuli (asi 1,5 ml) do 2:litrové nádoby, která obsahuje 500 ml média s obsahem 10 g/1 BBL kvasničného extraktu o pH 7,0. Kultura byla inkubována při teplotě 33 °C na rotační třepačce při 300 ot./min. Hustota kultury byla stanovována měřením absorbance při 600 nm (OD600). Inokulum bylo kultivováno až do hiustoty k hodnotě OD6oo>2,0. V tomto okamžiku bylo 80 ml kultury asepticky přeneseno do produkčního fermentoru o objemu 15 litrů, který obsahoval 7 litrů sterilního živného média.
Produkční fermentace využívá postup kontinuálního doplňování živin do média. Produkční médium je komplexní médium obsahující kvasničný extrakt, soli a prostředek proti pěnění, které je sterilizováno ve fermentoru. Po ochlazení fermentační nádoby na teplotu nižší než 40 °C jsou přidány stopové minerály, glukóza, síran horečnatý a hexametafosfát, sterilizované filtrací. Jsou používány dvě živiny, jedna je zdrojem uhlíku (glukózá/síran hořečnatý), druhou je kvasničný extrakt obsahující dusík.
Po ustálení teploty produkčního média na 33 °C bylo toto médium naočkováno inokulum. Růst kultury byl sledován měřením OD600, pH kultury bylo udržováno na hodnotě 7,0 automatickým přidáváním hydroxidu amonného a 48,7% kyseliny citrónové. Po dosažení hodnot OD60o v rozmezí 8,0 až 12,0 bylo zahájeno přidávání živiny I exponenciální rychlostí. Když se hodnoty OD600 vrozmezí 8,0 až 12,0 bylo zahájeno přidávání živiny I exponenciální rychlostí. Když se hodnoty OD60o nalézaly v rozmezí 30 až 40, začalo se s přidáváním živiny II konstantní rychlostí. Po dosažení hodnoty OD60o 67 až 83 byla kultura indukována aseptickým přidáním sterilního autoinduktoru (lakton homoserinu) do konečné koncentrace 0,6 mg/1. V okamžiku indukce byly rychlosti přidávání živin I a II změněny na konstantní. Kultura byla sklizena v čase 16D 2 hodiny po indukci.
Po ukončení fermentace byly buňky sklizeny centrifugací v 500ml kyvetách. Buňky byly sedimentovány do pelety centrifugací při 10 000 ot./min po dobu 30 minut. Kašovitá bakteriální peleta byla naředěna na hustotu 15 % pevných částic v lytickém pufru složeném z 50 mM Tris a 5 mM EDTA, pH 8,0. Resuspendované buňky byly poté lyžovány trojnásobným protlačením suspenze homogenizátorem (APV Gaulin, lne., Everett, MA) při tlaku 57 MPa (8000 psi). Centrifugací homogenátu při 10 000 ot./min 30 minut byla získána inkluzní tělíska (IBs). Inkluzní tělíska byla promyta resuspendováním v lytickém pufru a třetí centrifugací při 10 000 Ot./min 30 minut. IBs byla resuspendována v deionizované vodě (v poměru 1:1) a naposledy byla centrifugována při 10 000 ot./min po dobu 30 minut. Tento krok představuje druhé promytí. Promytá inkluzní tělíska každého z proteinů byla připravena k rozpouštění, renaturaci a purifíkaci.
CZ 296835 Β6
C. Rozpouštění/renaturace proteinů:
Promytá inkluzní tělíska z každé lOlitrové fermentace byla solubilizována v 80 ml solubilizač5 ního pufru (50 mM Tris, 8M močovina, 160 mM cystein, pH 9,5). Hodnoty pH solubilizační směsi byla nastavena na 9,5 pomocí ION NaOH a směs byla míchána při teplotě místnosti 2-3 hodiny. Každá várka poskytla výtěžek zhruba 200-250 g IBs.
Jednotlivé solubilizační směsi byly ředěny v poměru 1:20 s ledovým renaturační pufrem (50 mM ío Tris, 1, M močovina). Každý z konečných objemů byl přibližně 16 litr. Poté byla hodnota pH jednotlivých směsí upravena na 9,7 pomocí 6N HC1 a směsi byly zvolna míchány při 4 °C po dobu 2 až 3 dnů.
Poté bylo pH každé ze směsí nastaveno na hodnotu 5,0 pomocí ledové kyseliny octové a 6N HC1. 15 Vkaždé ze směsí se vytvářel precipitát, který byl odstraněn centrifugací při 10 000 x g na centrifuze Beckman Model J2-HS. Získaný materiál byl filtrován na filtru o pórech 5 pm a 0,22 pm.
I). Purifikace
Proteinový materiál po renaturaci byl připraven pro purifíkaci na sefarózovém sloupci IX-1 SPSepharose Big Bead™ (Pharmacia Biotech, lne., Piscataway, NJ).
Kolona IX-1 SP-Sepharose Big Bead™ (4,4 cm x 20 cm)
Pufr A Pufr B mM octan 25 mM octan mM NaCl 375 mM NaCl pH 5,0 pH 5,0.
Před nanesením renaturovaného materiálu byla každá kolona ekvilibrována se 4 až 5 objemy kolony pufrem A. Materiál z jednotlivých várek byl odděleně nanášen na kolony k přečištění. Na každou kolonu bylo naneseno maximálně 12 g proteinu na litr pryskyřice. Pak byla každá kolona promyta se 3 až 4 objemy kolony pufrem A (dokud se hodnota UV absorbance nevrátila k základní úrovni). Proteiny byly eluovány pomocí lineárně rostoucího gradientu soli v rozmezí 35 50 až 375 mM NaCl v celkovém rozsahu 8 objemů kolony. Celá bílkovinná frakce pro každé provedení byla sbírána dohromady. Jímání každé proteinové frakce na koloně začalo, když UV absorbance vzrostla přibližně na 20 % maxima píku. Sběr eluátu byl zastaven v případě dosažení hodnot 50 % maxima UV absorbance, anebo pokud absorbance přestala klesat.
Rychlost průtoků:
7,5 objemů kolony/hod - ekvilibrace, promývání objemů kolony/hod - nanášení objemů kolony/hod - eluce
Veškerá purifikace na kolonách byla prováděna při 4 °C.
Spojené frakce z každé IX-I kolony byly připraveny k dalšímu přečištění na koloně Toyo Pearl™ Butyl 650M HIC column (Toso Haas, Phaladelphia, PA).
li li ' ' ' ’
CZ 296835 B6
ίί:
Kolona 300 ml - Toyo Pearl™ Butyl 650M (4,4 cm x 20 cm)
PufrA
20 mM NaPO4
1,8 M NaCl, Ph 6,0
Ředicí pufr mM NaPO4
PufrB
Milli Q H2O
M NaCl pH 6,0
Před nanesením spojené frakce z kolony IX-1 byla kolona ekvilibrována se 4 až 5 objemy kolony 10 pufru A. Spojené frakce z IX-1 byly naředěny v poměru 1:1 ředicím pufrem a pH bylo upraveno na hodnotu 6,0. Zředěná spojená frakce z IX-1 byla nanesena na kolonu. Na každou kolonu byla naneseno maximálně deset gramů proteinu na litr pryskyřice. Každá kolona byla promyta se 3 objemy kolony pufru. Proteiny byly z kolony eluovány pomocí lineárního klesajícího gradientu soli v rozmezí od 1,8 M NaCl až do H2O v celkovém rozsahu 8 objemů kolony. Jímání každé 15 bílkovinné frakce započalo, když UV absorbance vzrostla k 15 až 20% maxima. Sběr byl ukončen v případě dosažení hodnoty 50 % maxima UV absorbance, anebo pokud absorbance přestala klesat.
Rychlost průtoků:
objemů kolony/hod - ekvilibrace, naředění a promývání objemy kolony/jod - eluce
Veškerá purifíkace na kolonách byla prováděna při teplotě místnosti.
Každá spojená frakce z HIC byla připravená pro zahuštění/diafiltraci.
2'ahuštění/diafíltrace (Concentration/diafíltration, C/D)
V kroku C/D byla užita 1 čtvereční stopa (30,5 cm x 30,5 cm) regenerované celulózové (mol. hmotn., 5000) membrány PLLCTM (Milli-Pore, Bedford, MA). Každá spojená frakce z HIC kolony byla zahuštěna na objem asi 200 ml a potom byla diafiltrována proti 6 až 7 objemům 20mM NaPO4 o pH 6,0, dokud nebyla hodnota vodivosti < 4 mm/hod.
2'ahuštění/diafiltrace byla prováděna při teplotě místnosti.
Každý vzorek po C/D byl poté přípraven k přečištění na koloně IX-2-365 ml SP-Sepharose HP™ (Pharmacia Biotech, len., Piscataway, NJ).
Kolona IX-2-365 ml SP-Sepharose HP™ 5 cm x 18,5 cm)
Ekvilibrační pufr mM NaPO4 pH 6,0
PufrA mM NaPO4 pH 6,3 50 mM NaCl
PufrB mM NaPO4 pH 6,8
Před nanesením jednotlivých C/D vzorků byla každá kolona ekvilibrována se 4 objemy kolony ekvilibračního pufru. Každý C/D vzorek byl odděleně nanášen na kolonu tak, aby nanesené množství nepřesáhlo osm gram proteinu na litr pryskyřice. Pak byla každá kolona postupně promyta se 3 objemy kolony ekvilibračního pufru a se 3 objemy pufru A. Proteiny byly eluovány 50 pomocí lineárního gradientu pH v rozmezí 6,3 až 6,8 a gradientu soli v rozmezí 0 až 50 mM
NaCl (pufr B) v celkovém rozsahu 8 objemů kolony. Sběr frakcí započal při hodnotě OD 1,0 na počátku a končil při dosažení 50 % maxima na konci.
Zakráčený sTNFR-I může být solubilizován, renaturován a přečištěn i jiným způsobem, jehož popis následuje.
C. l Rozpouštění/Renaturace proteinů:
Promytá inkluzní tělíska (IBs) jsou rozpuštěna v roztoku o složení 8 M močovina, 60 mM Tris, 100 mM cystein tak, aby výsledná koncentrace roztoku byla 6,5 M močovina, 50 mM Tris a80mM cystain, pH 9,5 a 5 - 10 mg/ml zkráceného sTNFR-I. (Koncentrace sTNFR-I je stanovena na základě množství sTNFR-I v promytých IBs v g/1). Roztok se míchán při teplotě místnosti 90 minut a poté jsou proteiny renaturovány zředěním 1:10 v ledovém (4 °C - 8 °C) pufru o složení 0,85 M močovina, 50 mM Tris, pH 9,8 (pH je měřeno při teplotě 4 °C - 8 °C).
Roztok, ve kterém probíhá renaturace, je míchám 24 až 72 hodin při 4 °C až 8 °C. Ke konci této doby je přidána ledová kyselina octová (~ 20 mM) pHje upraveno na 5,0. Vytvořená sraženina je odstraněna centrifugací a supematant je uchován pro nanesení na první kolonu.
D. l Purifikace
P’o precipitaci kyselinou byl projasněný spojený vzorek supematantu nanesen na kolonu SPSepharose Big Bead™ (Pharmacia Biotech, lne., Piscataway, NJ), která byla ekvilibrována pufrem o složení 20 mM octan sodný, 75 mM NaCl, pH 5,0. Vzorek byl nanesen na kolonu v množství nepřesahujícím 15 g zkráceného sTNFR-I na litr objemu náplně. Po nanesení byla kolona promyta se 3 objemy kolony 20 mM octanu sodného, 75 mM NaCl, pH 5,0 a eluována s lineárním gradientem (9 objemů kolony) V rozmezí 75 mM až 450 mM NaCl ve 20mM octanu sodném, pH 5,0. Krok na koloně SP-Sepharose Big Bead™ (SP-BB) byl prováděn při teplotě 4 °C až 8 °C.
Spojené frakce z kolony SP-BB byly naředěny v poměru 1:1 ve 2 M NaCl, 60 mM octanu, pH
4,5 a pokud to bylo nutné, bylo pH upraveno na hodnotu 4,5. Spojená frakce z kolony SP-BB tyla nanesena na kolonu Toyopearl™ Butyl 650M (Toso Haas, Philadelphia, PA), která byla ekvilibrována s pufrem o složení 1 M NaCl, 30 mM octan, pH 4,5. Na kolonu byl nanesen zkrácený sTNFR-I v množství ~ 10 až 13 gramů na litr náplně kolony. Po nanesení vzorku byla kolona promyta se 3 objemy kolony pufru o složení 1 M NaCl, 30 mM octan, pH 4,5 a eluována s lineárním gradientem (8 objemů kolony) v rozmezí 1 M NaCl až 0 M NaCl ve 30mM octanu, pH4,5.
Purifikované frakce zkráceného sTNFR-I z kolony Butyl 650M byly spojeny, zředěny vodou v poměru 1:5 a naneseny na kolonu SP-Sepharose High Performance™ (SP-HP) (Pharmacia Biotech, lne., Piscataway, NJ), která byla ekvilibrována s 30mM octanem, pH 4,5 (naneseno ne více než ~ 15 g/1 objemu náplně). Kolona byla potom promyta se 3 objemy 30mM octanu, pH4,5. a: eluována s lineárním gradientem (12 objemů kolony) v rozmezí 100 mM až 400 mM NaCl 3' 30 mM octanu, pH 4,5. Purifikované frakce zkráceného sTNFR-i byly spojeny a hodnota pH upravena na 5,0 pomocí NaOH.
C. PEGylace:
1. Příprava sTNFR-12.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa)
Do chlazeného (4 °C) roztoku sTNFR-R2.6D/NI05 (3,5 mg/ml) v 50mM octanu sodném, pH 4 byl za stálého míchání přidán trojnásobný molární nadbytek t-BuPEG (mono-t-butoxy-polyethylenglykol o průměrné molekulové hmotnosti 33 kDa, Shearwater Polymers, lne.). Pak byl přidán NaCNBH3 do výsledné koncentrace 20 mM a reakční směs byla míchána 18 až 24 hodin při 7 °C.
CZ 296835 Β6
Rozsah modifikace proteinu v průběhu reakce byl sledován pomocí, SEC HPLC kolony TSKG3000swxl (Toso Haas, Montgomeryville, PA) vymývané s fosfátovým pufrem o složení 0,1 M fosforečnan sodný pH 6,9, 0,5 M NaCl a 10% ethanol rychlostí 0,7 ml/min (Toso Haas, Montgomeryville, PA).
pH reakční směsi bylo upraveno na hodnotu přibližně 3,5 pomocí 1M HC1 a reakční směs byla zředěna vodou na výslednou koncentraci 1,5 mg/ml.
sTNFR-Ι 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) byl oddělen od přebytku t-BuPEG a jiných vedlejších io produktů iontoměničovou chromatografii na SP Sepharose HP 16/10™ (Pharmacia Biotech, lne.,
Piscataway, NJ).
