KR20220103695A - 근육 위축을 치료하기 위한 펩티드 - Google Patents

Abstract

본 출원인은 시험관내 세포 검정에서 다양한 범위의 농도에 걸쳐 리보솜 단백질 S6 (rpS6)을 용량-의존성 방식으로 인산화할 수 있는 다수의 펩티드를 발견하였다. RPS6은 단백질 키나제에 대한 주요 기질이고, 세포 성장 및 세포 분열 동안 성장 인자 및 미토겐에 의해 인산화된다. 이는 골격근 조직 내 새로운 단백질의 합성에서의 주요 단계이다. 기재된 펩티드는 또한, 직접 연결되어 단백질 분해를 증가시켜 진행성 골격근 위축을 유발하는 mRNA 전사체 (TRIM63 및 FBXO32)의 발현을 감소시키는 능력을 갖는다. 또한, 근육 위축의 증가는 순환 TNFα의 전신 상승과 연관된다. 본원에 기재된 펩티드는 또한 순환 면역 세포에서 TNFα의 감소된 발현을 유발한다. 펩티드는 근육 위축을 나타내는 대상체, 예를 들어 고령 대상체, 신체적으로 비활동적인 사람, 및 근육 위축을 특징으로 하는 적응증 (즉, MS 및 소아마비)을 갖는 대상체에서 근육 성장 및 근육 건강을 촉진하는데 사용될 수 있다.

Description

근육 위축을 치료하기 위한 펩티드

본 발명은 다수의 펩티드, 및 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 대상체에서 근육 위축을 치료 또는 예방하기 위한 펩티드 또는 조성물의 용도가 또한 고려된다.

근육 위축은 근육 소모, 단백질 분해의 증가, 증가된 전신 염증, 및 이환된 근육 유형에서 새로 합성된 단백질의 하향-조절을 특징으로 하는 인간에서의 상태이다. 상태의 증상은 하나 이상의 사지의 현저한 약화를 포함하며, 하나의 팔 또는 다리가 다른 것보다 현저히 더 작다. 이는 통상적으로 노화 (종종 근육감소증의 일부로서)와, 장기간 동안 신체적으로 비활동적인 대상체, 예를 들어 병상에 있는 환자, 우주비행사, 부상당한 운동선수, 섭식 장애를 갖는 대상체, 대사 질환을 갖는 대상체, 및 뉴런, 근육 또는 관절 변성을 특징으로 하는 질환, 예컨대 ALS, MS, 근육 이영양증, 길랑-바레 증후군, 근육감소증, 골관절염, 소아마비, 류마티스 관절염, 척수성 근육 위축 및 다발근염을 갖는 대상체와 연관된다.

리보솜 단백질 S6은 18 S rRNA의 1개의 분자와 함께 작은 40 S 리보솜 서브유닛을 포함하는 33종의 단백질 중 하나이다 (4). rpS6은 번역 개시에 요구되는 m7GpppG 5'-캡-결합 복합체와 직접적으로 상호작용하고, 세포 성장 및 세포 증식 신호에 반응하여 번역 개시를 제어하는 신호 전달 경로에 대한 조절 수렴점을 나타낸다. rpS6은 유사분열촉진 및 세포 성장 자극에 반응하여 유도성 인산화를 겪고, 이러한 인산화는 척추동물, 무척추동물, 식물 및 진균에서 보존된다 (5). 고등 진핵생물에서, 인산화는 rpS6의 카르복실 말단에서 5개의 세린 잔기: Ser-235, Ser-236, Ser-240, Ser-244 및 Ser-247의 클러스터에서 발생한다 (6). 드로소필라 rpS6은 5개의 인산화 부위의 유사한 조직을 함유하는 반면, 사카로미세스 세레비지아에에서 발견되는 상동체는 포유동물 Ser-235 및 Ser-236에 상응하는 2개의 Ser 잔기를 함유한다 (4). rpS6의 인산화는 Ser-236으로 시작하여 순차적으로 Ser-235, Ser-240, Ser-244 및 Ser-247의 인산화가 이어지는 규칙적인 방식으로 일어난다 (7, 8). C-말단 잔기 상에서의 rpS6의 인산화는 m7GpppG 캡에 대한 그의 친화도를 증진시키며, 이는 rpS6 인산화가 mRNA 번역 개시를 증진시킨다는 것을 강하게 암시한다.

rpS6의 카르복실-말단 인산화는 적어도 2개의 신호 전달 경로에 의해 조절된다. p70 리보솜 S6 키나제인 S6K1 및 S6K2는 인슐린, 혈청 및 아미노산 자극에 반응하여 rpS6 C 말단 인산화에서 주요 역할을 한다 (4). S6K1 및 S6K2는 무손상 세포에서 Ser-240 및 Ser-244를 인산화하지만 Ser-235 및 Ser-236 인산화에는 불필요하다 (13). S6K1 및 S6K2의 활성은 차례로, 성장 및 유사분열촉진 신호에 반응하는, 라파마이신의 포유동물 표적인 mTOR에 의해 직접 조절된다. 라파마이신을 사용한 mTOR의 억제는 포유동물 세포에서 rpS6 인산화의 급격한 감소를 유발한다 (14). mTOR은 또한 번역 리프레서 4E-BP1을 인산화시켜 m7GpppG 5'-캡-결합 복합체로부터 그의 해리를 유발하고, S6K 및 4E-BP1의 조합된 인산화를 통해, mTOR은 유리한 성장 조건에 반응하여 단백질 번역을 양성으로 조절한다. RAS/ERK 경로 또한 p90 리보솜 S6K 키나제인 RSK1 및 RSK2의 활성화를 통해 mTOR과 독립적으로 rpS6 인산화를 조절한다 (12). RSK1 및 RSK2는 포르볼 에스테르, 혈청 및 종양원성 RAS에 반응하여 Ser-235 및 Ser-236 상에서 rpS6을 인산화시키고, 두 잔기의 인산화는 캡 결합에 요구된다 (13).

본 발명의 목적은 상기 언급된 문제들 중 적어도 하나를 극복하는 것이다.

본 출원인은 용량-의존적 방식으로 시험관내 세포 검정 (도 1-10, 12)에서 다양한 범위의 농도에 걸쳐 리보솜 단백질 S6 (rpS6)을 인산화시킬 수 있는 비시아 파바(Vicia Faba) 단백질로부터 유래된 다수의 펩티드를 발견하였다. RPS6은 단백질 키나제에 대한 주요 기질이고, 세포 성장 및 세포 분열 동안 성장 인자 및 미토겐에 의해 인산화된다. 이는 골격근 조직 내 새로운 단백질의 합성에서의 주요 단계이다. 기재된 펩티드는 또한, 직접 연결되어 단백질 분해를 증가시켜 진행성 골격근 위축을 유발하는 mRNA 전사체 (TRIM63 및 FBXO32)의 발현을 감소시키는 능력을 갖는다 (도 14-15). 또한, 근육 위축의 증가는 순환 TNFα의 전신 상승과 연관된다. 본원에 기재된 펩티드 중 일부는 또한 순환 면역 세포에서 TNFα의 감소된 발현을 유발한다. 펩티드는 대상체, 특히 근육 위축을 나타내는 대상체, 예를 들어 고령 대상체, 신체적으로 비활동적인 사람, 및 근육 위축을 특징으로 하는 적응증 (즉, MS 및 소아마비)을 갖는 대상체에서 근육 성장 및 근육 건강을 촉진하고, 근육 손실을 감소시키고, 면역 및/또는 염증 반응을 지지하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 제1 측면에 따르면, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 펩티드 또는 그의 기능적 변이체 (이하 "본 발명의 펩티드")가 제공된다:

TIKLPAGT 서열식별번호: 1

IEDPGQFPT 서열식별번호: 2

HLPSYSPSPQ 서열식별번호: 3

KGDIIAIPSGIPY 서열식별번호: 4

LDWYKGPT 서열식별번호: 5

SRGPIYSN 서열식별번호: 6

LERGDTIKIPAGT 서열식별번호: 7

TIKIPAGT 서열식별번호: 8

SYSPSPQ 서열식별번호: 9

IGSSSSPDIYNPQAGRIKT 서열식별번호: 10

IDPNGLHLPSYSPSPQL 서열식별번호: 11

LVNRDDEEDLRVLDLVIP 서열식별번호: 12

ITGQVLHPNGGTVVNA 서열식별번호: 13

ALEPDNR 서열식별번호: 14

LREQSQQNECQLER 서열식별번호: 15

VAGKGIPWDKQDPGEEAIES 서열식별번호: 16

VGRRGGQHQQEEESEEQKD 서열식별번호: 17

YDEEKEQGEEEIRK 서열식별번호: 18

HLPSYSPSP 서열식별번호: 19

SYSPSP 서열식별번호: 20.

한 실시양태에서, 펩티드는 서열식별번호: 20을 포함한다. 이러한 펩티드의 예는 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 11 및 서열식별번호: 19를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 변형된 본 발명의 펩티드를 제공한다. 펩티드는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 N-말단, C-말단 또는 아미노산 측쇄 변형에 의해, PEG화에 의해, 고리화에 의해 또는 지질화에 의해 변형될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 결합 파트너에 접합된 (일반적으로 공유 접합된) 본 발명의 펩티드를 포함하는 접합체를 제공한다.

용어 "본 발명의 펩티드"는 변형된 펩티드 및 접합체를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 펩티드 중 1개 이상 또는 모두, 예를 들어 본 발명의 펩티드 중 1, 2, 3, 4 또는 5개를 포함하는 조성물을 제공한다.

한 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 20, 예를 들어 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 11 및 서열식별번호: 19 중 1, 2, 3개 또는 모두를 포함하는 펩티드를 포함한다.

한 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 8, 예를 들어 서열식별번호: 7 및 서열식별번호: 8을 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 펩티드를 포함한다.

한 실시양태에서, 조성물은 추가의 펩티드를 임의로 포함하는 분말이다. 분말은 펩티드로 보충될 수 있고/거나 식용 분말로서 제공될 수 있는 단백질 가수분해물일 수 있다. 한 실시양태에서, 분말은 약 0.0001 내지 약 1.0%, 약 0.0001 내지 약 0.2%, 약 0.001 내지 약 0.1%, 또는 약 0.001 내지 약 0.1%의 하나 이상의 본 발명의 펩티드 (w/w)를 포함한다. 한 실시양태에서, 분말에는 완전 단백질이 실질적으로 없다. 한 실시양태에서, 조성물은 식품, 음료 또는 식이성 보충제이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 국소 조성물이다.

한 실시양태에서, 분말은 서열식별번호: 1 및 3의 펩티드를 전형적으로 약 0.01 내지 0.2% (w/w)의 양으로 포함한다.

한 실시양태에서, 분말은 서열식별번호: 1, 2, 3 및 5의 펩티드를 전형적으로 약 0.001 내지 0.2% (w/w)의 양으로 포함한다.

한 실시양태에서, 분말은 서열식별번호: 1, 2, 3, 4 및 5의 펩티드를 전형적으로 약 0.001 내지 0.2% (w/w)의 양으로 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 펩티드를 제약상 허용되는 부형제와 조합하여 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 펩티드 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 근육 위축을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 치료제는 본 발명의 펩티드 또는 조성물을 포함하는 제약 조성물에 의해, 식이성 보충제에 의해, 또는 식품 또는 음료에 의해 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체는 고령 대상체 또는 신체적으로 비활동적인 대상체, 예를 들어 신체 손상을 갖는 대상체이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 펩티드 또는 조성물을 근육 위축을 특징으로 하는 질환 또는 상태를 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 근육 위축을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 근육 위축을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 예는 신체 손상, 섭식 장애, 대사 질환 (제I형 및 제II형 당뇨병 포함), 및 뉴런, 근육 또는 관절 변성을 특징으로 하는 질환, 예컨대 ALS, MS, 근육 이영양증, 길랑-바레 증후군, 골관절염, 소아마비, 류마티스 관절염, 척수성 근육 위축, 악액질, 근육감소증, 영양실조 및 다발근염을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 펩티드 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 근육 합성을 촉진하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 펩티드 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 근육 손실을 감소시키는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 펩티드 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 또는 염증 반응을 지지하거나 증진시키는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 펩티드 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 근육 파괴 기간 동안 (예를 들어, 웨이트 운동 동안) 근육을 보호하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 펩티드 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 근육 섬유 (특히 유형 I 또는 유형 II 근육 섬유)의 존재비를 증가시키는 방법을 제공한다.

임의의 실시양태에서, 대상체는 건강하거나, 젊거나 또는 고령일 수 있다.

임의의 실시양태에서, 펩티드 또는 조성물은 경구로 (예를 들어, 음료, 식품 또는 제약 조성물로) 투여될 수 있다.

임의의 실시양태에서, 펩티드는 서열식별번호: 20을 포함한다. 이러한 펩티드의 예는 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 11 및 서열식별번호: 19를 포함한다.

임의의 실시양태에서, 펩티드는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 8, 예를 들어 서열식별번호: 7 및 서열식별번호: 8을 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포에서의 본 발명의 펩티드의 이종 발현을 위해 구성된, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터 (이하 "본 발명의 발현 벡터")를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 이종 발현하도록 조작된 숙주 세포, 특히 박테리아 또는 포유동물 생산자 세포 (이하 "본 발명의 형질전환된 세포")를 제공한다. 한 실시양태에서, 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 발현 벡터를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 형질전환된 세포를 제공하는 단계, 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 숙주 세포에 의한 본 발명의 재조합 펩티드의 이종 발현을 실시하는 단계, 및 본 발명의 재조합 펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 세포를 본 발명의 발현 벡터로 형질전환시키는 단계를 포함하며, 이에 따라 형질전환된 세포는 본 발명의 펩티드의 이종 발현이 가능한 것인, 본 발명의 펩티드의 이종 발현을 위해 세포를 조작하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면 및 바람직한 실시양태는 하기 제시된 다른 청구범위에 정의되고 기재되어 있다.

