CN114650834A - 用于治疗肌肉萎缩的肽 - Google Patents

Abstract

申请人已经发现了许多肽，所述肽能够在体外细胞测定中在一定浓度范围内以剂量依赖的方式使核糖体蛋白S6(rpS6)磷酸化。RPS6是蛋白激酶的关键底物，并且在细胞生长和细胞分裂期间被生长因子和丝裂原磷酸化。这是骨骼肌组织中新蛋白质合成的关键步骤。所描述的肽还能够降低与蛋白质降解增加从而导致进行性骨骼肌萎缩直接关联的mRNA转录物(TRIM63和FBXO32)的表达。另外，肌肉萎缩的增加与循环TNFα的全身升高有关联。本文所述的肽还导致循环免疫细胞中的TNFα的表达降低。所述肽可以用于促进展现出肌肉萎缩的受试者的肌肉生长和肌肉健康，所述受试者为例如老年受试者、身体不活动的人和患有以肌肉萎缩为特征的适应症(即，MS和脊髓灰质炎)的受试者。

Description

用于治疗肌肉萎缩的肽

技术领域

本发明涉及多种肽和包含一种或多种肽的组合物。还考虑了所述肽或组合物用于治疗或预防受试者的肌肉萎缩的用途。

背景技术

肌肉萎缩是一种人类病症，其特征在于肌肉损耗、蛋白质降解增加、全身炎症增加以及受影响的肌肉类型中新合成蛋白下调。该病症的症状包括一个或多个肢体明显虚弱，一条手臂或腿明显小于另一条。它通常与衰老(通常作为肌肉减少症的一部分)相关，与长期身体不活动的受试者相关，所述受试者为例如卧床不起的患者、宇航员、受伤的运动员、患有进食障碍的受试者、患有代谢疾病的受试者、以及患有以神经元、肌肉或关节退行为特征的疾病的受试者，所述以神经元、肌肉或关节退行为特征的疾病为诸如ALS、MS、肌营养不良、吉兰-巴雷(Guillane-Barre)综合征、肌肉减少症、骨关节炎、脊髓灰质炎、类风湿性关节炎、脊髓性肌萎缩和多发性肌炎。

核糖体蛋白S6是与一分子18S rRNA一起构成小40S核糖体亚基的33种蛋白质之一(4)。rpS6直接与翻译起始所需的m7GpppG 5'-帽结合复合物相互作用，并且表示响应于细胞生长和细胞增殖信号而控制翻译起始的信号转导通路的调节汇集点。rpS6响应于有丝分裂和细胞生长刺激而经历可诱导的磷酸化，并且这种磷酸化在脊椎动物、无脊椎动物、植物和真菌中是保守的(5)。在较高等真核生物中，磷酸化发生在rpS6的羧基末端的以下五个丝氨酸残基的簇上：Ser-235、Ser-236、Ser-240、Ser-244和Ser-247(6)。果蝇rpS6含有五个磷酸化位点的类似组织，而在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中发现的同源物含有对应于哺乳动物Ser-235和Ser-236的两个Ser残基(4)。rpS6的磷酸化以有序的方式发生，从Ser-236开始，然后依次是Ser-235、Ser-240、Ser-244和Ser-247的磷酸化(7、8)。rpS6在C-末端残基的磷酸化增强了其对m7GpppG帽的亲和力，这强烈暗示了rpS6磷酸化增强mRNA翻译起始。

rpS6的羧基末端磷酸化受到至少两种信号转导通路的调节。p70核糖体S6激酶S6K1和S6K2在响应于胰岛素、血清和氨基酸刺激的rpS6 C末端磷酸化中起主要作用(4)。S6K1和S6K2将Ser-240和Ser-244磷酸化，但对于完整细胞中的Ser-235和Ser-236磷酸化是非必要的(13)。S6K1和S6K2的活性进而直接受到哺乳动物雷帕霉素靶点mTOR的调节，mTOR对生长和有丝分裂信号有反应。用雷帕霉素抑制mTOR会引起哺乳动物细胞中rpS6磷酸化的急剧减少(14)。mTOR还磷酸化转译阻遏物4E-BP1，引起其从m7GpppG 5'-帽结合复合物解离，并且通过S6K和4E-BP1的组合磷酸化，mTOR响应于有利生长条件而正向调节蛋白质翻译。RAS/ERK通路还通过激活p90核糖体S6K激酶RSK1和RSK2来调节rpS6磷酸化，不依赖mTOR(12)。响应于佛波酯、血清和致癌RAS，RSK1和RSK2在Ser-235和Ser-236上磷酸化rpS6，并且这两个残基的磷酸化是帽结合所需要的(13)。

本发明的目的是克服以上提及的问题中的至少一个。

发明内容

申请人已经发现了许多源自蚕豆(Vicia faba)蛋白的肽，所述肽能够在体外细胞测定(图1-10、12)中在一定浓度范围内以剂量依赖的方式使核糖体蛋白S6(rpS6)磷酸化。RPS6是蛋白激酶的关键底物，并且在细胞生长和细胞分裂期间被生长因子和丝裂原磷酸化。这是骨骼肌组织中新蛋白质合成的关键步骤。所描述的肽还能够降低与蛋白质降解增加从而导致进行性骨骼肌萎缩直接关联的mRNA转录物(TRIM63和FBXO32)的表达(图14-15)。另外，肌肉萎缩的增加与循环TNFα的全身升高有关联。本文所述的一些肽还导致循环免疫细胞中的TNFα的表达降低。所述肽可以用于促进受试者的肌肉生长和肌肉健康，降低肌肉损失并且支持免疫和/或炎性响应，特别是展现出肌肉萎缩的受试者，例如老年受试者、身体不活动的人和患有以肌肉萎缩为特征的适应症(即，MS和脊髓灰质炎)的受试者。

根据本发明的第一方面，提供了一种肽，所述肽包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或基本上由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：

TIKLPAGT SEQUENCE ID 1

IEDPGQFPT SEQUENCE ID 2

HLPSYSPSPQ SEQUENCE ID 3

KGDIIAIPSGIPY SEQUENCE ID 4

LDWYKGPT SEQUENCE ID 5

SRGPIYSN SEQUENCE ID 6

LERGDTIKIPAGT SEQUENCE ID 7

TIKIPAGT SEQUENCE ID 8

SYSPSPQ SEQUENCE ID 9

IGSSSSPDIYNPQAGRIKT SEQUENCE ID 10

IDPNGLHLPSYSPSPQL SEQUENCE ID 11

LVNRDDEEDLRVLDLVIP SEQUENCE ID 12

ITGQVLHPNGGTVVNA SEQUENCE ID 13

ALEPDNR SEQUENCE ID 14

LREQSQQNECQLER SEQUENCE ID 15

VAGKGIPWDKQDPGEEAIES SEQUENCE ID 16

VGRRGGQHQQEEESEEQKD SEQUENCE ID 17

YDEEKEQGEEEIRK SEQUENCE ID 18

HLPSYSPSP SEQUENCE ID 19

SYSPSP SEQUENCE ID 20

或其功能变体(下文称为“本发明的肽”)。

在一个实施方案中，所述肽包含SEQ ID 20。此类肽的实例包括SEQ ID 3、SEQ ID9、SEQ ID 11和SEQ ID 19。

在另一方面，本发明提供了本发明的修饰肽。所述肽可以通过本文所述的任何方法进行修饰，例如，通过N-末端、C-末端或氨基酸侧链修饰，通过聚乙二醇化，通过环化或通过脂化。

在另一方面，本发明提供了一种缀合物，所述缀合物包含与结合配偶体缀合(通常共价缀合)的本发明的肽。

术语“本发明肽”包括修饰肽和缀合物。

在另一方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含一种或多种或所有的本发明的肽，例如1、2、3、4或5种本发明的肽。

在一个实施方案中，所述组合物包含肽，所述肽包含SEQ ID 20，例如，所有SEQ ID3、SEQ ID 9、SEQ ID 11和SEQ ID 19中的一种、两种、三种。

在一个实施方案中，所述组合物包含肽，所述肽包含SEQ ID 1或SEQ ID 8或基本上由SEQ ID 1或SEQ ID 8组成，例如SEQ ID 7和SEQ ID 8。

在一个实施方案中，所述组合物是粉末，其任选地包含另外的肽。所述粉末可以是蛋白质水解产物，其可以补充有肽，和/或可以作为可食用粉末提供。在一个实施方案中，所述粉末包含约0.0001至约1.0％、约0.0001至约0.2％、约0.001至约0.1％或约0.001至约0.1％的一种或多种本发明的肽(w/w)。在一个实施方案中，所述粉末基本上不含全蛋白质。在一个实施方案中，所述组合物是食品、饮料或膳食补充剂。在另一个实施方案中，所述组合物是局部组合物。

在一个实施方案中，所述粉末包含SEQ ID 1和3的肽，其含量通常为约0.01％至0.2％(w/w)。

在一个实施方案中，所述粉末包含SEQ ID 1、2、3和5的肽，其含量通常为约0.001％至0.2％(w/w)。

在一个实施方案中，所述粉末包含SEQ ID 1、2、3、4和5的肽，其含量通常为约0.001％至0.2％(w/w)。

在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的与药学上可接受的赋形剂的组合的本发明的肽。

在另一方面，本发明提供了治疗或预防受试者的肌肉萎缩的方法，包含向受试者施用治疗有效量的本发明的肽或组合物的步骤。可以借助药物组合物、借助膳食补充剂或借助包含本发明的肽或组合物的食品或饮料来施用治疗。在一个实施方案中，所述受试者是老年受试者或身体不活动的受试者，例如具有身体受伤的受试者。

在另一方面，本发明提供了治疗或预防患有以肌肉萎缩为特征的疾病或病症的受试者的肌肉萎缩的方法，包含向受试者施用治疗有效量的本发明的肽或组合物的步骤。以肌肉萎缩为特征的疾病或病症的实例包括身体受伤、进食障碍、代谢障碍(包括I型和II型糖尿病)，以及以神经元、肌肉或关节退行为特征的疾病，诸如ALS、MS、肌营养不良、吉兰-巴雷综合征、骨关节炎、脊髓灰质炎、类风湿性关节炎、脊髓性肌萎缩、恶病质、肌肉减少症、营养失调和多发性肌炎。

在另一方面，本发明提供了促进受试者的肌肉合成的方法，包含向受试者施用治疗有效量的本发明的肽或组合物的步骤。

在另一方面，本发明提供了降低受试者的肌肉损失的方法，包含向受试者施用治疗有效量的本发明的肽或组合物的步骤。

在另一方面，本发明提供了支持或增强受试者的免疫响应或炎性响应的方法，包含向受试者施用治疗有效量的本发明的肽或组合物的步骤。

在另一方面，本发明提供了在受试者肌肉分解的时间段期间(例如，在重量锻炼期间)保护肌肉的方法，包含向受试者施用治疗有效量的本发明的肽或组合物的步骤。

在另一方面，本发明提供了增加受试者的肌肉纤维(尤其是I型或II型肌肉纤维)的丰度的方法，包含向受试者施用治疗有效量的本发明的肽或组合物的步骤。

在任何实施方案中，受试者可以是健康的、年轻的或年老的。

在任何实施方案中，肽或组合物可以口服施用(例如，在饮料、食品或药物组合物中)。

在任何实施方案中，肽包含SEQ ID 20。此类肽的实例包括SEQ ID 3、SEQ ID 9、SEQ ID11和SEQ ID 19。

在任何实施方案中，肽包含SEQ ID 1或SEQ ID 8或基本上由SEQ ID 1或SEQ ID 8组成，例如SEQ ID 7和SEQ ID 8。

在另一方面，本发明提供了编码本发明的肽的核酸。

在另一方面，本发明提供了包含编码本发明肽的DNA的表达载体(下文称为“本发明的表达载体”)，其中所述载体被配置用于在宿主细胞中异源表达本发明的肽。

在另一方面，本发明提供了宿主细胞，尤其是细菌或哺乳动物生产细胞，其经工程化以异源表达本发明肽(下文称为“本发明的转化细胞”)。在一个实施方案中，所述转化的宿主细胞包含本发明的表达载体。

