CN111741746A - 治疗自身免疫性疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了可用于治疗自身免疫性疾病和炎症性障碍的组合物和方法。所述组合物和方法利用与主要组织相容性复合物(MHC)相缔合并偶联到纳米颗粒核的遍在非组织特异性抗原来诱导调节性T细胞和调节性B细胞。

Description

治疗自身免疫性疾病的方法
相关申请的交叉引用
本申请主张2017年11月29日提交的美国临时申请62/591,921；2018年2月28日提交的美国临时申请62/636,520；和2018年3月12日提交的美国临时申请62/641,607的权益，所有这些申请以其全部内容通过引用并入本文。
发明内容
本文提供了组合物，所述组合物包含偶联到纳米颗粒核的多个抗原-主要组织相容性复合物。所述组合物可用于治疗自身免疫性障碍和炎症性障碍。许多自身免疫性疾病或炎症性疾病与针对特定组织特异性抗原或抗原亚群的免疫应答有关。这为设计治疗自身免疫性疾病或炎症性疾病的干预措施提出了一个问题，因为每种疾病都需要靶向所述抗原或抗原亚群的特定药物。另外，也可以使用非特异性免疫抑制剂，但这些抑制剂与明显的全身副作用有关。本文描述了包含偶联到纳米颗粒的遍在自身抗原-MHC复合物的组合物(uaMHC-NP)，所述组合物可用于治疗自身免疫性疾病或扩大抑制自身反应性(即自身免疫性或炎症性)T细胞的T调节细胞群体。
主要地，本文所述的治疗是多目的，因为单一组合物可以治疗与机械或病理上不相关的多种自身免疫性障碍和炎症性障碍。许多治疗，例如皮质类固醇或抗一般炎症性介质的抗体，以这种方式是多目的，所述方式导致全身性免疫抑制，因此，增加了接受治疗的患者发生继发感染和全身性免疫学并发症的风险。本文所述的组合物虽然是多目的，但也保留了全身性免疫，使患者抵抗病毒、细菌、真菌感染或肿瘤的能力保持完整。出人意料的是，本文所述方法所使用的抗原能够治疗多种疾病，所述疾病在病理上是不同的(例如，同一器官的不同自身免疫性疾病可以由单一抗原治疗)，并且就起源组织而言是不同的(例如，折磨不同器官系统的自身免疫性疾病)。这些抗原是跨许多不同组织类型广泛表达的抗原，但不是与疾病相关的主要抗原(其通常显示出仅限于特定组织的表达)。
在某些方面，本文描述的是一种组合物，其包含：(a)多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)，所述多个抗原-主要组织相容性复合物中的每个抗原-MHC包含与MHC分子的结合槽相缔合的不是组织特异性抗原的遍在自身抗原；和(b)具有1至100纳米直径的纳米颗粒核；其中所述抗原-MHC偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述MHC分子是MHC II类分子。在某些实施例中，所述纳米颗粒核是金属或金属氧化物。在某些实施例中，所述金属是铁。在某些实施例中，所述金属氧化物是氧化铁。在某些实施例中，所述直径在约5纳米和约50纳米之间。在某些实施例中，所述直径在约5纳米和约25纳米之间。在某些实施例中，所述多个抗原-MHC以至少10:1的抗原-MHC比纳米颗粒核的比率偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述多个抗原-MHC以不超过150:1的抗原-MHC比纳米颗粒核的比率偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述多个抗原-MHC以约0.4至约13个抗原-MHC/100nm2纳米颗粒表面积的密度偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述抗原-MHC共价偶联到所述纳米颗粒。在某些实施例中，所述抗原-MHC通过质量小于约5千道尔顿的聚乙二醇(PEG)接头共价偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述纳米颗粒核还包含生物相容包衣。在某些实施例中，所述遍在自身抗原包含衍生自以稳定状态存在于细胞内区室中或细胞内区室上的蛋白质的多肽。在某些实施例中，所述细胞内区室是胞质溶胶、线粒体、高尔基体、内质网、细胞核或质膜。在某些实施例中，所述细胞内区室是线粒体。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是丙酮酸脱氢酶复合物-E2组分(PDC-E2)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是细胞色素P450 2D6(CYP2D6)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是可溶性肝抗原(SLA)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是肌动蛋白(ACTB)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是甲酰亚胺转移酶-环化脱氨酶(FTCD)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是髓过氧化物酶(MPO)。在某些实施例中，所述细胞内区室是线粒体。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：对于DRB3*0202，PDC-E2353-367、PDC-E272-86和PDC-E2422-436；对于DRB5*0101，PDC-E2353-367、PDC-E280-94和PDC-E2535-549；对于DRB4*0101，PDC-E2629-648、PDC-E2122-135和PDC-E2249-263；以及对于DRB1*0801，PDC-E2249-263。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：PDC-E2422-436和PDC-E280-94。