Reakční směs byla nanesena na kolonu a nezreagovaný t-BuPEG byl vymyt se 3 objemy kolony startovacího pufru A (20 mM octan sodný, pH 4,0). sTNFR-Ι 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) byl 15 eluován s lineárním gradientem (20 objemů kolony) v rozmezí 0 až 30 % pufru Β (1 M NaCl ve
2:20 mM octanu, pH 4,0). Eluát byl měřen při 280 nm. Každá frakce' obsahující sTNFR-I 2:.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) byla analyzována pomocí SDS-PAGE na komerčně připravených gradientových 4- 20% gelech (Novex, San Diego, CA). Frakce byly spojeny podle výsledků SDS-PAGE, zahuštěny a sterilně zfiltrovány. Všechny spojené frakce přečištěného sTNFR-I 20 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) byly opět analyzovány pomocí SDS-PAGE a SEC HPLC.
Protein je převeden do roztoku lOmM fosforečnanu sodného, pH 6, a 20mM NaCl.
2. Příprava sINFR-12.6D/N105-33 kDa (MePEG)
Do chlazeného (7 °C) a míchaného roztoku sTNFR-2.6D/N105 (4 mg/ml) byla přidávána kyselina octová, dokud pH nedosáhlo hodnoty 5,0. K tomuto roztoku byl přidán 15 mM NaCNBH3 a dvojnásobný molární přebytek t-butoxy PEG (t-butoxy-polyethylenglykol) o průměrné molekulové hmotnosti 33 kDa, Schaerwater Polymers, lne.). Reakční směs byla při této teplot krátce zamíchána a potom ponechána inkubovat po dobu asi 18 hodin.
30
Po 18 hodinách byla reakční směs upravena na hodnotu pH 3,0 kyselinou citrónovou.
sTNFR-Ι 2.6D/N105-MePEG (33kDa) byl oddělen od přebytku MePEG a jiných vedlejších produktů iontovou chromatografíí na koloně SP Sepharose HP™ (Pharmacia Biotech, lne., Pisca35 taway, NJ).
Reakční směs byla nanesena na kolonu (maximálně 8 mg/ml polymeru) a nezreagovaný MePEG byl eluován se 3 objemy kolony startovacího pufru A (20 mM citronan sodný, pH 3,0). sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (33kDa) byl eluován lineárním gradientem (16 objemů kolony) v rozmezí 40 0,1 až 0,5 M NaCl ve 20mM citrátu, pH 3,0. Eluát byl měřen při 280 nm. Každá frakce obsahující sTNFR-Ι 2.6D/N105-MePEG (33kDa) byla analyzována pomocí SDS-PAGE na komerčně připravených gradientových 4-20% gelech (Novex, San Diego, CA). Frakce byly spojeny podle výsledků SDS-PAGE, zahuštěny a sterilně zfiltrovány. Všechny spojené frakce přečištěného sTNFR-Ι 2.6D/N105-MePEG (33kDa) byly opět analyzovány pomocí SDS-PAGE. Purifikova45 ný sTNFR-Ι 2.6D/N105-MePEG (33kDa) byl zahuštěn na 5 - 20 mg/ml a převeden do PBS, pH
6,5 (10 mM fosforečnan sodný, 35-100 mM NaCl), anebo do roztoku 20 mM octanu, lOOmM NaCl, pH 5,0.
3. Příprava sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(20kDa)
Postup kroku A přípravy sTNFR-Ι 2.6D/N105-MePEG (33kDa) byl v podstatě zopakován s tou výjimkou, že MePEG (mono-methoxy-polyethylenglykol o průměrné molekulové hmotnosti 33 kDa (Shearwater Polymers, lne.) byl nahrazen MePEGem (mono-methoxy-polyethylenglykolem o průměrné molekulové hmotnosti 20 kDá (Shearwater Polymers, lne.). Získaný protein byl 55 převeden do roztoku lOmM fosforečnanu sodného, pH 6,5 a 20mM NaCl.
-53CZ 296835 B6
4. Příprava dalších konjugátů ;
Další konjugáty sTNFR-2.6D/N105 byly připraveny v podstatě shodně jako sTNFR-I 1
2.6D/N105-MePEG (33kDa) s tou výjimkou, že byly použity následující typy PEG aldehydů (Shearwater Polymers, lne.): : i lineární monofunkční - mol. hmotn. 5 kDa, 6 kDa a 57 kDa, rozvětvený monofunkční-mol. hmotn. 10 kDa, 20 kDa a 40 kDa, ίο lineární bifunkční - mol. hmotn. 8 kDa a 20 kDa, rozvětvený trifunkční - mol. hmotn. 10 kDa.
Žoskané proteiny byl převedeny do roztoku lOmM fosforečnanu sodného, pH 6,5 a 20mM NaCl.
5. Jiné způsoby pegyláce
Ž^krácené molekuly sTNFR-I mohou být pegylovány a purifikovány také jinými způsoby:
Eluát z kolony SP-HP (3-5 mg/ml, pH upraveno na 5,0) reaguje se 2 mpl polyethylenglykolu (např. MePEG anebo t-BuPEG) na jeden mol sTNFR-I 2.6D/N105 (~ 5 gramů t-BuPEG na gram s TNFR-I 2.6D/N105). Po rozpuštění polyethylenglykolu je přidáno 10 - 20 mM kyanoborohydridu a roztok je inkubován přes noc při 7 °C - 15 °C. Po skončení pegyláce (~ za 18 hodin) je reakce ukončena přidáním 10 mM glycinu.
Pegylační směs je zředěna se 4 objemy 50mM octanu, pH 4,0, a jestliže je třeba, je konečné pH je upraveno na hodnotu 4,0. Směs je nanesena na kolonu SP-HP ekvilibrovanou s 50mM octanem, pH 4,0. Na kolonu je naneseno maximálně 8 gram sTNFR-2.6D/N105 na litr objemu náplně. Poté je kolona promyta se 3 objemy kolony ekvilibračního pufru a eluována lineárním gradientem 0 až 0,3 mM NaCl v 50mM octanu, pH 4,0. Monopegylované frakce sTNFR-2.6D/N10530 3 0kDa jsou sbírány, pH upraveny na hodnotu 5,0, a frakce jsou dále zahuštěny a diafiltrovány do izotonického pufru. Všechny purifíkační kroky jsou prováděny při teplotě místnosti. Protein je > převeden buď do PBS, pH 6,5 (10 mM fosforečnan sodný, 35-100 mM NaCl), nebo do roztoku 20mM octanu, lOOmM NaCl, pH 5,0.
6. Příprava sTNFR-I 2.6D/C105 „dumbbell“ a sTNFR-I 6D/C106 „dumbbel“ 1
Polyethylenglykol aktivovaný sulfonovou skupinou (připravený a přečištěný podle US patentové přihlášky č. 08/473, 809, podané 7. červena 1995 a US patentové přihlášky č. 08/611,918, podané
6. března 1996) [PEG 20 OOO-to-vinylsulfon] byl použit k dimerizaci proteinů v podstatě podle metody popsané v PCT publikované přihlášce WO 95/34326, s výjimkou redukčních a reakčních podmínek. Před připojením k polyethylenglykolu byly proteiny redukovány se 4 mol DTT na jeden mol proteinu při teplotě 5 až 9 °C, pH 7,6. Všechny reakce probíhaly v přítomnosti 30% glycerolu. Dimerizovaný protein se nazývá sTNFR-I 2.6D/C105db a sTNFR-I 2.6D/C106db. Každý protein byl převeden do PBS, pH 6,5 ’(10mM fosforečnan sodný, 35-100 mM NaCl), nebo do roztoku 20mM octanu, lOOmM NaCl, pH 5,0.
7. Příprava srovnávacích molekul sTNFR-I (i). sTNFR-I 4D/N105 byl připraven podle popisu vEP 422339. sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33kDa) byl připraven pegylací sTNFR-I 4D/N105 v podstatě podle postupu uvedeného výše pro pegylaci sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa). sTNFR-I 4D/N105-t-MePEG (33kDa) byl připraven pegylací sTNFR-I 4D/N105 v podstatě podle postupu uvedeného výše pro pegylaci sTNFR-I 2.6D/N105-t-MePEG (33kDa). Příprava sTNFR-I 4D/C1O5 a sTNFR-I 4D/C105db je ,
-54ΐ'τιβ.'ΡΓ'? r ' Ί! · '..·' > ' ' ;í $ ' $
J CZ 296835 B6 popsána v PCT publikované přihlášce WO 95/34326. Získané proteiny byly rozpuštěny v roztoku lOmM fosforečnanu sodného, pH 6,5 a 20mM NaCl.
(ii). sTNFR-Ι 4D/C105-33kDa (MePEG) byl připraven pegylací 4D/C105 v podstatě podle 5 postupu uvedeného výše pro pegylací sTNFR-Ι 2.6D/C105-33kDa (MePEG) s touto výjimkou:1 reakce probíhala při pH 7,5 s 1,3 mól DTT na mol s TNFR-I přibližně 5 až 6 hodin, poté násle- doválo odstranění DTT na koloně SP-Sepharose™ FF a pegylace s 1,5 až 3 mol PEGu na mol proteinu po dobu nejméně 15 hodin při teplotě místnosti. Získaný protein byl rozpuštěn buď v PBS, pH 6,5 (10 mM fosforečnan sodný, 35-100 mM NaCl), nebo ve 20mM octanu, lOOmM io NaCl, pH 5,0.
(liii). sTNFR-Ι 3D/N105 (sTNFR-Ι 4D/N105 zkrácený o 34 aminokyselin na C konci) byl připraven následujícím způsobem. PCR amplifíkace byla provedena s sTNFR-Ι 4D/N105 jako templátem a s primery OLIGO#13 (nese Ndel místo, hybridizuje s 5' koncem zkráceného genu) 15 a OLIGO#14 (nese HindXl místo, hybridizuje s 3' koncem zkráceného genu). PCR amplifikační reakce probíhala ve 25 cyklech; každý cyklus se skládal ze 30 sekund při 94 °C denaturace, 15 sekund při 60 °C hybridizace příměrů a 1 minuty při 72 °C polymerace [termocyklér typ 2400 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)]. PCR produkt byl přečištěn pomocí soupravy QIAquick™ PCR Purification Kit (QIAGEn, Chatworth, CA). Přečištěný PCR produkt byl štěpen s enzymy 20 Ndél a HindYS. a poté byl izolován z gelu pomocí soupravy QIAquick™ Gel Extraction Kit > (QIAGEn, Chatsworth, CA). PCR produkt izolovaný z gelu byl ligován do vektoru pAMGll a vnesen transformací do buněkE. coli FM 15.
5’ OLIGO#13: (SEQ ID N0:80)
5·-GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3’
3’ OLIGOA14 (SEQ ID NO:81) ’ -CCCAAGCTTTTAGGTGCACACGGTGTTCTGTTT-3'
Získaný protein byl rozpuštěn v lOmM fosforečnanu sodném, pH 6,5 a 20mM NaCl.
(iv) . sTNFR-Ι 3D/C105 (sTNFR-Ι 4D/C105 zkrácený o 34 aminokyselin na C konci) byl připraven shodně jako sTNFR-Ι 3D/N105, jako templátu byl však použit sTNFR-Ι 4D/C105.
sTNFR-Ι 3D/C105 byl rozpuštěn buď v PBS, pH 6,5 (10 mM fosforečnan sodný, 35-100 mM NaCl), nebo ve 20 mM octanu, 100 mM NaCl, pH 5,0.
(v) . sTNFRI 3D/C105db byl připraven podobně jako sTNFR-Ι 4D/C105db, jako výchozí látka byl však použit sTNFR—I 3D/C105 namísto sTNFR—I 4D/C105. sTNFR—I 3D/C105db byl rozpuštěn buď v PBS, pH 6,5 (10 mM fosforečnan sodný, 35-100 mM NaCl), nebo ve 20 mM octanu, 100 mM NaCl, pH 5,0.
Příklad II '
U různých forem zkráceného rekombinantního rozpustného TNFR-I byla stanovována schopnost inhibovat aktivitu TNF.
A. WEHI cytotoxický test:
Test WEHI je založen na proliferaci buněk in vitro (Edwards et al. (1991), Endocrinology, 128:989-996). Buněčné linie jsou citlivé k TNF-α (tzn., že TNF-oc je cytotoxický). V přítomnosti inhibitoru TNF-α jsou buňky chráněny před cytotoxickým účinkem a jsou proto schopny proliferace.
Protokol:
Eluňky WEHI 164, klon 13, které jsou citlivé kTNF (ATCC, Rockville, MD), byly suspendovány 5 v koncentraci 20 x 104 buněk/ml v RPMI médiu (Gibco, Grand Island, NY) doplněném 5% fekálním hovězím sérem (Fetal Calf Sérum, Hyclone, Ogden, UT) a penicilinem se streptomycinem v poměru penicilín 50 U/ml:streptomycin 50 mg/ml. Sto mikrolitrů této buněčné suspenze bylo naneseno do každé z jamek 96místné mikrotitrační destičky s plochým dnem a buňky byly ponechány adherovat po dobu 4 až 6 hodin při 37 °C v 5% CO2. Do každé jamky bylo přidáno ío 10 μΐ aktinomycinu D v koncentraci 0,0060 mg/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Deset mikrolitrů rekombinantního lidského TNF-α o koncentraci 50 ng/ml (konečná koncentrace 5 ng/ml) bylo přidáno do každé jamky. Dvojková ředicí řada různých forem sTNFR (sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR-I 4D/C105 a sTNFR-I 4D/C105db) byla naředěna v PBS a z tohoto ředění bylo dvojmo do jamek přidáno ΙΟμΙ/jamku, obsahující adherované buňky linie WEHI 164, 15 k nimž byl již dříve přidán rekombinantní lidský TNF-α. Buňky WEHI 164, klon 13 byly inkubovány po dobu 18 hodin při 37 °C v 5% CO2. Po skončení inkubace bylo přidáno 10 ml roztoku (2 mg/ml) organického barviva, jímž byl MTT tetrazolium (3-[4,5-diomethylthiazol-2-yl]2,5difenyl tetrazolium bromid; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a buňky byly solubilizovány přidáním 50 μΐ roztoku DMF/SDS (20 % SDS a 50 % Ν,Ν-dimethylformamid, pH 4,7). Roztok 20 DMF/SDS byl promícháván několikerým nabráním a vypuštěním do a ze špičky pipety, dokud nebyly všechny krystalky MTT rozpuštěny a buňky byly dále inkubovány po dobu 2 až 22 hodin.
Hodnoty absorbance (abs) byly měřeny na čtecím zařízení Vmax při 570 m. Procento specifické cytotoxicity bylo vypočítáno z hodnot optických denzit podle vzorce:
% specifické cytotoxicity = 100% x [abs (buňky + médium) - abs (buňky + vzorek)] / [abs (buňky + médium) - abs (buňky + TX-100)].