도 1: 다양한 펩티드 농도에서의 서열식별번호: 1의 rpS6 인산화 활성.
도 2: 다양한 펩티드 농도에서의 서열식별번호: 2의 rpS6 인산화 활성.
도 3: 다양한 펩티드 농도에서의 서열식별번호: 3의 rpS6 인산화 활성.
도 4: 다양한 펩티드 농도에서의 서열식별번호: 4의 rpS6 인산화 활성.
도 5: 다양한 펩티드 농도에서의 서열식별번호: 5의 rpS6 인산화 활성.
도 6: 0.5 μg/ml에서의 펩티드 서열식별번호: 1 내지 5의 rpS6 인산화 활성.
도 7: 고갈 프로토콜에 따라 20분 동안 0.05 μg/ml에서의 펩티드 서열식별번호: 8; 서열식별번호: 1; 서열식별번호: 3; 서열식별번호: 10; 서열식별번호: 16; 서열식별번호: 11; 서열식별번호: 12; 서열식별번호: 17; 서열식별번호: 18의 rpS6 인산화 활성 (일원 ANOVA 분석; *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001; 평균 ± SEM; N=4).
도 8: S6 인산화에 대한 서열식별번호: 6의 효과. C2C12 세포를 고갈 프로토콜에 따라 30분 동안 펩티드 (0.005 - 0.5 μg/ml)로 처리하였다 (스튜던트 t 검정 또는 일원 ANOVA 분석; *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001; 평균 ± SEM; N=4).
도 9: S6 인산화에 대한 모티프 SYSPSP (서열식별번호: 20)를 함유하는 서열식별번호: 9의 효과. C2C12 세포를 고갈 프로토콜에 따라 30분 동안 펩티드 (5 μg/ml)로 처리하였다 (스튜던트 t 검정 또는 일원 ANOVA 분석; *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001; 평균 ± SEM; N=4).
도 10: S6 인산화에 대한 모티프 SYSPSP (서열식별번호: 20)를 함유하는 서열식별번호: 11의 효과. C2C12 세포를 고갈 프로토콜에 따라 30분 동안 펩티드 (0.005 - 0.5 μg/ml)로 처리하였다 (스튜던트 t 검정 또는 일원 ANOVA 분석; *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001; 평균 ± SEM; N=4).
도 11: TNF-α 분비에 대한 펩티드 처리의 효과. THP-1 대식세포를 뉴리타스 펩티드 (0.5 μg/ml)로 24시간 동안 처리한 다음, LPS (100 ng/ml)로 24시간 동안 자극하였다. 서열식별번호: 14; 서열식별번호: 8; 서열식별번호: 13; 서열식별번호: 15. (일원 ANOVA 분석; *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001; 평균 ± SEM; N=4).
도 12: S6 인산화에 대한 펩티드 처리의 효과. C2C12 세포를 고갈 프로토콜에 따라 30분 동안 서열식별번호: 2 (0.5 - 5 μg/ml)로 처리하였다. (일원 ANOVA 분석; *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001; 평균 ± SEM; N=3).
도 13: TNF-α 분비에 대한 펩티드 처리의 효과. THP-1 대식세포를 서열식별번호: 2 (0.05 - 5 μg/ml)로 24시간 동안 처리한 다음, LPS (100 ng/ml)로 24시간 동안 자극하였다. (일원 ANOVA 분석; *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001; 평균 ± SEM; N=3).
도 14: 위축 관련 유전자 발현에 대한 누리타스 펩티드의 효과. TRIM63 (N=6) 유전자 발현에 대한 서열식별번호: 19 (SYSPSP 모티프를 함유함)의 효과를 나타내는 위축 유발 C2C12 세포에 대해 PCR 분석을 수행하였다. 세포를 덱사메타손 (0.3 μg/ml)으로 24시간 동안 처리하고, 덱사메타손 처리 종료 30분 전에 pep_MU12PE (0.5 - 5 μg/ml)를 첨가하였다. (일원 ANOVA 분석; *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001; 평균 ± SEM).
도 15: 위축 관련 유전자 발현에 대한 누리타스 펩티드의 효과. FBXO (N=5) 유전자 발현에 대한 서열식별번호: 19 (SYSPSP 모티프를 함유함)의 효과를 나타내는 위축 유도 C2C12 세포에 대해 PCR 분석을 수행하였다. 세포를 덱사메타손 (0.3 μg/ml)으로 24시간 동안 처리하고, 덱사메타손 처리 종료 30분 전에 pep_MU12PE (0.5 - 5 μg/ml)를 첨가하였다. (일원 ANOVA 분석; *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001; 평균 ± SEM).
도 16: NPN_1 (서열식별번호: 3 및 8을 포함하는 분말 조성물)은 무부하 후 가자미근에서의 근육 손실을 유의하게 방지하였다. C57BL/6 마우스를 18일의 과정에 걸쳐 BBI (113.3 mg/kg/일), 카세인 (650 mg/kg/일) 또는 NPN_1 (650 mg/kg/일)로 치료하였다. (일원 ANOVA 분석; *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001; N=10).
도 17: NPN_1은 결합 조직 및 근육간 지방의 양을 감소시키고, 근섬유 밀도를 증가시킨다. A) NPN_1의 효과를 입증하는, 유형-I (적색) & 유형 IIa (녹색) 근육 섬유 밀도에 대한 골격근 면역염색, 및 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색. 유형 I (B) 및 유형 IIa (C) 섬유 밀도에 대한 치료 효과의 정량화 (*p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001; N=5).

본원에 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 다른 참고문헌은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되도록 지시된 것처럼 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함되며, 그 내용은 완전히 인용된다.

정의 및 일반적 선호도

본원에 사용되고 달리 구체적으로 나타내지 않는 한, 하기 용어들은 이러한 용어가 관련 기술분야에서 누릴 수 있는 임의의 보다 넓은 (또는 보다 좁은) 의미에 추가로 하기 의미를 갖는 것으로 의도된다:

문맥상 달리 요구되지 않는 한, 본원에서 단수의 사용은 복수를 포함하는 것으로 해석되어야 하며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 실재물과 관련하여 사용된 단수 용어 ("a" 또는 "an")는 이러한 실재물 중 하나 이상을 지칭하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 용어 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

본원에 사용된 용어 "포함하다", 또는 그의 변형, 예컨대 "포함한다" 또는 "포함하는"은 임의의 언급된 정수 (예를 들어, 특색, 요소, 특징, 특성, 방법/공정 단계 또는 제한) 또는 정수들 군 (예를 들어, 특색들, 요소들, 특징들, 특성들, 방법/공정 단계들 또는 제한들)을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수들 군을 배제하지 않는다는 것을 나타내는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "포함하는"은 포괄적이거나 또는 개방형이며, 추가의 언급되지 않은 정수 또는 방법/공정 단계를 배제하지 않는다.

본원에 사용된 용어 "질환"은 생리학적 기능을 손상시키고 구체적인 증상과 연관된 임의의 비정상적 상태를 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 병인의 성질 (또는 실제로 질환에 대한 병인학적 기초가 확립되었는지의 여부)에 상관없이 생리학적 기능이 손상된 임의의 장애, 질병, 이상, 병리상태, 병, 상태 또는 증후군을 포괄하기 위해 광범위하게 사용된다. 따라서, 이는 감염, 외상, 손상, 수술, 방사선 절제, 중독 또는 영양 결핍으로부터 발생하는 상태를 포괄한다.

본원에 사용된 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 질환의 증상을 치유, 호전 또는 경감시키거나, 또는 그의 원인(들)을 제거하는 (또는 그의 영향을 경감시키는) 개입 (예를 들어, 대상체에게 작용제를 투여하는 것)을 지칭한다. 이 경우, 상기 용어는 용어 "요법"과 동의어로 사용된다.

추가로, 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 질환의 발병 또는 진행을 예방 또는 지연시키거나, 또는 치료된 집단 내에서 그의 발병률을 감소시키는 (또는 근절하는) 개입 (예를 들어, 대상체에게 작용제를 투여하는 것)을 지칭한다. 이 경우, 용어 치료는 용어 "예방"과 동의어로 사용된다.

본원에 사용된 본 발명의 펩티드의 유효량 또는 치료 유효량은 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 합리적인 이익/위험 비에 부합하여 대상체에게 투여될 수 있지만, 목적하는 효과, 예를 들어 대상체의 상태에서의 영구적 또는 일시적 개선으로써 나타나는 치료 또는 예방을 제공하기에 충분한 양을 정의한다. 이러한 양은 개체의 연령 및 일반적 상태, 투여 방식 및 다른 요인에 따라 대상체마다 달라질 것이다. 따라서, 정확한 유효량을 특정하는 것이 가능하지는 않지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험 및 배경 일반 지식을 사용하여 임의의 개별 경우에 적절한 "유효량"을 결정할 수 있을 것이다. 이러한 맥락에서의 치료 결과는 증상의 근절 또는 경감, 통증 또는 불편함 감소, 장기 생존, 이동성 개선, 및 다른 임상 개선 마커를 포함한다. 치료 결과는 완전한 치유일 필요는 없다.

상기 정의된 바와 같은 치료 및 유효량과 관련하여, 용어 대상체 (문맥상 허용되는 경우에 "개체", "동물", "환자" 또는 "포유동물"을 포함하는 것으로 해석되어야 함)는 치료가 지시되는 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 정의한다. 포유동물 대상체는 인간, 가축, 농장 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물, 애완 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 젖소; 영장류, 예컨대 유인원, 원숭이, 오랑우탄 및 침팬지; 갯과 동물, 예컨대 개 및 늑대; 고양이과, 예컨대 고양이, 사자 및 호랑이; 에퀴드, 예컨대 말, 당나귀 및 얼룩말; 식용 동물, 예컨대 젖소, 돼지 및 양; 유제류, 예컨대 사슴 및 기린; 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터 및 기니 피그 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

본원에 사용된 용어 "펩티드"는 전형적으로 펩티드 결합 연결을 통해 5 내지 50개의 아미노산 단량체로 구성된 중합체를 지칭한다. 본 발명의 펩티드 및 본 발명에서 사용하기 위한 펩티드 (그의 단편 및 변이체 포함)는 화학적 합성에 의해 또는 핵산으로부터의 발현에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드 및 본 발명에 사용하기 위한 펩티드는 널리 확립된 표준 액체, 또는 바람직하게는 관련 기술분야에 공지된 고체-상 펩티드 합성 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984), in M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984)] 참조). 필요한 경우, 본 발명에 사용된 펩티드 중 임의의 것을 화학적으로 변형시켜 그의 안정성을 증가시킬 수 있다. 화학적으로 변형된 펩티드 또는 펩티드 유사체는 본 발명의 실시와 관련하여 생체내 또는 시험관내에서 그의 증가된 안정성 및/또는 효능을 특징으로 하는 펩티드의 임의의 기능적 화학적 등가물을 포함한다. 용어 펩티드 유사체는 또한 본원에 기재된 바와 같은 펩티드의 임의의 아미노산 유도체를 지칭한다. 펩티드 유사체는 측쇄에 대한 변형, 펩티드 합성 동안 비천연 아미노산 및/또는 그의 유도체의 혼입 및 가교제의 사용, 및 펩티드 또는 그의 유사체에 입체형태적 제약을 부여하는 다른 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 절차에 의해 생산될 수 있다. 측쇄 변형의 예는, 예컨대 알데히드와의 반응에 이은 NaBH4를 이용한 환원에 의한 환원성 알킬화에 의한 아미노 기의 변형; 메틸아세트이미데이트를 이용한 아미드화; 아세트산 무수물을 이용한 아세틸화; 시아네이트를 이용한 아미노 기의 카르바밀화; 2,4,6,트리니트로벤젠 술폰산 (TNBS)을 이용한 아미노 기의 트리니트로벤질화; 숙신산 무수물 및 테트라히드로프탈산 무수물을 이용한 아미노 기의 알킬화; 및 피리독사-5'-포스페이트를 이용한 리신의 피리독실화에 이은 NABH4를 이용한 환원에 의한 아미노 기의 변형을 포함한다. 아르기닌 잔기의 구아니디노 기는 시약, 예컨대 2,3-부탄디온, 페닐글리옥살 및 글리옥살을 이용한 헤테로시클릭 축합 생성물의 형성에 의해 변형될 수 있다. 카르복실 기는 o-아실이소우레아 형성을 통한 카르보디이미드 활성화에 이어서, 예를 들어 상응하는 아미드로의 후속 유도체화에 의해 변형될 수 있다. 술프히드릴 기는 아이오도아세트산 또는 아이오도아세트아미드를 사용한 카르복시메틸화; 시스테산으로의 퍼포름산 산화; 다른 티올 화합물과 혼합된 디술피드의 형성; 말레이미드, 말레산 무수물 또는 다른 치환된 말레이미드와의 반응; 4-클로로머큐리벤조에이트, 4-클로로머큐리페닐술폰산, 페닐머큐리 클로라이드, 2-클로로머큐릭-4-니트로페놀 및 다른 수은을 이용한 수은 유도체의 형성; 알칼리성 pH에서 시아네이트를 사용한 카르바밀화와 같은 방법에 의해 변형될 수 있다. 트립토판 잔기는, 예를 들어 N-브로모숙신이미드를 이용한 산화 또는 2-히드록시-5-니트로벤질 브로마이드 또는 술포닐 할라이드를 이용한 인돌 고리의 알킬화에 의해 변형될 수 있다. 티로신 잔기는 테트라니트로메탄을 이용한 니트로화에 의해 3-니트로티로신 유도체를 형성함으로써 변경될 수 있다. 히스티딘 잔기의 이미다졸 고리의 변형은 아이오도아세트산 유도체를 이용한 알킬화 또는 디에틸피로카르보네이트를 이용한 N-카르브에톡실화에 의해 달성될 수 있다. 펩티드 합성 동안 비천연 아미노산 및 유도체를 혼입하는 예는 노르류신, 4-아미노 부티르산, 4-아미노-3-히드록시-5-페닐펜탄산, 6-아미노헥산산, t-부틸글리신, 노르발린, 페닐글리신, 오르니틴, 사르코신, 4-아미노-3-히드록시-6-메틸헵탄산, 2-티에닐 알라닌 및/또는 아미노산의 D-이성질체의 사용을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 펩티드 구조 변형은 D-아미노산에 의해 코딩되는 역전된 서열을 포함하는 레트로-인버소 펩티드의 생성을 포함한다.

용어 "본 발명의 펩티드"는 집합적으로 서열식별번호: 1 내지 20으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 펩티드, 및 그의 치료상 유효한 변이체를 지칭한다. 본 발명의 펩티드는 재조합 펩티드일 수 있다.

참조 펩티드에 적용된 용어 "치료상 유효한 변이체"는 참조 펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 의미하고, 이는 하기 정의된 바와 같이 치료상 유효하다. 따라서, 예를 들어 상기 용어는 1개 이상의 아미노산 잔기와 관련하여 변경된 변이체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 바람직하게는, 이러한 변경은 5개 이하의 아미노산, 보다 바람직하게는 4개 이하, 보다 더 바람직하게는 3개 이하, 가장 바람직하게는 단지 1 또는 2개의 아미노산의 삽입, 부가, 결실 및/또는 치환을 수반한다. 천연 및 변형된 아미노산을 이용한 삽입, 부가 및 치환이 고려된다. 변이체는 도입되는 아미노산이 치환되는 것과 구조적으로, 화학적으로 또는 기능적으로 유사한 보존적 아미노산 변화를 가질 수 있다. 일반적으로, 변이체는 참조 항박테리아 단편과 적어도 70% 아미노산 서열 상동성, 바람직하게는 적어도 80% 서열 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 90% 서열 상동성, 이상적으로는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 상동성을 가질 것이다. 본 명세서에서, 용어 "서열 동일성"은 서열 동일성 및 유사성 둘 다를 포함하는 것으로 이해되어야 하며, 즉 참조 서열과 70% 서열 동일성을 공유하는 변이체 (또는 상동체)는 변이체 (또는 상동체)의 정렬된 잔기의 임의의 70%가 서열의 전체 길이에 걸쳐 참조 서열 내의 상응하는 잔기와 동일하거나 또는 그의 보존적 치환인 것이다. 서열 동일성은 2개의 상이한 서열 간에 정확하게 매칭되는 문자의 양이다. 이로써, 갭은 계수되지 않고, 측정은 2개의 서열 중 보다 짧은 것과 관련된다. "서열 상동성"의 측면에서, 상기 용어는 변이체 (또는 상동체)의 정렬된 잔기의 백분율이 참조 서열 내의 상응하는 잔기와 동일하거나 또는 그의 보존적 치환인 경우 및 변이체 (또는 상동체)가 참조 서열과 동일한 기능을 공유하는 경우에 참조 서열과 규정된 퍼센트 유사성 또는 동일성을 공유하는 변이체 (또는 상동체)를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

이러한 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 관련 기술분야에 공지된 소프트웨어 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 예를 들어 하나의 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST이다. 이들 프로그램의 세부사항은 다음 인터넷 주소에서 찾아볼 수 있다: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi.

근육 합성과 관련하여 본 발명의 펩티드에 적용되는 "치료상 유효한"은 하기 기재된 포스포-S6 세포 검정에서 대조군과 비교하여 rpS6 인산화의 유의한 증가를 달성할 수 있는 펩티드를 의미한다. 이는 특히 서열식별번호: 1-3, 8-12 및 16-20의 펩티드에 적용된다.

면역 또는 염증 반응을 지지하는 것과 관련하여 본 발명의 펩티드에 적용되는 "치료상 유효한"은 하기 기재된 TNF-알파 분비 세포 검정에서 대조군과 비교하여 THP-1 대식세포에서 TNF-알파 분비를 감소시킬 수 있는 펩티드를 의미한다. 이는 특히 서열식별번호: 2, 8 및 13-15의 펩티드에 적용된다.

