SK1599A3 - Truncated soluble tumor necrosis factor type-i and type-ii receptors - Google Patents

Truncated soluble tumor necrosis factor type-i and type-ii receptors Download PDF

Info

Publication number
SK1599A3
SK1599A3 SK15-99A SK1599A SK1599A3 SK 1599 A3 SK1599 A3 SK 1599A3 SK 1599 A SK1599 A SK 1599A SK 1599 A3 SK1599 A3 SK 1599A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
stnfr
cys
seq
truncated
protein
Prior art date
Application number
SK15-99A
Other languages
English (en)
Inventor
Eric F Fischer
Iii Carl K Edwards
Gary L Kieft
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of SK1599A3 publication Critical patent/SK1599A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0325—Animal model for autoimmune diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Description

Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka problematiky zápalov. Konkrétnejšie sa predkladaný vynález sa týka problematiky skrátených receptorov faktora nekrotizujúceho tumory (truncated tumor necrosis factor receptors - sTNFRs).
Skrátené sTNFR majú nasledovný vzorec: Rj.- [Cys19-Cys103] -R2, kde [Cys19-Cys103] predstavuje zvyšky 19 až 103 sTNFR-Ι a kde ďalej Ri predstavuje metionylovanú alebo nemetionylovanú aminoskupinu Cys19 alebo aminokyselinového zvyšku (alebo zvyškov) aminokyselinového konca vybraných zo skupiny:
C
IC
SIC
NSIC NNSIC (SEQ ID NO:15) (SEQ ID NO:16)
QNNSIC (SEQ ID NO:17)
PQNNSIC (SEQ ID NO:18)
HPQNNSIC (SEQ ID NO:19)
IHPQNNSIC (SEQ ID NO:20)
YIHPQNNSIC (SEQ ID NO:21)
KYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:22)
GKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:23)
QGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:24)
PQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:25)
CPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:26)
VCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:27)
SVCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:28)
DSVCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:29)
a kde R2 predstavuje karboxyskupinu Cys103 alebo karboxyskupinu
karboxy-koncového aminokyselinového zvyšku vybraného zo
skupiny: F
JT FN
FNC
FNCS (SEQIDNO:30)
FNCSL (SEQ IDN0.-31) .
FNCSLC (SEQIDNO:32) '
FNCSLCL (SEQ ID NO:33);
a od nich odvodených obmien alebo derivátov, ale za predpokladu že keď Ri predstavuje metionylovanú alebo nemetiolovanú aminoskupinu aminokyselinovej sekvencie VCPQGKYIHPQNNSIC alebo odtiaľ odvodené N-terminálne skrátenie 1 až 15 zvyškov, potom Ri-[Cys19-Cys103]-R2 nie je pridaný variant vzorca Ri~ [Cys19-Cys103] FCCSLCL-R3, kde R3 predstavuje karboxyskupinu aminokyselinových zvyškov jAsn111-Asn161 alebo skrátenie na karboxylovom konci Asnm-Asn161.
Doterajší stav techniky
Zápal je obranná reakcia tela na poranenie spôsobené napríklad mechanickým poškodením, infekciou alebo pôsobením antigénov. Zápalová reakcia sa môže prejaviť patologicky, keď je zápal indukovaný nevhodnými stimulmi (ako napríklad autoantigénom), keď sa prejavuje výrazným spôsobom alebo keď stále pretrváva aj po odstránení pôvodného škodlivého činidla.
Takáto zápalová reakcia môže zahŕňať produkciu určitých cytokinov.
Zatiaľ čo etiológia zápalov nie je doteraz úplne objasnená, v poslednom čase sa zlepšila naša znalosť molekulových aspektov zápalov. Tento výskum viedol k identifikácii určitých cytokinov, o ktorých sa predpokladá, že hrajú výraznú úlohu v procesoch zápalu. Cytokiny sú extracelulárne proteiny, ktoré modifikujú chovanie buniek, najmä tých buniek, ktoré sú v najbližšom okolí miesta syntézy a uvoľňovania cytokinov. Faktory nekrotizujúce tumory (TNFs) tvoria triedu cytokinov produkovaných radom typov buniek, vrátane monocytov a makrofágov.
Už predtým sa opísali najmenej dva typy TNF, konkrétne TNF alfa (TNF a) a TNF beta (TNF β alebo lymfotoxín (lymphotoxin)). Obidva sú aktívne ako trimérna molekula (trimeric molecule) a predpokladá sa, že iniciujú prenos bunkových signálov prepojením re^ceptorov (Engelmann et al. (1990), J. Biol.
Chem., 265:14497-14504).
Niektoré dôkazy naznačujú, že TNF-α a TNF-β sú hlavnými cytokínmi zápalu. Tieto známe TNF majú dôležité fyziologické účinky rtä rad rozdielnych cieľových buniek, ktoré sa zúčastňujú na zápalovej odpovedi na rôzne podnety, napríklad na infekciu alebo poranenie. Proteiny podnecujú sekréciu latentnej kolagenázy (latent collagenase) a prostagladínu E2 pri fibroblastoch aj pri synoviálnych bunkách (sinovial cells) a ďalej spôsobujú, že bunky osteocytov stimulujú resorpciu kostí. Tiefo proteiny zvyšujú povrchové adhezívne vlastnosti endoteliálnych buniek voči neutrofilom. Spôsobujú aj to, že endoteliálne bunky sekretujú koagulačnú aktivitu a redukujú ich schopnosť rozkladať (lysé) zrazeniny. Navyše presmerujú aktivitu adipocytov (adipocyte) od ukladania lipidov inhibíciou expresie enzýmu lipoproteínová lipáza (lipoprotein lipase). TNF taktiež podnecujú u hepatocytov syntézu jednej triedy proteínov známych ako „reaktanty akútnej fázy (acute phase reactants), ktoré pôsobia na hypotalamus ako pyrogény (pyrogens) (Selby et al. (1988), Lancet, 1(8583): 483; Starness, Jr. et al. (1988) J. Clin. Invest., 82: 1321; Oliff et al. (1987), Celí, 50: 555 a Wage et al. (1987), Lancet, 1(8529):355). Aj preklinické výsledky na rôznych zvieracích modeloch zápalov (vrátane reumatickej artritídy) naznačujú, že inhibícia TNF má významný dopad na vývoj choroby a jej vážnosť (Dayer et al. (1994), European Cytokine NetWork, 5(6):563-571 a Feldman et al. (1995), Annals Of The New York Academy Of Sciences, 66:272-278). Aj nedávne predbežné klinické testy na luďoch s reumatickou artritídou s inhibítormi TNF ukázali sľubné výsledky (Rankin et al. (1995), British Journal Of Rheumatology, 3(4):4334-4342; Elliot et al. (1995), Lancet, 344:1105-1110; Tak et al. (1996), Arthritis and Rheumatism, 39:1077-1081; a Paleolog et al. (1996), Arthritis and Rheumatism, 39:1082-1091.
Proteínové inhibítory TNF sa uvádzajú v správe EP 308 378 - proteíny izolované z moču pacientov s horúčkou vykazujú TNF inhibičnú aktivitu. Efekt týchto proteínov je pravdepodobne daný kompetitívnym mechanizmom na úrovni receptorov. EP 308 378 opisuje proteíny dostatočne čisté na to, aby mohli byť charakterizované svojím N-koncom. Odkaz ale nič nehovorí o akejkoľvek sekvencii DNA alebo rekombinantne produkovanom inhibítore TNF.
Existujú ale aj údaje o rekombinantne pripravených inhibítoroch TNF. Napríklad EP 393 438 a EP 422 339 uvádza aminokyselinové a nukleotidové seekvencie hotového (mature) rekombinantného ľudského „30 kDa inhibítora TNF (známeho aj ako receptor p55 a ako sTNFR-I) a hotového rekombinantného ľudského „40 kDa inhibítora (známeho aj ako receptor p75 a ako sTNFR-II); opisuje aj ich modifkované formy, ako napríklad fragmenty, funkčné odvodeniny a varianty. EP 393 438 a
ΕΡ 422 339 uvádza aj metódy izolácie génov kódujúcich tieto inhibítory, klonovanie príslušných génov vo vhodných vektoroch a bunkách a expresiu génov vedúcu k produkcii inhibítorov. Hotový rekombinantný ľudský 30 kDa inhibítor TNF a hotový rekombinantný ľudský 40 kDa inhibítor je schopný inhibovať TNF (EP 393 438, EP 422 339, PCT Publication No. WO 92/16221 a PCT Publication No. WO 95/34326.
sTNFR-I a sTNFR-II sú členmi receptorovej superrodiny nervový rastový faktor/TNF, receptorov, ktoré zahŕňajú receptor nervového rastového faktora (nerve growth factor reeceptor - NGF), antigén CD40 B buniek, Fas antigén a CD27 a CD30 antigény (Smith et al. (1990), Science, 248: 10191023) .
Naj konzervatívnejšia vlastnosť v tejto skupine bunkových povrchových receptorov je na cysteín bohatá, extracelulárny ligand viažuca doména, ktorá môže byť rozdelená do štyroch opakujúcich sa motívov s asi 40 aminokyselinami a ktorá obsahuje 4 až 6 cysteínových zvyškov na značne konzervovaných pozíciách (Smith et al. (1990)), viď vyššie).
EP 393 438 ďalej pojednáva o 40 kDa TNF inhibítore Δ51 a 40 kDa TNF inhibítore Δ53, čo sú skrátené verzie rekombinantnéhó' 40 kDa proteínu inhibítora TNF s celou dĺžkou, kde sú odstránené aminokyselinové zvyšky 51 alebo 53 na karboxykonci hotového proteínu. Odborník ocení, že štvrtá doména 30 kDa inhibítora TNF aj 40 kDa inhibítora nie je nutná na inhibíciu TNF. Tento fakt bol potvrdený viacerými skupinami. Pripravili sa varianty 30 kDa a 40 kDa inhibítorov TNF s odstránenými doménami a tieto varianty bez štvrtej domény si zachovávajú úplnú TNF väzbovú aktivitu; naproti tomu varianty bez prvej, druhej alebo tretej domény si nezachovávajú TNF väzbovú aktivitu (Corcoran et al. (1994), Eur. J. Biochem., 223:831-840; Chih-Hsueh et al. (1995) The Journal of Biological Chemistry, 270(6):2874-2878 a Scallon et al (1995) Cytokine, 7(8):759-770).
Vzhľadom na relatívne nízku »inhibíciu cytotoxicity, ktorú vykazuje 30kDa inhibítor TNF a 40 kDa inhibíttor TNF (Butler et al. (1994), Cytokine, 6(6):616-623), rôzne skupiny pripravili diméry proteínov TNF inhibítorov (Butler et al. 1994, viď vyššie a Martin et al. (1995), Exp. Neurol., 131:221-228). Diméry ale môžu podnietiť protilátkovú odpoveď (Martin et al. (1995), viď vyššie a Fisher et al. (1996),
The New England Journal of Medicíne, 334(26):1697-1702).
Cieľom predkladaného vynálezu je poskytnúť funkčne aktívne skrátené sTNFR. Tento a ďalšie ciele predkladaného vynálezu budú jasné z nasledovného opisu.
Podstata vynálezu
Predkladaný vynález sa venuje funkčne aktívnym skráteným formám sTNFR-Ι a sTNFR-II, ktoré sa ďalej uvádzajú ako „skrátený (skrátené) sTNFR. Skrátené sTNFR sú modifikované formy sTNFR-Ι a sTNFR-II, ktoré neobsahujú štvrtú doménu (aminokyselinové zvyšky Thr127-Asp161 v sTNFR-Ι a aminokyselinové zvyšky Pro141-Thr179 v sTNFR-II); časť tretej domény (aminokyselinové zvyšky Asn111-Cys126 v sTNFR-Ι a Pro123-Lys140 v sTNFR-II); a ktoré prípadne neobsahujú časť prvej domény (aminokyselinové zvyšky Asp1-Cys19 v sTNFR-Ι a Leu1-Cs32 v sTNFR-II). Tieto nové inhibítory TNF (napríklad TNF-α a/alebo TNF-β) majú všeobecné uplatnenie.
Skrátené sTNFR predkladaného vynálezu zahŕňajú proteíny, ktoré zodpovedajú vzorcu Ri-[Cys19-Cys103]-R2 a R4-[Cys32Cys115]-R5. Tieto proteíny sú skrátené formy sTNFR-Ι a sTNFRII.
Vzorcom „Ri- [Cys19-Cys103] -R2, sa rozumie jeden alebo viac proteínov, kde [Cys19-Cys103] zodpovedajú sTNFR-Ι zvyškom až 103 pri číslovaní aminokyselinových zvyškov podlá schémy na obrázku 1 (SEQ ID NO:2); kde Ri predstavuje metionylovanú alebo nemetionylovanú aminoskupinu Cys19 alebo aminokoniec niektorého aminokyselinového zvyšku(ov) z nasledovnej skupiny:
C
IC
SIC
NSIC (SEQ ID NO:15)
NNSIC (SEQ ID NO:16)
QNNSIC (SEQ ID NO:17)
PQNNSIC (SEQ ID NO:18)
HPQNNSIC (SEQ ID NO:19)
IHPQNNSIC (SEQ ID NO:20)
YIHPQNNSIC (SEQ ID NO:21)
KYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:22)
GKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:23)
QGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:24)
PQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:25)
CPQQKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:26)
VCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:27)
SVCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:28)
DSVC PQGKYIH PQNN SIC (SEQ ID NO:29)
a kde R2 predstavuje karboxyskupinu Cys103 alebo karboxykonce aminokyselinového zvyšku vybraného zo skupiny:
F
FN
FNC
FNCS (SEQ ID NO:30)
FNCSL (SEQ ID NO:31)
FNCSLC (SEQ ID NO:32)
FNCSLCL (SEQ ID NO:33);
a ich variantov, ale za predpokladu, že keď Ri predstavuje metionylovanú alebo nemetiolovanú aminoskupinu aminokyselinovej sekvencie VCPQGKYIHPQNNSIC alebo skrátenie N-konca o 1 až 15 zvyškov, potom proteín Rx- [Cys19-Cys103] -R2 nie je variantom Ri- [Cys19-Cys103]-FNCSLCL-R3, kde R3 predstavuje karboxyskupinu aminokyselinovej sekvencie Asnm-Asn161 z obrázka 1 alebo jeho skrátenie na karboxykonci.
Nasledovné molekuly môžu slúžiť ako príklady skrátených sTNFR-I predkladaného vynálezu: NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC[Cys19-Cys103]-FC-COOH (uvádzaná aj ako sTNFR-I 2.6D/C105); NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC- [Cys19-Cys103] -FNCSL-COOH (uvádzaná aj ako sTNFR-I 2.6D/C106); NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19Cys103]-FN-COOH (uvádzaná aj ako sTNFR-I 2.6D/N105); NH2MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (uvádzaná aj ako sTNFR-I 2.3D/d8); NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (uvádzaná aj ako sTNFR-I 2.3D/dl8) a NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (uvádzaná aj ako sTNFR-I 2.3D/dl5) buď metionylované alebo nemetionylované a ich varianty a odvodeniny.
Pod „R4-[Cys32-Cys115] -R5 sa rozumie jeden alebo viac proteínov, kde [Cys32-Cys115] predstavujú zvyšky Cys32 až Cys115 sTNFR-I podľa schémy použitej na obrázku 8 (SEQ ID NO:35) na uľahčenie porovnania a kde R4 predstavuje metionylovanú alebo nemetionylovanú aminoskupinu Cys32 alebo aminokyselinový zvyšok (zvyšky) na aminokonci vybrané zo skupiny:
C
MC
QMC
AQMC (SEQ ID NO: 36)
TAQMC (SEQ ID NO:37)
QTAQMC (SEQ ID NO:38)
DQTAQMC (SEQ ID NO:39)
YDQTAQMC (SEQ ID NO:40)
YYDQTAQMC (SEQ ID N0:41)
EYYDQTAQMC (SEQ ID NO:42)
REYYDQTAQMC (SEQ ID NO:43)
LREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:44)
RLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:45)
CRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:46)
TCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:47)
STCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:48)
GSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:49)
PGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:50)
EPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:51)
PEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:52)
APEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:53)
YAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:54)
PYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:55)
TPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:56)
FTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:57)
AFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:58)
VAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:59)
QVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:60)
AQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:61)
PAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:62)
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:63)
kde R3 predstavuje karboxyskupinu Cys115 alebo karboxy-
skupinu karboxykonca aminokyselinových zvyškov vybraných zo skupiny:
A
AP
APL
APLR (SEQ ID NO:64)
APLRK (SEQ ID NO:65)
APLRKC (SEQ ID NO:66)
APLRKCR (SEQ ID NO:67)
a ich variantov, ale za predpokladu, že keď R4 predstavuje metionylovanú alebo nemetionylovanú aminoskupinu aminokyselinovej sekvencie TCRLREYYDQTAQMC alebo skrátenie N-konca o 1 až 15 zvyškov, potom R4-[Cys32-Cys115] -R5 nie je variantom vzorca R4-[Cys32-Cys115]-APLRKCR-R6, kde R6 predstavuje karboxyskupinu aminokyselinovej sekvencie Pro123-Thr179 z obrázka 8 alebo skrátenie jeho karboxykonca.
V jednom aspekte predkladaného vynálezu sa môžu pripraviť skrátené sTNFR v glykozylovanej alebo neglykozylovanej forme. Skrátené sTNFR sa pripravujú technikami rekombinantného génového inžinierstva. Okrem toho sa skrátené sTNFR môžu syntetizovať chemickými technikami alebo kombináciou rekombinantných a chemických techník.
V inom aspekte predkladaného vynálezu sa môžu skrátené sTNFR modifikovať pripojením skrátených sTNFR k polyméru rozpustnému vo vode. Napríklad skrátené sTNFR sa môžu konjugovať k jednej alebo viacerým molekulám polyetylénglykolu s cieľom zlepšiť farmakokinetickú účinnosť zväčšením zdanlivej molekulovej hmotnosti molekuly.
Ďalší aspekt predkladaného vynálezu zahŕňa rôzne polynukleotidy kódujúce skrátené sTNFR. Vhodné nukleotidové sekvencie zahŕňajú napríklad tie konkrétne uvedené na obrázkoch a taktiež degenerované sekvencie a ich prirodzene sa vyskytujúce alelické varianty. Takéto sekvencie nukleových kyselín sa môžu použiť pri expresii skrátených sTNFR v eukaryotických alebo prokaryotických hostiteľských bunkách, kde sú produkty expresie alebo ich deriváty charakterizované schopnosťou ovplyvňovať aktivitu TNF.
Ďalším aspektom predkladaného vynálezu sú vektory obsahujúce polynukleotidy kódujúce skrátené sTNFR funkčne spojené (operatively link) s amplifikačnými a/alebo expresiu riadiacimi sekvenciami. Prokaryotické aj eukaryotické hostiteľské bunky môžu byť stabilne transformované alebo transfekované takýmito vektormi na expresiu skrátených sTNFR. Predkladaný vynález ďalej zahŕňa rekombinantnú produkciu skrátených sTNFR. Hostitelské bunky obsahujúce takéto polynukleotidy sa pestujú vo vhodnom živnom médiu a bunkami exprimované skrátené sTNFR sa prípadne izolujú z hostiteľských buniek a/alebo živného média.
Ďalším aspektom predkladaného vynálezu sú farmaceutické zmesi obsahujúce skrátené sTNFR alebo ich deriváty. Typicky môžu byť skrátené sTNFR alebo ich deriváty pripravené v spojení s farmaceutický vhodnými nosičmi. Na ulahčenie výroby, uskladnenia, manipulácie, dopravy a/alebo účinnosti skrátených sTNFR a ich variantov sa môže použiť rad materiálov.
Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka metód ovplyvnenia (methods of modulating) aktivity TNF. Konkrétne choroby sprostredkované TNF (napríklad choroby sprostredkované TNF-α a/alebo TNF-β) sa môžu liečiť podávaním terapeuticky účinných množstiev skrátených sTNFR alebo ich derivátov.
Polynukleotidy kódujúce skrátené sTNFR sa môžu využiť aj v bunkovej terapii alebo v génovej terapii.
Skrátené sTNFR predkladaného vynálezu sú vhodné najmä na produkciu proteínu vo velkých množstvách. Napríklad sTNFR-Ι má deamidované miesto vnútri aminokyselinovej sekvencie 111 až 126 (aminokyseliny Asn111-Gly126) . Predpokladá sa, že absencia tohto miesta zvyšuje biochemickú stabilitu purifikovaného proteínu a znižuje možnú degradáciu produktu, čo sa prejaví zvýšením stability proteínu pri jeho skladovaní. Skrátené sTNFR majú menej disulfidových mostíkov ako ostatné skôr objavené proteíny inhibítorov TNF. Napríklad sTNFR-Ι má dva sulfidové mostíky vnútri sekvencie aminokyselín 111 až 126 a tri disulfidové mostíky vnútri sekvencie aminokysellín 127 až 161; sTNFR-II má disulfidový mostík medzi Cys121 a Cys139, Cs142 a Cys157 a Cys163 a Cys178. Znížený počet disulfidových mostíkov je dôležitý preto, že vyšší počet týchto väzieb môže komplikovať proces opätovného skladania proteínu. Je prekvapivé, že skrátené sTNFR majú menej miest pre antigénne epitopy, ako majú ostatné skôr opísané proteíny inhibítorov TNF (napríklad skrátená forma sTNFR-Ι s prvými troma doménami má nový epitop vzniknutý odhalením určitých zvyškov, viď príklad III), čo značne zníži antigénnosť a ďalej dochádza k významnému zníženiu rýchlosti odbúravania pri opakovanom podávaní. Predpokladá sa, že znížená imunogénnosť skrátených sTNFR je vhodná na liečenie TNF-sprostredkovaných ochorení, najmä chronických zápalových ochorení.
Ďalšie aspekty a výhody vynálezu budú odborníkom jasné pri nasledovnom opise, kde sú podrobne opísané obvyklé metódy (practice) predkladaného vynálezu.
Detailný opis vynálezu
Predkladaný vynález je založený na neočakávanom zistení, že sa môže zmenšiť veľkosť sTNFR-Ι aj TNFR-II nielen odstránením štvrtej domény, ale aj časti tretej domény a prípadne aj častí prvej domény pri zachovaní biologickej aktivity a znížení antigénnosti. Produkcia týchto biologicky aktívnych skrátených sTNFR alebo ich derivátov sa pokladá za výhodnú minimálne z nasledovných dôvodov. Po prvé tieto molekuly môžu mať o jedno potenciálne destabilizujúce deamidované miesto menej. Po druhé tieto molekuly majú menej disulfidových mostíkov a to uľahčí prípadnú purifikáciu a opätovné skladanie. Po tretie tieto molekuly majú menší počet miest pre možné antigénne epitopy.
Tu používaný termín „skrátený(é) sTNFR zahŕňa jeden alebo viac biologicky aktívnych, syntetických alebo rekombinantných, molekúl vzorca Ri-[Cys19-Cys103]-R2 alebo
R4-[Cys32-Cys115]-R5 a ich varianty (vrátane inzerčných, substitučných a delečných), ktoré sú opísané nižšie.
Tu používaný termín „biologicky aktívny znamená, že skrátený sTNFR vykazuje podobné TNF inhibičné vlastnosti ako sTNFR-Ι a/alebo sTNFR-II, aj keď nie nutne všetky a nie nutne v celom rozsahu. Všeobecne skrátené sTNFR a ich odvodeniny majú schopnosť inhibovať TNF. Biotesty skrátených sTNFR sú opísané nižšie v časti Príklady II. Výber konkrétnych TNF inhibičných vlastností závisí od požadovaného použitia skráteného sTNFR.
Skrátené sTNFR proteíny sa môžu výhodne produkovať rekombinantnými tchnikami v bakteriálnych, cicavčích alebo hmyzích .bunkových systémoch a môžu byť buď v glykozylovanej, alebo neglykozylovanej forme. Alternatívne sa môžu syntetizovať chemicky. Produkčné metódy preferované v súčasnosti sú opísané detailne nižšie.
Všetky skrátené sTNFR sa môžu typicky izolovať a purifikovať na značnú čistotu a zbaviť tak ostatných proteínových materiálov (napríklad neskrátených sTNFR). Uprednostňuje sa, keď je skrátený sTNFR na asi 80 % zbavený ostatných proteínov, ktoré môžu byť prítomné vzhľadom na produkčnú techniku použitú pri príprave skrátených sTNFR. Je výhodne', ak je proteín ešte čistejší (na viac ako 90 %, 95 % alebo na viac ako 98 %). Je ale cenné, keď sa požadovaný proteín môže pred podávaním kombinovať s ďalšími aktívnymi komponentmi, chemickými zlúčeninami a/alebo vhodnými farmaceutickými materiálmi, ako sa opisuje podrobnejšie nižšie.
Skrátené sTNFR
Skrátené sTNFR predkladaného vynálezu môžu byť jedným alebo viacerými proteínmi reprezentovanými nasledovným vzorcom:
Ri-[Cys19-Cys103]-R2, kde [Cys19-Cys103] predstavuje zvyšky 19 až 103 (pri označení aminokyselinových zvyškov použitom na obrázku 1 (SEQ ID NO:2)), kde Ri predstavuje metionylovanú alebo nemetionylovanú aminoskupinu Cys19 alebo aminokyselinový zvyšok (zvyšky) na aminokonci patriace do nasledovnej skupiny:
C
zc
SIC
NSIC (SEQ ID NO:15)
NNSIC (SEQ ID NO:16)
QNNSIC (SEQ ID NO:17)
PQNNSIC (SEQ ID NO:18)
HPQNNSIC (SEQ ID NO:19)
IHPQNNSIC (SEQ ID NO:20)
YIHPQNNSIC (SEQ ID NO:21)
KYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:22)
GKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:23)
QGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:24)
PQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:25)
CPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:26)
VCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:27)
SVCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:28)
DSVCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:29)
a kde R2 predstavuje karboxyskupinu Cys103 alebo aminokyselinový zvyšok karboxykonca vybraný z nasledovnej skupiny:
F
FN
FNC
FNC S FNC S L (SEQ ID NO:30)
(SEQ ID N0:31)
FNCSLC (SEQ ID NO:32)
FNCSLCL (SEQ ID NO:33);
a ich varianty, ale za predpokladu, že keď Ri predstavuje metionylovanú alebo nemetionylovanú aminoskupinu aminokyselinovej sekvencie VCPQGKYIHPQNNSIC alebo skrátenie N-konca o 1 až 15 zvyškov, potom Rx- [Cys19-Cys103] -R2 protein nie je variantom vzorca Rx- [Cys19-Cys103]-FNCSLCL-R3, kde R3 predstavuje karboxyskupinu aminokyselinovej sekvencie Asn111Asn161 z obrázka 1 alebo skrátenie jeho karboxykonca.
V ďalšom prípade skrátené sTNFR predkladaného vynálezu môžu byť jedným alebo viacerými proteínmi reprezentovanými nasledovným vzorcom:
R4-[Cys32-Cys115]-R5, kde [Cys32-Cys115] reprezentuje sTNFR-II zvyšky Cys32 až Cys115 podlá schémy číslovania aminokyselinových zvyškov na obrázku 8 (SEQ ID NO:35), kde R4 predstavuje metionylovanú alebo nemetionylovanú aminoskupinu Cys32 alebo aminokyselinový zvyšok (zvyšky) na aminokonci patriaci do nasledovnej skupiny:
C
MC
QMC
AQMC (SEQ ID NO:36)
TAQMC (SEQ ID NO:37)
QTAQMC (SEQ ID NO:38)
DQTAQMC (SEQ ID NO:39)
YDQTAQMC (SEQ ID NO:40)
YYDQTAQMC (SEQ ID NO:41)
EYYDQTAQMC (SEQ ID NO:42)
REYYDQTAQMC (SEQ ID NO:43)
LREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:44)
RLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:45)
CRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:46)
TCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:47)
STCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:48)
GSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:49)
PGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:50)
EPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:51)
PEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:52)
APEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:53)
YAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:54)
PYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:55)
TPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:56)
tFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:57)
AFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:58)
VAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:59)
QVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:60)
AGVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:61)
PAQVAFT PYAPE PGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:62)
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO:63)
kde R3 predstavuje karboxyskupinu Cys115 alebo aminokyseli-
nový zvyšok karboxykonca vybraný z nasledovnej skupiny:
A
AP
APL
APLR (SEQ ID NO:64)
APLRK (SEQ ID NO:65)
APLRKC (SEQ ID NO:66)
APLRKCR (SEQ ID NO:67)
a ich varianty, ale za predpokladu, že keď R4 predstavuje metionylovanú alebo nemetionylovanú aminoskupinu aminokyselinovej sekvencie TCRLREYYDQTAQMC alebo skrátenie N-konca o 1 až 15 zvyškov, potom R4- [Cys32-Cys115] -R5 nie je variantom vzorca R4- [Cys32-Cys115] -APLRKCR-Rô, kde Rg predstavuje karboxyskupinu aminokyselinovej sekvencie Pro123-Thr179 z obrázka 8 alebo jeho skrátenie na karboxykonci.
Ďalším aspektom predkladaného vynálezu je jeden alebo viac variantov Ri- [Cys19-Cys103] -R2 a R4-[Cys32-Cys115] -R5 buď metionylovaných alebo nemetionylovaných. Termín „skrátený (skrátené) sTNFR teda zahŕňa jeden alebo viac prirodzene sa vyskytujúcich alelických variantov Ri- [Cys19-Cys103] -R2 a R4[Cys32-Cys115]-R5 a jeden alebo viac variantov proteínov, kde boli aminokyselinové zvyšky v aminokyselinových sekvenciách Ri~ [Cys19-Cys103]-R2 a R4- [Cys32-Cys115] -R5 odstránené („delečné varianty), včlenené (inzerčné varianty) alebo substituované („substitučné varianty).
Delécie sekvencií aminokyselín sú typicky v rozsahu asi od 20 aminokyselinových zvyškov; spravidla sa ale jedná o asi 1 až 10 zvyškov a najčastejšie o 1 až 5 zvyškov, takže nedôjde k narušeniu konformácie proteínu. Myslí sa delécia na N-konci, C-konci a vnútorných intrasekvenciách. Počet celkových delécií a/alebo následných delécií bude zvolený tak, aby sa zachovala terciárna štruktúra proteínu v ovplyvnenej doméne, napríklad cysteínová krížová väzba.
Delécie vnútri aminokyselinovej sekvencie Ri-[Cys19Cys103]-R2 a vnútri aminokyselinovej sekvencie R4-[Cys32Cys115]-R5 sa môžu uskutočňovať v oblasti nízkej homológie so sekvenciami ostatných členov receptorovej rodiny NGF/TNF v skupine bunkových povrchových membránových proteínov. Delécie vnútri aminokyselinovej sekvencie Ri-[Cys19-Cys103]-R2 a vnútri aminokyselinovej sekvencie R4- [Cys32-Cys115] -R5 sa môžu uskutočňovať aj v oblasti významnej homológie so sekvenciami ostatných členov receptorovej rodiny NGF/TNF a potom je väčšia pravdepodobnosť významnej modifikácie biologickej aktivity. Sekvenčná podobnosť medzi členmi NGF/TNF receptorovej rodiny je konkrétne obzvlášť vysoká v oblastiach zodpovedajúcich prvým dvom disulfidovým slučkám domény 1, celej doméne 2 a prvej disulfidovej slučke domény 3 (Banner et al. (1993), Celí, 73:431-445). Príkladom dvoch delečných variantov Ri- [Cys19-Cys103] -R2 sú Ri-[Cys19-(AThr20) - Cys103]-R2 a Ri~ [Cys19-(ACys19-Lys21) Cys103]-R2, kde Ri a R2 zodpovedajú vyššie uvedenej definícii. Príkladom troch delečných variantov R4-[Cys32-Cys115]-R5 sú R4-[Cys32-(ACys115) Cys115]-R5, Rx[Cys19-(ACys115-Lys115) Cys103]-R2 a R4-[Cys32-(ACys115Arg113) Cys115]-R5, kde Ri a R2 zodpovedajú vyššie uvedenej definícii.
Pridanie sekvencii aminokyselín môže zahŕňať fúzie na amino- a/alebo karboxykonci v rozsahu dĺžok od jedného zvyšku do sto alebo viac zvyškov a aj interné intrasekvenčné inzercie jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov. Interné adície sú spravidla v rozsahu 1 až 10 aminokyselinových zvyškov, častejšie v rozsahu 1 až 5 aminokyselinových zvyškov a najčastejšie v rozsahu 1 až 3 aminokyselinových zvyškov.
Adičné varianty aminokonca zahŕňajú pridanie metionínu (napríklad ako výsledok priamej expresie proteínu v bakteriálnych rekombinantných bunkových kultúrach) alebo ďalšie aminokyselinové zvyšky alebo sekvencie. Ďalší príklad inzercie na aminokonci zahŕňa fúziu signálnej sekvencie, niekedy s ostatnými pre-pro sekvenciami, na uľahčenie sekrécie proteínu z rekombinantných hositeľských buniek. Pri prokaryotických hostiteľských bunkách, ktoré nerozoznávajú a nespracovávajú pôvodné signálne sekvencie sTNFR-I a sTNRFII, sa môžu signálne sekvencie nahradiť prokaryotickými signálnymi sekvenciami, napríklad zo skupiny alkalických fosfatáz, peniciláz alebo počiatočnej sekvencie teplotné odolného enterotoxínu II. Pri kvasniciach sa môžu signálne sekvencie vybrať napríklad zo skupiny kvasnicových invertáz, alfa faktora alebo počiatočnej sekvencie kyslej fosfatázy. Pri cicavčích bunkách je expresia pôvodných signálnych sekvencií s-TNFR-I a sTNFR-II (EP 393 438 a EP 422 339) dostatočná, aj keď môžu byť vhodné aj iné cicavčie signálne sekvencie (napríklad sekvencie odvodené od ostatných členov rodiny NGF/TNF).
Adičné varianty na karboxykonci nezahŕňajú pridanie jedného .alebo viacerých aminokyselinových zvyškov, ktoré by ovplyvňovali rekonštitúciu s-TNFR-I alebo sTNFR-II. Je žiaduce, keď adičné varianty na karboxykonci nezahŕňajú pridanie jedného alebo viacerých zvyškov karboxylovej kyseliny, ktoré by ovplyvnili rekonštitúciu tretej alebo štvrtej domény s-TNFR-I alebo sTNFR-II. Príkladom adičného variantu na karboxykonci môžu byť chimerické proteiny zahŕňajúce fúziu Ri-[Cys19-Cys103]-R2 alebo R4-[Cys32-Cys115]-R5 s celou alebo časťou konštantnej domény ťažkého alebo ľahkého reťazca ľudského imunoglobulínu. Takéto chimerické proteiny sa preferujú, keď ich imunoglubulínová časť zahŕňa všetky domény okrem domény konštantnej oblasti ťažkého reťazca ľudského imunoglubulínu, ako je IgG, IgA, IgM alebo IgE (najmä IgG, napríklad IgGl alebo IgG3). Odborník ocení, že (ak TNF viažuca časť stále viaže TNF a imunoglobulínová časť vykazuje jednu alebo viac svojich charakteristických vlastností) sa môže akákoľvek aminokyselina každej imunoglobulínovej časti odstrániť alebo nahradiť jednou alebo viacerými aminokyselinami alebo že sa môže pridať jedna alebo viac aminokyselín.
Ďalšou skupinou sú varianty so substitúciou aminokyseliny. Všetky tieto varianty majú najmenej jeden aminokyselinový zvyšok v Ri- [Cys19-Cys103] -R2 alebo R4-[Cys32Cys115]-Rs odstránený a nahradený odlišnými zvyškami na ich miestach. Substitučné varianty zahŕňajú alelické varianty, ktoré sú charakterizované zmenami v prirodzene sa vyskytujúcich nukleotidových sekvenciách v druhovej populácii, ktoré môžu alebo nemusia mať za následok zmeny aminokyselín. Odborníci môžu použiť akúkoľvek známu informáciu o väzbovom alebo aktívnom mieste polypeptidu pri výbere možných miest pre mutácie.
Jedna metóda identifikácie aminokyselinových zvyškov alebo oblastí pre mutagenézu proteínu sa nazýva „mutagenéza alanínovým vyhľadaním (ala^nine scanning mutagenesis) (Cunningham a Wells (1989), Science, 244:1081-1085, ktorého opis je tu zahrnutý odkazom). V tejto metóde je identifikovaný aminokyselinový zvyšok alebo skupina cieľových zvyškov proteínu (napríklad nabité zvyšky, ako Arg, Asp, His, Lys a Glu) a nahradený neutrálnou alebo negatívne nabitou aminokyselinou (najlepšie alanínom alebo polyalanínom) s cieľom ovplyvniť interakciu aminokyselín s okolitým vodným prostredím vnútri alebo mimo bunky. Tieto zvyšky, ktoré vykazujú funkčnú citlivosť na substitúcie, sú ďalej analyzované včlenením ďalších alebo iných zvyškov na miesto substitúcie. Tak sa vopred určí miesto na včlenenie zmenenej sekvencie nukle21 ových kyselín. Na ďalšiu optimalizáciu vlastností mutácie na danom mieste sa môže uskutočniť alanínové vyhľadávanie alebo náhodná mutagenéza. Pri výsledných variantných polypeptidoch sa zisťuje optimálna kombinácia žiaducej aktivity a stupňa aktivity.
Záujmové miesta na substitučnú mutagenézu zahŕňajú miesta, kde sú aminokyseliny vyskytujúce sa v Ri-[Cys19Cys103]-R2 alebo R4-[Cys32-Cys115]-R5 významne odlišné (čo sa týka podstatnej časti bočného reťazca, náboja a/alebo hydrofóbnosti) od proteínov podobných sTNFR, ako sú napríklad sTNFR rôznych iných druhov alebo iných členov receptorovej rodiny NGF/TNF.
Ďalšie záujmové miesta zahŕňajú tie, v ktorých sú určité zvyšky podobné alebo identické so zodpovedajúcimi miestami pri proteínoch podobných sTNFR-Ι a proteínoch podobných sTNFR-II. Takéto miesta sú všeobecne dôležité pre biologickú aktivitu proteínu. Napríklad skúsený odborník chápe, že pred týmto vynálezom nebol vplyv skrátenia sTNFR-I a sTNFR-II na ich príslušnú trojrozmernú štruktúru predvídateľný. Ale na základe tu uvedených výsledkov odborník ocení, že prvé princípy vývoja stratégie na tvorbu variantných proteínov sa mohli čiastočne zakladať na skôr vysvetlených údajoch pre sTNFR-Ι a sTNFR-II s úplnou dĺžkou. Nasledovné informácie boli teda objasnené o sTNFR (Banner et al. (1993), viď vyššie a Fu et al. (1995), Protein Engineering, 8(12):1233-1241). Ako potenciálne dôležité pre stabilizáciu zodpovedajúcej štruktúry domény 1, 2 a 3 sa identifikovali zvyšky Tyr9, Thr39, His55 domény 1, zvyšky Phe49, Ser63, Asp82 domény 2 a zvyšky Tyr92 a Ser107 domény 3. Zvyšky Pro12 a His55 boli identifikované ako potenciálne vzájomne sa ovplyvňujúce so Ser86-Tyr87 na subjednotke C TNFa. Zvyšky Glu45-Phe49 boli identifikované ako podstata slučky, ktorá sa potenciálne vzájomne ovplyvňuje so zvyškami
Leu29-Arg32 podjednotky A TNFa. Zvyšky Gly48 boli identifikované ako vzájomne sa ovplyvňujúce s Asn19-Pro20 na podjednotke A TNFa. Zvyšky His58-Le60 boli identifikované ako dôležitý prvok v konformácii predĺženého prameňa a interakcia bočného reťazca so zvyškami Arg31-Ala33 na podjednotke A TNFa bola potenciálne identifikovaná so zvyškom His58 sTNFR-Ι, ktoré sa špecificky vzájomne ovplyvňuje so zvyškom Arg31. Zvyšky Lys64-Arg66 boli identifikované ako dôležitý prvok v konformácii predĺženého prameňa a zistilo sa, že vykazujú interakcie bočného reťazca a hlavného reťazca so zvyškami Ala145-Glu146 a rezíduom Glu46 na podjednotke A TNFa. Pri rezíduu Met69 sa identifikovala možná interakcia so zvyškom Tyr115 na podjednotke A TNFa.
Zistilo sa, že zvyšky His94-Phe101 tvoria slučku, ktorá sa vzájomne ovplyvňuje so zvyškami Thr72-Leu75 a Asn137 podjednotky C TNFa a zvyškom Trp96 sTNFR-Ι, špecificky sa ovplyvňujúcim so zvyškami Ser71-Thr72 na podjednotke C TNFa,
Leu100 sTNFR-Ι (ktoré je v tesnej blízkosti so zvyškom Asn137 na podjednotke C TNFa) so zvyškom Gin102 sTNFR-I (ktoré sa špecificky vzájomne ovplyvňuje so zvyškom Pro113 na podjednotke A TNFa) . (Residues His^-Phe101 háve been identified as forming a loop which interacts with residues Thr72-Leu75 and' Asn137 of subunit C of TNFa, with residue Trp96 of sTNFR-Ι specifically interacting with residues Ser71-Thr72 on subunit C of TNFa, Leu100 of sTNFR-Ι being in close proximity with residue Asn137 on subunit C of TNFa and residue Gin102 of sTNFR-Ι specifically interacting with residue Pre1*1 on subunit a of TNFa). Odbornik potom oceni, že najprv by sa mali tieto miesta modifikovať substitúciou relatívne konzervatívnym spôsobom.
Takéto konzervatívne substitúcie sú uvedené v tabuľke 1 pod záhlavím „Preferované substitúcie (Preferred Substitutions). Ak takéto substitúcie vyvolajú zmeny biologickej aktivity, potom sa môžu použiť výraznejšie substitučné zmeny (vzorové substitúcie, Exemplary substitutions) a/alebo sa môžu uskutočniť ďalšie adície/delécie a potom analýza výsledných produktov.
Tabuľka 1: Substitúcie aminokyselín
Pôvodný zvyšok Preferovaná substitúcia Vzorová substitúcia
Ala (A) Val Val; Leu; íle
Arg (R) Lys Lys; Gin; Asn
Asn (N) Gin Gin; His; Lys; Arg
Asp (D) Glu Glu
Cys (C) Ser Ser
Gin (Q) Asn Asn
Glu (E) Asp Asp
Gly (G) Pro Pro
HÍS (H) Arg Asn; Gin; Lys; Arg
íle (I) Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe; norleucín (norleucine)
Leu (L) íle norleucín (norleucine); íle; Val; Met; Ala; Phe
Lys (K) Arg Arg; Gin; Asn
Met (M) Leu Leu; Phe; íle
Phe (F) Leu Leu; Val; íle; Ala
Pro (P, Gly Gly
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr Tyr
Tyr (Y) Phe Trp; .Phe; Thr; Ser
Val (V) Leu íle; Leu; Met; Phe; Ala; norleucín (norleucine)
Pri takýchto zmenách obdobnej povahy sa môže brať do úvahy hydropatický index (hydropatic index) aminokyselín. Každej aminokyseline bol priradený hydropatický index na základe jej hydrofóbnosti a charakteristík náboja. Hodnoty sú nasledovné: izoleucín (+4,5); valín (+4,2); leucín (+3,8); fenylalanín (+2,8); cysteín/cystín (+2,5); metionín (+1,9); alanín (+1,8); glycín (-0,4); treonín (-0,7); serín (-0,8); tryptofán (-0,9); tyrozín (-1,3); prolín (-1,6); histidín (-3,2); glutamát (-3,5); glutamín (-3,5); aspartát (-3,5); asparagín (-3,5); lyzín (-3,9) a arginín (-4,5).