Počet jednotek TNF v každém vzorku byl určen pomocí procentuální specifické cytotoxicity vzhledem k myším standardům tak, jak bylo popsáno dříve.
Výsledky WEHI testu jsou shrnuty níže v tabulce 2:
TABULKA 2: In vitro aktivita v testu WEHI
Sloučenina IC5o (ng/ml)
STNFR--1 208
2.6D/C106
sTNE’R-1 238
4D/C105
STNFR-I N/A
4D/C105db
Na základě výsledku testu WEHI nebyly zjištěny žádné významné rozdíly v biologické účinnosti in vitro mezi sTNFR-I 2.6D/C106 a sTNFR-I 4D/C105.
13. L929 cytotoxický test:
L929 cytotoxický test je založen na proliferaci buněk in vitro (Parmely et al. (1993), J. Immunol.,
151:389-396), a stanovuje rovněž vytotoxicitu na základě citlivosti buněk kTNF-α vedoucí
k jejich zabíjení. Buněčné linie jsou citlivé na TNF-α (tzn., že TNF-a je pro ně cytotoxický). V přítomnosti rozpustného inhibitoru TNF-a jsou buňky chráněny před cytotoxickým účinkem TNF-a, a jsou proto schopné proliferace.
Protokol:
Buněčná linie L929 byla získána z Američan Type Culture Collection (Catalog number CCL 1, NCTC klon 929, klon kmene L, pojivová tkáň, myš). K pomnožení buněk bylo použito RPMI Medium 1640 doplněné 10% FBS (fetální hovězí sérum) + 1% roztok L-glutaminu + 1% roztok 10 penicilin-streptomycinu.
Test byl prováděn v 96místných mikrotitračních destičkách (Coming) tak, že bylo použito pouze [ 60 vnitřních jamek. Testované a standardní vzorky byly testovány trojmo na téže destičce.
INF-α použitý v testu pochází od R&D Systems (Minneapolis, MN). Ve všech pokusných i jamkách byla konečná koncentrace TNF-α 1 ng/ml.
[ Jako ředidlo bylo v testu používáno růstové médium pro L929, obsahující 10 ng/ml TNF-α a
10pg/ml aktinomycinu D (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Destičky byly sklizeny pomocí 20 roztoku XTT/MEN (1,5 mg/ml XTT + 75 mM MEN).
I První den byly buňky vysety na pokusné destičky. Buněčná suspenze byla připravena trypsinizací
I a resuspendováním buněk do koncentrace 3,33 x 104 buněk/ml. Do každé z vnitřních 60 jamek
I pokusné destičky bylo vyseto 180 ml této buněčné suspenze. 200 ml růstového média bylo roz25 místěno ve vnějších 36 jamkách, aby byly vyloučeny chyby pokusu způsobené odpařováním.
ΐ Destičky, přikryté fólií a chráněné před průvanem, byly ponechány při teplotě místnosti asi jednu i hodinu. Poté byly umístěny do inkubátoru s vysokou vlhkostí, při teplotě 37 ± 2 °C, a v 5 ± 1% i CO2. Destičky byly inkubovány po dobu přibližně 20 až 22 hodin, poté byl přidán sTNFR-I v různém ředění.
i Druhý den byl připraven standard sTNFR-I 4D/N105 a pokusné vzorky tímto způsobem: standard s TNFR-I 4D/N105 a pokusné vzorky byly zředěny na koncentraci přibližně 2,0 mg/ml (anebo na jinou vhodnou koncentraci). Byla provedena postupná ředění této koncentrace tak, aby vznikla ředicí křivka o 10 bodech sahající od hodnoty přibližně 1,0 x 106 ng/ml k 1,0 x 10‘3 35 ng/ml, včetně hodnoty 0 ng/mL (pouze testovací ředidlo). Mohou být použity i jiné vhodné koncentrace. Trojmo na každou testovací destičku bylo naneseno 1 000 μΐ z každého ředění. Poté byly destičky inkubovány v inkubátoru s vysokou vlhkosti při teplotě 37 ± 2 °C, a v 5 ± 1% CO2 po dobu 20 E 1 hodina.
Třetí den byl přidáno 50 μΐ na jamku roztoku XTT/MEN do 60 vnitřních jamek testovacích destiček. Destičky byly inkubovány v inkubátoru s vysokou vlhkostí při teplotě 37 ± 2 °C, a v 5 ± 1% CO2 (Falcon, New York, New York) po dobu 24 ± 0,5 hodina.
Čtvrtý den byly stanoveny hodnoty optické hustoty (OD) pokusných destiček při 450 nm minus 45 6 50 nm na čtecím zařízení ELISA (SpectraMAX, Beckman Instruments, lne., Fullerton, CA).
Pokud byla pro jamky na destičce při těchto vlnových délkách získána hodnota OD 4000, musela být destička ihned znovu odečtena při 490 nm minus 650 nm, a tyto údaje byly použity pro výpočet.
Standardní logaritmická křivka závislosti odpovědi na dávce byla stanovena pomocí čtyřparai metrové logistické aproximace. Původní koncentrace neznámých vzorků byly vypočítány ze standardní křivky, pro standard byla vypočtena hodnota ED50 a korelační koeficient byl vypočten ze standardní křivky.
-57CZ 296835 B6
Výsledky:
Výsledky L929 cytotoxického testu jsou shrnuty v tabulce 3.
TABULKA 3: In vitro aktivita v L929 cytotoxickém testu
Sloučenina Koncentrace (mg/ml) EDSo (ng/ml)
sTNFR-I 4D/C105db 7,8 1,0 ± 0,1
sTNFR-I 2.6D/C105db 2, 6 1,1 ± o,c
sTNFR-I 2.D/C106db 2,2 1,0 ± 0,1 ;
sTNFR-I 4D/N105-t- -BuPEG(33kDa) 2,0 229,2 ±8 j 1
STNFR-I 4D/C105-t- -BuPEG(33kDa) 1,1 325,5 ± 147
STNFR-I 2.6D/C105- t-BuPEG(33kDa) 210,2 ± 9
Vnitřní standard sTNFR-I 4D/C1O5 3,5 314,8 ± 188,1
10
Údaje naznačují, že sTNFR-14D/C105db, sTNFR-12.6D/C105db a sTNFR-12.6D/C106db jsou aktivní a mají srovnatelnou odpověď na délku v porovnání se standardem. Dále z těchto údajů plyne, že sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33kDa), sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG (33kDa) a sTNFR-I 2.6D/C105-t-BuPEG (33kDa) mají téměř o dva řády nižší aktivitu, nicméně jsou ještě v tomto testu aktivní v porovnání s sTNFR-I 4D/C105db.
Pokus #2 i
i i
sTNFR-I 3D/C105db 0,2 2,2 ± 0,3
sTNFR-I 3D/C105db 0,2 2, 0*
sTNFR-I 3D/C105db 1,9 1, 8*
sTNFR-I 3D/N105 2,4 413,3*
Vnitřní standard: sTNFR-I 4D/C105 3,5 115,9 ±. 42,1
* Hodnota založená na jediném výsledku
Tyto údaje naznačují, že sTNFR-I 3D/C105db je aktivní a hodnoty EDS0 jsou v rozmezí hodnot charakterizujících sTNFR-I 4D/C105db (pokus #1), sTNFR-I 2.6D/C105db (pokus #1) a sTNFR-I 2.6D/C106db (pokus #1). Výsledky rovněž ukazují, že sTNFR-I 3D/N105 je méně i aktivní něž vnitřní standard sTNFR-I 4D/C105.
C. Reaktivační modelový pokus založený na indukci buněčnou stěnou streptokoka:
Reaktivační modelový pokus artritidy indukované buněčnou stěnou streptokoka u krys byl proveden podle známých protokolů (Esser et al. (1985), Arthritis And Rheumatism, 28:1402-1411 10 a Makarov et al. (1996), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 93:402-406).
Protokol:
1 Samice krys Lewis (Charle River Laboratories, lne., Wilmington, MA), každá o váze 175 až
185 gramů, byly intraartikulámě injikovány do kloubu na pravém kotníku se suspenzí preparátu buněčné stěny streptokoka, obsahujícím peptidoglykan-polysacharid (SCW) (Lee Laboratory, Grayson, GA) v dávce 1,5 mg/10 mg na kloub. Fyziologický roztok byl injikován do kontralatei rálního kloubu jako kontrola. Intraartikulámí injekce SCW způsobuje akutní artritidu relativně liátkého trvání s otokem kloubu, která vrcholí jeden až dva dny po injekci. Po dvaceti dnech, 20 během nichž dozní akutní zánětlivá odpověď, byl opět podán SCW, a to intravenózní injekcí | v dávce 200 mg/200 ml na krysu. Druhá dávka je postačující k reaktivaci zánětu v tomto kotníkoi vém kloubu, do kterého byl předtím injikován SCW, avšak má malý účinek na kotník injikovaný fyziologickým roztokem. Rozsah zánětu během 72 hodin po nitrožilní injekci SCW byl stanoven měřením zadního kotníkového kloubu pomocí kotníkového kaliperu v časech 0, 24, 36, 48 a 72 25 hodin po reaktivaci artritidy, poté byl zadní kontralaterální kloub odebrán pro histologické vyšetření (např. zánět, vytvoření pannusu, poškození chrupavky a kosti.).
Výsledky:
Byly testovány účinky podání sTNFR-I 2.6D/C106db na vývoj kloubního otoku během reakti1 vace artritidy. Každý z inhibitorů a slepý vzorek byly podány v jedné intravenózní injekci i 24 hodin před reaktivací pomocí SCW.
! sTNFR-I 2.6D/C106db vykazoval statisticky významnou účinnost v redukci otoku kloubu, pro35 kázanou analýzou rozptylu (ANOVA) ve „Fischerově post-hoc testu“ (Statvier®), ve všech ! čtyřech dávkách podaných dva nebo tři dny po reaktivaci a ve všech dávkách s výjimkou jedné i (1,5 mg/kg) podaných první den. Tato redukce otoku je srovnatelná s pozitivní kontrolu sTNFR| 4D/C105db, podávanou denně v dávce 0,5 mg/kg (např. 8,8 mM) v časovém rozmezí od prvního | dne před reaktivací do třetího dne po reaktivaci. Preparáty sTNFR vykazovaly také významnou účinnost, pokud hodnotíme rozsah otoku jako celek v průběhu tří dnů. Plocha vymezená křivkou i (AUC) má charakter závislosti odpovědi na dávce při všech dávkách (viz obrázek 9, sTNFR-I : 2.6/C 106db je označen „sTNFR-Ι 2.6D“ a sTNFR-Ι 4D/C105db je označen „sTNFR-Ι 4D“).
sTNFR-Ι 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) vykazoval významnou redukci v šířce kloubu a 45 histologických indexech ve srovnání s kontrolní skupinou v pokusu modelujícím onemocnění.
i i D. Modelový pokus s použitím
D-galaktosamin/lipopolysacharidu:
D-galaktosamin (D-GalNH2)/lipopolysacharidový (LPS) model (Parmely et al. (1993), viz výše) i je modelový pokus in vivo, založený na zvířecí letalitě vysoce závislé na TNF-α. Kromě toho j u autoimunních myší MRL-lpr/lpr byla prokázána extrémní citlivost k LPS- nebo SEB-indukovanému TNF-α (Mountz et al. (1995), J. Immunol., 155:4829-4837).
' <? · «
Protokol:
U 6-8 týdnů starých myších samic (MRL-lpr/lpr) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) byla po hladovění přes noc i.p. injekcí vyvolaná reakce na následující farmakologické preparáty: 25 mg 5 D-GalNH2 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) suspendovaný vHanksově balancovaném solném roztoku (Gibco Laboratories, lne., Grans Island, NY) (50 mg/ml); lipopolysacharid (LPS) z E. coli sérotypu 0127:B8 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ve sterilním, endotoxinu prostém, fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) (25mg/myš), anebo SEB (Toxin Technologies, Sarata, FL) v běžném fyziologickém roztoku (50 mg/myš). Různé formy sTNFR ío byly podávány v postupném dvojnásobném ředění (dávka v mg/kg) tak, aby byla získána křivka
ED50 s využitím statistického softwaru od firmy Macintosh (Statwiew®, Mountain View, CA). Letalita byla sledována během 48 hodin po vyvolání reakce.
Výsledky:
Jak ukazuje tabulka 4 níže, jestliže byl sTNFR-I 2.6D/C106db podán tak, jak bylo výše popsáno, i 1 hodinu před podáním LPS/DGalNH2, byla hodnota ED50 (tj. dávka sTNFR-I 2.6D/C106db ' nutná pro 50% ochranu myši) v čase 48 hodin R 50 pg/kg (N = 8 myších jedinců). V porovnání s sTNFR-I 4D/C105db nebyly zjištěny žádné významné rozdíly (P > 0,05) ve schopnosti této 20 formy zabraňovat letalitě.
I : (ED5o = ~ 50 pg/kg; N = 8 myších jedinců).
| TABULKA. 4: Srovnání sTNFR a optimalizovaných forem sTNFR [ v modelovém pokuse LPS/D-GalNH2
Preparát EDjoo ED50
sTNFR-I 4D/C105db - 100 pg/kg ~ 50 pg/kg
sTNFR-I 2.6D/C106db ~ 100 pg/kg - 50 pg/kg
sTNFR-I 2.6D/N105-t- -BuPEG(33kDa) - 2 mg/kg -400 pg/kg
sTNFR-I 2.6D/N105- -MePEG(20kDá) - 800-1000 pg/kg - 1 mg/kg
STNFR-I 2.6D/N105- -MePEG (20kDa rozvětvený) 2 mg/kg - 1-1,5 mg/kg
sTNFR-I 2.6D/N105- -MePEG (40kDa rozvětvený) 1,5 mg/kg ~ 1 mg/kg
Uvedené údaje ukazují, že sTNFR—I 2.6D/C106db má stejnou aktivitu jako sTNFR—I 4D/C105db, avšak sTNFR-I 2.6D/N105-T-BuPEG (33kDa) je v tomto modelovém pokuse méně aktivní (hodnota ED50 je R400 pg/kg (n = 5 myších jedinců). Kromě toho byly sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (20 kDa rozvětvený) a 2.6D/N105-MePEG (40kDa rozvětvený) v tomto 30 pokuse méně účinné.
-60F-.:
i ' ,? *:>' ’ 1
E. Pokusný model artritidy indukované pomocí adjuvans:
Revmatoidní artritida indukovaná u krys pomocí adjuvans se v mnohém podobá revmatoidní artritidě u lidí. Účelem tohoto pokusu je demonstrovat, že systémové podání zkrácených forem 5 sTNFRs má zmírňující účinek na patogenezi artritidy vyvolané pomocí adjuvans u myší.