"조성물": 본 발명은 또한 본 발명의 펩티드 중 하나 이상을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 펩티드, 또는 펩티드의 일부 또는 전부는 변형되거나 또는 접합체로서 제공될 수 있다. 조성물은 식품 성분 분말, 식품 음료, 식이성 보충제, 제약 조성물 또는 국소 조성물일 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물은 스포츠 영양 제품, 예를 들어 음료, 스낵 또는 보충제이다. 한 실시양태에서, 조성물은 음료이다. 한 실시양태에서, 조성물은 베이커리 제품이다. 한 실시양태에서, 조성물은 유제품이다. 한 실시양태에서, 조성물은 스낵 제품이다. 한 실시양태에서, 조성물은 구운 압출 식품이다. 한 실시양태에서, 조성물은 분유이다. 한 실시양태에서, 조성물은 영아용 분유 제품이다. 한 실시양태에서, 조성물은 과자류 제품이다. 한 실시양태에서, 조성물은 요거트이다. 한 실시양태에서, 조성물은 요거트 음료이다. 한 실시양태에서, 조성물은 아이스크림 제품이다. 한 실시양태에서, 조성물은 동결 식품이다. 한 실시양태에서, 조성물은 조식용 시리얼이다. 한 실시양태에서, 조성물은 빵이다. 한 실시양태에서, 조성물은 향미 우유 음료이다. 한 실시양태에서, 조성물은 과자류 바이다. 한 실시양태에서, 조성물은 차 또는 차 제품이다. 한 실시양태에서, 조성물은 구운 압출 스낵 제품이다. 한 실시양태에서, 조성물은 튀긴 스낵 제품이다. 한 실시양태에서, 조성물은 영양 보충제이다. 한 실시양태에서, 조성물은 스포츠 영양 제품이다. 한 실시양태에서, 조성물은 이유식 제품이다. 한 실시양태에서, 조성물은 면역손상 개체를 위한 특수 식품이다. 한 실시양태에서, 조성물은 노인 환자를 위한 식품이다. 한 실시양태에서, 조성물은 동물 사료이다. 한 실시양태에서, 조성물은 동물 사료 보충제이다. 한 실시양태에서, 조성물은 의료용 식품이다.

조성물은 국소 또는 제약 조성물일 수 있다. 본 발명의 펩티드는 본 발명의 국소 또는 제약 조성물에서 목적하는 효과를 달성하기 위한 치료 유효 농도로 사용된다; 조성물의 총 중량에 대해 바람직한 형태로, 0.00000001% (중량) 내지 20% (중량); 바람직하게는 0.000001% (중량) 내지 15% (중량), 보다 바람직하게는 0.0001% (중량) 내지 10% (중량), 보다 더 바람직하게는 0.0001% (중량) 내지 5% (중량). 이상적으로, 본 발명의 펩티드는 바람직하게는 조성물의 약 0.00001% w/w 내지 약 0.5% w/w [0.1 내지 5000 ppm], 더욱 바람직하게는 0.00005 w/w 내지 약 0.05 w/w [0.5 내지 500 ppm], 가장 바람직하게는 약 0.0001 w/w 내지 약 0.01 w/w [1 내지 100 ppm]로 사용된다. 이상적으로, 본 발명의 펩티드는 바람직하게는 조성물의 약 0.0001% w/w 내지 약 0.004% w/w로 사용된다.

식제품 및 식품 또는 영양 보충제 (즉, 식용 조성물)에 사용하기 위한 본 발명의 조성의 투여량은 광범위하게 0.2-100 g/일 범위일 것이다. 한 실시양태에서, 1일 투여량은 1-10 g/일, 이상적으로는 약 3-8 g/일이다. 한 실시양태에서, 1일 투여량은 10-20 g/일이다. 한 실시양태에서, 1일 투여량은 20-30 g/일이다. 한 실시양태에서, 1일 투여량은 30-40 g/일이다. 한 실시양태에서, 1일 투여량은 10-100 g/일이다. 한 실시양태에서, 1일 투여량은 약 5 g/일, 이상적으로는 약 3-8 g/일이다. 한 실시양태에서, 투여량은 2-1000 mg/일/kg 체중이다. 한 실시양태에서, 투여량은 10-500 mg/일/kg 체중이다. 한 실시양태에서, 투여량은 10-100 mg/일/kg 체중이다. 한 실시양태에서, 투여량은 30-70 mg/일/kg 체중이다. 식품 보충제에 대한 본 발명의 펩티드의 투여량은 1일 또는 용량 당 0.00001 mg-0.01 mg일 수 있다.

식제품은 의료적 감독 하에 치료받고 있는 개체의 질환, 장애 또는 의학적 상태의 식이 관리를 위해 특별히 제제화되고 가공되고 의도된 식품으로서 정의되는 특수 의약 목적 식품 (FSMP)일 수 있다. 이들 식품은 정상 식품에 의해 영양 요건이 충족될 수 없는 사람들의 독점적 또는 부분적 급식을 위해 의도된다. 용량은 환자의 연령 및 상태에 따라 1일에 50-500 g일 수 있다. 특수 의약 목적 식품 또는 의료용 식품으로서 투여되는 경우, 1일 투여량은 50-500 g/일일 수 있다.

"국소 조성물": 본 발명은 또한 본 발명의 펩티드 또는 조성물을 포함하는 국소 조성물에 관한 것이다. 국소 조성물이 복수의 펩티드를 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 한 실시양태에서, 국소 조성물은 실질적으로 모든 펩티드를 포함한다. 본 발명의 국소 조성물은 크림, 다중 에멀젼, 무수 조성물, 수분산액, 오일, 밀크, 발삼, 폼, 로션, 겔, 크림 겔, 히드로-알콜성 용액, 히드로-글리콜 용액, 화장품, 개인 관리 제품, 히드로겔, 도찰제, 세럼, 비누, 산포제, 페이스트, 반고체 제제, 도찰제, 세럼, 샴푸, 컨디셔너, 연고, 임의의 헹궈내는 제제, 탈크, 무스, 분말, 스프레이, 에어로졸, 용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 엘릭시르, 폴리사카라이드 필름, 패치, 겔 패치, 붕대, 접착제 시스템, 유중수 에멀젼, 수중유 에멀젼, 및 실리콘 에멀젼을 포함하는 군으로부터 선택된 제제로 제공될 수 있다.

"제약 조성물": 본 발명의 추가 측면은 하나 이상의 제약상 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체와 혼합된 본 발명의 펩티드 또는 본 발명의 펩티드의 조성물을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드 및 조성물은 단독으로 투여될 수 있지만, 이들은 일반적으로 특히 인간 요법을 위해 제약 담체, 부형제 또는 희석제와 혼합하여 투여될 것이다. 제약 조성물은 인간 및 수의학에서 인간 또는 동물 사용을 위한 것일 수 있다. 본원에 기재된 제약 조성물의 다양한 상이한 형태에 적합한 부형제의 예는 문헌 ["Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Weller]에서 찾아볼 수 있다. 특히, 국소 전달용 제제는 문헌 [Topical drug delivery formulations edited by David Osborne and Antonio Aman, Taylor & Francis]에 기재되어 있으며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 치료 용도를 위해 허용되는 담체 또는 희석제는 제약 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)]에 기재되어 있다. 적합한 담체의 예는 락토스, 전분, 글루코스, 메틸 셀룰로스, 스테아르산마그네슘, 만니톨, 소르비톨 등을 포함한다. 적합한 희석제의 예는 에탄올, 글리세롤 및 물을 포함한다. 제약 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도된 투여 경로 및 표준 제약 실시와 관련하여 선택될 수 있다. 제약 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제로서 또는 그에 추가로 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁화제(들), 코팅제(들), 가용화제(들)를 포함할 수 있다. 적합한 결합제의 예는 전분, 젤라틴, 천연 당, 예컨대 글루코스, 무수 락토스, 자유-유동 락토스, 베타-락토스, 옥수수 감미제, 천연 및 합성 검, 예컨대 아카시아, 트라가칸트 또는 알긴산나트륨, 카르복시메틸 셀룰로스 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 적합한 윤활제의 예는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨 등을 포함한다. 보존제, 안정화제, 염료 및 심지어 향미제가 제약 조성물에 제공될 수 있다. 보존제의 예는 벤조산나트륨, 소르브산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 항산화제 및 현탁화제가 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 펩티드 또는 조성물은 국소, 경구, 직장, 비경구, 근육내, 복강내, 동맥내, 기관지내, 피하, 피내, 정맥내, 비강, 질, 협측 또는 설하 투여 경로에 적합할 수 있다. 경구 투여의 경우, 압축 정제, 환제, 정제, 겔룰, 점적제 및 캡슐이 특히 사용된다. 바람직하게는, 이들 조성물은 용량당 1 내지 250 mg, 보다 바람직하게는 10-100 mg의 활성 성분을 함유한다. 다른 투여 형태는 정맥내, 동맥내, 피하, 피내, 복강내 또는 근육내 주사될 수 있고, 멸균 또는 멸균가능한 용액으로부터 제조되는 용액 또는 에멀젼을 포함한다. 본 발명의 제약 조성물은 좌제, 질 링, 페사리, 현탁액, 에멀젼, 로션, 연고, 크림, 겔, 스프레이, 용액 또는 산포제의 형태일 수도 있다. 본 발명의 조성물은 국소 전달용으로 제제화될 수 있다. 국소 전달은 일반적으로 피부로의 전달을 의미하지만, 또한 상피 세포로 라이닝된 체강, 예를 들어 폐 또는 기도, 위장관, 협강으로의 전달을 의미할 수 있다. 특히, 국소 전달용 제제는 문헌 [Topical drug delivery formulations edited by David Osborne and Antonio Aman, Taylor & Francis]에 기재되어 있으며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 기도로의 전달을 위한 조성물 또는 제제는 문헌 [O'Riordan et al. (Respir Care, 2002, Nov. 47)], EP2050437, WO2005023290, US2010098660, 및 US20070053845에 기재되어 있다. 활성제를 회장, 특히 근위 회장에 전달하기 위한 조성물 및 제제는 마이크로입자 및 마이크로캡슐을 포함하며, 여기서 활성제는 내산성이지만 회장의 보다 알칼리성 환경에서 용해되기 쉬운 중합체 또는 유 단백질로 형성된 보호 매트릭스 내에 캡슐화된다. 이러한 전달 시스템의 예는 EP1072600.2 및 EP13171757.1에 기재되어 있다. 경피 투여의 대안적 수단은 피부 패치의 사용에 의한 것이다. 예를 들어, 활성 성분이 폴리에틸렌 글리콜 또는 액체 파라핀의 수성 에멀젼으로 이루어진 크림에 혼입될 수 있다. 활성 성분은 또한 1 내지 10 중량%의 농도로 필요에 따라 안정화제 및 보존제와 함께 백색 왁스 또는 백색 연질 파라핀 베이스로 이루어진 연고 내로 혼입될 수 있다.

주사가능한 형태는 용량당 10-1000 mg, 바람직하게는 10-250 mg의 활성 성분을 함유할 수 있다.

조성물은 단위 투여 형태로, 즉 단위 용량을 함유하거나, 또는 다수의 단위 용량 또는 단위 용량의 서브-유닛을 함유하는 별개의 부분의 형태로 제제화될 수 있다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 과도한 실험 없이 대상체에게 투여하기 위한 본 발명의 조성물 중 하나의 적절한 용량을 용이하게 결정할 수 있다. 전형적으로, 의사는 개별 환자에 가장 적합할 실제 투여량을 결정할 것이고, 이는 사용되는 구체적 화합물의 활성, 그 화합물의 대사 안정성 및 작용 기간, 연령, 체중, 전반적 건강, 성별, 식이, 투여 방식 및 시간, 배출 속도, 약물 조합, 특정 상태의 중증도, 및 개별 진행중인 요법을 포함한 다양한 요인에 따라 달라질 것이다. 본원에 개시된 투여량은 평균 사례의 예이다. 물론, 보다 높거나 보다 낮은 투여량 범위가 가치가 있는 개별 경우가 있을 수 있으며, 이는 본 발명의 범주 내에 있다. 필요에 따라, 작용제는 0.01 내지 30 mg/kg 체중, 예컨대 0.1 내지 10 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1 mg/kg 체중의 용량으로 투여될 수 있다. 예시적 실시양태에서, 10 내지 300 mg/일 또는 보다 바람직하게는 10 내지 150 mg/일의 하나 이상의 용량이 염증성 장애의 치료를 위해 환자에게 투여될 것이다.

특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 본 발명의 펩티드 또는 조성물을 1종 이상의 다른 활성제, 예를 들어 시판 중인 기존의 항박테리아 약물 또는 약리학적 증진제와 조합하여 투여하는 것을 수반한다. 이러한 경우, 본 발명의 화합물은 1종 이상의 다른 활성제와 연속적으로, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 펩티드는 펩티드, 링커, 및 생체내에서 접합체의 반감기를 증가시키도록 의도된 항체 분자를 포함하는 접합체의 형태로 투여될 수 있다.

변형된 펩티드

"변형된 펩티드": 한 실시양태에서, 본 발명의 펩티드 (펩티드 변이체 포함)는 변형된 펩티드일 수 있다. 용어 "변형된 펩티드"는 용어 펩티드의 유도체와 상호교환가능하게 사용된다. 한 실시양태에서, 용어 "변형된 펩티드"는 비변형된 펩티드와 비교하여 다음 특성 중 하나 이상을 나타내도록 변형된 펩티드를 의미한다: 혈장 반감기 증가; 펩티드의 친지성 증가; 변형된 펩티드의 신장 클리어런스 증가; 및 전형적으로 rpS6 인산화 활성을 유지하면서 단백질분해적 분해에 대한 변형된 펩티드의 저항성 증가. 이들 특성을 나타내도록 본 발명의 펩티드를 변형시키는 다양한 방법이 본원에 개시되며, 이는 펩티드를 결합 파트너 (예를 들어, 알부민 결합 소분자, 큰 중합체, 긴 수명의 혈장 단백질, 또는 항체 또는 항체-단편)와 접합시키는 것, 고리화, N- 또는 C-말단, 또는 측쇄 보호기의 부가, L-아미노산을 D-이성질체로 대체하는 것, 아미노산 변형, 증가된 혈장 단백질 결합, 증가된 알부민 결합을 포함한다. 변형된 펩티드는 본원에 정의된 바와 같은 1개 이상의 기로 치환되거나, 또는 결합 파트너와 접합되거나, 또는 고리화된 펩티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로, 펩티드는 동물에서 생체내 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 변형 방법이 하기에 제공된다.

한 실시양태에서, 변형은 본 발명의 펩티드 및/또는 조성물에 증가된 세포 침투 능력을 제공하는 임의의 변형일 수 있다. 한 실시양태에서, 변형은 본 발명의 조성물 또는 펩티드의 반감기를 증가시키는 임의의 변형일 수 있다. 한 실시양태에서, 변형은 본 발명의 조성물 또는 펩티드의 활성을 증가시키는 임의의 변형일 수 있다. 한 실시양태에서, 변형은 본 발명의 조성물 또는 펩티드의 선택성을 증가시키는 임의의 변형일 수 있다.