本发明还提供了生产本发明的肽的方法，所述方法包括以下步骤：提供本发明的转化细胞，培养所述转化宿主细胞以实现宿主细胞异源表达本发明的重组肽，以及回收本发明的重组肽。

本发明还提供了工程化用于异源表达本发明的肽的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：用本发明表达载体转化细胞，由此转化细胞能够异源表达本发明的肽。

本发明的其他方面和优选实施方案在下面列出的其他权利要求中定义和描述。

附图说明

图1：在不同肽浓度下的SEQ ID 1的rpS6磷酸化活性。

图2：在不同肽浓度下的SEQ ID 2的rpS6磷酸化活性。

图3：在不同肽浓度下的SEQ ID 3的rpS6磷酸化活性。

图4：在不同肽浓度下的SEQ ID 4的rpS6磷酸化活性。

图5：在不同肽浓度下的SEQ ID 5的rpS6磷酸化活性。

图6：0.5μg/ml的肽SEQ ID 1至5的rpS6磷酸化活性。

图7：在饥饿方案后20分钟内，0.05μg/ml的肽的rpS6磷酸化活性：SEQ ID 8；SEQID1；SEQ ID 3；SEQ ID 10；SEQ ID 16；SEQ ID 11；SEQ ID 12；SEQ ID 17；SEQ ID 18(单因素方差分析；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；平均值±SEM；N＝4)：

图8：SEQ ID 6对S6磷酸化的影响。在饥饿方案之后，将C2C12细胞用肽(0.005-0.5μg/ml)处理30min(学生t检验或单因素方差分析；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；平均值±SEM；N＝4)。

图9：含有基序SYSPSP(SEQ ID 20)的SEQ ID 9对S6磷酸化的影响。在饥饿方案之后，将C2C12细胞用肽(5μg/ml)处理30min(学生t检验或单因素方差分析；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；平均值±SEM；N＝4)。

图10：含有基序SYSPSP(SEQ ID 20)的SEQ ID 11对S6磷酸化的影响。在饥饿方案之后，将C2C12细胞用肽(0.005-0.5μg/ml)处理30min(学生t检验或单因素方差分析；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；平均值±SEM；N＝4)。

图11：肽处理对TNF-α分泌的影响。将THP-1巨噬细胞用Nuritas肽(0.5μg/ml)处理24小时，并且然后用LPS(100ng/ml)刺激24小时。SEQ ID 14；SEQ ID 8；SEQ ID 13；SEQ ID15。(单因素方差分析；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；平均值±SEM；N＝4)。

图12：肽处理对S6磷酸化的影响。在饥饿方案之后，将C2C12细胞用SEQ ID 2(0.5-5μg/ml)处理30min。(单因素方差分析；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；平均值±SEM；N＝3)。

图13：肽处理对TNF-α分泌的影响。将THP-1巨噬细胞用SEQ ID 2(0.05-5μg/ml)处理24小时，并且然后用LPS(100ng/ml)刺激24小时。(单因素方差分析；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；平均值±SEM；N＝3)。

图14：Nuritas肽对萎缩相关基因表达的影响。对萎缩诱导的C2C12细胞进行PCR分析，显示SEQ ID 19(含有SYSPSP基序)对TRIM63(N＝6)基因表达的影响。将细胞用地塞米松(0.3μg/ml)处理24h，在地塞米松处理结束前30min，添加pep_MU12PE(0.5-5μg/ml)。(单因素方差分析；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；平均值±SEM)。

图15：Nuritas肽对萎缩相关基因表达的影响。对萎缩诱导的C2C12细胞进行PCR分析，显示SEQ ID 19(含有SYSPSP基序)对FBXO(N＝5)基因表达的影响。将细胞用地塞米松(0.3μg/ml)处理24h，在地塞米松处理结束前30min，添加pep_MU12PE(0.5-5μg/ml)。(单因素方差分析；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；平均值±SEM)。

图16：NPN_1(包含SEQ ID 3和8的粉末组合物)显著防止了比目鱼肌在去负荷后的肌肉损失。将C57BL/6小鼠用BBI(113.3mg/kg/天)、酪蛋白(650mg/kg/天)或NPN_1(650mg/kg/天)在18天的过程中处理。(单因素方差分析；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；N＝10)。

图17：NPN_1减少结缔组织和肌间脂肪的量并且增加肌肉纤维密度。A)对I型(红色)和IIa型(绿色)肌肉纤维密度的骨骼肌免疫染色以及苏木精和伊红(H&E)染色证明了NPN_1的影响。处理对I型(B)和IIa型(C)纤维密度的影响的量化(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；N＝5)。

具体实施方式

将本文提及的所有出版物、专利、专利申请和其他参考文献均出于所有目的通过引用以其整体并入本文，就好像具体且单独地指示将每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入并且其内容以全文引用。

定义和一般偏好

在本文中使用的情况下，除非另有明确指出，否则以下术语除了该术语在本领域可能具有的任何更宽(或更窄)的含义之外，还旨在具有以下含义：

除非上下文另有要求，否则本文中单数的使用应理解为包括复数，反之亦然。与实体有关施用的术语“一(a)”或“一(an)”应理解为是指一个或多个该实体。因此，术语“一(a)”(或“一(an)”)、“一个或多”和“至少一个”在本文中可互换使用。

如本文所用，术语“包含(comprise)”或其变体诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为指示包括任何列举的整体(integer)(例如，特征、要素、特性、性质、方法/过程步骤或限制)或整体组(例如，特征、要素、特性、性质、方法/过程步骤或限制)，但不排除任何其他整体或整体组。因此，如本文所用，术语“包含”是包含性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的整体或方法/过程步骤。

如本文所用，术语“疾病”用于定义损害生理功能并且与特定症状相关的任何异常病症。该术语广泛用于涵盖生理功能受损的任何障碍、病患、异常、病理、病态、病症或综合征，而不管病因的性质如何(或实际上是否确定疾病的病因基础)。因此，它涵盖由感染、创伤、损伤、手术、放射消融、中毒或营养缺乏引起的病症。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指治愈、改善或减轻疾病的症状或消除其一种或多种病因(或减轻其影响)的干预(例如，向受试者施用药剂)。在这种情况下，该术语与术语“疗法”同义使用。

另外，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指预防或延迟疾病的发作或进展，或降低(或根除)其在受治疗群体中的发病率的干预(例如，向受试者施用药剂)。在这种情况下，术语治疗与术语“预防”同义使用。

如本文所用，有效量或治疗有效量的本发明的肽定义了这样的量，所述量可以施用于受试者而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称，但所述量足以提供所希望的效果，例如治疗或预防表现为受试者病症的永久或暂时的改善。所述量将因受试者而异，取决于个体的年龄和一般状况、施用方式和其他因素。因此，虽然不可能指定确切的有效量，但本领域技术人员将能够使用常规实验和背景常识在任何个别情况下确定适当的“有效”量。在此上下文中，治疗结果包括症状的根除或减轻、疼痛或不适减轻、生存延长、活动能力改善和其他临床改善标志。治疗结果不一定是完全治愈。

在如上定义的治疗和有效量的上下文中，术语受试者(在上下文允许的情况下将被理解为包括“个体”、“动物”、“患者”或“哺乳动物”)定义了治疗针对的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括但不限于人、家养动物、农场动物、动物园动物、运动动物、宠物动物，诸如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛；灵长类动物，诸如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物，诸如狗和狼；猫科动物，诸如猫、狮和虎；马科动物，诸如马、驴和斑马；食用动物，诸如奶牛、猪和绵羊；有蹄类动物，诸如鹿和长颈鹿；以及啮齿动物，诸如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠。在优选的实施方案中，受试者是人。

本文使用的术语“肽”是指通常通过肽键连接的由5至50个氨基酸单体组成的聚合物。本发明的肽和用于本发明的肽(包括其片段和变体)可以全部或部分地通过化学合成或通过从核酸表达产生。例如，可以根据本领域已知的充分确认的标准液相，或优选为固相肽合成方法容易地制备本发明的肽和用于本发明的肽(参见，例如，J.M.Stewart和J.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd edition,Pierce Chemical Company,Rockford,Illinois(1984),in M.Bodanzsky and A.Bodanzsky,The Practice ofPeptide Synthesis,Springer Verlag,New York(1984))。必要时，可以对本发明中使用的任何肽进行化学修饰以增加其稳定性。经化学修饰的肽或肽类似物包括肽的任何功能化学等效物，其特征在于就本发明的实践而言其在体内或体外的稳定性和/或功效增加。术语肽类似物还指如本文所述肽的任何氨基酸衍生物。可以通过包括但不限于侧链的修饰、，在肽合成过程中掺入非天然氨基酸和/或其衍生物和使用交联剂以及在肽或其类似物施加构象约束的其他方法的程序来制备肽类似物。侧链修饰的实例包括氨基的修饰，诸如通过与醛反应，然后用NaBH4还原进行还原烷基化；用乙酰亚胺酸甲酯(methylacetimidate)进行酰胺化；用乙酸酐进行乙酰化；用氰酸酯对氨基进行氨甲酰化；用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)对氨基进行三硝基苄基化；用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐对氨基进行酰化；以及用吡哆醛-5’-磷酸对赖氨酸进行吡哆醛化，然后用NABH₄还原。精氨酸残基的胍基可以通过与试剂诸如2,3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛形成杂环缩合产物来修饰。羧基可以通过经由形成O-酰基异脲形成的碳二亚胺活化，然后随后的衍生化(例如相应的酰胺)来修饰。巯基可以通过诸如以下方法来修饰：用碘乙酸或碘乙酰胺进行羧甲基化；过甲酸氧化成磺基丙氨酸；与其他硫醇化合物形成混合二硫化物；与马来酰亚胺、马来酸酐或其它经取代的马来酰亚胺反应；使用4-氯汞苯甲酸酯、4-氯汞苯磺酸、氯化苯汞、2-氯汞基-4-硝基酚和其他汞剂形成汞衍生物；在碱性pH下用氰酸酯进行氨甲酰化。色氨酸残基可以通过例如，用N-溴代丁二酰亚胺进行氧化或用2-羟基-5-硝基苄基溴或磺酰卤对吲哚环进行烷基化来修饰。酪氨酸残基可以通过用四硝基甲烷进行硝化以形成3-硝基酪氨酸衍生物来改变。组氨酸残基的咪唑环的修饰可以通过用碘乙酸衍生物进行烷基化或用焦碳酸二乙酯进行N-乙酯基化(N-carbethoxylation)来实现。在肽合成过程中掺入非天然氨基酸和衍生物的实例包括但不限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。肽结构修饰包括产生包含由D-氨基酸编码的反向序列的逆反肽。

术语“本发明的肽”统指包含选自SEQUENCE ID NO 1至20的氨基酸序列的肽或基本上由选自SEQUENCE ID NO 1至20的氨基酸序列组成的肽，及其治疗有效变体。本发明的肽可以是重组肽。

如应用于参考肽的术语“治疗有效变体”意指具有与参考肽基本相同的氨基酸序列并且如下定义治疗有效的肽。因此，例如，所述术语应用于包括关于一个或多个氨基酸残基发生改变的变体。优选地，此类改变涉及5个或更少氨基酸、更优选4个或更少、甚至更优选3个或更少、最优选仅1或2个氨基酸的插入、添加、缺失和/或取代。设想用天然氨基酸和经修饰的氨基酸插入、添加和取代。变体可以具有保守的氨基酸变化，其中被引入的氨基酸在结构、化学或功能上与被取代的氨基酸相似。通常，变体将具有与参考抗细菌片段至少70％的氨基酸序列同源性、优选至少80％的序列同源性、更优选至少90％的序列同源性并且理想地至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性。在本说明书中，术语“序列同一性”应理解为包括序列同一性和类似性两者，即，与参考序列共享70％序列同一性的变体(或同源物)是其中变体(或同源物)的任何70％比对残基在序列的整个长度上与参考序列中的相应残基相同或是其保守取代的变体(或同源物)。序列同一性是两个不同序列之间完全匹配的字符量。因此，不计算缺口，并且测量与两个序列中较短的序列有关。就“序列同源性”而言，该术语应理解为表示当变体(或同源物)的比对残基百分比与参考序列中的相应残基相同或是其保守取代时和在变体(或同源物)共享与参考序列相同的功能的情况下，与参考序列共享限定的百分比的类似性或同一性变的体(或同源物)。