Protokol:
Samci krys Lewis (5-7 ve skupině) (Charles Laboratories, lne., Wilmington, MA) o váze nej10 méně 200 g byli kanylováni katétrem SQ a ponecháni zotavit se po dobu několika dnů. Potom byli umístěni do infuzních klecí a klimatizováni po dobu jednoho týdne před začátkem infuzí fyziologickým roztokem.
i V den 0 byly všechny krysy injikovány se 100 μΐ Freundova kompletního adjuvans (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO), ke kterému bylo přidáno syntetické adjuvans M,N-dioktyldecyldecyl-N',N-bis(2-hydroxy-ethyl)propandiamin, 50 mg/ml. Osmý den byla různým skupinám ' frys podávána SQ kontinuální infuze sTNFR-I 4D/C105 a sTNFR-I 2.6D/N105.
i
Výsledky j sou shrnuty v tabulce 5.
{ · TABULKA 5: Artritida indukovaná pomoci adjuvans
Sloučenina Dávka AUC% Hmotnost tlapky Zánět Res. kosti
(mg/kg/hod) (% inhib.) (% inhib.) Histopatologie (% inhib.) (% inhib.)
Pokus#1
sTNFR-I 5 61 46 37 89
4r.7C.tO5 1 49 45 26 855
0,2 33 40 14 34
sTNFP. I 1 55 53 33 i 1
2.6D/N105
Pokus#2 i -----------
sTNFR-I 5 42 ND 19 s/ ·
2.6D/N105 1 38 ND 13 4 9
Pokus#3
sTNFR-I 9 50 40 13 27
2.6D/N105·· 3 35 34 9 22
-MePEG(20kDa) 1 36 30 0 0
STNFR-I 9 43 37
2.6D/N105- 3 38 33
-MePEG(33kDa) 1 24 20
CZ 296835 Β6
Formy sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) a sTNFR-I 4D/C105db měly srovnatelnou antiartritickou aktivitu pro případ artritidy Vyvolané pomočí adjuvans u krys Lewis, ačkoliv sTNFRI 4D/C105db je účinnější v in vitro cytotoxických testech WEHI-164 a L929, stejně jako pokusném modelu LPS/GalN.
F. Model artritidy indukované kolagenem:
/Artritida indukovaná kolagenem typu II u krys v mnohém připomíná revmatoidní artritidu u lidí. Účelem tohoto pokusu bylo demonstrovat, že systémové podání zkrácených forem sTNFR má 10 zmirňující účinek na patogenezi artritidy vyvolané kolagenem typu II u krys a myší.
Protokol pro krysy:
j Krysím samicím Lewis (Charles River Laboratories, lne., Wilmington, MA) byly implantovány kanyly SQ, krysy byly přivyknuty na upoutání během kontinuální infuze. Poté byly imunizovány j bovinním kolagenem typu II ve Freundově kompletním adjuvans. 13., 14. nebo 15. den po imuni, zaci byla zvířata s rozvinutou artritidou náhodně rozdělena do skupin po osmi jedincích. Infuze i různých dávek sTNFR-Ι nebo slepého vzorku (vehikula) byla podávána pokusným skupinám po ' dobu sedmi dnů, jak je popsáno v tabulce 6. Zánět v tlapce byl hodnocen denním měřením kot20 níkových kloubů kaliperem. Sedmý den byla zvířata šetrně usmrcena a tlapky byl odebrány | k určení váhy, která slouží jako index zánětu. Kotníkové a kolenní klouby byly odebrány k histoi patologickému vyhodnocení parametrů artritidy.
i í Výsledky j sou uvedeny v tabulce 6A.
i TABULKA 6A: Artritida indukovaná kolagenem
Sloučenina Dávka AUCI Hmotnost tlapky Zánět Res. Kosti
(mg/kg/hod) (% inhib.) (% inhib.) Histopatologie (% inhib.) (% inhib.)
Pokus#1
STNFR-I 4D/C105 5 65 81 ND ND
1 35 34 ND ND
0,2 19 22 ND ND
STNFR-I 2.6D/N105 1 39 41 ND ND
Pokus#2 (mg/kg/hod)
sTNFR-I 2.6D/N105- MePEG(33kDa) 3 50 60 76 46
sTNFR-I 4D/N105- MePEG(33kDa) 3 47 50 ND ND
ιί
i Pokus#3 (mg/kq/hod)
i ...rtin--T 2. ÓL7N1 05- -HetEG v'*3kDa) 9 25 44 ND ND
sTHFR-· 1 2.6D/MI05- -M‘žPEGí33kDa) 3 25 37 ND ND
sTNFR-I 2.6D/N105- -MePEG(20kOa) 9 35 52 ND ND
‘ťTNFR-I 2.6D/N105- -MePEGlŽOkDa) 3 35 37 ND ND
Je. zajímavé, že v krysím modelu kolagenem indukované artritidy byly účinnost u všech léčených skupin téměř shodná (např. tvar křivky procento (%) inhibice plochy vymezené křivkou (AUC) bylo v rozmezí 30-59 %, inhibice hmotnosti tlapky se pohybovala v rozmezí 40-64 %). V tomto modelu artritidy byla skupina zvířat, která nebyla léčena, statisticky významně odlišná.
Protokol pro myši:
Samci DBA/1 (Jackson Laboratories, lne. Bar Harbor, ME) byli imunizováni bovinním kolagenem typu II (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ve Freundově nekompletním adjuvans. 24., 25. a 26. den po imunizaci byla zvířata s rozvinutou artritidou náhodně rozdělena do skupin po osmi zvířatech. Jedincům v pokusných skupinách byl dvakrát denně i.p. cestou podáván buď 15 fyziologický roztok, anebo sTNFR-I 2.6 D/N105-mePEG(33kDa) po tři dny za sebou (dny +27, +28, +29). Zánět v tlapce byl hodnocen denním měřením kotníkových kloubů kaliperem. 34. den byla zvířata šetrně usmrcena a tlapky byly odebrány ke stanovení jejich hmotnosti, která slouží jako index zánětu. Kotníkové a kolenní klouby byly odebrány k histopatologickému vyhodnocení parametrů artritidy.
2'0
Výsledky jsou shrnuty v tabulce 6B.
-63CZ 296835 B6
TABULKA 6B: Áttřitida indukovaná kolagenem
Sloučenina Dávka AUC% Celkem
(mg/kg 2D) (% irihib.) Histopatologie (% inhib.)
Pokus#1
sTNFR-I 4Ď/C105db 3 49 39
Pokus#2
sTNFR-I 2.6D/N105- -MePEG(33kDa) 9 73 ND
sTNFR-1 2.6D/N105- -MePEG(33kDa) 3 75 ND
G. Krysí model produkce TNF-α indukované kontinuální infuzí LPS:
sTNFR-Ι 2.6D/C105db a sTNFR-i 2.6D/C106db, sTNFR-Ι 2.6D/N105 a sTNFR-Ι 4D/N105 byly i.v. jugulámě implatované pomocí Alzet™ minipumpy (Alza Corp., Palo Alto, CA), podle návodu výrobce, pro 48 hodinovou kontinuální infuzí (1 mg/kg). Hladiny TNF-α v séru měřené testem ELISA (Genzyme, Cambridge, MA) byly významně sníženy ve srovnání s kontrolami měřenými+2 hodiny po podání vysoké dávky LPS.
Příklad III: Imunologické testy
Imunogenicita různých forem zkráceného rekombinantního rozpustného TNFR-I byla stanovována v několika zvířecích modelech.
A. Hlodavci:
sTNFR-Ι 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) a sTNFR-Ι 4D/C105db byly subkutánně podány (4 mg/kg) v prvérň a pátém pokusném dnu krysích samicích Sprague Dawley (Charles Rivers Labs, Wilmington, MA) (n = 6 až 8 ve skupině). Retroorbitální vzorky krve byly odebírány týdně až do 21. dne od začátku pokusu. Ve vzorcích byla stanovena produkce protilátek IgM a IgG.
-64i
A · .
TABULKA 7: Imunogenicita ύ hlodavců
Čas [dny] 0,01 7 14 21
SKUPÍNA+ZVÍŘE Titr IgM Titr IgM Titr IgM Titr IgM ’
STNFR-I 2.6D/N105-
33kDaPEG
1 NEG 0 0 0
2 NEG 0 o ; 0
3 NEG 0 0 0
4 NEG 0 0 . p
6 NEG 0 0 0
sTNFR-I 2.6/N105- 0 0,00 0,00 0,00 f.
-t-BuPEG(33kDa) f
SEM 0 0,00 0,00 0,00
Kontrola
7 0 0 50 0
8 0 0 2.C 0
3 0 0 15 ž 0
9 0 0 - 0
10 0 « 0
11 0 0 -
12 0 0 - ·
13 0 0 -
Kontrola 0 0 62,5 6,3
SEM 0 ' « ’ 0 15,7 6,3
í·
-65CZ 296835 B6
Čas [dny] 0,01 7 14 21
SKUPINA+ZVÍŘE Titr IgG Titr IgG Titr IgG Titr IgG
STNFR-I 2.6D/N105-
-t-BuPEG(33kDa)
1 NEG NEG 0 0
2 ' NEG NEG 0 0
3 NEG. NEG 7
4 NEG NEG C -
6 NEG NEG 0
sTNFR-I 2.6D/N105- 0,00 0,00 0,00 0,00
-t-BuPEG (33kDa)
SEM 0,00 0,00 0,00 0, 00
Kontrola
7 NEG NEG 0 200
8 NEG NEG 0 200 ..
9 NEG NEG 0 0
10 NEG NEG 0 0
11 NEG NEG 200 400
12 NEG NEG 0 200
13 NEG NEG 200 800
14 NEG NEG 0 50
Kontrola 0 0 50 231,3
SEM 0 0 32,7 94,0
Z tabulky 7 je patrné, že sTNFR-I 4D/C105db, podaný subkutánně (SC) 1. a 5. den, poskytuje vyšší titry krysích anti-sTNFR-I IgG protilátek do 21. dne, než sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDA), který má téměř nulové titry protilátek. Podobné trendy imunogenicity byl pozorovány i v případe krys produkujících anti—sTNFR—I IgM protilátky do 21. dne. sTNFR—I 2.6D/N105—t— BuPEG (33 kDa) nevyvolával tvorbu krysích anti-sTNFR-I IgM protilátek do 21. dne.
B. Papio anubis'.
Předmětem části 1, fáze A v této studii bylo stanovení farmakokinetiky a imunogenicity sTNFRI 4D/C105db (0,2 mg/kg živé váhy [BW]), sTNFR-I 3D/C105db (0,2 mg/kg BW) a sTNFR-i 2.6D/C105db (0,2 mg/kg BQ), které byly i.v. dvakrát podány zdravému paviánovi ve 21 denním intervalu.
-66Ιό
I
I
CŽ 296835 B6
Část 1 studie byla rozdělena do dvou fází. Cílem fáze A bylo stanoveno farmakokinetiky a imunogenicity různých preparátů šTŇFR^I u zdravého paviánů v odpovědi na dvě injekce. Dvanáct paviánů bylo rozděleno do tří skupin. Jedinci z každé skupiny dostali v anestézii 0,2 mg/kg BW sTNFR-Ι 4D/C105db, sTNFR-Ι 3D/C105db nebo sTNFR-Ι 2.6D/C105db. Během jednoho pokusu byli studováni tři paviáni. Zvířata byla sledována podobu 21 dnů, potom obdržela druhou identickou i.v. injekci proteinu a byla studována po dalších 21 dnů. Farmakokinetika a imunogenicita byly stanovovány v níže uvedených intervalech.
Cílem fáze B této studie bylo určení účinnosti těchto preparátů na dobře prozkoumaném modelu letality způsobené TNF-α (Espat et al., J. Surg. Res., 59:153-158, 1995). U 16 zvířat rozdělených do skupin po 4 jedincích byla indukována letální E. coli bakteriémie podáním 5-10 x 1010cfu/kg živé váhy. Skupina, která dostala placebo byla porovnávána s paviány, kteří byli předem i.v. injikováni se sTNFR-Ι 4D/C105db (0,2 mg/kg živé váhy [BW]), sTNFR-I 3D/C105db (0,2 mg/kg BW) a sTNFR-Ι 2.6D/C105db (1 mg/kg BW).
N obou fázích studie 1 byli mladí, dospělí paviáni Papio anubis, samci i samice, (6-11 kg), (Biomedical Reseach Foundation, San Antonio, TX) ponecháni hladovět přes noc. Anestézie 2:vířat byla provedena ketaminem (10 mg/kg i.m.) a cefalika (povrchová žíla horní končiny) byla perkutánně kanýlována. Anestézie byla udržována prvotním podáním až 35 mg/kg pentobarbitalu sodného, pak následovaly opakované injekce 3-5 mg/kg/hod pentobarbitalu sodného. Elomí cesty dýchací byly zajištěny umístěním endotracheální trubice s manžetou a zvířata si uchovávala spontánní dýchání. Do femorální tepny byl perkutánně umístěn katétr umožňující opakovaný odběr arteriálních krevních vzorků, stejně jako nepřetržité sledování srdečního pulzu a středního arteriálního krevního tlaku s pomocí monitoru anestézie a srdeční činnosti Dataschope 2000 (Datascope, San Antonio, TX). Vzorky krve z arterie byly odebírány v intervalech, antikoagulovány s EDTA nebo heparinem a bezprostředně po odběru byly chlazeny na ledu. Frakce krevní plazmy byla oddělena centrifugací při 4 °C a uchovávána při -70 °C až do okamžiku analýzy. Vnitřní tělesná teplota zvířat byla sledována rektální sondou. Trvale připojený urinámí Foleyův katétr byl umístěn do močové trubice tak, aby bylo možno sledovat vylučování moče a slearanci kreatininu. Každých patnáct minut byly sledovány hemodynamické parametry. Všechna zvířata dostala 0,9% chlorid sodný (4 ml/kg) po udržení i.v. tekutin. Během fáze B pokusu dostávala zvířata další tekutinu (10 ml/kg každých 15 minut), dokud nebylo dosaženo dvou z následujících fyziologických kriterií: 1) střední arteriální tlak poklesne o více než 30 %; 2) tepová frekvence se zvýší o více než 30 % 3) výdej moči poklesne na méně než 1 ml/kg/hod. Po odběru krevních vzorků reprezentujících základní hodnoty a nejméně hodinu trvajícím období klidu k dosažení rovnováhy začala infuze proteinů.
Během fáze A této studie byla infuze rekombinantních proteinů provedena via cefalika (povrchová žíla horní končetiny), zvířata byla pozorována po dobu osmi hodin, poté byly odstraněny všechny katétry a zvířata byla vrácena do svých klecí na dobu 21 dní. Za 24 a48 hodin a dále pak ve 3., 5., 8., 11., 16. a 21. dnu byla u zvířat provedena lehká anestézie i.m. injekcí kateminu (10 mg/kg) a byly odebrány vzorky žilní krve. 21. den byla anestézie opakována, byla podána druhá aplikace proteinu a celý postup započatý v den 0, byl opakován po dalších 21 dnů, kdy po této době byla zvířata šetrně usmrcena.