Dôležitosť hydropatického indexu aminokyselín pri porovnaní interaktívnych biologických funkcií na proteíny je odborníkom spravidla jasná (Kyte a Doolittle (1982), J. Mol. Biol., 157:105-131, ktorého opis je tu zahrnutý pomocou odkazu). Je známe, že určité aminokyseliny môžu byť substituované za iné s podobným hydropatickým indexom alebo stavom a stále sa zachová podobná biologická aktivita. Ak sa robia zmeny založené na hydropatickom indexe, preferujú sa substitúcie aminokyselín, ktorých hydropatický index je v rozsahu +2 alebo lepšie v rozsahu ±1 alebo najlepšie ±0,5.
Odborníkom je známe aj to, že substitúcia podobných aminokyselín sa môže efektívne uskutočniť na základe hydrofilnosti najmä vtedy, keď biologicky funkčný ekvivalentný proteín alebo peptid takto vytvorený sa bude používať na imunologické účely ako v tomto prípade.
US patent 4 554 101 (ktorého opis je tu zahrnutý odkazom) hovorí, že najväčšia miestna priemerná hydrofilnosť proteínu (určovaná hydrofilnosťou svojich priľahlých aminokyselín) koreluje s jeho imunogénnosťou a antigénnosťou, t.j. s biologickými vlastnosťami proteínu.
Ako sa detailne opisuje v US Patent 4 554 101, jednotlivým aminokyselinovým zvyškom sa priradili nasledovné hodnoty hydrofilnosti: arginín (+3,0); lyzín (+3,0);
aspartát (3,1±1); glutamát (+3,0 ±1); serín (+0,3);
asparagín (+0,2); glutamín (+0,2); glycín (0); treonín (-0,4); prolín (-0,5 ±1)); alanín (-0,5); histidín (-0,5); cysteín (-1,0); metionín (-1,3); valín (-1,5); leucin (-1,8); izoleucín (-1,8); tyrozín (-2,3); fenylalanín (-2,5) a tryprofán (-3,4).
Ak sa robia zmeny založené na podobnej hodnote hodnôt hydrofilnosti, preferujú sa substitúcie aminokyselín, ktorých hodnoty hydrofilnosti sú v rozsahu ±2 alebo lepšie ±1 alebo najlepšie ±0,5.
U.S. Patent 4 554 101 opisuje aj identifikáciu a prípravu epitopov z primárnej aminokyselinovej sekvencie na základe hydrofilnosti. Metódou uvedenou v U.S. Patent 4 554 101 by bol odborník schopný identifikovať epitopy vnútri sekvencie aminokyselín, ako sú tu opísané sekvencie sTNFR. Tieto oblasti sú uvedené ako „epitopové vnútorné oblasti” (epitopic core regions).
Rad vedeckých publikácií bol zameraný na predpoveď sekundárnej štruktúry a identifikáciu epitopov analýzou sekvencie aminokyselín (Chou a Fasman (1974), Biochemistry, 13(2):222-245; Chou a Fasman, Biochemistry, 113(2):211-222; Chou a Fasman, (1978) Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148; Chou a Fasman, Ann. Rev., Biochem., 47:251-276 a Chou a Fasman (1979), Biophys. J., 26:367-384 (ktorých opisy sú tu zahrnuté odkazom). Okrem toho sú v súčasnosti k dispozícii počítačové programy na pomoc s predpoveďou antigénnych častí a epitopovej vnútornej oblasti proteínov. Príkladom sú programy založené na Jamesonovej-Wolfovej analýze (Jameson a Wolf (1998). Comput. Appl. Biosci., 4(1):181-186 a Wolf et al. (1988), Comput. Appl. Biosci., 4(1):187-191, ktorých opisy sú tu zahrnuté odkazom), program PepPlot (Brutlag et al. (1990), CABS, 6:237-245 a Weinberger et al. (1985), Science, 228:740-742, ktorých opis je tu zahrnutý odkazom) a ostatné nové programy na predpoveď terciárnej štruktúry proteínov (Fetrow a Bryant (1993), Biotechnology, 11:479-483, ktorého opis je tu zahrnutý odkazom).
Očakáva sa, že konzervatívne modifikácie sekvencií aminokyselín (a príslušné modifikácie kódujúcej sekvencie nukleových kyselín) Ri- [Cys19-Cys103] -R2 alebo R4-[Cys32Cys115]-R5 dajú proteíny s podobnými funkciami a chemickými charakteristikami ako modifikovaný proteín.
Naproti tomu sa môže dosiahnuť významná modifikácia vo funkcii a/alebo chemickej charakteristike Ri- [Cys19-Cys103] -R2 a R4-[Cys32-Cys115]-R5 výberom substitúcií, ktoré sa výrazne líšia svojím vplyvom na zachovanie: a) štruktúry polypeptidovej kostry v oblasti substitúcie (napríklad skrutkovicová konformácia alebo konformácia listu), b) náboja alebo hydrofóbnosti proteínu na cieľovom mieste, c) prevažnej časti bočného reťazca. Prirodzene sa vyskytujúce zvyšky sú rozdelené do skupín založených na vlastnostiach bočného reťazca:
A. hydrofóbne: norleucín, Met, Ala, Val, Leu, íle;
B. neutrálne hydrofilné: Cys, Ser, Thr;
C. 'kyslé: Asp, Glu;
D. zásadité: Asn, Gin, His, Lys, Arg;
E. zvyšky, ktoré ovplyvňujú orientáciu reťazca: Gly,
Pro a
F. aromatické: Trp, Tyr, Phe.
Nekonzervatívne substitúcie môžu zahŕňať výmenu člena jednej z týchto skupín za iný. Takáto zámena sa môže vniesť do oblastí Ri-[Cys19-Cys103]-R2 a R4-[Cys32-Cys115]-R5, ktoré sú homológne alebo nehomológne s inými členmi rodiny receptorov NGF/TNF.
Špecifické mutácie sekvencií Ri-[Cys19-Cys103] -R2 a R4[Cys32-Cys115] -R5 môžu zahŕňať substitúciu nepôvodných (non27 native) aminokyselín na N-konci, C-konci alebo na akomkoľvek mieste proteínu, ktoré je modifikované pridaním N-viazaného alebo O-viazaného cukru. Takéto modifikácie môžu byť obzvlášť užitočné napríklad pri pridaní aminokyseliny (napr. cysteínu), čo je výhodné na pripojenie vo vode rozpustného polyméru pri tvorbe derivátov, ako sa opisuje ďalej. Príklad vidno na obrázku 5, kde pôvodne sa vyskytujúci Asn105 sTNFR-I je zamenený za Cys na uľahčenie naviazania molekuly polyetylénglykolu (príklad I).
Sekvencia Ri~ [Cys19-Cys103] -R2 alebo R4-[Cys32-Cys115]-R5 sa môže ďalej modifikovať s cieľom pridať glykozylačné miesto alebo odstrániť N-viazané alebo O-viazané glykozylačné miesto. Asparagínom pripojené glykozylačné rozpoznávacie miesto zahŕňa tripeptidovú sekvenciu, ktorá je špecificky rozpoznávaná príslušným bunkovým glykozylačným enzýmom.
Tieto tripeptidové sekvencie sú Asn-Xaa-Thr alebo Asn-XaaSer, kde Xaa môže byť akákoľvek aminokyselina okrem Pro. Dokázané alebo predpovedané asparagínové zvyšky sTNFR-I existujú v polohách 14, 105 a 111. Dokázané alebo predpovedané asparagínové zvyšky sTNFR-II existujú v polohách 149 a 171. Na modifikáciu alebo pridanie N-viazaných alebo 0viazaných glykozylačných miest sa môže uskutočniť náhrada alebo odstránenie aminokyseliny; výsledkom je proteín s pozmenenou glykozyláciou.
V špecifickom prípade sú varianty značne homológne k aminokyseline Ri- [Cys19-Cys103] -R2 alebo R4-[Cys32-Cys115]-R5. Termín „značne homológne, ako sa tu používa, znamená stupeň homológie, ktorý je prednostne nad 70 % alebo lepšie nad 80 %, nad 90 % a najlepšie dokonca nad 95 %. Percento homológie, tu opísané, sa vypočíta ako percento aminokyselinových zvyškov nájdených v menšej z dvoch sekvencií, ktoré sa zhodujú (which align) s identickými aminokyselinovými zvyškami v porovnávacej sekvencii, pričom sa môžu uviesť štyri medzery (gaps) s dĺžkou 100 aminokyselín na uľahčenie tohto porovnania, ako sa uvádza v Dayhoff (1972), in Atlas of Protein Sequences and Structure, 5:124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., ktorého opis je tu zahrnutý odkazom. Ako podstatne homológne sú zahrnuté aj skrátené sTNFR, ktoré môžu byť izolované vďaka krížovej reakcii protilátok so sekvenciou aminokyselín v SEQ IF NO:2 a SEQ ID NO:35, alebo ktorých gény môžu byť izolované pomocou hybridizácie s DNA SEQ ID NO:la alebo SEQ ID NO:34 alebo ich segmentmi.
Medzi príklady sTNFR predkladaného vynálezu patria nasledovné molekuly: NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103] FC-COOH (uvádzaná aj ako sTNFR-Ι 2.6D/C105);
NHz-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC- [Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (uvádzaná aj ako sTNFR-Ι 2.6D/C106); NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19Cys103]-FN-COOH (uvádzaná aj ako sTNFR-Ι 2.6D/N105); NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103] -FNCSL-COOH (uvádzaná aj ako sTNFR-Ι 2.3D/d8); NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (uvádzaná aj ako sTNFR-Ι 2.3D/dl8) a NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (uvádzaná aj ako sTNFR-Ι 2.3D/dl5) buď metionylované alebo nemetionylované a ich varianty a odvodeniny.
Produkcia variantov skrátených sTNFR sa opisuje podrobnejšie nižšie. Takéto varianty sa môžu pripraviť včlenením príslušných nukleotidových zmien do DNA kódujúcej skrátené sTNFR alebo chemickou syntézou in vitro požadovaných skrátených sTNFR. Odborníci ocenia, že sa môže uskutočniť mnoho kombinácií delécií, inzercií a substitúcií za predpokladu, že výsledné sTNFR sú biologicky aktívne.
Techniky mutagenézy na výmenu, včlenenie alebo odstránenie jedného alebo viacerých vybraných aminokyselinových zvyškov sú odborníkom známe (napr. U.S. Patent No. 4 518
584, ktorého opis je tu zahrnutý odkazom). Pri konštrukcii každého variantu sekvencie aminokyselín sa uplatnia dve základné premenné, a to umiestnenie mutačného miesta a povaha mutácie. Pri návrhu každého variantu bude umiestnenie každej mutácie a jej povaha záležať na modifikovanej biochemickej charakteristike (alebo modifikovaných biochemických charakteristikách). Každé mutačné miesto sa môže modifikovať individálne alebo v sérii, napr. 1) najprv substitúciou vybraných konzervatívnych aminokyselín a potom s radikálnejším výberom v závislosti od dosiahnutého výsledku, 2) odstránením cieľového aminokyselinového zvyšku, 3) včlenením aminokyselinových zvyškov do susedstva vybraného miesta.
Chemicky modifikované deriváty alebo skrátené sTNFR môže odborník pripraviť tu opísaným postupom. Konjugáty sa môžu pripraviť použitím glykozylovaných, neglykozylovaných alebo deglykozylovaných skrátených sTNFR. Typicky sa používajú neglykozylované skrátené sTNFR. Medzi vhodné chemické zložky (moieties) na úpravu (derivatization) skrátených sTNFR patria vo vode rozpustné polyméry.
Vo vode rozpustné polyméry sú vhodné, pretože proteín, na ktorom sú naviazané, nebude precipitovať vo vodnom prostredí, ako napríklad vo fyziologickom prostredí. Je žiaduce, aby polymér bol farmaceutický prijateľný na prípravu terapeutických produktov alebo zmesí. Odborník bude schopný vybrať príslušný polymér v závislosti od úvahy, či konjugát polymér/proteín bude použitý terapeuticky a ak áno, od žiaducej dávky, cirkulačnej doby a odolnosti voči proteolýze.
Medzi vhodné klinicky akceptovateľné vo vode rozpustné polyméry patrí polyetylénglykol (PEG), polyetylénglykolpropiónaldehyd, kopolyméry etylénglykolu a propylénglykolu, monometoxypolyetylénglykol, karboxymetylcelulóza, dextrán, polyvinylalkohol (PVA), polyvinypyrolidón, poly-1,330 dioxalán, poly-1,3-trioxán, kopolymér etylénu a maleínanhydridu, poly(β-aminokyselina) (buď homopolymér alebo náhodné kopolyméry), poly(n-vinylpyrolidón)polyetylénglykol, homopolyméry propylénglykolu (PPG) a ďalšie polyalkylénové oxidy, kopolyméry polypropylénoxidu a etylénoxidu, polyoxyetylované polyoly (POG) (napr. glycerol), polyoxyetylovaný sorbitol alebo polyoxyetylované glukóza, kolónové kyseliny (colonic acids) alebo iné sacharidové polyméry, Ficoll alebo dextrán a ich zmesi.
Pod polyetylénglykolom sa tu rozumie akákoľvek z foriem, ktorá sa použila na derivatizáciu iných proteinov, ako napr. mono-(C1-C10)alkoxy- alebo aryloxypolyetylénglykol. Polyetylénglykolpropiónaldehyd môže byť výhodný pri výrobe vzhľadom na svoju stabilitu vo vode.
Každý z polymérov rozpustných vo vode môže mať ľubovoľnú molekulovú hmotnosť a môže byť rozvetvený alebo nerozvetvený. Typická priemerná molekulová hmotnosť vo vode rozpustných polymérov je asi medzi 2 kDa a 100 kDa (termín „asi naznačuje, že v preparátoch vo vode rozpustných proteinov majú niektoré molekuly väčšiu hmotnosť a niektoré menšiu, ako je uvedená molekulová hmotnosť). Preferovaná priemerná molekulová hmotnosť vo vode rozpustných polymérov je od asi 5 kDa do 50 kDa, lepšie od asi 12 kDa do asi 40 kDa a najlepšie od asi 20 kDa do asi 35 kDa.
Všeobecne, čím je molekulová hmotnosť vyššia alebo čím viac je rozvetvený, tým väčší je pomer polymér:proteín. V závislosti od požadovaného terapeutického profilu (napr. od dĺžky trvania požadovaného uvoľňovania; od účinku, ak existuje, na biologickú aktivitu; od ľahkosti manipulácie; od stupňa alebo absencie antigénnosti a od iných známych účinkov vo vode rozpustných polymérov na terapeutické proteíny) sa môžu použiť aj iné veľkosti.
Každý z polymérov rozpustných vo vode by mal byť naviazaný na protein so zreteľom na vplyv na funkčné alebo antigénne oblasti proteínu. Všeobecne sa môže chemické modifikovanie uskutočňovať za akýchkoľvek vhodných podmienok použitých na reakciu proteínu s aktivovanou molekulou polyméru. Medzi aktivovateľné skupiny (activating groups), ktoré môžu byť použité na naviazanie vo vode rozpustného proteínu na jeden alebo viac proteínov, patria nasledovné: sulfónová, maleimidová, sulfhydrylová, tiolová, triflátová, trezylátová, azidirínová, oxiránová a 5-pyridylová.
Všetky vo vode rozpustné proteíny sú všeobecne naviazané na protein na a- alebo ε-aminoskupine aminokyseliny alebo na reaktívnej tiolovej skupine. Vo vode rozpustná skupina môže byť naviazaná na akejkoľvek reaktívnej skupine proteínu, ktorá je dostatočne reaktívna na naviazanie ku skupine rozpustnej vo vode za vhodných reakčných podmienok. Aminokyselinové zvyšky s voľnou aminoskupinou môžu zahŕňať lyzínové zvyšky a zvyšky aminokyselín na N-konci. Tie s voľnou karboxyskupinou môžu zahŕňať zvyšky kyseliny asparágovej, zvyšky kyseliny glutámovej a zvyšky aminokyselín na C-konci. Tie s reaktívnou tiolovou skupinou zahŕňajú cysteínové zvyšky.
Metódy prípravy proteínov konjugovaných s polymérmi rozpustnými vo vode budú všeobecne zahŕňať tieto kroky: a) reakciu proteínu s polymérom rozpustným vo vode za podmienok, kedy sa protein naviaže na jeden alebo viac vo vode rozpustných polymérov, b) získanie reakčného produktu. Reakčné podmienky pre každú konjugáciu sa môžu vybrať ľubovoľne zo známych alebo z tých, ktoré sa vyvinú, ale tak, aby sa vylúčilo alebo obmedzilo pôsobenie reakčných podmienok (ako je teplota, rozpúšťadlá alebo hodnota pH), ktoré by mohli inaktivovať modifikovaný protein. Všeobecne sa optimálne reakčné podmienky pre reakcie určia prípad od prípadu v závislosti od známych parametrov a požadovaného výsledku. Napríklad čím väčší je pomer konjugátu vo vode rozpustný polymér:proteín, tým väčšie je percento konjugovaného produktu. Optimálny pomer (v zmysle účinnosti reakcie, takže nedochádza k nadbytku nezreagovaného proteínu alebo polyméru) môže byť daný takými faktormi, ako je stupeň derivatizácie (napr. mono-, di-, tri- atď.), molekulovou hmotnosťou vybraného polyméru, tým, či je polymér rozvetvený alebo nerozvetvený a použitými reakčnými podmienkami. Pomer vo vode rozpustného proteínu (napr. PEG-u) k proteínu bude všeobecne v rozsahu 1:1 až 1:100. Z každej zmesi sa môže získať štandardnými izolačnými technikami (ku ktorým patrí napr. dialýza, vysolovanie, ultrafiltrácia, iónová chromatografia, gélová filtrácia a elektroforéza) jeden alebo viac purifikovaných konjugátov.
Môže sa vyskytnúť požiadavka na proteín chemicky modifikovaný na N-konci. Vo vode rozpustný polymér sa môže vybrať na základe molekulovej hmotnosti, rozvetvenia atď., podielu vo vode rozpustného polyméru k proteínovým (alebo peptidovým) molekulám v reakčnej zmesi, typu uskutočňovanej reakcie a metódy získania vybraného na N-koncovo modifikovaného proteínu. Metódou získania N-koncovo chemicky modifikovaného proteínového preparátu (t.j. separácie tejto aktívnej zložky od ostatných monoderivatizovaných zložiek, ak je to nutné) môže byť purifikácia N-koncovo chemicky modifikovaného proteínového materiálu z populácie chemicky modifikovaných proteínových molekúl. Selektívna chemická modifikácia na N-konci sa môže uskutočniť redukčnou alkyláciou, ktorá využije rozdielnu reaktivitu odlišných typov primárnych aminoskupín (lyzín oproti N-koncu) dostupných v určitom proteíne na derivatizáciu. Za vhodných reakčných podmienok sa dosiahne značná selektívna derivatizácia proteínu na N-konci s polymérom obsahujúcim karbonylovú skupinu. Napríklad možno selektívne naviazať vo vode rozpustný polymér na N-koniec proteínu reakciou pri pH, ktoré umožní využiť výhodu rozdielneho pK medzi ε-aminoskupinou lyzínových zvyškov a α-aminoskupinou zvyšku na N-konci proteínu. Takou selektívnou derivatizáciou sa riadi naviazanie vo vode rozpustného polyméru na proteín: konjugácia s polymérom sa uskutoční prevažne na N-konci proteínu a nedochádza k významnej modifikácii ostatných reakčných skupín, ako napríklad aminoskupín na lyzínovom bočnom reťazci. Pri redukčnej alkylácii môže byť vo vode rozpustný polymér jedným z vyššie opísaných typov a mal by mať jeden reakčný aldehyd na spojenie s proteínom. Môže sa použiť polyetylénglykolpropiónaldehyd obsahujúci jeden reaktívny aldehyd.
Predkladaný vynález sa zaoberá konkrétne chemicky upravenými proteínmi s mono- alebo poly- (napr. 2 až 4) PEGzložkami. PEGylácia (pegylation) sa môže uskutočniť akoukoľvek alkylačnou reakciou s PEG-om známou odborníkom. Metódy prípravy PEGylovaných proteínových produktov spravidla zahŕňajú tieto kroky: a) reakciu proteínového produktu s polyetylénglykolom (napríklad s reaktívnym esterom alebo aldehydovým derivátom PEG-u) za podmienok, kedy dôjde k naviazaniu proteínu na jednu alebo viac PEG-skupín a b) získanie reakčného produktu (reakčných produktov). Všeobecne optimálne reakčné podmienky pre reakciu sa určia prípad od prípadu na základe známych parametrov a požadovaného výsledku.
Odborníkom je známy rad metód naviazania. Príkladom je napr. EP 0 401 384, ktorého opis je tu zahrnutý odkazom; viď aj Malik et al. (1992), Exp. Hematol., 20:1028-1035; Francis (1992), Focus on growth Factors, 3(2):4-10 (publikované Mediscript, Mountain Court, Frien Barnet Lane, London N20 OLD, UK); EP 0 154 316; EP 0 401 384; WO 92/16221; WO 95/34326; a ostatné tu citované publikácie, ktoré sa vzťahujú k PEGyláciám, ktorých opis tu je zahrnutý odkazom.
PEGylácia sa môže konkrétne uskutočniť acylačnou reakciou alebo alkylačnou reakciou s reaktívnou molekulou polyetylénglykolu. Čiže proteínové produkty podľa predkladaného vynálezu zahŕňajú aj PEGylované proteíny (pegylated proteins), kde je (sú) skupina PEG (skupiny) naviazaná cez acylovú alebo alkylovú skupinu. Takéto produkty môžu byť mono- alebo poly- PEGylované (napr. obsahujúce 2 až 6 alebo lepšie 2 až 5 skupín PEG). Skupiny PEG sú všeobecne naviazané na proteíne na a- alebo εaminoskupinách aminokyselín, ale je nutné vziať do úvahy aj to, že skupiny PEG môžu byť naviazané na akejkoľvek aminoskupine naviazanej na proteíne, ktorá je dostatočne reaktívna na to, aby sa mohla naviazať na skupinu PEG za vhodných reakčných podmienok.
ÄPEGylácia všeobcne zahŕňa reakciu aktívneho esterového derivátu polyetylénglykolu (PEG) s proteínom. Polymér (polyméry) vybraný na acylačnú reakciu by mal mať jednu reaktívnu esterovú skupinu. Na PEGyláciu sa môže použiť akákoľvek známa alebo následne objavená reaktívna molekula PEG. Preferovaným aktivovaným esterom PEG je PEG esterifikovaný na N-hydroxysukcínimide (NHS). Pod „acyláciou sa tu myslia nasledovné typy väzieb (bez obmedzenia len na ne) medzi terapeutickým proteínom a vo vode rozpustným polymérom (napr. PEG-om): amidová, karbamátová, uretánová a podobne (viď Chamov (1994), Bioconjugate Chem., 5(2):133-140; ktorého opis je tu zahrnutý odkazom). Reakčné ‘podmienky sa môžu vybrať zo známych odborníkom v s PEGylácii alebo prípadne novovyvinuté, ale mali by sa vylúčiť také podmienky, ktoré by viedli k inaktivácii modifikovaných proteínov (napr. teplota, rozpúšťadlo, pH).
PEGylácia acyláciou vedie spravidla k proteínom s viacerými molekulami PEG (poly-pegylated protein). Preferuje sa, keď je spojovacia väzba amid. Preferuje sa aj to, keď je výsledný produkt z väčšej časti (napr. z viac ako 95 %) mono-, di- alebo tri-PEGylovaný. Môže ale dôjsť aj k tvorbe niektorých produktov s vyšším stupňom PEGylácie v množstvách závislých od použitých špecifických reakčných podmienok. Ak je to potrebné, môžu sa zo zmesi oddeliť čistejšie PEGylované komponenty (najmä nezreagovaných druhov) štandardnými purifikačnými postupmi, medzi ktoré patrí napr. dialýza, vysoľovanie, ultrafiltrácia, ionexová chromatografia, gélová filtrácia a elektroforéza.
PEGylácia alkyláciou všeobecne zahŕňa reakciu koncového aldehydového derivátu PEGu s proteínom za prítomnosti redukčného činidla. Na reakciu redukčnej alkylácie by vybraný protein (proteíny) mal mať jednu reaktívnu aldehydovú skupinu. Príkladom reaktívneho aldehydu PEG je polyetylénglykolpropiónaldehyd, ktorý je vo vode stabilný, alebo jeho mono-ClClO-alkoxy alebo aryloxyderiváty (viď U.S. oatent 5 252 714, ktorého opis je tu zahrnutý odkazom).
Výsledkom PEGylácie alkyláciou môže byť aj protein s viacerými molekulami PEG (poly-pegylated protein) . Navyše možno ovplyvniť reakčné podmienky s cieľom podstatne uprednostniť PEGyláciu len α-aminoskupiny na N-konci proteínu (t.j. proteínu s jednou molekulou PEG). V obidvoch prípadoch (monoPEGylácie alebo polyPEGylácie) sú skupiny PEG prednostne naviazané na proteíne cez skupinu -CH2-NH-. Pokiaľ ide o skupinu -CH2-, tento typ spojenia je tu uvádzaný ako „alkylová väzba.
Redukčná alkylácia na produkciu značne homogénnej populácie produktu monopolymér/proteín bude všeobecne zahŕňať nasledovné kroky: a) reakcia proteínu s reaktívnou molekulou PEG za podmienok pre redukčnú alkyláciu a pri pH umožňujúcom selektívnu modifikáciu α-aminoskupiny na aminokonci daného proteínu a b) získanie reakčného produktu (produktov). Príprava derivátov redukčnou alkyláciou na produkciu produktov s jednou molekulou PEG využíva rozdiely pKa medzi lyzínovou aminoskupinou a α-aminoskupinou na N-konci (pKa je pH, kedy 50 % aminoskupín je protónovaných a 50 % nie).
Reakcia prebieha pri pH, ktoré umožní využiť rozdiel pKa medzi ε-aminoskupinami lyzínových zvyškov a a-aminoskupinou zvyšku na N-konci proteínu. Všeobecne ak je pH nižšie, bude žiaduca väčšia prevaha polyméru k proteínu (t.j. čím menej reaktívna je α-aminoskupina N-konca, tým viac polyméru bude potrebné na dosiahnutie optimálnych podmienok). Ak je pH vyššie, pomer polymér:protein nemusí byť taký vysoký (t.j. k dispozícii sú reaktívnejšie skupiny, takže je potrebné menej molekúl polyméru). Na účely predkladaného vynálezu bude pH spravidla v rozsahu 3 až 9 alebo lepšie 3 až 6. Na redukčnú alkyláciu by redukčné činidlo malo byť stabilné vo vodných roztokoch a tiež schopné redukovať len Schiffovu zásadu tvorenú na začiatku procesu redukčnej alkylácie. Vhodné redukčné činidlá sa môžu vybrať zo súboru zahŕňajúceho borohydrid sodný (sodium borohydride), kyanoborohydrid sodný (sodium cyanoborohydride), dimetylamínborán (dimethylamin borane), trimetylamínborán, pyridínborán (piridine borane). Obzvlášť vhodným redukčným činidlom je kyanoborohydrid sodný. Ostatné reakčné parametre, ako je napríklad rozpúšťadlo, reakčný čas, teplota a spôsob purifikácie produktu, sa môžu určiť prípad od prípadu a odvodiť na základe publikovaných informácií vzťahujúcich sa na prípravu derivátov proteínov s polymérmi rozpustnými vo vode.
Takouto selektívnou prípravou derivátov sa riadi naviazanie vo vode rozpustného polyméru (ktorý obsahuje reaktívnu skupinu, ako napríklad aldehyd) na protein: konjugácia s polymérom sa uskutoční prevažne na N-konci proteínu a nedochádza k významnej modifikácii ostatných reaktívnych skupín, ako sú aminoskupiny lyzínového bočného reťazca. Prípravok bude typicky viac ako na 90 % tvorený konjugátom monopolymér/proteín (spravidla na viac ako 95 % konjugátom monopolymér/proteín) s tým, že sa budú vyskytovať aj zistiteľné nezreagované molekuly (t.j. protein bez polymérovej zložky).
Špecifickým prípadom predkladaného vynálezu je nerozvetvená molekula monometoxypolyetylénglykolaldehydu (unbranched monomethoxy-polyethylene glykol aldehyde molecule) s priemernou molekulovou hmotnosťou buď asi 20 kDa alebo asi 33 kDa (napr. medzi 30 kDa a 35 kDa) alebo terciárny butylpolyetylénglykcfcldehyd (tertiary-butyl polyethylene glycol aldehyde) s priemernou molekulovou hmotnosťou'asi 33 kDa (napr. medzi 30 kDa a 35 kDa) konjugovaných redukčnou alkyláciou k sTNFR-I 2,6D/N105.
PEGylácia sa môže špeciálne uskutočniť cez polyméry rozpustné vo vode s aspoň jednou reaktívnou hydroxyskupinou (napr. polyetylénglykol), ktoré môžu reagovať s činidlom s reaktívnou karbonylovou, nitrilovou alebo sulfónovou skupinou na konverziu hydroxylovej skupiny na reaktívny Michaelov akceptor (ractive Michael acceptor). Tým sa vytvorí „aktivovaná spojka (activated linker) užitočná pri modifikácii rôznych proteínov s cieľom poskytnúť lepšie biologicky aktívne konjugáty. „Reaktívny karbonyl, nitril alebo sulfón znamená karbonylovú, nitrilovú alebo sulfónovú skupinu, na ktorej je naviazaná skupina s dvoma atómami uhlíka s reaktívnym miestom pre tiol-špecifickú väzbu na druhom uhlíku od karbonylovej, nitrilovej alebo sulfónovej skupiny (WO 92/16221).
Aktivované spojky môžu byť monofunkčné, bifunkčné alebo multifunkčné. Užitočnými činidlami s reaktívnou sulfónovou skupinou, ktoré sa môžu použiť v týchto metódach, sú (bez obmedzenia len na ne) chlórsulfón, vinylsulfón a divinylsulfón.
V špecifickom prípade sa môže vo vode rozpustný polymér aktivovať Michaelovým akceptorom. WO 95/13312 opisuje (okrem iného) vo vode rozpustné, sulfónom aktivované PEGy, ktoré sú vysokoselektívne pre väzbu s tiolovou zložkou namiesto aminozložiek na molekule a na povrchu. Tieto deriváty PEGu sú dlhšie stabilné pri hydrolýze vo vodnom prostredí pri pH 11 alebo nižšom a môžu tvoriť väzby s molekulami, pričom dochádza k tvorbe konjugátov, ktoré sú tiež hydrolyticky stabilné.
Väzba, ktorou sú konjugované PEGy a biologicky aktívna molekula, zahŕňajú sulfónovú zložku spojenú js tiolovou zložkou a majú štruktúru PEG-SO2-CH2-CH2-S-W, kde W predstavuje biologicky aktívnu molekulu a kde sulfónová skupina je vinylsulfón alebo aktívny etylsulfón. Dva osobitne užitočné homobifunkčné (homobifunctional) deriváty sú PEG-bischlórsulfón a PEG-bis-vinylsulfón
PCT International Application No. US96/19459, ktorého opis je tu zahrnutý odkazom, uvádza metódu prípravy sulfónom aktivovaných väzieb (sulfone activated linkers) získaním zlúčeniny s reaktívnou hydroxylovou skupinou a konverziou hydroxylovej skupiny na reaktívny Michaelov akceptor na vytvorenie aktivovanej spojky (activated linker). Ako rozpúšťadlo na konverziu sa použije tetrahydrofurán (THF). PCT International Application No. US96/19459, ktorého opis je tu zahrnutý odkazom, uvádza postup purifikácie aktivovaných spojok, ktorý používa chromatografiu s hydrofóbnymi interakciami založenú na separácii spojok podlá veľkosti a funkčnosti koncovej skupiny.
Predkladaný vynález sa konkrétne zaoberá nasledovnými prokaryoticky exprimovanými molekulami chemicky pozmenenými tak, aby obsahovali poly- (napr. 2 až 4) zložky PEG: sTNFR-I 2.6D/C105, sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR-I 2.6D/N105, sTNFR-I 2.3D/d8, sTNFR-I 2.3D/18 a sTNFR-I 2.3D/dl5, buď metionylovanými alebo nemetionylovanými a ich variantmi.
Polyvalentná forma (formy)
Môže sa pripraviť polyvalentná forma (formy), t.j. molekuly obsahujúce viac ako jednu aktívnu zložku (active moiety). V jednom prípade môže mať molekula viac väzbových miest pre faktor nekrotizujúci tumory pre TNF ligand (napr. kombinácia skráteného sTNFR produktu). Molekula má ďalej najmenej jedno väzbové miesto pre faktor nekrotizujúci tumory a (v závislosti od požadovaných vlastností polyvalentnej formy) najmenej jedno väzbové miesto pre inú molekulu (napr. kombinácia najmenej jedného skráteného sTNFR produktu a najmenej jedného antagonistu interleukín-1 receptora („IL-lra), ako sa opisuje ďalej).
Môžu sa vytvoriť aj polyvalentné formy, napr. chemickým spojením najmenej jedného skráteného sTNFR produktu s akoukoľvek klinicky akceptovateľnou spojkou (linker) (napr. vo vode rozpustným polymérom, ako sa opisuje ďalej). Spravidla by spojka nemala dodávať novú imunogénnosť (vzhľadom na nové aminokyselinové zvyšky) alebo pozmeňovať hydrofóbnosť a náboj konštruktu tak, aby došlo ku škodlivému ovplyvneniu jeho biodistribúcie a odbúravania.
Takéto polyméry, ak sa použijú ako spojky, môžu byť homopolyméry, náhodné alebo blokujúce kopolyméry (momopolymer, random or block copolymers) a terpolyméry (terpolymers) založené na vyššie uvedených monoméroch, nerozvetvené alebo rozvetvené, substituované alebo nesubstituované. Polymér môže mať akúkoľvek dĺžku alebo molekulovú hmotnosť, ale tieto charakteristiky môžu ovplyvniť biologické vlastnosti. Polyméry obzvlášť vhodné na zníženie rýchlosti odbúravania vo farmaceutických aplikáciách majú priemernú molekulovú hmotnosť v rozsahu 2000 až 35000 daltonov. Dĺžka polyméru môže byť navyše rozmanitá na optimalizáciu alebo vytvorenie požadovaných biologických aktivít.
Medzi aktivované (activating) skupiny, ktoré sa môžu použť na naviazanie vo vode rozpustného polyméru na dva alebo viac proteínov, patria nasledovné: sulfónová, maleimidová, sulfhydrylová, tiolová, triflátová, trezylátová, azidirínová, oxiránová a 5-pyridylová (sulfone, maleimide, sulfhydryl, thiol, triflate, tresylate, azidirine, oxirane and 5-pyridyl).
V špecifickom prípade sa môžu bifunkčné alebo multifunkčné aktivované spojky s aspoň jedným Michaelovým akceptorom pripraviť podlá United States Patent Application No. 08/473 809 a purifikovať podlá United States Patent Application No. 08/611 918.
Aktívne zložky sa môžu naviazať použitím konvenčných pripojovacích (coupling) techník (viď PCT Publication No. WO 92/16221 a viď PCT Publication No. WO 95/34326, ktorých opis je tu zahrnutý odkazom). Okrem toho PCT Publication No. WO 92/16221 opisuje prípravu rôznych dimerizovaných inhibítorových molekúl sTNFR-Ι, napr. dimerizované cl05 sTNFR-Ι. Príklad polyvalentného faktora nekrotizujúceho tumory väzbového proteínu vzorca (sTNFR-I 2,6D/C106)2-(20 kDa PEG) je uvedený v príklade I.
Alebo sa bivalentná molekula môže skladať z dvoch tandemových opakovaní skrátených sTNFR produktov oddelených polypeptidovou spojkou (by polypeptide linker región). Návrh polypeptidových spojok je podobný návrhu vloženia krátkej slučky sekvencií medzi domény de novo navrhovaných proteínov (Mutter (1998), TIBS, 13: 206-265 a Regan a DeGrado (1988), Science, 242:976-978, ktorých opis je tu zahrnutý odkazom). Ukázalo sa, že spojka vhodná pre jednoreťazcové protilátky je účinná na vytvorenie dimérnej formy rekombinantného ľudského sTTNFR-II (Neve et al. (1996), Cytokine, 8(5):365-370, ktorého opis je tu zahrnutý odkazom). Pripravilo sa (a úspešne použilo pri protilátkach) niekoľko odlišných konštruktov spojok; najúspešnejšie funkčné spojky majú veľkosť medzi 12 až 25 aminokyselinami (aminokyseliny s nereaktívnymi bočnými skupinami, napr. alanín, serín a glycín), čo dohromady tvorí hydrofilnú sekvenciu s niekoľkými opačne nabitými zvyškami na zvýšenie rozpustnosti a sú prispôsobivé (Whitlow a Filipula (1991), Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2:97-105 a Bridgo at al. (1993), J. Immunol., 150: 469-479, ktorých opis je tu zahrnutý odkazom).
V inom aspekte sa môžu skrátené sTNFR chemicky naviazať na biotín a konjugáty biotín/skrátené sTNFR sa môžu potom naviazať na avidín, čím vznikne tetravalentná molekula avidín/biotín/skrátené molekuly sTNFR. Skrátené sTNFR sa môžu aj kovalentne viazať na dinitrofenol (DNP) alebo tetranitrofenol (TNP) a výsledný konjugát sa môže precipitovať anti-DNP alebo antiTNP IgM za tvorby dimérnych konjugátov, kde hodnota valencie pre TNF väzbové miesta je 10.
Taktiež sa môžu pripraviť rekombinantné fúzne proteíny so skráteným sTNFR, kde každá rekombinantná chimerická molekula má sekvenciu sTNFR (ako sa opisuje vyššie) substituovanú za variabilné domény buď ktorejkoľvek samotnej alebo obidvoch častí imunoglobulínovej molekuly (ľahké alebo ťažké reťazce) a s úplnými alebo časťami konštantných domén (ale najmenej s jednou konštantnou doménou) ťažkého alebo ľahkého reťazca ľudských imunoglobulínov. Napríklad každý takýto chimerický skrátený sTNFR/IgGl fúzny proteín sa môže pripraviť z dvoch chimerických génov: chiméra skráteného sTNFR/ľudský kapa ľahký reťazec (skrátený sTNFR/Ck) a chiméra skráteného sTNFR/ľudský gama-1 ťažký reťazec (skrátený sTNFR/Cg-1). Po transkripcii a translácii dvoch chimerických génov, ako sa opisuje ďalej, môže byť génový produkt zložený do jednej chimerickej molekuly, kde je skrátený sTNFR bivalentný. Ďalšie podrobnosti vzťahujúce sa na konštrukciu takýchto chimerických molekúl sú uvedené v United States Patent 5 116 964, PCT Publication No. WO 89/09622, PCT Publication No. WO 89/16437 a EP 315062, ktorých opis je tu zahrnutý odkazom.
V ďalšom aspekte sa môžu pripraviť rekombinantné fúzne proteíny so skráteným sTNFR, kde každá rekombinantná chimerická molekula má sekvenciu sTNFR opísanú vyššie a aspoň časť regiónu 186-401 osteoprotegerínu (OPG - osteoprotegerin), ako sa opisuje v European Patent Application No. 96309363.8.
Polynukleotidy
Predkladaný vynález poskytuje aj polynukleotidy, ktoré kódujú skrátené sTNFR. Na základe uvedeného výkladu s použitím tabulky kodónov môže priemerný odborník lahko určiť všetky nukleotidové sekvencie, ktoré kódujú aminokyselinové sekvencie skrátených sTNFR. V súčasnosti preferované sekvencie nukleových kyselín zahŕňajú polynukleotidové sekvencie kódujúce sTNFR-I 2.6D/C105, sTNFR-Ι 2.6D/C106, sTNFR-Ι 2.6D/N105, sTNFR-I 2.3D/d8, sTNFR-Ι 2.3D/dl8 a sTNFR-Ι 2.3D/dl5. Príklady rozličných polynukleotidov sú uvedené na obrázkoch 2, 3, 4, 5, a 7.
Na prípravu týchto polynukleotidov a na expresiu kódovaných proteínov sa môžu použiť techniky rekombinantnej expresie uskutočnenej v zhode s opismi vysvetlenými ďalej. Napríklad vložením sekvencie nukleových kyselín, ktoré kódujú skrátené sTNFR, do vhodného vektora, môže odborník lahko vytvoriť velké množstvo požadovaných nukleotidových sekvencií. Tieto sekvencie sa môžu ďalej použiť na prípravu detekčných sond alebo amplifikačných primerov. Polynukleotidy kódujúce skrátené sTNFR sa môžu tiež včleniť do expresívnych vektorov. Vložením expresívnych vektorov do vhodného hostiteľa sa môže produkovať požadovaný skrátený sTNFR vo velkých množstvách.
Ako sa opisuje ďalej, na zmnoženie požadovanej sekvencie nukleových kyselín a/alebo produkciu skrátených sTNFR existuje rad dostupných systémov hostitel/vektor. Patria k nim okrem iných plazmidy, vírusové a inzerčné vektory a prokaryotickí a eukaryotickí hostitelia. Odbornik môže upraviť systém hostitel/vektor, ktorý je schopný propagácie alebo expresie heterológnej DNA na produkciu alebo expresiu sekvencií predkladaného vynálezu.
Okrem toho odborníci ocenia vzhladom na predkladaný opis nové sekvencie nukleových kyselín vrátane degenerovaných sekvencií nukleových kyselín kódujúcich skrátené sTNFR so sekvenciami uvedenými v sekcii Obrázky a tie sekvencie nukleových kyselín, ktoré hybridizujú (prednostne za stringentných hybridizačných podmienok) s doplnkami týchto sekvencií nukleových kyselín (Maniatis et al. (1982), Molecular cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, strany 387-389). Vzorové stringentné hybridizačné podmienky sú hybridizácia v 4x SSC pri 62 až 67 °C s následným odmývaním počas asi jednej hodiny v 0,lx SSC pri 62 až 67 °C. Inými vzorovými stringentnými hybridizačnými podmienkami je hybridizácia v 45% až 55% formamide, 4x SSC pri 40 až 45 °C.
Zahrnuté sú aj sekvencie DNA, ktoré hybridizujú k sekvenciám nukleových kyselín vyznačeným na obrázkoch 1 a 9 za miernejších hybridizačných podmienok a ktoré kódujú skrátené sTNFR.
Príklady takých menej stringentných hybridizačných podmienok sú 4xSSC pri 45 až 55 °C alebo hybridizácia s 30% až 40% formamidom pri 40 až 45 °C.
Predkladaný vynález poskytuje aj rekombinantné konštrukty DNA obsahujúce vektorové DNA so sekvenciami DNA kódujúcimi skrátené sTNFR. V každom takomto konštrukte DNA je sekvencia nukleových kyselín kódujúca skrátený sTNFR (s alebo bez signálnych peptidov) operačne spojená (in operation association) s vhodnou sekvenciou, riadiacou expresiu alebo regulačnou, schopnou riadiť replikáciu a/alebo expresiu skráteného sTNFR vo vybranom hostiteľovi.