这种比对和同源性百分比或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序来确定，例如，一种比对程序是使用默认参数的BLAST。这些程序的详细信息可以在以下互联网地址找到：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi。

在肌肉合成的上下文中，如应用于本发明的肽的“治疗有效”意指在下述磷酸-S6细胞测定中，与对照组相比能够实现rpS6磷酸化显著增加的肽。这尤其适用于SEQ ID 1-3、8-12和16-20的肽。

在支持免疫反应或炎性反应的上下文中，如应用于本发明的肽的“治疗有效”意指在下述TNF-α分泌细胞测定中，与对照组相比能够减少THP-1巨噬细胞中TNF-α分泌的肽。这尤其适用于SEQ ID 2、8和13-15的肽。

“组合物”：本发明还涉及包含一种或多种本发明的肽的组合物。所述肽或所述肽中的一些或全部的肽可以被修饰为或提供为缀合物。所述组合物可以是食品原料粉末、食品饮料、膳食补充剂、药物组合物或局部组合物。在一个实施方案中，所述组合物是运动营养产品，例如饮料、零食或补充剂。在一个实施方案中，所述组合物是饮料。在一个实施方案中，所述组合物是烘焙产品。在一个实施方案中，所述组合物是乳制品。在一个实施方案中，所述组合物是零食产品。在一个实施方案中，所述组合物是烘焙的挤出食品产品。在一个实施方案中，所述组合物是奶粉。在一个实施方案中，所述组合物是婴儿配方产品。在一个实施方案中，所述组合物是糖果产品。在一个实施方案中，所述组合物是酸奶。在一个实施方案中，所述组合物是酸奶饮品。在一个实施方案中，所述组合物是冰淇淋产品。在一个实施方案中，所述组合物是冷冻食品产品。在一个实施方案中，所述组合物是早餐谷物。在一个实施方案中，所述组合物是面包。在一个实施方案中，所述组合物是调味乳饮品。在一个实施方案中，所述组合物是糖果棒。在一个实施方案中，所述组合物是茶或茶产品。在一个实施方案中，所述组合物是基于挤出零食的产品。在一个实施方案中，所述组合物是油炸零食产品。在一个实施方案中，所述组合物是营养补充剂。在一个实施方案中，所述组合物是运动营养产品。在一个实施方案中，所述组合物是幼儿食品产品。在一个实施方案中，所述组合物是用于免疫受损个体的特殊食品产品。在一个实施方案中，所述组合物是用于老年患者的食品。在一个实施方案中，所述组合物是动物饲料。在一个实施方案中，所述组合物是动物饲料补充剂。在一个实施方案中，所述组合物是医疗食品。

所述组合物可以是局部或药物组合物。本发明的肽以治疗有效浓度使用于本发明的局部或药物组合物中以达到所希望的效果；在优选的形式中，相对于组合物的总重量，在0.00000001％(按重量计)与20％(按重量计)之间；优选在0.000001％(按重量计)与15％(按重量计)之间，更优选在0.0001％(按重量计)与10％(按重量计)之间，并且甚至更优选在0.0001％(按重量计)与5％(按重量计)之间。理想地，本发明的肽优选以占组合物的约0.00001％w/w至约0.5％w/w[0.1至5000ppm]，并且更优选0.00005w/w至约0.05w/w[0.5至500ppm]，并且最优选约0.0001w/w至约0.01w/w[1至100ppm]的量使用。理想地，本发明的肽优选以占组合物的约0.0001％w/w至约0.004％w/w的量使用。

用于食品产品和食品或营养补充剂(即，可食用组合物)的本发明的组合物的剂量将广泛地在0.2-100g/天的范围内。在一个实施方案中，每日剂量是1-10g/天，理想地约3-8g/天。在一个实施方案中，每日剂量是10-20g/天。在一个实施方案中，每日剂量是20-30g/天。在一个实施方案中，每日剂量是30-40g/天。在一个实施方案中，每日剂量是10-100g/天。在一个实施方案中，每日剂量是约5g/天，理想地约3-8g/天。在一个实施方案中，剂量是2-1000mg/天/kg体重。在一个实施方案中，剂量是10-500mg/天/kg体重。在一个实施方案中，剂量是10-100mg/天/kg体重。在一个实施方案中，剂量是30-70mg/天/kg体重。用于食品补充剂的本发明的肽的剂量可以是0.00001mg-0.01mg/天或剂。

食品产品可以是特定药用食品(Food for Specific Medicinal Purposes，FSMP)，其被定义为专门配制、加工并且用于对在医疗监督下接受治疗的个体的疾病、障碍或医疗状况进行饮食管理的食品。这些食物旨在为正常食物无法满足营养需求的人提供专属或部分喂养。剂量可以是50-500g/天，取决于患者的年龄和状况。当作为特殊药用食品或医疗食品施用时，每日剂量可以是50-500g/天。

“局部组合物”：本发明还涉及包含本发明的肽或组合物的局部组合物。应当理解，所述局部组合物可以包含多种肽。在一个实施方案中，所述局部组合物包含基本上所有的肽。本发明的局部组合物可以呈现在配制品中，所述配制品选自包含以下项的组：乳膏、复合乳液、无水组合物、水性分散体、油、乳、香脂、泡沫、洗剂、凝胶、乳膏凝胶、水-醇溶液、水-二醇溶液、化妆品、个人护理产品、水凝胶、搽剂、精华液、肥皂、扑粉、糊剂、半固体配制品、搽剂、精华液、洗发露、调理剂、软膏、任何冲洗型配制品、滑石、摩丝、散剂、喷雾剂、气雾剂、溶液、混悬剂、乳液、糖浆剂、酏剂、多糖膜、贴剂、凝胶贴剂、绷带、粘合剂体系、油包水乳液、水包油乳液和有机硅乳液。

“药物组合物”：本发明的另一方面涉及药物组合物，所述药物组合物包含与一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体混合的本发明的肽或本发明的肽的组合物。尽管本发明的肽和组合物可以单独施用，但它们通常与药物载体、赋形剂或稀释剂混合施用，特别是用于人类疗法。药物组合物可以用于人或兽医学用途的人类或动物。用于本文所述的各种不同形式的药物组合物的此类合适的赋形剂的实例可以在由A Wade和PJ Weller编辑的药用赋形剂(Handbook of Pharmaceutical Excipients),第2版,(1994)中找到。特别地，用于局部递送的制剂在由David Osborne、Antonio Aman和Taylor&Francis编辑的局部药物递送制剂(Topical drug delivery formulations)中描述，其全部内容通过引用并入本文。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂是药学领域中公知的，并且描述于例如雷明顿的药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences),Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编辑.1985)。合适的载体的实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨糖醇等。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期的施用途径和标准的药学实践来选择。所述药物组合物可以包含作为载体、赋形剂或稀释剂的或除载体、赋形剂或稀释剂之外的任何合适的一种或多种粘合剂、一种或多种润滑剂、一种或多种助悬剂、一种或多种包衣剂、一种或多种增溶剂。合适的粘合剂的实例包括淀粉、明胶、天然糖(诸如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖)、玉米甜味剂、天然和合成树胶(诸如阿拉伯树胶、黄芪胶或海藻酸钠)、羧甲基纤维素和聚乙二醇。合适的润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。可以在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。还可以使用抗氧化剂和助悬剂。

本发明的肽或组合物可以适于局部、口服、直肠、肠胃外、肌内、腹膜内、动脉内、支气管内、皮下、皮内、静脉内、经鼻、阴道、经颊或舌下施用途径。对于口服施用，特别使用压制片剂、丸剂、片剂、凝胶剂(gellule)、滴剂和胶囊。优选地，这些组合物每剂包含1至250mg，并且更优选为10-100mg的活性成分。其他施用形式包括可以静脉内、动脉内、皮下、皮内、腹膜内或肌肉内注射的溶液或乳液，且该溶液或乳液由无菌或消毒的溶液制备。本发明的药物组合物还可以呈栓剂、阴道环、阴道栓剂、混悬剂、乳液、洗剂、软膏、乳膏、凝胶、喷雾剂、溶液或扑粉的形式。本发明的组合物可以配制用于局部递送。局部递送通常意指递送至皮肤，但也可以意指递送至衬有上皮细胞的体腔，例如肺或气道、胃肠道、颊腔。特别地，用于局部递送的制剂在由David Osborne、Antonio Aman和Taylor&Francis编辑的局部药物递送(Topical drug delivery formulations)中描述，其全部内容通过引用并入本文。用于递送至气道的组合物或制剂描述于O’Riordan等人(Respir Care,2002,Nov.47)、EP2050437、WO 2005023290、US 2010098660和US 20070053845中。用于将活性剂递送至回肠，尤其是近端回肠的组合物和制剂包括微粒和微胶囊，其中活性剂被包封在由聚合物或乳蛋白形成的保护性基质中，该保护基质耐酸但容易在回肠的更大碱性环境中溶解。此类递送系统的实例在EP 1072600.2和EP 13171757.1中描述。经皮施用的替代方式是使用皮肤贴片。例如，可以将活性成分掺入由聚乙二醇或液体石蜡的水性乳液组成的乳膏中。还可以将活性成分以按重量计的1％与10％之间的浓度掺入由白蜡或白软石蜡基质以及可能需要的稳定剂和防腐剂组成的软膏中。

可注射形式的每剂可以含有10-1000mg、优选10-250mg的活性成分。

组合物可以以单位剂量形式配制，即以含有单位剂量或多单位或亚单位的单位剂量的离散部分的形式配制。

本领域普通技术人员可以容易地确定本发明组合物中的其中一种的合适剂量以施用至受试者而无需过多实验。通常，医生将确定最适合于个体患者的实际剂量，并且这将取决于多种因素，包括所采用的具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时长、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用方式和时间、排泄率、药物组合、特定病症的严重程度以及接受疗法的个体。本文公开的剂量是平均情况的示例。当然，可能存在较高或较低剂量范围是合适的个别情况，且此类情况在本发明的范围内。根据需要，药剂可以以0.01至30mg/kg体重，诸如0.1至10mg/kg、更优选为0.1至1mg/kg体重的剂量施用。在一个示例性实施方案中，将10至300mg/天或更优选为10至150mg/天的一个或多个剂量施用至患者以治疗炎性障碍。

在特别优选的实施方案中，本发明的方法和用途包括将本发明的肽或组合物与一种或多种其他活性剂(例如，市场上可得的现有抗细菌药物或药理学增强剂)组合施用。在这种情况下，本发明的化合物可以与一种或多种其他活性剂连续、同时或相继地施用。

在本发明的一个实施方案中，本发明的肽可以以包含肽、接头和抗体分子的缀合物的形式施用，旨在增加缀合物的体内半衰期。

修饰肽

“修饰肽”：在一个实施方案中，本发明的肽(包括肽变体)可以是修饰肽。术语“修饰肽”与术语“肽的衍生物”可互换使用。在一个实施方案中，术语“修饰肽”意指经修饰以与未修饰的肽相比展现出以下特性中的一种或多种的肽：增加血浆半衰期；增加肽的亲脂性；增加修饰肽的肾清除率；以及增加修饰肽对蛋白水解降解的抗性，同时通常保留rpS6磷酸化活性。本文公开了修饰本发明的肽以展现出这些特性的各种方法，包括将肽与结合配偶体(例如，白蛋白结合小分子、大聚合物、长寿命血浆蛋白、或抗体或抗体片段)缀合、环化、添加N-或C-末端或侧链保护基团、将L-氨基酸用D-异构体替代、氨基酸修饰、增加血浆蛋白结合、增加白蛋白结合。修饰肽包括但不限于已被一个或多个如本文定义的基团取代、或与结合配偶体缀合、或环化的肽。通常，肽经修饰以增加其在动物体内的半衰期。下面提供了各种修饰方法。