Během fáze B této studie byla jednu hodinu před infuzí E. coli náhodně vybrána čtyři zvířata, která dostávala buď placebo, anebo jeden z výše zmíněných rekombinantních preparátů. Zvířata byla sledována po dobu osm hodin, poté byly všechny katétry odstraněny, a zvířata byla navrácena do klecí a bylo pozorováno případné přežívání letální bakterémie. Zvířata, která nadměrně trpěla, byla šetrně usmrcena. Nadměrné utrpení je IACUC definováno ták: 1) neschopnost stát nebo sedět po dobu 12 hodin, 2) neschopnost přijímat potravu či vodu po dobu 12 hodin, 3) nezvladatelné krvácení z míst, v nichž byly zavedeny katétry, anebo 4) neodpovídavost na vnější podněty. Vzorky žilní krve byly odebírány v časech -1, 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 24 hodin, 48 hodin a ve dnech 3, 5, 8, 11, 16 a 21. Ve 21. dnu byla zvířata, která do této doby přežila, šetrně usmrcena.
-67CZ 296835 B6
Přítomnost Papio protilátek proti podaným rekombinantním proteinům byla stanovována pomocí sendvičového testu ELISA. Velice stručně popsáno, ELISA destičky byly potaženy s preparáty l sTNFR-I (1 pg/ml), pak byla přidána ředěná (1:50 až 1:100 000) paviánní plazma (100 μΐ). 5 Po promytí vzorků byl přidán konjugát křenové peroxidázy a proteinu A (0,5 pg/ml), reakce byla vizualizována s pomocí TMB.
Výsledky (Část I):
Tři kombinantní preparáty se významně lišily poločasem života v plazmě. Křivky popisující ' vymizení byly stanoveny metodou nezávislou na modelu a poločasy byly obecně hodnoceny ί mezi 8 až 172 hodinami. U nedotčených zvířat vstupujících do pokusu byl poločas života v ρύζι mě nejdelší u paviánů, kterým byl podán 4.0 doménový konstrukt (29 hod) a postupně klesal i u paviánů, kterým byl podán sTNFR-I 3D/C105db (24,7 hod) a sTNFR-I 2.6D/C105db (21,5 1'5 hod). Rozdíl, byť statisticky významný, byl pouhým 26%.
I
I Po druhém podání proteinů příslušným paviánům měly poločasy života v plazmě neočekávanou ί tendenci k výraznému zkrácení, což naznačuje rychlejší vylučování (clearanci). Tato redukce poločasů byla nejvýraznější u paviánů ošetřených s sTNFR-I 4D/C105db, u nichž byly poločasy 2'0 lcratší o 48 % (p<0,01) [obrázek 10]. Střední redukce poločasů byla u paviánů ošetřených | s sTNFR-I 3D/C105db (31 %) [obrázek 11] a nejmenší u zvířat, kteiým byl podán sTNFR-I
2.6D/C105db (14%) [obrázek 12]. U paviánů, kteří dostali sTNFR-I 2.6D/C105db, nebyly redukce poločasů statisticky odlišné.
2'5 Všechny preparáty byly u paviánů imunogenní. Avšak nej vyšší hodnota imunogenicity byla nalezena u paviánů ošetřených s sTNFR-I 4D/C105db, střední u zvířat ošetřených s sTNFR-I 3D/C105db a nejnižší u zvířat, kterým byl podán sTNFR-I 2.6D/C105db (tabulka 8).
TABULKA 8: Vrcholy protilátkové odpovědi1
Prvních 21 dnů Druhých 21 dnu
Střední hodnota 25 V 75 δ Střední hodnota 25 % - 75 %
sTNFR-I 4D/C105db (n=4) 3,20 3,20 3,20 3,95 3,50 4,40
sTNFR-I 3D/C15db (n=4) 1,60 0,00 3,65 3,50 1,30 4,75
STNFR-I 2.6D/C105db (n=4) 0,00* 0,00 1,75 1,45 0,00 3,50
11 logaritmické měřítko (převrácená hodnota ředění plazmy potřebná k dosažení poloviny maxima absorbance v sendvičovém testu ELIA; viz Experimentální metody).
-68'«f • r η
CŽ 296835 B6 * p=0,056, stanoveno dle Kruškáí-Wálíis dvoufaktorovóú ANOVA (analýzou variace) (hodnoty vyjádřené logaritmicky nebyl použitelné v normálním rozložení).
Protilátkové odpovědi se obecně rozvíjely kolem osmého dne po podání rekombinantního konstruktu a byly přítomny během 21-denního testovacího období. Kromě toho měly protilátkové odpovědi tendenci být silnějšími během odpovědi na druhou injekci proteinových konstruktů.
Všichni čtyři paviáni, kteří dostali sTNFR-I 4D/C105db, vytvářeli protilátky, dvě ze čtyř zvířat, ío kteiým byl podán sTNFR-I 3D/C105db a jeden ze čtyř paviánů, kterým byl podán sTNFR-I 2.6D/C105db rovněž tvořili protilátky. Velikost protilátkové odpovědi (vyjádřená logaritmicky) dle Kruskall-Wallis ANOVA se významně lišila mezi třemi skupinami jako Funkce času i (p<0,05). „Post-hoc analýza“ naznačuje, že významný rozdíl v protilátkové odpovědi byl pře| devším mezi zvířaty, která dostala sTNFR-I 4D/C105db a sTNFR-I 2.6D/C105db, střední (a nevýznamné) odpovědi byly nalezeny u zvířat, kterým byl podán sTNFR-I 3D/C105db.
ΐ Byla pozorována korelace mezi tvorbou protilátek a změnou v clearanci mezi oběma 21 denními i studiemi (p<0,01). U zvířat se silnou protilátkovou odpovědí na první podání konstruktu byl i podle očekávání protein po druhém podání rychleji vylučován. Změna v clearanci po prvních
2'0 a druhých injekcích byly porovnána u zvířat, u nichž se vyvinula protilátková odpověď (n=7) a u těch, u nichž se odpověď nevyvinula (n=5) [obrázek 13],
Přímá cytotoxicita na buněčnou linii ME-180 a neutralizační kapacita v testu L-929 testu byla hodnocena u protilátek nalezených v plazmě paviánů u vybraného počtu zvířat. Žádná cytotoxici25 ta ani neutralizace nebyly nalezena u protilátek proti kterémukoliv ze tří zkoumaných konstruktů.
Ve fázi A studie u paviánů, vykazují zvířata, která rozvinula nej silnější protilátkovou odpověď, nejrychlejší zvýšení v clearanci konstruktů po jejich druhém podání. Taková zjištění naznačují, že protilátková odpověď může redukovat biologický poločas a tedy i terapeutickou účinnost 30 konstruktů, a proto může být vyžadována úprava dávky. Nezdá se však být prokázána jakákoliv nepříznivá klinická odpověď na přítomnost protilátek, jestliže konstrukty byl podány po druhé. Terapeutické úsilí, které je zaměřeno na modifikace takových konstruktů ke snížení jejich imunogenicity bež významného ovlivnění poločasu účinnosti, směřuje primárně k omezení potřeby i zvýšit dávku, spíše než ke snížení rizika nepříznivých vedlejších reakcí.
Část 1 fáze B Výsledky:
! Závěrem je možné kontrolovat, že všechny tři konstrukty jsou téměř stejně účinné u dosud nedotI čených zvířat a zabraňují poškození způsobenému cytokiny během bakteriémie E. coli, pokud jsou podávány v dávce 1,0 mg/kg BW. Přežil jeden ze čtyř paviánů, kteří dostali placebo, dále
I přežili 4 ze 4 paviánů léčených sTNFR-I 4D/C105db nebo sTNFR-I 3D/C105db a 3 ze 4 paviá' nů léčených sTNFR-1 2.6D/C 105db. Všechny tři konstrukty zabraňují biologické aktivitě TNF-a a mají dostatečnou neutralizační kapacitu.
Část II:
Cílem části II studie u paviánů bylo určit, zda má opakovaná expozice zvířat (tj. 3 oddělené I injekce) k různým sTNFR-I konstruktům za následek další imunogenicitu a snížený poločas.
Kromě toho tato studie byla návržena tak, aby byla srovnávána imunogenicita a farmakokinetika 50 několika sTNFR-I konstruktů, zahrnující sTNFR-I 4D/C105db a sTNFR-I 2.6D/C105db, dále sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) a sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa). Konečně tato studie byla zaměřena na zhodnocení klinického významu protilátkové odpovědi a změn clearance pro následnou odpověď k poškození způsobenému TNF-α (E. coli bakterémii).
-69; ’ 1 , ' '' CZ 296835 B6
- ·
Ve dnech O, 21 a 42 byly paviánům podány i.v. (0,2 mg/kg) různé konstrukty (sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-I 2.6D/CÍ05db, sTNFR-ΐ 2.6D/ÍN 105-t-BuPEG(33kDa) a sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa). 63 den dostali paviáni 2,0 mg/kg BW příslušného konstruktu. 65. den (tj. o 48 hodin později) byla paviánům podána letální dávka E. coli, jak bylo popsáno výše 5 v části I. Hlavní poznatky z části II jsou následující.
Výsledky (část II):
U nedotčených paviánů mají sTNFR-I 4D/N105-t-BuPĚG(33kDa) a sTNFR-I 2.6D/N105-t10 BuPEG(33kDa) obecně delší poločasy života než sTNFR-I 4D/C105db a sTNFRI 2.6D/C105db bez ohledu na počet domén. Délka poločasu života se pohybovala v rozmezí od 30 do 35 hodin u monopegylovaných forem sTNFR-I, na rozdíl od rozmezí 10 až 20 hodin u dimerických I pegylovaných forem. Kromě toho u nedotčených zvířat mají sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG i (33kDa) a sTNFR-I 4D/C105db delší poločasy života, což sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33Da) a sTNFR-I 2.6D/C105db.
I sTNFR-I 4D/C105db a sTNFR-I 26D/C105db byly také imunogenní, s mírným trendem k nižší j imunogenicitě u sTNFR-I 2.6D/C105db. Avšak pouze sTNFR-I 4D/C105db vykazoval reduko| vanou clearanci po opakovaném podávání. sTNFR-I 4D/dN105-t-BuPEG(33kDa) a sTNFR-I 2ó 2.6/N105-t-BuPEG (33kDa) nebyly ani antigenní, ani se rychlost jejich clearance významně neměnila po opakovaném podávání.
Byla stanovena in vitro imunoreaktivita (pomocí „ELISA sandwich capture“) k jiným konsti ruktům, získaným ze séra každého z paviánů (N=3), kteří byli ošetřeni odlišnými sloučeninami
21., 42. a 61. den, a to s použitím odlišných konstruktů jako záchytného (capture) antigenu. Tak i například, sérum získané z paviánů, kterým byl podán sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) ! v +21.den (tabulka 9) „nereaguje“ ani s sTNFR-I 4D/C105db, ani s sTNFR-I 4D/N105, jestliže tyto sloučeniny byly použity na ELISA destičkách jako záchytné antigeny.
' ··’Τ'® ^Λ'·1 . «
Imunitní reakce paviánů
M 1 oc tu Z H to 4D/N105 3/3 neg 3/3 neg 3/3 neg CT' Φ c
3 cm
w iD Cn σ> σ> <9
I O <D α> <y <υ
Ě rH C c. c P
25 O CO 09 CO 00
H Q \ Ss
(0 co co co r-1
CM
c <d
0) Q
Q P 44
1 cn
H m m tm
o o ·«*-* Φ
o oc r-t 0 c
vr u< O w
·· z \ CU co
r-4 Q o
ΛΙ <0 m co
M
-P
•H
+J
P tn
0 1 Q
m 44
o CO
M í-4 00 O)
1 z <D
a: 0 C
tu Q ω
z AP 0u 09
» 5 \
(0 CN Oi 09
m
O
M rH cn
1 O V'
ά \ C
K o
z CO
• \
co CM co
4-» <ϋ +-> <n Λ fl
Q 1 Q 1 Q
Ή U9 44 in 44 44 P> 44 A
> O 00 O 1 CO 1 co TJ
h-H co M r-f M in 00 Pt U9. co W iT)
52 1 0 o *-* 1 O *—' 1 O
pí 0 oí \ ώ t-M 0 tf. t-4 0 α rH
φ o ω u. α E z Ul E 0 Ul ͱ4 o
CO kO CL, z k£) Z X LU z \ cu Z
o H H 5 E-t • H Q 3 p Q 3 6-< Q
CL, c V) CM m CO CM (Λ íD (0 *=r CQ co <T
-71 CZ 296835 B6
Za pozitivní byla pokládána protilátková odpověď o titrli > 1:400. Údaje ze 42. a 61. dne jsou shrnuty v tabulkách 10 a 11. Za důležitý je považován fakt, že sérum z jednoho paviána, kterému byl podán sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPE<3(33kDa), vykazovalo pozitivní reakci in vitro při testování se sTNFR-I 4D/C105db záchytným antigenem.
-72ΊΤ -Τ' :
Cí
Z
W lO O r-4 Z
Q
tn Φ C co co σ> α> c co co σ» α> c co \ co σ' tu u rO 'v.
OJ
O
O €
M tD CH
1 o ω
Cí r*4 c
JL O
Z co
f-< Q
<0 CO
σ'
co co tn O) C co co cn <b <u —M O
O CO Ol \ co OJ Imunitní reakce paviánů
Ol xr σ>
1 ro Q
4-> .M
1 CO
m co
o *—'
r-H 0
o ω
CU
Q 3
«ςρ co
4-1 I
PO o
w 1 rH ž
Ďí
Cx4 Q
z k£>
♦
« 04
Φ Q Ai
CO
CO tn
—- <D
0 3
ω
cu co
3
03 CO
cí co =8 m o ř—I
O
Q CO
Ol σ' <ú <u
M O O CO l£> \ rH CO ~
JJ to *r-| >
N
4-J Φ >U o
Ol
CO II c
-P 1 lD a € lO
O co o
r-< co n rH
& «·«* 1 O
\ 0 tů
Q ω ÍJU α
kP ÍXí z <p
3 H
<N CQ w <N
<0
1 Q
p 44
1 co
H Ú0 co
1 o —··
Pí t-4 0
Cu z ω
Z (X
E-i Q 3
w xr 03
1 P 1 rb Q Λ4 CO η T5
M LO CO n lO
1 O 1 O
CS- t—í 0 Cí <—1
Cu 0 ω Cu O
Z CU z \
H Q 3 E- Q
to xr OQ tn *^r
-73CZ 296835 B6
σ> <D c m
m
σ> Cn
Π3 <0
ω α>
^4 00 >-ι
CN <η
\ <η
t-4 :—· Γ*4
o o w CD
O' <v Φ cn \ cn o o
CO
CN i—I
cn
π3 <υ
Μ ο
ΓΟ ο m
\ «-Η
r~4
Tabulka 11
Imunitní reakce paviánů
O O ό* i—i
Al •P •H P
ω
1 Q
+J
| cn
H ιη m
1 ο
(Α γ-4 ω
ÍJU Ο ω
Ζ ω
Η ο σ
ω •ςτ ca
Ρ <ϋ
I Q
m Λί
ο cn
Μ tn
1 ζ —
(£. Ο
U. Q ω
Ζ CD ω
Η ♦ 5
tn CN (X)
M i Ě z E-< « € m o rH O a CO
CN
P <0 >P Ή > N +J
Φ >O cn O II cu c cn Φ c cn X» cn
z
E-1 w
2/3 reag | (204800)
Λ
Ό 1 Q
ιΓ) Ρ Λ
Ο m
Μ rH Μ m m
1 ο 1 ο
(Ύί α: Γ”< <9
tM Q Ιχι ζ ω
z <0 ζ Ů4
Η «· Η α 2
(0 CN (0 <3* ca
<o
1 4-> Q <η η Τ3
Μ ιη <η »-< ιη
1 Ο — 1 ο
λ γΗ Ο X ϊΉ
ω ω ω ÍX4 Ο
ζ CU Ζ
Η. α 3 Ε- Q
OT «3· cn ω •CT
-74I
CZ 296835 B6 ’ í :
U paviánů, kteří byli předem třikřát vystaveni působení konstruktu byla účinnost vyvolané odpo^ vědí na poškození zprostředkované TNF nejvyšší u (1) sTNFR-I 4D/G105db, (2) sTNFR-I 2.6D/C105db, (3) sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa) a (4) sTNFR-I 2.6D/N105-P 5 BuPEG(33kDa) (jak bylo stanoveno na základě přežívání, systémového selhání orgánů, IL-6 : v séru a WBC odpovědi). Nedostatkem této studie je fakt, že nebrala v úvahu rozdíly ve schopnosti různých rekombinantních protéinů neutralizovat TNF.