한 실시양태에서, 기는 보호기이다. 보호기는 N-말단 보호기, C-말단 보호기 또는 측쇄 보호기일 수 있다. 펩티드는 이들 보호기 중 하나 이상을 가질 수 있다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 아미노산을 이들 보호기와 반응시키는 적합한 기술을 알고 있다. 이들 기는 관련 기술분야에 공지된 제조 방법, 예를 들어 US2014120141의 단락 [0104] 내지 [0107]에 약술된 바와 같은 방법에 의해 부가될 수 있다. 상기 기는 펩티드 상에 남아있을 수 있거나 또는 제거될 수 있다. 보호기는 합성 동안 부가될 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 펩티드는 1 내지 29개의 탄소 원자를 갖는, 히드록실, 아미노, 아미노 아실, 술페이트 또는 술피드 기로 치환 또는 비치환된, 포화 또는 불포화된 하나 이상의 직쇄 또는 분지쇄, 장쇄 또는 단쇄로부터 선택된 기로 치환될 수 있다. N-아실 유도체는 아세트산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 옥탄산, 팔미트산, 스테아르산, 베헨산, 리놀레산, 리놀렌산, 리포산, 올레산, 이소스테르산, 엘라이도산, 2-에틸헥산산, 코코넛 오일 지방산, 탈로우 지방산, 경화 탈로우 지방산, 팜핵 지방산, 라놀린 지방산 또는 이와 유사한 산으로부터 유래된 아실 기를 포함한다. 이들은 치환 또는 비치환될 수 있다. 치환되는 경우, 이들은 바람직하게는 히드록실, 또는 황 함유 기, 예컨대 비제한적으로 SO3H, SH 또는 S-S로 치환된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 펩티드는 R1-X-R2이다.

R1 및/또는 R2 기는 펩티드 서열의 아미노-말단 (N-말단) 및 카르복실-말단 (C-말단)에 각각 결합된다.

한 실시양태에서, 펩티드는 R1-X이다. 대안적으로, 펩티드는 X-R2이다.

바람직하게는, R1은 H, C1-4 알킬, 아세틸, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸이고;

X는 본 발명의 펩티드이고;

R2는 OH 또는 NH2이다.

한 실시양태에서, R1은 H, 비-시클릭 치환 또는 비치환된 지방족 기, 치환 또는 비치환된 알리시클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로시클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, Tert-부틸옥시카르보닐, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc) 및 R5-CO-에 의해 형성된 군으로부터 선택되고, 여기서 R5는 H, 비-시클릭 치환 또는 비치환된 지방족 기, 치환 또는 비치환된 알리시클릴, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로시클릴 및 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬에 의해 형성된 군으로부터 선택되고;

R2는 -NR3R4, -OR3 및 -SR3에 의해 형성된 군으로부터 선택되고, 여기서 R3 및 R4는 독립적으로 H, 비-시클릭 치환 또는 비치환된 지방족 기, 치환 또는 비치환된 알리시클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로시클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 및 치환 또는 비치환된 아르알킬에 의해 형성된 군으로부터 선택되고; 단 R1 및 R2는 α-아미노산이 아니다.

또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, R2는 -NR3R4, -OR3 또는 -SR3이고, 여기서 R3 및 R4는 H, 치환 또는 비치환된 C1-C24 알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C24 알케닐, Tert-부틸옥시카르보닐, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc), 치환 또는 비치환된 C2-C24 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C24 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C5-C24 시클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C8-C24 시클로알키닐, 치환 또는 비치환된 C6-C30 아릴, 치환 또는 비치환된 C7-C24 아르알킬, 3-10원의 치환 또는 비치환된 헤테로시클릴 고리, 및 2 내지 24개의 탄소 원자 및 탄소 이외의 1 내지 3개의 원자의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬 (여기서, 알킬 쇄는 1 내지 6개의 탄소 원자를 가짐)에 의해 형성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 임의로, R3 및 R4는 포화 또는 불포화 탄소-탄소 결합에 의해 결합되어 질소 원자와 고리를 형성할 수 있다. 보다 바람직하게는, R2는 -NR3R4 또는 -OR3이고, 여기서 R3 및 R4는 H, 치환 또는 비치환된 C1-C24 알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C24 알케닐, 치환 또는 비치환된 C2-C24 알키닐, 치환 또는 비치환된 C3-C10 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C6-C15 아릴 및 3-10원의 치환 또는 비치환된 헤테로시클릴, 3 내지 10원의 고리 및 1 내지 6개의 탄소 원자의 알킬 쇄를 갖는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬에 의해 형성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 보다 바람직하게는, R3 및 R4는 H, 메틸, 에틸, 헥실, 도데실 또는 헥사데실에 의해 형성된 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직하게는, R3은 H이고, R4는 H, 메틸, 에틸, 헥실, 도데실 또는 헥사데실에 의해 형성된 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직한 실시양태에 따르면, R2는 -OH 및 -NH2로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면 R1은 H, 아세틸, 라우로일, 미리스토일 또는 팔미토일에 의해 형성된 군으로부터 선택되고, R2는 -NR3R4 또는 -OR3이고, 여기서 R3 및 R4는 독립적으로 H, 메틸, 에틸, 헥실, 도데실 및 헥사데실로부터 선택되고, 바람직하게는 R2는 -OH 또는 -NH2이다. 보다 바람직하게는, R1은 아세틸 또는 팔미토일이고, R2는 -NH2이다.

바람직한 실시양태에서, 아실 기는 펩티드의 적어도 하나의 아미노산의 N-말단 단부에 결합된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 펩티드는 측쇄 보호기를 포함하도록 변형된다. 측쇄 보호기는 벤질 또는 벤질계 기, t-부틸계 기, 벤질옥시-카르보닐 (Z) 기 및 알릴옥시카르보닐 (alloc) 보호기를 포함하는 군 중 하나 이상일 수 있다. 측쇄 보호기는 비키랄 아미노산, 예컨대 비키랄 글리신으로부터 유래될 수 있다. 비키랄 아미노산의 사용은 생성된 펩티드를 안정화시키고, 또한 본 발명의 용이한 합성 경로를 용이하게 하는 것을 돕는다. 바람직하게는, 펩티드는 변형된 C-말단, 바람직하게는 아미드화된 C-말단을 추가로 포함한다. 비키랄 잔기는 알파-아미노이소부티르산 (메틸알라닌)일 수 있다. 사용된 특정 측쇄 보호기는 펩티드의 서열 및 사용된 N-말단 보호기의 유형에 따라 달라질 것으로 인지될 것이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 펩티드는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 중합체 또는 다른 화합물, 예컨대 분자량 증가 화합물에 접합, 연결 또는 융합된다. 분자량 증가 화합물은 분자량을 전형적으로 생성된 접합체의 10% 내지 90%, 또는 20% 내지 50%만큼 증가시킬 임의의 화합물이고, 200 내지 20,000, 바람직하게는 500 내지 10,000의 분자량을 가질 수 있다. 분자량 증가 화합물은 PEG, 임의의 수용성 (양친매성 또는 친수성) 중합체 모이어티, PEG의 단독중합체 또는 공중합체, PEG의 모노메틸-치환된 중합체 (mPEG) 및 폴리옥시에틸렌 글리세롤 (POG), 폴리아미노산, 예컨대 폴리-리신, 폴리-글루탐산, 폴리-아스파르트산, 특히 L 입체형태의 것, 약리학상 불활성 단백질, 예컨대 알부민, 젤라틴, 지방산, 폴리사카라이드, 지질 아미노산 및 덱스트란일 수 있다. 중합체 모이어티는 직쇄형 또는 분지형일 수 있고, 500 내지 40000 Da, 5000 내지 10000 Da, 10000 내지 5000, Da의 분자량을 가질 수 있다. 화합물은 임의의 적합한 세포 투과 화합물, 예컨대 tat 펩티드, 페네트라틴, pep-1일 수 있다. 화합물은 항체 분자일 수 있다. 화합물은 친지성 모이어티 또는 중합체성 모이어티일 수 있다.

친지성 치환기 및 중합체성 치환기는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 친지성 치환기는 에스테르, 술포닐 에스테르, 티오에스테르, 아미드 또는 술폰아미드의 일부를 형성하는 아실 기, 술포닐 기, N 원자, O 원자 또는 S 원자를 포함한다. 친지성 모이어티는 4 내지 30개의 C 원자, 바람직하게는 8 내지 12개의 C 원자를 갖는 탄화수소 쇄를 포함할 수 있다. 이는 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화일 수 있다. 탄화수소 쇄는 추가로 치환될 수 있다. 이는 시클로알칸 또는 헤테로시클로알칸일 수 있다.

펩티드는 N-말단, C-말단 또는 둘 다에서 변형될 수 있다. 중합체 또는 화합물은 바람직하게는 아미노, 카르복실 또는 티오 기에 연결되고, 임의의 아미노산 잔기의 측쇄의 N-말단 또는 C-말단에 의해 연결될 수 있다. 중합체 또는 화합물은 임의의 적합한 잔기의 측쇄에 접합될 수 있다.

중합체 또는 화합물은 스페이서를 통해 접합될 수 있다. 스페이서는 천연 또는 비천연 아미노산, 숙신산, 리실, 글루타밀, 아스파라길, 글리실, 베타-알라닐, 감마-아미노 부타노일일 수 있다.

중합체 또는 화합물은 에스테르, 술포닐 에스테르, 티오에스테르, 아미드, 카르바메이트, 우레아, 술폰아미드를 통해 접합될 수 있다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 기재된 접합체를 제조하는데 적합한 수단을 알고 있다.

펩티드는, 예를 들어 그의 순환 반감기를 증가시키기 위해 중합체로의 공유 접합에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 예시적인 중합체 및 이러한 중합체를 펩티드에 부착시키는 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285; 및 4,609,546에 예시되어 있다. 추가의 예시적인 중합체는 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티를 포함한다.

본 발명의 펩티드는 펩티드의 저장 안정성, 약동학, 및/또는 생물활성의 임의의 측면, 예를 들어 효력, 선택성, 및 약물 상호작용을 조작하기 위한 하나 이상의 변형에 적용될 수 있다. 펩티드가 적용될 수 있는 화학적 변형은 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 폴리-(N-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤) 및 폴리비닐 알콜, 콜로민산 또는 다른 탄수화물 기반 중합체, 아미노산의 중합체, 및 비오틴 유도체 중 하나 이상의 펩티드로의 접합을 포함한다. Cys 잔기에서의 단백질의 PEG 접합은, 예를 들어 문헌 [Goodson, R. J. & Katre, N. V. (1990) Bio/Technology 8, 343 and Kogan, T. P. (1992) Synthetic Comm. 22, 2417]에 개시되어 있다.

변형된 펩티드는 또한 하나 이상의 잔기가 변형된 (즉, 인산화, 황산화, 아실화, PEG화 등에 의함) 서열, 및 모 서열과 관련하여 하나 이상의 변형된 잔기를 포함하는 돌연변이체를 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 또한 방사성동위원소, 형광 및 효소 표지를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 검출가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지로 변형될 수 있다. 형광 표지는 예를 들어 Cy3, Cy5, 알렉사, BODIPY, 플루오레세인 (예를 들어, 플루오르X, DTAF, 및 FITC), 로다민 (예를 들어, TRITC), 아우라민, 텍사스 레드, AMCA 블루, 및 루시퍼 옐로우를 포함한다. 바람직한 동위원소 표지는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 및 286Re를 포함한다. 바람직한 효소 표지는 퍼옥시다제, β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 글루코스 옥시다제 플러스 퍼옥시다제, 및 알칼리성 포스파타제를 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 3,654,090; 3,850,752 및 4,016,043 참조). 효소는 가교 분자, 예컨대 카르보디이미드, 디이소시아네이트, 글루타르알데히드 등과의 반응에 의해 접합될 수 있다. 효소 표지는 가시적으로 검출될 수 있거나, 또는 열량측정, 분광광도측정, 형광분광광도측정, 전류측정 또는 기체측정 기술에 의해 측정될 수 있다. 다른 표지화 시스템, 예컨대 아비딘/비오틴, 티라미드 신호 증폭 (TSA™)은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어, ABC 키트, 벡터 래보러토리즈, 인크.(Vector Laboratories, Inc.), 캘리포니아주 벌링게임; NEN® 라이프 사이언스 프로덕츠, 인크.(Life Science Products, Inc.), 매사추세츠주 보스톤 참조).

한 실시양태에서, 펩티드, 변이체 및/또는 조성물은 약물 수행 능력을 증가시키도록 변형된다. 한 실시양태에서, 펩티드, 변이체 및/또는 조성물은 안정성, 투과성을 증가시키고/거나, 효력을 유지하고/거나, 독성을 피하고/거나, 반감기를 증가시키도록 변형된다. 변형은 상기 기재된 바와 같을 수 있다. 예를 들어, 변형은 N 및 C-말단을 보호하는 것일 수 있고, 이는 변형된 아미노산, 고리화, 아미노산의 대체, 및/또는 거대분자 또는 대형 중합체 또는 긴 수명의 혈장 단백질로의 접합일 수 있다. 반감기를 연장시키는 전략은 문헌 [Strohl, et al. (BioDrugs, 2015), Schlapschy, et al. (Protein Eng Des Sel. 2013), Podust, VN, et al. (Protein Eng Des Sel. 2013), Zhang, L et al. (Curr Med Chem. 2012), Gaberc-Porekar, V, et al. (Curr Opin Drug Discov Devel. 2008)]에 기재된 바와 같을 수 있다. 예는 PEG화, 지질화 (펩티드 측쇄로의 지방산의 공유 결합), Fc 도메인 및 인간 혈청 알부민에 대한 융합, 친수성 아미노산 중합체, 예를 들어 XTEN 또는 PAS와의 융합, 및/또는 반감기 연장 단백질과의 융합을 사용하는 것을 포함한다.

펩티드의 생체내 반감기를 연장시키는 펩티드의 변형은 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다:

문헌 [Strategies to improve plasma half life time of peptide and protein drugs. Werle M, Bernkop-Schnuerch A. Amino Acids. 2006 Jun;30(4):351-67].

장기-작용 펩티드 및 단백질 약물의 명백한 이점으로 인해, 이러한 화합물의 혈장 반감기를 연장시키는 전략은 고도로 요구되고 있다. 짧은 혈장 반감기는 통상적으로 빠른 신장 클리어런스 뿐만 아니라 전신 순환 동안 발생하는 효소적 분해로 인한 것이다. 펩티드/단백질의 변형은 연장된 혈장 반감기로 이어질 수 있다. 소마토스타틴의 전체 아미노산 양을 줄이고 L: -유사체 아미노산을 D: -아미노산으로 대체함으로써, 유도체 옥트레오티드의 혈장 반감기는 단지 몇 분의 소마토스타틴과 비교하여 1.5시간이었다. INF-알파-2b의 PEG (2,40 K) 접합체는 천연 단백질과 비교하여 330배 연장된 혈장 반감기를 나타냈다. N- 및 C-말단의 변형 또는 PEG화와 같은 혈장 반감기를 연장시키는 가능한 전략 뿐만 아니라 약물 변형의 유효성을 평가하는 방법의 개요를 제공하는 것이 본 검토의 목적이었다. 또한, 전신 순환 동안 펩티드 및 단백질 약물의 효소적 절단을 예측하기 위해, 인간 혈액, 간 및 신장의 가장 중요한 단백질분해 효소 뿐만 아니라 그의 절단 특이성 및 그에 대한 억제제에 관한 근본적인 데이터가 제공된다.

문헌 [Strategic Approaches to Optimizing Peptide ADME Properties. Li Di AAPS J. 2015 Jan; 17(1): 134-143].

단백질분해로부터 펩티드를 안정화시키는 전략

구조 변형을 통해 펩티드의 안정성을 증진시키기 위한 많은 접근법이 이용가능하다. 일부 접근법은 안정성을 개선시킬 뿐만 아니라 다른 ADME 특성을 증진시키며, 예를 들어 고리화는 안정성 및 투과성을 증가시킬 수 있고; 거대분자로의 접합은 안정성을 개선시키고 신장 클리어런스를 감소시킬 수 있다. 펩티드의 안정성 및 ADME 특성을 개선시키면서 효력을 유지하고 독성을 피하는 것이 중요하다.