在一个实施方案中，修饰可以是为本发明的肽和/或组合物提供增加的穿透细胞能力的任何修饰。在一个实施方案中，修饰可以是增加本发明的组合物或肽的半衰期的任何修饰。在一个实施方案中，修饰可以是增加本发明的组合物或肽的活性的任何修饰。在一个实施方案中，修饰可以是增加本发明的组合物或肽的选择性的任何修饰。

在一个实施方案中，所述基团是保护基团。保护基团可以是N-末端保护基团、C-末端保护基团或侧链保护基团。所述肽可以具有这些保护基团中的一种或多种。

本领域技术人员知道使氨基酸与这些保护基团反应的合适技术。这些基团可以通过本领域已知的制备方法(例如，如US 2014120141的第[0104]至[0107]段中概述的方法)添加。所述基团可以保留在肽上或可以被去除。所述保护基团可以在合成过程中添加。

在本发明的一个实施方案中，所述肽可以被基团取代，所述基团选自一个或多个直链或支链、长链或短链，饱和或不饱和的，被羟基、氨基、氨基酰基、硫酸酯或硫醚基团取代或未经取代，具有从1至29个碳原子。N-酰基衍生物包括衍生自以下的酰基：乙酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、辛酸、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸、亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、油酸、异脂酸、反油酸、2-乙基己酸、椰子油脂肪酸、牛油脂肪酸、硬化牛油脂肪酸、棕榈仁脂肪酸、羊毛脂脂肪酸或类似酸。这些可以是被取代或未被取取代。当被取代时，它们优选被羟基或含硫基团取代，所述含硫基团诸如但不限于SO₃H、SH或S-S。

在本发明的实施方案中，所述肽是R1-X-R2。

R1和/或R2基团分别与肽序列的氨基末端(N-末端)和羧基末端(C-末端)结合。

在一个实施方案中，所述肽是R1-X。可替代地，所述肽是X-R2。

优选地，R1是H、C1-4烷基、乙酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；

X是本发明的肽；

R2是OH或NH2。

在实施方案中，R1选自由以下项形成的组：H、非环状的经取代或未经取代的脂族基团、经取代或未经取代的脂环基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的杂芳基烷基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的芳烷基、叔丁氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)和R₅-CO-，其中R5选自由以下项形成的组：H、非环状的经取代或未经取代的脂族基团、经取代或未经取代的脂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的芳烷基、经取代或未经取代的杂环基和经取代或未经取代的杂芳基烷基；

R2选自由以下项形成的组：-NR3R4、-OR3和-SR3，其中R3和R4独立地选自由以下项形成的组：H、非环状的经取代或未经取代的脂族基团、经取代或未经取代的脂环基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的杂芳基烷基、经取代或未经取代的芳基和经取代或未经取代的芳烷基；并且条件是R1和R2不是α-氨基酸。

根据另一个优选实施方案，R2是-NR3R4、-OR3或-SR3，其中R3和R4独立地选自由以下项形成的组：H、经取代或未经取代的C1-C24烷基、经取代或未经取代的C2-C24链烯基、叔丁氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、经取代或未经取代的C2-C24炔基、经取代或未经取代的C3-C24环烷基、经取代或未经取代的C5-C24环烯基、经取代或未经取代的C8-C24环炔基、经取代或未经取代的C6-C30芳基、经取代或未经取代的C7-C24芳烷基、经取代或未经取代的3-10元杂环基环、和经取代或未经取代的具有2至24个碳原子和1至3个非碳的原子的杂芳基烷基，其中烷基链具有1至6个碳原子。任选地，R3和R4可以通过饱和或不饱和的碳-碳键结合，与氮原子形成环。更优选地，R2是-NR3R4或-OR3，其中R3和R4独立地选自由以下项形成的组：H、经取代或未经取代的C1-C24烷基、经取代或未经取代的C2-C24烯基、经取代或未经取代的C2-C24炔基、经取代或未经取代的C3-C10环烷基、经取代或未经取代的C6-C15芳基和经取代或未经取代的3至10元杂环基、经取代或未经取代的具有3至10元环和1至6个碳原子的烷基链的杂芳基烷基。更优选地，R3和R4选自由以下项形成的组：H、甲基、乙基、己基、十二烷基或十六烷基。甚至更优选地，R3是H，并且R4选自由以下项形成的组：H、甲基、乙基、己基、十二烷基或十六烷基。根据甚至更优选的实施方案，R2选自-OH和-NH2。

根据本发明的另一个实施方案，R1选自由以下项形成的组：H、乙酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基或棕榈酰基，并且R2是-NR3R4或-OR3，其中R3和R4独立地选自H、甲基、乙基、己基、十二烷基和十六烷基，优选地R2是-OH或-NH2。更优选地，R1是乙酰基或棕榈酰基，并且R2是-NH2。在一个优选实施方案中，酰基与肽的至少一个氨基酸的N-末端结合。

在本发明的一个实施方案中，肽经修饰以包含侧链保护基团。侧链保护基团可以是包含以下项的组中的一个或多个基团：苄基或基于苄基的基团、基于叔丁基的基团、苄氧基-羰基(Z)基团和烯丙氧基羰基(alloc)保护基团。侧链保护基团可以衍生自非手性氨基酸，诸如非手性甘氨酸。使用非手性氨基酸有助于稳定所得的肽，并且也有利于本发明的精简合成路线。优选地，所述肽进一步包含经修饰的C-末端，优选为酰胺化的C-末端。非手性残基可以是α-氨基异丁酸(甲基丙氨酸)。应当理解，所使用的特定侧链保护基团将取决于肽的序列和所使用的N-末端保护基团的类型。在本发明的一个实施方案中，所述肽与一种或多种聚乙二醇聚合物或其他化合物(诸如增加分子量的化合物)缀合、连接或融合。增加分子量的化合物是会增加分子量，通常增加所得缀合物的10％至90％或20％至50％并且可以具有200与20,000之间、优选为500与10,000之间的分子量的任何化合物。增加分子量的化合物可以是PEG、任何水溶性(两亲性或亲水性)聚合物部分、PEG的均聚物或共聚物、单甲基取代的PEG聚合物(mPEG)和聚氧乙烯甘油(POG)、聚氨基酸(诸如聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸，特别是L构象的那些)、药理学上无活性的蛋白质(诸如白蛋白)、明胶、脂肪酸、多糖、脂质氨基酸和葡聚糖。聚合物部分可以是直链的或支链的并且它可以具有500至40000Da、5000至10000Da、10000至5000Da的分子量。所述化合物可以是任何合适的细胞穿透化合物，诸如tat肽、渗透素、pep-1。所述化合物可以是抗体分子。所述化合物可以是亲脂性部分或聚合物部分。亲脂性取代基和聚合物取代基是本领域中已知的。亲脂性取代基包括形成酯、磺酰酯、硫酯、酰胺或磺酰胺的一部分的酰基、磺酰基、N原子、O原子或S原子。亲脂性部分可以包括具有4至30个C原子、优选8至12个C原子的烃链。它可以是直链或支链、饱和或不饱和的。烃链可以进一步被取代。它可以是环烷烃或杂环烷烃。所述肽可以在N-末端、C-末端或两者处被修饰。聚合物或化合物优选与氨基、羧基或硫基连接并且可以通过任何氨基酸残基的侧链的N-末端或C-末端连接。聚合物或化合物可以与任何合适残基的侧链缀合。聚合物或化合物可以经由间隔物缀合。间隔物可以是天然或非天然氨基酸、琥珀酸、赖氨酰基、谷氨酰基、天冬酰胺酰基、甘氨酰基、β-丙氨酰基、γ-氨基丁酰基。聚合物或化合物可以经由酯、磺酰酯、硫酯、酰胺、氨基甲酸酯、脲、磺酰胺缀合。本领域技术人员知道制备所希望的缀合物的合适手段。

例如，肽可以通过与聚合物的共价缀合进行化学修饰，以增加其循环半衰期。例如美国专利号4,766,106；4,179,337；4,495,285；和4,609,546中说明了示例性聚合物和将此类聚合物附接到肽的方法。另外的说明性聚合物包括聚氧乙基化多元醇和聚乙二醇(PEG)部分。

可以使本发明的肽经受一种或多种修饰以操纵肽的储存稳定性、药代动力学和/或生物活性的任何方面，诸如例如效力、选择性和药物相互作用。肽可经受的化学修饰包括但不限于聚乙二醇(PEG)、单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇、多聚乙酰神经氨酸(colominic acid)或其他基于碳水化合物的聚合物、氨基酸聚合物和生物素衍生物中的一种或多种与肽的缀合。例如，Goodson,R.J.&Katre,N.V.(1990)Bio/Technology 8,343和Kogan,T.P.(1992)Synthetic Comm.22,2417中公开了蛋白质在Cys残基处的PEG缀合。

修饰肽还可以包含其中一个或多个残基被修饰(即，通过磷酸化、硫酸化、酰化、聚乙二醇化等)的序列，以及包含一个或多个关于亲本序列的修饰残基的突变体。氨基酸序列也可以用能够直接或间接提供可检测信号的标签进行修饰，所述可检测信号包括但不限于放射性同位素、荧光和酶标签。荧光标签包括例如Cy3、Cy5、Alexa、BODIPY、荧光素(例如，FluorX、DTAF和FITC)、罗丹明(例如，TRITC)、金胺、德克萨斯红、AMCA蓝和荧光黄。优选的同位素标签包括3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和286Re。优选的酶标签包括过氧化物酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加过氧化物酶、和碱性磷酸酶(参见，例如，美国专利号3,654,090；3,850,752和4,016,043)。酶可以通过与诸如碳二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等桥接分子反应而缀合。酶标签可以目测检测或通过量热技术、分光光度技术、荧光分光光度技术、电流分析技术或气体计量技术来测量。其他标签体系，诸如抗生物素蛋白/生物素、酪胺信号放大(TSA^TM)，是本领域中已知的，并且是可商购的(参见，例如，ABC试剂盒，Vector Laboratories,Inc.，加利福尼亚州伯林盖姆；

Life Science Products,Inc.，马萨诸塞州波士顿)。

在一个实施方案中，将肽、变体和/或组合物进行修饰以增加药物性能能力。在一个实施方案中，将肽、变体和/或组合物进行修饰以增加稳定性、渗透性、维持效力、避免毒性和/或增加半衰期。修饰可以如上所述。例如，修饰可以是为了保护N和C-末端，它可以是修饰氨基酸、环化、氨基酸的替代、和/或与大分子或大聚合物或长寿命血浆蛋白的缀合。延长半衰期的策略可以如以下所述：Strohl等人(BioDrugs,2015)、Schlapschy等人(ProteinEng Des Sel.2013)、Podust,VN等人(Protein Eng Des Sel.2013)、Zhang,L等人(CurrMed Chem.2012)、Gaberc-Porekar,V等人(Curr Opin Drug Discov Devel.2008)。实例包括使用聚乙二醇化、脂化(脂肪酸与肽侧链的共价结合)、与Fc结构域和人血清白蛋白的融合、与亲水性氨基酸聚合物(例如，XTEN或PAS)的融合和/或与半衰期延长蛋白的融合。

文献中描述了肽的修饰以延长肽的体内半衰期，例如：Strategies to improveplasma half life time of peptide and protein drugs.Werle M,Bernkop-SchnürchA.Amino Acids.2006June；30(4):351-67。

由于长效肽和蛋白质药物的明显优点，延长此类化合物的血浆半衰期时间的策略是非常需要的。短的血浆半衰期时间通常是由于快速肾清除以及全身循环过程中发生的酶促降解。肽/蛋白质的修饰可以导致血浆半衰期时间延长。通过缩短生长激素抑制素的总氨基酸量并且用D:-氨基酸替代L:-类似氨基酸，衍生物奥曲肽的血浆半衰期时间是1.5小时，而相比之下，生长激素抑制素的血浆半衰期时间仅为几分钟。与天然蛋白质相比，INF-α-2b的PEG(2,40K)缀合物展现出330倍延长的血浆半衰期时间。此综述的目的是提供以下的概述：延长血浆半衰期时间的可能策略，诸如修饰N-末端和C-末端或聚乙二醇化，以及评价药物修饰的有效性的方法。此外，提供了有关人血液、肝脏和肾脏的最重要蛋白水解酶以及其切割特异性和它们的抑制剂的基本数据，以便预测肽和蛋白质药物在全身循环过程中的酶促切割。