(2. Šimpanz (Dílem této studie bylo stanovit imunogenicitu různých forem sTNFR-I, které byly opakovaně injikovány i.v. cestou šimpanzům v průběhu jednoho měsíce. Byly testovány následující formy sTNFR-I: sTNFR-I 2.6D/C105db, sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33kDa), sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) a sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa). V jedné pokusné skupině byli celkem tři šimpanzi.
Dávkovači režim a parametry této studie byly následující: Každý šimpanz dostával pokusný vzorek v podobě intravenózní injekce (0,1 mg/kg) dvakrát týdně v pondělí a v pátek po dobu čtyř týdnů (celkem 8 dávek). Objem dávky se měnil v závislosti na koncentraci podávaného vzorku. 5 ml séra bylo odebráno každému zvířeti v den 0 před začátkem pokusu. Další vzorky séra byly odebírány těsně před podáním preparátu 1., 14.,21.a28. den.
Základní údaje o imunogenicitě u šimpanze jsou uvedeny v tabulce 12.
·* ii
CM
G
0) Q
X Φ > •<0 O oo o o co
O O 04 01
CM
O O OO
O O 00 CM rd
Cd +J Ή E-<
.* Φ P 'CO •rd
P O P Q.
OT >
vek
rd
·*—’
o o
·*—- «Φ
>
X tr > rd 'CO
G <u *r Q — rd o o r—i
O O O o kO CM rd 01
rd
rd ^r
O
O o
O <£>
rd
O O CM ro
CO X > 'CO 15
I
Φ P Oj t-d
I
C4
Cli
Z f-j w <£> O rd u a
MO
W € Lf> Hd
1 Ě C10 1 Ě
z z
H Q H
cn ’Φ cn
1 <0 o
•P X
1 Ol
ni σι
o
Η O
Z ω
Ou
Q G
*r m
P
I
Lil o PC rd I z
Ě £ z H <Z1 04
I P i iD O rd Z \ a M·
Poznámka: Titry pozorované s použitím sTNFŘ-I 4D/C105db jako záchytné (capture) antigen
-76CZ 296835 B6
Do 28. dne byla u všech zvířat (ň-3); kterým byí podáván sTNFR-i 4D/C105db nebo sTNFR-i [ 2.6D/C105db, zaznamenána pozitivní reakce (stanoveno testem ELISA), s pozorovanými nejί vyššími naměřenými titry 1:12800 nebo a 1:3200 (tabulka 12). (Poznámka: V této části pokusu Λ byly všechny „imunizující“ antigeny použity jako odpovídající záchytné antigeny imobilizované ;
na ELISA destičce). Jedno zvíře ošetřené s sTNFR-Ι 4D/N105-t-BuPEG(33kDa) mělo pozitivní protilátkovou reakci 21. a 28. den (tabulka 12). Významné je zjištění, že u žádných zvířat ošetřených během tohoto pokusu s sTNFR-Ι 4D/C105-t-BuPEG(33kDa) nebo sTNFR-Ι 2.6D/N105t-BuPEG(33kDa) nebyla pozorována tvorba protilátek proti sTNFR-Ι (tabulka 12).
, Tak, jak bylo popsáno v části týkající se paviánů, bylo 28. den odebráno sérum všem šimpanzům j (n=3), kteří byli ošetřeni s různými formami sTNFR-Ι, a sérum bylo testováno na in vitro imunoj reaktivitu (metodou ELISA) proti jiným konstruktům s použitím forem sTŇFR-I jako záchytl ných antigenů. Pozitivní reakcí byla protilátková odpověď o titru >1:400. Je významné, že sérum 15 získané od šimpanzů, kterým byl podáván sTNFR-Ι 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) „nereaguje“ ani s sTNFR-Ι 4D/C105db, ani s sTNFR-Ι 4D/N105, když byly tyto sloučeniny použity jako záchytné antigeny na ELISA destičce (tabulka 13).
Totéž bylo rovněž pozorováno u zvířat ošetřených s sTNFR-Ι 4D/C105db, sTNFR-Ι 4D/C105-t20 BuPEG(33kDa) nebo sTNFR-Ι 4D/N105-t-BuPEG(33kDa) (tabulka 13).
CZ 29Í6835 B6
Výsledky protilátek u šimpanzů
STNFR-I 4D/N105 θ’ φ a Γ0 on ---------------------------------------------------------------------------1 1/3 reag. (400) Cn «3 0) — tj o o cn cm \ cn CM — 3/3 neg. o> rú a> tj o o cn <g> \ tó cn —
STNFR-I 4D/C105db cr Φ c co \ co Cn <0 0) — n o o cn co \ co CM Ó «5 . 0) — M O G> m to \ rM CM — σ> ro O - M — O cn o 'v, ·ςτ. r-í - & Λ5 —, a> o M O oo cn cm *\ r—1 CO
1 Q 4J ΛΪ i cn n in cn 1 O —' OC r-i O u, o ω Z S Oj h a 5 v> ’Φ ta cr Φ c co \ co
«Ϊ i a Jj Λί i rn h m m I o — Oí <-H O tu U M 25 Oj É-I O O W 02 cr Φ c co \ co
1 — 4-1 «5 1 Q v> X o cn m <-4 cn 1 z — at \ o tu Q W Ž tp Oj m cm M cn 0) G on cn
m o H <-4 1 U κ > tu Q Z <0 H <fí CM θ’ «5 d> — Ul O o on cm cn cn
Počet zvířat: n=3 I — 4-> <0 l Q m o cn M rH cn 1 z - at o tu α ta Z U> Oj H · G W CM ffl 3 tn o M r~i í u Ě S Z to E-> m oj <0 t Q 4-» Λ4 i on m m cn i o — Ot rH <5 Uj z ω z Oj H Q 5 OT ’ϊ* ffl ra i Q p Λί i on w m on 1 o — at r-4 0 Uj O .ffl Z Oj H O G ot «y tn € m m I o Ot r-t Uj O z \ H Q 0)
Příklad IV [ EAE je akutní nebo chronická recidivující zánětlivá demyelinizující choroba CNS, která vznikáí jako důsledek působení neuroantigenů, jako je např. myelinový bazický protein (MBP), na gene-;
[ ticky citlivá zvířata. EAE představuje uznávaný a často užívaný model akutní lidské MS. [ ! í i Krysí samice Lewis (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) byly v anastézii imunizovány na
I chodidle levé zadní končetiny (den 0) s 0,1 ml emulze obsahující myelinový bazický protein íp (MBP) v kompletním Freundově adjuvans rozpuštěný v PBS se stejným objemem kompletního
Freundova adjuvans (CFA) obsahujícího 5 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco
I Lab MI). Kontrolním krysám byl podán 0,1 ml PBS/CFA emulze bez MBP do chodidla levé ; zadní končetiny. ,
1I5 Klinické hodnocení nemoci je založeno na obvyklém bodovacím systému 0 až 5. Následující : stavy jsou přiřazeny jednotlivým hodnotám: 0, normální; 0,5, částečná ztráta ocasního tonusu; 1’ úplná ztráta ocasního tonusu; 2, vláčení jedné zadní končetiny; 3, paralýza obou zadních končetin; 4, umírání; 5, smrt. Všechny injekce konstruktů sTNFR-I nebo slepého vzorku (vehikula) byly podávány subkutánně (s.c.) v dávce 1 mg/kg každý další den počínaje 9. dnem po imunizaci.
Pokus byl ukončen u všech zvířat 21. den. Výsledky jsou vyjádřeny ve dvou podobách, jednak ( i jako skóre klinické závažnosti v průběhu času, jednak je integrované skóre každé krysy v celém průběhu choroby spočítáno jako plocha vymezená křivkou závislosti denního klinického skóre na í čase. Hodnoty integrovaného klinického skóre léčených skupin je srovnány s hodnotami kontrolní skupiny pomocí Mannova-Whitneyova testu.
Zvířata, kterým byl podán slepý vzorek (vehikulum), projevovala začátek onemocnění kolem desátého dne, nemoc vrcholila 16. den a potom ustupovala. sTNFR-I 4D/C106db zmírňoval kliI nické příznaky o zhruba 73 % ve srovnání se zvířaty léčebnými slepým vzorkem. sTNFR-I i 4D/C105-t-BuPEG(33kDa) rovněž zmírňoval klinické příznaky o zhruba 85 %. sTNFR-I
4D/C105-t-BuPEG(33kDa) a sTNFR-I 2,6D/N105-t-BuPEG(33kDa) byly stejně účinné ve zmírňování klinických příznaků (64 a 57 %).
Lze uzavřít, že zkrácené formy sTNFR se zdají být klinicky účinné v tomto zvířecím modelu MS.
3!5 Ačkoliv tento vynálezu byl výše popsán jak v obecné podobě, tak v podobě konkrétních výhod-: í ných provedení, odborník v oboru snadno nalezne další jeho obměny a modifikace na základě 1 předkládaného popisu.

Claims (8)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    45 1. Zkrácený rozpustný receptor faktoru nekrotizujícího tumory, sTNFR, obecného vzorce
    R^Cys^CysH-R,, kde | Cys19-Cys103] představuje zbytky 19 až 103 sTNFR-I z obrázku 1 (SEQ ID NO:2); a kde Ri představuje methionylovanou nebo nemethionylovanou aminoskupinu Cys19 nebo aminoI skupinu aminoterminálního aminokyselinového zbytku ze skupiny
    1 - il. CZ 296835 B6 • 1 c IC SIC NSIC (SEQ ID NO:15) NNSIC (SEQ ID NO:16) QNNSIC (SEQ ID NO:17) PQNNSIC (SEQ ID NO:18) HPQNNSIC (SEQ ID NO:19) IHPQNNSIC (SEQ ID NO:20) YIHPQNNSIC (SEQ ID NO:21) KYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:22) GKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:23) QGKYIHPQNNSIG (SEQ ID NO: 24) PQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:25) CPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:26) VCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:27) SVC PQGKYIH PQNNSIC (SEQ ID NO:28) DSVCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO: 29),
    5 a kde R2 představuje karboxyskupinu Cys103 nebo karboxyskupinu karboxyterminálního aminoi kyselinového zbytku vybraného že skupiny: I
    F JÍ
    FN ; í
    FNC
    FNCS (SEQ ID NO:30) FNCSL (SEQ ID NO:31) FNCSLC (SEQ ID NO:32) FNCSLCL (SEQ ID NO:33) ,
    10 kde uvedené sTNFRs mají sníženou antigenicitu ve srovnání s rozpustným TNFR-I obsahujícím první tři domény, a jeho deleční a/nebo substituční mutein schopný inhibovat TNF, jakož i konjugát tohoto zkráceného sTNFR s vodorozpustným polymerem.
    ; ' . ί
  2. 2. Zkrácený sTNFR podle nároku'1, vybraný žé skupiny skládající se z sTNFR 2.6D/C105 ' [NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys18 l9-Cysl03]-FC-COOH], sTNFR 2.6D/C106 [NH2- í MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH], sTNFR-I 2.6D/N105 [NH2- í 5 MDSVCPQGKYffiPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH], sTNFR-I· 2.3D/d8 [NH2- ‘
    MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH], sTNFR-I 2.3D/dl5 [NH2-MSIŠ-[Cys19-
    Cys103]-FNCSL-COOH] a sTNFR-I 2.3D/dl8 [NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOHJ. |
  3. 3. Zkrácený sTNFR podle nároku 1 nebo 2, který je na karboxylovém konci fúzován s celou ιό konstantní doménou nebo její částí těžkého nebo lehkého řetězce lidského imunoglobulinu.
    i 4. Zkrácený sTNFR podle některého z nároků 1 až 3, který je neglykosylovaný.
    i ; 5. Zkrácený sTNFR podle některého z nároků 1 až 3, který je glykosylovaný.
    (i. Zkrácený sTNFR podle nároku 1, v němž je vodorozpustným polymerem polyethylenglykol.
    7. Polyvalentní vazebný protein faktoru nekrotizujícího tumory, TNFbp, obsahující nejméně jeden zkrácený sTNFR podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6. ;
    8. TNFbp podle nároku 7 obsahující dimér zkráceného sTNFR podle nároku 3.
    9. TNFbp podle nároku 7 obecného vzorce Ra-X-Rb, kde X obsahuje linker, kterým je ve vodě rozpustný polymer a Ra a Rb jsou biologicky aktivní molekuly kovalentne vázané na uvedený ve
    25 vodě rozpustný polymer, přičemž alespoň jeden z Ra a Rb je zkrácený sTNFR podle kteréhokoliv 2: nároků 1 až 5.
    10. TNFbp podle nároku 9, v němž ve vodě rozpustným polymerem je polyethylenglykol.
    30 11. TNFbp podle nárok 10, v němž je sTNFR vybrán ze skupiny skládající se zsTNFR-I t ! 2.6D/C105db a sTNFR-I 2.6D/C106db.
    12. Polynukleotid mající sekvenci kódující zkrácený sTNFR podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3' nebo sekvenci k ní komplementární.
    35 ;
    ! 13. Polynukleotid podle nároku 12, který má sekvenci nukleové kyseliny zvolenou ze sekvencí ! uvedených na obrázcích 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7, nebo sekvenci, která je v kódujících oblastech
    I degenerována.