ㆍ N- 및 C-말단 보호

혈액/혈장, 간 또는 신장 내 다수의 단백질분해 효소는 엑소펩티다제, 아미노펩티다제 및 카르복시펩티다제이고, 이들은 N- 및 C-말단으로부터 펩티드 서열을 분해한다. N- 또는/및 C-말단의 변형은 종종 펩티드 안정성을 개선시킬 수 있다. 많은 예들은 N-아세틸화 및 C-아미드화가 단백질분해에 대한 저항성을 증가시킨다고 보고하였다.

ㆍ L-아미노산의 D-아미노산으로의 대체

천연 L-아미노산을 비천연 D-아미노산으로 치환하는 것은 단백질분해 효소의 기질 인식 및 결합 친화도를 감소시키고, 안정성을 증가시킨다. 한 예가 바소프레신이며, 이는 L-Arg를 함유하고 인간에서 10-35분의 반감기를 갖는다. D-Arg 유사체인 데스모프레신은 건강한 인간 지원자에서 3.7시간의 반감기를 갖는다. 암-관련 프로테아제 우로키나제-유형 플라스미노겐 활성화제 (uPA)의 비시클릭 펩티드 억제제의 연구에서, 특이적 글리신의 D-세린으로의 대체는 마우스 혈장에서 효력을 1.8배 개선시킬 뿐만 아니라 안정성을 4배 증가시킨다.

ㆍ 아미노산의 변형

천연 아미노산의 변형은 입체 장애를 도입하거나 효소 인식을 파괴함으로써 펩티드의 안정성을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 고나도트로핀-방출 호르몬은 매우 짧은 반감기 (분)를 갖는 반면에, 하나의 Gly가 t-부틸-D-Ser로 대체되고 또 다른 Gly가 에틸아미드로 치환된 부세렐린은 인간에서 훨씬 더 긴 반감기를 갖는다.

ㆍ 고리화

고리화는 입체형태 제약을 도입하고, 펩티드의 유연성을 감소시키고, 안정성 및 투과성을 증가시킨다. 관능기에 따라, 펩티드는 머리-대-꼬리, 머리/꼬리-대-측쇄, 또는 측쇄-대-측쇄 고리화될 수 있다. 고리화는 통상적으로 락탐화, 락톤화 및 술피드-기재 가교를 통해 달성된다. 디술피드 가교는 효능, 선택성 및 안정성을 개선시킬 수 있는 폴딩 및 입체형태적 제약을 생성한다. 다수의 디술피드 결합-풍부 펩티드, 예를 들어 리나클로티드, 레피루딘 및 지코노티드가 시판되고 있거나 또는 전임상 또는 임상 개발 중에 있다. 다수의 펩티드 고리화 방법, 예컨대 수지 상 고리화, 측쇄 고리화 (락탐 가교), 직교 커플링을 통한 고리화, 효소 촉매화 고리화, 펩티드의 크기에 특이적인 고리화, 및 티아졸/옥사졸 고리를 함유한 시클릭 펩티드가 문헌 [Davies et al. (J. Peptide Sci, 9:471-501 (2003))]에 기재되어 있다.

ㆍ 거대분자로의 접합

거대분자 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 알부민)로의 접합은 펩티드의 안정성을 개선시키고 신장 클리어런스를 감소시키는 효과적인 전략이다.

신장 클리어런스

많은 펩티드가 유망한 시험관내 약리학적 활성을 나타내지만, 매우 짧은 생체내 반감기 (분)로 인해 생체내 효능을 나타내지 못한다. 펩티드의 신속한 클리어런스 및 짧은 반감기는 성공적인 약물로의 그의 개발을 방해한다. 전신 순환으로부터의 펩티드의 신속한 클리어런스의 주요 원인은 효소적 단백질분해 또는/및 신장 클리어런스이다. 사구체는 ~8 nm의 세공 크기를 갖고, MW < 2-25 kDa를 갖는 친수성 펩티드는 신장의 사구체를 통한 급속 여과의 영향을 받기 쉽다. 펩티드는 신세관을 통해 쉽게 재흡수되지 않기 때문에, 이들은 빈번하게 높은 신장 클리어런스 및 짧은 반감기를 갖는다. 펩티드 클리어런스의 다른 부차적 경로는 세포내이입 및 프로테아솜 및 간에 의한 분해이다. 동물 모델에서의 전신 및 신장 클리어런스 간의 비교는 신장 클리어런스가 주요 제거 경로일 가능성이 있는지 여부에 대한 유용한 정보를 제공한다.

신장-손상 환자의 경우, 신장 기능장애를 갖는 환자에서의 부적절한 투여가 독성 또는 비유효 요법을 유발할 수 있기 때문에, 축적 및 보다 높은 약물 노출을 피하기 위해서는 펩티드 약물에 대해 용량 조정이 필요할 수 있다. 펩티드 신장 클리어런스를 감소시키고 반감기를 연장시키기 위한 몇몇 전략이 개발되었다. 이들은 다음에 검토될 것이다.

ㆍ 혈장 단백질 결합의 증가

펩티드의 신장 클리어런스는 이들이 막 단백질 또는 혈청 단백질에 결합될 때 감소된다. 한 예는 내분비 종양 치료제인 시클릭 펩티드 약물 옥트레오티드이며, 이는 지단백질로의 결합으로 인해 인간에서 약 100분 반감기를 갖는다 (비결합 분율 0.65).

ㆍ 알부민-결합 소분자로의 공유 연결

알부민-결합 소분자를 펩티드에 공유 부착시키는 것은 고도로 결합된 소분자를 통해 알부민과 간접적으로 상호작용함으로써 사구체 여과를 감소시키고, 단백질분해 안정성을 개선시키고, 반감기를 연장시킬 수 있다.

ㆍ 큰 중합체로의 접합

펩티드의 큰 합성 또는 천연 중합체 또는 탄수화물로의 접합은 그의 분자량 및 유체역학적 부피를 증가시켜, 그의 신장 클리어런스를 감소시킬 수 있다. 펩티드 접합에 사용되는 통상적인 중합체는 PEG, 폴리시알산 (PSA), 및 히드록시에틸 전분 (HES)이다.

ㆍ 긴 수명의 혈장 단백질에 대한 융합

혈장 단백질, 예컨대 알부민 및 이뮤노글로불린 (IgG) 단편은 인간에서 19-21일의 긴 반감기를 갖는다. 높은 MW (67-150 kDa)로 인해, 이들 단백질은 낮은 신장 클리어런스를 갖고, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)로의 그의 결합은 혈관 상피에 의한 음세포작용을 통한 제거를 감소시킨다. 알부민 또는 IgG 단편으로의 펩티드의 공유 연결은 신장 클리어런스를 감소시키고 반감기를 연장시킬 수 있다.

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PEG화

친수성 중합체 폴리에틸렌 글리콜의 장쇄가 관심 분자에 부착되는 PEG화는 원래 면역계에 의한 외래 단백질의 인식을 방지하여 치료제로서의 그의 유용성을 가능하게 하는 변형으로서 생각되었다. 일단 형성되면, 비변형된 약물에 대한 항체는 단백질 약물을 신속하게 중화시키고 제거할 수 있다. 예상외로, PEG화는 항-약물 항체의 부재 하에서도 단백질의 약동학을 개선시켰다1. 단순히 약물 분자를 보다 크게 만듦으로써, PEG화는 약물이 신장에 의해 보다 천천히 여과되도록 하였다. 크기 또는 유체역학적 반경을 증가시키는 것이 신장 클리어런스 감소 및 반감기 증가를 초래한다는 경험적 관찰은 이어서 단백질 및 펩티드 약물의 PEG화에 대한 우세한 근거가 되었다. PEG화는 단백질 또는 펩티드를 보다 수용성으로 만들고 단백질분해 효소에 의한 분해로부터 이들을 보호하는 것을 포함하여 분자에 대해 다양한 효과를 가질 수 있다. PEG화는 또한 치료 단백질의 그의 동족 세포 수용체에 대한 결합에 영향을 미쳐, 통상적으로 친화도를 감소시킬 수 있다. PEG 중합체의 크기, 구조 및 부착 방식의 변화는 부착된 약물의 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있다.

제1 세대 PEG화 방법은 문제가 많았다. 그러나, PEG화의 화학은 매우 간단하다. 방법은 단백질 또는 펩티드의 반응성 측쇄로의 폴리에틸렌 글리콜 쇄의 공유 부착을 포함한다. 예를 들어, PEG는 단백질 또는 펩티드의 표면 상의 리신의 -아미노 기에 용이하게 부착된다2. 반응은 pH-의존성이다. 높은 pH (8.0이상)에서, 리신 측쇄 아미노 기는 N-히드록시 숙신이미드를 통해 PEG에 공유 부착된다. 이 방법은 전형적으로 단일 개별 산물보다는 단백질 상의 상이한 부위에 부착된 상이한 수의 PEG 쇄를 함유하는 산물의 패밀리를 생성한다3. 최초 승인된 PEG화 제약은 중증 복합 면역결핍에 대한 효소 대체 요법으로서의 페가데마제 소(Pegademase bovine) (PEG화 소 아데노신 데아미다제) 및 급성 림프모구성 백혈병의 치료를 위한 페가스파르가제(Pegaspargase) (PEG화 아스파라기나제)였다1. 이들 약물은 다양한 PEG화 종의 복합 혼합물이었지만, 혈청 반감기 증가 및 단백질의 면역원성 감소를 포함하여, 천연 효소에 비해 개선된 요법 특성을 가졌다. PEG의 고유한 다분산도로 인해, 품질 및 배치간 재현성은 어려웠다. 이러한 제한에도 불구하고, 수많은 모노-PEG화 위치 이성질체의 이종 집단인 2종의 PEG화 인터페론 (페그인터페론 알파-2b 및 페그인터페론 알파-2a)이 C형 간염 치료제로 FDA-승인되었다. 이들 약물은 각각 2001년 및 2002년에 시판되었다.

기본적인 PEG화 기술에 대해 다양한 증진 및 변경이 이루어졌다. 제2 세대 PEG화 방법은 분지형 구조 뿐만 아니라 PEG 부착을 위한 대체 화학의 사용을 도입하였다. 특히, 시스테인 반응성 기, 예컨대 말레이미드 또는 아이오도아세트아미드를 갖는 PEG는 펩티드 또는 단백질 내의 단일 잔기를 PEG화의 표적으로 하여, 최종 산물의 불균질성을 감소시키지만 PEG 자체의 다분산도로 인해 이를 제거하지는 않는다.

PEG화에 대한 원래의 근거는 면역원성을 감소시키는 것이었지만; 그럼에도 불구하고, 면역원성 PEG화 단백질의 몇몇 예가 있었다. 한 예는 통풍 환자에서 혈장 요산염 수준을 저하시키는 효소인 PEG화 요산염 옥시다제이다. 임상 시험에서, 비교적 높은 백분율의 통풍 환자는 상기 요법에 반응하지 않았으며, PEG에 특이적인 항체를 개발하였지만, 우리카제 단백질에 대해서는 그렇지 않았다2. 또한 일반적으로 비-면역원성인 것으로 생각되는 PEG화 리포솜은 일부 연구에서 면역원성인 것으로 밝혀졌다. PEG화 리포솜은 강한 항-PEG 이뮤노글로불린 M (IgM) 반응을 유도한다. 또한, PEG-글루쿠로니다제의 다중 주사는 특이적 항-PEG IgM 항체의 생성을 유도하여, 신체로부터 PEG-변형된 단백질의 클리어런스를 가속화하는 것으로 나타났다.

변형제로서 PEG를 사용하는 것의 주요 잠재적 단점은 그것이 비-생분해성이라는 것이다. 미국 식품 의약품국 (FDA)은 주사제, 국소, 직장 및 비강 제제를 포함한 제약에서 비히클로서 사용하기 위한 PEG를 승인하였다. PEG는 독성을 거의 나타내지 않고, 신장에 의해 (PEG < 30 kDa의 경우) 또는 분변에서 (PEG > 20 kDa의 경우) 신체로부터 무손상 제거된다1. 동물에게 일부 PEG화 단백질을 반복 투여하면 신세뇨관 세포 공포형성이 관찰되었다. 최근에, 맥락총 상피 세포의 공포형성은 또한 큰 (≥ 40 kDa) PEG와 접합된 단백질을 사용한 독성 연구에서 관찰되었다. 맥락총 상피 세포는 뇌척수액을 생산하고 혈액 CSF 장벽을 형성한다. 세포 공포형성의 장기적인 부정적 결과는 불명확하지만, 일부 잠재적 치료제에 대해 바람직하지 않은 결과를 나타낸다. 한 가지 가능한 대안은 PEG 대신 생분해성 중합체로 대체하는 것이다. 중합체, 예컨대 히드록시에틸 전분 (HES)이 가능한 대안이다. HES는 비-독성 및 생분해성이고, 혈액 확장제로서 사용된다. HES화 방법은 펩티드의 유체역학적 반경을 증가시키는 것을 통해 신장 클리어런스를 감소시키는데 있어서 PEG화와 유사하게 기능할 것이지만, 생분해성으로 인해 보다 낮은 축적 경향을 부여할 수 있다. 그러나, HES 및 다른 제안된 생분해성 중합체 PEG 대안은, PEG와 같이, 다분산성이어서 최종 생성물 및 대사물의 특징화를 어렵게 한다. 두 우려를 완화시키는 한 가지 새로운 해결책은 중합체 성분으로서 규정된 폴리펩티드를 사용하는 것이며; 이러한 접근법은 본 명세서에서 나중에 논의될 것이다.

지질화

펩티드 반감기를 증가시키는 두 번째 주요 화학적 변형 방법은 지방산과 펩티드 측쇄의 공유 결합을 포함하는 지질화이다4. 인슐린의 반감기를 연장시키는 방법으로서 최초로 구상되고 개발된 지질화는 PEG화와 동일한 반감기 연장의 기본 메카니즘, 즉 신장 여과를 감소시키기 위해 유체역학적 반경을 증가시키는 기본 메카니즘을 공유한다. 그러나, 지질 모이어티는 그 자체가 비교적 작으며, 효과는 순환 알부민에 대한 지질 모이어티의 비-공유 결합을 통해 간접적으로 매개된다. 인간 혈청 중 크고 (67 KDa) 고도로 풍부한 단백질 (35-50 g/L)인 알부민은 자연적으로 신체 전반에 걸쳐 지질을 비롯한 분자를 수송하는 기능을 한다. 혈장 단백질로의 결합은 또한, PEG화에서 관찰되는 것과 유사하게, 입체 장애를 통한 펩티다제에 의한 공격으로부터 펩티드를 보호할 수 있다. 지질화의 한 결과는 그것이 펩티드의 수용해도를 감소시키지만, 펩티드와 지방산 사이의 링커의 조작은, 예를 들어 링커 내의 글루타메이트 또는 미니 PEG의 사용에 의해 이를 조정할 수 있다는 것이다. 링커 조작 및 지질 모이어티의 변이는 자기-응집에 영향을 미칠 수 있고, 이는 알부민과 독립적으로 생체분포를 느리게 함으로써 증가된 반감기에 기여할 수 있다5.

인슐린을 이용한 선구적 연구에 따라6, 각종 펩티드, 특히 인간 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1) 유사체, 글루코스-의존성 인슐린 분비성 폴리펩티드 및 GLP-1R/글루카곤 수용체 공동 효능제를 포함한 당뇨병 공간 내의 펩티드의 지질화가 탐구되었다. 2종의 지질화된 펩티드 약물은 현재 인간에서의 사용에 대해 FDA 승인을 받았다. 이들은 둘 다 장기-작용 항당뇨병제인 GLP-1 유사체 리라글루티드 및 인슐린 데테미르이다.