Strategic Approaches to Optimizing Peptide ADME Properties.Li Di AAPSJ.2015Jan；17(1):134-143。

稳定肽免受蛋白水解的策略

许多方法可用于通过结构修饰来增强肽的稳定性。一些方法不仅可以改善稳定性，而且还增强其他ADME特性，例如，环化可以增加稳定性和渗透性；与大分子的缀合可以改善稳定性并且降低肾清除率。在改善肽的稳定性和ADME特性的同时维持效力和避免毒性是重要的。

·保护N-末端和C-末端

血液/血浆、肝脏或肾脏中的许多蛋白水解酶是外肽酶、氨肽酶和羧肽酶，并且它们从N-末端和C-末端分解肽序列。N-末端和/或C-末端的修饰通常可以改善肽的稳定性。许多实例报道了N-乙酰化和C-酰胺化会增加对蛋白水解的抗性。

·用D-氨基酸替代L-氨基酸

用非天然D-氨基酸取代天然L-氨基酸会降低蛋白水解酶的底物识别和结合亲和力并且增加稳定性。一个实例是加压素，所述加压素含有L-Arg并且具有在人体中10-35min的半衰期。D-Arg类似物去氨加压素在健康人类志愿者中具有3.7h的半衰期。在癌症相关蛋白酶尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)的双环肽抑制剂的研究中，用D-丝氨酸替代特定的甘氨酸不仅使效力改善1.8倍，而且而使在小鼠血浆中的稳定性增加4倍。

·氨基酸的修饰

天然氨基酸的修饰可以通过引入空间位阻或破坏酶识别来改善肽的稳定性。例如，促性腺激素释放激素具有非常短的半衰期(分钟)，而布舍瑞林(其中一个甘氨酸被叔丁基-D-丝氨酸替代并且另一个甘氨酸被乙酰胺取代)在人体中具有长得多的半衰期。

·环化

环化引入了构象约束，降低了肽的柔性，并且增加了稳定性和渗透性。取决于官能团，肽可以头对尾、头/尾对侧链或侧链对侧链环化。环化通常通过内酰胺化、内酯化和基于硫醚的桥来完成。二硫桥产生可改善效力、选择性和稳定性的折叠和构象约束。许多富含二硫键的肽已上市或处于临床前或临床开发中，例如利那洛肽、来匹卢定和齐考诺肽。Davies等人(J.Peptide Sci,9:471-501(2003))中描述了许多肽环化的方法，包括树脂上环化、侧链环化(内酰胺桥)、通过正交偶联的环化、酶催化的环化、特定于肽大小的环化和含有噻唑/噁唑环的环肽。

·与大分子的缀合

与大分子(例如，聚乙二醇(PEG)、白蛋白)的缀合是改善肽的稳定性和降低肾清除率的有效策略。

肾清除率

许多肽展现出有希望的体外药理活性，但由于体内半衰期非常短(分钟)而未能证明体内功效。肽的快速清除和短半衰期阻碍了其开发为成功的药物。从全身循环中快速清除肽的主要原因是酶促蛋白水解或/和肾清除。肾小球具有约8nm的孔径，并且MW<2-25kDa的亲水性肽易于通过肾脏的肾小球快速过滤。由于肽不易通过肾小管重吸收，因此它们通常具有高的肾清除率和短的半衰期。肽清除的其他次要途径是内吞作用和通过蛋白酶体和肝脏的降解。动物模型中全身清除与肾清除之间的比较提供了有关肾清除是否可能是主要消除通路的有用信息。

对于肾受损患者，可能需要调节肽药物的剂量以避免累积和较高的药物暴露，因为患有肾功能不全的患者的不适当剂量可能引起毒性或无效疗法。已经开发了若干种策略来降低肽的肾清除率和延长半衰期。这些将在下文进行评述。

·增加血浆蛋白结合

当肽与膜蛋白或血清蛋白结合时，它们的肾清除率会降低。实例是环肽药物奥曲肽(一种用于内分泌肿瘤的治疗)，由于与脂蛋白结合(未结合分数0.65)，其在人体中具有约100min的半衰期。

·与白蛋白结合小分子的共价连接

白蛋白结合小分子与肽的共价附接可以通过经由高度结合的小分子与白蛋白间接相互作用来减少肾小球过滤、改善蛋白水解稳定性并且延长半衰期。

·与大聚合物的缀合

肽与大的合成或天然聚合物或碳水化合物的缀合可以增加它们的分子量和流体动力学体积，从而降低它们的肾清除率。用于肽缀合的常用聚合物是PEG、聚唾液酸(PSA)和羟乙基淀粉(HES)。

·与长寿命血浆蛋白的融合

血浆蛋白，诸如白蛋白和免疫球蛋白(IgG)片段，在人体中具有19-21天的长半衰期。由于高MW(67-150kDa)，这些蛋白质具有低的肾清除率，并且它们与新生儿Fc受体(FcRn)的结合降低了通过血管上皮细的胞饮作用的消除。肽与白蛋白或IgG片段的共价连接可以降低肾清除率并且延长半衰期。

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聚乙二醇化

亲水性聚合物聚乙二醇的长链与目标分子的附接，聚乙二醇化最初被设想为是防止外来蛋白质被免疫系统识别，从而使其能够用作治疗剂的修饰。一旦形成，针对未修饰药物的抗体可以迅速中和并且清除蛋白质药物。出乎意料地，即使在不存在抗药物抗体的情况下，聚乙二醇化也改善蛋白质的药代动力学1。简单地通过使药物分子更大，聚乙二醇化导致药物被肾脏过滤得更慢。增加大小或流体动力学半径导致肾清除率降低和半衰期增加的经验观察于是成为了蛋白质和肽药物的聚乙二醇化的主要根本原因。聚乙二醇化可以对分子具有多种作用，包括使蛋白质或肽更易溶于水并且保护它们免受被蛋白水解酶的降解。聚乙二醇化还可以影响治疗性蛋白质与其同源细胞受体的结合，通常降低亲和力。PEG聚合物的大小、结构和附接方式的变化可能影响被附接的药物的生物活性。

第一代聚乙二醇化方法充满挑战。然而，聚乙二醇化的化学十分简单。过程涉及聚乙二醇链与蛋白质或肽的反应性侧链的共价附接。例如，PEG容易附接到蛋白质或肽的表面上的赖氨酸的氨基2。反应是pH依赖性的。在高pH(8.0或更高)下，赖氨酸侧链氨基通过N-羟基琥珀酰亚胺共价附接到PEG。这种方法通常导致含有附接在蛋白质上的不同位点处的不同数量PEG链的产物家族，而不是单一离散产物3。第一批经批准的聚乙二醇化药物是用作用于严重联合免疫缺陷的酶替代疗法的牛培加酶(Pegademase)(聚乙二醇化牛腺苷脱酰胺酶)和用于治疗急性成淋巴细胞性白血病的培门冬酶(Pegaspargase)(聚乙二醇化天冬酰胺酶)1。这些药物是各种聚乙二醇化物质的复杂混合物，但与天然酶相比具有改善的治疗特性，包括蛋白质的血清半衰期增加和免疫原性降低。由于PEG的固有多分散性，因此质量和批次间重现性是困难的。尽管存在这种限制，但两种聚乙二醇化干扰素(聚乙二醇化干扰素α-2b和聚乙二醇化干扰素α-2a)已被FDA批准用于治疗丙型肝炎，所述两种聚乙二醇化干扰素是众多单聚乙二醇化位置异构体的异质群体。这些药物分别于2001年和2002年投放市场。

已经对基本的聚乙二醇化技术进行了各种增强和变化。第二代聚乙二醇化方法引入了分支结构的使用以及用于PEG附接的替代化学。特别地，具有半胱氨酸反应性基团(诸如马来酰亚胺或碘乙酰胺)的PEG允许聚乙二醇化靶向肽或蛋白质内的单一残基，从而降低最终产物的异质性，但由于PEG本身的多分散性而不能将其消除。

虽然聚乙二醇化的最初根本原因是降低免疫原性；尽管如此，但存在几个免疫原性聚乙二醇化蛋白的实例。一个实例是聚乙二醇化尿酸氧化酶，这是一种降低患有痛风的患者的血浆尿酸水平的酶。在临床试验中，相对高百分比的患有痛风的患者对疗法没有反应，并且产生了对PEG特异性但对尿酸酶蛋白没有特异性的抗体2。聚乙二醇化脂质体，通常也被认为是非免疫原性的，在一些研究中已发现是免疫原性的。聚乙二醇化脂质体引发强的抗PEG免疫球蛋白M(IgM)反应。另外，多次注射PEG-葡糖醛酸糖苷酶显示会引发特异性抗PEG IgM抗体的产生，从而加速PEG修饰蛋白从体内的清除。

使用PEG作为修饰剂的主要潜在缺点是它是不可生物降解的。美国食品和药物管理局(FDA)已批准PEG用作包括注射、局部、直肠和鼻制剂在内的药物中的媒介物。PEG显示出很小毒性，并且通过肾脏(对于PEG<30kDa)或在粪便中(对于PEG>20kDa)从体内完整清除1。对动物重复施用一些聚乙二醇化蛋白已导致观察到肾小管细胞空泡形成。最近，在采用与大(≥40kDa)PEG缀合的蛋白质的毒性研究中还看到了脉络膜丛上皮细胞的空泡形成。脉络膜丛上皮细胞产生脑脊髓液并且形成血液CSF屏障。细胞空泡形成的长期负面后果尚不清楚，但它确实代表了一些潜在疗法的不希望后果。一种可能的替代方案将是用可生物降解聚合物代替PEG。聚合物诸如羟乙基淀粉(HES)是可能的替代品。HES无毒且可生物降解，并且用作血液扩张剂。HES化方法的功能将类似于聚乙二醇化，通过增加肽的流体动力学半径来降低肾清除率，但由于可生物降解性而可能赋予较低的积累倾向。然而，与PEG一样，HES和其他提出的可生物降解聚合物PEG替代品具有多分散性，使最终产品和代谢物的表征变得困难。减轻这两种担忧的一种新兴解决方案是使用限定的多肽作为聚合物组分；这种方法将在文章中稍后讨论。

脂化

增加肽半衰期的第二种主要化学修饰方法是脂化，其涉及脂肪酸与肽侧链的共价结合4。最初设想到和开发作为用于延长胰岛素半衰期的方法，脂化与聚乙二醇化共享相同的半衰期延长基本机制，即增加流体动力学半径以减少肾过滤。然而，脂质部分本身相对小，并且作用是通过脂质部分与循环白蛋白的非共价结合间接介导的。白蛋白是在人血清中(35-50g/L)的一种大(67KDa)且高度丰富的蛋白质，其天然功能是在全身运输分子，包括脂质。与血浆蛋白的结合还可以通过空间位阻保护肽免受肽酶的攻击，同样类似于聚乙二醇化所见的情况。脂化的一个结果是它降低了肽的水溶性，但肽与脂肪酸之间的接头的工程化可以对其调节，例如通过在接头内使用谷氨酸酯或微PEG。接头工程化和脂质部分的变化可能影响自聚集，其可以通过减慢生物分布而有助于增加半衰期，不依赖白蛋白5。

在用胰岛素的开创性工作之后6，已经探索出多种肽的脂化，所述肽特别是糖尿病领域中的肽，包括人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽和GLP-1R/胰高血糖素受体共激动剂等。两种脂化肽药物目前已被FDA批准用于人类。这些都是长效抗糖尿病药，GLP-1类似物利拉鲁肽和地特胰岛素。