  4. 4'0 14. Vektor obsahující polynukleotid podle nároku 12 nebo 13 operativně připojený k sekvenci řídící expresi.
    15. Prokaryontní nebo eukaryotní hostitelská buňka obsahující polynukleotid podle nároku 12 nebo 13 nebo vektor podle nároku 14.
    45 “
    16. Způsob přípravy zkráceného sTNFR, v y z n a č u j í c í se t í m , že se kultivuje hostitelská buňka podle nároku 15 za podmínek vhodných pro umožnění exprese zkráceného sTNFR hostitelskou buňkou a popřípadě se zkrácený sTNFR izoluje.
    50 17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že hostitelskou buňkou je buňka E.
    coli.
    18. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že hostitelskou buňkou je buňka vaječníku čínského křečka (CHO).
    19. Zkrácený sTNFR podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, který je rekombinantním expresním produktem prokaryontní nebo eukaryotní hostitelské buňky podle nároku 15.
    20. Způsob přípravy farmaceutické kompozice, v y z n a č u j í c í s e t i m , že se terapeutic-
  5. 5 ky účinné množství zkráceného sTNFR podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 nebo nároku 19 nebo TNFbp podle kteréhokoliv z nároků 7 až 11 smíchá s jedním nebo více farmaceuticky vhodnými nosiči.
    í 21. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje zkrácený sTNFR 10 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 nebo 19 ve spojení s farmaceuticky vhodným nosičem.
    22. Farmaceutická kompozice, vyznačujícíse tím, že obsahuje TNFbp podle které hokoliv z nároků 7 až 11 ve spojení s farmaceuticky vhodným nosičem.
    15 23. Farmaceutická kompozice podle kteréhokoliv z nároků 21 až 22, vyznačující se 1 tím, že obsahuje směs sprodlouženým uvolňováním.
    24. Farmaceutická kompozice podle kteréhokoliv z nároků 21 až 23, vyznačující se tím, že je lyofilizována.
    I 25. Použití zkráceného sTNFR podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 nebo nároku 19 pro výrobu léčiva pro léčení pacientů postižených chorobou zprostředkovanou TNF.
    I | 26. Použití zkráceného sTNFR podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 nebo nároku 19 pro výrobu
    25 léčiva pro léčení pacientů postižených diabetes, hyperalgesií, zánětlivou chorobou střev, ischemickým poškozením, reperfúzním poškozením nebo revmatickou chorobou.
    27. Použití podle nároku 26, kde revmatická choroba je zvolena ze souboru sestávajícího z revinatoidní artritidy, osteoartritidy, juvenilní (revmatoidní) artritidy, ankylozující spondylitidy, der-
    3,0 inatomyozitidy, lupénkové artritidy, sklerodermie, Sjógrenova syndromu a vaskulitidy.
    28. Použití podle kteréhokoliv z nároků 25 až 27, kde léčivo je upraveno pro intravenózní, intraI inuskulámí, intradermální, subkutánní, intraartikulámí nebo infuzní podávání.
    3í5 29. Použití podle kteréhokoliv z nároků 25 až 28, kde léčivo je určeno pro podávání před podá| ním protizánětlivého léčiva, současně s ním nebo po něm.
    30. Použití podle nároku 29, kde protizánětlivé léčivo je zvoleno ze souboru sestávajícího z nesteroidních protizánětlivých léčiv, NSAID, kostikosteroidů, pomalu působících antirevmatických
    40 léčiv, SAARD, nebo léčiv modifikujících chorobu, DM.
    31. Použití podle nároku 29, kde protizánětlivým léčivem je inhibitor interleukinu-1, IL-1, zvolený z antagonisty receptorů IL-1 (IL-lra) nebo rozpustného receptorů IL-1.
    45 32. Kit, vyznačující se tím , že obsahuje zkrácený sTNFR podle kteréhokoliv z náro| ků 1 až 6 nebo nároku 19 nebo TNFbp podle kteréhokoliv z nároků 7 až 11.
    33. Použití podle nároku 30, kde protizánětlivým léčivem je methotrexát.
    50 34. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 21 až 24, vyznačující se tím, že dále obsahuje protizánětlivé léčivo.
    35. Farmaceutická kompozice podle nároku 34, vyznačující se tím, že protizánětlivé léčivo je zvoleno z nesteroidních protizánětlivých léčiv, NSAID, kortikosteroidů, pomalu působí55 cích antirevmatických léčiv, SAARD, nebo léčiv modifikujících chorobu, DM.
    36. Farmaceutická kompozice podle nároku 35, vyznačující se tím, že protizánětlivým léčivem je methotrexát.
    5 37. Farmaceutická kompozice podle nároku 34, vyznačující se tím, že protizánětli' vým léčivem je inhibitor interleukinu-1, IL-1, zvolený z antagonisty receptorů IL-1, IL-lra, ! nebo rozpustného receptorů IL—1.
    38. Farmaceutická kompozice podle nároku 37, vyznačující se tím, že IL-lra obsa-
  6. 10 huje sekvenci lidského IL-lra.
    39. Použití TNFbp podle kteréhokoliv z nároků 7 až 11 pro výrobu léčiva pro léčení pacientů postižených chorobou zprostředkovanou TNF.
  7. 15 40. Použití TNFbp podle kteréhokoliv z nároků 7 až 11 pro výrobu léčiva pro léčení pacientů postižených diabates, hyperalgesií, zánětlivou chorobou střev, ischemickým poškozením, reperi fúzním poškozením nebo revmatickou chorobou.
    I • 41. Použití podle nároku 40, kde revmatická choroba je zvolena ze souboru sestávajícího z rev-
  8. 20 matoidní artritidy, osteoartritidy, juvenilní (revmatoidní) artritidy, ankylozující spondylitidy, j dermatomyozitidy, lupénkové artritidy, sklerodermie, Sjogrenova syndromu a vaskulitidy.
    • 42. Použití podle kteréhokoliv z nároků 39 až 41, kde léčivo se podává iritravenózně, intramus-
    I kulámě, intradermálně, subkutánně, intraartikulámě nebo infuzí.
    2'5
    I 43. Použití podle kteréhokoliv z nároků 39 až 42, kde léčivo se podává před podáním protizánět! livého léčiva, současně s ním nebo po něm.
    i
    44. Použití podle nároku 43, kde protizánětlivé léčivo je zvoleno ze souboru sestávajícího z ne-
    30 steroidních protizánětlivých léčiv, NSAID, kostikosteroidů, pomalu působících antirevmatických i léčiv, SAARD, nebo léčiv modifikujících chorobu, DM.
    45. Použití podle nároku 44, kde protizánětlivým léčivem je inhibitor interleukinu-1, IL-1, zvo- ί lený z antagonisty receptorů IL-1, IL-IRa, nebo rozpustného receptorů IL-1.
    i 46. Použití podle nároku 45, kde protizánětlivým léčivem je methotrexát.
CZ0000499A 1996-07-09 1997-07-09 Zkrácený rozpustný receptor faktoru nekrotizujícího tumory, zpusob jeho prípravy a pouzití, vazebnýprotein, polynukleotid, vektor, bunka, farmaceutická kompozice a zpusob její prípravy a kit CZ296835B6 (cs)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2144396P 1996-07-09 1996-07-09
US3253496P 1996-12-06 1996-12-06
US3773797P 1997-01-23 1997-01-23
US3931497P 1997-02-07 1997-02-07
US3979297P 1997-03-04 1997-03-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ499A3 CZ499A3 (cs) 2000-01-12
CZ296835B6 true CZ296835B6 (cs) 2006-06-14

Family

ID=27533913

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0000499A CZ296835B6 (cs) 1996-07-09 1997-07-09 Zkrácený rozpustný receptor faktoru nekrotizujícího tumory, zpusob jeho prípravy a pouzití, vazebnýprotein, polynukleotid, vektor, bunka, farmaceutická kompozice a zpusob její prípravy a kit

Country Status (22)

Country Link
US (2) US6989147B2 (cs)
EP (1) EP0914431B1 (cs)
JP (2) JP2002514048A (cs)
KR (1) KR20000023695A (cs)
AT (1) ATE364695T1 (cs)
AU (2) AU3601397A (cs)
BG (1) BG64910B1 (cs)
BR (1) BR9710350A (cs)
CA (1) CA2259156C (cs)
CZ (1) CZ296835B6 (cs)
DE (1) DE69737814T2 (cs)
EA (1) EA003900B1 (cs)
ES (1) ES2288304T3 (cs)
IL (1) IL127874A0 (cs)
NO (1) NO990086L (cs)
NZ (1) NZ333647A (cs)
PL (1) PL189309B1 (cs)
SK (1) SK1599A3 (cs)
TR (1) TR199700610A3 (cs)
TW (1) TW555765B (cs)
WO (1) WO1998001555A2 (cs)
YU (1) YU299A (cs)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7005413B1 (en) * 1995-12-22 2006-02-28 Amgen Inc. Combination therapy for conditions leading to bone loss
JP4771563B2 (ja) 1996-12-06 2011-09-14 アムジエン・インコーポレーテツド Ｉｌ−１媒介疾患を処置するためにｉｌ−１インヒビターを使用する組合せ療法
CZ302262B6 (cs) 1997-04-16 2011-01-19 Amgen Inc. Izolovaná nukleová kyselina, polypeptid kódovaný touto nukleovou kyselinou, expresní vektor obsahující tuto nukleovou kyselinu, hostitelská bunka transfekovaná tímto expresním vektorem, izolovaný protein vázající osteoprotegerin, protilátka vázající
US6316408B1 (en) 1997-04-16 2001-11-13 Amgen Inc. Methods of use for osetoprotegerin binding protein receptors
US20040220103A1 (en) * 1999-04-19 2004-11-04 Immunex Corporation Soluble tumor necrosis factor receptor treatment of medical disorders
DE60024636T2 (de) * 1999-06-21 2006-08-17 Santen Pharmaceutical Co., Ltd Arzneimittel für die rheumatoide arthritis
EP1263788A2 (en) 2000-02-11 2002-12-11 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Identification of a domain in the tumor necrosis factor receptor family that mediates pre-ligand receptor assembly and function
US20030103978A1 (en) 2000-02-23 2003-06-05 Amgen Inc. Selective binding agents of osteoprotegerin binding protein
US7087224B2 (en) * 2000-10-31 2006-08-08 Amgen Inc. Method of treating anemia by administering IL-1ra
CA2428092A1 (en) * 2000-12-06 2002-06-13 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Use of sarp-1 for the treatment and/or prevention of scleroderma
MXPA04000134A (es) 2001-06-26 2005-06-06 Abgenix Inc Anticuerpos para ligandos de osteoprotegerina.