PEG화와 지질화 간의 잠재적으로 약리학상 관련이 있는 차이는 치료 활성 펩티드가 훨씬 더 큰 PEG에 공유 연결되는 반면, 더 작은 지방 아실-펩티드 접합체는 평형 상태로 존재하는 결합 및 미결합 형태인 더 큰 알부민과 비공유적으로 연합된다는 것이다. 이는 상이한 조직에 국재화된 수용체에 대한 접근이 차별적 효과를 도출할 수 있기 때문에 상이한 약리학을 발생시킬 수 있는 생체분포 상의 차이를 야기할 수 있다. 일부 경우에는 보다 제한된 생체분포가 바람직할 수 있는 반면, 다른 경우에는 보다 큰 조직 침투가 중요할 수 있다. 이러한 문제를 다루는 PEG 접근법의 흥미로운 변형이 산티(Santi) 등에 의해 개발되었고, 여기서 예측가능한 절단율을 갖는 방출가능한 PEG 접합체가 이용된다7.

PEG화 및 지질화 둘 다는 입체 장애를 통해 차폐함으로써 프로테아제 및 펩티다제에 대항한 보호를 부여하고, 증가된 유체역학적 반경을 통해 직접 또는 간접적으로 순환 반감기를 연장시킨다. 두 방법은 모두 화학적 접합을 이용하며, 생물학적으로 생산되든지 합성적으로 생산되든지 간에, 이들이 변형시키는 펩티드를 생성하는데 사용되는 수단에 대해 불가지론적이라는 점에서 유연하다. 합성 펩티드를 사용하는 이점은 공지된 단백질분해적 절단 부작용으로 인한 불안정성을 포함하여 다수의 특이적 문제를 해결하기 위해 설계된 비-천연 아미노산을 혼입할 수 있다는 것이다. 이들은 또한, 활성 또는 효력이 유리 말단 또는 변형된 잔기, 예컨대 C 말단 아미드에 높게 의존하는 경우에 중요한 부착 부위의 선택의 관점에서 보다 유연할 수 있다.

고전적인 유전적 융합: Fc 및 HSA

긴 수명의 혈청 단백질에 대한 고전적인 유전적 융합은 PEG 또는 지질에 대한 화학적 접합과 구별되는 반감기 연장의 대안적인 방법을 제공한다. 2종의 주요 단백질이 전통적으로 융합 파트너로서 사용되었다: 항체 Fc 도메인 및 인간 혈청 알부민 (HAS). Fc 융합은 항체의 Fc 부분에 대한 펩티드, 단백질 또는 수용체 엑소도메인의 융합을 수반한다. Fc 및 알부민 융합 둘 다는 펩티드 약물의 크기를 증가시킴으로써 뿐만 아니라 신체의 자연 재생 메카니즘: 신생아 Fc 수용체인 FcRn을 이용함으로써 연장된 반감기를 달성한다. FcRn에 대한 이들 단백질의 pH-의존성 결합은 엔도솜에서 융합 단백질의 분해를 방지한다. 이들 단백질에 기초한 융합은 전형적인 PEG화 또는 지질화 펩티드보다 훨씬 더 긴 3-16일 범위의 반감기를 가질 수 있다. 항체 Fc와의 융합은 펩티드 또는 단백질 약물의 용해도 및 안정성을 개선시킬 수 있다. 펩티드 Fc 융합체의 한 예는 현재 후기 단계 임상 시험중인 GLP-1 수용체 효능제인 둘라글루티드이다. 지방 아실화 펩티드에 의해 이용되는 동일한 단백질인 인간 혈청 알부민은 다른 대중적인 융합 파트너이다. 알비글루티드는 이러한 플랫폼에 기초한 GLP-1 수용체 효능제이다. Fc와 알부민 간의 주요 차이는 Fc의 이량체 성질 대 HAS의 단량체 구조로, 이는 융합된 펩티드가 융합 파트너의 선택에 따라 이량체 또는 단량체로서 제시되게 한다. 펩티드 Fc 융합체의 이량체 성질은 표적 수용체가 함께 충분히 근접하게 이격되어 있거나 또는 그 자체가 이량체인 경우에 결합력 효과를 생성할 수 있다. 이는 표적에 따라 바람직하거나 또는 그렇지 않을 수 있다.

설계된 폴리펩티드 융합: XTEN 및 PAS

재조합 융합 개념의 흥미로운 변형은, PEG의 기능적 유사체인 기본적으로 구조화되지 않은 친수성 아미노산 중합체를 융합 파트너로서 설계한 저복잡성 서열의 개발이었다. 폴리펩티드 플랫폼의 고유한 생분해성은 이를 PEG에 대한 잠재적으로 보다 양성인 대안으로서 이를 매력적이게 만든다. 또 다른 이점은 PEG의 다분산도와 대조적으로 재조합 분자의 정확한 분자 구조이다. 융합 파트너의 3차원 폴딩이 유지될 필요가 있는 HSA 및 Fc 펩티드 융합체와 달리, 구조화되지 않은 파트너에 대한 재조합 융합체는 많은 경우에 보다 높은 온도 또는 가혹한 조건, 예컨대 HPLC 정제에 적용될 수 있다.

이러한 부류의 폴리펩티드 중 가장 진보된 것은 XTEN (아무닉스(Amunix))으로 명명되고, 864개 아미노산 길이이며, 6개 아미노산 (A, E, G, P, S 및 T)으로 구성된다. 중합체의 생분해성 성질에 의해 가능해지면, 이는 전형적으로 사용되는 40 KDa PEG보다 훨씬 더 크고, 동시에 더 큰 반감기 연장을 부여한다. XTEN과 펩티드 약물의 융합은 천연 분자에 비해 60배 내지 130배의 반감기 연장을 일으킨다. 2종의 완전히 재조합적으로 생산된 XTEN화 생성물, 즉 VRS-859 (엑세나티드-XTEN) 및 VRS-317 (인간 성장 호르몬-XTEN)이 임상에 들어갔다. Ia상 연구에서, VRS-859는 제2형 당뇨병을 갖는 환자에서 내약성이 우수하고 효과적인 것으로 밝혀졌다. VRS-317은 이전에 연구된 rhGH 생성물과 비교하여 우월한 약동학적 및 약역학적 특성을 보고하였고, 매월 1회 투여할 가능성이 있다.

유사한 개념적 고려사항에 기초한 제2 중합체는 PAS (XL-프로테인 게엠베하)이다9. 무작위 코일 중합체는 단지 3개의 작은 비하전된 아미노산, 프롤린, 알라닌 및 세린의 훨씬 더 제한된 세트로 구성되었다. PAS의 생물물리학적 특성과 고도로 음으로 하전된 XTEN에 있어서의 차이가 생체분포 및/또는 생체내 활성의 차이에 기여할 수 있는지 여부는 아직 알려져 있지 않지만, 이들 폴리펩티드가 보다 많은 치료제 내로 혼입되고 융합체의 거동이 특성화됨에 따라 밝혀질 것이다.

파트너가 Fc, HSA, XTEN 또는 PAS인지의 여부에 관계없이 모든 펩티드 단백질 융합체는 유전적으로 코딩되고, 결과적으로 유사한 제약을 겪는다. 하나의 제한은 비-천연 아미노산을 혼입하는 합성 펩티드의 사용을 허용하는 화학적 접합을 사용하는 방법과 달리, 단지 자연 발생 아미노산만이 혼입된다는 것이다. 유전자 코드를 확장시킴으로써 이를 극복하는 방법이 암브륵스(Ambrx) 또는 수트로(Sutro)와 같은 회사에 의해 개발되고 있지만, 아직 널리 사용되지 않고 있다. 두 번째 제한은 펩티드의 N-말단 또는 C-말단이 그 파트너와 융합될 필요가 있다는 것이다. 종종, 펩티드 말단은 수용체 상호작용에 관여하고, 한쪽 또는 양쪽 말단에 대한 유전적 융합은 활성을 크게 손상시킬 수 있다. PEG 또는 지질 접합 부위는 펩티드 상의 어디에나 있을 수 있기 때문에, 생성된 치료제의 생물학적 활성을 최대화하도록 최적화될 수 있다.

합성 펩티드를 반감기 연장 단백질과 통합하는 하이브리드 방법

유전적 융합은 역사적으로 보다 큰 반감기 연장에 대한 잠재력을 제공하였지만, 부착 부위의 유연성 및 비천연 아미노산의 혼입 또는 펩티드 백본에 대한 변형의 관점에서 화학적 접합, PEG화 및 지질화를 이용하는 방법에 의해 제공되는 이점이 결여되어 있다. 반감기 연장을 위한 화학적 접합과 유전적 융합체의 이점을 통합하기 위한 첫 번째 노력 중 하나는, 나중에 생명공학 회사인 CovX의 기반을 형성하는 기술을 이용한 라호야의 스크립스 리서치 인스티튜트(Scripps Research Institute)의 연구원에 의해 수행되었다10,11. 촉매 알돌라제 항체를 사용하여, 이들 연구자들은 항체의 활성 부위 리신이 펩티드 또는 소분자에 혼입된 베타-디케톤과 가역적 공유 엔아민 결합을 형성하는 플랫폼을 개발하였다. 생성된 복합체는 코브엑스바디(CovXBody)™로 명명된다. 이러한 접근법은 펩티드 약물 또는 소분자의 기능적 품질을, 유전적 융합을 통해서가 아니라 화학적 연결을 통해 항체의 긴 혈청 반감기와 조합한다. 이러한 기술의 초기 시연에 이어, 연구자들은 펩티드모방체 약물작용발생단을 표적으로 하는 인테그린에 기반한 코브엑스-바디™ 프로토타입의 사용을 확대하였다. 이러한 구조를 기반으로 하는 적어도 3개의 분자, 즉 CVX-096, Glp-1R 효능제; CVX-060, 안지오포이에틴-2 결합 펩티드; 및 CVX-045, 트롬보스폰딘 모방체가 임상 개발에 들어갔다.

최근, XTEN 폴리펩티드는 또한 PEG와 훨씬 더 직접적으로 유사하게 만드는 화학적 접합 모드 12에서 사용되었다. 이 방법을 사용하여 생성된 XTEN화 펩티드의 제1 예는, 펩티드가 말레이미드-티올 화학을 사용하여 XTEN 단백질 중합체에 화학적으로 접합된 GLP2-2G-XTEN이다. 화학적으로 접합된 GLP2-2GXTEN 분자는 재조합적으로 융합된 GLP2-2G-XTEN에 필적하는 래트에서의 시험관내 활성, 시험관내 혈장 안정성 및 약동학을 나타냈다.

XTEN 또는 PAS 폴리펩티드의 완전히 설계된 서열에서 반응성 기, 예컨대 리신 또는 시스테인 측쇄의 수 및 간격은 이들을 구성하는 제한된 아미노산 세트로 인한 부위-지정 변화를 통해 정확하게 제어될 수 있다. 이는 고도로 전문화된 활성 부위 내의 반응성 잔기에 의존하는 CovX 기술과는 대조적으로, 그의 서열이 많은 반응성 기와 스탠드를 자연적으로 함유하는 Fc 또는 알부민을 활용할 수 있는 방법에 비해 부가적 정도의 유연성을 제공한다. 또한, XTEN 또는 PAS의 3차 구조의 결여는 커플링 및 접합체의 정제에 사용되는 조건 및 화학 물질에 비해 보다 큰 유연성을 제공해야 한다.

요약하면, 화학적 접합 및 유전적 융합 방법의 이점을 조합하고 개별적인 한계를 극복하는 하이브리드 펩티드 반감기 연장 방법이 대두되고 있다. 이들 방법은, 보다 긴 반감기를 부여하지만, 천연 L-아미노산만으로 구성되거나 또는 N- 또는 C-말단 중 하나에서 융합된 선형의 단방향 폴리펩티드로서만 설정되는 한계로부터 치료용 펩티드 모이어티를 자유롭게 하는 재조합 폴리펩티드-기반 파트너에 근거한 분자의 창출을 가능하게 하므로, 보다 길게 작용하는 광범위한 펩티드-기반 약물로 나아가는 기회가 열렸다.

"근육 위축"은 근육 질량의 감소로 정의되고, 근육의 완전한 또는 부분적인 소모, 및 결과적인 근육 약화를 특징으로 할 수 있다. 이는 일반적으로 적절하게 운동하지 않거나, 적절하게 섭식하지 않거나, 또는 둘 다인 사람에서 발생한다. 이는 또한 근육 질환, 예컨대 근병증 (근육 이영양증)을 갖는 대상체에 존재하고, 섭식 장애, 암, AIDS, COPD, ALS, 운동을 제한하는 신체 손상, 퇴행성 상태를 포함한 여러 질환/상태의 동반이환이다. 이는 또한 정상 노화 과정의 일부로 고령 대상체에서 보편적이다.

"고령 대상체"는 적어도 65세인 대상체를 지칭한다.

"근육 위축을 특징으로 하는 질환 또는 상태"는 증상으로서 근육 위축을 포함하는 질환 또는 상태를 지칭한다. 예는 신체 손상 (즉, 대상체가 신체적으로 비활동적이 되도록 하는 것, 예를 들어 근육, 신경, 골, 연골, 인대, 원판, 두부 또는 관절 손상), 대상체가 병상 또는 가정에 국한되도록 하는 질환 (즉, 암, 감염성 질환 등), 섭식 장애, 악액질, 근육감소증, 영양실조, 대사 질환 (제I형 및 제II형 당뇨병 포함), 및 뉴런, 근육 또는 관절 변성 질환, 예컨대 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 다발성 경화증 (MS), 파킨슨병, 헌팅톤병, 근육 이영양증, 길랑-바레 증후군, 골관절염, 소아마비, 류마티스 관절염, 척수성 근육 위축 및 다발근염을 포함한다. 뉴런 변성 질환은 ALS, MS, 파킨슨병 및 헌팅톤병을 포함한다. 근육 변성 질환은 근병증 (다발성근염 포함), 근육 이영양증, 길랑-바레 증후군, 척수성 근육 위축을 포함한다. 관절 변성 질환은 관절염성, 류마티스 관절염, 골관절염을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "본 발명의 발현 벡터"는 세포에서 본 발명의 펩티드의 발현에 적합한 염색체, 비-염색체, 및 합성 핵산 벡터 (발현 제어 요소의 적합한 세트를 포함하는 핵산 서열)를 포함한 임의의 적합한 벡터일 수 있다. 이러한 벡터의 예는 SV40의 유도체, 박테리아 플라스미드, 파지 DNA, 바큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드 및 파지 DNA의 조합으로부터 유래된 벡터, 및 바이러스 핵산 (RNA 또는 DNA) 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드-코딩 핵산 분자는 네이키드 DNA 또는 RNA 벡터, 예컨대 예를 들어 선형 발현 요소 (예를 들어, 문헌 [Sykes and Johnston, Nat Biotech 12, 355-59 (1997)]에 기재된 바와 같음), 압축된 핵산 벡터 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,077,835 및/또는 WO 00/70087에 기재된 바와 같음), 또는 플라스미드 벡터, 예컨대 pBR322, pUC 19/18, 또는 pUC 118/119에 포함된다. 이러한 핵산 벡터 및 그의 용법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,589,466 및 미국 특허 번호 5,973,972 참조). 한 실시양태에서, DNA는 발현 제어 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 벡터는 박테리아 세포에서 본 발명의 펩티드의 발현에 적합하다. 이러한 벡터의 예는 발현 벡터, 예컨대 블루스크립트(BlueScript) (스트라타진(Stratagene)), pIN 벡터 (문헌 [Van Heeke & Schuster, 1989, J Biol Chem 264, 5503-5509]), pET 벡터 (노바젠(Novagen), 위스콘신주 매디슨) 등을 포함한다. 한 실시양태에서, 발현 벡터는 또한 또는 대안적으로 효모 시스템에서의 발현에 적합한 벡터일 수 있다. 효모 시스템에서의 발현에 적합한 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터는, 예를 들어 구성적 또는 유도성 프로모터, 예컨대 효모 알파 인자, 알콜 옥시다제 및 PGH를 포함하는 벡터를 포함한다 (문헌 [F. Ausubel et al., ed., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York; and Grant et al., 1987, Methods in Enzymol 153, 516-544]에서 검토됨). 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포에서의 발현에 적합하다 (문헌 [Kost, T; and Condreay, J P, 1999, Current Opinion in Biotechnology 10 (5): 428-33]).