Rekombinantné expresie
Príprava polynukleotidov
Sekvencie nukleových kyselín kódujúce skrátené sTNFR sa môžu ľahko získať radom spôsobov, ku ktorým patrí napríklad chemicá syntéza, testovanie cDNA alebo genómovej knižnice, testovanie expresívnej knižnice a/alebo PCR amplifikácia cDNA. Tieto a ostatné metódy, ktoré sú užitočné na izoláciu sekvencií nukleových kyselín, sa uvádzajú v Sambrook et al., Moleculár
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989); v Ausubel et al., eds Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press, (1994); a v Berger and Kimmel, Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, Vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA, (1987), ktorých opis je tu zahrnutý odkazom.
Chemická syntéza sekvencií nukleových kyselín, ktoré kódujú skrátené sTNFR, sa môže uskutočniť napríklad použitím metód dobre známych odborníkom, ktoré uvádza napríklad Engels et al., (1989) Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 a Wells et al., (1985), Gene, 34:315, ktorých opis je tu zahrnutý odkazom. Tieto metódy zahŕňajú okrem iného fosfotriesterovú, fosforamiditovú a H-fosfonátovú (phosphotriester, phosphoramidite and Hphosphonate) metódu syntézy sekvencie nukleových kyselín. Veľké sekvencie nukleových kyselín, napríklad dlhšie ako asi 100 nukleotidov, sa môžu syntetizovať ako niekoľko fragmentov. Fragmenty sa potom môžu spojiť ligáciou tak, aby vytvorili sekvenciu nukleových kyselín kódujúcu skrátené sTNFR. Preferovanou metódou je syntéza na polyméroch (polymer-supported) s použitím štandardnej fosforamiditovej chémie.
Príslušné sekvencie nukleových kyselín sa môžu získať aj testovaním rôznych knižníc cDNA (t.j. knižníc pripravených z jedného alebo viacerých pletív, kde sa predpokladá expresia proteínu) alebo genómových knižníc (knižnica pripravená z celkovej genómovej DNA). Zdroj pre knižnicu cDNA je typicky pletivo akéhokoľvek druhu, kde sa predpokladá expresia požadovaného proteínu v rozumných množstvách. Zdroj pre genómovú knižnicu môže byť akékoľvek pletivo alebo pletivo z akéhokoľvek cicavca alebo iného druhu, kde sa predpokladá gén kódujúci skrátený sTNFR.
Hybridizačné médiá sa môžu testovať na prítomnosť DNA kódujúcej skrátený sTNFR použitím jednej alebo viacerých sond z nukleových kyselín (oligonukleotidy, cDNA alebo fragmenty genómovej cDNA, ktoré majú prijateľný stupeň homológie s cDNA alebo klonovaným génom), ktorá bude hybridizovať selektívne s cDNA alebo génom (génmi) prítomným v knižnici. Typické sondy použité na testovanie kódujú malú oblasť sekvencie DNA z rovnakého alebo podobného druhu, ako je druh, z ktorého bola pripravená knižnica. Sondy môžu byť aj degenerované, ako sa opisuje ďalej.
Hybridizácia sa typicky uskutočňuje prichytením (annealing) oligonukleotidovej sekvencie alebo cDNA ku klonom za takých stringentných podmienok, ktoré vylúčia nešpecifické naväzovanie, ale umožnia naviazanie tých klonov, ktoré majú významnú hladinu homológie so sondou alebo primerom. Typické stringentné hybridizačné a premývacie podmienky závisia čiastočne od veľkosti cDNA alebo oligonukleotidovej sondy (t.j. od počtu nukleotidov) a od toho, či je sonda degenerovaná. Pri navrhovaní hybridizačného média sa berie do úvahy aj pravdepodobnosť identifikácie klonu (t.j. či sa testuje genómová alebo cDNA knižnica).
Keď sa ako sonda použije fragment DNA (ako napr. cDNA), typické hybridizačné podmienky zahŕňajú tie, ktoré sú opísané v Aubel et al. (1994), eds., supra. Po hybridizácii sa hybridizačné médium odmyje za stringentných podmienok. Tie sa volia v závislosti od niekoľkých faktorov, ako je veľkosť sondy, očakávaná homológia sondy a klonu, testovaného hybridizačného média, počtu testovaných klonov atď. Príklady stringentných premývacích roztokov (ktoré majú spravidla nízku iónovú silu a používajú sa pri relatívne vysokých teplotách) sú nasledovné: 0,015 M NaCl, 0,05 M Na-citrát a 0,1% SDS pri 55 až 65 °C alebo iný - lmM Na2ĽDTA, 40 mM NaHPO4, pH 7,2 a 1 % SDS pri 40 až 50 °C alebo ešte iný 0,2x SSC a 0,1% SDS pri asi 50 až 60 °C.
Existujú aj ukážkové protokoly pre stringentné premývacie podmienky, kde sa na testovanie hybridizačných médií používajú oligonukleotidové sondy. Napríklad prvý protokol používa 6x SSC s 0,0 5% pyrofosfátu sodného pri teplote približne od 35 do 63 °C v závislosti od dĺžky sondy. Napríklad sonda s dĺžkou 14 báz sa premýva pri 35 až 40 °C, s dĺžkou 17 báz pri 45 až 50 °C, s dĺžkou 20 báz pri 52 až 57 °C a s dĺžkou 23 báz pri 57 až 63 °C. Teplota sa môže zvýšiť o 2 až 3 °C, ak je pozadie dané nešpecifickým naväzovaním sondy vysoké. Druhý protokol používa na premývanie tetrametylamóniumchlorid (TMAC). Stringentný premývací roztok tak môže mať nasledovné zloženie: 3M TMAC,
50mM Tris-HCl, pH 8 a 0,2% SDS.
Inou vhodnou metódou na získanie vhodných sekvencií nukleových kyselín je polymerázová reťazová reakcia (PCR). Pri použití tejto metódy sa pripraví cDNA z poly(A)+RNA alebo celkovej RNA použitím enzýmu reverzná transkriptáza. Dva primery (oligonukleotidy), typicky komplementárne k dvom oddeleným oblastiam cDNA kódujúcej skrátený sTNFR, sa pridajú k cDNA spoločne s polymerázou (ako je napr. Taq polymeráza) a tá amplifikuje oblasť cDNA medzi dvoma primermi.
Oligonukleotidové sekvencie vybrané ako sondy alebo primery by mali mať príslušnú dĺžku a mali by byť dostatočne jednoznačné tak, aby sa minimalizovalo nešpecifické naväzovanie £
počas testovania alebo PCR amplifíkacie. Konkétna sekvencia sondy alebo primerov je spravidla založená na konzervovaných alebo vysoko homológnych sekvenciách alebo oblastiach. Sondy alebo primery môžu byť prípadne úplne alebo čiastočne degenerované, t.j. môžu obsahovať zmes sond/primerov, kde všetky kódujú tú istú aminokyselinovú sekvenciu, ale s použitím rôznych kodónov. Alternatívou degenerovaných sond je použitie inozínu na niektorých alebo všetkých kodónových polohách, kde sa líšia podľa druhu. Oligonukleotidové sondy alebo primery sa môžu pripraviť metódami chemickej syntézy DNA, ako sa opísalo vyššie.
Ako sa opisuje vyššie, alternatívna sekvencia je prírodná (napríklad alelický variant) alebo syntetická sekvencia, kťorá obsahuje jednu alebo viac nukleotidových substitúcií, delécií a/alebo inzercií pri porovnaní so sekvenciou na obrázkoch 2, 3, 4, 5, 6 a 7,ktoré vedú k expresii varinatných aminokyselinových sekvencií (pri porovnaní s pôvodnou (wild type) aminokyselinovou sekvenciou). Príprava syntetických variantov sekvencií je odborníkom dobre známa a opísaná napríklad v Sambrook et al. (1989), supra a Wells et al. (1985), Gene, 34:315, ktorých opis je tu zahrnutý odkazom.
Vektory
Dna kódujúca skrátené sTNFR sa môže na ďalšie klonovanie (amplifikáciu DNA) alebo expresiu včleniť do vektorov. Vhodné vektory sú komerčne dostupné alebo sa môžu špeciálne pripraviť. Výber alebo konštrukcia vhodného vektora bude závisieť 1) od toho, či sa bude používať na amplifikácie DNA alebo expresiu DNA, 2) od veľkosti DNA, ktorá sa má včleniť do vektora, 3) od zamýšľanej hostiteľskej bunky, ktorá sa bude transformovať vektorom.
Každý z vektorov obsahuje sekvenciu nukleových kyselín, ktorá kóduje požadovaný proteín, funkčne spojenú s jednou alebo viacerými regulačnými sekvenciami alebo riadiacimi expresiu, schopnými riadiť alebo inak ovplyvňovať expresiu požadovaného proteínu vybranou hostiteľskou bunkou. Každý vektor obsahuje rôzne komponenty v závislosti od jeho funkcie (amplifikácie DNA alebo expresie DNA) a jeho kompatibility so zamýšľanou hostiteľskou bunkou. Komponenty vektora spravidla zahŕňajú (ale nie sú obmedzené len na ne): signálne sekvencie, počiatok replikácie, jeden alebo viac signálnych (marker) génov, promótory, zosilňovacie elementy, sekvenciu ukončujúcu trans48 kripciu atď. Tieto komponenty sa môžu získať z prirodzených zdrojov alebo sa môžu syntetizovať známymi postupmi.
Príkladom vhodných prokaryotických klonovacích vektorov môžu byť bakteriofágy (napr. odvodené od lambdy) alebo plazmidy z E. coli (napr. pBR322, colEl, pUC, F-faktor, odvodeniny Bluescript® (Stratagene, LaJolla, CA)). Na uvedené účely sa môže použiť rad ďalších vhodných expresívnych vektorov, ktoré sú odborníkom známe.
Signálne sekvencie
Nukleová kyselina kódujúca signálnu sekvenciu sa môže vložiť na 5'-konci sekvencie kódujúcej skrátený sTNFR. Môže byť napr. zložkou vektora alebo môže byť časťou nukleovej kyseliny kódujúcej skrátený sTNFR. Nukleové kyseliny kódujúce pôvodné signálne sekvencie sTNFR-Ι a sTNFR-II sú známe (EP 393 438 a EP 422 339).
Počiatok replikácie
Expresívne aj klonovacie vektory všeobecne zahŕňajú sekvenciu nukleových kyselín, ktorá umožňuje vektoru replikovať sa v jednej alebo viacerých vybraných hostiteľských bunkách.
V klonovacom vektore je touto sekvenciou typicky tá, ktorá umožňuje vektoru replikovať sa nezávisle od hostiteľskej chromozómovej DNA a zahŕňa počiatok replikácie alebo autonómne sa replikujúce sekvencie. Takéto sekvencie sú dobre známe. Počiatok replikácie z plazmidu pBR322 je vhodný pre väčšinu gramnegatívnych baktérií. Rôzne počiatky (napr. SV40, polyoma, adenovírus, VSV alebo BVP) sú vhodné na klonovanie vektorov v cicavčích bunkách. Všeobecne nie je počiatok replikácie nutný pre cicavčie expresívne vektory (napr. počiatok SV40 sa často používa len preto, že obsahuje včasný promótor).
Selekčný gén
Expresívne aj klonovacie vektory typicky obsahujú selekčný gén. Tento gén kóduje „značkový (marker) protein nevyhnutný na prežitie alebo rast transformovaných hostiteľských buniek, ak rastú v selekčnom kultivačnom médiu. Hostiteľské bunky, ktoré nie sú transformované vektorom, nebudú obsahovať selekčný gén, a preto neprežijú v kultivačnom médiu. Typické selekčné gény kódujú proteíny, ktoré: a) udeľujú rezistenciu na antibiotiká alebo iné toxíny, napr. ampicilín, neomycín, metotrexát (metothrexate) alebo tetracyklín, b) doplnia auxotrofný nedostatok alebo c) poskytnú nutné živiny, ktoré nie sú v živnom médiu.
Na amplifikáciu génov, ktoré sa majú exprimovať, sa môžu použiť aj iné selekčné gény. Amplifikácia je proces, kde gény, ktoré sú dôležitejšie na produkciu proteínov nevyhnutných na rast, sa tandemovo opakujú vnútri chromozómov nasledujúcich generácií rekombinantných buniek. Príklady vhodných selekčných markerov pre cicavčie bunky zahŕňajú napr. dihydrofolátreduktázu (dihydrofolate reductase - DHFR) a tymidínkinázu. Bunkové transformanty sú vystavené selekčnému tlaku, kde len transformanty sú schopné sa adaptovať a prežiť vďaka markerom prítomným vo vektore. Selekčný tlak je vyvolaný pestovaním transformovaných buniek za podmienok, kedy koncentrácia selekčného činidla v médiu sa postupne mení, a tým dochádza k amplifikácii selekčného génu aj DNA, ktorá kóduje skrátené sTNFR. Výsledkom je zvýšené množstvo skrátených sTNFR, ktoré sa syntetizujú z amplifikovanej DNA.
Napríklad bunky transformované selekčným génom pre DHFR sa najskôr identifikujú pestovaním všetkých transformantov v živnom médiu, ktoré obsahuje metotrexát (kompetitívny analóg DHFR). Pri použití divého typu DHFR je vhodnou hostiteľskou bunkou bunková línia z vaječníkov chrčka (Chinese Hamster ovary celí line) bez aktivity DHFR (Urlaub a Chasin (198), Pro. Natl.
Acad. Sci., USA, 77:(7):4216-4220, ktorého opis je tu zahrnutý odkazom). Transformované bunky sa potom vystavia zvýšenej hladine metotrexátu. To vedie k syntéze viacerých kópií génu DHFR a sprievodne viacerým kópiám iných génov obsiahnutých v expresívnom vektore, ako je DNA kódujúca skrátenú sTNFR.
Promótory
Expresívne aj klonovacie vektory typicky obsahujú promótor, ktorý sa rozpoznáva hostiteľským organizmom a je operačne spojený so sekvenciou nukleovej kyseliny kódujúcej skrátený sTNFR. Promótor je netranslatovaná sekvencia umiestnená pred (5')-štartovacím kodónom štruktúrneho génu (spravidla v rámci 100 až 1000 pb), ktorá riadi transkripciu a transláciu určitej sekvencie nukleových kyselín, ktoré kódujú napríklad skrátené sTNFR. Promótor môže byť vhodne zaradený do jednej z dvoch tried - inducibilné promótory a konštitutívne promótory. Inducibilné promótory iniciujú zvýšenie transkripcie z DNA pod svojím riadením ako odpoveď na niektoré výživové zmeny alebo zmeny teploty. Je známy celý rad promótorov rozoznávaných radom potenciálnych hostiteľských buniek. Promótor sa môže operačne pripojiť k DNA kódujúcej skrátený sTNFR tak, že sa reštrikčnými enzýmami odstráni promótor zo zdrojovej DNA a včlení sa požadovaná promótorová sekvencia. Pôvodná promótorová sekvencia sTNFR-Ι alebo promótorová sekvencia sTNFR-II sa môže použiť na priamu amplifikáciu a/alebo expresiu DNA kódujúcej skrátený sTNFR. Preferuje sa ale heterológny promótor, ak to vedie k väčšej transkripcii a k vyššiemu výťažku exprimovaného proteínu v porovnaní s pôvodným promótorom a ak je kompatibilný s hostiteľským bunkovým systémom, ktorý bol vybraný na použitie. Napríklad na priamu amplifikáciu a/alebo expresiu DNA kódujúcej skrátený sTNFR sa môže použiť ktorákoľvek z pôvodných promótorových sekvencií ostatných členov rodiny NGF/TNF.
Promótory vhodné na použitie pri prokaryotických hostiteľoch zahŕňajú beta-laktamázový a laktózový promótorový systém; promótor alkalickej fosfatázy; tryptofánový (trp) promótorový systém; systém bakteriálneho luminiscenčného (luxR) génu a hybridné promótory, ako je promótor tac. Vhodné sú aj iné bakteriálne promótory.Ich nukleotidové sekvencie boli publikované, a tým sa umožnilo odborníkom pripojiť ich k požadovanej sekvencii DNA (sekvenciám) použitím spojok (linkers) a adaptorov (adaptors), keď je nutné doplniť požadované reštrikčné miesto.
Vhodné promótorové sekvencie na použitie pri cicavčích hostiteľských bunkách sú tiež dobre známe a patria k nim promótory získané z genómov vírusov, ako je polyoma vírus, vírus kiahní hydiny (fowlpox virus), adenovírus (ako napr. Adenovirus 2), hovädzí papiloma vírus (bovine papilloma virus), vtáčí sarkómový vírus (avian sarcoma virus), cytomegalovírus, retrovírus, vírus žltačky B a najmä opičí vírus 40 (SV40). Ďalšie vhodné cicavčie promótory zahŕňajú heterológne cicavčie promótory, napr. „heat-shock promótory a aktínový promótor.
Zosilňovacie prvky (Enhacer Element)
Expresívne aj klonovacie vektory budú spravidla obsahovať zosilňovacie sekvencie na zvýšenie transkripcie sekvencie DNA kódujúcej skrátený sTNFR vo vyšších eukaryotoch. Zosilňovače sú cis-pôsobiace (cis-acting) komponenty DNA s dĺžkou spravidla 10 až 300 pb, ktoré pôsobením na promótor zvyšujú jeho transkripciu. Zosilňovače sú relatívne orientačne a pozične nazávislé. Nachádzajú sa na 5'-konci aj na 3'-konci transkripčnej jednotky. Kvasnicový zosilňovač je výhodne spojený s kvasnicovými promótormi. Je známych niekoľko zosilňovacích sekvencii dostupných z cicavčích génov (napr. globín, elastáza, albumín, alfa-fetoproteín a inzulín). Navyše vírusové zosilňovače, ako napr. zosilňovač SV40, zosilňovač včasného promótora cytomegalovírusu, zosilňovač polyoma a zosilňovače adenovirusov sú príkladmi zosilňovacích prvkov na aktiváciu eukaryotických promótorov. Aj keď zosilňovač môže na 3'- aj na 5'-konci DNA kódujúcej skrátený sTNFR, typicky je na 5'-pozícii od promótora.
Ukončenie transkripcie
Všetky expresívne vektory použité v eukaryotických hostiteľských bunkách obsahujú sekvencie nevyhnutné na ukončenie transkripcie a na stabilizáciu mRNA. Také sekvencie sú bežne dostupné z 5'- a niekedy z 3'-oblastí, kde nedochádza k translácii eukaryotických DNA alebo cDNA. Tieto oblasti obsahujú nukleotidové segmenty transkribované ako polyadenylované fragmenty na oblastiach mRNA kódujúcej skrátený sTNFR, kde nedochádza k translácii.
Konštrukcia vektora
Konštrukcia vhodného vektora obsahujúceho jednu alebo viac z predtým uvedených zložiek (spoločne so sekvenciou kódujúcou skrátený sTNFR) sa dosiahne štandardnou ligačnou technikou. Izolované plazmidy alebo fragmenty DNA sa rozštiepia, upravia a znova spoja v požadovanom poradí tak, aby sa vytvoril požadovaný vektor. Aby sa overila správnosť sekvencie konštruktu, ligačnú zmes možno použiť na transformáciu E. coli a úspešné transformanty sa môžu vybrať technikami opísanými vyššie. Potom sa pripraví vektor z transformantov vo väčších množstvách a vektor sa analyzuje rozštiepením reštrikčnými endonukleázami a/alebo sekvenovaním, aby sa potvrdila prítomnosť požadovaného konštruktu.
Môže sa použiť aj vektor, ktorý v cicavčích bunkách zaistí prechodnú (transient) expresiu DNA kódujúcej skrátený sTNFR. Všeobecne zahŕňa prechodná expresia použitie expresívneho vektora, ktorý je schopný účinne sa replikovať v hostiteľskej bunke, takže hostiteľská bunka akumuluje mnoho kópií expresívneho vektora a následne syntetizuje vysoké hladiny požadovaného proteínu kódovaného expresívnym vektorom. Každý prechodný expresívny systém skladajúci sa z expresívneho vektora a hostiteľskej bunky je vhodný na pozitívnu identifikáciu proteínov kódovaných klonovanými DNA a aj na rýchle testovanie takých proteínov na požadované biologické alebo fyziologické vlastnosti, t.j. na identifikáciu biologicky aktívnych skrátených sTNFR.
Hostiteľské bunky yPredkladný vynález poskytuje aj všetky rekombinantné hostiteľské bunky, ktoré obsahujú sekvencie nukleových kyselín použiteľných pri expresii požadovaného proteínu. Vzorové prokaryotické a eukaryotické hostiteľské bunky zahŕňajú bunky bakteriálné, cicavčie, hmyzie, bunky húb a kvasiniek a rastlinné bunky.
Prokaryotické hostiteľské bunky zahŕňajú (ale nie sú obmedzené len na ne) eubaktérie, ako napríklad grampozitívne alebo gramnegatívne organizmy (napr. ŕľ.coli (HB101, DH5a, DH10 a MC1061), bacily, ako B. subtilis; druh Pseudomans, ako P. aeruginosa; poddruhy Streptomyces; Salmonel la typhimurium alebo Serratia marcescans. V špecifickom prípade sa môže požadovaný proteín exprimovať v E. coli.
Navyše okrem prokaryotických hostitelských buniek môžu byť vhodnými hostiteľmi na expresiu skrátených sTNFR eukaryotické mikróby, ako napr. vláknité huby alebo kvasnice. Medzi nižšími eukaryotickými hostiteľskými organizmami sa najčastejšie používa Sacharomyces cerevisiae alebo bežné droždie, ale dobre známy a bežne dostupný je rad ďalších tried, druhov a kmeňov.
Skrátené sTNFR sa môžu exprimovať v glykozylovanej forme ktoroukolvek z radu vhodných hostitelských buniek odvodených z viacbunkového organizmu. Takéto hostitelské bunky sú schopné komplexného spracovania a glykozylačných aktivít. Väčšinou sa môže použiť akákoľvek eukaryotická bunková kultúra, či už buniek stavovcov alebo bezstavovcov vrátane rastlinných a hmyzích buniek. Vo zvláštnom prípade sa môže požadovaný protein exprimovať v bunkách baculovírusov.
Môžu sa použiť bunky stavovcov, pretože ich množenie v kultúre (tkanivové kultúry) je dobre známe. Príklady vhodných línií cicavčích hostiteľských buniek zahŕňajú napríklad líniu z opičích obličiek CV1 transformovanú SV40 (COS-7), líniu z embryonálnych ľudských obličiek (bunky 293 alebo bunky 293 subklonované na rast v suspenznej kultúre), bunky z obličiek mláďat chrčkov a bunky z vaječníkov chrčkov. Medzi ostatné vhodné cicavčie bunkové línie patria napr. HeLa, myšie L-929bunky, 3T3-línie odvodené zo Swiss, Balb-c alebo NIH myší a bunkové línie BHK alebo HaK z chrčka. V určitom prípade sa môže požadovaný protein exprimovať v bunkách COS.
Hostiteľská bunka sa môže transfektovať alebo lepšie transformovať požadovanou nukleovou kyselinou za vhodných podmienok, kedy dochádza k expresii nukleovej kyseliny. Výber vhodných hostiteľských buniek, metódy transformácie, pestovania, amplifikácie, testovania a produkcie produktu a jeho purifikácie je odborníkom dobre známy (Gething a Sambrook-(1981), Náture, 293:620-625 alebo Kaufman et al. (1985), Mol. Celí. Biol., 5(7):1750-1759 alebo U.S. Pat. No. 4 419 446, ktorých opisy sú tu zahrnuté odkazom. Napríklad pre cicavčie bunky bez bunkovej steny sa môže použiť precipitačná metóda s fosfátom vápenatým (calcium phosphate). Ďalej sa môže použiť elektroporácia, mikroinjekcie a ostatné známe techniky.
Skrátené sTNFR možno produkovať aj homológnou rekombináciou alebo metódami rekombinantnej produkcie využívajúcimi riadiace elementy vnesené do buniek, ktoré už obsahujú DNA kódujúcu skrátené sTNFR. Homológna rekombinácia je technika pôvodne vyvinutá na zameranie génov na indukciu alebo opravu mutácií v transkripčne aktívnych génoch (Kucherlapati (1989), Prog. In Nucl. Acid Res. And Mol. Biol., 36:301, ktorého opis je tu zahrunutý odkazom). Základná technika sa vyvinula ako metóda na vnesenie špecifických mutácií do špecifických oblastí cicavčieho genómu (Thomas et al. (1986), Celí, 44:419-428; Thomas a Capecchi (1987), Celí, 51:503-512 a Doetschman et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., 85:8583-8587, ktorých opis je tu zahrnutý odkazom) alebo na opravu špecifických mutácií vnútri chybného génu (Doetschman et al. (1987), Náture, 330:576-578, ktorého opis je tu zahrnutý odkazom). Vzorové techniky sa opisujú v U.S. Patent No. 5 272 071; W092/01069; WO93/03183; WO 94/12650 a WO 94/31560, ktorých opis je tu zahrnutý odkazom.
Vďaka homológnej rekombinácii sa môže sekvencia DNA určená na včlenenie do genómu umiestniť do určitej oblasti príslušného génu jej prichytením k cieľovej DNA. Cieľová DNA je DNA, ktorá je komplementárna (homológna) k oblasti genómovej DNA. Malé úseky cieľovej DNA, ktoré sú komplementárne k špecifickej oblasti genómu, sa dostanú do kontaktu s rodičovským prameňom počas procesu replikácie DNA. DNA, ktorá sa vniesla do bunky, všeobecne hybridizuje, a teda rekombinuje s inými úsekmi endogénnej DNA zdieľaním homológnych oblastí. Ak sa tento komplementárny prameň pripojí k oligonukleotidu, ktorý obsahuje mutáciu alebo odlišnú sekvenciu DNA, táto sa tiež zainkorporuje do novosyntetizovaného prameňa (ako výsledok rekombinácie). Vďaka proofreadingovej funkcii je možné, že táto nová sekvencia slúži ako templát. Takto sa prenesená DNA inkorporuje do genómu.
Ak je známa sekvencia určitého génu (napríklad sekvencia nukleových kyselín skráteného sTNFR), môže sa syntetizovať alebo inak získať (napríklad vhodným reštrikčným štiepením pôvodnej DNA na miestach okolo oblasti, ktorá nás zaujíma) sekvencia riadiaca expresiu (úsek DNA, ktorý je komplementárny k vybranej oblasti génu). Tento úsek slúži ako cieľová sekvencia na vloženie do bunky a bude hybridizovať k svojej homológnej oblasti vnútri genómu. Ak k tejto hybridizácii dôjde v priebehu replikácie DNA, tento úsek DNA (a akákoľvek ďalšia takto pripojená sekvencia) bude slúžiť ako Okazakiho fragment a bude vsadený do novosyntetizovaného dcérskeho reťazca DNA.
K týmto úsekom cieľovej DNA sú pripojené oblasti DNA, ktoré sa môžu navzájom ovplyvňovať s expresiou skráteného sTNFR. Napríklad do genómu určenej hostiteľskej bunky sa vloží v dostatočnej blízkosti a v správnej orientácii promótor/zosilňovač, supresor alebo exogénny transkripčný modulačný element, aby sa ovplyvnila transkripcia DNA kódujúcej požadovaný skrátený sTNFR. Riadiaci element nekóduje skrátený sTNFR, ale namiesto toho riadi časť DNA prítomnej v genóme hostiteľskej bunky. Expresia skráteného sTNFR sa tak môže dosiahnuť nie transfekciou DNA, ktorá kóduje skrátený sTNFR, ale skôr použitím cieľovej DNA (obsahujúcej homológne oblasti s endogénnym génom, ktorý nás zaujíma) spojenej s DNA regulačným úsekom DNA, ktorý poskytne endogénna génová sekvencia s rozpoznateľným signálom pre transkripciu skráteného sTNFR.
Pestovanie hostiteľských buniek
Metódy kultivácie všetkých (jednej alebo viacerých) rekombinantných hostiteľských buniek na produkciu požadovaného proteínu závisia od mnohých faktorov a úvah; optimálny výrobný postup pre danú situáciu bude odborníkom zrejmý po niekoľkých experimentoch. Rekombinantné hostiteľské bunky sa pestujú vo vhodnom médiu a exprimujú skrátený sTNFR, ktorý sa prípadne izoluje a purifikuje zo živného média (alebo z buniek, ak sa exprimuje intracelulárne) vhodnými, odborníkom známymi postupmi.
Konkrétne každá z rekombinantných buniek použitých na produkciu požadovaného skráteného sTNFR sa môže pestovať v médiu vhodnom na indukciu promótorov, na výber vhodných rekombinantných hostiteľských buniek alebo na amplifikáciu génov kódujúcich požadovaný skrátený sTNFR. Médium sa môže doplniť (ak je to nutné) hormónmi a/alebo ostatnými rastovými faktormi (ako je inzulín, transferín alebo epidermálny rastový faktor), sólami (chlorid sodný, vápnik, horčík a fosfát), tlmivými roztokmi (ako je HEPES), nukleotidmi (ako je adenozín a tymidín), antibiotikami (ako je gentamycín), stopovými prvkami (sú definované ako anorganické zlúčeniny spravidla prítomné v konečných koncentráciách rádovo mikromol) a glukózou alebo iným zdrojom energie. Môžu sa doplniť aj inými doplnkami vo vhodných koncentráciách podlá názoru odborníkov. Vhodné podmienky pestovania, ako napr. teplota, pH a podobne, sú odborníkom zbehlým v práci s vybranými hostiteľmi dobre známe.
Farmaceutické zloženie
Každá farmaceutická zmes všeobecne obsahuje terapeuticky účinné množstvo skrátených sTNFR a chemicky modifikované deriváty skrátených sTNFR (spoločne „skrátený(é) sTNFR produkt(y)) s prísadou nosiča. Nosič prednostne obsahuje jeden alebo viac farmaceutický a fyziologicky prijateľných materiálov s prísadou skráteného sTNFR produktu(ov) a riadenú uvoľňovanú látku.
Primárne rozpúšťadlo v nosiči môže byť buď vodnej alebo nevodnej povahy. Nosič môže navyše obsahovať ďalšie farmaceutický prijatelné substancie na úpravu alebo udržanie pH medzi 5 a 6,5 alebo ešte lepšie medzi 5,5 a 6 (napríklad tlmivé roztoky, ako citrátový, fosfátový a aminokyseliny, ako je glycín); látky zväčšujúce objem lyofilizovaného preparátu (naríklad manitol a glycín); osmomolarity (napr. manitol alebo chlorid sodný); povrchovo aktívne látky (napr. polysorbát 20, polysobrát 80, triton a pluroniká (pluronics); viskozity;
jasnosti; farby; sterility; stability (napr. sacharóza a sorbitol); antioxidanty (napr. sulfát sodný a hydrogensulfit sodný); konzervačné látky (napr. kyselina benzoová a kyselina salicylová); vône preparátu; látky ovplyvňujúce chuť a riediace činidlá; rýchlosti rozpúšťania (napr. rozpúšťadlá a rozpúšťacie činidlá, ako alkohol, polyetylénglykol a chlorid sodný); rýchlosti uvoľňovania; emulzifikačné látky; suzpenzné činidlá; rozpúšťadlá; plnivá; prostriedky na transport (delivery vehicles); riedidlá; inertné substancie a/alebo farmaceutické zosilňovače. Dajú sa predvídať aj ďalšie účinné formy administrácie, ako napr. parenterálny pomaly sa uvoľňujúci prípravok (parenteral slow-release formulation), inhalačné hmly, orálne aktívne prípravky (orally-active formulations) alebo čapíky. Zmes môže obsahovať aj jednotlivé prípravky polymérnych zlúčenín, ako napr. značne narušené polyméry (bulk erosion polymers) (napr. tieto látky - kopolyméry poly(kyselina lactic-co-glycolic (PLGA), zmesi PLGA polyméru, blokujúce kopolyméry PEGu, a kyselina mliečna a glykolová, polykyanoakryláty); povrchovo erózne polyméry (napr. polyanhydridy a polyortoestery); hydrogél estery (napríklad pluronic polyoly, polyvinylalkohol, polyvinylpyrolidón, kopolyméry maleic anhydrid-alkyl vinyl ether, celulóza, deriváty kyseliny hyalurónovej, alginát, kolagén, želatína, albumín a škroby a dextrány) a ich kompozitné formy; alebo prípravky lipozómov alebo mikroguľôčok (liposomes or microspheres). Takéto prípravy môžu ovplyvniť fyziologický stav, stabilitu, rýchlosť uvoľňovania in vivo a rýchlosť odbúravania prítomných proteínov a derivátov in vivo. Optimálne farmaceutické zloženie pre požadovaný proteín určí odborník v závislosti od spôsobu podávania a požadovanej dávky. Príklady farmaceutických zložení sa uvádzajú v Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, strany 1435-1712; Gombotz and Pettit (1995), Bioconjugate Chem., 6:332-351; Leone-Bay, et al . (1995), Journal of Medicinal Chemistry, 38:4263-4269; Haas, et al. (1995), Clinical Immunology and Immunopathology, 76(1): 93; WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772 a WO 94121235, ktorých opis je tu zahrnutý odkazom.
Špecifické postupne sa uvoľňujúce zmesi sú dostupné od nasledovných výrobcov: Depotech (Depofoam™, multivezikulárny lipozóm - multivesicular liposome) : Alkermes (ProLease™, PLGA mikroguľôčky (microshepre)). Ako sa tu uvádza, pod hyalurónanom (hyaluronan) sa rozumie hyalurónan, kyselina hyalurónová (hyaluronan, hyaluronic acid) a jej soli (napr. hyalurónan sodný - sodium hyaluronate), estery, étery, enzymatické deriváty a krížovo spojené gély kyseliny hyalurónovej (crosslinked gels of hyaluronic acid), ako je hylan (hylan). Príklady foriem hyalurónanu sú uvedené v Peyron and Balazs (1974), Path. Biol., 22(8):731-736; Isdale et al. (1991), J. Drug
Dev., 4 (2):93-99,- Larsen et al. (1993), Journal of Biomedical Materials Research, 27:1129-1134; Namiki, et al. (1982), International Journal of Clinical Pharmacology, Therapy and Toxicology, 20(11):501-507,- Meyer et al. (1 995), Journal of Controlled Release, 35:67-72; Kikuchi et al. (1996), Osteoarthritis and Cartilage, 4:99-110; Sakakibara et al. (1994), Clinical Orthopaedics and Related Research, 299:282-292; Meyers a Brandt (1995), 22(9):1732-1739,- Laurent et al. (1995), Acta Orthop Scand, 66(266):116-120,- Cascone et al. (1995), Biomaterials, 16 (7):569574; Yerashalmi et al. (1994), Archives of Biochemistry and Biophysics, 313(2):267-273,- Bernatchez et al. (1993), Journal of Biomedical Materials Research, 27(5): 677-681; Tan et al. (1990), Australian Journal of Biotechnology, 4 (1):38-43,- Gombotz a Pettit (1995), Bioconjugate Chem., 6: 332-351; U. S . Patent Nos.
582 865, 4 605 691, 4 636 524, 4 713 448, 4 716 154, 4 716 224,
772 419, 4 851 521, 4 957 774, 4 863 907, 5 128 326, 5 202 431,
336 767, 5 356 883; European Patent Application Nos. 0 507 604 A2 a 0 718 312 A2; a WO 96/05845, ktorých opis je tu zahrnutý odkazom. Určité hyalurónanové zmesi sú dostupné od nasledovných dodávatelov: BioMatrix, Inc. Ridgefield, NJ (Synvisc™, zmes 90:10 hylan tekutiny a hylan gélu (mixture of a hylan fluid and hylan gel)); Fidia S.p.A., Abano Terme, Italy (Hyalgan™, sodná sol rozčlenenej kyseliny hyalurónovej (sodium sált of a rooster comb-derived hyaluronic acid) (molekulová hmotnosť asi 500 000 až asi 700 000)); Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan (Artz™, 1% roztok rozčlenenej kyseliny hyalurónovej s molekulovou hmotnosťou asi 700 000); Pharmacia AB, Stockholm, Sweden (Healon™, rozčlenená kyselina hyalurónová s molekulovou hmotnosťou asi 4xl06) ; Genzyme Corporation, Cambridge, MA (Surgicoat™, rekombinantná kyselina hyalurónová); Pronova Biopolymer, Inc. Portsmouth, NH (Hyaluronic Acid FCH, vysoká molekulová hmotnosť (napr. okolo 1,5 až 2,2 x 106) , kyselina hyalurónová pripravená z kultúry Strptococcus zoaepidemicus; Sodium Hyaluronate MV (molekulová hmotnosť približne 1,0 až 1,6 x 106) a Sodium Hyaluoronate LV (molekulová hmotnosť približne 1,0 až 2,2 x 106) ; Calbiochem-Novabiochem AB, Lautelfingen, Schwitzerland (sodná soľ kyseliny hyalurónovej) (Hyaluronic Acid, sodium sált) (katalógové číslo v katalógu z roku 1997 385908) pripravené z druhu Streptococcus); Intergen Company, Purchase, NY rozčlenená kyselina hyalurónová s molekulovou hmotnosťou asi 1 x 106) ; Diosynth Inc., Chicago, IL; Amerchol Corp., Edison, NJ and Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo,
Japan.
Len čo je dané farmaceutické zloženie, môže sa skladovať v sterilných ampulkách ako roztok, suspenzia, gél, tuhá alebo dehydratovaná emulzia alebo lyofilizovaný prášok. Takéto zloženie sa môže skladovať buď vo forme pripravenej na použitie, alebo vo forme vyžadujúcej pred použitím rekonštitúciu (napr. lyofilizovanej).
V špecifickom prípade sa vynález zameriava na súpravy na produkciu jednodávkových aplikačných jednotiek. Súpravy môžu obsahovať nádobku so sušeným proteínom a nádobku s vodným prípravkom. Súpravy v rámci tohto vynálezu zahŕňajú jednoalebo viackomorové predplnené injekčné striekačky; Ukážkovo predplnené injekčné striekačky (napr. tekuté injekčné striekačky (liquid syringes), lyo-injekčné striekačky (lyosyringes) (ako napr. Lyo-Ject, dvojkomorové predplnené lyoinjekčné striekačky), ktoré sú dostupné od Vetter GmbH, Ravensburg, Nemecko.
Použitie
Skrátené sTNFR produkty môžu byť užitočné ako látky na výskum alebo ako terapeutické a diagnostické látky. Skrátené sTNFR sa môžu použiť v diagnostických testoch in vitro a/alebo in vivo na kvantifikáciu množstva prirodzeného sTNFR-Ι alebo sTNFR-II v pletivách alebo vzorkách orgánu alebo na určenie a/alebo izolovanie buniek, ktoré exprimujú TNF (Scallon et al. (1995)), v testoch na kvantifikáciu množstva prirodzeného sTNFR-Ι alebo sTNFR-II v pletivách alebo vzorkách orgánu alebo na určenie a/alebo izolovanie buniek, ktoré exprimujú TNF (Scallon et al. (1995), viď vyššie). V testoch pletív alebo orgánov bude (v porovnaní so štandardnou väzbovou krivkou 125Iskrátených sTNFR) menej rádioaktivity 125I zo skrátených sTNFR viažucich sa na TNF vďaka neoznačenému prirodzenému sTNFR-I alebo sTNFR-II viažucemu sa na TNF. Podobne 125I-skrátené sTNFR sa môžu použiť na detekciu prítomnosti TNF v rôznych typoch buniek.
Tento vynález predpokladá aj použitie skrátených sTNFR produktov na tvorbu protilátok a výslednej protilátky (konkrétne vrátane tých, ktoré sa budú viazať aj na pôvodný sTNFR-Ι alebo sTNFR-II). Môžu sa pripraviť protilátky, ktoré sa budú viaží ku skráteným sTNFR, napríklad k epitopu vnútri aminokyselinovej sekvencie Ri-[Cys19-Cys103]-R2 alebo vnútri aminokyselinovej sekvencie R4-[Cys32-Cys115]-R5. Pracovník s bežnými schopnosťami môže použiť dobre známe a publikované postupy na získanie monoklonálnych a polyklonálnych protilátok alebo rekombinantných protilátok, ktoré špecificky rozoznajú a viažu sa na rôzne proteíny kódované aminokyselinovými sekvenciami predkladaného vynálezu. Také protilátly sa potom môžu použiť na purifikáciu a charakterizáciu hotového, 30 kDa TNF inhibítora s plnou dĺžkou a hotového 40 kDa TNF inhibítora s plnou dĺžkou.
Predkladaný vynález sa vzťahuje aj na metódy liečenia určitých chorôb a lekárskych stavov (mnoho z nich môže byť charakterizovaných ako zápalové ochorenia), ktoré sú sprostredkované TNF (mediated by TNF). Choroba alebo lekársky stav sa pokladá za „ochorenie sprostredkované TNF, ak je spontánna alebo experimentálna choroba spojená so zvýšenými hladinami TNF v telesných tekutinách alebo pletivách priľahlých k ohnisku ochorenia alebo sa objavuje v organizme. Ochorenia sprostredkované TNF sa môžu rozlišovať pomocou nasledovných dvoch podmienok: 1) patologické nálezy spojené s chorobou sa môžu vyvolať experimentálne na zvieratách podávaním TNF a 2) patológia indukovaná na experimentálnych zvieracích modeloch ochorenia *sa môže inhibovať alebo odstrániť použitím látok, ktoré inhibujú pôsobenie TNF. Mnoho ochorení sprostredkovaných TNF spĺňa dve z týchto troch podmienok, ostatné spĺňajú všetky tri. Neúplný zoznam chorôb sprostredkovaných TNF spolu s príslušnými následnými ochoreniami a symptómami, ktoré sa všetky môžu liečiť metódami podľa predkladaného vynálezu sú: syndróm respiračných ťažkostí u dospelých (adult respirátory distress syndróme); kachexia/anorexia (cachexia/anorexia); rakovina (napr. leukémia); syndróm chronickej únavy (chronic fatigue syndróm); odmietnutie štepu hostiteľom; hyperalgézia (hyperalgesia); zápalové ochorenie čriev (bowel inflammatory disease); zápalové neuro ochorenie (neuroinflammatory disease); ischemické/reperfúzne poškodenie (ischemic/reperfusion injury) vrátane mogovej ischémie (poškodenie mozgu ako výsledok traumy, epilepsia, krvácanie alebo mŕtvica, čo vo všetkých prípadoch môže viesť k neurodegeneráciám); diabetes (napr. počiatok detského diabetu mellitus typu 1); násobná skleróza; očné ochorenia; bolesť; pankreatitída; pľúcna fibróza (pulmonary fibrosis); reumatické ochorenia (napr. reumatická artritída, osteartritída, (osteoarthritis), detská (reumatoidná) artritída, séronegatívna polyartritída, ankylózna spondilitída (ankylosing spondylitis), Reiterov syndróm a reaktívna artritída (Reitherá syndróm and reactive arthritis), lupienková artritída, enteropatická artritída (enteropatic arthritis), polymyozitída (polymyosithis), dermatomyozitída (dermatomyositis), sklerodermia (sclerodema), systematická skleróza (systemic sclerosis), vaskulitída (vasculitis) , mozgová vaskulitída, Sjógrenov syndróm, reumatická horúčka, polychondritída (polychondritis) a reumatická polymyalgia (polymyalgia rheumatica) a arteritída veľkých buniek (giant celí arteritis; septický šok, vedľajšie účinky radiačnej terapie; systémová lupus erytheumatous; dočasné mandibulárne kĺbové ochorenie; tyroitída a transplantácia pletív.