聚乙二醇化与脂化之间的潜在药理学相关的差异是治疗活性肽与大得多的PEG共价连接，而较小的脂肪酰基-肽缀合物与较大的白蛋白非共价缔合，结合形式和未结合形式平衡存在。这可能导致生物分布的差异，所述差异可能导致不同的药理学，因为接近位于不同组织中的受体可能引发差异性作用。在一些情况下，更受限的生物分布可能是希望的，而在其他情况下，更大的组织穿透可能是重要的。Santi等人已开发出解决此问题的PEG方法的目标变型，其中使用具有可预测切割率的可释放PEG缀合物7。

聚乙二醇化和脂化都通过经由空间位阻的屏蔽而赋予抵抗蛋白酶和肽酶的保护，并且通过增加流体动力学半径直接或间接地延长循环半衰期。两种方法都利用化学缀合并且灵活，因为它们无关于用于产生它们所修饰的肽(无论是生物产生的还是合成产生的)的方式。使用合成肽的优点是它们可以掺入非天然氨基酸，所述非天然氨基酸被设计用于解决许多特定问题，包括由于已知的蛋白水解切割倾向导致的不稳定性。它们在附接位点的选择方面也可以更加灵活，如果活性或效力高度依赖于游离末端或修饰残基(诸如C末端酰胺)，则这至关重要。

经典遗传融合：Fc和HSA

与长寿命血清蛋白的经典遗传融合提供了延长半衰期的替代方法，所述替代方法不同于与PEG或脂质的化学缀合。传统上，两种主要蛋白质已被用作融合配偶体：抗体Fc结构域和人血清白蛋白(HAS)。Fc融合涉及肽、蛋白质或受体外结构域与抗体的Fc部分的融合。Fc融合和白蛋白融合两者不仅通过增加肽药物的大小来实现延长的半衰期，而且还都利用身体的天然再循环机制：新生儿Fc受体FcRn。这些蛋白质与FcRn的pH依赖性结合防止了融合蛋白在内体中降解。基于这些蛋白质的融合体可以具有在3-16天范围内的半衰期，比典型的聚乙二醇化或脂化肽长得多。与抗体Fc的融合可以改善肽或蛋白质药物的溶解度和稳定性。肽Fc融合体的实例是度拉鲁肽，度拉鲁肽是一种GLP-1受体激动剂，目前处于后期临床试验。人血清白蛋白(同样被脂肪酰化肽所利用的蛋白质)是另一种流行的融合配偶体。阿必鲁肽(albiglutide)是基于此平台的GLP-1受体激动剂。Fc与白蛋白之间的主要区别是Fc的二聚体性质与HAS的单体结构，导致融合肽呈现为二聚体或单体，取决于融合配偶体的选择。如果靶受体彼此间隔足够近或本身是二聚体，则肽Fc融合体的二聚体性质可以产生亲合力作用。这可能是希望的或不希望的，取决于靶标。

设计的多肽融合体：XTEN和PAS

重组融合概念的引起兴趣的变型是开发出设计的低复杂性序列作为融合配偶体，基本上非结构化的亲水性氨基酸聚合物，它们是PEG的功能类似物。多肽平台的固有可生物降解性使其具有作为潜在更良性的PEG替代品的吸引力。另一个优点是与PEG的多分散性相比，重组分子的精确分子结构。与需要维持融合配偶体的三维折叠的HSA和Fc肽融合体不同，与非结构化配偶体的重组融合体在许多情况下可以经受较高的温度或苛刻的条件，诸如HPLC纯化。

此类别的多肽中最先进的多肽被称为XTEN(Amunix)，长度为864个氨基酸，并且由六种氨基酸(A、E、G、P、S和T)构成。由于聚合物的可生物降解性质，这比通常使用的40KDaPEG大得多，并且赋予了伴随地更大的半衰期延长。XTEN与肽药物的融合导致半衰期与天然分子相比延长60至130倍。两种完全重组生产的XTEN化产品已进入临床，即VRS-859(艾塞那肽-XTEN)和VRS-317(人生长激素-XTEN)。在Ia期研究中，发现VRS-859在2型糖尿病患者中是良好耐受的且有效的。与先前研究的rhGH产品相比，VRS-317报告了优越的药代动力学和药效学特性，并且具有每月一次给药的潜力。基于类似概念考虑的第二聚合物是PAS(XL-Protein GmbH)9。由甚至更大限制的一组仅三种小的不带电荷的氨基酸(脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸)构成的无规卷曲聚合物。PAS的生物物理特性和高度带负电荷的XTEN的生物物理特性的差异是否可能有助于生物分布和/或体内活性的差异尚且未知，但随着这些多肽被掺入更多治疗剂中以及对融合体的行为的表征而将被揭示。

所有的肽蛋白融合体，无论配偶体是Fc、HSA、XTEN还是PAS，都是基因编码的并且因此受到类似的约束。一个限制是仅掺入天然存在的氨基酸，这与采用化学缀合的方法不同，采用化学缀合的方法允许使用掺入非天然氨基酸的合成肽。尽管诸如Ambrx或Sutro的公司正在开发通过扩展遗传密码来克服这一问题的方法，但它们尚未广泛使用。第二限制是肽的N-末端或C-末端都需要与配偶体融合。通常，肽末端参与受体相互作用，并且与一个或两个末端的遗传融合可能大大削弱活性。由于PEG或脂质缀合位点可以在肽上的任何位置，因此可以对其进行优化以最大化所得治疗剂的生物活性。

将合成肽与半衰期延长蛋白合并的混合方法

虽然遗传融合在历史上提供了更大半衰期延长的潜力，但它们缺乏由利用化学缀合、聚乙二醇化和脂化的方法提供的在附接位点的灵活性和非天然氨基酸的掺入或对肽骨架的修饰方面的优点。拉荷亚(La Jolla)的斯克里普斯研究所(Scripps ResearchInstitute)的研究人员用后来构成生物技术公司CovX 10,11的基础的技术进行了将遗传融合的优点与化学缀合以延长半衰期的优点合并的最初努力之一。使用催化醛缩酶抗体，这些研究人员开发出一种平台，通过所述平台，抗体的活性位点赖氨酸与掺入肽或小分子中的β-二酮形成可逆的共价烯胺键。所得复合物称为CovXBody^TM。这种方法将肽药物或小分子的功能特质与抗体的长血清半衰期组合，不是通过遗传融合，而是通过化学键。在对技术进行初步证明后，研究人员扩展了CovX-Body^TM原型的使用，所述原型基于靶向整合素的肽模拟药效团。至少三种基于此架构的分子已进入临床开发：CVX-096，Glp-1R激动剂；CVX-060，血管生成素-2结合肽；和CVX-045，血小板反应素模拟物。

最近，XTEN多肽也已被用于化学缀合模式12，使其甚至更直接地类似于PEG。使用此方法产生的XTEN化肽的第一个实例是GLP2-2G-XTEN，其中使用马来酰亚胺-硫醇化学将肽与XTEN蛋白聚合物化学缀合。与重组融合的GLP2-2G-XTEN相比，化学缀合的GLP2-2GXTEN分子在大鼠中展现出可比较的体外活性、体外血浆稳定性和药代动力学。

完全设计的XTEN或PAS多肽序列中的反应性基团(诸如赖氨酸或半胱氨酸侧链)的数量和间距可以通过定点变化来精确控制，因为它们是由受限制的氨基酸组构成的。相对于可能利用序列天然含有许多反应性基团的Fc或白蛋白的方法，这提供了另外程度的灵活性，并且与依赖于高度特异化活性位点中的反应性残基的CovX技术形成对比。另外，XTEN或PAS的三级结构的缺乏应在偶联和缀合物纯化中使用的条件和化学上提供更大的灵活性。

总之，混合肽半衰期延长方法正在兴起，其组合了化学缀合方法和遗传融合方法的优点并且克服其各自的局限性。这些方法能够产生基于重组多肽基配偶体的分子，所述分子赋予更长的半衰期，但使治疗性肽部分摆脱了仅由天然L-氨基酸构成或仅被配置为在N-末端或C-末端融合的线性单向多肽的限制，从而打开了通往宽范围的基于较长效肽的药物的大门。

“肌肉萎缩”被定义为肌肉质量的减少，并且其特征可以为肌肉的完全或部分耗损以及由此导致的肌肉虚弱。它通常在锻炼不当、进食不当或两者兼具的群体中发生。它也存在于患有肌肉疾病诸如肌病(即，肌营养不良)的受试者中，并且是若干种疾病/病症的共发病，包括进食障碍、癌症、AIDS、COPD、ALS、限制锻炼的身体损伤、变性病症。作为正常衰老过程的一部分，它在老年受试者中也很普遍。

“老年受试者”是指至少65岁的受试者。

“以肌肉萎缩为特征的疾病或病症”是指包括肌肉萎缩作为症状的疾病或病症。实例包括身体损伤(即，其导致受试者身体不活动，例如肌肉、神经、骨骼、软骨、韧带、椎间盘、头部或关节损伤)、使受试者被限制在床上或家中的疾病(即，癌症、传染病等)、进食障碍、恶病质、肌肉减少症、营养失调、代谢性疾病(包括I型和II型糖尿病)以及神经元、肌肉或关节变性疾病，诸如肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、多发性硬化症(MS)、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌肉营养不良、吉兰-巴雷综合征、骨关节炎、脊髓灰质炎、类风湿性关节炎、脊髓性肌萎缩和多发性肌炎。神经元变性疾病包括ALS、MS、帕金森氏病和亨廷顿氏病。肌肉变性疾病包括肌病(包括多发性肌炎)、肌营养不良、吉兰-巴雷综合征、脊髓性肌萎缩。关节变性疾病包括关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎。

如本文所用，术语“本发明的表达载体”可以是任何合适的载体，包括适用于在细胞中表达本发明肽的染色体、非染色体和合成核酸载体(包含合适的一组表达控制元件的核酸序列)。此类载体的实例包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、来源于质粒与噬菌体DNA的组合的载体以及病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一个实施方案中，编码肽的核酸分子包含在裸DNA或RNA载体中，所述载体包括，例如，线性表达元件(如在例如Sykes和Johnston,Nat Biotech 12,355-59(1997)中所述)、压缩的核酸载体(如在例如美国专利号6,077,835和/或WO 00/70087中所述)或质粒载体，诸如pBR322、pUC 19/18或pUC 118/119。此类核酸载体及其用途是本领域中是公知的(参见，例如，美国专利号5,589,466和美国专利号5,973,972)。在一个实施方案中，DNA包含表达控制序列。

在一个实施方案中，载体适用于在细菌细胞中表达本发明肽。此类载体的实例包括表达载体，诸如BlueScript(Stratagene)、pIN载体(Van Heeke&Schuster,1989,J BiolChem 264,5503-5509)、pET载体(Novagen,Madison,Wis.)等。在一个实施方案中，表达载体也可以是或可替代地是适用于在酵母系统中表达的载体。可以使用适用于在酵母系统中表达的任何载体。合适的载体包括，例如，包含组成型或诱导型启动子(诸如酵母α因子)、醇氧化酶和PGH的载体(综述于：F.Ausubel et al.,ed.,1987,Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing and Wiley InterScience New York；和Grantet al.,1987,Methods in Enzymol 153,516-544)。在其他实施方案中，表达载体适用于在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达。(Kost,T；和Condreay,J P,1999,Current Opinion inBiotechnology 10(5):428-33.)