발현 제어 서열은 다양한 세포계에서 관심 유전자의 전사, 및 후속적으로 단백질의 발현을 제어 및 구동하도록 조작된다. 플라스미드는 관심있는 발현가능한 유전자를 바람직한 요소, 예컨대 예를 들어 프로모터, 인핸서, 선택 마커, 오퍼레이터 등을 포함하는 발현 제어 서열 (즉, 발현 카세트)과 조합한다. 본 발명의 발현 벡터에서, 펩티드-코딩 핵산 분자는 임의의 적합한 프로모터, 인핸서, 선택 마커, 오퍼레이터, 리프레서 단백질, 폴리A 종결 서열 및 다른 발현-촉진 요소를 포함하거나 그와 연합될 수 있다.

본원에 사용된 "프로모터"는 작동가능하게 연결된, 즉 적절한 신호가 존재하는 경우에 본 발명의 펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열의 전사를 허용하는 방식으로 연결된, DNA 서열의 전사를 지시하기에 충분한 DNA 서열을 나타낸다. 펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열의 발현은 관련 기술분야에 공지된 임의의 프로모터 또는 인핸서 요소의 제어 하에 놓일 수 있다. 이러한 요소의 예는 강한 발현 프로모터 (예를 들어, 인간 CMV IE 프로모터/인핸서 또는 CMV 주요 IE (CMV-MIE) 프로모터, 뿐만 아니라 RSV, SV40 후기 프로모터, SL3-3, MMTV, 유비퀴틴 (Ubi), 유비퀴틴 C (UbC), 및 HIV LTR 프로모터)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 SV40, CMV, CMV-IE, CMV-MIE, RSV, SL3-3, MMTV, Ubi, UbC 및 HIV LTR로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함한다.

본 발명의 핵산 분자는 또한 효과적인 폴리 (A) 종결 서열, 이. 콜라이에서 플라스미드 생성물에 대한 복제 기점, 선택 마커로서 항생제 내성 유전자, 및/또는 편리한 클로닝 부위 (예를 들어, 폴리링커)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 핵산은 또한 구성적 프로모터, 예컨대 CMV IE와 반대되는 조절가능한 유도성 프로모터 (유도성, 억제성, 발달적으로 조절됨)를 포함할 수 있다 (관련 기술분야의 통상의 기술자는 이러한 용어가 실제로 특정 조건 하에서의 유전자 발현 정도의 기재어임을 인식할 것이다).

선택 마커는 관련 기술분야에 널리 공지된 요소이다. 선택 조건 하에, 적절한 선택 마커를 발현하는 세포만이 생존할 수 있다. 통상적으로, 선택 마커 유전자는 세포 배양물에서 다양한 항생제에 대한 내성을 부여하는 단백질, 통상적으로 효소를 발현한다. 다른 선택적 조건에서, 형광 단백질 마커를 발현하는 세포가 가시적이게 되고, 따라서 선택가능하다. 실시양태는 베타-락타마제 (bla) (베타-락탐 항생제 내성 또는 암피실린 내성 유전자 또는 ampR), bls (블라스티시딘 내성 아세틸 트랜스퍼라제 유전자), bsd (블라스티시딘-S 데아미나제 내성 유전자), bsr (블라스티시딘-S 내성 유전자), Sh ble (제오신(Zeocin)® 내성 유전자), 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (hpt) (히그로마이신 내성 유전자), tetM (테트라시클린 내성 유전자 또는 tetR), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (npt) (네오마이신 내성 유전자 또는 neoR), kanR (카나마이신 내성 유전자), 및 pac (퓨로마이신 내성 유전자)를 포함한다.

특정 실시양태에서, 벡터는 bla, bls, BSD, bsr, Sh ble, hpt, tetR, tetM, npt, kanR 및 pac로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 선택 마커 유전자를 포함한다. 다른 실시양태에서, 벡터는 녹색 형광 단백질 (GFP), 증진된 녹색 형광 단백질 (eGFP), 시아노 형광 단백질 (CFP), 증진된 시아노 형광 단백질 (eCFP), 또는 황색 형광 단백질 (YFP)을 코딩하는 하나 이상의 선택 마커 유전자를 포함한다.

본 발명의 목적을 위해, 진핵 세포에서의 유전자 발현은 오퍼레이터에 의해 제어되는 강한 프로모터를 사용하여 엄격하게 조절될 수 있고, 이는 다시 재조합 "조절 융합 단백질" (RFP)일 수 있는 조절 단백질에 의해 조절된다. RFP는 전사 차단 도메인, 및 그의 활성을 조절하는 리간드-결합 도메인으로 본질적으로 이루어진다. 이러한 발현 시스템의 예는 US20090162901A1에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본원에 사용된 "오퍼레이터"는, 유전자가 RFP의 오퍼레이터로의 결합에 의해 조절될 수 있고, 그 결과 관심 유전자, 즉 본 발명의 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드의 전사를 방지하거나 허용하는 방식으로 유전자 내에 또는 근처에 도입된 DNA 서열을 나타낸다. 원핵 세포 및 박테리오파지에서의 다수의 오퍼레이터가 잘 특징화되어 있다 (문헌 [Neidhardt, ed., Escherichia coli and Salmonella; Cellular and Molecular Biology 2d. Vol 2 ASM Press, Washington D.C. 1996]). 이들은 LexA 펩티드에 결합하는 이. 콜라이의 LexA 유전자의 오퍼레이터 영역, 및 이. 콜라이의 Lad 및 trpR 유전자에 의해 코딩되는 리프레서 단백질에 결합하는 락토스 및 트립토판 오퍼레이터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들은 또한 람다 cI 및 P22 arc에 의해 코딩되는 리프레서 단백질에 결합하는 람다 PR 및 파지 P22 ant/mnt 유전자로부터의 박테리오파지 오퍼레이터를 포함한다. 일부 실시양태에서, RFP의 전사 차단 도메인이 제한 효소, 예컨대 NotI인 경우, 오퍼레이터는 그 효소에 대한 인식 서열이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 오퍼레이터가 프로모터에 의해 전사를 제어할 수 있도록 프로모터에 인접하거나 3'에 위치해야 함을 인식할 것이다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 5,972,650은 tetO 서열이 TATA 박스로부터 특정 거리 내에 있음을 명시한다. 구체적 실시양태에서, 오퍼레이터는 바람직하게는 프로모터의 바로 하류에 위치한다. 다른 실시양태에서, 오퍼레이터는 프로모터의 10개 염기 쌍 내에 위치한다.

예시적인 세포 발현 시스템에서, 세포는 테트라시클린 리프레서 단백질 (TetR)을 발현하도록 조작되고, 관심 단백질은 그의 활성이 TetR에 의해 조절되는 프로모터의 전사 제어 하에 위치한다. 2개의 탠덤 TetR 오퍼레이터 (tetO)는 벡터에서 CMV-MIE 프로모터/인핸서의 바로 하류에 위치한다. 이러한 벡터에서 CMV-MIE 프로모터에 의해 지시된 관심 단백질을 코딩하는 유전자의 전사는 테트라시클린 또는 일부 다른 적합한 유도제 (예를 들어, 독시시클린)의 부재 하에 TetR에 의해 차단될 수 있다. 유도제의 존재 하에, TetR 단백질은 tetO에 결합할 수 없고, 따라서 관심 단백질의 전사에 이어서 번역 (발현)이 발생한다. (예를 들어, 미국 특허 번호 7,435,553 (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조).

본 발명의 벡터는 또한 숙주 게놈 내로의 관심 유전자의 통합을 용이하게 하기 위해 Cre-lox 재조합 도구를 사용할 수 있다. Cre-lox 전략은 적어도 2종의 성분을 필요로 한다: 1) 2개의 loxP 부위 사이의 재조합을 촉매하는 효소인 Cre 레콤비나제; 및 2) loxP 부위 (예를 들어, 재조합이 일어나는 8-bp 코어 서열, 및 2개의 플랭킹 13-bp 역전된 반복부로 이루어진 서열에 의한 특이적 34-염기 쌍) 또는 돌연변이체 lox 부위 (예를 들어, 문헌 [Araki et al., 1995, PNAS 92:160-4; Nagy, A. et al., 2000, Genesis 26:99-109; Araki et al., 2002, Nuc Acids Res 30(19):e103]; 및 US20100291626A1 (이들 모두는 본원에 참조로 포함됨) 참조). 또 다른 재조합 전략에서, 효모-유래 FLP 레콤비나제는 컨센서스 서열 FRT와 함께 이용될 수 있다 (또한, 예를 들어 문헌 [Dymecki, S. M., 1996, PNAS 93(12): 6191-6196] 참조).

본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 재조합 핵산 서열을 발현하는데 적합한 임의의 세포를 포함한다. 세포는 원핵생물 및 진핵생물의 세포 (단일-세포 또는 다중-세포), 박테리아 세포 (예를 들어, 이. 콜라이, 바실루스 종, 스트렙토미세스 종 등의 균주), 미코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포 (예를 들어, 에스. 세레비지아에, 에스. 폼베, 피. 파르토리스, 피. 메타놀리카 등), 식물 세포, 곤충 세포 (예를 들어, SF-9, SF-21, 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포, 트리코플루시아 니 등), 비-인간 동물 세포, 포유동물 세포, 인간 세포, 또는 세포 융합체, 예컨대 예를 들어 하이브리도마 또는 쿼드로마를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트 또는 마우스 세포이다. 다른 실시양태에서, 세포는 진핵 세포이고, 다음 세포: CHO (예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장 (예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431 (표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 종양 세포, 및 상기 언급된 세포로부터 유래된 세포주로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예를 들어 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포 (예를 들어, PER.C6® 세포)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 CHO 세포이다. 다른 실시양태에서, 세포는 CHO K1 세포이다.

본원에 사용된 용어 "본 발명의 형질전환된 세포"는, 본 발명의 펩티드의 발현을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 세포 게놈 내로 안정하게 통합된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 펩티드의 발현을 코딩하는 서열을 포함하는 비-통합된 (즉, 에피솜) 핵산, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 파지미드 또는 선형 발현 요소를 포함하는 세포를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 플라스미드로 안정하게 형질감염시킴으로써 생산된 세포주를 제공한다.

본원에 사용된 바와 같은, 세포에 적용된 용어 "조작된"은 재조합 DNA 기술을 사용하여 유전자 조작된 것을 의미하고, 일반적으로 적합한 발현 벡터의 합성 단계 (상기 참조) 및 이어서 발현 벡터를 숙주 세포 내로 형질감염시키는 단계 (일반적으로 안정한 형질감염)를 수반한다.

본원에 사용된 용어 "이종 발현"은 자연적으로는 핵산을 갖지 않는 숙주 세포에서의 핵산의 발현을 지칭한다. 이종 숙주 내로의 핵산의 삽입은 재조합 DNA 기술에 의해 수행된다.

<실시예>

본 발명은 이제 구체적 실시예를 참조하여 설명될 것이다. 이들은 단지 예시적이며, 예시적 목적을 위한 것일 뿐이며: 이들은 어떠한 방식으로든 청구된 독점권의 범주 또는 기재된 본 발명을 제한하도록 의도되지 않는다. 이들 실시예는 본 발명을 실시하기 위해 현재 고려되는 최적 방식을 구성한다.

물질 및 방법

세포 배양 검정 제조: C2C12 제조

성장 배지 제조:

4.5 g/L 글루코스 DMEM 500 mL에 55℃에서 30분 동안 미리 가열된 L-글루타민 용액 (최종 농도: 1%) 5 mL, 페니실린-스트렙토마이신 (최종 농도: 1%) 5 mL 및 멸균 여과된 태아 소 혈청 (최종 농도: 10%) 50 mL를 첨가하였다.

분화 배지 제조:

4.5 g/L 글루코스 DMEM 500 mL에 L-글루타민 용액 (최종 농도: 1%) 5 mL, 페니실린-스트렙토마이신 (최종 농도: 1%) 5 mL 및 열 불활성화된 말 혈청 (최종 농도: 2%) 10 mL를 첨가하였다.

고갈 배지 제조:

4.5 g/L 글루코스 DMEM 500 mL에 L-글루타민 용액 (최종 농도: 1%) 5 mL 및 페니실린-스트렙토마이신 (최종 농도: 1%) 5 mL를 첨가하였다.

S6 인산화 검정 작업흐름

제1일: 96-웰 플레이트에서 100 ul/웰의 성장 배지 중 2400개 세포/웰 (8,000개 세포/cm2)을 시딩하였다. 이들을 부착시키고, 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 성장시켰다. (추가의 세부사항에 대해서는 C2C12 SOP 58의 해동 계대배양 참조).

제3일: 성장 배지를 제거하고, 100 ul/웰의 분화 배지를 첨가하였다. 가능한 한 매일 신선한 분화 배지를 첨가함으로써 37℃, 5% CO2에서 7일 동안 이들을 분화시켰다. (추가의 세부사항에 대해서는 C2C12 SOP60의 분화 참조).

제8일: 분화 배지를 제거하고, 100 ul/웰의 고갈 배지를 첨가하여 세포를 3시간 동안 37℃, 5% CO2에서 고갈시켰다. 이 후, 고갈 배지를 제거하고, 100 ul/웰의 HBSS를 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하여 1시간 동안 세포에서 아미노산을 박탈하였다.

펩티드/가수분해물을 HBSS 중에 희석하여 목적하는 농도 (전형적으로 0.5 ug/ml 및 5 ug/ml)를 구성함으로써 2 ml 시험 튜브에서 펩티드 및 가수분해물 처리를 구성하였다. 3개의 웰 (100 ul/웰)을 처리하기 위해 300 ul의 최소 부피가 필요하였다. 양성 대조군으로서 0.1 uM의 인슐린 처리를 사용하였다. 모든 처리는 삼중으로 완료되어야 한다. 권장되는 처리 시간은 30분이다.

세포 배양 검정 제조: THP-1 세포 배양

인간 단핵구성 백혈병 (THP-1) 세포 (ECACC 콜렉션; 시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스)를 55℃에서 30분 동안 미리 가열된 1% L-글루타민, 10% 열-불활성화 FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 및 10% 멸균 여과된 태아 소 혈청으로 보충된 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 배지 (RPMI 1640, 론자, 스위스 바젤)에서 배양을 유지하였다.

TNF-Α 분비 검정 작업흐름

상청액으로 방출된 THP-1 유래 TNF를 제조업체의 지침에 따라 TNF-α ELISA 키트 (바이오레전드, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 평가하였다. 대식세포로 분화하기 위해, THP-1 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하고 (2 x 10⁶ 웰^-1), 37℃, 5% CO₂에서 72시간 동안 100 nM 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트 (PMA; 시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스)로 처리하였다. 인큐베이션 후에, 비-부착된 세포를 흡인하고, 부착 세포를 NPN_1 (0.5-5 μg/mL)로 이중 또는 삼중으로 처리하였다. 24시간 동안 인큐베이션한 후, 에스케리키아 콜라이 O127:B8 (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스)로부터의 리포폴리사카라이드 (LPS)를 37℃, 5% CO₂에서 24시간 동안 100 ng/mL로 첨가하였다. 세포 상청액을 수집하고, 상청액으로 방출된 THP-1 유래 TNF를 제조업체의 지침에 따라 TNF-α ELISA 키트 (바이오레전드, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여 평가하였다.