Skrátené sTNFR produkty sa môžu podávať pacientom v terapeuticky účinných množstvách na liečenie ochorení sprostredkovaných TNF (ako sa definujú vyššie) vrátane napríklad reumatických ochorení (napr. lymské ochorenie, detská (reumatoidná) artritída, osteoartritída, lupienková artritída, reumatická artritída a stafylokokmi vyvolaná („septická) artritída). Pod pojmom „pacient sa myslia zvieratá (napr. mačky, psi, kone) aj ľudia.
Skrátený sTNFR produkt sa môže podávať lokálne, enterálne a parenterálne vrátane (a nielen) intravenóznej, intramuskulárnej, intraarteriálnej, intratekálnej, do puzdra (intracap64 sular), intraorbitálnej (intraorbital), intrakardiálnej (intracardiac), intradermálnej, intraperitoneálnej, transtracheálnej, subkutánnej, subkutikulárnej (subcuticular), intraartikulárnej (intra-articular), subkapsulárnej (subcaksular), do mozgovej pleny (subarachnoid), intraspinálnej, intravertikulárnej a intrasternálnej injekcie a infúzie. Skrátený sTNFR produkt sa môže podávať aj orálne alebo cez mukóznu membránu (through mucus membranes), t.j. intranazálne, sublingválne, bukálne alebo rektálne; vždy sa jedná o systémovú aplikáciu.
Preferuje sa, keď sa skrátené sTNFR produkty aplikujú intraartikulárnou, subkutánnou, intramuskulárnou alebo intravenóznou injekciou. Skrátené sTNFR produkty sa môžu podávať aj nepretržitou infúziou (napríklad implantovaný alebo externý infúzne zariadenie meniaci stály alebo prerušovaný prietok), a tak sa zaistí plynulé požadovaná úroveň skrátených sTNFR v krvi počas podávania. Prednostne sa to dosahuje prostriedkami kontinuálnej infúzie, napr. minipumpou, ako je osmotická minipumpa. Pri týchto spôsoboch je istota, že množstvo liečiva sa udržiava na požadovanej úrovni a že možno odoberať vzorky krvi a sledovať množstvo liečiva v krvnom obehu. Komerčne sú dostupné rôzne pumpy od dodávateľov, ako MiniMed Inc, Sylmar, CA (napr. MT507) a AlzaCorp., Palo Alto,
CA (napr. osmotická pumpa Alzet, model 2MLI).
Uvažuje sa aj o iných spôsoboch kontinuálneho alebo takmer kontinuálneho dávkovania. Napríklad chemické úpravy môžu viesť k formám s ustáleným uvoľňovaním proteínu, čo tiež vedie k ich stálej prítomnosti v krvnom obehu v predvídanom množstve založenom na určenom dávkovom režime.
Spôsoby použitia skrátených sTNFR produktov na liečenie ochorení sprostredkovaných TNF (vrátane zápalových stavov kĺbov (napr. osteoartritída, lupienková artritída a reumatická artritída) sú vysvetlené v European Patent Application 567566, ktorého obsah je tu uvedený odkazom. V špecifickom prípade sa môžu skrátené sTNFR produkty (napríklad pri liečení reumatickej artritídy a osteoartritídy) podávať intraartikulárne. V inom špecifickom prípade (pri liečení reumatoidnej artritídy, zápalovom ochorení čriev (inflammatory bowel disease), kachexii/anorexii alebo násobnej skleróze sa môžu skrátené sTNFR produkty aplikovať subkutánne alebo intramuskulárne.
V ďalšom špecifickom prípade sa môžu skrátené sTNFR podávať intravenózne - pri liečení poškodenia mozgu ako výsledku traumy, epilepsie, krvácania alebo mŕtvice. Medzi preferované spôsoby pri liečení artritídy patria: 1) jednotlivé intraartikulárne injekcie skrátených sTNFR produktov podávaných opakovane podlá potreby na prevenciu alebo liečenie vypuknutej artritídy a 2) opakované subkutánne injekcie skrátených sTNFR porduktov. Začatie liečby pri septickom šoku by malo začať čo možno najskôr po otrave krvi (septicemia) alebo keď sa diagnostikuje nebezpečenstvo otravy krvi. Liečenie môže napríklad začať ihneď po chirurgickom zákroku alebo nehode alebo akejkoľvek inej udalosti, s ktorou je spojené riziko septického šoku. K preferovaným spôsobom liečenia pri syndróme dýchacích ťažkostí u dospelých (adult respirátory distress syndróme) patrí: 1) jednotlivá alebo viacnásobná intratracheálna aplikácia skrátených sTNFR produktov a 2) bolus (bolus) alebo nepretržitá intravenózna infúzia skrátených sTNFR produktov.
V inom prípade sa uvažuje o bunkovej terapii, napr. implantácii buniek produkujúcich skrátené sTNFR. Tento prípad predkladaného vynálezu môže zahŕňať implantáciu buniek, ktoré sú schopné syntetizovať a vylučovať biologicky aktívne formy skrátených sTNFR pacientovi. Takýmito bunkami produkujúcimi skrátené sTNFR môžu byť bunky, ktoré neprodukujú normálne sTNFR, ale ktoré sa modifikovali na produkciu skrátených sTNFR, alebo to môžu byť bunky, ktorých schopnosť produkovať skrátené sTNFR sa zvýšila transformáciou polynukleotidom vhodným na expresiu a sekréciu skráteného sTNFR. Aby sa minimalizovala potenciálna imunologická reakcia pacientov podávaním skrátených sTNFR odlišných druhov, preferuje sa, keď sú bunky z toho istého druhu ako pacient (napríklad človek) alebo keď bunka môže byť opuzdrená materiálom, ktorý poskytne zábranu proti rozpoznaní imunitným systémom alebo keď môžu byť bunky umiestnené do imunologický zvláštnej anatomickej polohy, ako napríklad do semenníkov, oka alebo centrálneho nervového systému.
Ľudské alebo iné bunky sa môžu implantovať do pacientov v biokompatibilných, semipermeabilných polymérnych obaloch (enclosures) alebo membránach, ktoré uvolňujú skrátené sTNFR, ale zabránia deštrukcii buniek pacientovým imunitným systémom alebo inými škodlivými faktormi z okolitých tkanív. Alebo sa môžu vlastné bunky pacienta transformované mimo organizmu (ex vivo}, aby produkovali skrátené sTNFR, implantovať priamo pacientovi bez takýchto obalov. Metodológia obalenia živých buniek membránou je odborníkom známa, takže sa môže uskutočniť príprava opuzdrených buniek a ich implantácia pacientom.
V inom prípade možno predvídať génovú terapiu in vivo, kedy sa sekvencia nukleovej kyseliny kódujúca skrátený sTNFR vnesie priamo do pacienta. Napríklad sekvencia nukleovej kyseliny kódujúca skrátený sTNFR sa vnesie do cielovej bunky miestnou injekciou koštruktu nukleovej kyseliny (s vhodným vektorom alebo bez neho, napríklad adenovírusového vektora). Ďalšími vektormi môžu byť (medzi inými) retrovírusy, adenovírusy, herpes simplex vírus vektor a papiloma vírus vektor. Fyzický prenos sa môže dosiahnuť in vivo lokálnou injekciou konštruktu požadovanej nukleovej kyseliny alebo iného vhodného transportného vektora obsahujúceho požadovanú sekvenciu nukleových kyselín, prenosom sprostredkovaným lipozómami, priamou injekciou (obnažená DNA), prenosom sprostredkovaným receptorom (komplex ligand-DNA) alebo bombardovaním mikročasticami (génové delo).
Príklady techník bunkovej a génovej terapie sa uvádzajú v U.S. Patent No. 4 892 538; v U.S. Patent No. 5 011 472; v U.S. patent No. 5 106 627; v DE 4219626, WO 94/20517 a 96/22793, ktorých opis je tu zahrnutý odkazom.
Bez ohladu na spôsob aplikácie vyžaduje liečenie chorôb sprostredkovaných TNF dávkový alebo celkový dávkový (dose or total dose) režim skrátených sTNFR účinný na obmedzenie alebo zmiernenie symptómov ochorenia. Ostatné faktory pri určení vhodnej dávky môžu zahŕňať ochorenie alebo stav, ktorý sa má liečiť alebo ktorému sa má predísť, závažnosť ochorenia, spôsob podávania, vek, pohlavie a lekársky stav pacienta. Ďalšie spresnenie výpočtov nevyhnutných na určenie vhodnej dávky na liečenie rutinne uskutočňujú odborníci, najmä vo svetle informácií o dávkovaní „ad assays tu obsiahnutých. Dávka sa môže určiť aj použitím známych skúšok na určenie dávok použitých v spojení s vhodnými údajmi o odpovedi na dávky. Určitá dávka sa kalkuluje podlá približnej telesnej hmotnosti alebo telesného povrchu pacienta.
Frekvencia dávkovania závisí od farmakokinetických parametrov skráteného sTNFR v použitom prípravku. Skrátené sTNFR sa môžu podať raz alebo v prípade vážnych a dlhotrvajúcich ťažkostí denne v menej frekventovaných dávkach alebo sa môžu podávať s počiatočným bolusom nasledovaným nepretržitými alebo udržiavacími dávkami. Pri parenterálnom podávaní môže mať každá dávka napríklad až 10 mg alebo skôr až 15 mg alebo ešte skoršie až 20 mg. Pri podaní do kĺbovej dutiny (articular cavity) sa farmaceutické zloženie prednostne aplikuje ako jedna injekcia (napríklad 3 až 10ml injekčná striekačka obsahujúca dávku od 5 mg/ml do 10 mg/ml) skrátených sTNFR rozpustených v roztoku izotonickej, fosfátom pufrovanej soli. Prípravok sa môže aplikovať do kĺbovej dutiny napríklad raz za 7 až 10 dní.
Takýmto spôsobom sa uskutočňuje aplikácia napríklad 4 až 5krát, pričom dávka sa môže (ak je to nutné) upraviť.
V niektorých prípadoch sa môžu skrátené sTNFR podávať ako doplnok inej terapie a taktiež s inými farmaceutickými prípravkami vhodnými na liečenú indikáciu. Skrátený sTNFR a akákoľvek z tradičných alebo nových protizápalových látok (alebo viac týchto látok) sa môže podávať samostatne alebo v kombinácii.
Skrátené sTNFR produkty (napr. proteíny Rx-[Cys19-Cys103]R2) a akákoľvek z doplnkových protizápalových látok (alebo viac týchto látok) sa môže podávať samostatne alebo v kombinácii. Informáciu o nasledovných zlúčeninách možno nájsť v The Merck Manula of Diagnosis and Therapy, Sixteen Edition, Merck, Sharp & Dohme Research Laboratories, Merck & Co., Rahway, NJ (1992) a vo Pharmaprojects, PJB Publications Ltd.
Terajšie liečenie ochorení sprostredkovaných TNF (ako sa definujú vyššie) vrátane akútnych a chronických zápalov, ako sú reumatické ochorenia, (napr. lymská choroba, detská (reumatická) artritída, osteartritída, lupienková artritída, reumatická artritída a stafylokokmi indukovaná („septická) artritída) zahŕňa najskôr použitie liečiv na ovplyvnenie bolesti a zápalu, klasifikovaných ako nesteroidné protizápalové liečivá (NSAIDs non-steroidal antiinflammatory). Druhotné liečenie zahŕňa ŕ
krtikosteroidy, pomaly pôsobiace antireumatické liečivá (SAARDs - slow acting antirheumatic drugs) alebo ochorenia upravujúce (DM - disease modifying) liečivá.
V špecifickom prípade sa predkladaný vynález orientuje na použitie skráteného sTNFR produktu (napr. proteínu Ri-[Cys19Cys103]-R2) a akéhokoľvek (jedného alebo viacerých) NSAID na liečenie ochorení sprostredkovaných TNF, ako sa definujú vyššie, vrátane akútnych a chronických zápalov, ako reumatických ochorení (napr. lymská choroba, detská (reumatická) λ
artritída, osteartritída, lupienková artritída, reumatická artritída a stafylokokmi indukovaná („septická) artritída; a ochorenie vyvolané vzťahom trn|asplantát versus hostitel. NSAID vďačí svojim protizápalovým účinkom aspoň čiastočne za inhibíciu syntézy prostagaldínov (Goodman a Gilman v „The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, MacMillan, 7th Edition (1985)). NSAID sa môžu rozdeliť do deviatich skupín: 1) deriváty kyseliny salicylovej, 2) deriváty kyseliny propiónovej, 3) deriváty kyseliny octovej, 4) deriváty kyseliny fenámovej (fenamic acid), 5) deriváty kyseliny karboxylovej, 6) deriváty kyseliny maslovej, 7) oxikamy (oxicams), 8) pyrazoly (pyrazoles), 9) pyrazolóny (pyrazolones).
V špecifickom prípade sa predkladaný vynález orientuje na použitie skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri-[Cys19Cys103]-R2) v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s jedným alebo viacerými derivátmi kyseliny salicylovej, prekurzormi jej esterov alebo farmaceutický akceptovateľnými soľami. Medzi tieto deriváty kyseliny salicylovej, prekurzory jej esterov alebo farmaceutický akceptovateľné soli patria (názvy nie sú prekladané):
acetaminosalol, aloxiprin, aspirín, benorylate, bromosaligenin, calcium acetylsalicylate, choline magnesium trisalicylate diflusinal, etersalate, fendosal, gentisic acid, glycol salicylate, imidazole salicylate, lysine acetylsalicylate, mesalamine, morpholine salicylate, 1-naphthyl salicylate, olsalazine, parsalmide, phenyl acetylsalicylate, phenyl salicylate, salacetamide, salicylamide O-acetic acid, salsalate a sulfasalazine
Štruktúrne podobné deriváty kyseliny salicylovej s podobnými analgetickými a protizápalovými vlastnosťami sú taktiež zahrnuté v tejto skupine.
V špecifickom prípade sa predkladaný vynález orientuje na použitie skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri-[Cys19Cys103]-R2) v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s jedným alebo viacerými derivátmi kyseliny propiónovej, prekurzormi jej esterov alebo farmaceutický akceptovatelnými sólami. Medzi tieto deriváty kyseliny propiónovej, prekurzory jej esterov alebo farmaceutický akceptovateľné soli patria (názvy nie sú prekladané): alminoprofen, benoxaprofen, bucloxic acid, carprofen, dexindoprofen, fenoprofen, flunoxaprofen, fluprofen, flurbiprofen, furcloprofen, ibuprofen, ibuprofen aluminum, ibuproxam, indoprofen, isoprofen, ketoprofen, loxoprofen, miroprofen, naproxen, oxaprozin, piketoprofen, pimeprofen, pirprofen, pranoprofen, protizinic acid, pyridoxiprofen, suprofen, tiaprofenic acid a tioxaprofen.
Štruktúrne podobné deriváty kyseliny propiónovej s podobnými analgetickými a protizápalovými vlastnosťami sú taktiež zahrnuté v tejto skupine.
V špecifickom prípade sa predkladaný vynález orientuje na použitie skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri-[Cys19Cys103]-R2) v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s jedným alebo viacerými derivátmi kyseliny octovej, prekurzormi jej esterov alebo farmaceutický akceptovatelnými soľami. Medzi tieto deriváty kyseliny octovej, prekurzory jej esterov alebo farmaceutický akceptovateľné soli patria (názvy nie sú prekladané):
acemetacin; alclofenac, amfenac, bufexamac, cinmetacin, clopirac, delmetacin, díclofenac sodium, etodolac, felbinac, fenclofenac, fenclorac, fenclozic acid, fentiazac, furofenac, glucametacin, ibufenac, indomethacin, isofezolac, isoxepac, lonazolac, metiazinic acid, oxametacin, oxpinac, pimetacin, progiumetacín, sulindac, talmetacin, tiaramide, tivpinac, tolmetin, zidometacin a zomepirac. Štruktúrne podobné deriváty kyseliny octovej s podobnými analgetickými a protizápalovými vlastnosťami sú taktiež zahrnuté v tejto skupine.
V špecifickom prípade sa predkladaný vynález orientuje na použitie skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri-[Cys19Cys103]-R2) v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s jedným.alebo viacerými derivátmi kyseliny fenámovej, prekurzormi jej esterov alebo farmaceutický akceptovateľnými sólami. Medzi tieto deriváty kyseliny fenámovej, prekurzory jej esterov alebo farmaceutický akceptovateľné soli patria (názvy nie sú prekladané): enfenamic acid, etofenamate, flufenamic acid, isonixin, meclofenamic acid, meclofenamate sodium, medofenamic acid, mefanamic acid, niflumic acid, talniflumate, terofenamate, tolfenamic acid and ufenamate.
Štruktúrne podobné deriváty kyseliny fenámovej s podobnými analgetickými a protizápalovými vlastnosťami sú taktiež zahrnuté v tejto skupine.
V špecifickom prípade sa predkladaný vynález orientuje na použitie skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri-[Cys19Cys103]-R2) v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s jedným alebo viacerými derivátmi kyseliny karboxylovej, prekurzormi jej esterov alebo farmaceutický akceptovateľnými soľami. Medzi tieto deriváty kyseliny karboxylovej, prekurzory jej esterov alebo farmaceutický akceptovateľné soli patria (názvy nie sú prekladané): clidanac, diflunisal, flufenisal, inoridine, ketorolac a tinoridine. Štruktúrne podobné deriváty kyseliny karboxylovej s podobnými analgetickými a protizápalovými vlastnosťami sú taktiež t
zahrnuté v tejto skupine.
V špecifickom prípade sa predkladaný vynález orientuje na použitie skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri-[Cys19Cys103]-R2) v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s jedným alebo viacerými derivátmi kyseliny maslovej, prekurzormi jej esterov alebo farmaceutický akceptovateľnými sólami. Medzi tieto deriváty kyseliny maslovej, prekurzory jej esterov alebo farmaceutický akceptovateľné soli patria (názvy nie sú prekladané):
bumadizon, butibufen, fenbufen a xenbucin.
Štruktúrne podobné deriváty kyseliny maslovej s podobnými analgetickými a protizápalovými vlastnosťami sú taktiež zahrnuté v tejto skupine.
V špecifickom prípade sa predkladaný vynález orientuje na použitie skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri-[Cys19Cys103]-R2) v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s jedným alebo viacerými oxikamami (oxicams), prekurzormi ich esterov alebo farmaceutický akceptovatelnými sólami. Medzi oxikamy, prekurzory ich esterov alebo farmaceutický akceptovateľné soli patria (názvy nie sú prekladané) : droxicam, enolicam, isoxicam, piroxicam, sudoxicam, tenoxicam a 4-hydroxyl-l,2-benzothiazine 1,1-dioxide 4(N-phenyl) carboxamide.
Štruktúrne podobné oxikamy s podobnými analgetickými a protizápalovými vlastnosťami sú taktiež zahrnuté v tejto skupine.
V špecifickom prípade sa predkladaný vynález orientuje na použitie skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri-[Cys19Cys103]-R2) v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s jedným alebo viacerými pyrazolmi (pyrazoles), prekurzormi ich esterov alebo farmaceutický akceptovatelnými sólami. Medzi pyrazoly, prekurzory ich esterov alebo farmaceutický akceptovateľné soli patria (názvy nie sú prekladané): difenamizole a epirizole. Štruktúrne podobné pyrazoly s podobnými analgetickými a protizápalovými vlastnosťami sú taktiež zahrnuté v tejto skupine.
V špecifickom prípade sa predkladaný vynález orientuje na použitie skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri-[Cys19Cys103]-R2) v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s jedným alebo viacerými pyrazolónmi (pyrazolones), prekurzormi ich esterov alebo farmaceutický akceptovatelnými sólami. Medzi pyrazolóny, prekurzory ich esterov alebo farmaceutický akceptovateľné soli patria (názvy nie sú prekladané) : apazone, azapropazone, benzpiperylon, feprazone, mofebutazone, morazone, oxyphenbutazone, phenylbutazone, pipebuzone, propylphenazone, ramifenazone, suxibuzone a thiazolinobutazone.
Štruktúrne podobné pyrazolóny s podobnými analgetickými a protizápalovými vlastnosťami sú taktiež zahrnuté v tejto skupine.
V špecifickom prípade sa predkladaný vynález orientuje na použitie skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri-[Cys19-Cys103]-R2) v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s jedným alebo viacerými NSAID (názvy nie sú prekladané) : ε-acetamidocaproic acid,
S-adenosylmethionine, 3-amino-4-hydroxybutyric acid, amixetrine, anitrazafen, antrafenine, bendazac, bendazac lysinate, benzydamine, beprozin, broperamole, bucolome, bufezolac, ciproquazone, cloximate, dazidamine, deboxamet, detomidine, difenpiramide, difenpyramide, difisalamine, ditazol, emorfazone, fanetizole mesylate, fenflumizole, floctafenine, flumizole, flunixin, fluproquazone, fopirtoline, fosfosal, guaimesal, guaiazolene, isonixirn, lefetamine HC1, leflunomide, lofemizole, lotifazole, lysin clonixinate, meseclazone, nabumetone, nictindole, nimesulide, orgotein, orpanoxin, oxaceprolm, oxapadol, paranyline, perisoxal, perisoxal citrate, pifoxime, piproxen, pirazolac, pirfenidone, proquazone, proxazole, thielavin B, tiflamizole, timegadine, tolectin, tolpadol, tryptamid a látky označené firemnými kódmi ako 480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP5O4, AU8001, BPPC, BW54OC, CHINOIN 127, CN100, EB382, EL508, F1044, EK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ONO3144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281,
SY6001, TA60, TAI-901 (4-benzoyl-l-indancarboxylic acid), TVX2706, U60257, UR2301 a WY41770.
Štruktúrne podobné NSAID s podobnými analgetickými a protizápalovými vlastnosťami ako vyššie uvedené NSAID sú taktiež zahrnuté v tejto skupine.
V špecifickom prípade sa predkladaný vynález orientuje na použitie skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri~[Cys19Cys103]-R2) v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s jedným alebo viacerými kortikosteroidmi, prekurzormi ich esterov alebo farmaceutický akceptovateľnými soľami na liečbu ochorení sprostredkovaných TNF (ako sa definujú vyššie), vrátane akútneho a chronického zápalu, ako sú reumatické ochorenia (napr. lymská choroba, detská (reumatická) artritída, osteoartritída, lupienková artritída, reumatická artritída a stafylokokmi indukovaná („septická”) artritída; a skleróza multiplex (multiple sclerosis). Kortikosteroidy, prekurzory ich esterov alebo farmaceutický akceptovateľné soli zahŕňajú hydrokortizón a zlúčeniny, ktoré sú odvodené od hydrokortizónu, ako napríklad (názvy nie sú prekladané):
21-acetoxypregnenolone, alclomerasone, algestone, amcinonide, beclomethasone, betamethasone, betamethasone valerate, budesonide, chloroprednisone, clobetasol, clobetasol propionate, clobetasone, clobetasone butyrate, clocortolone, cloprednol, corticosterone, cortisone, cortivazol, deflazacon, desonide, desoximerasone, dexamethasone, diflorasone, diflucortoloňe, difluprednate, enoxolone, fluazacort, flucloronide, flumethasone, flumethasone pivalate, flunisolide, flucinolone acetonide, fluocinonide, fluorocinolone acetonide, fluocortin butyl, fluocortolone, fluorocortolone hexanoate, diflucortoloňe valerate, fluorometholone, fluperolone acetate, fluprednidene acetate, fluprednisolone, flurandenolide, formocortal, halcinonide, halometasone, halopredone acetate, hydrocortamate, hydrocortisone, hydrocortisone acetate, hydrocortisone butyrate, hydrocortisone phosphate, hydrocortisone 21-sodium succinate, hydrocortisone tebutate, mazipredone, medrysone, meprednisone, methylprednicolone, mometasone furoate, paramethasone, prednicarbate, prednisolone, prednisolone 21-diedryaminoacetate, prednisolone sodium phosphate, prednisolone sodium succinate, prednisolone sodium 21-m75 sulfobenzoate, prednisolone sodium 21-stearoglycolate, prednisolone tebutate, prednisolone 21-trimethylacetate, prednisone, prednival, prednylidene, prednylidene 21-diethylaminoacetate, tixocortol, triamcinolone, triamcinolone acetonide, triamcinolone benetonide a triamcinolone hexacetonide.
Štruktúrne podobné kortikosteroidy s podobnými analgetickými a protizápalovými vlastnosťami sú taktiež zahrnuté v tejto skupine.
V špecifickom prípade sa predkladaný vynález orientuje na použitie skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Rj-tCys19Cys103]-R2) v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s jedným alebo viacerými pomaly pôsobiacimi antireumatickými liekmi (SAARD) alebo antireumatickými liekmi ovplyvňujúcimi chorobu (DMARDS), prekurzormi ich esterov alebo farmaceutický akceptovateľnými sólami na liečbu ochorení sprostredkovaných TNF (ako sa definujú vyššie), vrátane akútneho a chronického zápalu, ako sú reumatické ochorenia (napr. lymská choroba, detská (reumatická) artritída, osteoartritída, lupienková artritída, reumatická artritída a stafylokokmi indukovaná („septická) artritída; a skleróza multiplex (multiple sclerosis). SAARD a DMARDS, prekurzory ich esterov alebo farmaceutický akceptovateľné soli zahŕňajú (názvy nie sú prekladané) : allocupreide sodium, auranof in, aurothioglucose, aurothioglycanide, azathioprine, brequinar sodium, bucillamine, calcium 3-aurothio-2-propanol-l-sulfonate, chlorambucil, chloroquine, clobuzarit, cuproxoline, cyclophosphamide, cyclosporin, dapsone, 15-deoxyspergualin, diacerein, glucosamine, soli zlata (napr. cycloquine gold sált, gold sodium thiomalate, gold sodium thiosulfate), hydroxychloroquine, hydroxyurea, kebuzone, levamisole, lobenzarit, melittin, 6-mercaptopurine, methotrexate, mizoribxne, mycophenolate mofetil, myoral, nitrogen mustard, D-penicillamine, pyridinol imidazoles .ako SKNF86002 a SB203580, rapamycin, thiols, thymopoietin a vincristine.
Štruktúrne podobné SAARD alebo DMARD s podobnými analgetickými a protizápalovými vlastnosťami sú taktiež zahrnuté v tejto skupine.
V špecifickom prípade sa predkladaný vynález orientuje na použitie skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri-[Cys19Cys103]-R2) v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s jedným alebo viacerými inhibítormi COX2, prekurzormi ich esterov alebo farmaceutický akceptovateľnými sólami na liečbu ochorení sprostredkovaných TNF (ako sa definujú vyššie), vrátane akútneho a chronického zápalu.
Príklad inhibítorov COX2, prekurzorov ich esterov alebo farmaceutický akceptovateľných solí zahŕňa celocoxib (názov nie je prekladaný). Štruktúrne podobné inhibítory COX2 s podobnými analgetickými a protizápalovými vlastnosťami sú taktiež zahrnuté v tejto skupine.
V špecifickom prípade sa predkladaný vynález orientuje na použitie skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri-[Cys19Cys103]-R2) v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s jedným alebo viacerými bakteriostatikami (antimicrobials), prekurzormi ich esterov alebo farmaceutický akceptovateľnými sólami na liečbu ochorení sprostredkovaných TNF (ako sa definujú vyššie), vrátane akútneho a chronického zápalu. Bakteriostatiká zahŕňajú napríklad (názvy nie sú prekladané): ampicillin, amoxycillin, aureomicin, hacitracin, ceftazidime, ceftriaxone, cefotaxime, cephachlor, cephalexin, cephradine, ciprofloxacin, clavulanic acid, cloxacillin, dicloxacillan, erythromycin, flucloxacillan, gentamicin, gramicidin, methicillan, neomycin, oxacillan, penicillin a vancomycin.
Štruktúrne podobné bakteriostatiká s podobnými analgetickými a protizápalovými vlastnosťami sú taktiež zahrnuté v tejto skupine.
V špecifickom prípade sa predkladaný vynález orientuje na použitie skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri-[Cys19Cys103]-R2) v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s jednou alebo viacerými z nasledovných zlúčenín na liečbu ochorení sprostredkovaných TNF (ako sa definujú vyššie), vrátane akútneho a chronického zápalu (niektoré názvy nie sú prekladané): faktor stimulujúci kolónie granulocytov (granulocyte colony stimulating factor); thalidone; BN 50730; tenidap; E 5531; tiapafant PCA 4248; nimesulide; panavir; rolipram; RP 73401; peptide T; MDL 201 449A; (ÍR, 3S)-Cis-1-[9-(2,6diaminopurinyl)]-3-hydroxy-4-cyclopentene hydrochloride; (ÍR, 3R)trans-1-[9-(2,6-diamino)purine]-3-acetoxycyclopentane; (ÍR,3R)trans-1-[9-adenyl)-3-azidocyclopentane hydrochloride a (1R,3R)trans-1-(6-hydroxy-purin-9-yl)-3-azidocyclopentane.
V špecifickom prípade sa predkladaný vynález orientuje na použitie skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri~[Cys19Cys103]-R2) v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s jedným alebo viacerými inhibítormi TNF na liečbu ochorení sprostredkovaných TNF (ako sa definujú vyššie), vrátane akútneho a chronického zápalu. Inhibítory TNF zahŕňajú zlúčeniny a proteíny, ktoré blokujú syntézu in vivo alebo extracelulárne uvoľňovanie TNF vrátane nasledovných zlúčenín.
Ďalšie inhibítory TNF zahŕňajú protilátky anti-TNF (napr. protilátku MAK 195F Fab (Holler et al. (1993), lst International Symposium on Cytokines in Bone Marrow Transplantation, 147; monoklonálnu protilátku CDP 571 anti-TNF (Rankin et al. (1995), British Journal of Rheumatology, 34:334-342 (ktorých opis je tu zahrnutý odkazom); myšiu monoklonálnu protilátku BAY X 1351 proti faktoru nekrotizujúcemu tumor (murine anti-tumor necrosisi factor monoclonal antibody) (Kieft et al. (1995), 7th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 9, ktorého opis je tu zahrnutý odkazom; monoklonálnu protilátku CenTNF cA2 anti-TNF (Elliott et al. (1994), Lancet, 344:1125-1127 a Elliott et al. (1994), Lancet, 344-1105-1110, ktorých opis je tu zahrnutý odkazom).
V špecifickom prípade sa predkladaný vynález orientuje na použitie skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri-[Cys19Cys103]-R2) v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s rozpustným rekombinantným ľudským antigénom Fas alebo s jeho rekombinantnými verziami (WO 96/20206 a Mountz et al., J. Immunology, 155:4829-4837 a EP 510 691), ktorých opis je tu zahrnutý odkazom. WO 96/20206 opisuje sekretovaný ľudský antigén Fas (prirodzený a rekombinantný vrátane fúzneho proteínu Ig), metódy izolácie génov zodpovedných za kódovanie rozpustného rekombinantného ľudského antigénu Fas, metódy klonovania génu vo vhodnom vektore a vo vhodných typoch buniek a metódy produkcie inhibítorov expresií génu. EP 510 691 opisuje DNA kódujúcu ľudský antigén Fas vrátane rozpustného antigénu Fas, vektory exprimujúce dané DNA a transformanty transfekované vektorom. Pri parenterálnom podávaní sú dávky fúzneho proteínu antigénu Fas od 1 ug/kg do 100 ug/kg.
V špecifickom prípade sa predkladaný vynález orientuje na použitie skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri-[Cys19Cys103]-R2) v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou), s jedným alebo viacerými inhibítormi interleukínu-1 na liečbu ochorení sprostredkovaných TNF (ako sa definujú vyššie), vrátane akútneho a chronického zápalu, ako sú reumatické ochorenia (napr. lymská choroba, detská (reumatická) artritída, osteoartritída, lupienková artritída, reumatická artritída a stafylokokmi indukovaná („septická) artritída; poškodenie mozgu ako následok traumy, epilepsie, krvácania alebo mŕtvice; a skleróza multiplex (multiple sclerosis).
Triedy inhibítorov interleukín-1 zahŕňajú antagonisty receptoru interleukínu 1 (akákoľvek zlúčenina špecificky zabraňujúca aktivácii bunkových receptorov IL-1), ako IL-lra, ako je opísané ďalej; monoklonálnu protilátku proti anti-IL-1 (naprEP 623674, ktorého opis je tu zahrnutý odkazom); väzbové proteíny IL-1, napr. rozpustné receptory IL-1 (napr. U.S.P. 5 492 888, U.S.P. 5 488 032, U.S.P. 5 464 937, U.S.P. 5 319 071 a U.S.P. 5 180 812, ktorých opis je tu zahrnutý odkazom); monoklonálne protilátky anti-IL-1 (napr. WO 9501997, WO 9402627, W09006371, U.S.P. 4935343, EP 364778, EP 267611 a EP 220063, ktorých opis je tu zahrnutý odkazom); doplnkové proteíny receptora IL-1, napr. WO 96/23067 (ktorého opis je tu zahrnutý odkazom) a ostatné zlúčeniny a proteíny, ktoré blokujú syntézu in vivo alebo extracelulárne uvoľňovanie IL-1.
Antagonistom receptora IL-1 (IL-lra) je ľudský protein, ktorý pôsobí ako prirodzený inhibítor interleukínu-1. Preferované antagonisty receptora spolu s metódou ich prípravy a použitia sú opísané v U.S. Patent No. 5 075 222 (tu odkazovaný ako '222 patent); WO 91/08285; WO 91/17184; A(J 9173636; WO 92/16221; WO93/21946; PCT International Application No. US97/02131, ktorý uvádza farmaceutické zloženie zahŕňajúce a) účinné množstvo kontrolovane uvoľňovaného polyméru (napr. kyseliny hyalurónovej) a b) účinné množstvo IL-lra; WO 94/06457;·WO 94/21275; FR 2706772; WO 94/21235; DE 4219626; WO 94/20517; a WO 96/22793, ktorých opis je tu zahrnutý odkazom.
Proteíny zahŕňajú glykozylované a neglykozylované antagonisty receptora IL-1.
V U. S. Patent No. 5 075 222 (Hannum et al. nazvanom „Interleukin-1 Inhibitors) sa konkrétne uvádzajú a opisujú tri preferované formy IL-lra (IL-lraa, IL-lraP a IL-lrax), z ktorých každý je odvodený z tej istej DNA kódujúcej sekvencie. Tento U.S. Patent (tu uvádzaný ako '222 patent) je tu konkrétne uvedený odkazom. Všetky tri interleukín-1 inhibitory majú podobné funkčné a imunologické aktivity. V '222 patente sa uvádzajú aj metódy produkcie IL-1 inhibitorov, najmä IL-lras. Jedna z uvedených metód zahŕňa izoláciu inhibitorov z ľudských monocytov (kde sú prirodzene produkované). Druhá uvedená metóda zahŕňa izoláciu génu zodpovedného za kódovanie IL-lras, klonovanie génu vo vhodných typoch vektorov a buniek, expresiu génu vedúcu k produkcii IL-lras a získaniu IL-lras. Prechovanou metódou tohto vynálezu je druhá metóda, ktorá je všeobecným príkladom rekombinantných DNA metód. V špecifickom prípade obsahuje IL-lra metionylovanú skupinu na N-konci ako dôsledok expresie v E. coli. Predkladaný vynález zahŕňa aj modifikovaný IL-lras. Modifikovaný IL-lras zahŕňa napríklad muteíny (muteins) takýchto inhibitorov, kde cysteínový zvyšok je nahradený za aminokyselinu v jednej alebo viacerých polohách
Jaminokyselinovej sekvencie prirodzene sa vyskytujúceho inhibítora. Také muteíny môžu potom selektívne miestne reagovať s funkčnými jednotkami polyetylénglykolu (PEG) alebo inými polyétermi obsahujúcimi sulfhydryl (sulfhydryl-containing polyethers), a tak vzniknú IL-lra PEG druhy. PCT Publication No. WO 92/16221 uvádza rad modifikovaných IL-lra druhov a metódy prípravy týchto inhibitorov modifikovaných PEGom.
Ďalšia trieda interleukín-1 inhibitorov zahŕňa zlúčeniny schopné špecificky zabrániť aktivácii bunkových receptorov IL1. K takýmto zlúčeninám patria IL-1 väzbové proteíny, napríklad rozpustné receptory a monoklonálne protilátky. Patria sem aj monoklonálne protilátky proti receptorom.
Ďalšia trieda inhibítorov interleukínu-1 zahŕňa zlúčeniny a proteíny, ktoré blokujú syntézu in vivo a/alebo extracelulárne uvoľňovanie IL-1. jedná sa o látky, ktoré ovplyvňujú transkripciu génu IL-1 alebo úpravu nehotového pre-proteínu IL1.
Vyššie uvedené príklady nevylučujú vopred iné liečenie súbežne s týmito protizápalovými zlúčeninami, ktoré sú odborníkom známe a ktoré by odborníci mohli získať použitím smerníc uvedených v tomto opise.
Na ľahšie podávanie a rovnomernosť dávkovania je obzvlášť výhodné vyrábať (to formulate) zmesi doplnkových protizápalových zlúčenín vo forme dávkových jednotiek (dosage unit). „Forma dávkovej jednotky sa tu vzťahuje na fyzicky oddelenú jednotku vhodnú na jednotkové dávkovanie liečených cicavčích subjektov, pričom každá jednotka obsahuje vopred určené množstvo doplnkových protizápalových zlúčenín určených tak, aby sa dosiahol (v spojení s požadovaným farmaceutickým nosičom) požadovaný terapeutický účinok. „Farmaceutický akceptovateľný nosič zahŕňa všetky rozpúšťadlá, disperzné médiá, obalové, antimikrobiálne a protihubové činidlá, izotonické činidlá a činidlá spomaľujúce absorpciu atď., ktoré sú kompatibilné s aktívnymi látkami, so spôsobom podávania a ďalšími zložkami danej zmesi a ktoré nie sú škodlivé pre príjemcu. Použitie takýchto agens a médií je odborníkom známe (viď napríklad Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, strany 1435-1712, ktorého opis je tu zahrnutý odkazom). Do zmesi sa môžu včleniť aj dodatočné aktívne zložky.
Na orálne terapeutické podávanie môžu byť dodatočné protizápalové zlúčeniny zahrnuté s excipientmi (inertnými nosičmi) a použité vo forme tabliet na prehltnutie, bukálnych (ústnych) tabliet, pastiliek, kapsúl, suspenzií, sirupov, oblátok a podobne, alebo môžu byť zainkorporované priamo do potravy. Tablety, pastilky, pilulky, kapsuly a ďalšie formy môžu obsahovať aj: spojivo (binder), ako napr. „žuvačku z kozinca, agátu (gum tragacants, acacia), obilný škrob alebo želatínu; inertné nosiče (excipients) ako napríklad fosforečnan vápenatý (dicalcium phosphate); rozvolňujúce látky, ako obilný škrob, kyselinu algínovú (alginic acid) a podobne; lubrikant, ako je stearan horečnatý; sladidlo, ako je sacharóza, laktóza alebo sacharín; príchuťové látky, ako matová silica, libavkový olej, čerešňovú alebo pomarančovú príchuť. Ak je dávkovacou jednotkou kapsula, môže okrem vyššie uvedených látok obsahovať tekutý nosič. Môže sa použiť aj rad ďalších materiálov, ktoré modifikujú obal alebo fyzikálnu formu dávkovacej jednotky. Napríklad tablety, pilulky alebo kapsuly sa môžu poťahovať šelakom, cukrom alebo obidvoma látkami. Všetky materiály použité na prípravu akejkoľvek dávkovacej jednotky musia byť pochopiteľne farmaceutický čisté a použitých množstvách netoxické. Navyše sa môžu do postupne uvoľňovaných prípravkov a zloženia pridávať doplnkové protizápalové zlúčeniny. Množtsvo týchto doplnkových protizápalových zlúčenín v danej terapeuticky užitočnej zmesi sa volí tak, aby sa dosiahla vhodná dávka.
Na parenterálne podávanie môžu všetky protizápalové zlúčeniny obsahovať sterilný roztok vhodný na injekcie.
Sterilný roztok vhodný na injekcie sa môže pripraviť zlúčením požadovaného množstva doplnkovej protizápalovej zlúčeniny vo vhodnom, farmaceutický prijatteľnom nosiči s rôznymi ďalšími prísadami vymenovanými nižšie (požadovanými) a následnou sterilizáciou filtráciou. Všetky disperzie sa môžu pripraviť včlenením protizápalovej zlúčeniny do sterilného nosiča, ktorý obsahuje záklladné disperzné médium a ďalšie požadované ingrendiencie z tých, ktoré sú vymenované vyššie. Všetky sterilné roztoky vhodné na injekcie sa môžu pripraviť zlúčením prášku doplnkovej protizápalovej zlúčeniny a (prípadne) akejkoľvek ďalšej požadovanej ingrediencie z predchádzajúcej prípravy jej sterilného roztoku. Prášok sa pripraví akoukoľvek vhodnou technikou (napr. vákuové sušenie a lyofilizácia).
Špecifická dávka doplnkovej protizápalovej zlúčeniny sa vypočíta podľa približnej telesnej hmotnosti alebo telesného povrchu pacienta. Pri určení vhodnej dávky sa môžu zahrnúť aj ďalšie faktory, ak sa jedná o akútne alebo chronické zápalové ochorenie a ak sa jedná o liečbu alebo prevenciu, vážnosť ochorenia, spôsob aplikácie, vek, pohlavie a zdravotný stav pacienta. Odborníci ľahko uskutočnia presnejšie výpočty nutné na vhodné dávkovanie pri liečbe, pri zohľadnení všetkých vyššie uvedených formulácií. Dávkovanie sa môže určiť aj pomocou známych testov na určenie dávky použitých v spojení s príslušnými údajmi o reakcii na dávky.
Zámerom tohto vynálezu je napríklad to, že dávky doplnkových protizápalových zlúčenín vybraných na liečenie určitého akútneho alebo chronického ochorenia, ako napríklad reumatických chorôb (napr. lymská choroba, detská (reumatoidná) artritída, osteoartritída a stafylokokmi indukovaná („septická) artritída) môžu byť na dosiahnutie terapeutického účinku rôznorodé.· Keď má jedna z doplnkových protizápalových zlúčenín vedľajšie účinky, môže sa podávať pacientom počas oobdobia alternatívnej liečby kombinačnej terapie. Napríklad dlhodoobé liečenie meotrexátom (chróme methotrexate treatment) je spojené s toxicitou gastrointestinálnou, pečeňovou, pľúcnou a toxicitou kostnej drene (Sandoval et al., (1995) British Journal of Rheumatology, 34:49-56, ktorého opis je tu zahrnutý odkazom.