表达控制序列经工程化以控制和驱动在各种细胞系统中的目的基因的转录以及随后蛋白质的表达。质粒将可表达的目的基因与表达控制序列(即，表达盒)组合，所述表达控制序列包含所希望的元件，诸如例如启动子、增强子、选择标记、操纵子等。在本发明的表达载体中，编码肽的核酸分子可以包含任何合适的启动子、增强子、选择标记、操纵子、阻遏蛋白、聚A终止序列和其他表达促进元件或者与任何合适的启动子、增强子、选择标记、操纵子、阻遏蛋白、聚A终止序列和其他表达促进元件相关。

如本文所用的，“启动子”指示DNA序列，所述DNA序列足以指导与其可操作地连接(即，以这样的方式连接，使得当存在适当的信号时允许编码本发明肽的核苷酸序列的转录)的DNA序列的转录。编码肽的核苷酸序列的表达可以置于本领域已知的任何启动子或增强子元件的控制下。此类元件的实例包括强表达启动子(例如，人CMV IE启动子/增强子或CMV主要IE(CMV-MIE)启动子，以及RSV、SV40晚期启动子、SL3-3、MMTV、泛素(Ubi)、泛素C(UbC)和HIV LTR启动子)。在一些实施方案中，载体包含选自由以下项组成的组的启动子：SV40、CMV、CMV-IE、CMV-MIE、RSV、SL3-3、MMTV、Ubi、UbC和HIV LTR。

本发明的核酸分子也可以可操作地连接至有效的聚(A)终止序列、大肠杆菌中质粒产物的复制起点、作为选择标记的抗生素抗性基因、和/或方便的克隆位点(例如，多接头)。核酸也可以包含可调节诱导型启动子(诱导型、阻遏型、发育调节型)，与组成型启动子诸如CMV IE相反(技术人员将认识到此类术语实际上是在某些条件下基因表达程度的描述符)。

可选择的标记是本领域中公知的元件。在选择性条件下，只有表达适当的可选择的标记的细胞才能存活。通常，可选择的标记基因在细胞培养中表达赋予对各种抗生素的抗性的蛋白质，通常是酶。在其他选择性条件下，表达荧光蛋白标记的细胞是可见的并且因此是可选择的。实施方案包括β-内酰胺酶(bla)(β-内酰胺抗生素抗性或氨苄青霉素抗性基因或ampR)、bls(杀稻瘟菌素抗性乙酰基转移酶基因)、bsd(杀稻瘟菌素-S脱氨酶抗性基因)、bsr(杀稻瘟菌素-S抗性基因)、Sh ble(

抗性基因)、潮霉素磷酸转移酶(hpt)(潮霉素抗性基因)、tetM(四环素抗性基因或tetR)、新霉素磷酸转移酶II(npt)(新霉素抗性基因或neoR)、kanR(卡那霉素抗性基因)和pac(嘌呤霉素抗性基因)。

在某些实施方案中，载体包含一种或多种选自由以下项组成的组的可选择的标记基因：bla、bls、BSD、bsr、Sh ble、hpt、tetR、tetM、npt、kanR和pac。在其他实施方案中，载体包含一种或多种可选择的标记基因，所述可选择的标记基因编码绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、氰基荧光蛋白(CFP)、增强型氰基荧光蛋白(eCFP)或黄色荧光蛋白(YFP)。

出于本发明的目的，真核细胞中的基因表达可以使用由操纵子控制的强启动子来严密调节，所述操纵子进而由调节蛋白调节，所述调节蛋白可以是重组“调节融合蛋白”(RFP)。RFP基本上由转录阻断结构域和调节其活性的配体结合结构域组成。US20090162901 A1中描述了此类表达系统的实例，将所述专利通过引入以其整体并入本文。

如本文所用,“操纵子”指示引入基因中或基因附近的DNA序列，其引入方式使得所述基因可以通过RFP与操纵子的结合来调节，并且结果是阻止或允许目的基因(即，编码本发明肽的核苷酸)的转录。原核细胞和噬菌体中的许多操纵子已经被很好地表征(Neidhardt编辑,Escherichia coli and Salmonella；Cellular and Molecular Biology2d.Vol 2ASM Press,华盛顿特区1996)。这些包括但不限于结合LexA肽的大肠杆菌(E.coli)LexA基因的操纵子区以及结合由大肠杆菌Lad和trpR基因编码的阻遏蛋白的乳糖和色氨酸操纵子区。这些还包括来自λPR和噬菌体P22 ant/mnt基因的细菌噬菌体操纵子，所述操纵子结合由λcI和P22 arc编码的阻遏蛋白。在一些实施方案中，当RFP的转录阻断结构域是限制性酶诸如NotI时，操纵子是该酶的识别序列。本领域技术人员应认识到操纵子的位置必须邻接启动子或其3’，使得它能够控制由启动子的转录。例如，美国专利号5,972,650说明了tetO序列在距TATA盒的特定距离内，将所述专利通过引用并入本文。在具体实施方案中，操纵子优选置于紧接在启动子的下游。在其他实施方案中，操纵子置于启动子的10个碱基对内。

在一个示例性的细胞表达系统中，细胞经工程化以表达四环素阻遏蛋白(TetR)，并且目标蛋白置于启动子的转录控制下，所述启动子的活性受TetR调节。两个串联的TetR操纵子(tetO)置于紧接在载体中的CMV-MIE启动子/增强子的下游。在此类载体中，由CMV-MIE启动子指导的编码目标蛋白的基因的转录可以在不存在四环素或一些其他合适的诱导剂(例如，多西环素)的情况下被TetR阻断。在存在诱导剂的情况下，TetR蛋白不能结合tetO，因此发生目标蛋白的转录、然后翻译(表达)。(参见，例如，美国专利号7,435,553，将其通过引用以其整体并入本文。)

本发明的载体也可以使用Cre-lox重组工具来促进目标基因整合到宿主基因组中。Cre-lox策略至少需要两个组分：1)Cre重组酶，一种催化两个loxP位点之间的重组的酶；和2)loxP位点(例如，序列由以下组成的特定34个碱基对：8-bp核心序列(其中发生重组)和两个侧翼13-bp反向重复序列)或突变lox位点。(参见，例如，Araki等人,1995,PNAS92:160-4；Nagy,A.等人,2000,Genesis 26:99-109；Araki等人,2002,Nuc Acids Res 30(19):e103；和US20100291626A1，将所述文献全部通过引用并入本文)。在另一种重组策略中，酵母来源的FLP重组酶可以与共有序列FRT一起使用(也参见，例如，Dymecki,S.M.,1996,PNAS 93(12):6191-6196)。

如本文所用，术语“宿主细胞”包括适用于表达重组核酸序列的任何细胞。细胞包括原核生物和真核生物的细胞(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如，大肠杆菌、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、链霉菌属物种(Streptomyces spp.)等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.partoris)、甲醇毕赤酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞或细胞融合体，诸如例如杂交瘤或四源杂交瘤。在某些实施方案中，细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在其他实施方案中，细胞是真核细胞并且选自以下细胞：CHO(例如，CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如，COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾脏(例如，HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB 8065、HL-60、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127 cell、SP2/0、NS-0、MMT细胞、肿瘤细胞和源自上述细胞的细胞系。在一些实施方案中，细胞包含一种或多种病毒基因，例如，表达病毒基因的视网膜细胞(例如，

细胞)。在一些实施方案中，细胞是CHO细胞。在其他实施方案中，细胞是CHO K1细胞。

如本文所用，术语“本发明的转化细胞”是指包含稳定整合到细胞基因组中的核酸的宿主细胞，所述核酸包含编码本发明的肽的表达的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供了包含非整合(即，游离)核酸(诸如质粒、粘粒、噬菌粒或线性表达元件)的细胞，所述核酸包含编码本发明的肽的表达的序列。在其他实施方案中，本发明提供了通过用包含本发明的表达载体的质粒稳定转染宿主细胞而产生的细胞系。

如本文所用，如应用于细胞的术语“工程化”意指使用重组DNA技术的遗传工程化，并且通常涉及以下步骤：合成合适的表达载体(参见上文)，并且然后将表达载体转染到宿主细胞中(通常为稳定转染)。

如本文所用，术语“异源表达”是指核酸在天然不具有所述核酸的宿主细胞中的表达。通过重组DNA技术将核酸插入异源宿主中。

举例

现在将参考具体实施例来描述本发明。这些仅仅是示例性的并且仅用于说明的目的：它们不旨在以任何方式限制所要求保护的专利范围或所描述的发明。这些实施例构成目前考虑用于实施本发明的最佳方式。

材料和方法

细胞培养测定制备：C2C12制备

生长培养基制备：

向500mL 4.5g/L葡萄糖DMEM中添加5mL L-谷氨酰胺溶液(最终浓度：1％)、5mL青霉素-链霉素(最终浓度：1％)和50mL先前在55℃下加热30分钟的无菌过滤胎牛血清(最终浓度：10％)。

分化培养基制备：

向500mL 4.5g/L葡萄糖DMEM中添加5mL L-谷氨酰胺溶液(最终浓度：1％)、5mL青霉素-链霉素(最终浓度：1％)和10mL热灭活的马血清(最终浓度：2％)。

饥饿培养基制备：

向500mL 4.5g/L葡萄糖DMEM中添加5mL L-谷氨酰胺溶液(最终浓度：1％)和5mL青霉素-链霉素(最终浓度：1％)。

S6磷酸化测定工作流程

第1天：在96孔板中，将2400个细胞/孔(8,000个细胞/cm2)接种到100ul/孔的生长培养基中。让它们在37℃、5％CO2下附着并且生长48h。(参见融化传代培养C2C12 SOP 58以了解更多细节)。

第3天：去除生长培养基，并且添加100ul/孔的分化培养基。通过(如果可能的话)每天添加新鲜的分化培养基，让它们在37℃、5％CO2下分化7天。(参见C2C12 SOP60的分化以了解更多细节)。

第8天：去除分化培养基，并且添加100ul/孔的饥饿培养基，以使细胞在37℃、5％CO2下饥饿3h。此后，去除饥饿培养基，并添加100ul/孔的HBSS，并且在37℃、5％CO2下孵育1h以剥夺细胞的氨基酸。

通过将肽/水解产物稀释在HBSS中以补足至所希望的浓度(通常地0.5ug/ml和5ug/ml)，在2ml试管中完成肽和水解产物处理。你需要300ul的最小体积来处理3个孔(100ul/孔)。使用0.1uM的胰岛素处理作为阳性对照。所有处理应一式三份地完成。推荐处理时间为30分钟。

细胞培养测定制备：THP-1细胞培养

将人单核细胞白血病(THP-1)细胞(ECACC收藏；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)维持在罗斯维尔帕克纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute)培养基(RPMI 1640，Lonza，瑞士巴塞尔)中，所述培养基补充有1％L-谷氨酰胺、10％热灭活的FBS、1％青霉素-链霉素和10％先前在55℃下加热30min的无菌过滤胎牛血清。

TNF-α分泌测定工作流程

根据制造商的说明，使用TNF-αELISA试剂盒(BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥)评估释放到上清液中的源自THP-1的TNF。为了分化为巨噬细胞，将THP-1细胞接种(2×10⁶孔^-1)在6孔板中，并且用100nM佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)在37℃、5％CO2下处理72h。孵育后，抽吸未附着的细胞，并且将附着细胞用NPN_1(0.5-5μg/mL)一式两份或一式三份地处理。孵育24h后，将来自大肠杆菌O127:B8的脂多糖(LPS)(Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)添加至100ng/mL，在37℃、5％CO2下保持24h。收集细胞上清液，并且根据制造商的说明，使用TNF-αELISA试剂盒(BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥)评估释放到上清液中的源自THP-1的TNF。

从C2C12细胞中分离RNA以及实时QPCR

将C2C12细胞铺板到6孔板中，并且在37℃、5％CO₂下生长和分化。随后使细胞在饥饿培养基中在37℃、5％CO₂下饥饿24h。按照Menconi等人(2008)，为了诱导萎缩，将细胞用溶解在补充有1％青霉素-链霉素的DMEM-LM(30030，BIOSCIENCES)中的100μM地塞米松在37℃、5％CO₂下处理24h[33]。萎缩诱导结束前30分钟，将细胞用添加在地塞米松处理物顶上的NPN处理，并且在37℃、5％CO₂下孵育30min。计算稀释度以获得所希望的浓度，最终体积为2mL/孔。在不干扰细胞的情况下，首先从地塞米松处理物中取出等体积的添加到每个孔中的处理物。将C2C12细胞用TRIzol(Invitrogen，美国卡尔斯巴德)裂解，并且根据制造商的说明，使用Purelink RNA微型试剂盒(赛默飞世尔科技的Invitrogen)提取总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)将总RNA(1μg)逆转录为cDNA。使用基于TaqMan探针的方法进行定量PCR，其中对于使用C2C12的实验，使用针对Trim63(Mm01185221_m1)和Fbxo32(Mm00499518_m1)的TaqMan荧光基因表达探针(ABI生物系统，美国加利福尼亚州)检测mRNA表达。将含有引物/探针和