AU2003243139B2 (en) 2002-04-05 2007-06-21 Amgen Inc. Human anti-OPGL neutralizing antibodies as selective OPGL pathway inhibitors
US20040002451A1 (en) 2002-06-20 2004-01-01 Bruce Kerwin Compositions of pegylated soluble tumor necrosis factor receptors and methods of preparing
WO2004098595A1 (en) * 2003-05-12 2004-11-18 Altana Pharma Ag COMPOSITION COMPRISING ROFLUMILAST AND A TNFα ANTAGONIST
JP2007523117A (ja) * 2004-02-20 2007-08-16 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗コリン作用薬及びｐｅｇｓｕｎｅｒｃｅｐｔを基にした新規な医薬組成物
CA2574881C (en) 2004-08-04 2013-01-08 Amgen Inc. Antibodies to dkk-1
KR20080031684A (ko) 2005-06-14 2008-04-10 암젠 인코포레이티드 자가 - 완충성 단백질 제형
AR056806A1 (es) 2005-11-14 2007-10-24 Amgen Inc Moleculas quimericas de anticuerpo rankl- pth/ pthrp
US7833527B2 (en) 2006-10-02 2010-11-16 Amgen Inc. Methods of treating psoriasis using IL-17 Receptor A antibodies
WO2009009186A2 (en) 2007-04-13 2009-01-15 The Regents Of The University Of California Receptors useful for gas phase chemical sensing
SI2188313T1 (en) 2007-08-21 2018-04-30 Amgen, Inc. HUMAN C-FMS ANTIGEN TRANSFER PROTEIN
US8883146B2 (en) 2007-11-30 2014-11-11 Abbvie Inc. Protein formulations and methods of making same
CA2731546C (en) 2008-07-23 2013-11-19 Hanmi Holdings Co., Ltd. A polypeptide complex comprising non-peptidyl polymer having three functional ends
EP2492281B1 (en) * 2009-10-19 2018-04-11 HanAll Biopharma Co., Ltd. Modified human tumor necrosis factor receptor-1 polypeptide or fragment thereof, and method for preparing same
SI3295957T1 (sl) 2010-01-15 2020-02-28 Kirin-Amgen, Inc. Formulacija protitelesa proti IL-17RA in terapevtski režim za zdravljenje luskavice
KR101273893B1 (ko) 2010-09-13 2013-06-14 한올바이오파마주식회사 변형된 인간 종양 괴사 인자 수용체-1 폴리펩티드 또는 그의 절편 및 그의 제조방법
ES2626418T3 (es) * 2010-12-23 2017-07-25 Hanall Biopharma Co., Ltd. Polipéptido modificado del receptor-1 del factor de necrosis tumoral humano o fragmento del mismo y procedimiento de preparación del mismo
TW201605896A (zh) 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
WO2015087187A1 (en) 2013-12-10 2015-06-18 Rinat Neuroscience Corp. Anti-sclerostin antibodies
AU2015380301B2 (en) * 2015-01-28 2020-04-23 Dnx Biotech, Llc Compositions and methods of using a soluble TNF-alpha receptor modified for increased half-life
MA43814A (fr) 2016-03-08 2018-11-28 Janssen Biotech Inc Anticorps anti-gitr, méthodes et utilisations
BR112019007858A2 (pt) 2016-10-21 2019-07-02 Amgen Inc formulações farmacêuticas e métodos para produzir as mesmas

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0393438A2 (de) * 1989-04-21 1990-10-24 Synergen, Inc. TNF-Rezeptor, TNF bindende Proteine und dafür kodierende DNAs
EP0398327A1 (en) * 1989-05-18 1990-11-22 Yeda Research And Development Company Limited Tumor necrosis factor binding protein II, its purification and antibodies thereto
EP0422339A1 (en) * 1989-07-18 1991-04-17 Amgen Boulder Inc. Tumor necrosis factor (TNF) inhibitor and method for obtaining the same
EP0433900A1 (en) * 1989-12-13 1991-06-26 Yeda Research And Development Company Limited Expression of the recombinant tumor necrosis factor binding protein I (TBP-I)
WO1992007076A1 (en) * 1990-10-18 1992-04-30 The Mathilda And Terence Kennedy Institute Of Rheumatology Modified human tnfalpha (tumor necrosis factor alpha) receptor
WO1996016221A1 (de) * 1994-11-22 1996-05-30 Ulrich Theiss Verfahren zur übergabe von wäschestücken und vorzugsweise zur durchführung des verfahrens dienende muldenmangel sowie vorrichtung

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
IN150740B (cs) 1978-11-24 1982-12-04 Hoffmann La Roche
US4760067A (en) 1979-08-15 1988-07-26 Merck & Co., Inc. Allylsulfoxide enzyme inhibitors
EP0040506B1 (en) 1980-05-21 1986-08-20 Teijin Limited Reactive polymer and process for the preparation thereof
US4560649A (en) 1981-10-15 1985-12-24 Cornell Research Foundation Assaying for hLH or hCG with immobilized hormone receptors
JPH0751511B2 (ja) 1982-03-15 1995-06-05 味の素株式会社 インターロイキン２を含有してなる癌治療剤
DE3378250D1 (en) 1982-04-22 1988-11-24 Ici Plc Continuous release formulations
US4587046A (en) 1982-05-18 1986-05-06 The Regents Of The University Of California Drug-carrier conjugates
DE3380726D1 (en) 1982-06-24 1989-11-23 Japan Chem Res Long-acting composition
US4966888A (en) 1985-07-08 1990-10-30 Cornell Research Foundation, Inc. hCG-hLH receptor and hCG-hLH receptor-hCG complex as antigens, antibodies thereto and contraceptive vaccine
US4522750A (en) 1984-02-21 1985-06-11 Eli Lilly And Company Cytotoxic compositions of transferrin coupled to vinca alkaloids
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
SE470099B (sv) 1984-05-17 1993-11-08 Jerker Porath Sulfonaktiverade tioeteradsorbenter för separation av t ex protein
US4578335A (en) 1984-05-21 1986-03-25 Immunex Corporation Interleukin 2 receptor
US4670563A (en) 1984-06-20 1987-06-02 Sanofi Imidazolides as intermediates for the synthesis of cytotoxic conjugates
US4675285A (en) 1984-09-19 1987-06-23 Genetics Institute, Inc. Method for identification and isolation of DNA encoding a desired protein
SE454885B (sv) 1984-10-19 1988-06-06 Exploaterings Ab Tbf Polymerbelagda partiklar med immobiliserade metalljoner pa sin yta jemte forfarande for framstellning derav
US4959314A (en) 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
JP2524586B2 (ja) 1985-06-26 1996-08-14 シタス コーポレイション ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
JPS62185029A (ja) 1986-02-07 1987-08-13 Ajinomoto Co Inc 修飾インタ−ロイキン−２
CA1283046C (en) 1986-05-29 1991-04-16 Nandini Katre Tumor necrosis factor formulation
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
IN165717B (cs) 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US4931544A (en) 1986-09-04 1990-06-05 Cetus Corporation Succinylated interleukin-2 for pharmaceutical compositions
IL80005A (en) 1986-09-10 1992-11-15 Yeda Res & Dev Compositions for modulating the effect of tnf and il-1
US4965271A (en) 1986-12-31 1990-10-23 Hoechst Roussel Pharmaceuticals, Inc. Method of inhibiting the activity of leukocyte derived cytokines
US5359032A (en) 1987-08-26 1994-10-25 Biogen Inc. Interkeukin-1 inhibitor
IL83878A (en) 1987-09-13 1995-07-31 Yeda Res & Dev Soluble protein corresponding to tnf inhibitory protein its preparation and pharmaceutical compositions containing it
IL90339A (en) 1989-05-18 1996-10-16 Yeda Res & Dev Anti-cytotoxic protein and its purification
US5512544A (en) 1987-09-13 1996-04-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Pharmaceutical compositions comprising an anticytokine
IL98078A0 (en) 1991-05-07 1992-06-21 Yeda Res & Dev Pharmaceutical compositions comprising an anticytokyne
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US5153265A (en) 1988-01-20 1992-10-06 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
GB8806339D0 (en) 1988-03-17 1988-04-13 Hoffmann La Roche Monoclonal antibodies
GB8807803D0 (en) 1988-03-31 1988-05-05 Glaxo Group Ltd Biochemical product
US5256642A (en) 1988-04-01 1993-10-26 The Johns Hopkins University Compositions of soluble complement receptor 1 (CR1) and a thrombolytic agent, and the methods of use thereof
IL89790A (en) 1988-04-01 2002-05-23 Johns Hopking University Sequences of nucleic acids encoding and cells producing CR1 protein and methods for its production and purification
US5214131A (en) 1988-05-06 1993-05-25 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, modified peptides and production thereof
KR0148009B1 (ko) 1988-05-27 1998-08-01 그래고리 비. 아보트 인터루킨-1 억제제
US5075222A (en) 1988-05-27 1991-12-24 Synergen, Inc. Interleukin-1 inhibitors
JPH0240399A (ja) 1988-07-27 1990-02-09 Takeda Chem Ind Ltd 線維芽細胞増殖因子ムテインの複合体あるいは組成物
US5811261A (en) 1988-09-12 1998-09-22 Yeda Research And Development Co. Ltd. Expression of the recombinant tumor necrosis factor binding protein I (TBP-I)
IL95064A0 (en) * 1990-07-12 1991-06-10 Yeda Res & Dev Molecular cloning of tnf binding protein
IL94039A (en) 1989-08-06 2006-09-05 Yeda Res & Dev Antibodies to tbp - 1 and their use
US5359037A (en) 1988-09-12 1994-10-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies to TNF binding protein I
GB8824592D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Purification process
GB8824869D0 (en) 1988-10-24 1988-11-30 Stevenson G T Synthetic antibody
US5681566A (en) 1988-10-24 1997-10-28 3I Research Exploitation Limited Antibody conjugates with two or more covalently linked FC regions
US5162430A (en) 1988-11-21 1992-11-10 Collagen Corporation Collagen-polymer conjugates
WO1990005534A1 (en) 1988-11-23 1990-05-31 Genentech, Inc. Polypeptide derivatives
JPH04502469A (ja) 1988-12-22 1992-05-07 ゾマ　コーポレイション ヒンダードカップリング剤および方法
US5089261A (en) 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
CA2011450C (en) 1989-03-07 2002-06-04 Tadatsugu Taniguchi Recombinant b-chain of the il-2 receptor
EP0386289A1 (en) 1989-03-07 1990-09-12 Taniguchi, Tadatsugu, Dr. Recombinant interleukin-2 receptor
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
JPH03164179A (ja) * 1989-04-21 1991-07-16 Boehringer Ingelheim Internatl Gmbh Ｔｎｆレセプター、ｔｎｆ結合たん白質およびこれらをコードするｄｎａ
US7264944B1 (en) * 1989-04-21 2007-09-04 Amgen Inc. TNF receptors, TNF binding proteins and DNAs coding for them
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
DE3922089A1 (de) 1989-05-09 1990-12-13 Basf Ag Neue proteine und ihre herstellung
US6143866A (en) * 1989-07-18 2000-11-07 Amgen, Inc. Tumor necrosis factor (TNF) inhibitor and method for obtaining the same
AU630497B2 (en) 1989-09-05 1992-10-29 Immunex Corporation Tumor necrosis factor-alpha and -beta receptors
NZ235148A (en) 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
US5395760A (en) 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
US5605690A (en) 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
EP0939121B2 (de) 1989-09-12 2007-12-26 AHP Manufacturing B.V. TFN-bindende Proteine
US5350836A (en) * 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
US5234903A (en) 1989-11-22 1993-08-10 Enzon, Inc. Chemically modified hemoglobin as an effective, stable non-immunogenic red blood cell substitute
ES2103305T3 (es) 1989-11-29 1997-09-16 Amgen Boulder Inc Produccion de inhibidor de interleuquina-1 humana recombinada.
US5136021A (en) 1990-02-27 1992-08-04 Health Research, Inc. TNF-inhibitory protein and a method of production
US5171264A (en) 1990-02-28 1992-12-15 Massachusetts Institute Of Technology Immobilized polyethylene oxide star molecules for bioapplications
US6552170B1 (en) 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US6458360B1 (en) 1990-04-25 2002-10-01 The Johns Hopkins University Soluble complement regulatory molecules
GB2246569A (en) 1990-06-15 1992-02-05 Charing Cross Sunley Research Tumour necrosis factor - alpha binding protein
WO1992001002A1 (fr) 1990-07-11 1992-01-23 Teijin Limited Inhibiteur de l'activite du facteur de la necrose tumorale et son procede de preparation
GB9015908D0 (en) 1990-07-19 1990-09-05 Celltech Ltd Multivalent immunoglobulin
WO1992001474A1 (en) 1990-07-20 1992-02-06 Kabi Pharmacia Ab Heterobifunctional reagents and conjugates with oxaalkylene units for amphiphilic bridge structures
EP0546055B1 (en) 1990-08-31 1996-07-10 Regents Of The University Of Minnesota Polyethylene glycol derivatives for solid-phase applications
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
DK0567566T4 (da) 1991-01-18 2007-10-22 Amgen Inc Fremgangsmåder til behandling af tumornekrosefaktor-medierede sygdomme
AU664030B2 (en) 1991-02-27 1995-11-02 Micromet Ag Serine-rich peptide linkers
JP3693671B2 (ja) * 1991-03-15 2005-09-07 アムゲン インコーポレーテッド ポリペプチドのｐｅｇ化
JPH06506217A (ja) 1991-03-18 1994-07-14 エンゾン，インコーポレーテッド ポリペプチドまたはグリコポリペプチドとポリマーとのヒドラジン含有結合体
DE69213240T2 (de) 1991-07-04 1997-04-24 Immunodex K/S, Glostrup Wasserlösliche reagenzien und konjugate auf polymerbasis, die vom divinylsulfon abgeleitete reste enthalten
IL99120A0 (en) * 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5569779A (en) 1991-12-23 1996-10-29 Albemarle Corporation Polyfunctional michael addition products
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
WO1994001483A1 (en) 1992-07-02 1994-01-20 Collagen Corporation Biocompatible polymer conjugates
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
EP0620739A4 (en) 1992-09-15 1997-01-15 Immunex Corp Method of treating tnf-dependent inflammation using tumor necrosis factor antagonists.
US6270766B1 (en) 1992-10-08 2001-08-07 The Kennedy Institute Of Rheumatology Anti-TNF antibodies and methotrexate in the treatment of arthritis and crohn's disease
EP0622394A1 (en) 1993-04-30 1994-11-02 S.A. Laboratoires S.M.B. Reversible modification of sulfur-containing molecules with polyalkylene glycol derivatives and their use
EP0710121B1 (en) 1993-07-30 2000-10-11 Kennedy Institute Of Rheumatology Method for treating multiple sclerosis
GB9317618D0 (en) 1993-08-24 1993-10-06 Royal Free Hosp School Med Polymer modifications
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
HUT76666A (en) * 1994-07-22 1997-10-28 Hoffmann La Roche Pharmaceutical compositions comprising a chimaeric tnf binding protein
TW313568B (cs) 1994-12-20 1997-08-21 Hoffmann La Roche
US7429646B1 (en) * 1995-06-05 2008-09-30 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to human tumor necrosis factor receptor-like 2
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0393438A2 (de) * 1989-04-21 1990-10-24 Synergen, Inc. TNF-Rezeptor, TNF bindende Proteine und dafür kodierende DNAs
EP0398327A1 (en) * 1989-05-18 1990-11-22 Yeda Research And Development Company Limited Tumor necrosis factor binding protein II, its purification and antibodies thereto
EP0422339A1 (en) * 1989-07-18 1991-04-17 Amgen Boulder Inc. Tumor necrosis factor (TNF) inhibitor and method for obtaining the same
EP0433900A1 (en) * 1989-12-13 1991-06-26 Yeda Research And Development Company Limited Expression of the recombinant tumor necrosis factor binding protein I (TBP-I)
WO1992007076A1 (en) * 1990-10-18 1992-04-30 The Mathilda And Terence Kennedy Institute Of Rheumatology Modified human tnfalpha (tumor necrosis factor alpha) receptor
WO1996016221A1 (de) * 1994-11-22 1996-05-30 Ulrich Theiss Verfahren zur übergabe von wäschestücken und vorzugsweise zur durchführung des verfahrens dienende muldenmangel sowie vorrichtung

Also Published As

Publication number Publication date
IL127874A0 (en) 1999-10-28
EA003900B1 (ru) 2003-10-30
CZ499A3 (cs) 2000-01-12
US6989147B2 (en) 2006-01-24
PL189309B1 (pl) 2005-07-29
TW555765B (en) 2003-10-01
BG103091A (en) 2000-05-31
WO1998001555A2 (en) 1998-01-15
EA199900095A1 (ru) 2000-02-28
TR199700610A2 (xx) 1998-01-21
US7732587B2 (en) 2010-06-08
BG64910B1 (bg) 2006-08-31
CA2259156C (en) 2010-09-07
NO990086D0 (no) 1999-01-08
DE69737814D1 (de) 2007-07-26
JP2002514048A (ja) 2002-05-14
JP2009280612A (ja) 2009-12-03
AU1112101A (en) 2001-04-05
KR20000023695A (ko) 2000-04-25
NZ333647A (en) 2000-09-29
ES2288304T3 (es) 2008-01-01
DE69737814T2 (de) 2008-03-06
YU299A (en) 1999-11-22
EP0914431B1 (en) 2007-06-13
WO1998001555A3 (en) 1998-05-22
EP0914431A2 (en) 1999-05-12
AU774307B2 (en) 2004-06-24
AU3601397A (en) 1998-02-02
PL331240A1 (en) 1999-07-05
NO990086L (no) 1999-03-09
CA2259156A1 (en) 1998-01-15
SK1599A3 (en) 2001-02-12
US20050250696A1 (en) 2005-11-10
US20030054439A1 (en) 2003-03-20
TR199700610A3 (tr) 1998-01-21
ATE364695T1 (de) 2007-07-15
BR9710350A (pt) 1999-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ296835B6 (cs) Zkrácený rozpustný receptor faktoru nekrotizujícího tumory, zpusob jeho prípravy a pouzití, vazebnýprotein, polynukleotid, vektor, bunka, farmaceutická kompozice a zpusob její prípravy a kit
US6294170B1 (en) Composition and method for treating inflammatory diseases
AU724960B2 (en) Composition comprising interleukin-1 inhibitor and controlled release polymer
US6096728A (en) Composition and method for treating inflammatory diseases
US6306820B1 (en) Combination therapy using a TNF binding protein for treating TNF-mediated diseases
CA2273852C (en) Combination therapy using an il-1 inhibitor for treating il-1 mediated diseases
AU748575B2 (en) Composition comprising interleukin-1 inhibitor and controlled release polymer
AU771793B2 (en) Combination therapy using a TNF binding protein for treating TNF-mediated diseases
EP1352656A2 (en) Combination therapy using a TNF binding protein for treating TNF-mediated diseases
MXPA99005224A (en) Combination therapy using a tnf binding protein for treating tnf-mediated diseases
AU5400701A (en) Combination therapy using an il-1 inhibitor for treating il-1 mediated diseases

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20090709