Testy na monitorovanie zlepšenia zdravotného stavu môžu zahŕňať špecifické testy zamerané napríklad na určenie systémovej odpovede na zápal, čo zahŕňa rýchlosť sedimenttácie erytroctov (ESR - erythrocyte sedimentation rate), reaktanty akútnej fázy (APR - acute phase reactant). Pozoruje sa opuch postihnutej časti tela. Môže sa pozorovať aj zlepšenie stuhlosti a stisku (siffness and grip (ak je to možné) a zníženie bolesti. Ak je pacientov stav stabilný, podáva sa mu rovnaká dávka týždenne a taktiež týždenne sa hodnotí jeho stav. Ak je pacientov stav stabilný, môže sa v liečbe pokračovať. Po šiestich mesiacoch liečby sa zistia rádiologickým snímaním (napríklad rôntgenom) anatomické zmeny na kostre.
Na konci každého obdobia sa pacient hodnotí znova. Porovnanie rádiologického zhodnotenia pred a po liečení, hodnoty ESR a APR ukazujú na účinnosť liečenia. Podľa účinnosti liečenia a pacientovho stavu sa dávkovanie môže počas liečenia zvýšiť alebo zachovať na tej istej úrovni.
Predkladaný vynález sa prednostne zameriava na metódu (voliteľne s jednou z nasledovných kombinácií) na liečenie alebo prevenciu akútnych alebo chronických zápalových ochorení a stavov (ako sú definované vyššie), ako sú reumatické ochorenia (napr. lymská choroba, detská (reumatoidná) artritída, osteoartritída, lupienková artritída, reumatoidná artritída a stafylokokmi indukovaná („septická) artritída): skrátený sTNFR produkt (napr. proteín Ri- [Cys19-Cys103] -R2) a metotrexat (methotrexate); skrátený sTNFR produkt (napr. proteín Ri-[Cys19-Cys103]-R2) metotrexát a inhibítor IL-1, prednostne IL-lra; skrátený sTNFR produkt (napr. proteín Ri[Cys19-Cys103]-R2) a jedna alebo viac nasledovných látok metotrexát, imunosupresívum (napr. cyklosporín), ciproflaxín, antigén Fas a inhibítor IL-1, prednostne IL-lra; skrátený sTNFR produkt (napr. proteín Ri~ [Cys19-Cys103] -R2) a metotrexát a imunosupresívum (napr. cyklosporín); skrátený sTNFR produkt (napr. proteín Ri- [Cys19-Cys103] -R2) metotrexát ciprofloxacín; skrátený sTNFR produkt (napr. proteín Ri~ [Cys19-Cys103] -R2) , metotrexát a inhibítor IL-1, prednostne IL-lra; skrátený sTNFR produkt (napr. proteín Ri-[Cys19-Cys103]-R2) a jedna alebo viac nasledovných látok - metotrexát, sulfasazín (sulphasazine) a hydroxychlórchinón (hydroxychloroquine); skrátený sTNFR produkt (napr. proteín Rx- [Cys19-Cys103] -R2) metotrexát a hydroxychlórchinón (hydroxychloroquine); skrátený sTNFR produkt (napr. proteín Ri-[Cys19-Cys103]-R2) metotrexát a sulfasazín.
V špecifickom preferovanom prípade metóda zahŕňa podávanie (napr. do kĺba (intraarticular), subkutánne alebo intramuskulárne) skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri-[Cys.19Cys103]-R2, voliteľne vo forme s postupným uvoľňovaním (napr. hyalurónan)) alebo v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s metotrexátom a/alebo inhibítorom IL-1 (napr. IL-lra) a/alebo rozpustným ľudským rekombinantným antigénom Fas na liečbu reumatických ochorení, ako je uvedené vyššie (napr. lymská choroba, detská (reumatická) artritída, osteoartritída, lupienková artritída, reumatická artritída a stafylokokmi indukovaná („septická) artritída a symptómov spojených s nimi.
V špecifickom preferovanom prípade metóda zahŕňa podávanie (napr. intravenózne alebo intravertikulárne) skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri~ [Cys19-Cys103] -R2, voliteľne vo forme s postupným uvoľňovaním (napr. hyalurónan)) a voliteľne v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s aktivátorom pletivového plazminogénu a/alebo s inhibítorom IL-1 (napr. IL-lra) na liečbu poškodenia mozgu ako výsledku traumy, epilepsie, krvácania alebo mŕtvice, ktoré všetky vedú k neurodegenerácii.
V špecifickom preferovanom prípade metóda zahŕňa podávanie (napr. subkutánne alebo intramuskulárne) skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri~ [Cys19-Cys103] -R2, voliteľne vo forme s postupným uvoľňovaním (napr. hyalurónan)) alebo v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s (jednou alebo viacerými látkami) - kortikosteroidom, cyklosporínom, FK-506 alebo interferónom (napr. alfa-interferón, beta-interferón, gama-interferón alebo konsenzuálny (cosensus) interferón) a/alebo IL-lra na liečbu sklerózy multiplex (multiple sclerosis).
V špecifickom preferovanom prípade metóda zahŕňa podávanie (napr. subkutánne alebo intramuskulárne) skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri-[Cys19-Cys103]-R2, voliteľne vo forme s postupným uvoľňovaním (napr. hyalurónan)) alebo v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s G-CSF a/alebo IL-lra na liečbu zápalového ochorenia čriev (inflammatory bowel disease).
V špecifickom preferovanom prípade metóda zahŕňa podávanie (napr. subkutánne alebo intramuskulárne) skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri- [Cys19-Cys103] -R2, voliteľne vo forme s postupným uvoľňovaním (napr. hyalurónan)) alebo v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s leptínom, Marinolom (Marinol™) alebo Megace (Magace™) na liečbu kachexie/anorexie.
V špecifickom preferovanom prípade metóda zahŕňa podávanie (napr. subkutánne, intraventrikulárne alebo intratekálne) skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Rx- [Cysl9-Cys103] -R2, voliteľne Vo forme s postupným uvoľňovaním (napr. hyalurónan)) alebo v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s NSAID (napr. indometacínom (indomethacin) a/alebo inhibítorom IL-1 (napr.IL-lra) na liečbu Alzheimerovej choroby).
V špecifickom preferovanom prípade metóda zahŕňa podávanie (napr. subkutánne, intraventrikulárne alebo intratekálne) skrátených sTNFR produktov (napr. proteínu Ri[Cys19-Cys103]-R2, voliteľne vo forme s postupným uvoľňovaním (napr. hyalurónan)) alebo v kombinácii (pred liečbou, po liečbe alebo súčasne s liečbou) s rozpustným rekombinantným ľudským antigénom Fas na liečbu rakoviny (napríklad leukémií) ; detského diabetes mellitus typu 1; odmietnutia štepu hostiteľom; hepatitídy; ischemického/reperfúzneho (reperfusion) poškodenia, vrátane mozgovej ischémie (poškodenia mozgu ako následku traumy, epilepsie, krvácania alebo mŕtvice, ktoré môžu viesť k neurodegenerácii); zápalové neuro ochorenia; reumatické ochorenia, ako sú vymedzené vyššie (napr. lymská choroba, detská (reumatická) artritída, osteoartritída, lupienková artritída, reumatická artritída a stafylokokmi indukovaná („septická) artritída a transplantácia pletív).
Po uvážení ďalej uvedených ilustratívnych príkladov budú jasné ďalšie stránky a výhody tohto vynálezu.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Rad aspektov a výhod predkladaného vynálezu bude zrejmý po prezretí obrázkov, kde:
Obr. 1 zobrazuje sekvenciu nukleových kyselín (SEQ ID NO:1) kódujúcu Asp1-Asn161 - rekombinantný ľudský sTNFR s plnou dĺžkou. Zobrazuje sa aj sekvencia aminokyselín Asp1Asn161 (SEQ ID N0:2) .
Obr. 2 zobrazuje sekvenciu nukleovej kyseliny (SEQ ID NO: 3) kódujúcu NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys30]-FC-COOH (uvádzaný aj ako sTNFR-Ι 2.6D/C105). Zobrazuje sa aj sekvencia aminokyselín NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC- [Cys19-Cys30] -FC-COOH (SEQ ID N0:4).
Obr. 3 zobrazuje sekvenciu nukleovej kyseliny (SEQ ID NO: 5) kódujúcu NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL88
COOH (uvádzaný aj ako sTNFR-Ι 2.6D/C106). Zobrazuje sa aj sekvencia NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC- [Cys19-Cys103] -FNCSL-COOH (SEQ ID NO:6).
Obr. 4 zobrazuje sekvenciu nukleovej kyseliny (SEQ ID NO: 7) kódujúcu NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC- [Cys19-Cys103]-FN-COOH (uvádzaný aj ako sTNFR-Ι 2.6D/N105). Zobrazuje sa aj sekvencia aminokyselín NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC- [Cys19-Cys103] FN-COOH (SEQ ID NO:8).
Obr. 5 zobrazuje sekvenciu nukleovej kyseliny (SEQ ID NO: 11) kódujúcu NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (uvádzaný aj ako sTNFR-Ι 2.3D/d8). Zobrazuje sa aj sekvencia aminokyselín NH2-MYIHPQNNSIC- [Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (SEQ ID NO:12).
Obr. 6 zobrazuje sekvenciu nukleovej kyseliny (SEQ ID NO: 9) kódujúcu NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (uvádzaný aj ako sTNFR-Ι 2.3D/dl8). Zobrazuje sa aj sekvencia aminokyselín NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (SEQ ID NO: 10).
Obr. 7 zobrazuje sekvenciu nukleovej kyseliny (SEQ ID NO: 13) kódujúcu NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (uvádzaný aj ako sTNFR-Ι 2.3D/dl5). Zobrazuje sa aj sekvencia aminokyselín NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (SEQ ID NO:14).
Obr. 8 zobrazuje sekvenciu nukleových kyselín (SEQ ID NO:34) kódujúcu Leux-Thr179 hotového rekombinantného ľudského sTNFR-II. Zobrazuje sa aj sekvencia aminokyselín Leux-Thr179 (SEQ ID NO:35).
Obr. 9 znázorňuje rozsah opuchu (amount of swelling) indukovaného v reaktivačnom (reactivation) modeli indukovanom streptokokálnou bunkovou stenou podľa opisu v časti príklady II.
Obr. 10 zobrazuje plazmové profily sTNFR-Ι 4D/Cl05db u zdravých paviánov po dvoch minútach intravenóznej infúzie 0,2 mg/kg podľa opisu v časti príklady III.
Obr. 11 zobrazuje plazmové profily sTNFR-Ι 3D/C105db u zdravých paviánov po dvoch minútach intravenóznej infúzie 0,2 mg/kg podľa opisu v časti príklady III.
Obr. 12 zobrazuje plazmové profily sTNFR-Ι 2,6D/C105db u zdravých paviánov po dvoch minútach intravenóznej infúzie 0,2 mg/kg podľa opisu v časti príklady III.
Obr. 13 zobrazuje vzťah medzi dávkou a odbúravaním rôznych dimérových sTNFR-Ι konštruktov podľa opisu v časti príklady III.
Príklady uskutočnenia vynálezu iŠtandardné metódy tvoriace základ pracovných postupov opísaných v nasledovných príkladoch alebo iné vhodné pracovné postupy sa opisujú v známych molekulovo-biologických príručkách, napr. Sambrook et al. (1989), viď vyššie, a Ausubel et al. (1990), viď vyššie. Pre väčšiu názornosť sa používa skratka „mL pre mililiter a „L pre liter.
Príklad 1
Nasledovný príklad opisuje produkciu rôznych foriem skráteného rekombinantného rozpustného sTNFR-I: NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC- [Cys19-Cys103] -FC-COOH (sTNFR-I 2.6D/C105) ; NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC- [Cys19-Cys103] -FNCSL-COOH (sTNFR-Ι 2.6D/C106); NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103] FN-COOH (STNFR-I 2.6D/N105); NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103] FNCSL-COOH (sTNFR-Ι 2.3D/d8); NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (sTNFR-Ι 2.3D/dl8) a NH2-MSIS- [Cys19-Cys103] -FNCSL-COOH (sTNFR-Ι 2.3D/dl5).
A. Príprava DNA
1. sTNFR-Ι 2,6D/C106
Klonovaná DNA odvodená z klonu lambda - gtl07ctnfbp (EP 422339) slúži ako matrica v PCR amplifikačnej reakcii použitím nasledovných PCR primerov:
5' OLIGO #1: (SEQ ID NO: 68)
5' - GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3'
3' OLIGO #2: (SEQ ID NO: 69)
5·-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3'
OLIGO #1 a OLIGO #2 obsahujú miesta Ndel a HindlII a hybridizujú s 5'-koncom (OLIGO #1) a 3'-koncom (OLIGO #2) skráteného génu. PCR amplifikačná reakcia prebieha v 25 cykloch; každý cyklus sa skladá z 30 sekúnd pri 94 °C (denaturácia), 15 sekúnd pri 55 °C (hybridizácia primerov) a 1 minúty pri 72 °C (polymerizácia) [termocykler typ 2400 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)]. PCR produkt sa prečistí pomocou QIAquick™ PCR Purification Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA) podľa návodu výrobcu. Prečistený PCR produkt sa štiepi enzýmami Ndel a HindlII a potom izoluje z gélu pomocou QIAquick™ Gel Extraction Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA) podlá návodu výrobcu. PCR produkt izolovaný z gélu sa vloží do vektora pAMGll (WO 95/26746) a vnesie transformáciou do buniek E. coli FM 15 (ATCC 55765).
2. sTNFR-I 2,6D/C105
PCR amplifikácia sTNFR-I 2,6/C105 sa uskutočňuje použitím pehjLzmidovej DNA sTNFR-I 2,6D/C106 ako matrice a nasledovný^ PCR primerov:
OLIGO #3: (SEQ ID NO: 70)
5' -ACTCGA GGATCCGCGGATAAATAAGTAACGATCCGGTCCA- 3'
OLIGO #4: (SEQ ID NO: 71)
5' -CAGGTCGGATCCTATCAGCAGAAGCACTGGAAAAGGTTTTC-3'
OLIGO #3 a OLIGO #4 obsahujú miesto BamHI a mutáciu N (105) nasledovanú stop kodónom. Primery sú navrhnuté tak, aby úplná amplifikácia matrice zaistila nové miesto BamHI vhodné na ligáciu. PCR amplifikačná reakcia prebieha v 35 cykloch; prvých 10 cyklov sa skladá z 10 sekúnd pri 92 °C (denaturácia), 30 sekúnd pri 55 °C (hybridizácia primerov) a 4 minút pri 68 °C (polymerizácia), nasleduje 25 cyklov zložených z 10 sekúnd pri 92 °C (denaturácia), 30 sekúnd pri 55 °C (hybridizácia primerov) a 4 minúty + 20 sekúnd pri 68 °C (polymerizácia) [termocykler typ 2400 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)]. PCR produkt sa prečistí z gélu pomocou QIAquick™ Gel Extraction Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA) podlá návodu výrobcu, štiepi enzýmom BamHI, extrahuje zmesou fenolu a chloroformu a prezráža etanolom. Resuspenduje sa, vloží do vektora pAMGll (WO 95/26764) a vnesie transformáciou do buniek E. coli FM 15.
3. sTNFR-I 2,6D/N105
PCR amplifikácia sTNFR-Ι 2,6D/N105 sa uskutočňuje použitím plazmidovej DNA sTNFR-Ι 2,6D/C106 ako matrice a nasledovných PCR primerov:
5' OLIGO #5: (SEQ ID NO: 72)
5'-GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3'
3' OLIGO #6: (SEQ ID NO: 73)
5'-CGCGGATCCCTATTAATTGAAGCACTGGAAAAGG-3'
OLIGO #5 a OLIGO #6 obsahujú miesta Ndel a BamHI a hybridizujú s 5'-koncom (OLIGO #5) a 3'-koncom (OLIGO #6) skráteného génu. PCR amplifikačná reakcia prebieha v 30 cykloch; každý cyklus sa skladá zo 45 sekúnd pri 95 °C (denaturácia), jednej minúty pri 65 °C (hybridizácia primerov) a dvoch minút pri 72 °C (polymerizácia) [termocykler typ 2400 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)].
PCR produkt sa prečistí pomocou Wizard™ Clean-Up Systém (Promega, Madison, WI) podlá návodu výrobcu. Prečistený PCR produkt sa štiepi enzýmami Ndel a BamHI, extrahuje zmesou fenolu a chloroformu a prezráža etanolom. Potom sa resuspenduje, vloží do reaktora pAMGll a vnesie transformáciou do buniek E. coli FM 15.
Pracovníci s bežnou znalosťou molekulových techník sú si vedomí, že na základe opisu tohto vynálezu sa môžu lahko na vydarenú expresiu v hostitelskej bunke (napr. E. coli a iné baktérie) použiť alebo upraviť rozmanité genetické materiály a metódy.
4. sTNFR-Ι 2,3D/dl8; sTNFR-Ι 2,3D/d8 a sTNFR-Ι 2,3D/dl5
PCR amplifikácia sTNFR-Ι 2,3D/dl8; sTNFR-Ι 2,3D/d8 a sTNFR-Ι 2,3D/dl5 sa zakaždým uskutoční použitím plazmidovej DNA 2,6D/C106 ako matrice pomocou nasledovných PCR primerov: sTNFR-Ι 2,3D/d8 PCR primery:
5' OLIGO #7: (SEQ ID NO:74)
5' -CCCCATATGTATATCCACCCTCAAAATAAT-3'
3' OLIGO #8: (SEQ ID NO:75) · -CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3' sTNFR-Ι 2,3D/dl5 PCR primery:
5' OLIGO #9: (SEQ ID NO:76)
5' -CCCCATATGTCGATTAGCTGTACCAAGTGCCACAAAGG-3'
3' OLIGO #10: (SEQ ID NO:77)
5' -CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3' sTNFR-Ι 2,3D/dl8 PCR primery:
5' OLIGO #11: (SEQ ID NO:78) · -CCCCATATGTGTACCAAGTGCCACAAAGGA-3'
3' OLIGO #12: (SEQ ID NO:79)
5' -CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3'
Každý z primerov OLIGO #7, OLIGO#9 a OLIGO #11 obsahuje miesto Ndel a každý z primerov OLIGO#á, OLIGO#10 a OLIGO#12 obsahuje miesto HindlI. PCR amplifikačná reakcia prebieha v 25 cykloch; každý cyklus sa skladá zo 45 sekúnd pri 95 °C (denaturácia), jednej minúty pri 65 °C (hybridizácia primerov) a dvoch minút pri 72 °C (polymerizácia) [termocykler typ 2400 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)]. PCR produkty sa prečistia pomocou Wizard™ Clean-Up Systém (Promega, Madison, WI) podľa návodu výrobcu. Prečistené PCR produkty sa štiepia enzýmami Ndel a BamHI, extrahujú zmesou fenolu a chloroformu a prezrážajú etanolom. Potom sa resuspendujú, vložia do reaktora pAMGll a vnesú transformáciou do buniek E. coli FM15.
B. Produkcia v E. coli
Najprv sa rozmnoží čerstvé inokulum vybraného rekombinantného kmeňa E. coli nesúceho požadovaný konštrukt sTNFR-I 2,6D/N105, sTNFR-Ι 2,6D/C105, sTNFR-I 2,6D/C106, sTNFR-I 2,3D/dl8, sTNFR-Ι 2,3D/d8 a sTNFR-Ι 2,3D/dl5. celý obsah zmrazenej glycerolovej konzervy v zásobnej ampulke (asi 1,5 mL) sa prenesie do 2L nádoby, ktorá obsahuje 500 mL pôdy podľa Luriho (LB). Bakteriálna kultúra sa inkubuje pri teplote 37 °C v rotačnej trepačke pri 350 ot/min. Hustota kultúry sa stanovuje meraním absorbanice pri 660 nm (Οϋββο) Inokulum sa kultivuje až do hustoty väčšej ako 2,0 Οϋββο·
V tomto okamihu sa 125 mL kultúry aseptický prenesie do produkčného fermentora s objemom 15 L, ktorý obsahuje 10 L sterilného média.
Produkčné médium a podmienky fermentácie na vlastnú produkciu ako komplexné médium a podmienky fermentácie opisuje Sniff (1993) v doktorandskej práci nazvanej „Chemicky definované médium na nadprodukciu rekombinantných proteínov v E. coli, Colorado State University. Táto práca doporučuje použitie komplexného média obsahujúceho hydrolyzát kazeínu, solí, glycerol a prostriedok proti peneniu (antifoam). Tieto zložky média sa sterilizujú vo fermentore. Po ochladení fermentora na teplotu nižšiu ako 40 °C sa pridajú stopové minerály a hydrochlorid tiamínu, sterilizované filtráciou.
Po ustálení teploty média na 37 °C sa toto médium naočkuje inokulom. Rast kultúry sa sleduje meraním Οϋβδο· pH kultúry sa udržiava na hodnote 6,0 automatickým pridávaním 5 M hydroxidu sodného a 5 M kyseliny chlorovodíkovej . Keď OD66o dosiahne hodnotu 9,5 až 10,5, kultúra sa indukuje aseptickým pridaním sterilného izopropyl-p-D-tiogalaktopyranozidu (IPTG) po konečnú koncentráciu 0,50 mM. Kultúra sa pozberá po zastavení rastu.
Kultivačné médium a podmienky rastu sa použijú v podobe opísanej Sniffom (1993), viď vyššie, s nasledovnými rozdielmi: do média sa pridá síran amónny (2,0 g/L) a monohydrát hydrochloridu L-cysteínu (1,0 g/L), hydrochlorid tetracyklínu sa vynechá, pH sa udržiava na hodnote 6,0 pomocou hydroxidu sodného a kyseliny chlorovodíkovej namiesto hodnoty 7,0 udržiavanej len pomocou hydroxidu sodného, teplota kultivácie sa zvýši na 37 °C, koncentrácia induktora sa zvýšila z 0,15 mM na 0,50 mM IPTG, čas zberu sa určí okamihom zastavenia rastu namiesto časom, ktorý uplynul od indukcie.
Po ukončení fermentácie sa bakteriálne bunky pozberajú centrifugáciou v 500 mL kyvetách. Centrifugujú sa pri 10 000 ot/min 30 minút. Kašovitá bakteriálna peleta sa nariedi na hustotu 15% tuhých častíc v lytickom tlmivom roztoku zloženom z 50 mM Tris a 5 mM EDTA, pH 8,0. Resuspendované bunky sa potom lyžujú trojnásobným pretlačením suspenzie homogenizátorom (APV Gaulin, Inc., Everett, MA) pri tlaku 57 MPa (8000 libier na štvorcový palec). Centrifugáciou homogenizátu pri 10 000 ot/min 30 minút sa získajú inklúzne telieska (IT). Inklúzne telieska sa premyjú v lytickom tlmivom roztoku a centrifugujú tretí raz pri 10 000 ot/min 30 minút. Po resuspendovaní IT v deionizovanej vode (v pomere 1:1) sa naposledy centrifugujú pri 10 000 ot/min 30 minút. Tento krok prestavuje druhé premytie. Premyté inklúz96 ne telieska každého proteínu sa pripravia na rozpustenie, renaturáciu a purifikáciu. Každá várka dáva výťažok asi 200 až 250 IT.
Skrátený sTNFR-Ι sa môže pripraviť fermentáciou podlá iného postupu:
Najprv sa rozmnoží čerstvé inokulum vybraného rekombinantného kmeňa E. coli nesúceho požadovaný konštrukt sTNFR-I 2,6D/N105 alebo sTNFR-I 2,6D/C106. Celý obsah zmrazenej glycerolovej konzervy v zásobnej ampulke (asi 1,5 mL) sa prenesie do 2L nádoby, ktorá obsahuje 500 mL kvasnicového extraktu BBL (10 g/L, pH 7,0). Kultúra sa inkubuje pri teplote 33 °C v rotačnej trepačke pri 300 ot/min. Hustota kultúry sa stnovuje meraním absorbancie pri 600 nm (Οϋβοο) · Inokulum sa kultivuje až do hustoty väčšej ako 2,0 Οϋβοο·
V tomto okamihu sa 80 mL kultúry aseptický prenesie do produkčného fermentora s objemom 15 L, ktorý obsahuje 7 L sterilného rastového média.
Produkčná fermentácia využíva postup kontinuálneho dopĺňania živín do média. Produkčné médium je komplexné médium obsahujúce kvasnicový exktrakt, soli a prostriedok proti peneniu (antifoam). Tieto zložky média sa sterilizujú vo fermentore. Po ochladení fermentora na teplotu nižšiu ako 40 °C sa pridajú stopové minerály, glukóza, síran horečnatý a hexametafosfát, sterilizované filtráciou. Použijú sa dve živiny, jedna je zdrojom uhlíka (glukóza/síran horečnatý), druhou je kvasnicový extrakt obsahujúci dusík.
Po ustálení teploty produkčného média na 33 °C sa toto médium naočkuje inokulom. Rast kultúry sa sleduje meraním ΟΟβοο· pH kultúry sa udržiava na hodnote 7,0 automatickým pridávaním hydroxidu amónneho a kyseliny citrónovej (48,7%). Keď OD600 dosiahne hodnotu 8,0 až 12,0, začne sa pridávať živina I exponenciálnou rýchlosťou. Keď sú hodnoty Οϋβοο v rozmedzí 30 až 40, začína pridávanie živiny II konštantnou rýchlosťou. Po dosiahnutí hodnôt Οϋεοο 67 až 83 sa kultúra indukuje aseptickým pridaním sterilného autoinduktora (laktón homoserínu) po konečnú koncentráciu 0,6 mg/L. V okamihu indukcie sa rýchlosti pridávania živín I a II zmenia na konštantné. Kultúra sa pozberá 16 hodín (+-2) po indukcii.
Po ukončení fermentácie sa bakteriálne bunky pozberajú centrifugáciou v 500 mL kyvetách pri 10 000 ot/min počas 30 minút. Kašovitá bakteriálna peleta sa nariedi na hustotu 15% tuhých častíc v lytickom tlmivom roztoku zloženom z 50 mM Tris a 5 mM EDTA, pH 8,0. Resuspendované bunky sa potom lyžujú trojnásobným pretlačením suspenzie homogenizátorom (APV Gaulin, Inc., Everett, MA) pri tlaku 57 MPa (8000 libier na štvorcový palec). Centrifugáciou homogenizátu pri 10 000 ot/min 30 minút sa získajú inklúzne telieska (IT). Inklúzne telieska sa premyjú v lytickom tlmivom roztoku a centrifugujú tretí raz pri 10 000 ot/min 30 minút. Po resuspendovaní IT v deionizovanej vode (v pomere 1:1) sa naposledy centrifugujú pri 10 000 ot/min 30 minút. Tento krok prestavuje druhé premytie. Premyté inklúzne telieska každého proteínu sa pripravia na rozpustenie, renaturáciu a purifikáciu.
C. Rozpúšťanie/ Renaturácia:
Premyté IT z každej 10 L fermentácie sa rozpustia v 800 mL solubilizačného tlmivého roztoku (50 mM Tris, 8 M močovina, 160 mM cysteín, pH 9,5). pH solubilizačnej zmesi sa nastaví na hodnotu 9,5 pomocou 10N NaOH, zmes sa mieša pri laboratórnej teplote 2 až 3 hodiny. Každá várka poskytla výťažok asi 200 až 250 g IT.
Jednotlivé solubilizačné zmesi sa riedia v pomere 1:20 v chladnom renaturačnom tlmivom roztoku (50 mM Tris, 1,1 M močovina). Konečný objem je asi 16 L. Potom sa pH jednôt98 livých zmesí nastaví na hodnotu 9,7 pomocou 6N HC1. Zmesi sa pomaly miešajú pri 4 °C 2 až 3 dni.
Potom sa pH jednotlivých zmesí nastaví na hodnotu 5,0 ľadovou kyselinou octovou a 6N HC1. Zrazenina, ktorá sa v každej zmesi vytvorí, sa odstráni centrifugáciou pri 10 000 g v centrifúge Beckman, typ J2-HS. Získaný supernatant sa potom filtruje na 5μιη a 0,22gm filtri.
D. Purifikácia
Renaturovaný proteín sa pripraví na purifikáciu na kolóne IX-1 SP Sepharose Big Bead™ (Pharmacia Biotech, Inc. Piscatawax, NJ).
Kolóna IX-1 SP Sepharose Big Bead™ (4,4 cm x 20 cm)
Tlmivý roztok A 25 mM octan mM NaCl pH 5,0
Tlmivý roztok B 25 mM octan
375 mM NaCl pH 5,0
Pred nanesením renaturovaného materiálu sa každá kolóna ekvilibruje 4 až 5 objemami kolóny tlmivým roztokom A. Materiál z jednotlivých várok sa oddelene nanáša na kolóny na prečistenie. Na každú kolónu sa nanesie maximálne 12 g proteínu na liter polyméru. Potom sa každá kolóna premyje 3 až 4 objemami kolóny tlmivého roztoku A (ak sa hodnota UV nevráti k základnej línii). Proteíny sa eluujú pomocou lineárne rastúceho gradientu soli v rozmedzí 50 až 375 mM NaCl s celkovým rozsahom 8 objemov kolóny. Celá bielkovinová frakcia sa zhromaždí. Zachytávanie bielkovinovej frakcie na každej kolóne začína, keď UV absorbancia vzrastie na 20 % maxima. Zber eluátu sa zastaví v prípade dosiahnutia hodnôt 50 % maxima UV absorbancie alebo ak absorbancia prestáva klesať.
Rýchlosť prietokov:
7,5 objemov kolóny/hod - ekvilibrácia, premývanie objemov kolóny/hod - nanášanie objemov kolóny/hod - elúcia
Celá purifikácia na kolónach sa uskutočňuje pri 4 °C.
Spojené frakcie z každej IX-I kolóny sa pripravia na ďalšie prečistenie na kolóne Toyo Pearl™ Butyl 650M HIC (Toso Haas, Philadelphia, PA) .
Kolóna 300 mL - Toyo Pearl™ Butyl 650M (4,4 cm x 20 cm)
Tlmivý roztok A Riediaci tlmivý roztok Tlmivý roztok B 20 mM NaPOí 40 mM NaPO4 Milli Q H2O
1,8 M NaCl, pH 6,0 4 M NaCl pH 6,0
Pred nanesením spojenej frakcie z kolóny IX-I sa kolóna ekvilibruje 4 až 5 objemami kolóny tlmivým roztokom A. Spojené frakcie z IX-1 sa zriedia 1:1 riediacim tlmivým
J** roztokom a pH sa upraví na hodnotu 6,0. Zriedená spojená frakcia z IX-I sa nanensie na kolónu. Na každú kolónu sa nanesie maximálne desať gramov proteínu na liter polyméru. Potom sa každá kolóna premyje 3 objemami kolóny tlmivého roztoku A. Proteíny sa eluujú pomocou lineárne klesajúceho gradientu soli v rozmedzí 1,8 mM NaCl až H2O s celkovým rozsahom 8 objemov kolóny. Zachytávanie každej bielkovinovej frakcie začína, keď UV absorbancia vzrastie na 15 až 20 % maxima. Zber sa ukončí v prípade dosiahnutia hodnôt 50 % maxima UV absorbancie alebo ak absorbancia prestáva klesať.
100
Rýchlosť prietokov:
objemov kolóny/hod - ekvilibrácia, nanášanie a premývanie 3 objemy kolóny/hod - elúcia
Celá purifikácia a kolónach sa uskutočňuje pri laboratórnej teplote.
Zahustenie/diafiltrácia (C/D)
V kroku C/D sa použije 1 štvorcová stopa (30,5 cm x 30,5 cm) PLLC regenerovanej celulózovej membrány s M.V.cutoff 5 000 (Milli-Pore, Bedford, MA). Každá spojená frakcia z kolóny HIC sa zahustí na objem asi 200 mL a potom diafiltruje proti 6 až 7 objemom 20 mM NaPO4 pH 6,0, kým vodivosť nie je nižšia ako 4 mm/hod.
Zahustenie/diafiltrácia sa uskutočňuje pri laboratórnej teplote.
Každá vzorka po C/D sa pripraví na prečistenie na kolóne IX-2 - 365 mL SP-Sepharose HP™ (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ).
á»'·
Kolóna IX-2 - 365 mL SP-Sepharose HP™ (5 cm x 18,5 cm)
Ekvilibračný tlmivý roztok 20 mM Na NaPO4 pH 6,0
Tlmivý roztok A mM NaPO4 pH 6,3 50 mM NaCl
Tlmivý roztok B mM NaPO4 pH 6,8
Pred nanesením jednotlivých vzoriek C/D sa každá kolóna ekvilibruje 4 až 5 objemami kolóny ekvilibračného
101 tlmivého roztokom A. Každá vzorka C/D sa oddelene nanáša na kolónu tak, aby nanesené množstvo neprekročilo osem gramov proteínu na liter polyméru. Potom sa každá kolóna premyje 3 objemami kolóny ekvilibračného tlmivého roztoku a 3 objemami tlmivého roztoku A . Proteíny sa eluujú pomocou lineárneho gradientu pH v rozmedzí 6,3 až 6,8 a gradientu soli v rozmedzí 0 až 50 mM NaCl (tlmivý roztok B) s celkovým rozsahom 8 objemov kolóny. Zber frakcií začína pri hodnote O.D. 1,0 na začiatku a končí pri dosiahnutí 50 % maxima na konci.
Skrátený sTNFR-Ι sa môže solubilizovať, renaturovať a prečistiť aj iným spôsobom, ktorého opis nasleduje.
C.l Rozpúšťanie/Renaturácia:
Premyté inklúzne telieska (IT) sa rozpustia v roztoku so zložením 8 M močovina, 60 mM Tris, 100 mM cysteín tak, aby výsledná koncentrácia roztoku bola 6,5 M močovina, 50 mM Tris a 80 mM cysteín, pH 9,4 a 5 až 10 mg/mL skráteného sTNFR-Ι. (Koncentrácia sTNFR-Ι sa stanoví na základe množstva sTNFR-Ι v premytých IT v g/L.) Roztok sa mieša pri laboratórnej teplote 90 minút a potom sa proteíny renaturujú zriedením 1:10 v chladnom (4 C až 8 °C) tlmivom roztoku so zložením 0,85 močovina, 50 mM Tris, pH 9,8 (pH je merané pri teplote 4 °C až 8 °C).
Renaturovaný roztok sa mieša 24 až 72 hodín pri 4 ’C až 8 °C. Na konci tohto času sa pridá ľadová kyselina octová (~ 20 mM) a pH sa upraví na 5,0. Vytvorená zrazenina sa odstráni centrifugáciou a supernatant sa uchová na nanesenie na prvú kolónu.
102
D.l Purifikácia
Prejasnený supernatant po kyslej precipitácii sa nanesie na kolónu SP-Sepharose Big Bead™ (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ), ktorá sa ekvilibrovala tlmivým roztokom so zložením 20 mM octan sodný, 75 mM NaCl, pH 5,0. Vzorka sa nanesie na kolónu v množstve nepresahujúcom 15 g skráteného sTNFR-1 na L objemu náplne. Po nanesení sa kolóna premyje 3 objemami kolóny 20 mM octanu sodného, 75 mM NaCl, pH 5,0 a eluuje lineárnym 9 kolónovým gradientom v rozmedzí 75 mM až 450 mM NaCl v 20 mM octane sodnom, pH 5,0. Čistenie na kolóne SP-Sepharose Big Bead™ (SP-BB) sa uskutočňuje pri teplote 4 °C až 8 °C.
Spojené frakcie z SP-BB kolóny sa nariedia v pomere 1:1 v 2 M NaCl, 60 mM octane, pH 4,5 a ak je to nutné, pH sa upraví na 4,5. Spojená frakcia z SP-BB kolóny sa nanesie na kolónu Toyopearl™ Butyl 650M (Toso Haas, Philadelphia, PA), ekvilibrovanú tlmivým roztokom so zložením IM NaCl, 30 mM octan, pH 4,5. Na kolónu sa nanesie skrátený sTNFR-1 v množstve ~ 10 až 13 gramov na liter náplne kolóny. Po nanesení vzorky sa kolóna premyje 3 objemami kolóny tlmivého roztoku so zložením 1 M NaCl, 30 mM octan, pH 4,5 a eluuje lineárnym gradientom (8 objemov kolóny) v rozmedzí 1 M NaCl až 0 M NaCl v 30 mM octane pH 4,5.
Purifikované frakcie skráteného sTNFR-1 z Butyl 650M kolóny sa spoja, zriedia vodou 1:5 a nanesú na kolónu SPSepharose High Performance™ (SP-HP) (Pharmacia Biotech,
Inc., Piscataway, NJ) ekvilibrovanú 30 mM octanom, pH 4,5 (nanesené maximálne - 15 g/L objemu náplne). Kolóna sa potom premyje 3 objemami 30 mM octanu, pH 4,5 a eluuje lineárnym gradientom (12 objemov kolóny) v rozmedzí 100 mM až 400 mM NaCl v 30 mM octane, pH 4,5. Purifikované frakcie skráteného sTNFR-1 sa spoja a pH sa upraví na 5,0 pomocou NaOH.
103
C. PEGylácia:
1. Príprava sTNFR-I 2,6D/N105-t-BuPEG(33 kDa)
K chladnému roztoku (4 °C) sTNFR-Ι 2,6D/N105 (3,5 mg/mL) v 50mM octane sodnom, pH 4, sa pridá za stáleho miešania trojnásobný molový nadbytok t-BuPEG (mono-tercbutoxypolyetylénglykol, priemerná m.h. = 33 kDa, Sherwater polymers, Xnc.). NaCNBH3 sa pridá do výslednej koncentrácie 20 mM a reakčná zmes sa mieša 18 až 24 hodín pri 7 °C.
Rozsah modifikácie proteínu v priebehu reakcie sa sleduje pomocou SEC HPLC kolóny TSKG3000swXL (Toso Haas, Motngomeryville, PA), vymývanej fosfátovým tlmivým roztokom so zložením O,1M fosforečnan sodný, pH 6,9, 0,5M NaCl a 10% etanol rýchlosťou 0,7 ml/min (Toso Haas, Montgomeryville, PA) .
pH reakčnej zmesi sa upraví na hodnotu asi 3,5 pomocou IM HC1 a reakčná zmes sa zriedi vodou na výslednú koncentrá ciu 1,5 mg/ml.
sTNFR-I 2,6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) sa oddelí od zvyšku t-BuPEG a iných vedľajších produktov ionexovou chromatografiou na SP-Sepharose HP 16/10™ (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ).
Reakčná zmes sa nanesie na kolónu a nezreagovaný tBuPEG sa vymyje 3 objemami kolóny štartovacieho tlmivého roztoku A (20mM octan sodný, pH 4,0). sTNFR-Ι 2,6D/N105-tBuPEG(33 kDa) sa eluuje lineárnym gradientom (20 objemov kolóny) v rozmedzí 0 až 30 % tlmivého roztoku B (IM NaCl v 20mM octane, pH 4,0). Eluát sa meria pri 280 nm. Každá frakcia obsahujúca sTNFR-I 2,6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) sa analyzuje pomocou SDS-PAGE na komerčne pripravených gradien tových géloch 4 až 20% (Novex, San Diego, CA) . Frakcie sa spoja podľa výsledkov SDS-PAGE, zahustia a sterilné filtrujú. Všetky spojené frakcie prečisteného sTNFR-Ι 2,6D/N105-t BuPEG(33 kDa) sa opäť analyzujú pomocou SDS-PAGE a SEC HPLC
104
Proteín sa prenesie do roztoku 10 mM fosforečnan sodný, pH
6,5 a 20 mM NaCl.
1. Príprava sTNFR-I 2,6D/N105-33 kDa (MePEG)
K chladenému (7 °C) a miešanému roztoku sTNFR-2,6D/N105 (4 mg/mL) sa pridáva kyselina octová dovtedy, kým hodnota pH nedosiahne 5,0. K tomuto roztoku sa pridá 15 mM NaCNBH3 a dvojnásobný molový nadbytok t-butoxy PEG (terc-butoxypolyetylénglykol, priemerná m.h. = 33 kDa, Shearwater polymers, Inc.). Reakčná zmes sa pri tejto teplote krátko mieša a potom sa inkubuje asi 18 hodín.
Po 18 hodinách sa reakčná zmes upraví na pH 3,0 kyselinou citrónovou.
sTNFR-I 2,6D/N105-t-MePEG (33 kDa) sa oddelí od zvyšku MePEG a iných vedľajších produktov ionexovou chromatografiou na kolóne SP-Sepharose HP™ (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ).
Reakčná zmes sa nanesie na kolónu (maximálne 8 mg/ml polyméru) a nezreagovaný MePEG sa eluuje 3 objemami kolóny štartovacieho tlmivého roztoku A (20mM citrát sodný, pH 3,0). sTNFR-I 2,6D/N105-t-MePEG (33 kDa) sa eluuje lineárnym gradientom (16 objemov kolóny) v rozmedzí 0,1 až 0,5 M NaCl v 20mM citráte, pH 3,0. Eluát sa meria pri 280 nm. Každá frakcia obsahujúca sTNFR-I 2,6D/N105-MePEG(33 kDa) sa analyzuje pomocou SDS-PAGE na komerčne pripravených gradientových géloch 4 až 20% (Novex, San Diego, CA). Frakcie sa spoja podľa výsledkov SDS-PAGE, zahustia a sterilné filtrujú. Všetky spojené frakcie prečisteného sTNFR-Ι 2,6D/N105MePEG(33 kDa) sa opäť analyzujú pomocou SDS-PAGE. Purifikovaný sTNFR-I 2,6D/N105-MePEG (33 kDa) sa zahustí na 5 až 20 mg/mL a prenesie do PBS, pH 6,5 (10 mM fosforečnan sodný, 35 až 100 mM NaCl) alebo do 20 mM octanu, 100 mM NaCl, pH 5,0).
105
3. Príprava sTNFR-I 2,6D/N105-MePEG (20 kDa)
Postup kroku A prípravy sTNFR-I 2,6D/N105-MePEG (33 kDa) sa v podstate zopakuje s tou výnimkou, že MePEG (monometoxypolyetylénglykol, priemerná m.h. = 33 kDa, Shearwater Polymers, Inc.) sa nahradí MePEGom (monometoxypolyetylénglykol, priemerná m.h. = 20 kDa, Shearwater polymers, Inc.). Tento protein sa prenesie do roztoku lOmM fosforečnan sodný, pH 6,5 a 20mM NaCl.
4. Príprava ďalších konjugátov
Ďalšie konjugáty sTNFR-Ι 2,6D/N105 sa pripravujú v podstate rovnako ako sTNFR-I 2,6D/N105-MePEG(33 kDa) s použitím nasledovných typov PEG aldehydov (Shearwater Polymers, Inc.).
Lineárny monofunkčný - m.h. 5 kDa a 57 kDa
Rozvetvený monofunkčný - m.h. 10 kDa, 20 kDa a 40 kDa
Lineárny monofunkčný - m.h. 8 kDa a 20 kDa
Rozvetvený trifunkčný - m.h. 10 kDa
Tieto proteíny sa prenesú do roztoku 10 mM fosforečnan sodný, pH 6,5 a 20 mM NaCl.
5. Iné metódy pegylácie
Skrátené molekuly sTNFR-Ι sa môžu pegylovať a purifikovať aj inými spôsobmi:
Eluát z kolóny SP-HP (3 až 5 mg/mL, pH upravené na 5,0) reaguje s 2 molmi polyetylénglykolu (napr. MePEG alebo tBuPEG) na mol sTNFR-Ι 2,6D/N105 (~ 5 gramov t-BuPEG na gram sTNFR-Ι 2,6D/N105). Po rozpustení polyetylénglykolu sa pridá 10 až 20 mM kyanoborohydrid a roztok sa inkubuje cez noc pri 7 až 15 °C. Po skončení pegylácie (~ 18 hodín) sa reakcia ukončí pridaním 10 mM glycínu.