C2C12 세포로부터의 RNA 단리 및 실시간 QPCR

C2C12 세포를 6-웰 플레이트에 플레이팅하고, 37℃, 5% CO₂에서 성장 및 분화되도록 두었다. 세포를 후속적으로 37℃, 5% CO₂에서의 고갈 배지에서 24시간 동안 고갈시켰다. 문헌 [Menconi et al. (2008)]에 따라, 위축을 유도하기 위해, 세포를 1% 페니실린-스트렙토마이신-보충된 DMEM-LM (30030, 바이오사이언시스) 중에 가용화된 100 μM 덱사메타손으로 37℃, 5% CO₂에서 24시간 동안 처리하였다[33]. 위축 유도의 종료 30분 전에, 세포를 덱사메타손 처리물의 최상부에 첨가된 NPN으로 처리하고, 37℃, 5% CO₂에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 희석물을 산출하여 2 mL/웰의 최종 부피로 목적하는 농도를 얻었다. 각각의 웰에 첨가된 동일한 부피의 처리물을 먼저 세포를 방해하지 않으면서 덱사메타손 처리물로부터 제거하였다. C2C12 세포를 트리졸(TRIzol) (인비트로젠, 미국 칼스배드)로 용해시키고, 퓨어링크 RNA 미니 키트 (써모 피셔 사이언티픽의 인비트로젠)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. 총 RNA (1 μg)를 고용량 cDNA 역전사 키트 (써모 피셔, 미국 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 정량적 PCR을 택맨(TaqMan) 프로브-기반 방법을 사용하여 수행하였고, 여기서 C2C12를 사용하는 실험의 경우 Trim63 (Mm01185221_m1) 및 Fbxo32 (Mm00499518_m1)에 대한 택맨 형광발생 유전자 발현 프로브 (ABI 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주)를 사용하여 mRNA 발현을 검출하였다. 프라이머/프로브를 함유하는 마스터 믹스 및 택맨®유전자 발현 마스터 믹스 (에이비아이 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주)를 1 μL cDNA 주형에 첨가하였다. 9 μL의 최종 부피를 로슈 옵티칼 96-웰 반응 플레이트 상에 이중으로 피펫팅하고, 실시간 PCR을 로슈 라이트사이클러 480 실시간 PCR 기기 상에서 수행하였다. 각각의 웰에 대한 역치 사이클 (Ct)을 기기 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 데이터 분석은 플레이트 상에 포함된 B2M 하우스키핑 유전자 (Mm00437762_m1)에 의해 정규화된 미가공 데이터를 사용한 ΔΔCt 방법에 기초하였다. 덱사메타손을 사용하여 C2C12 세포에서 위축을 유도하였으므로, 모든 유전자 발현을 덱사메타손과 비교하였다. NPN_1이 덱사메타손에 의해 야기된 위축 작용을 약화시킬 수 있는지 조사하기 위해 이를 후속적으로 첨가하였다. 결과는 대조군에 대한 배수로서 표현된다.

불용 뮤린 위축 연구 프로토콜

본 연구는 멜리오 디스커버리 (미국)와 함께 수행하였다. 12주령 수컷 C57b1/6J 마우스 (N = 10/군)를 체중 (고리 이식 10일 후)에 기초하여 치료군에 무작위로 배정하였다. 윤리적 승인은 국제 종합 자유 협회 (IARF #:MLR-I15)에 의해 승인되었고, 따라서 동물 실험 윤리 위원회 (IACUC)에 의해 정리된 윤리적 표준에 따라 수행되었다.

연구는 5개의 치료군으로 이루어졌다: (1) 건강한 대조군 (대조군 체중 부하), (2) 뒷다리 무부하 (HU)-대조군 비히클 (위축), (3) 보우만-버크 억제제 (BBI; 113.3 mg/kg 양성 대조군), (4) 카세인 (650 mg/kg; 양성 대조군), (5) NPN_1 (650 mg/kg). 간략하게, 뒷다리 무부하 전에, 2-0 멸균 수술용 강철 와이어로 꼬리 고리를 형성하였고, 이는 제5, 제6, 또는 제7 추간판 공간을 통과하여 마우스가 매달린 고리로 형상화되었다. 꼬리-고리에 대한 척추 위치는 배변을 방해하지 않으면서 동물 체중의 균형을 적절하게 맞추도록 선택되었다. 동물을 케이지의 최상부에 부착된 회전 하니스로 매달았다. 앞다리만 케이지 바닥과 접촉을 유지하도록 동물의 몸체를 30°높이로 유지하였다. 동물은 이 절차 동안 이동하여 케이지 내의 음식 및 물에 자유롭게 접근할 수 있었다. 동물의 높이를 매일 체크하고, 필요한 경우에 조정하였다 [34]. IACUC 가이드라인에 기초하여 마우스에게 순응 및 조건화를 위해 7일, 이어서 꼬리-고리 이식 후 10-13일의 회복 시간을 제공하였다. 본 연구의 1차 종점은 뒷다리 매달기 19일 직후 대조군 및 시험 마우스의 뒷다리 내에 함유된 가자미근의 습윤 중량을 평가하는 것이었다. 또한, 고정된 근육 샘플 (5개/군)을 유형 I 및 유형 IIa 근육 섬유 마커의 면역형광 (IF) 염색 및 영상 분석을 위해 케어스바이오 래보러토리 엘엘씨로 보냈다. 가자미근 조직 샘플 (10개/군)을 또한 유전자 발현 분석을 위해 셀로매틱스 바이오사이언시스 리미티드로 보냈다.

투여 및 근육 습윤 질량

모든 마우스에게 제1일부터 제18일까지 NPN_1, BBI 또는 카세인을 투여하였다. 제19일에, 동물을 경추 탈구에 의해 희생시키고; 혈액/혈장 샘플을 수집하고, 가자미근을 단리하고, 디지털 플랫폼 저울을 사용하여 칭량하였다. 습윤 근육 중량을 체중에 대해 정규화하였다 (mg/g). 가자미근의 한쪽을 급속 동결시키고, 가자미근의 다른 쪽을 4% 신선한 PBS-완충 포름알데히드에서 고정시켰다.

가자미근의 면역형광 분석

수집된 가자미근을 4% 신선한 PBS-완충 포름알데히드에서 후-고정시켰다. 각각의 치료군으로부터의 5개의 샘플을 면역형광 분석을 위해 무작위로 선택하였다. 근육을 파라핀-포매하고, 절편화하였다. 면역형광 표지를 사용하여 유형 I 및 유형 IIa 근육 섬유를 염색하였다. 두 염색 표지에 대한 각각의 샘플의 대표 영역 상에서 영상 분석을 수행하였다. 샘플 처리시, 절편 (두께, 8 μM)을 절단하고, 면역형광 염색을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 [35]. 간략하게, 슬라이드를 시트레이트 완충제 (10 mM, pH 6.0) 중에서 열 유도 항원 회복에 적용하고, 비특이적 항원성 차단제로 차단한 후에 1차 항체 ab11083 (1:250 희석) 및 ab91506 (1:200 희석)과 함께 밤새 인큐베이션하였다. 1차 항체 농도 둘 다를 시험 슬라이드에서의 최적화 후에 결정하였다. 상응하는 형광 접합된 2차 항체 (Alexa 594 및 Alexa 488)를 실온에서 1시간 동안 적용하였다. 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 2차 항체와 함께 포함시켜 핵을 가시화하였다.

영상 획득 및 분석

슬라이드를 맞춤형 컴퓨터-제어 현미경 (xy-스테이지 및 z 컨트롤러 구비, 자이스 현미경, 칼 자이스 게엠베하, 독일 예나)을 사용하여 X4 및 X10 대물렌즈로 스캐닝하였다. 영상을 MATLAB (R2011b, 매쓰웍스)에 기초한 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 스캐닝 셋업을 위한 기준선은 HU-대조군을 사용하여 수행하였다. 2차 항체 대조군으로 염색된 조직의 현미경 슬라이드로부터 생성된 영상에 영상 분석 알고리즘을 적용하여 배경 점수를 생성하였다. 대조군/기준선을 사용하여 모든 영상에 적용된 신호 및 신호-대-노이즈 비율을 구별하는 알고리즘을 생성하였다. 각각의 마커를 단일 채널-기반 분석에 의해 정량화하였다. 자동 배경 차감을 수행하였다. 이어서, 평균 신호 강도를 장소(locale) 면적으로 나눈 것에 상응하는 모든 마커에 대한 강도 점수를 계산하였다. 마우스 근육 조직 내 상이한 군의 염색에 대한 염색된 상대 면적에서의 유의한 차이 및 평균 비강도(specific intensity)를 계산하였다. 미가공 데이터를 제시하고, 정규화를 수행하지 않았다.

마우스 가자미근 조직으로부터의 RNA 단리 및 유전자 어레이

유전자 발현 분석을 가자미근 조직 샘플에 대해 수행하였다. 3 μl 프로테이나제 K를 포함한 300 μL의 균질화 용액 (퀀티진 플렉스 검정, 인비트로젠)을 10 mg의 동결된 조직에 첨가하여 농축된 용해물을 제조하였다. 하나의 5-mm 스테인레스 스틸 비드를 튜브에 첨가하고, 불렛 블렌더(Bullet Blender)® 균질화기에 넣었다. 이어서, 조직을 속도 10에서 2분 동안 균질화하였다. 튜브를 실온에서 냉각시키고, 가시적인 입자가 남아있지 않을 때까지 과정을 반복하였다. 이어서, 조직 용해물을 65℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 16,000x g에서 15분 동안 원심분리하고, 상청액을 즉시 검정 키트에 사용하였다 (제조업체의 가이드라인에 따름). 순 평균 형광 강도 (MFI)를 모든 유전자에 대해 루미넥스로부터 수득하였다.

표 1. NPN_1 치료 후 조절된 유전자 발현 배수. 대조군 비히클 및 NPN_1 치료된 동물 (N=10/군)로부터의 수집된 가자미근 조직 샘플로부터 RNA를 추출하였다. 근발생 및 미토콘드리아 생물발생과 관련된 유전자가 상향조절되었다.

조성물

식품 보충제 분말 I

식품 보충제 분말 II

식품 보충제 분말 III

식품 보충제 분말 IV

식품 보충제 분말 V

식품 보충제 분말 VI

식품 보충제 분말 VII

국소 조성물

국소 조성물은 근육 위축을 앓고 있는 대상체에게, 또는 격렬한 신체 활동 후의 건강한 사람에게 국소로 적용될 수 있다.

백분율은 단지 예이며, 용도에 따라 임의의 적합한 백분율이 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이다.

에멀젼을 다음 방식으로 제조하였다: 상 A: 울트레즈 10 (카르보머)을 물 중에 분산시키고, 20분 동안 팽윤되도록 한 다음, 상 B를 부가하고; 75℃로 가열하였다. 상 C를 별도로 75℃로 가열하였다. 2개의 상을 교반 하에 혼합하고, 균질화하고, 상 D를 부가하고, 상 E로 중화시키고, 30℃에 도달할 때까지 냉각시킨 다음, 상 F 및 상 G를 부가하고; NaOH를 사용하여 pH를 ~6으로 조정하였다. 이는 단지 예일 뿐이며, 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이다.

등가물

상기 설명은 현재 본 발명의 바람직한 실시양태를 상술한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이들 설명을 고려하여 그의 실시에 있어서 수많은 변형 및 변경이 발생할 것으로 예상한다. 이들 변형 및 변경은 본원에 첨부된 청구범위 내에 포괄되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> NURITAS LIMITED <120> PEPTIDES FOR TREATING MUSCLE ATROPHY <130> P12774PC00 <150> EP19192689.8 <151> 2019-08-20 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 1 Thr Ile Lys Leu Pro Ala Gly Thr 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 2 Ile Glu Asp Pro Gly Gln Phe Pro Thr 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 3 His Leu Pro Ser Tyr Ser Pro Ser Pro Gln 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 4 Lys Gly Asp Ile Ile Ala Ile Pro Ser Gly Ile Pro Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 5 Leu Asp Trp Tyr Lys Gly Pro Thr 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 6 Ser Arg Gly Pro Ile Tyr Ser Asn 1 5 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 7 Leu Glu Arg Gly Asp Thr Ile Lys Ile Pro Ala Gly Thr 1 5 10 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 8 Thr Ile Lys Ile Pro Ala Gly Thr 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 9 Ser Tyr Ser Pro Ser Pro Gln 1 5 <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 10 Ile Gly Ser Ser Ser Ser Pro Asp Ile Tyr Asn Pro Gln Ala Gly Arg 1 5 10 15 Ile Lys Thr <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 11 Ile Asp Pro Asn Gly Leu His Leu Pro Ser Tyr Ser Pro Ser Pro Gln 1 5 10 15 Leu <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 12 Leu Val Asn Arg Asp Asp Glu Glu Asp Leu Arg Val Leu Asp Leu Val 1 5 10 15 Ile Pro <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 13 Ile Thr Gly Gln Val Leu His Pro Asn Gly Gly Thr Val Val Asn Ala 1 5 10 15 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 14 Ala Leu Glu Pro Asp Asn Arg 1 5 <210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 15 Leu Arg Glu Gln Ser Gln Gln Asn Glu Cys Gln Leu Glu Arg 1 5 10 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 16 Val Ala Gly Lys Gly Ile Pro Trp Asp Lys Gln Asp Pro Gly Glu Glu 1 5 10 15 Ala Ile Glu Ser 20 <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 17 Val Gly Arg Arg Gly Gly Gln His Gln Gln Glu Glu Glu Ser Glu Glu 1 5 10 15 Gln Lys Asp <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 18 Tyr Asp Glu Glu Lys Glu Gln Gly Glu Glu Glu Ile Arg Lys 1 5 10 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 19 His Leu Pro Ser Tyr Ser Pro Ser Pro 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 20 Ser Tyr Ser Pro Ser Pro 1 5

Claims (15)

1. 50개 이하의 아미노산을 갖고 서열식별번호: 20의 서열을 포함하는 펩티드를 포함하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 펩티드가 6 내지 20개의 아미노산을 갖는 것인 조성물.
3. 제2항에 있어서, 서열식별번호: 20의 서열을 포함하는 펩티드가 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 11 및 서열식별번호: 19로부터 선택되는 것인 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 50개 이하의 아미노산을 갖고 서열식별번호: 8의 서열을 포함하는 펩티드를 포함하는 조성물.
5. 제4항에 있어서, 50개 이하의 아미노산을 갖고 서열식별번호: 8의 서열을 포함하는 펩티드가 서열식별번호: 8 및 서열식별번호: 7로부터 선택되는 것인 조성물.
6. 제1항에 있어서, 서열식별번호: 3 및 서열식별번호: 8의 펩티드를 포함하는 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 식용 분말인 조성물.
8. 치료 유효량의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 건강한 대상체에게 경구 투여하는 단계를 포함하는, 건강한 대상체에서 근육 합성을 촉진하는 방법.
9. 치료 유효량의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 건강한 대상체에게 경구 투여하는 단계를 포함하는, 건강한 대상체에서 근육 손실을 억제하는 방법.
10. 치료 유효량의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 건강한 대상체에게 경구 투여하는 단계를 포함하는, 건강한 대상체에서 염증 반응을 개선시키는 방법.
11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 근육 위축을 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물.
12. 50개 이하의 아미노산을 갖고 서열식별번호: 20을 포함하는 단리된 펩티드.
13. 제12항에 있어서, 6-20개의 아미노산을 갖는 단리된 펩티드.
14. 제13항에 있어서, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 11 및 서열식별번호: 19로부터 선택되는 단리된 펩티드.
15. 건강한 대상체에서 근육 합성을 촉진하기 위한, 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 단리된 펩티드 또는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.

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