基因表达主混合物(ABI生物系统，美国加利福尼亚州)的主混合物添加到1μL cDNA模板中。将9μL的最终体积一式两份地移液到Roche Optical 96孔反应板上，并且在Roche lightcycler 480实时PCR仪器上进行实时PCR。使用仪器软件，计算每个孔的阈值循环(Ct)。数据分析基于ΔΔCt方法，其中原始数据按板上包含的B2M管家基因(Mm00437762_m1)归一化。将所有基因表达与地塞米松进行比较，因为地塞米松用于诱导C2C12细胞的萎缩。随后添加NPN_1以检查它是否能减弱由地塞米松引起的萎缩作用。结果表示为相对于对照组的倍数。

废用鼠萎缩研究方案

此研究由美国Melior Discovery进行。基于体重(环植入后10天)，将12周龄雄性C57b1/6J小鼠(N＝10/组)随机分配到处理组。国际宗教自由协会(InternationalAssociation of Religious Freedom)(IARF#:MLR-I15)授予了伦理批准，并且因此，根据由机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)制定的伦理标准进行。

研究由以下五个处理组组成：(1)健康对照(对照承重)，(2)后肢去负荷(HU)-对照媒介物(萎缩)，(3)Bowman-Birk抑制剂(BBI；113.3mg/kg阳性对照)，(4)酪蛋白(650mg/kg；阳性对照)，(5)NPN_1(650mg/kg)。简而言之，在后肢去负荷之前，用2-0无菌外科钢丝形成尾环，所述钢丝通过第5、第6或第7椎间盘空间并且成形为悬挂小鼠的环。选择尾环的椎骨位置以适当平衡动物体重，而不干扰排便。通过附接在笼顶部的旋转吊带将动物悬挂。将动物的身体维持在30°的高度，使得只有前肢维持与笼的地板接触。在此程序中，动物可以在笼内移动并且自由获取食物和水。每天检查动物的高度，并且必要时进行调节[34]。基于IACUC指南，给予小鼠7天来适应和调整，随后是在尾环植入后10-13天的恢复时间。此研究的主要终点是在后肢悬挂19天后直接评估对照小鼠和测试小鼠后肢中所含的比目鱼肌的湿重。另外，将固定的肌肉样品(5个/组)送至护理生物实验室LLC(CaresBio LaboratoryLLC)以进行I型和IIa型肌肉纤维标记的免疫荧光(IF)染色和图像分析。还将比目鱼肌组织样品(10个/组)送至Cellomatics Biosciences LTD以进行基因表达分析。

给药和肌肉湿质量

从第1天至第18天，向所有小鼠分别给药NPN_1、BBI或酪蛋白。在第19天，通过颈椎脱位处死动物；收集血液/血浆样品，分离比目鱼肌并使用数字平台天平称重。将湿肌肉重量归一化为体重(mg/g)。将比目鱼肌的一侧快速冷冻，并且将比目鱼肌的另一侧固定在4％新鲜PBS缓冲甲醛中。

比目鱼肌的免疫荧光分析

将收集的比目鱼肌后固定在4％新鲜的PBS缓冲甲醛中。从每个处理组中随机选择五个样品，用于免疫荧光分析。将肌肉进行石蜡包埋并且切片。使用免疫荧光标签将I型和IIa型肌肉纤维染色。对于两种染色标签，对每个样品的代表性区域进行图像分析。随着样品的处理，将切片(厚度，8μM)切割，并且如前所述进行免疫荧光染色[35]。简而言之，使载玻片在柠檬酸盐缓冲液(10mM，pH 6.0)中经受热诱导抗原修复，并且在用非特异性抗原性阻断剂阻断后，与一抗ab11083(稀释度1:250)和ab91506(稀释度1:200)一起孵育过夜。在测试载玻片中优化后，确定两种一抗的浓度。在室温下，应用相应的荧光缀合的二抗(Alexa594和Alexa 488)持续1h。将4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)与二抗混合在一起，以可视化细胞核。

图像获取和分析

使用具有X4和X10物镜的定制的计算机控制的显微镜(具有xy载物台和z控制器、Zeiss显微镜，Carl Zeiss GMBh，德国耶拿)扫描载玻片。使用基于MATLAB的图像分析软件(R2011b，MathWorks)分析图像。使用HU对照组完成扫描设置的基线。将图像分析算法应用于从用二抗对照染色的组织的显微镜载玻片产生的图像，以产生背景得分。将对照/基线用于生成算法，以区分应用于所有图像的信号和信噪比。通过基于单通道的分析来量化每种标记。进行自动背景扣除。然后计算所有标记的强度得分，其对应于平均信号强度除以区域面积。计算小鼠肌肉组织中不同组的染色相对面积和染色的平均比强度的显著差异。呈现原始数据，并且不进行归一化。

从小鼠比目鱼肌组织中分离RNA和基因阵列

对比目鱼肌组织样品进行基因表达分析。将300μL含3μl蛋白酶K的匀浆溶液(Quantigene Plex Assay，Invitrogen)添加到10mg冷冻组织中以制备浓缩裂解物。将一个5-mm不锈钢珠添加到管中并且置于Bullet

匀浆器中。然后将组织在速度10下匀浆2min。使管在室温下冷却，并且重复过程，直到没有可见颗粒残留。然后将组织裂解物在65℃下孵育30min，然后以16,000×g离心15min，并且将上清液立即用于测定试剂盒(按照制造商的指南)。从Luminex获得所有基因的净平均荧光强度(MFI)。

表1.NPN_1处理后倍数调节的基因表达。从对照媒介物和NPN_1处理的动物(N＝10/组)收集的比目鱼肌组织样品中提取RNA。与肌发生和线粒体生物发生相关的基因上调。

组合物食品补充粉末I

成分	含量(g)	含量(％)
			酪蛋白酸钠	999.52	99.952
SEQ ID 1的肽	0.48	0.048

食品补充粉末II

成分		含量(g)	含量(％)
				酪蛋白酸钠		999.74	999.74
SEQ ID 3的肽		0.26	0.026

食品补充粉末III

成分	含量(g)	含量(％)
			酪蛋白酸钠	999.96	99.996
SEQ ID 2的肽	0.48	0.048

食品补充粉末IV

成分	含量(g)	含量(％)
			酪蛋白酸钠	999.99	99.999
SEQ ID 8的肽	0.01	0.001

食品补充粉末V

成分	含量(g)	含量(％)
			酪蛋白酸钠	999.62	999.62
SEQ ID 11的肽	0.38	0.38

食品补充粉末VI

成分	含量(g)	含量(％)
			酪蛋白酸钠	999.26	99.926
SEQ ID 3的肽	0.48	0.048
			SEQ ID 8的肽	0.26	0.026

食品补充粉末VII

成分	含量(g)	含量(％)
			酪蛋白酸钠	998.73	99.873
SEQ ID 3的肽	0.30	0.03
			SEQ ID 8的肽	0.04	0.004
SEQ ID 11的肽	0.53	0.053
			SEQ ID 10的肽	0.01	0.001
SEQ ID 19的肽	0.39	0.039

局部组合物

局部组合物可以局部应用于患有肌肉萎缩的受试者或剧烈身体活动后的健康人。

百分比仅是示例，并且应当理解，根据用途，可以使用任何合适的百分比。

通过以下方式制备乳液：相A：将Ultrez 10(卡波姆)分散在水中，并且让其溶胀20分钟，然后添加相B；加热至75℃。将相C单独加热至75℃。在搅拌下混合两相，匀浆，添加相D，用相E中和，冷却直到30℃，然后添加相F和相G；用NaOH将pH调节至6。应当理解，这只是实例，并且可以使用本领域已知的任何合适方法。

等效形式

前面的描述详细描述了本发明的当前优选实施方案。在考虑这些描述后，本领域技术人员预期会想到其实践中的各种修改和变化。这些修改和变化旨在涵盖在所附权利要求中。

序列表

<110> 努里塔斯有限公司

<120> 用于治疗肌肉萎缩的肽

<130> P12774PC00

<150> EP19192689.8

<151> 2019-08-20

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 1

Thr Ile Lys Leu Pro Ala Gly Thr

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 2

Ile Glu Asp Pro Gly Gln Phe Pro Thr

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 3

His Leu Pro Ser Tyr Ser Pro Ser Pro Gln

1 5 10

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 4

Lys Gly Asp Ile Ile Ala Ile Pro Ser Gly Ile Pro Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 5

Leu Asp Trp Tyr Lys Gly Pro Thr

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 6

Ser Arg Gly Pro Ile Tyr Ser Asn

1 5

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 7

Leu Glu Arg Gly Asp Thr Ile Lys Ile Pro Ala Gly Thr

1 5 10

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 8

Thr Ile Lys Ile Pro Ala Gly Thr

1 5

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 9

Ser Tyr Ser Pro Ser Pro Gln

1 5

<210> 10

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 10

Ile Gly Ser Ser Ser Ser Pro Asp Ile Tyr Asn Pro Gln Ala Gly Arg

1 5 10 15

Ile Lys Thr

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 11

Ile Asp Pro Asn Gly Leu His Leu Pro Ser Tyr Ser Pro Ser Pro Gln

1 5 10 15

Leu

<210> 12

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 12

Leu Val Asn Arg Asp Asp Glu Glu Asp Leu Arg Val Leu Asp Leu Val

1 5 10 15

Ile Pro

<210> 13

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 13

Ile Thr Gly Gln Val Leu His Pro Asn Gly Gly Thr Val Val Asn Ala

1 5 10 15

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 14

Ala Leu Glu Pro Asp Asn Arg

1 5

<210> 15

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 15

Leu Arg Glu Gln Ser Gln Gln Asn Glu Cys Gln Leu Glu Arg

1 5 10

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 16

Val Ala Gly Lys Gly Ile Pro Trp Asp Lys Gln Asp Pro Gly Glu Glu

1 5 10 15

Ala Ile Glu Ser

20

<210> 17

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 17

Val Gly Arg Arg Gly Gly Gln His Gln Gln Glu Glu Glu Ser Glu Glu

1 5 10 15

Gln Lys Asp

<210> 18

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 18

Tyr Asp Glu Glu Lys Glu Gln Gly Glu Glu Glu Ile Arg Lys

1 5 10

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 19

His Leu Pro Ser Tyr Ser Pro Ser Pro

1 5

<210> 20

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 20

Ser Tyr Ser Pro Ser Pro

1 5

Claims (15)

1.一种组合物，其包含具有至多50个氨基酸并且包含SEQ ID 20的序列的肽。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肽具有6至20个氨基酸。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述包含SEQ ID 20的序列的肽选自SEQ ID 3、SEQ ID 9、SEQ ID 11和SEQ ID 19。

4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其包含具有至多50个氨基酸并且包含SEQ ID 8的序列的肽。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述具有至多50个氨基酸并且包含SEQ ID 8的序列的肽选自SEQ ID 8和SEQ ID 7。

6.根据权利要求1所述的组合物，其包含SEQ ID 3和SEQ ID 8的肽。

7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物是可食用粉末。

8.一种促进健康受试者的肌肉合成的方法，包含向所述健康受试者口服施用治疗有效量的根据权利要求1至7中任一项所述的组合物的步骤。

9.一种抑制健康受试者的肌肉损失的方法，包含向所述健康受试者口服施用治疗有效量的根据权利要求1至7中任一项所述的组合物的步骤。

10.一种改善健康受试者的炎性响应的方法，包含向所述健康受试者口服施用治疗有效量的根据权利要求1至7中任一项所述的组合物的步骤。

11.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其用于预防或治疗受试者的肌肉萎缩的方法中。

12.一种分离肽，其具有至多50个氨基酸并且包含SEQ ID 20。

13.根据权利要求12所述的分离肽，其具有6-20个氨基酸。

14.根据权利要求13所述的分离肽，其选自SEQ ID 3、SEQ ID 9、SEQ ID 11和SEQID19。

15.根据权利要求12至14中任一项所述的分离肽或根据权利要求1至7中任一项所述的组合物用于促进健康受试者的肌肉合成的用途。

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