106
Pegylačná zmes sa zriedi 4 objemami 50 mM octanu, pH 4,0, výsledné pH sa upraví na 4,0, ak je to potrebné. Zmes sa nanesie na SP-HP kolónu ekvilibrovanú 50 mM octanom, pH 4,0. Maximálne 8 gramov sTNFR-Ι 2,6D/N105 na liter objemu náplne sa nanesie na kolónu. Potom sa kolóna premyje 3 objemami kolóny ekvilibračného tlmivého roztoku a eluuje lineárnym gradientom 0 až 0,3M NaCl v 50 mM octanu, pH 4,0. Monopegylované frakcie sTNFR-2,6D/N105-30 kDa sa zbierajú, pH sa upraví na 5,0, ďalej sa zahustia a diafiltrujú do izotonického tlmivého roztoku. Všetky purifikačné kroky sa uskutočňujú pri laboratórnej teplote. Proteín sa prenesie buď do PBS, pH 6,5 (10 mM fosforečnan sodný, 35 až 100 mM NaCl), alebo do 20 mM octanu, 100 mM NaCl, pH 5,0.
6. Príprava sTNFR-Ι 2,6D/C105 a sTNFR-Ι 2,6D/C106
Polyetylénglykol aktivovaný sulfónovou skupinou (pripravený a prečistený podlá patentov United States Patent Application No. 08/473,809, podaného 7. júna 1995 a United States Patent Application No. 08/611,918, podaného 6. marca 1996) [PEG 20 000-bis-vinylsulfón] sa použije na dimerizáciu proteínov v podstate podlá metódy opísanej v PCT Publication No. WO 95/34326, okrem redukcie a reakčný podmienok.
Proteíny sa pred pripojením polyetylénglykolu redukujú 4 molmi DTT na jeden mol proteínu pri teplote 5 až 6 °C, pH 7,6. Všetky reakcie prebiehajú v prítomnosti 30% glycerolu. Dimerizovaný proteín sa nazýva sTNFR-Ι 2,6D/C105db a sTNFR-I 2,6D/C106db. Každý proteín sa prenesie do PBS, pH 6,5 (10 mM fosforečnan sodný, 35 až 100 mM NaCl) alebo do 20 mM octanu, 100 mM NaCl, pH 5,0.
7. Príprava porovnávacích molekúl sTNFR-I (i). sTNFR-Ι 4D/N105 sa pripraví podlá opisu v EP 422339. sTNFR-Ι 4D/NlO5-t-BuPEG (33 kDa) sa pripraví pegy107 láciou sTNFR-Ι 4D/N105 v podstate podľa postupu uvedeného vyššie pre pegyláciu sTNFR-I 2,6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) . sTNFR-Ι 4D/N105-t-MePEG (33 kDa) sa pripraví pegyláciou sTNFR-Ι 4D/N105 v podstate podlá postupu uvedeného vyššie pre pegyláciu sTNFR-I 2,6D/NlO5-t-MePEG(33 kDa). Príprava sTNFR-Ι 4D/C105 a sTNFR-Ι 4D/C105db sa opisuje v PCT Publication No. WO 95/34326. Tieto proteíny sa rozpustia v lOmM fosforečnane sodnom, pH 6,5 a 20 mM NaCl.
(ii) . sTNFR-Ι 4D/C105-33 kDa (MePEG) sa pripraví pegyláciou 4D/C105 v podstate podľa postupu uvedeného vyššie pre pegyláciu sTNFR-I 2,6D/C105-33 kDa (MePEG) s touto výnimkou: reakcia prebieha pri pH 7,5 a 1,3 molmi DTT na mol sTNFR-Ι ~ 5 až 6 hodín, potom nasleduje odstránenie DTT na kolóne SP-Shepharose™ FF a PEGylácia s 1,5 až 3 mol PEG na mol proteínu počas najmenej 15 hodín pri laboratórnej teplote. Tento proteín sa rozpustí v PBS, pH 6,5 (10 mM fosforečnan sodný, 35 až 100 mM NaCl) alebo v 20 mM octane, 100 mM NaCl, pH 5,0.
(iii) . sTNFR-Ι 3D/N105 (sTNFR-Ι 4D/N105 skrátený o 34 aminokyselín na C-konci) sa pripraví nasledovným spôsobom. PCR amplifikácia sa uskutoční s matricou sTNFR-Ι 4D/N105 a primermi OLIGO#13 (nesie miesto Ndel, hybridizuje s 5'koncom skráteného génu) a OLIGO#14 (nesie miesto HindlI, hybridizuje s 3'-koncom skráteného génu). PCR amplifikačné reakcie prebiehajú v 25 cykloch; každý cyklus sa skladá z 30 sekúnd pri 94 °C (denaturácia), 15 sekúnd pri 60 °C (hybridizácia primerov) a 1 minúty pri 72 °C (polymerizácia) [termecykler typ 2400 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)].
PCR produkt sa prečistí pomocou QIAquick™ PCR Purification Kit (QUIAGEN, Chatsworth, CA). Prečistený PCR produkt sa štiepi enzýmami Ndel a HindlII a potom sa izoluje z gélu pomocou QIAquick™ Gel Extraktion Kit (QUIAGEN, Chatsworth,
108
CA). Produkt PCR izolovaný z gélu sa vloží do vektora pAMGll a vnesie transformáciou do buniek E. coli FM 15.
5' OLIGO#13: (SEQ ID NO:80)
5'-GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3'
3' OLIGO#14 (SEQ ID NO:81)
5'-CCCAAGCTTTTAGGTGCACACGGTGTTCTGTTT-3'
Tento protein sa rozpustí v 10 mM fosforečnane sodnom, pH 6, 5 a 20 mM NaCl.
(iv) . sTNFR-Ι 3D/C105 (sTNFR-Ι 4D/C105 skrátený o 34 aminokyselín na C-konci) sa pripraví tak ako sTNFR-I 3D/N105, ako matrica sa však použije sTNFR-Ι 4D/C105. sTNFRI 3D/C105 sa rozpustí v PBS, pH 6,5 (10 mM fosforečnan sodný, 35 až 100 mM NaCl) alebo v 20 mM octane, 100 mM NaCl, pH 5,0.
(v) . sTNFR-Ι 3D/C105db sa pripraví podobne ako sTNFR-I 4D/C105db, ako východisková látka sa však použije sTNFR-I 3D/C105* namiesto sTNFR-Ι 4D/C105. sTNFR-Ι 3D/C105db sa rozpustí v PBS, pH 6,5 (10 mM fosforečnan sodný, 35 až 100 mM NaCl) alebo v 20 mM octane, 100 mM NaCl, pH 5,0.
Príklad II
Schopnosť inhibovať aktivitu TNF sa stanovuje pri rôznych formách skráteného rekombinantného rozpustného TNFR-I.
A. WEHI cytotoxicky test
Test WEHI je založený na proliferácii buniek in vitro (Edwars et al. (1991), Endocrinology. 128: 989-996). Bunkové
109 línie sú citlivé na TNF-oc (t. zn. TNF-oc je cytotoxický). V prítomnosti inhibítora TNF-oc sú bunky ochránené pred cytotoxickým účinkom, a sú preto schopné proliferácie.
Protokol:
Bunky WEHI 164 kloň 13, citlivé na TNF (ATCC, Rockville, MD) sa suspnedujú v koncentrácii 20 x 104 buniek/mL v médiu RPMI (Gibco, Grand Island, NY) doplnenom 5% Fetal Calf Sérum (Hyclone, Ogden, UT) a penicilín (50 jednotiek/mL): streptomycín (50 ng/mL). Sto mikrolitrov tejto bunkovej suspenzie sa prenesie do všetkých jamiek 96miestnej mikrotitračnej platničky s plochým dnom, bunky sa ponechajú adherovať 4 až 6 hodín pri 37 °C v 5% CO2. Do každej jamky sa pridá 10 μΐ aktinomycínu D (0,0060 mg/mL, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Desať mikrolitrov rekombinantného ľudského TNF-oc s koncentráciou 50 ng/ml (výsledná koncentrácia 5 ng/ml) sa pridá do každej jamky. Dvojkový riediaci rad rôznych foriem sTNFR (sTNFR-I 2,6D/C106, sTNFR-Ι 4D/C105 a sTNFR-Ι 4D/C105db) sa nariedi v PBS a potom pridá dvojmo do jamiek (10 pL/jamka) s adherovanými bunkami línie WEHI 164, ku ktorým sa predtým pridal rekombinantný ľudský TNF-oc. Bunky WEHI-164 kloň 13 sa inkubujú 18 hodín pri 37 °C v 5% CO2. Po skončení inkubácie sa pridá 10 mL roztoku (2 mg/mL) organického farbiva MTT tetrazólium (3-[4,5-dimetyltiozol-2-yl]-2,5-difenyltetrazóliumbromid; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a bunky sa ďalej inkubujú 4 až 6 hodín. Bunky sa solubilizujú pridaním 50 μΐ roztoku DMF/SDS (20% SDS a 50% N,N-dimetylformamid, pH 4,7). Roztok DMF/SDS sa premiešava viacnásobným nabraním a vypustením zo špičky, kým sa všetky kryštáliky MTT nerozpustia a bunky sa ďalej inkubujú 2 až 22 hodín. Hodnoty absorbancie sa merajú na čítacom zariadení Vmax pri 570.
110
Podiel špecifickej cytotoxicity sa vypočíta z hodnôt optických denzít podlá vzorca: % špecifickej cytotoxicity = 100 % x [abs (bunky + médium) - abs(bunky + vzorka)] / [abs(bunky + médium) - abs(bunky + TX-100)]. Počet jednotiek TNF v každej vzorke sa určí pomocou podielu špecifickej cytotoxicity myších štandardov, ako sa už predtým opísalo.
Výsledky testu WEHI sú zhrnuté nižšie v tabuľke 2:
TAB. 2: Aktivita in vitro v teste WEHI
Látka
IC50 (ng/mL) sTNFR-Ι 2,6D/C106 sTNFR-Ι 4D/C105 sTNFR-Ι 4D/C105db
208 238 N/A
Na základe výsledku testu WEHI nie sú žiadne významné rozdiely v biologickej účinnosti in vitro medzi sTNFR-1 2,6D/C106 a sTNFR-1 4D/C105.
B. Cytotoxický test L929:
Cytotoxický test L929 je založený na proliferácii buniek in vitro (Parmely et al. (1993), J. Immunol., 151: 389-396), stanovuje taktiež cytotoxicitu usmrcovania citlivého na TNF-oc. Bunkové línie sú citlivé na TNF-oc (t. zn. TNF-oc je cytotoxický) . V prítomnosti rozpustného inhibítora TNF-cc sú bunky ochránené pred cytotoxickým účinkom, a sú preto schopné proliferácie.
Protokol:
111
Bunková línia L929 sa získa z American Type Culture Collection (Catalog number CCL 1, NCTC kloň 929, kloň kmeňa L, spojivové tkanivo, myš). Na rozmnoženie buniek sa použije RPMI Médium 1640 doplnené 10% FBS + 1% roztok L-glutamínu + 1% roztok penicilín-streptomycínu.
Test sa uskutočňuje na 96-miestnych mikrotitračných platničkách (Corning) tak, že sa použije len 60 vnútorných jamiek. Test sa opakuje trikrát na tej istej platničke pre štandard aj pokusné vzorky.
TNF-oc použitý v teste pochádza z R&D Systems (Minneapolis, MN) . Konečná koncentrácia TNF-oc je 1 ng/mL vo všetkých pokusných jamkách.
Vzorky sa riedia v rastovom médiu L929, 10 ng/mL TNF-oc, 10 pg/mL aktinomycínu D (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)
- Assay Diluent.
Platničky sa pozberajú pomocou roztoku XTT/MEN (1,5 mg/mL XTT + 75 mM MEN).
Prvý deň sa bunky vysejú na pokusné platničky. Bunková suspenzia sa pripraví trypsinizáciou a resuspendovaním buniek v koncentrácii 3,33 x 104 muniek/mL. Do každej z vnútorných .60 jamiek pokusnej platničky sa vyseje 180 mL tejto bunkovej suspenzie. 200 mL rastového média sa rozmiestni vo vonkajších 36 jamkách, aby sme sa vyhli pokusným chybám spôsobeným odparovaním. Platničky prikryté fóliou a chránené pred prievanom sa ponechajú pri laboratórnej teplote asi 1 hodinu. Potom sa umiestnia v inkubátore s vysokou vlhkosťou pri teplote 37 ± 2 °C, 5 ± 1 % CO2. Platničky sa inkubujú asi 20 až 22 hodín, potom sa pridá sTNFR-Ι v rôznom riedení.
Druhý deň sa pripraví štandard sTNFR-Ι 4D/N105 a pokusné vzorky týmto spôsobom: Zrieďte štandard sTNFR-Ι 4D/N105 a pokusné vzorky na koncentráciu asi 2,0 mg/mL (alebo na inú
112 vhodnú koncentráciu). Urobte postupné riedenia tejto koncentrácie tak, aby vznikla riediaca krivka s 10 bodmi siahajúcimi od hodnoty asi 1,0 x 106 ng/mL k 1,0 x 10-3 ng/mL vrátane 0 ng/mL (len Assay Diluent) . Môžu sa použiť aj iné vhodné koncentrácie. Pridajte 1000 gL každého riedenia trojmo na každú pokusnú platničku. Potom inkubujte platničky v inkubátore s vysokou vlhkosťou pri teplote 37 ± 2 °C, 5 ± % CO2 20 ± 1 hodín.
Tretí deň sa pridá 50 μΐ na jamku roztoku XTT/MEN do 60 vnútorných jamiek pokusných platničiek. Platničky sa inkubujú v inkubátore s vysokou vlhkosťou pri teplote 37+2 °C, 5 ± 1 % C02 (Falcon, New York, New York) 24+0,5 hodín.
Štvrtý deň sa stanovia hodnoty optickej hustoty (O. D.) pokusných platničiek pri 450 nm mínus 650 nm na čítacom zariadení ELISA (SpectraMAX, Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA). Ak sa získa pri týchto vlnových dĺžkach hodnota 4000 OD pre jamky na platničke, platnička sa musí ihneď znova prečítať pri 490 nm mínus 650 nm a tieto údaje sa musia použiť na výpočet.
Štandardná logaritmická krivka závislosti odpovede od dávky sa stanoví pomocou štvorparametrovej logaritmickej aproximácie. Pôvodné koncentrácie neznámych vzoriek sa vypočítajú zo štandardnej krivky, ED50 sa vypočíta pre štandard, vypočíta sa korelačný koeficient štandardnej krivky.
Výsledky: Ĺ32.9
Výsledky cytotoxického testu'zú zhrnuté v tabulke 3.
113
TAB. 3 : Aktivita in vitro v cytotoxickom teste L929.
Látka Koncentrácia (mg/mL) ED50 (ng/mL)
sTNFR-I 4D/C105db 7,8 1,0 + 0,1
sTNFR-I 2,6D/C105db 2,6 1,1 + 0,0
STNFR-I 2,6D/C106db 2,2 1,0 + 0,1
STNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33 kDa) 2,0 229,2+8
sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG (33 kDa) 1,1 325,5+147
STNFR-I 2,6D/C105-t-BuPEG (33 kDa) 1,7 210,2+9
Vnútorný štandard:
sTNFR- I 4D/C105 3, 5 314,8±188,1
Údaje naznačujú, že sTNFR-Ι 4D/C105db, STNFR-I 2,6D/C105db a sTNFR-Ι 2,6D/C106db sú aktívne a majú porovnatelnú odpoveď na dávku v porovnaní so štandardom. Ďalej z týchto údajov vyplýva, že sTNFR-Ι 4D/N105-t-BuPEG(33kDa), sTNFR-Ι 4D/C105-t-BuPEG(33kDa) a sTNFR-Ι 2,6D/ClO5-tBuPEG(33kDa) majú takmer o dva rády nižšiu aktivitu, avšak sú ešte v tomto teste aktívne v porovnaní s sTNFR-I 4D/Cl05db.
Pokus #2
sTNFR-I 3D/C105db 0,2 2,27+0,3
sTNFR-I 3D/C105db 0,2 2,0*
STNFR-I 3D/C105db 1»9 1,8*
sTNFR-I 3D/N105 2,4 413,3*
Vnútorný štandard sTNFR-Ι 4D/C105
3,5
115,9+42,1
114 • Hodnota založená na jedinom výsledku
Tieto údaje dokazujú, že sTNFR-Ι 3D/C105db je aktívny a hodnoty ED50 sú v rozmedzí hodnôt charakterizujúcich sTNFR I 4D/C105db (pokus 1#), sTNFR-Ι 2,6D/C105db (pokus 1#) a sTNFR-Ι 2,6D/C106db (pokus 1#) . Údaje ukazujú aj to, že sTNFR-Ι 3D/N105 je menj aktívny ako vnútorný štandard sTNFRI 4D/C105.
C. Reaktivačný modelový pokus založený na indukcii bunkovou stenou streptokoka
Reaktivačný modelový pokus artritídy indukovanej bunkovou stenou streptokoka u potkanov sa uskutočňuje podlá známych protokolov (Esser et al. (1985), Arthritis And Rheumatism, 28: 1402-1411 a Makarov et al.(1996), Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 93: 402-406).
Protokol:
Samice potkana Lewis (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA), každá s hmotnosťou 175 a 185 g sa injikujú intraartikulárne do kĺbu na pravom členku suspenziou preparátu bunkovej steny streptokoka s obsahom peptidoglykánpolysacharidu (SCW) (Lee Laboratory, Grayson, GA) v dávke 1,5 mg/10 mg na kĺb. Fyziologický roztok sa injikuje do kontralaterálneho kĺba ako kontrola. Intrartikulárna injekcia SCW spôsobuje akútnu artritídu s relatívne krátkym trvaním s opuchom kĺbu, ktorá vrcholí deň až dva po injekcii. Po dvadsiatich dňoch, v priebehu ktorých doznieva akútna zápalová odpoveď, sa opäť podá vnútrožilne SCW v dávke 200 mg/200mL na potkana. Druhá dávka stačí na reaktiváciu zápalu v tom členkovom kĺbe, do ktorého sa pred tým injikoval SCW, ale má malý účinok na členok injikovaný
115 fyziologickým roztokom. Rozsah zápalu v priebehu 72 hodín po vnútrožilnej injekcii SCW sa stanoví meraním zadného členkového kĺba pomocou členkového meradla (kaliper) v časoch 0, 24, 36, 48 a 72 hodín po reaktivácii artritídy, potom sa zadný kontralaterálny článok odoberie na histologické vyšetrenie (napr. zápal, vytvorenie pannusu, poškodenie chrupavky a kosti).
Výsledky:
Účinky podania sTNFR-I 2,6D/C106db na vývoj kĺbového opuchu počas reaktivácie artritídy sa testujú. Inhibítor a slepá vzorka sa podáva každý v jednej vnútrožilnej injekcii 24 hodín pred reaktiváciou pomocou SCW.
sTNFR-Ι 2,6D/C106db vykazuje štatisticky významnú účinnosť v redukcii opuchu kĺba, dokázanú analýzou rozptylu (ANOVA) vo Fisherovom post-hoc teste (StatviewR), vo všetkých štyroch dávkach podaných dva alebo tri dni po reaktivácii a vo všetkých dávkach s výnimkou jednej (1,5 mg/kg) podaných prvý deň. Táto redukcia opuchu je porovnateľná s pozitívnou kontrolou sTNFR-Ι 4D/C105db podávanou denne v dávke 0,5 mg/kg (t.j. 8,8 nM) v časovom rozmedzí od prvého dňa pred reaktiváciou do tretieho dňa po reaktivácii. Prepa4ráty sTNFR vykazujú významnú účinnosť aj vtedy, ak hodnotíme rozsah opuchu ako celok v priebehu troch dní. Plocha vymedzená krivkou (AUC) má charakter závislosti odpovede od dávky pri všetkých dávkach (viď obr. 9, sTNFR-Ι 2,6D/C106db je označený „sTNFR-Ι 2,6D a sTNFR-Ι 4D/C105db je označený „sTNFR-Ι 4D).
sTNFR-I 2,6D/N105-t-BuPEG(33kDa) ukazuje výzmanú redukciu v šírke kĺba a histologických indexoch v porovnaní s kontrolnou skupinou choroby v modelovom pokuse.
D. Modelový pokus s použitím D-galaktozamín/lipopolysacharidu
116
D-Galaktozamín (D-GalNH2)/lipopolysacharid (LPS), model (Parmely et al. (1993), viď vyššie) je modelový pokus in vivo založený na zvieracej letalite závislej od TNF-α. Okrem toho bola u autoimúnnych myší MRL-lpr/lpr dokázaná extrémna citlivosť na TNF-α indukovaný LPS alebo SEB (Mountz et al. (1995), J. Immunol., 155: 4829-4837).
Protokol:
U 6- až 8-týždňových myších samíc (MRL -lpr/lpr) (Jakckson Laboratory, Bar Harbor, ME) sa po nočnom hladovaní vyvolá I. P. reakcia pomocou nasledovných farmakologických preparátov: 25 mg D-GalNH2 (Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO) suspendovaný v Hanksovom balancovanom roztoku solí (Gibco Laboratories, Inc., Grand Island, NY) (50 mg/mL); lipopolysacharid (LPS) z E. coli sérotyp 0127:B8 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) v sterilnom médiu PBS zbavenom endotoxínu (25 mg/myš); alebo SEB (Toxin Technologies, Sarasota, FL) v bežnom fyziologickom roztoku (50 mg/myš). Rôzne formy sTNFR sa podávajú v postupnom dvojnásobnom riedení (dávky v mg/kg) tak, aby sa získala krivka ED50 pomocou štatistického Software od firmy Macintosh (StatviewR, Mountain View, CA). Letalita sa sleduje v priebehu 48 hodín po vyvolaní I. P. reakcie.
Výsledky:
Tabuľka 4 ukazuje, že ak sa sTNFR-Ι 2,6D/C106db podá tak, ako sa opísalo vyššie, 1 hodinu pred podaním LPS/DGalNH2, ED50 (t.j. dávka sTNFR-Ι 2,6D/C106db nutná na záchranu 50 % myší) v čase 48 hodín je ~50 pg/kg (N=8 myší). V porovnaní s sTNFR-Ι 4D/C105db nie je žiadny významný rozdiel (P > 0,05) v schopnosti tejto formy zabraňovať letalite (ED50 = ~50 ug/kg; N=8 myší) .
117
ΤΑΒ. 4: Porovnanie sTNFR a optimalizovaných foriem sTNFR v modelovom pokuse LPS/D-GalNIh
Preparát ED100 ED50
STNFR-I 4D/C105db -100 pg/kg -50 gg/kg
sTNFR-Ι 2,6D/C106db ~100 pg/kg -50 gg/kg
sTNFR-I 2,6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) -2 mg/kg -400 pg/kg
sTNFR-I 2, 6D/N105-MePEG(20 kDa) -800-1000 pg/kg -1 mg/kg
sTNFR-I 2,6D/N105-MePEG 2 mg/kg -1-1,5 mg/kg
(20 kDa rozvetvený)
sTNFR-I 2,6D/N105-MePEG 1,5 mg/kg -1 mg/kg
(40 kDa rozvetvený)
Uvedené údaje ukazujú, že sTNFR-Ι 2,6D/C106db má rovnakú aktivitu ako sTNFR-Ι 4D/C105db, avšak sTNFR-I 2,6D/NlO5-t-BuPEG (33kDa) je v tomto modelovom pokuse menej aktívny,.(ED50 je asi 400 gg/kg n = 5 myší). Aj aktivity sTNFR-I 2,6D/NlO5-MePEG (20 kDa rozvetvený) a 2,6D/N1O5MePEG (40 kDa rozvetvený) sú v tomto pokuse nižšie.
E. Pokusný model artritídy indukovanej pomocou adjuvans:
Reumatoidná artritída indukovaná u potkanov pomocou adjuvans sa v mnohom podobá reumatoidnej artritíde u ľudí. Účelom tohto pokusu je demonštrovať, že systémové podanie skrátených foriem sTNFR má zmierňujúci účinok v patogenéze artritídy vyvolanej pomocou adjuvans u myší.
118
Protokol:
Samce potkana Lewis (5 až 7 v skupine) (Charles Laboratories, Inc., Wilmington, MA) s hmotnosťou najmenej 200 g sa kanylujú katétrom SQ a nechajú zotaviť niekoľko dní.
Potom sa umiestnia v infúznych klietkach, kde si zvykajú týždeň pred začiatkom infúzií.
V deň 0 sa všetky potkany injikujú 100 μΐ Freundovho kompletného adjuvans (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), ku* ktorému sa pridalo syntetické adjuvans N,N-dioktyldecyldecyl-N',N-bis-(2-hydroxyetyl)propándiamín, 50 mg/ml. Ôsmy deň sa rôznym skupinám potkanov podáva SQ kontinuálna infúzia sTNFR-Ι 4D/C105 a sTNFR-Ι 2,6D/N105.
Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 5.
TAB. 5: Artritída indukovaná pomocou adjuvans m tn^ 1» 1« u<
Látka Dávka AUC% Hmotnosť tlapky Zápal Res. Kosti Histopatológia
(mg /kg/hod) (% Inh.) (% Inh.) (5 Inh.) (Ϊ Inh
Šcudifu # 1
sTNFR-Ι 4D/C105 5 61 46 37 89
1 49 45 26 855
0,2 33 40 14 34
sTNFR-Ι 2,6D/N105 1 55 53 33 51
Štúdia If 2
sTNFR-I 2,6D/N105 5 42 ND 19 67
1 38 ND 13 49
* . StudiO# 3
sTNFR-I 2,6D/N105 9 50 40 13 27
- KePEG(20 kDa) 3 35 34 9 22
1 36 30 0 0
sTNFR-I 2,6D/N105 9 43 37
XePEG(33 kDa 3 38 33
1 24 20
119
Formy sTNFR-1 2,6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) a sTNFR-I
4D/C105db majú napodiv v prípade artritídy vyvolanej pomocou adjuvans u potkanov Lewis navzájom porovnateľnú antiartritickú aktivitu, aj keď sTNFR-Ι 4D/C105db je účinnejší v cytotoxických testoch WEHI - 164 a L929 in vitro, ako aj v pokusnom modeli LPS/GalN.
F. Artritída indukovaná kolagénom
Artritída indukovaná kolagénom II u potkanov veľmi pripomína reumatoidnú artritídu u ľudí. Účelom tohto pokusu je demonštrovať, že systémové podanie skrátených foriem sTNFR má zmierňujúci účinok v patogenéze artritídy vyvolanej kolagénom typu II u potkanov a myší.
Protokol pre potkany:
Samiciam potkana (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) sa implantovali kanyly SQ, potkany si privykali na upútanie v priebehu kontinuálnej infúzie. Potom sa imunizujú kravským kolagénom typu II vo Freundovom kompletnom adjuvans. 13., 14 alebo 15. deň po imunizácii sa zvieratá s rozvinutou artritídou náhodne rozdelia do skupín po osem jedincov. Infúzia rôznych dávok sTNFR-Ι alebo slepej vzorky sa podáva pokusným skupinám sedem dní tak, ako sa opisuje v tab. 6. Zápal v tlapke sa hodnotí denným meraním členkových kĺbov špeciálnym meradlom (kaliper). Siedmy deň sa zvieratá šetrne zabijú a tlapky sa odoberú na určenie hmotnosti, ktorá slúži ako index zápalu. Členkové a kolenné kĺby sa odoberú na histopatologické posúdenie parametrov artritídy.
Výsledky sa uvádzajú v tab. 6A.
120
ΤΑΒ. 6Α: Artritída indukovaná kolagénom
Látka Dávka AUC% Hmotnosť tlapky Zápal Res. Kosti
Histopatológia
(mg /kg/hod) (% Inh.) {% Inh.) (í Inh.) (6 Inh.)
Štúdia. # 1
sTNFR-Ι 4D/C105 5 65 81 ND ND
1 35 34 ND ND
0,2 19 22 ND ND
STNFR-I 2,6D/N105 1 39 41 ND ND
Štúdia. # 2 (mg /kg/hod)
sTNFR-X 2,6D/N105 3 50 60 76 46
NePEG{33 kDa)
V z Scudics, # 3 (mg /kg/hod,
STNFR-I 2,6D/N105 9 25 44 ND ND
WePEG(33 kDa)
sTNFR-I 2,6D/N105 MePEG(33 kDa) 3 25 37 ND ND
sTNFR-Ι 2.6D/N105 KePEG(20 kDa) 9 35 52 ND ND
sTNFR-Ι 2,6D/N105 3 35 37 ND ND
MePEG(20 kDa)T
Je zaujímavé, že v prípade artrózy indukovanej kolagé-
nom je účinnosť vo všetkých liečených skupinách približne rovnaká (napr. tvar krivky, podiel inhibície plochy vymedzenej krivkou (AUC) v rozpätí 30 až 59 %, inhibícia hmotnosti tlapky v rozpätí 40 až 64 %). Skupina, ktorá nebola liečená, sa štatisticky významne odlišuje od všetkých ostatných skupín pri tomto modeli artritídy.
Protokol pre myši:
121
Samce DBA/1 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) sa imunizujú kravským kolagénom typu II (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) vo Freundovom nekompletnom adjuvans. 24., 25 a 26. deň po imunizácii sa zvieratá s rozvinutou artritídou náhodne rozdelia do skupín s ôsmimi zvieratami. Jedincom v pokusných skupinách sa podáva dvakrát denne IP cestou fyziologický roztok alebo sTNFR-I 2,6D/N105-MePEG (33 kDa) tri dni za sebou (dni +27, +28 , +29). Zápal v tlapke sa hodnotí denným meraním členkových kĺbov špeciálnym meradlom (kaliper). 34. deň sa zvieratá šetrne usmrtia a tlapky sa odoberú na určenie hmotnosti, ktorá slúži ako index zápalu. Členkvé a kolenné kĺby sa odoberú na histopatologické posúdenie parametrov artritídy.
Výsledky sú zhrnuté v tab. 6B.
TAB. 6B: Artritída indukovaná kolagénom
Látka
Dávka AUCí (mg/kg 2D) (% Inh
Celková histopatologicx/ (% Inh.)
Štúdiu- # 1 sTNFR-Ι 4D/C105db 3 sTNFR-Ι 4D/N105 3
Λ ·
-t-BuPEG(33 kDa)
Štúdiou # 2 sTNFR-I 2,6D/N105- 9
MePEG(33 kDa) sTNFR-Ι 2,6D/N105- 3
MePEG(33 kDa)
ND
ND
G.
Produkcia TNF-α indukovaného LPS ovplyvnená kontinuálnou infúziou u potkanov:
122 sTNFR-Ι 2,6D/C105db a sTNFR-Ι 2,6D/C106db, sTNFR-I 2,6D/N105 a sTNFR-Ι 4D/N105 sa podávajú IV do krčnej žily pomocou Alzet™ minipump (Alza Corp., Palo Alto, CA) podlá návodu výrobcu v priebehu 48-hodinovej infúzie (1 mg/kg). Hladiny TNF-α v sére merané testom ELISA (Genzyme, Cambridge, MA) sú významne znížené v porovnaní s kontrolami +2 hodiny po podaní LPS.
Príklad III: Imunogénna štúdia
Imunogénnosť rôznych foriem skráteného rekombinantného rozpustného sTNFR-Ι sa stanoví u niekoľkých zvieracích modelov.
A. Hlodavce sTNFR-I 2,6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) a sTNFR-Ι 4D/C105db sa subkutánne podajú (4 mg/kg) prvý a piaty pokusný deň samiciam potkana Sprague Dawley (Charles River Labs, Inc., Wilmington, MA) (n = 6 až 8 v skupine). Vzorky krvi sa odoberajú týždenne do 21. dňa po začiatku pokusu. Vo vzorkách sa stanoví produkcia IgM a IgG protilátok.
TAB. 7: Imunogénnosť u hlodavcov
Čas [dni] 0,01 7 14 21
SKUPINA+ZVIERA Titer IgM Titer IgM Titer IgM Titer IgM
sTNFR-I 2.6D/N105- -
33 kDaPEG
1 NEG 0 0 0
2 NEG 0 0 0
3 NEG 0 0 0
4 NEG 0 0 0
6 NEG 0 0 0
sTNFR-Ι 2,6D/N105- 0 0,00 0,00 0,00
t-BuPEG (33 kDa)
SEM 0 0,00 0,00 0,00
123
Čas [dni] 0,01 7 14 21
SKUPINA+ZVIERA Titer IgM Titer IgM Titer IgM Titer IgM
Kontrola
7 0 0 50 0
8 0 0 50 0
3 0 0 100 0
9 0 0 0 0
10 0 0 100 50
11 0 0 100 0
12 0 0 100 0
13 0 0 0 0
Kontrola 0 0 62,5 6,3
SEK 0 0 15,7 6,3
sTNFR-I 2,6D/N105-
t-BuPEG(33 kDa) 1 NEG NEG 0 0
2 NEG NEG 0 0
3 NEG NEG 0 0
4 NEG NEG 0 0
6 NEG NEG 0 0
sTNFR-Ι 2,6D/N105- 0,00 0,00 0,00 0,00
t-BuPEG (33 kDa)
SEM 0,00 0,00 0,00 0,00
Kontrola 7 NEG NEG 0 200
8 NEG NEG 0 200
9 NEG NEG 0 0
10 NEG NEG 0 0
11 NEG NEG 200 400
12 NEG NEG 0 200
13 NEG NEG 200 800
14 NEG NEG 0 50
Kontrola 0 0 50 231,3
SEK 0 0 32,7 94,0
124
Z tabuľky je 7 vidno, že sTNFR-Ι 4D/C105db podaný subkutánne (SC) 1. a 5. deň poskytuje vyššie titre potkaních anti-sTNFR-I IgG protilátok do 21. dňa ako sTNFR-I
2,6D/N105-t-BuPEG (33 kDa), ktorý má takmer nulové titre protilátok. Podobné trendy imunogénnosti sa pozorujú aj v prípade potkanov produkujúcich anti-sTNFR-I IgM protilátky do 21. dňa. STNFR-I 2,6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) nevyvoláva tvorbu potkaních anti-sTNFR-I IgM protilátok do 21. dňa.
B. Papio anubis
Náplňou fázy A časti tejto štúdie je stanovenie farmakokinetiky a imunogénnosti sTNFR-Ι 2,6D/C105db (0,2 mg/kg živej hmotnosti (BW)], sTNFR-Ι 3D/C105db (0,2 mg/kg BW) a sTNFR-Ι 2,6/C105db (0,2 mg/kg BW), ktoré sa podávajú dvakrát IV zdravému paviánovi v 21-dňovom intervale.
Časť 1 je rozdelená do dvoch fáz. Cieľom fáze A je stanovenie farmakokinetiky a imunogénnosti rôznych preparátov sTNFR-Ι u zdravého paviána v odpovedi na dve aplikácie. Dvanásť paviánov sa rozdelí do troch skupín. Jedince každej skupiny dostávajú v anestézii 0,2 mg/kg BW sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-Ι 3D/C105db a sTNFR-Ι 2,6D/C105db. Tri paviány sa študujú v priebehu jedného pokusu. Zvieratá sa sledujú 21 dní, potom dostávajú druhú identickú IV aplikáciu proteínu a študujú sa ďalších 21 dní. Farmakokinetika a imunogénnosť sa potom stanovujú v intervaloch.
Cieľom fáze B tejto štúdie je určenie účinnosti týchto preparátov na dobre preskúmanom modeli letality spôsobenej TNF-α (Espat et al., J. Surg. Res., 59: 153-158, 1995). U 16 zvierat rozdelených do skupín po 4 sa indukuje letálna E. coli bakterémia podaním 5 až 10 x 1010 cfu/kg živej hmotnosti. Skupina, ktorá dostala placebo, sa porovnáva s paviánmi, ktoré boli vopred IV injikované sTNFR-Ι 4D/C105db
125 (0,2 mg/kg živej hmotnosti), sTNFR-Ι 3D/C105db (0,2 mg/kg [BW]) a sTNFR-Ι 2,6D/C105db (1 mg/kg BW) .
V obidvoch fázach štúdie 1 sa mladé dospelé paviány Papio anubis, samce aj samice (6 až 11 kg), (Biomedical Research Foundation, San Antonio, TX) ponechajú cez noc hladovať. Anestézia zvierat sa uskutoční ketamínom (10 mg/kg i.m.) a žila na hlave sa perkutánne kanyluje. Anestézia sa udržiava prvotným podaním až 35 mg/kg pentobarbitálu sodného, potom nasledujú opakované injekcie 3 až 5 mg/kg/hod pentobarbitálu sodného. Horné cesty dýchacie sa poistia umiestnením endotracheálnej trubice s manžetou, zvieratá dýchajú spontánne. Do stehennej tepny sa umiestni perkutánne katéter umožňujúci opakovaný odber arteriálnych krvných vzoriek ako aj súvislé sledovanie činnosti srdca a stredný arteriálny krvný tlak pomocou monitora anestézie a srdcovej činnosti Datascope 2000 (Datascope, San Antonio, TX). Vzorky krvi z artérie sa odoberajú v intervaloch, po pridaní EDTA alebo heparínu na zamedzenie zrážania sa ihneď po odbere ochladia na ľade. Frakcia krvnej plazmy sa oddelí centrifugáciou pri 4 °C a uloží pri -70 °až do okamihu analýzy. Vnútorná telesná teplota sa sleduje rektálnou sondou. Nenapučiavajúci Foleyho katéter sa umiestni do močovej rúry, aby bolo možné sledovať výdaj moču a vylučovanie kreatinínu. Každých 15 minút sa sledujú hemodynamické parametre. Všetky zvieratá dostanú 0,9% chlorid sodný (4 ml/kg) na udržanie i.v. tekutín. Počas fáze B pokusu dostávajú zvieratá ďalšiu tekutinu (10 ml/kg každých 15 minút), ak sú splnené dve z nasledovných fyziologických kritérií: 1) stredný arteriálny tlak klesne o viac ako 30 %; 2) tepová frekvencia sa zvýši o viac ako 30 %; 3) výdaj moču klesne na menej ako 1 ml/kg/hod. Po odbere krvných vzoriek reprezentujúcich základné hodnoty a po najmenej hodinu trvajúcom období pokoja na ekvilibráciu začína infúzia proteínov.
126
Počas fáze A tejto štúdie sa na infúziu rekombinantných proteínov využije cefalická véna, zvieratá sa sledujú osem hodín, potom sa všetky katétre odstránia a zvieratá sa vrátia do svojich klietok na 21 dní. Po 24 a 48 hodinách a 3., 5., 8., 11., 16. a 21. deň sa u zvierat uskutoční ľahká anestézia IM ketamínom (10 mg/kg) a odoberú vzorky žilnej krvi. 21. deň sa uskutoční nová anestézia, podá druhá aplikácia proteínu a celý postup, ako bol vyššie opísaný, sa odo dňa nula opakuje ďalších 21 dní. Po tomto čase sa zvieratá šetrne usmrtia.
Počas fáze B tejto štúdie sa jednu hodinu pred infúziou E. coli náhodne vyberú 4 zvieratá, ktoré dostávajú placebo alebo jeden z vyššie uvedených rekombinantných preparátov. Zvieratá sa sledujú osem hodín, potom sa všetky katétre odstránia, zvieratá sa vrátia do klietok a pozoruje sa prípadné prežívanie letálnej bakterémie. Zvieratá, ktoré nadmerne trpia, sa šetrne usmrtia. Nadmerné utrpenie definuje IACUC takto: 1) neschopnosť stáť alebo sedieť 12 hodín, 2) neschopnosť prijímať potravu alebo vodu 12 hodín, 3) nezvádateľné krvácanie z miest, kde boli katétre alebo 4) neodpovedavosť na vonkajšie podnety. Vzorky žilnej krvi sa odoberajú v časoch -1, 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 24 „hodín, 48 hodín a v dňoch 3,5, 8, 11, 16 a 21. 21. deň sa zvieratá, ktoré do tohto času prežijú, šetrne usmrtia.
Prítomnosť Papio protilátok proti podaným rekombinantným proteínom sa určuje pomocou testu ELISA sandwich.
Stručne opísané, doštičky ELISA sa potiahnu preparátmi sTNFR-Ι(lpg/ml), potom sa pridá riedená (1:50 až 1:100 000, plazma paviánov (100 pL). Po premytí vzoriek sa pridá konjugát chrenovej peroxidázy a proteínu A (0,5 μg/ml), reakcia sa vizualizuje pomocou TMB.
127
Výsledky (Časť I):
Tri rekombinantné preparáty sa významne odlišovali polčasom pretrvania v plazme. Krivky opisujúce vymiznutie sa stanovia metódou nezávislou od modelu, polčasy sa všeobecne hodnotia medzi 8 a 172 hodinami. U zvierat vstupujúcich do pokusu je polčas pretrvania v plazme najdlhší u paviánov, ktoré dostali 4 doménový preparát (29 hod) a postupne klesá u paviánov, ktorým sa podal sTNFR-Ι 3D/C105db (24,7 hod) a sTNFR-I 2,6D/C105db (21,5 hod). Rozdiel, aj keď štatistický významný, je len 26 %. Po druhom podaní proteínov príslušným paviánom majú polčasy pretrvania v plazme neočakávanú tendenciu k výraznému skráteniu, čo naznačuje rýchlejšie vylučovanie. Táto redukcia polčasov je najvýraznejšia u paviánov ovplyvnených sTNFR-Ι 4D/C105db, u ktorých sú polčasy kratšie o 48 % (p<0,01) [obr. 10]. Stredná redukcia polčasov je u paviánov ovplyvnených sTNFR-Ι 3D/C105db (31 %) [obr. ll]a najmenší u zvierat, ktorý sa podal sTNFR-I 2,6D/C105db (14 %) [obr. 12]. U paviánov, ktoré dostali sTNFR-Ι 2,6D/C105db, nie sú redukcie polčasov štatisticky odlišné.
Všetky preparáty sú u paviánov imunogénne. Avšak najvyššia hodnota imunogénnosti sa zistila u paviánov ovplyvnených sTNFR-Ι 4D/C105db, stredná u zvierat ovplyvnených sTNFR-Ι 3D/C105db a najnižšia u zvierat, ktorým sa podal sTNFR-Ι 2,6D/C105db (tab. 8).
128
ΤΑΒ. 8: Vrcholy protilátkovej odpovede
Prv^A Medián 21 dni 25%-75% Druhých 21 dní
Medián 25%-75%
sTNFR-Ι 4D/C105db (n=4) 3,20 3,20 3,20 3, 95 3,50 4, 40
sTNFR-Ι 3D/C105db (n=4) 1, 60 0,00 3, 65 3,50 1,30 4,75
sTNFR-I 2,6D/C105db (n=4) 0, 00* 0,00 1,75 1,40 0,00 3,50
1 logaritmické meradlo (prevrátená hodnota riedenia plazmy potrebná na dosiahnutie polovice maxima absorbancie v teste ELISA sandwich, viď Experimentálne metódy) p=0,056, stanovené podlá Kruskal-Wallis dvojparametrový ANOVA (hodnoty vyjadrené logaritmický neboli použiteľné v normálnom rozložení)
Protilátková odpoveď sa všeobecne rozvíja okolo ôsmeho dňa po podaní rekombinantného preparátu a je prítomná 21 dní. Protilátková odpoveď sa stáva silnejšou po druhej aplikácii rekombinantného proteínu.
Všetky štyri paviány, ktoré dostali sTNFR-Ι 4D/C105db tvoria protilátky, dve zo štyroch zvierat, ktorým sa podal sTNFR-Ι 3D/C105db a jeden zo štyroch paviánov, ktorým sa podal sTNFR-Ι 2,6D/C105db, tvoria protilátky. Veľkosť protilátkovej odpovede (vyjadrená logaritmický) podľa Kruskall Wallis ANOVA sa významne líši medzi troma skupinami ako funkcia času (p<0,05). Post-hoc analýza naznačuje, že významný rozdiel v protilátkovej odpovedi je predovšetkým
129 medzi zvieratami, ktoré dostali sTNFR-Ι 4D/C105db a sTNFR-I 2,6D/C105db so strednými (a nevýznamnými) odpoveďami u zvierat, ktorým sa podal sTNFR-Ι 3D/C105db.
Pozoruje sa korelácia medzi tvorbou protilátok a zmenou vo vylučovaní medzi obidvoma 21-dennými štúdiami (p<0,01).
U zvierat so silnou odpoveďou na prvé podanie rekombinantného preparátu sa podľa očakávania proteín po druhom podaní rýchlejšie vylučuje. Zmena vo vylučovaní po prvej a druhej aplikácii sa porovnáva u zvierat, ktoré vykázali protilátkovú odpoveď (n=7) a ktoré nie (n=5) [obr. 13].
Priamam toxicita na bunkovej línii ME-180 a neutralizačná kapacita v teste L-929 sa hodnotila pri protilátkach nájdených v plazme paviánov pri vybranom počte zvierat. Žiadna toxicita ani neutralizácia pri protilátkach proti trom skúmaným rekombinantným proteínom nebola zistená.
Ako sa dokázalo v priebehu A fázy štúdia paviánov, zvieratá, ktoré rozvíjajú najsilnejšiu protilátkovú odpoveď, vykazujú najrýchlejšie zvýšenie vo vylučovaní rekombinantného preparátu po jeho druhom podaní. Také zistenia naznačujú, že protilátková odpoveď môže skrátiť biologický polčas, a teda aj terapeutickú účinnosť rekombinantného preparátu, a preto sa môže vyžadovať úprava dávky. Nezdá sa však dokázaná akákoľvek nepriaznivá klinická odpoveď na prítomnosť protilátok po druhom podaní rekombinantného preparátu. Terapeutické úsilie zamerané na modifikácie rekombinantného preparátu, ktoré by znížili imunogénnosť a významne neovplyvnili polčas účinnosti, smerujú primárne k obmedzeniu potreby zvýšiť dávku, nie však k zníženiu rizika nepriaznivej klinickej reakcie.
130
Výsledky - časť 1, fáza B:
Na záver možno konštatovať, že všetky tri rekombinantné preparáty sú takmer rovnako účinné pri doteraz nedotknutých zvieratách a zabraňujú poškodeniu spôsobenému cytokinmi počas bakterémie E. coli, ak sa podávajú v dávke 1,0 mg/kg BW. Prežil jeden zo štyroch paviánov, ktoré dostali placebo, ďalej prežili 4 zo 4 paviánov liečených sTNFR-Ι 4D/C105db alebo sTNFR-Ι 3D/C105db a 3 zo 4 paviánov liečených sTNFR-I 2,6D/C105db. Všetky tri rekombinantné preparáty zabraňujú biologickej aktivite TNFa a majú dostatočnú neutralizačnú kapacitu.
Časť II:
Cielom časti II štúdie u paviánov je rozhodnúť, či má opakovaná expozícia zvierat (t.j. 3 oddelené aplikácie) k rôznym sTNFR-Ι proteínom za následok zvýšenú imunogénnosť a znížený polčas. Ďalej má táto štúdia porovnať imunogénnosť a farmakokinetiku niekoľkých sTNFR-Ι preparátov vrátane sTNFR-Ι 4D/C105db a sTNFR-Ι 2,6D/C105db, ďalej sTNFR-I 2, 6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) a sTNFR-Ι 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa). Napokon je táto štúdia zameraná na zhodnotenie klinického významu protilátkovej odpovede a zmeneného vylučovania na následnú odpoveď na poškodenie spôsobené TNFa (E. coli bakterémia).
V dňoch 0, 21 a 42 sa paviánom podajú IV (0,2 mg/kg) rôzne rekombinantné proteíny (sTNFR-Ι 4D/C105db, sTNFR-I 2,6D/C105db, sTNFR-I 2,6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) a sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa). 63. deň dostávajú paviány 2,0 mg/kg BW príslušného proteínu. 65. deň (t.j. o 48 hodín neskoršie) sa paviánom podá letálna dávka E. coli, ako sa opísalo vyššie v časti I. Hlavné poznatky časti II sú nasledovné.
131
Výsledky (časť II):
U nedotknutých paviánov majú sTNFR-Ι 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa) a sTNFR-I 2,6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) všeobecne dlhšie polčasy ako sTNFR-Ι 4D/C105db a sTNFR-Ι 2,6D/C105db bez ohľadu na počet domén. Dĺžka polčasu je v rozmedzí 30 až 35 hodín pri monopegylovaných formách sTNFR-Ι na rozdiel od 10 až 20 hodín pri dimérnych pegylovaných formách. Navyše majú sTNFR-Ι 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa) a sTNFR-Ι 4D/C105db dlhšie polčasy ako sTNFR-I 2,6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) a sTNFR-I 2,6D/C105db.
sTNFR-Ι 4D/C105db a sTNFR-Ι 2,6D/C105db sú tiež imunogénne, s miernym trendom k nižšej imunogénnosti u sTNFR-I 2,6D/C105db. Avšak len sTNFR-Ι 4D/C105db sa menej vylučuje po opakovanom podávaní. sTNFR-Ι 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa) a sTNFR-I 2,6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) nie sú ani antigénne, ani sa nemení významne ich rýchlosť vylučovania po opakovanom podávaní.
In vitro imunoreaktivita (ELISA sandwich capture) k iným rekombinantným proteínom v sére odobranom každému paviánovi (N=3) 21., 42. a 61. deň sa stanoví pomocou odlišného rekombinantného proteínu použitého ako záchytný (capture) antigén. Napríklad sérum z paviánov, ktorým sa podal sTNFR-I 2,6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) 21. deň (tab. 9) „nereaguje s sTNFR-Ι 4D/C105db ani s sTNFR-Ι 4D/N105 použitými ako záchytné (capture) antigény na doštičke ELISA.
Za pozitívnu sa pokladá protilátková odpoveď s titrom >1:400. Údaje zo 42. a 61. dňa sú zhrnuté v tab. 10 a 11. Za dôležitý sa považuje fakt, že sérum z 1 paviána, ktorému sa podal sTNFR-I 2,6D/N105-t-BuPEG(33 kDa), dávalo pozitívnu in vitro reakciu pri testovaní s sTNFR-Ι 4D/C105db záchytným (capture) antigénom (tab. 11).
132
Za pozitívnu sa pokladá protilátková odpoveď s titrom >1:400. Údaje zo 42. a 61. dňa sú zhrnuté v tab. 10 a 11. Za dôležitý sa považuje fakt, že sérum z 1 paviána, ktorému sa podal sTNFR-I 2,6D/N105-t-BuPEG(33 kDa), dávalo pozitívnu in vitro reakciu pri testovaní s sTNFR-Ι 4D/C105db záchytným (capture) antigénom.
Podľa účinnosti prevencie poškodenia spôsobeného TNFa u paviánov, ktorým sa trikrát podal rekombinantný preparát, možno zoradiť proteíny počínajúc najúčinnejším takto: (1) sTNFR-Ι 4D/C105db, (2) sTNFR-I 2,6D/C105db, (3) sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa) a (4) sTNFR-I 2,6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) (stanovené na základe prežívania, systémového zlyhania orgánov (MSOF), IL-6 a bielych krviniek (WBC) v sére. Nedostatkom tejto štúdie je fakt, že nebrala do úvahy rozdiely v schopnosti rôznych rekombinantných proteínov neutralizovať TNF.
>
o c
'(0 •H (0
Qi (0
ΟΪ y
Imunitná
CM *c
Φ
Q
T)
Φ
P
H +J
O
O sp t-H
ΛΙ
sTNFR-I 4D/N105 3/3 neg 3/3 neg 3/3 neg 3/3 neg
sTNFR-I 4D/C105db 3/3 neg 3/3 neg 3/3 neg 1/3 reag. (400)
sTNFR-I 4D/C105-tBuPEG (33kDa)
STNFR-I 4D/N105-tBuPEG (33kDa) 3/3 neg
sTNFR-I 2.6D/N105-t— BuPEG (33kDa) 3/3 neg
sTNFR-I 2.6D/C105db 3/3 neg
Počet zvierat ; n=3 sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) sTNFR-I 2.6D/C105db sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33kDa, sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG (33kDa) sTNFR-Ι 4D/C105db
nn
Tabuľka 10
Imunitná reakcia paviánov
CM >G
0)
Q
M
Φ
4->
rd +J o
O
O*
ΛΙ
Ľ>
D
H
•
tp θ' θ' tP
M tf) o> G) 0) (0 —
1 o G G C dl o
o5 τη P o
04 z n n n 00
5S \ \ m
H Q n M n
n ό1 CM
b θ' θ' θ' CP _
b d) (U o OJ n
h m I o c G G
05 rH <*> CO CO »-» eq
ti υ v. \ \ σι 3
z > n CO CO
Eh Q CM
01 M*
(0
Q
1
p n
1 ro
n m
I o
Bi H U
tu U M
Z \ 04
EH Q 0
«] sr OQ
n)
Q θ'
1 X. dl
p n G
i n
nm*-* CO
1 o x.
05 H O n
tu z ω
Z \ Cú
Eh Q 3
tn ’T ta
1 Π3
P Q
I tr
m n <P
o n c
H H
1 z co
cd \ O \
tu Q U co
Z tO 04
Eh · 3
« ci (Q
b
b •
m tP —
o S O
M rH S O
i υ ςθ
05 \
tu Q co CL
Z tO \
e-< · rH
01 CM
o b
w b
04 U u m
a 3 U 03 o
P 03 04 04 r4
m 1 3 3 o
P P b OQ OQ
ω 1 b 1 1 Q
m m P P
> o o I 1
N H H — H i—1 h m nm — H
1 Z <0 1 O i o to 1 O (0 1
P 05 \ Q o5 \ 05 I-H Q (ť H O 05
v 04 Q 04 Q 04 Z * 04 υ λ: 04
>U CO Z to m Z to Z n Z 'χ n Z
0 II EH Π Eh · H Q n Eh Q σι Eh
CM G 01 CM — 01 CM W W M* *-* 01
Tabuíka 11 >
o
C
'«J •H iH <X>
> (0 >c 0)
a Q
iti Tí
H <D
υ P
λ: H
<a P
oj
M O
O
'«e sr
c t~1
+J
•H ÚL
C
0
ε H u Ο» H
sTNFR-I 4D/N105 3/3 neg 1/3 reag. (3200) 1/3 reag. (6400) 3/3 reag. (12800)
STNFR-I 4D/C105db 1/3 reag. (1600) 1/3 reag. (1600) 1/3 reag. (6400, 1/3 reag. (6400)
STNFR-I 4D/C105-tBuPEG (33kDa)
STNFR-I 4D/N105-tBuPEG (33kDa) 3/3 neg
sTNFR-I 2.6D/N105-tBuPEG (33kDa) 3/3 neg
sTNFR-I 2.6D/C105db 2/3 reag. (204800)
Počet zvierat n=3 sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) sTNFR-I 2.6D/C105db sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33kDa) sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG (33kDa) sTNFR-Ι 4D/C105db
!n «Ό
136
C. Šimpanz
Cielom tejto štúdie je stanoviť imunogénnosť rôznych foriem sTNFR-Ι, ktoré sa opakovane injikujú I.V. cestou šimpanzom v priebehu 1 mesiaca. Testujú sa nasledovné formy sTNFR-Ι: sTNFR-Ι 2,6D/C105db, sTNFR-Ι 4D/C105db, sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33 kDa), sTNFR-I 2,6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) a sTNFR-Ι 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa). V jednej pokusnej skupine sú celkom tri šimpanzy.
Dávkovací režim a parametre tejto štúdie sú nasledovné: Každý šimpanz dostáva pokusnú vzorku v podobe intravenóznej injekcie (0,1 mg/kg) dvakrát týždenne v pondelok a v piatok štyri týždne (celkom 8 dávok). Objem dávky sa mení v závislosti od koncentrácie podávanej vzorky. 5 ml séra sa odoberie každému zvieraťu v deň 0 pred začiatkom pokusu. Ďalšie vzorky séra sa odoberajú tesne pred podaním preparátu 7., 14., 21. a 28. deň.
Základné údaje o imunogénnosti u šimpanza sú uvedené v tab. 12.
Do 28. dňa sa pri všetkých zvieratách (N=3), ktorým sa podával sTNFR-Ι 4D/C105db alebo sTNFR-Ι 2,6D/C105db, zaznamená pozitívna reakcia (stanovené testom ELISA), najvyššie namerane titre sú 1:12 800 a 1:3200 (tab. 12). (Poznámka:
V tejto časti pokusu sa všetky „imunizačné antigény použijú ako príslušné záchytné (capture) antigémy imobilizované na doštičke ELISA). Jedno zviera imunizované sTNFR-Ι 4D/N105-tBuPEG(33 kDa) má pozitívnu protilátkovú reakciu 21. a 28. deň (tab. 12). Je dôležité, že u žiadnych zvierat imunizovaných počas tohto pokusu sTNFR-Ι 4D/C105-t-BuPEG(33 kDa) alebo sTNFR-I 2,6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) sa nepozorovala tvorba anti-sTNFR-I protilátok (tab. 12).
Sérum odobrané 28. deň všetkým šimpanzom (N=3) imunizovaným rôznymi formami sTNFR sa testuje na in vitro imuno137 reaktivitu proti iným rekombinantným proteínom sTNFR-I použitým ako záchytné (capture) antigény v teste ELISA, ako sa opísalo vyššie v pokusoch s paviánmi. Pozitívnou reakciou je protilátková odpoveď s titrom vyšším ako 1:400. Je významné, že sérum zo šimpanzov, ktorým sa podával sTNFR-I 2,6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) „nereaguje s sTNFR-Ι 4D/C105db ani s sTNFR-Ι 4D/N105, ak sa tieto proteíny použijú ako záchytné (capture) antigény na doštičke ELISA (tab. 13). To isté sa sleduje pri zvieratách imunizovaných sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33 kDa)a podáva sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa) (tab. 13).
Titer (počet šimpanzov)
Deň 28 (8 dávok) 800 (1) 3200 (2) 800 (2) 12800 (1) 100 (1) ♦ 400 (1)
Deň 21 (6 dávok) 400 (1) 1600 (1) 3200(1) 400 (1) 1600 (1) 200 (1) * 1600 (1)
Deň 14 (4 dávky) 100 (1) 3200 (1)
Deň 7 (2 dávky)
Deň 0 (Pre-dávka)
sTNFR-I 2.6D/C106db sTNFR-I 4D/C105db STNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33kDa) sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) sTNFR-I 4D/N105db-t-BuPEG (33kDa)
•m ω
>
o
XI
N :<0 >
O fO
X!
Ό m
o t—I u
Q
M’
H m
g
Ή
P
H >N □
O
Q.
'>1
C
Π3 >
O
M
O > n λ; O P Q, x<0 i—I
M ·Η Q, P P O •H M E-t Qi ·· c
N
O
CL.
* co
ŕ)
Tabuľka 13
Imunitné výsledky šimpanzov IgG (> 1:400 titer)
STNFR-I 4D/N105 3/3 neg 1/3 reag. (400) 2/3 reag. (3200) 3/3 neg 3/3 reag. (6400)
sTNFR-I 4D/C105db 3/3 neg 2/3 reag. (3200) 2/3 reag. (1600) 1/3 reag. (400) 3/3 reag. (12800)
sTNFR-I 4D/C105-tBuPEG (33kDa) 3/3 neg
sTNFR-I 4D/N105-tBuPEG (33kDa) 3/3 neg
sTNFR-I 2.6D/N105-tBuPEG (33kDa) 3/3 neg
sTNFR-I 2.6D/C105db 3/3 reag. (3200)
Počet zvierat·’ n=3 sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) sTNFR-I 2.6D/C105db sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33kDa) sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG (33kDa) sTNFR-Ι 4D/C105db
140
Príklad IV
EAE je akútna alebo chronická recidivujúca zápalová demyelinizujúca choroba CNS, ktorá vzniká ako dôsledok pôsobenia neuroantigénov, ako je napríklad myelínový bázický protein (MBP), na geneticky citlivé zvieratá. EAE predstavuje uznávaný a často používaný model akútnej ľudskej MS.
Samice potkana Lewis (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) sa v anestézii imunizujú na chodidle ľavej zadnej končatiny (deň 0) 0,1 ml emulzie obsahujúcej myelínový bázický protein (MBP) v kompletnom Freundovom adjuvans rozpustený v PBS s rovnakým objemom kompletného Freundovho adjuvans (CFA) obsahujúceho 5 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco Lab MI). Kontrolným potkanom sa podá 0,1 ml emulzie PBS/CFA bez MBP do chodidla ľavej zadnej končatiny.
Klinické hodnotenie choroby je založené na obvyklom bodovacom systéme 0 až 5. Nasledovné stavy sa priraďujú jednotlivým hodnotám: 0, normálny; 0,5, čiastočná strata chvostového tonusu; 1, úplná strata chvostového tonusu; 2, vláčenie jednej zadnej končatiny; 3, paralýza obidvoch zadných končatín; 4, umieranie; 5, smrť. Injekcie rekombinantných preparátov sTNFR-Ι alebo slepej vzorky sa podávajú S.C. v dávke 1 mg/kg každý ďalší deň počínajúc dňom 9 po imunizáčii. Pokus sa ukončí pri všetkých zvieratách 21. deň. Výsledky sú vyjadrené v dvoch podobách, jednak ako skóre klinickej závažnosti v priebehu času a jednak sa integrované skóre každého potkana v celom priebehu choroby spočíta ako plocha vymedzená krivkou závislosti denného klinického skóre od času. Hodnoty integrovaného klinického skóre liečených skupín sa porovnajú s hodnotami kontrolnej skupiny pomocou Mannovho-Whitneyho testu.
Zvieratá, ktorý sa podala slepá vzorka, prejavujú začiatok ochorenia okolo desiateho dňa, choroba vrcholila 16. deň a potom ustupovala. sTNFR-Ι 4D/C106db zmierňuje
141 klinické príznaky o približne 73 % v porovnaní so zvieratami liečenými slepou vzorkou. sTNFR-Ι 4D/C105-t-BuPEG(33 kDa) taktiež zmierňuje klinické príznaky o približne 85 %. sTNFRI 4D/C105-t-BuPEG(33 kDa) a sTNFR-I 2, 6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) sú rovnako účinné v zmierňovaní klinických príznakov (64 a 57 %) .
Dá sa uzavrieť, že skrátené formy sTNFR sa zdajú klinicky účinné v tomto zvieracom modeli MS.
Tento vynález bol opísaný vyššie všeobecne aj v podobe doporučených konkrétnych postupov a pokusov. Je však jasné, že odborníci môžu navrhnúť na základe tohto opisu ďalšie variácie a modifikácie.
' - GATAGTGTGTGTCCCCAAGGAAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGATTTGCTGTACC
+.........+......--- +.........+.........+.........+.........
DSVCPQGKYIHPQNNSICCT
-AAGTGCCACAAAGGAACCTACTTGTACAATGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGATACGGAC
+.........+.........+.........+.........+.........+.........
KCHKGTYLYNDCPGPGQDTD
-TGCAGGGAGTGTGAGAGCGGCTCCTTCACCGCTTCAGAAAACCACCTCAGACACTGCCTC
CRECESGSFTASENHLRHCL
-AGCTGCTCCAAATGCCGAAAGGAAATGGGTCAGGTGGAGATCTCTTCTTGCACAGTGGAC
+.........+.........+.........+.........+.........+.........
SCSKCRKEMGQVEISSCTV D
-CGGGACACCGTGTGTGGCTGCAGGAAGAACCAGTACCGGCATTATTGGAGTGAAAACCTT
+.........+.........+.........+.........+.........+.........
RDTVCGCRKNQYRHYWSENL
-TTCCAGTGCTTCAATTGCAGCCTCTGCCTCAATGGGACCGTGCACCTCTCCTGCCAGGAG
+.........+.........+.........+.........+.........+.........
FQCFNCSLCLNGTVHLSC Q E
-AAACAGAACACCGTGTGCACCTGCCATGCAGGTTTCTTTCTAAGAGAAAACGAGTGTGTC
+.........+.........+.........+.........+ - - - -.....+.........
KQNTVCTCHAGFFLRENECV
-TCCTGTAGTAACTGTAAGAAAAGCCTGGAGTGCACGAAGTTGTGCCTACCCCAGATTGAG
+.........+.........+.........+.................... . - -......
scsnckkslectklclpqie
-AAT-31
Obr. 1
5' -CATATGGACAGCGTTTGCCCCCAAGGAAAATACATCCACCCTCAAAATAATTCGATTTGC + - - ----. - - + - - - - - -- -- + -- - - - - .-- + -.-. --. -- + MDSVCPQGKYIHPQNNSIC •TGTACCAAGTGCCACAAAGGAACCTACTTGTACAATGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGAT
+.........+.........+.........+...................+.........
CTKCH-K.GTY LYNDC P G P G Q D
ACGGACTGCAGGGAGTGTGAGAGCGGCTCCTTCACCGCTTCAGAAAACCACCTCAGACAC
+.........+.........+.........+.........+...................
TDCRECESG SFTASENHLRH
-TGCCTCAGCTGCTCCAAATGCCGAAAGGAAATGGGTCAGGTGGAGATCTCTTCTTGCACA
+.........+.........+.......................................
CLSCSKCRKEMGQVEISSCT
-GTGGACCGGGACACCGTGTGTGGCTGCAGGAAGAACCAGTACCGGCATTATTGGAGTGAA
+.........+.........+.........+.........+.........+.........
VDRDTVCGCRKNQYRKYWSE • AACCTTTTCCAGTGCTTCTGCTGATAGGATCC - 3 ' ’
+.........+.........+.........+.........+.........+.........
NLFQCFC*
Obr. 2
5'-CATATGGACA GCGTTTGCCCCCAAGGAAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGATTTGC
+.........+ - -.......+---------+.........+.........+.........
MDSVCPQGKYIHPQNNSIC - TGTACCAAGTGCCACAAAGGAACCTACTTGTACAATGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGAT +.........+.........+.........+.........+.........+.........
CTKCHKGTYLYNDCPGPGQD - ACGGACTGCAGGGAGTGTGAGAGCGGCTCCTTCACCGCTTCAGAAAACCACCTCAGACAC
+.........+.........+.........+.........+...................
tdcrecesgsftasenhlrh - tgcctcagctgctccaaatgccgaaaggaaatgggtcaggtggagatctcttcttgc ac a ·
+.........+.........+.........+.........+.........*.........
CLSCSKCRKEMGQVEISSCT ·
- GTGGACCGGGACACCGTGTGTGGCTGCAGGAAGAACCAGTACCGGC ATTATTGGAGTGAA +.......-- +.........+.........+.........+.........+.........
VDRDTVCGCRKNQYRHYWSE - AACCTTTTCCAGTGCTTCAATTGCTCTCTGTAAAAGCTT - 3 '
+.........+.........+.........+.........+...................
NLFQCFNCSL*
Obr. 3
5' -CATATGGACAGCGTTTGCCCCCAAGGAAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGATTTGC
+.........+.........+.........+...................+.........
MDSVCPQGKYIHPQNNS IC
-TGTACCAAGTGCCACAAAGGAACCTACTTGTACAATGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGAT
+.........+.........+.........+.........+.........+.........
CTKCHK GTYLYNDCPGPGQD
- ACGGACTGCAGGGAGTGTGAGAGCGGCTCCTTCACCGCTTCAGAAAACCACCTCAGACAC
+.........+.........+.........+.........+.........+.........
TDCRECESGSFTASENHLRH
-TGCCTCAGCTGCTCCAAATGCCGAAAGGAAATGGGTCAGGTGGAGATCTCTTCTTGCACA t·.........+.........+.........+...................+.........
CLSCSKCRKEMGQVEISSCT
-GTGGACCGGGACACCGTGTGTGGTTGCAGGAAGAACCAGTACCGGCATTATTGGAGTGAA
+.........+.........+...........................-........
VDRDTVCGCRKNQYRHYWSE
-AACCTTTTCCAGTGCTTCAATTAATAGGGATCC- 3'
+.........+.........+.........+.........+.........+.........
NLFQCFN*
Obr. 4 ' -CATATGTATATCCACCCTCAAAATAATTCGATTTGCTGTACCAAGTGCCACAAAGGAACC +.........+.........+...................+.........+.........
MYXHPQNNSICCTKCHKGT •TACTTGTACAATGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGATACGGACTGCAGGGAGTGTGAGAGC
+.........+.........+.......- . ..........+.........+.........
YLYNDČPGPGQDTDCRECES
-GGCTCCTTCACCGCTTCAGAAAACCACCTCAGACACTGCCTCAGCTGCTCCAAATGCCGA
+.........+.........+...................+.........+.........
GSFTASENHLRHCLSCSKCR
AAGGAAATGGGTCAGGTGGAGATCTCTTCTTGCACAGTGGACCGGGACACCGTGTGTGGC j-...................+...................ť-.........+.........
K E M G Q V E I S S C T V D R D T V C G
-TGCAGGAAGAACCAGTACCGGCATTATTGGAGTGAAAACCTTTTCCAGTGCTTCAATTGC
..........+.........+.........+.........+.........+.........
CRKNQYRHYWSENLFQCFNC
-TCTCTGTAAAAGCTT-3'
+.........+..................+........... ......... ...........
S L *
Obr. 5
5' -CATATGTGTACCAAGTGCCACAAAGGAACCTACTTGTACAATGACTGTCCAGGCCCGGGG + --....... + ......... + ...--.... +.........+........_ +
MCTKCHKGTYLYNDCPGPG
-CAGGATACGGACTGCAGGGAGTGTGAGAGCGGCTCCTTCACCGCTTCAGAAAACCACCTC
+.........+.........+.........+.........+.......-- +.........
QDTDC R-ECESGSFTASENHL
- AGACACTGCCTCAGCTGCTCCAAATGCCGAAAGGAAATGGGTCAGGTGGAGATCTCTTCT
+.........+.........+.........+.........+.........+.........
RHCLSCSKCRKEMGQVEI SS •TGCACAGTGGACCGGGACACCGTGTGTGGCTGCAGGAAGAACCAGTACCGGCATTATTGG
+.........+.........+.........+.........+.......... .........
CTVDRDTVCGCP.KNQYRHYW
- AGTGAAAACCTTTTCCAGTGCTTCAATTGCTCTCTGTAAAAGCTT- 3 1
+.........+.........+.........+.........+.........+.........
S ENLFQCFNCSL*
Obr. 6
5' -CATATGTCGATTAGCTGTACCAAGTGCCACAAAGGAACCTACTTGTACAATGACTGTCCA
+.........+.........+.........+.........+.........+.........
MSISCTKCHKGTYLYNDCP
-GGCCCGGGGCAGGATACGGACTGCAGGGAGTGTGAGAGCGGCTCCTTCACCGCTTCAGAA
+.........+..........+.........+.........+.........+.........
GPGQDTDCRECESGSFTASE
- AACCACCTCAGACACTGCCTCAGCTGCTCCAAATGCCGAAAGGAAATGGGTCAGGTGGAG
+.........+.........+.........+.........+.........+.........
NHLRHCLSCSKCRKEMGQVE
-ATCTCTTCTTGCACAGTGGACCGGGACACCGTGTGTGGCTGCAGGAAGAACCAGTACCGG
+.........+.........+.........+.........+.........+.........
I SSCTVDRDTVCGCRKNQYR
-CATTATTGGAGTGAAAACCTTTTCCAGTGCTTCAATTGCTCTCTGTAAAAGCTT· 3'
+.........+.........+.........+...................+.........
HYWSENLFQCFNCSL*.
Obr. 7
5'-TTGCCCGCCCAGGTGGCATTTACACCCTACGCCCCGGAGCCCGGGAGCACATGCCGGCTC+---------+---------+---------+---------+---------+--------LPAQVAFTPYAPEPGSTCRL-AGAGAATACTATGACCAGACAGCTCAGATGTGCTGCAGCAAGTGCTCGCCGGGCCAACAT+---------+---------+---------+---------+---------+--------REYYDQTAQMCCSKCSPGQH-GCAAAAGTCTTCTGTACCAAGACCTCGGACACCGTGTGTGACTCCTGTGAGGACAGCACA+---------+---------+---------+---------+---------+--------AKVFCTKTS DTVCDSCEDST-TACACCCAGCTCTGGAACTGGGTTCCCGAGTGCTTGAGCTGTGGCTCCCGCTGTAGCTCT+---------+---------+---------+---------+---------+--------YTQLWNWVP ECLSCGSRCSS-GACCAGGTGGAAACTCAAGCCTGCACTCGGGAACAGAACCGCATCTGCACCTGCAGGCCC+---------+---------+---------+---------+---------+--------DQVETQACT REQNRICT-CRP-
-GGCTGGTACTGCGCGCTGAGCAAGCAGGAGGGGTGCCGGCTGTGCGCGCCGCTGCGCAAG+---------+---------+---------+---------+---------+--------GWYCALSKQ EGCRLCAPLRK-TGCCGCCCGGGCTTCGGCGTGGCCAGACCAGGAACTGAAACATCAGACGTGGTGTGCAAG+ — — ——————4·———————— crpgfgvar pgtetsdvvck-CCCTGTGCCCCGGGGACGTTCTCCAACACGACTTCATCCACGGATATTTGCAGGCCCCAC+---------+---------+---------+---------+---------+--------P C A ľP G T F S N TTSSTDICRPH-CAGATCTUÍAACGTGGTGGCCaiCCCTGGEAATGCAAGCAGGGATGCAGTCTGCACGICC
QICNVV AI P GNASRDAVCTS-ACGTCCCCCACCCGGAGTATGGCCCCAGGGGCAGTACACTTACČCCAGCCAGTGTCCACA
H--------I-------4—- t----4--------T S P T S S M A .P GAVä.lP Q P V S T -CGATCCCAACACACGCAGCCAACTCCAGAACCCAGCACTGCTCCAAGCACCTCCTTCCTG . +-----1-—----4—— 4.—. | , ----R S -Q H T Q P. T '.P ...E. P -S T Ä .P S T S T 'X —
-CTCCC AATGGGCCCCAGCCCCCCAGCTG AAGGGAGC ACTGGCGAC - 3' —+---------+---------+---- -----+-------—
LPMGPSPPAEGSTGD*
Oh r· ft siinr onv o
M
O
O •
o o
o o
o
M o
o o
Λ
O
O o
O) o
o o
o o
TREATMENT
= p < 02 by ANOVA from DIseqso Control · ...
—·— Dose 1 —O— Dose 2
Plasma Conccntration (ng/mL)
Obr.10
Dose 1 Dose 2
Plasma Concenlralion (ng/mL)
Obr.11 · Dosc 1 —O— Dosc 2
Plasma Concentralion (ng/mL)
Time (hr)
Obr.12 ίο η
2Í e
n
U □
O
β □
O o
Q o
Q
O
O 2.60(4- vc) • 2.60 («, J.OD(-vr) □ 3.0D(+vc)
O 4.00 (4-vc)
4-r
Dose
Obr.13
Zoznam sekvencií <110> Amgen Inc.
<120> Skrátené rozpustné receptory faktora nekrotizujúceho tumory typu I a typu II <13.0> - A415Erev <140> PCT/US 97/12244 <141> 1997-07-09 <150> US 60/021,443 <151> 1996-07-09 <150> US 60/032,534 <151> 1996-12-06 <150> US 60/037,737 <151> 1997-01-23 <150> US 60/039,314 <151> 1997-02-07 <150> US 60/039,792 <151> 1997-03-04 <160> 81 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 483 <212> DNA <213> Rekombinantná ľudská ** <220>
<221> CDS
<222> (1) . . (483)
<400> 1
gat agt gtg tgt ccc caa gga aaa tat atc cac CC t caa aat aat tcg
Asp Ser Val Cys Pro Gin Gly Lys Tyr íle His Pro Gin Asn Asn Ser
1 5 10 15
att tgc tgt acc aag tgc cac aaa gga acc tac ttg tac aat gac tgt
íle Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys
20 25 30
cca ggc ccg ggg cag gat acg gac tgc agg gag tgt gag age ggc tcc
Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser
35 40 45
144 ttc acc get tca gaa aac cac ctc aga cac tgc ctc age tgc tcc aaa 192 Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys
55 60
tgc ega Cys Arg 65 aag Lys gaa atg ggt cag gtg gag atc tet tet tgc aca gtg gac 240
Glu Met Gly 70 Gin Val Glu íle Ser 75 Ser Cys Thr Val Asp 80
cgg gac acc gtg tgt. ggc tgc agg aag aac cag tac cgg cat tat tgg 288
Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gin Tyr Arg His Tyr Trp
85 90 95
agt gaa aac ctt ttc cag tgc ttc aat tgc age ctc tgc ctc aat ggg 336
Ser Glu Asn Leu Phé Gin Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly
100 105 110
acc gtg cac ctc tcc tgc cag gag aaa cag aac acc gtg tgc acc tgc 384
Thr Val His Leu Ser Cys Gin Glu Lys Gin Asn Thr Val Cys Thr Cys
115 120 125
cat gca ggt ttc ttt c ta aga gaa aac gag tgt gtc tcc tgt agt aac 432
His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn
130 135 140
tgt aag aaa age ctg gag tgc acg aag ttg tgc cta ccc cag att gag 480
Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gin íle Glu
145 150 155 160
aat 483
Asn <210> 2 <211> 161 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský· <400> 2
Asp 1 Ser Vaľ Cys Pro 5 Gin Gly Lys Tyr íle 10 His Pro Gin Asn Asn 15 Ser
íle Cys Cys Thr 20 Lys Cys His Lys Gly 25 Thr Tyr Leu Tyr Asn 30 Asp Cys
Pro Gly Pro 35 Gly Gin Asp Thr Asp 40 Cys Arg Glu Cys Glu 45 Ser Gly Ser
Phe Thr 50 Ala Ser Glu Asn His 55 Leu Arg His Cys Leu Ser 60 Cys Ser Lys
Cys 65 Arg Lys Glu Met Gly Gin 70 Val Glu íle Ser 75 Ser Cys Thr Val Asp 80
Arg Asp Thr Val Cys 85 Gly Cys Arg Lys Asn 90 Gin Tyr Arg His Tyr 95 Trp
Ser Glu Asn Leu 100 Phe Gin Cys Phe Asn 105 Cys Ser Leu Cys Leu 110 Asn Gly
Thr Val His 115 Leu Ser Cys Gin Glu 120 Lys Gin Asn Thr Val 125 Cys Thr Cys
His Ala 130 Gly Phe Phe Leu Arg 135 Glu Asn Glu Cys Val 140 Ser Cys Ser Asn
Cys 145 Lys Lys Ser Leu Glu 150 Cys Thr Lys Leu Cys 155 Leu Pro Gin íle Glu 160
Asn
<210> 3 <211> 332 <212> DNA <213> Rekombinantná ľudská·
<220>
<221> CDS
<222> (4)..(324)
<400> 3
cat atg gac agc gtt tgc ccc caa gga aaa tac atc cac cct caa aat 48
Met Asp Ser Val Cys Pro Gin Gly Lys Tyr íle His Pro Gin Asn
15 10 15
aat tcg att tgc tgt acc aag tgc cac aaa gga acc tac ttg tac aat 96
Asn Ser íle Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn
20 25 30
gac tgt cca ggc ccg ggg cag gat acg gac tgc agg gag tgt gag agc 144
Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser
35 40 45 á—
ggc tcc ttc acc get tca gaa aac cac ctc aga cac tgc ctc agc tgc 192
Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys
50 55 60
tcc aaa tgc ega aag gaa atg ggt cag gtg gag atc tet tet tgc aca 240
Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gin Val Glu íle Ser Ser Cys Thr
65 70 75
gtg gac cgg gac acc gtg tgt ggc tgc agg aag aac cag tac cgg cat 288
Val Asp Arg Aso Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gin Tyr Arg His
80 85 90 95
tat tgg agt gaa aac ctt ttc cag tgc ttc tgc tga taggatcc. 332
Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gin Cys Phe Cys
100 105 <210> 4 <211> 106· <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 4
Met Asp Ser 1 Val Cys 5 Pro Gin Gly Lys Týr 10 íle His Pro Gin Asn 15 Asn
Ser íle Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp
20 25 30
Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly
35 40 45
Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser
50 55 60
Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gin Val Glu íle Ser Ser Cys Thr Val
65 70 75 80
Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gin Tyr Arg His Tyr
85 90 95
Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gin Cys Phe Cys
100 105
<210> 5 <211> 339 <212> DNA <213> Rekombinantná ľudská <220>
<221> CDS <222> (4)..(333) <400> 5 cat atg gac agc gtt tgc ccc caa gga aaa tat atc cac cct caa aat 48
Met Asp Ser Val Cys Pro Gin Gly Lys Tyr íle His Pro Gin Asn
5 10 15 aat tcg att tgc tgt acc aag tgc cac aaa gga acc tac ttg tac aat 96
Asn Ser íle Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn
25 30 gac tgt cca ggc ccg ggg cag gat acg gac tgc agg gag tgt gag agc 144
Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser
40 45 ggc tcc ttc acc get tca gaa aac cac ctc aga cac tgc ctc agc tgc 192
Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys
55 60 tcc aaa tgc ega aag gaa atg ggt cag gtg gag atc tet tet tgc aca 240
Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gin Val Glu íle Ser Ser Cys Thr
70 75 gtg gac cgg gac acc gtg tgt ggc tgc agg aag aac cag tac cgg cat 288
Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gin Tyr Arg His
85 90 95 taĽ tgg agt gaa aac ctt ttc cag tgc Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gin Cys 100 ttc aat tgc tct ctg taa Phe Asn Cys Ser Leu 105 110
333 aagctt <
339 <210> 6 <211> 109 <212> PRT <213> Rekombinantný ludský <400> 6
Met Asp Ser Val Cys Pro Gin Gly Lys Tyr íle His Pro Gin Asn Asn
1 5 10 15
Ser íle Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp
20 25 30
Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly
35 40 45
Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser
50 55 60
Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gin Val Glu íle Ser Ser Cys Thr Val
65 70 75 80
Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gin Tyr Arg His Tyr
85 90 95
Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gin Cys Phe Asn Cys Ser Leu
100 105
<210> 7 <211> 333 <212> DNA <213> Rekonbinantná ľudská <220>
<221> CDS <222> (4)..(324) <400> 7
cat atg gac agc gtt tgc ccc caa gga aaa tat atc cac cct caa aat 48
Met Asp Ser Val Cys Pro Gin Gly Lys Tyr íle His Pro Gin Asn
1 5 10 15
aat tcg att tgc tgt acc aag tgc cac aaa gga acc tac ttg tac aat 96
Asn Ser íle Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn
20 • 25 30
gac tgt cca ggc ccg ggg cag gat acg gac tgc agg gag tgt gag agc 144
Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser
35 40 45
ggc tcc ttc acc get tca gaa aac cac ctc aga cac tgc ctc agc tgc 192
Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn' His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys
50 55 60
tcc aaa tgc ega aag gaa atg ggt cag gtg gag atc tet tet tgc aca Ser Cys Thr 240
Ser Lys Cys 65 Arg Lys Glu Met 70 Gly Gin Val Glu íle 75 Ser
gtg gac cgg gac acc gtg tgt ggt tgc ágg aag aac cag tac cgg cat 288
Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gin Tyr Arg His '
80 85 90 95
tat tgg agt gaa aac ctt ttc cag tgc ttc aat taa tagggatcc 333
Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gin Cys Phe Asn
100 105
<210> 8 <211> 106 <212> PRT <213> Rekombinantná ľudská <400> 8
Met Asp Ser Val Cys Pro Gin Gly Lys Tyr íle His Pro Gin Asn Asn
1 5 10 15
Ser íle Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp
20 25 30
Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly
35 40 45
Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser
50 55 60
Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gin Val Glu íle Ser Ser Cys Thr Val
65 70 75 ‘80
Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gin Tyr Arg His Tyr
85 90 95
Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gin Cys Phe Asn
100 105
<210> 9 <211> 285 <212> DŇA <213> Rekombinantná ľudská <220>
<221> CDS <222> (4)..(279) <400> 9 cat atg tgt acc aag tgc cac aaa gga acc tac ttg tac aat gac tgt 48
Met Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys
10 15 cca ggc ccg ggg cag gat acg gac tgc agg gag tgt gag agc ggc tcc 96
Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser
25 30
144
ttc acc get tca gaa aac cac ctc aga cac tgc ctc age tgc tcc aaa
Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser • Lys
35 40 45
tgc ega aag gaa ätg ggt cag gtg gag atc tet tet tgc aca gtg gac
Cys Arg Lys Glu Met- Gly Gin Val Glu íle Ser Ser Cys Thr Val Asp
50 55 60
cgg gac acc gtg tgt ggc tgc agg aag aac cag tac cgg cat tat tgg
Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gin Tyr Arg His Tyr Trp
65 70 75
agt gaa aac ctt ttc cag tgc ttc aat tgc tet ctg taa aagctt
Ser Glu Asn Leu Phe Gin Cys Phe Asn Cys Ser Leu
80 85 90
285
192
240 <210> 10 <211> '91 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> ίο
Met Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro
1 5 10 15
Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe
20 25 30
Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys
35 40 45
Arg Lys Glu Met Gly Gin Val Glu íle Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg
50 55 60
Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gin Tyr Arg His Tyr Trp Ser
65 70 75 80
Glu Asn Leu Phe Gin Cys Phe Asn Cys Ser Leu
85 90
<210> 11 <211> 315 <212> DNA <213> Rekombinantná ľudská <220> <221> CDS <222> (4).
.(309) <400> 11
cat atg tat atc cac cct caa aat aat tcg att tgc tgt acc aag tgc
Met Tyr íle His Pro Gin Asn Asn Ser íle Cys Cys Thr Lys Cys
1 5 10 15
cac aaa gga acc tac ttg tac aat gac tgt cca ggc ccg ggg cag gat
His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp
20 25 30
acg Thr gac tgc agg gag tgt gag agc ggc
Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly
35 40
cac ctc aga cac tgc ctc agc tgc tcc
His Leu Arg His Cys· Leu Ser Cys Ser
50 55
cag gtg gag atc tct tct tgc aca gtg
Gin Val Glu íle Ser Ser Cys Thr Val
65 70
tgc agg aag aac cag tac cgg cat ta t
Cys Arg Lys Asn Gin Tyr Arg His Tyr
80 85
tgc ttc aat tgc tct ctg taa aagctt
Cys Phe Asn Cys Ser Leu
100
tcc ttc acc get tca gaa aac 144
Ser Phe Thr Ala Ser 45 Glu Asn
aaa tgc ega aag gaa atg ggt 192
Lys Cys Arg Lys 60 Glu Met Gly
gac cgg gac acc gtg tgt ggc . 240
Asp Arg Asp 75 Thr Val Cys Gly
tgg agt gaa aac ctt ttc cag 288
Trp Ser 90 Glu Asn Leu Phe Gin 95
315 <210> 12 <211> 101 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 12
Met 1 Tyr íle His Pro 5 Gin Asn Asn Ser
Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys
20 25
Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser
35 40
Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys
50 55
Val Glu íle’ Ser Ser Cys Thr Val Asp
65 70
Arg Lys Asn Gin Tyr Arg His Tyr Trp
85
Phe Asn Cys Ser Leu
100
íle 10 Cys Cys Thr Lys Cys 15 Kis
Pro Gly Pro Gly Gin 30 Asp Thr
Phe Thr Ala Ser 45 Glu Asn Kis
Cys Arg Lys 60 Glu Met Gly Gin
Arg Asp 75 Thr Val Cys Gly Cys 80
Ser 90 Glu Asn Leu Phe Gin 95 Cys
<210> 13 <211> 294 <212> DNA <213> Rekombinantná ľudská <220>
<221> CDS <222> (4)..(288) <400> 13
cat atg tcg att agc tgt acc Thr aag tgc cac aaa gga acc tac ttg tac 48
Met 1 Ser íle Ser Cys 5 Lys Cys His Lys 10 Gly Thr Tyr Leu Tyr 15
aat gac tgt cca ggc ccg ggg cag gat ácg gac tgc agg gag tgt gag 96
Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu
20 25 30
agc ggc tcc ttc acc get tca gaa aac cac ctc aga cac tgc ctc agc 144
Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser
35 40 45
tgc tcc aaa tgc ega aag gaa atg ggt cag gtg gag atc tet tet- tgc 192
Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gin Val Glu íle Ser Ser Cys
50 55 60
aca gtg gac cgg gac acc gtg tgt ggc tgc agg aag aac cag tac cgg- 240
Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gin Tyr Arg
65 70 75
cat ta t tgg agt gaa aac ctt ttc cag tgc ttc aat tgc tet ctg taa 288
His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gin Cys Phe Asn Cys Ser Leu
80 85 90 95
aagctt 294 <210> 14 <211> 94 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 14
Met Ser íle Ser Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn
1 J-'· 5 10 15
Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser
20 25 30
Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys
35 40 45
Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gin Val Glu íle Ser Ser Cys Thr
50 55 60
Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gin Tyr Arg His
65 70 75 80
Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gin Cys Phe Asn Cys Ser Leu
85 90
<210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 15
Asn Ser íle Cys 1 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 16
Asn Asn Ser íle Cys 1 5 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 17
Gin Asn Asn Ser íle Cys 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 18
Pro Gin Asn Asn Ser íle Cys 1 5 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213» Rekombinantný ľudský <400> 19
His Pro Gin Asn Asn Ser íle Cys 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213» Rekombinantný ľudský <400> 20 íle His Pro Gin Asn Asn Ser íle Cys 1 5 <210> 21 <211> 10 .
<212> PRT <213> Rekombinantný ľudský
<400> 21 Tyr íle His Pro Gin Asn Asn Ser íle Cys
1 5 10
<210> 22 >’
<211> 11
<212> PRT
<213> .Rekombinantný ľudský
<400> 22
Lys Tyr íle His Pro Gin Asn Asn Ser íle Cys
1 5 10
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> Rekombinantný ľudský
<400> 23
Gly Lys Tyr íle His Pro Gin Asn Asn Ser íle Cys
1 5 10
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> Rekombinantný ľudský
<400> 24
Gin Gly Lys Tyr íle His Pro Gin Asn Asn Ser íle Cys
1 5 10
<210> 25
<211> 14
<212> PRT
<213> Rekombinantný ľudský
<400> 25
Pro Gin Gly Lys Tyr íle His Pro Gin Asn Asn Ser íle Cys
1 5 10
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> Rekombinantný ľudský
<400> 26
Cys Pro Gin Gly Lys lyr íle His Pro Gin Asn Asn Ser íle Cys
1 5 10 15
vi tn <210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 27 ΐ
Val Cys Pro Gin Gly Lys Tyr íle His Pro Gin Asn Asn Ser íle Cys 15 10 15 <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 28
Ser Val Cys Pro Gin Gly Lys Tyr íle His Pro Gin Asn Asn Ser íle 15 10 15
Cys <210> 29 <211> 18 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 29
Asp Ser Val Cys Pro Gin Gly Lys Tyr íle His Pro Gin Asn Asn Ser 15 10 15 íle Cys <210> 30 <211> 4 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 30
Phe Asn Cys Ser 1 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213» Rekombinantný ľudský <400> 31
Phe Asn Cys Ser Leu 1 5 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213>Rekombinantný ľudský <400> 32
Phe Asn Cys Ser Leu Cys 1 5 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Rekombinantný. ľudský <400> 33
Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu 1 5 <210> 34 <211> 705 <212> DNA <213> Rekombinantná ľudská <220>
<221> CDS <222> (1)..(705) <400> 34
ttg ccc Leu Pro 1 gcc cag gtg gca ttt aca ccc tac gcc ccg gag ccc ggg agc Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser 48
Ala Gin Val 5 Ala Phe Thr Pro
10 15
aca tgc cgg ctc aga gaa tac tat gac cag aca get cag atg tgc tgc 96
Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys Cys
20 25 30
agc aag tgc tcg ccg ggc caa cat gca aaa gtc ttc tgt acc aag acc 144
Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gin His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr
35 40 45
tcg gac acc gtg tgt gac tcc tgt gag gac agc aca tac acc cag ctc 192
Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Glň Leu
50 55 60
tgg aac tgg gtt ccc gag tgc ttg agc tgt ggc tcc ege .tgt agc tet 240
Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser
65 70 75 80
gac cag 9tg gaa act caa gcc tgc act cgg gaa cag aac ege atc tgc 288
Asp Gin Val Glu Thr Gin Ala Cys Thr Arg Glu Gin Asn Arg íle Cys
85 90 95
acc tgc agg ccc ggc tgg tac tgc gcg ctg age aag cag gag ggg tgc 336
Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu 105 Ser Lys Gin Glu 110 Gly Cys
100
cgg ctg tgc gcg ccg ctg cgc aag tgc cgc ccg ggc ttc ggc gtg gcc .384
Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala
115 120 S 125
aga cca gga act gaa aca tca gac gtg gtg tgc aag ccc tgt gcc ccg 432
Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro
130 135 140
ggg acg ttc tcc aac acg act tca tcc acg gat att tgc agg ccc cac 480
Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp íle Cys Arg Pro His
145 • 150 155 160
cag atc tgt aac gtg gtg gcč atc cct ggg aat gca age agg gat gca 528
Gin íle Cys Asn Val Val Ala íle Pro Gly Asn Ala Ser Arg Asp Ala
165 170 175
gtc tgc acg tcc acg tcc ccc acc cgg agt atg gcc cca ggg gca gta 576
Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val
180 185 190
cac His tta Leu ccc Pro 195 cag cca gtg Val tcc aca Ser Thr 200 ega tcc caa cac acg cag cca act Thr 624
Gin Pro Arg Ser Gin His Thr 205 Gin Pro
cca gaa ccc age act get cca age acc tcc ttc ctg ctc cca atg ggc 672
Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly
210 215 220
ccc age ccc cca get gaa ggg age act ggc gac 705
Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp
225 230 235 <210> 35 <211> 235 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský
<400> 35 Leu Pro Ala 1 Gin Val 5 Ala Phe Thr Pro Tyr 10 Ala Pro Glu Pro Gly 15 Ser
Thr Cys Arg Leu 20 Arg Glu Tyr Tyr Asp 25 Gin Thr Ala Gin Met 30 Cys Cys
Ser Lys Cys 35 Ser Pro Gly Gin His 40 Ala Lys Val Phe Cys 45 Thr Lys Thr
Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gin Leu
55 60
Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser
65 70 75 .80
Asp Gin Val Glu Thr Gin Ala Cys Ťhr Arg Glu Gin Asn Arg íle Cys
85 90 95
Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gin Glu Gly Cys
100 105 110
Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala
115 120 125
Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro
130 135 140
Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp íle Cys Arg Pro His
145 150 155 160
Gin íle Cys Asn Val Val Ala íle Pro Gly Asn Ala Ser Arg Asp Ala
165 170 175
Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val
180 185 190
His Leu Pro Gin Pro Val Ser Thr Arg Ser Gin Kis Thr Gin Pro Thr
195 200 205
Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly
210 215 220
Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp
225 230 235
<210> 36 <211> 4' <212> PRT <213> Rekombinantrrý ľudský <400> 36
Ala Gin Met Cys 1 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 37
Thr Ala Gin Met Cys 1 5 <210> 38 <211> 6 <212> PRT <213> Rekombinantný ludský <400> 38
Gin Thr Ála Gin Met Cys 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Rekombinantný ludský <400> 39
Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys 1 5 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Rekombinantný ludský <400> 40
Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Rekombinantný ludský <400> 41
Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys 1 5 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Rekombinantný ludský <400> 42
Glu Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys 15 10 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Rekombinantný ludský · <400> 43
Arg Glu Tyr' Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys 1 5 -.10 <210> 44 · ' φ <211> 12 <212> PRT <213> Rekombinantný. ľudský <400> 44
Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys 15 10 <210> 45 <211> 13 <212>.PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 45
Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys
10 <210> 46 <211> 14 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 46
Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys
5 10 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 47
Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys 15 10 15 <210> 48 <211> 16 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 48
Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu .Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys 15 10 15 <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 49 λ:
Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met 1 5 10 15
Cys <210> 50 <211> 18 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 50
Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gin 15 10 15
Met Cys <210> 51 <211> 19 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 51
Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala
10 15
Gin Met Cys <210> 52 <211> 20 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 52
Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin Thr 15 10 15
Ala Gin Met Cys 20 <210> 53 <211> 21 <21Z> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 53 ·
Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin
5 '10 15
Thr Ala Gin Met Čys- ‘č;·· <210> 54 <211> 22 <212> PRT <213> Rekombinantný. ľudský <400> 54
Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp 15 10 15
Gin Thr Ala Gin Met Cys <210> 55 <211> 23 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 55
Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr 15 10 15
Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys <210> 56 <211> 24 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 56
Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr 15 10 15
Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys 20 <210> 57 <211> 25 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 57
Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Prô Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu 15 10 15
Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys
25 <210> 58 <211> 26 >·.
<212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 58
Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg 15 10 15
Glu Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys 20 25 <210> 59 <211> 27 <212> PRT <213» Rekombinantný ľudský <400> 59
Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu 15 10 15
Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys 20 25 <210> 60 <211> 28 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 60
Gin Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg 15 10 15
Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys
25 <210> 61 <211> 29 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 61
Ala Gin Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys 1 5 10 15
Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys 20 ·· 25 <210> 62 <211> 30 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský
Ý <400> 62
Pro Ala Gin Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr 15 10 15
Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys 20 25 30 <210> 63 <211> 31 <212> PRT <213> Rekombinantn.ý ludský <400> 63
Leu Pro Ala Gin Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser 15 10 15
Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys 20 25 30 <210> 64 <211> 4 <212> PRT <213> Rekombinantný ludský <400> 64
Ala Pro Leu Arg 1 <210> 65 <211> 5 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 65 . Ala Pro Leu Arg Lys 1 5 <210> 66 <211> 6 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 66
Ala Pro Leu Arg Lys Cys 1 5 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Rekombinantný ľudský <400> 67
Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg 1 5 <210> 68 <211> 31 <212> DNA <213> Rekombinantná ľudská <400> 68 ggttagccat atggacagcg tttgccccca a 31 <210> 69 <211> 33 <212> DNA *213» Rekombinantná ľudská <400> 69 cccaagcttt tacagagagc aattgaagca ctg 33 <210> 70 <211> 40 <212> DNA <213» Rekombinantná ľudská <400> 70 actcgaggat -ccgcggataa ataagtaacg atccggtcca 40 <210> 71 <211> 41 <212> DNA <213> Rekombinantná ludska <400> 71 caggtcggat cctatcagca gaagcactgg aaaaggtttt c 41 <210> 72 <211> 31 <212> DNA <213> Rekombinantná ludska <400> 72 ggttagccat atggacagcg tttgccccca a <210> 73 <211> 34 <212> DNA <213> Rekombinantná ľudská <400> 73 ·>:· cgcggatccc tattaattga agcactggaa aagg' 34 <210> 74 <211> 30 <212> DNA <213> Rekombinantná ľudská <400> 74 ccccatatgt atatccaccc tcaaaataat 30 <210> 75 <211> 33 <212> DNA <213> Rekombinantná ľudská <400> 75 cccaagcttt tacagagagc aattgaagca ctg 33 <210> 76 <211> 38 <212> DNA <213> Rekombinantná ľudská <400> 76 ccccatatgt cgattagctg taccaagtgc cacaaagg 38 <210> 77 <211> 33 <212> DNA <213> Rekombinantná ľudská <400> 77 cccaagcttt tacagagagc aattgaagca ctg 33 <210> 78 <211> 30 <212> DNA <213> .Rekombinantná ľudská <400> 78 ccccatatgt gtaccaagtg ccacaaagga <21O> 79 <211> 33 · <212> DNA <213> Rekombinantná ludská <400> 79 ·?;.· cccaagcttt tacagagagc aattgaagca ctg · 33 <210> 80 <211> 31 <212> DNA <213> Rekombinantná ludská <400> 80 ggttagccat atggacagcg tttgccccca a 31 <210> 81 <211> 33 <212> DNA <213> Rekombinantná ludská.
<400> 81 cccaagcttt taggtgcaca cggtgttctg ttt 33

Claims (32)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Skrátené receptory faktora nekrotizujúceho tumory (skrátené sTNFR) majúce nasledovný vzorec: Ri~ [Cys19-Cys103] -R2, kde [Cys19-Cys103] predstavuje zvyšky 19 až 103 sTNFR-Ι (schéma číslovania aminokyselinových zvyškov je uvedená na obr. 1 (SEQ ID NO:2) na uľahčenie porovnania a kde ďalej Ri predstavuje metionylovanú alebo nemetionylovanú aminoskupinu Cys19 alebo aminokyselinového zvyšku (alebo zvyškov) aminokyselinového konca vybraných zo skupiny:
    C
    IC
    SIC
    NSIC (SEQ ID NO:15) NNSIC (SEQ ID NO:16) QNNSIC (SEQ ID NO:17) PQNNSIC (SEQ ID NO:18) HPQNNSIC (SEQ ID NO:19) IHPQNNSIC (SEQ ID NO:20) YIHPQNNSIC (SEQ ID NO:21) KYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:22) GKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:23) QGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:24) PQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:25) CPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:26) VCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:27) SVCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:28) DSVCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO:29)
    a kde R2 predstavuje karboxyskupinu Cys103 alebo karboxyskupinu karboxykoncového aminokyselinového zvyšku vybraného zo skupiny:
    F
    FN FNC FNCS (SEQ ID NO:30) FNCSL (SEQ ID N0:31) FNCSLC (SEQ ID NO:32) FNCSLCL (SEQ ID NO:33);
    a od nich odvodených obmien alebo derivátov, ale za predpokladu, že keď Ri predstavuje metionylovanú alebo nemetionylovanú aminoskupinu aminokyselinovej sekvencie VCPQGKYIHPQNNSIC alebo odtiaľ odvodené N-terminálne skrátenie 1 až 15 zvyškov, potom Ri- [Cys19-Cys103] -R2 nie je pridaný variant majúci vzorec Ri~ [Cys19-Cys103]-FNCSLCL-R3, kde R3 predstavuje karboxyskupinu aminokyselinových zvyškov Asn111-Asn161 z obr. 1 alebo skrátenie na karboxylovom konci Asnul-Asn161 z obr. 1.
  2. 2. Skrátený sTNFR podľa nároku 1, vybraný zo skupiny skladajúcej sa z sTNFR-Ι 2,6D/C105, sTNFR-Ι 2,6D/C106, sTNFR-I 2,6D/N105, sTNFR-Ι 2,3D/d8, sTNFR-Ι 2,3D/dl5 alebo sTNFR-I 2,3D/dl8.
  3. 3. Skrátený sTNFR podľa nároku 1 alebo 2, ktorý je na . r# karboxylovom konci fuzicX/aný s celou konštantnou doménou alebo jej časťou ťažkého alebo ľahkého reťazca ľudského imunoglobulínu.
  4. 4. Skrátený sTNFR podľa niektorého z nárokov 1 až 3, ktorý je neglykozylovaný.
  5. 5. Skrátený sTNFR podľa niektorého z nárokov 1 až 3, ktorý je glykozylovaný.
  6. 6. Skrátený sTNFR podľa niektorého z nárokov 1 až 5, ktorý je konjugovaný k polyméru rozpustnému vo vode.
  7. 7. Skrátený sTNFR podľa nároku 6, v ktorom je vo vode rozpustným polymérom polyetylénglykol.
  8. 8. Polyvalentný väzbový proteín faktora nekrotizujúceho tumory (TNFbp) obsahujúci najmenej jeden skrátený sTNFR podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7.
  9. 9. TNFbp podľa nároku 8 obsahujúci dimér skráteného sTNFR podľa nároku 3.
  10. 10. TNFbp podľa nároku 8 všeobecného vzorca Ri-X-R2, kde X obsahuje linker, ktorým je vo vode rozpustný polymér a Ri a R2 sú biologicky aktívne molekuly kovalentne viazané na uvedený vo vode rozpustný polymér, pričom aspoň jeden z Ri a R2 je skrátený sTNFR podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5.
  11. 11. TNFbp podľa nároku 10, v ktorom vo vode rozpustným polymérom je polyetylénglykol.
  12. 12. TNFbp podľa nároku 11, v ktorom je sTNFR vybraný zo skupiny skladajúcej sa z sTNFR-Ι 2,6D/C105db a sTNFR-I 2,6D/C106db.
  13. 13. Polynukleotid majúci sekvenciu kódujúcu skrátený sTNFR podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 alebo sekvenciu k nej komplementárnu.
  14. 14. Polynukleotid podľa nároku 13, ktorý má sekvenciu nukleovej kyseliny zvolenú zo sekvencií uvedených na obr. 2,
    3, 4, 5, 6 alebo 7 alebo sekvenciu, ktorá je v kódujúcich oblastiach degenerovaná.
  15. 15. Vektor obsahujúci polynukleotid podľa nároku 13 alebo 14 operatívne pripojený k sekvencii riadiacej expresiu.
  16. 16. Prokaryotická alebo eukaryotická hostiteľská bunka obsahujúca polynukleotid podľa nároku 13 alebo 14 alebo vektor podľa nároku 15.
  17. 17. Spôsob prípravy skráteného sTNFR, vyznačuj ú ci sa tým, že sa kultivuje hostiteľská bunka podľa nároku 16 za podmienok vhodných na umožnenie expresie skráteného sTNFR hostiteľskou bunkou a poprípade sa skrátený sTNFR izoluje.
  18. 18. Spôsob podľa nároku 17,vyznačujúci sa tým, že hostiteľskou bunkou je bunka E. coli.
  19. 19. Spôsob podľa nároku 17,vyznačujúci sa tým, že hostiteľskou bunkou je bunka vaječníka čínskeho chrčka (CHO).
  20. 20. Skrátený sTNFR, ktorý je rekombinantným expresným produktom prokaryotickej alebo eukaryotickej hostiteľskej bunky podľa nároku 16.
  21. 21. Spôsob prípravy farmaceutickej kompozície, vyzná čujúci sa tým, že sa terapeuticky účinné množstvo skráteného sTNFR podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 alebo nároku 20 alebo TNFbp podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 12 zmieša s jedným alebo viacerými farmaceutický vhodnými nosičmi.
  22. 22. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje skráténý sTNFR podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 alebo 20 v spojení s farmaceutický vhodným nosičom.
  23. 23. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje TNFbp podlá ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 12 v spojení s farmaceutický vhodným nosičom.
  24. 24. Farmaceutická kompozícia 22 až 23, vyznačujúca zmes s predĺženým uvoľňovaním.
  25. 25. Farmaceutická kompozícia 22 až 24, vyznačuj úca lizovaná.
    podľa ktoréhokolvek z nárokov sa t ý m , že obsahuje podľa ktoréhokoľvek z nárokov sa t ý m , že je lyofi
  26. 26. Použitie skráteného sTNFR podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 alebo nároku 20 alebo TNFbp podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 12 na výrobu liečiva na liečenie pacientov postihnutých chorobou sprostredkovanou TNF.
  27. 27. Použitie skráteného sTNFR podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 alebo nároku 20 alebo TNFbp podľa ktoréhokolvek z nárokov'8 až 12 na výrobu liečiva na liečenie pacientov postihnutých diabetes, hyperalgéziou, zápalovou chorobou čriev, ischemickým poškodením, reperfúznym poškodením alebo reumatickou chorobou.
  28. 28. Použitie podľa nároku 27, kde reumatická choroba je zvolená zo súboru pozostávajúceho z reumatoidnej artritídy, osteoartritídy, juvenilnej (reumatoidnej) artritídy, ankylóznej spondylitídy, dermatomyozitídy, psoriatickej artritídy, sklerodermie, Sjógrenovho syndrómu a vaskulitídy.
  29. 29. Použitie podlá ktoréhokoľvek z nárokov 26 až 28, kde liečivo sa podáva intravenózne, intramuskulárne, intradermálne, subkutánne, intraartikulárne alebo infúziou.
  30. 30. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 26 až 29, kde liečivo sa podáva pred podaním protizápalového liečiva, súčasne s ním alebo po ňom.
  31. 31. Použitie podľa nároku 30, kde protizápalové liečivo je zvolené zo súboru pozostávajúceho z nesteroidných protizápalových liečiv (NSAID), kortikosteroidov, pomaly pôsobiacich antireumatických liečiv (SAARD) alebo liečiv modifikujúcich chorobu (DM).
    31. Použitie podľa nároku 30, kde protizápalovým liečivom je inhibítor interleukínu (IL-1) zvolený z antagonistu receptora IL-1 (IL-lra) alebo rozpustného receptora IL-1.
  32. 32. Kit, vyznačujúci sa tým, že obsahuje skrátený sTNFR podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 alebo nároku 20 alebo TNFbp podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 12.
SK15-99A 1996-07-09 1997-07-09 Truncated soluble tumor necrosis factor type-i and type-ii receptors SK1599A3 (en)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2144396P 1996-07-09 1996-07-09
US3253496P 1996-12-06 1996-12-06
US3773797P 1997-01-23 1997-01-23
US3931497P 1997-02-07 1997-02-07
US3979297P 1997-03-04 1997-03-04
PCT/US1997/012244 WO1998001555A2 (en) 1996-07-09 1997-07-09 Truncated soluble tumor necrosis factor type-i and type-ii receptors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK1599A3 true SK1599A3 (en) 2001-02-12

Family

ID=27533913

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK15-99A SK1599A3 (en) 1996-07-09 1997-07-09 Truncated soluble tumor necrosis factor type-i and type-ii receptors

Country Status (22)

Country Link
US (2) US6989147B2 (sk)
EP (1) EP0914431B1 (sk)
JP (2) JP2002514048A (sk)
KR (1) KR20000023695A (sk)
AT (1) ATE364695T1 (sk)
AU (2) AU3601397A (sk)
BG (1) BG64910B1 (sk)
BR (1) BR9710350A (sk)
CA (1) CA2259156C (sk)
CZ (1) CZ296835B6 (sk)
DE (1) DE69737814T2 (sk)
EA (1) EA003900B1 (sk)
ES (1) ES2288304T3 (sk)
IL (1) IL127874A0 (sk)
NO (1) NO990086L (sk)
NZ (1) NZ333647A (sk)
PL (1) PL189309B1 (sk)
SK (1) SK1599A3 (sk)
TR (1) TR199700610A3 (sk)
TW (1) TW555765B (sk)
WO (1) WO1998001555A2 (sk)
YU (1) YU299A (sk)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7005413B1 (en) * 1995-12-22 2006-02-28 Amgen Inc. Combination therapy for conditions leading to bone loss
JP4771563B2 (ja) 1996-12-06 2011-09-14 アムジエン・インコーポレーテツド Ｉｌ−１媒介疾患を処置するためにｉｌ−１インヒビターを使用する組合せ療法
CZ302262B6 (cs) 1997-04-16 2011-01-19 Amgen Inc. Izolovaná nukleová kyselina, polypeptid kódovaný touto nukleovou kyselinou, expresní vektor obsahující tuto nukleovou kyselinu, hostitelská bunka transfekovaná tímto expresním vektorem, izolovaný protein vázající osteoprotegerin, protilátka vázající
US6316408B1 (en) 1997-04-16 2001-11-13 Amgen Inc. Methods of use for osetoprotegerin binding protein receptors
US20040220103A1 (en) * 1999-04-19 2004-11-04 Immunex Corporation Soluble tumor necrosis factor receptor treatment of medical disorders
DE60024636T2 (de) * 1999-06-21 2006-08-17 Santen Pharmaceutical Co., Ltd Arzneimittel für die rheumatoide arthritis
EP1263788A2 (en) 2000-02-11 2002-12-11 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Identification of a domain in the tumor necrosis factor receptor family that mediates pre-ligand receptor assembly and function
US20030103978A1 (en) 2000-02-23 2003-06-05 Amgen Inc. Selective binding agents of osteoprotegerin binding protein
US7087224B2 (en) * 2000-10-31 2006-08-08 Amgen Inc. Method of treating anemia by administering IL-1ra
CA2428092A1 (en) * 2000-12-06 2002-06-13 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Use of sarp-1 for the treatment and/or prevention of scleroderma
MXPA04000134A (es) 2001-06-26 2005-06-06 Abgenix Inc Anticuerpos para ligandos de osteoprotegerina.
AU2003243139B2 (en) 2002-04-05 2007-06-21 Amgen Inc. Human anti-OPGL neutralizing antibodies as selective OPGL pathway inhibitors
US20040002451A1 (en) 2002-06-20 2004-01-01 Bruce Kerwin Compositions of pegylated soluble tumor necrosis factor receptors and methods of preparing
WO2004098595A1 (en) * 2003-05-12 2004-11-18 Altana Pharma Ag COMPOSITION COMPRISING ROFLUMILAST AND A TNFα ANTAGONIST
JP2007523117A (ja) * 2004-02-20 2007-08-16 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗コリン作用薬及びｐｅｇｓｕｎｅｒｃｅｐｔを基にした新規な医薬組成物
CA2574881C (en) 2004-08-04 2013-01-08 Amgen Inc. Antibodies to dkk-1
KR20080031684A (ko) 2005-06-14 2008-04-10 암젠 인코포레이티드 자가 - 완충성 단백질 제형
AR056806A1 (es) 2005-11-14 2007-10-24 Amgen Inc Moleculas quimericas de anticuerpo rankl- pth/ pthrp
US7833527B2 (en) 2006-10-02 2010-11-16 Amgen Inc. Methods of treating psoriasis using IL-17 Receptor A antibodies
WO2009009186A2 (en) 2007-04-13 2009-01-15 The Regents Of The University Of California Receptors useful for gas phase chemical sensing
SI2188313T1 (en) 2007-08-21 2018-04-30 Amgen, Inc. HUMAN C-FMS ANTIGEN TRANSFER PROTEIN
US8883146B2 (en) 2007-11-30 2014-11-11 Abbvie Inc. Protein formulations and methods of making same
CA2731546C (en) 2008-07-23 2013-11-19 Hanmi Holdings Co., Ltd. A polypeptide complex comprising non-peptidyl polymer having three functional ends
EP2492281B1 (en) * 2009-10-19 2018-04-11 HanAll Biopharma Co., Ltd. Modified human tumor necrosis factor receptor-1 polypeptide or fragment thereof, and method for preparing same
SI3295957T1 (sl) 2010-01-15 2020-02-28 Kirin-Amgen, Inc. Formulacija protitelesa proti IL-17RA in terapevtski režim za zdravljenje luskavice
KR101273893B1 (ko) 2010-09-13 2013-06-14 한올바이오파마주식회사 변형된 인간 종양 괴사 인자 수용체-1 폴리펩티드 또는 그의 절편 및 그의 제조방법
ES2626418T3 (es) * 2010-12-23 2017-07-25 Hanall Biopharma Co., Ltd. Polipéptido modificado del receptor-1 del factor de necrosis tumoral humano o fragmento del mismo y procedimiento de preparación del mismo
TW201605896A (zh) 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
WO2015087187A1 (en) 2013-12-10 2015-06-18 Rinat Neuroscience Corp. Anti-sclerostin antibodies
AU2015380301B2 (en) * 2015-01-28 2020-04-23 Dnx Biotech, Llc Compositions and methods of using a soluble TNF-alpha receptor modified for increased half-life
MA43814A (fr) 2016-03-08 2018-11-28 Janssen Biotech Inc Anticorps anti-gitr, méthodes et utilisations
BR112019007858A2 (pt) 2016-10-21 2019-07-02 Amgen Inc formulações farmacêuticas e métodos para produzir as mesmas

Family Cites Families (111)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
IN150740B (sk) 1978-11-24 1982-12-04 Hoffmann La Roche
US4760067A (en) 1979-08-15 1988-07-26 Merck & Co., Inc. Allylsulfoxide enzyme inhibitors
EP0040506B1 (en) 1980-05-21 1986-08-20 Teijin Limited Reactive polymer and process for the preparation thereof
US4560649A (en) 1981-10-15 1985-12-24 Cornell Research Foundation Assaying for hLH or hCG with immobilized hormone receptors
JPH0751511B2 (ja) 1982-03-15 1995-06-05 味の素株式会社 インターロイキン２を含有してなる癌治療剤
DE3378250D1 (en) 1982-04-22 1988-11-24 Ici Plc Continuous release formulations
US4587046A (en) 1982-05-18 1986-05-06 The Regents Of The University Of California Drug-carrier conjugates
DE3380726D1 (en) 1982-06-24 1989-11-23 Japan Chem Res Long-acting composition
US4966888A (en) 1985-07-08 1990-10-30 Cornell Research Foundation, Inc. hCG-hLH receptor and hCG-hLH receptor-hCG complex as antigens, antibodies thereto and contraceptive vaccine
US4522750A (en) 1984-02-21 1985-06-11 Eli Lilly And Company Cytotoxic compositions of transferrin coupled to vinca alkaloids
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
SE470099B (sv) 1984-05-17 1993-11-08 Jerker Porath Sulfonaktiverade tioeteradsorbenter för separation av t ex protein
US4578335A (en) 1984-05-21 1986-03-25 Immunex Corporation Interleukin 2 receptor
US4670563A (en) 1984-06-20 1987-06-02 Sanofi Imidazolides as intermediates for the synthesis of cytotoxic conjugates
US4675285A (en) 1984-09-19 1987-06-23 Genetics Institute, Inc. Method for identification and isolation of DNA encoding a desired protein
SE454885B (sv) 1984-10-19 1988-06-06 Exploaterings Ab Tbf Polymerbelagda partiklar med immobiliserade metalljoner pa sin yta jemte forfarande for framstellning derav
US4959314A (en) 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
JP2524586B2 (ja) 1985-06-26 1996-08-14 シタス コーポレイション ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
JPS62185029A (ja) 1986-02-07 1987-08-13 Ajinomoto Co Inc 修飾インタ−ロイキン−２
CA1283046C (en) 1986-05-29 1991-04-16 Nandini Katre Tumor necrosis factor formulation
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
IN165717B (sk) 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US4931544A (en) 1986-09-04 1990-06-05 Cetus Corporation Succinylated interleukin-2 for pharmaceutical compositions
IL80005A (en) 1986-09-10 1992-11-15 Yeda Res & Dev Compositions for modulating the effect of tnf and il-1
US4965271A (en) 1986-12-31 1990-10-23 Hoechst Roussel Pharmaceuticals, Inc. Method of inhibiting the activity of leukocyte derived cytokines
US5359032A (en) 1987-08-26 1994-10-25 Biogen Inc. Interkeukin-1 inhibitor
IL83878A (en) 1987-09-13 1995-07-31 Yeda Res & Dev Soluble protein corresponding to tnf inhibitory protein its preparation and pharmaceutical compositions containing it
IL90339A (en) 1989-05-18 1996-10-16 Yeda Res & Dev Anti-cytotoxic protein and its purification
US5512544A (en) 1987-09-13 1996-04-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Pharmaceutical compositions comprising an anticytokine
IL98078A0 (en) 1991-05-07 1992-06-21 Yeda Res & Dev Pharmaceutical compositions comprising an anticytokyne
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US5153265A (en) 1988-01-20 1992-10-06 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
GB8806339D0 (en) 1988-03-17 1988-04-13 Hoffmann La Roche Monoclonal antibodies
GB8807803D0 (en) 1988-03-31 1988-05-05 Glaxo Group Ltd Biochemical product
US5256642A (en) 1988-04-01 1993-10-26 The Johns Hopkins University Compositions of soluble complement receptor 1 (CR1) and a thrombolytic agent, and the methods of use thereof
IL89790A (en) 1988-04-01 2002-05-23 Johns Hopking University Sequences of nucleic acids encoding and cells producing CR1 protein and methods for its production and purification
US5214131A (en) 1988-05-06 1993-05-25 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, modified peptides and production thereof
KR0148009B1 (ko) 1988-05-27 1998-08-01 그래고리 비. 아보트 인터루킨-1 억제제
US5075222A (en) 1988-05-27 1991-12-24 Synergen, Inc. Interleukin-1 inhibitors
JPH0240399A (ja) 1988-07-27 1990-02-09 Takeda Chem Ind Ltd 線維芽細胞増殖因子ムテインの複合体あるいは組成物
US5811261A (en) 1988-09-12 1998-09-22 Yeda Research And Development Co. Ltd. Expression of the recombinant tumor necrosis factor binding protein I (TBP-I)
IL95064A0 (en) * 1990-07-12 1991-06-10 Yeda Res & Dev Molecular cloning of tnf binding protein
IL94039A (en) 1989-08-06 2006-09-05 Yeda Res & Dev Antibodies to tbp - 1 and their use
US5359037A (en) 1988-09-12 1994-10-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies to TNF binding protein I
GB8824592D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Purification process
GB8824869D0 (en) 1988-10-24 1988-11-30 Stevenson G T Synthetic antibody
US5681566A (en) 1988-10-24 1997-10-28 3I Research Exploitation Limited Antibody conjugates with two or more covalently linked FC regions
US5162430A (en) 1988-11-21 1992-11-10 Collagen Corporation Collagen-polymer conjugates
WO1990005534A1 (en) 1988-11-23 1990-05-31 Genentech, Inc. Polypeptide derivatives
JPH04502469A (ja) 1988-12-22 1992-05-07 ゾマ　コーポレイション ヒンダードカップリング剤および方法
US5089261A (en) 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
CA2011450C (en) 1989-03-07 2002-06-04 Tadatsugu Taniguchi Recombinant b-chain of the il-2 receptor
EP0386289A1 (en) 1989-03-07 1990-09-12 Taniguchi, Tadatsugu, Dr. Recombinant interleukin-2 receptor
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
JPH03164179A (ja) * 1989-04-21 1991-07-16 Boehringer Ingelheim Internatl Gmbh Ｔｎｆレセプター、ｔｎｆ結合たん白質およびこれらをコードするｄｎａ
ATE289350T1 (de) * 1989-04-21 2005-03-15 Amgen Inc Tnf-rezeptor, tnf bindende proteine und dafür kodierende dnas
US7264944B1 (en) * 1989-04-21 2007-09-04 Amgen Inc. TNF receptors, TNF binding proteins and DNAs coding for them
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
DE3922089A1 (de) 1989-05-09 1990-12-13 Basf Ag Neue proteine und ihre herstellung
CA2017025C (en) * 1989-05-18 2008-07-22 David Wallach Tumor necrosis factor binding protein ii, its purification and antibodies thereto
IL95031A (en) * 1989-07-18 2007-03-08 Amgen Inc A method of producing a recombinant human necrotic factor absorber
US6143866A (en) * 1989-07-18 2000-11-07 Amgen, Inc. Tumor necrosis factor (TNF) inhibitor and method for obtaining the same
AU630497B2 (en) 1989-09-05 1992-10-29 Immunex Corporation Tumor necrosis factor-alpha and -beta receptors
NZ235148A (en) 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
US5395760A (en) 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
US5605690A (en) 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
EP0939121B2 (de) 1989-09-12 2007-12-26 AHP Manufacturing B.V. TFN-bindende Proteine
US5350836A (en) * 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
US5234903A (en) 1989-11-22 1993-08-10 Enzon, Inc. Chemically modified hemoglobin as an effective, stable non-immunogenic red blood cell substitute
ES2103305T3 (es) 1989-11-29 1997-09-16 Amgen Boulder Inc Produccion de inhibidor de interleuquina-1 humana recombinada.
ES2080098T3 (es) * 1989-12-13 1996-02-01 Yeda Res & Dev Expresion de la proteina de union i al factor de necrosis tumoral tbp-i recombinante.
US5136021A (en) 1990-02-27 1992-08-04 Health Research, Inc. TNF-inhibitory protein and a method of production
US5171264A (en) 1990-02-28 1992-12-15 Massachusetts Institute Of Technology Immobilized polyethylene oxide star molecules for bioapplications
US6552170B1 (en) 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US6458360B1 (en) 1990-04-25 2002-10-01 The Johns Hopkins University Soluble complement regulatory molecules
GB2246569A (en) 1990-06-15 1992-02-05 Charing Cross Sunley Research Tumour necrosis factor - alpha binding protein
WO1992001002A1 (fr) 1990-07-11 1992-01-23 Teijin Limited Inhibiteur de l'activite du facteur de la necrose tumorale et son procede de preparation
GB9015908D0 (en) 1990-07-19 1990-09-05 Celltech Ltd Multivalent immunoglobulin
WO1992001474A1 (en) 1990-07-20 1992-02-06 Kabi Pharmacia Ab Heterobifunctional reagents and conjugates with oxaalkylene units for amphiphilic bridge structures
EP0546055B1 (en) 1990-08-31 1996-07-10 Regents Of The University Of Minnesota Polyethylene glycol derivatives for solid-phase applications
GB9022648D0 (en) 1990-10-18 1990-11-28 Charing Cross Sunley Research Polypeptide and its use
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
DK0567566T4 (da) 1991-01-18 2007-10-22 Amgen Inc Fremgangsmåder til behandling af tumornekrosefaktor-medierede sygdomme
AU664030B2 (en) 1991-02-27 1995-11-02 Micromet Ag Serine-rich peptide linkers
JP3693671B2 (ja) * 1991-03-15 2005-09-07 アムゲン インコーポレーテッド ポリペプチドのｐｅｇ化
JPH06506217A (ja) 1991-03-18 1994-07-14 エンゾン，インコーポレーテッド ポリペプチドまたはグリコポリペプチドとポリマーとのヒドラジン含有結合体
DE69213240T2 (de) 1991-07-04 1997-04-24 Immunodex K/S, Glostrup Wasserlösliche reagenzien und konjugate auf polymerbasis, die vom divinylsulfon abgeleitete reste enthalten
IL99120A0 (en) * 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5569779A (en) 1991-12-23 1996-10-29 Albemarle Corporation Polyfunctional michael addition products
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
WO1994001483A1 (en) 1992-07-02 1994-01-20 Collagen Corporation Biocompatible polymer conjugates
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
EP0620739A4 (en) 1992-09-15 1997-01-15 Immunex Corp Method of treating tnf-dependent inflammation using tumor necrosis factor antagonists.
US6270766B1 (en) 1992-10-08 2001-08-07 The Kennedy Institute Of Rheumatology Anti-TNF antibodies and methotrexate in the treatment of arthritis and crohn's disease
EP0622394A1 (en) 1993-04-30 1994-11-02 S.A. Laboratoires S.M.B. Reversible modification of sulfur-containing molecules with polyalkylene glycol derivatives and their use
EP0710121B1 (en) 1993-07-30 2000-10-11 Kennedy Institute Of Rheumatology Method for treating multiple sclerosis
GB9317618D0 (en) 1993-08-24 1993-10-06 Royal Free Hosp School Med Polymer modifications
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
HUT76666A (en) * 1994-07-22 1997-10-28 Hoffmann La Roche Pharmaceutical compositions comprising a chimaeric tnf binding protein
DE4441446A1 (de) * 1994-11-22 1996-05-23 Ulrich Theis Verfahren zur Übergabe von Wäschestücken und vorzugsweise zur Durchführung des Verfahrens dienende Muldenmangel
TW313568B (sk) 1994-12-20 1997-08-21 Hoffmann La Roche
US7429646B1 (en) * 1995-06-05 2008-09-30 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to human tumor necrosis factor receptor-like 2
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols

Also Published As

Publication number Publication date
IL127874A0 (en) 1999-10-28
EA003900B1 (ru) 2003-10-30
CZ499A3 (cs) 2000-01-12
US6989147B2 (en) 2006-01-24
PL189309B1 (pl) 2005-07-29
TW555765B (en) 2003-10-01
BG103091A (en) 2000-05-31
WO1998001555A2 (en) 1998-01-15
EA199900095A1 (ru) 2000-02-28
TR199700610A2 (xx) 1998-01-21
US7732587B2 (en) 2010-06-08
BG64910B1 (bg) 2006-08-31
CA2259156C (en) 2010-09-07
NO990086D0 (no) 1999-01-08
DE69737814D1 (de) 2007-07-26
JP2002514048A (ja) 2002-05-14
JP2009280612A (ja) 2009-12-03
AU1112101A (en) 2001-04-05
KR20000023695A (ko) 2000-04-25
NZ333647A (en) 2000-09-29
CZ296835B6 (cs) 2006-06-14
ES2288304T3 (es) 2008-01-01
DE69737814T2 (de) 2008-03-06
YU299A (en) 1999-11-22
EP0914431B1 (en) 2007-06-13
WO1998001555A3 (en) 1998-05-22
EP0914431A2 (en) 1999-05-12
AU774307B2 (en) 2004-06-24
AU3601397A (en) 1998-02-02
PL331240A1 (en) 1999-07-05
NO990086L (no) 1999-03-09
CA2259156A1 (en) 1998-01-15
US20050250696A1 (en) 2005-11-10
US20030054439A1 (en) 2003-03-20
TR199700610A3 (tr) 1998-01-21
ATE364695T1 (de) 2007-07-15
BR9710350A (pt) 1999-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6989147B2 (en) Truncated soluble tumor necrosis factor type-I and type-II receptors
US6306820B1 (en) Combination therapy using a TNF binding protein for treating TNF-mediated diseases
AU736876B2 (en) Combination therapy using an IL-1 inhibitor for treating IL-1 mediated diseases
US6294170B1 (en) Composition and method for treating inflammatory diseases
US6096728A (en) Composition and method for treating inflammatory diseases
AU5187600A (en) Composition comprising interleukin-1 inhibitor and controlled release polymer
AU771793B2 (en) Combination therapy using a TNF binding protein for treating TNF-mediated diseases
EP1352656A2 (en) Combination therapy using a TNF binding protein for treating TNF-mediated diseases
MXPA99005224A (en) Combination therapy using a tnf binding protein for treating tnf-mediated diseases
AU5400701A (en) Combination therapy using an il-1 inhibitor for treating il-1 mediated diseases