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：CYP2D6284-298、CYP2D6289-303、CYP2D6318-332、CYP2D6313-332、CYP2D6393-412、CYP2D6192-206、CYP2D65-19、CYP2D6293-307(对于DRB1*0301)；CYP2D6219-233、CYP2D6237-251、CYP2D615-29(对于DRB3*0202)；CYP2D6235-249、CYP2D6317-331、CYP2D6293-307(对于DRB4*0101)；CYP2D6428-442、CYP2D6237-251、CYP2D614-28(对于DRB5*0101)；CYP2D6199-213、CYP2D6450-464、CYP2D6301-315(对于DRB1*0401)；CYP2D6452-466、CYP2D659-73、CYP2D6130-144、CYP2D6193-212、CYP2D6305-324、CYP2D615-29(对于DRB1*0701)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB202-216、ACTB170-184、ACTB245-259(对于DRB1*0301)；ACTB187-201、ACTB172-186、ACTB131-145(对于DRB3*0202)；ACTB131-145、ACTB171-185、ACTB129-143(对于DRB4*0101)；ACTB164-178、ACTB25-39、ACTB323-337(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB146-160、ACTB18-32和ACTB171-185。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：SLA334-348、SLA196-210、SLA115-129、SLA373-386、SLA186-197(对于DRB1*0301)；SLA342-256、SLA110-124、SLA299-313(对于DRB3*0202)；SLA49-63、SLA260-274、SLA119-133(对于DRB4*0101)；SLA86-100、SLA26-40、SLA331-345(对于DRB5*0101)；SLA317-331、SLA171-185、SLA417-431(对于DRB1*0401)；SLA359-373、SLA215-229、SLA111-125(对于DRB1*0701)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD439-453、FTCD381-395、FTCD297-311(对于DRB3*0202)；FTCD525-539、FTCD218-232、FTCD495-509(对于DRB1*0301)；FTCD262-276、FTCD300-314、FTCD259-273(对于DRB4*0101)；FTCD490-504、FTCD389-403、FTCD295-309(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD271-285、FTCD498-512,和FTCD301-315。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：MPO322-336、MPO714-728、MPO617-631(对于DRB3*0202)；MPO504-518、MPO462-476、MPO617-631(对于DRB1*0301)；MPO444-458、MPO689-703、MPO248-262(对于DRB4*0101)；MPO511-525、MPO97-111、MPO616-630(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述复合物还包含与所述纳米颗粒核偶联的第二多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)，所述第二多个抗原-主要组织相容性复合物中的每个抗原MHC包含抗原。在某些实施例中，所述第二多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)的抗原是第二遍在自身抗原。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原包含衍生自以稳定状态存在于细胞内区室中或细胞内区室上的蛋白质的多肽。在某些实施例中，所述细胞内区室是胞质溶胶、线粒体、高尔基体、内质网、细胞核或质膜。在某些实施例中，所述细胞内区室是线粒体。在某些实施例中，所述细胞内区室是线粒体。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：对于DRB3*0202，PDC-E2353-367、PDC-E272-86和PDC-E2422-436；对于DRB5*0101，PDC-E2353-367、PDC-E280-94和PDC-E2535-549；对于DRB4*0101，PDC-E2629-648、PDC-E2122-135和PDC-E2249-263；以及对于DRB1*0801，PDC-E2249-263。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：PDC-E2422-436和PDC-E280-94。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：CYP2D6284-298、CYP2D6289-303、CYP2D6318-332、CYP2D6313-332、CYP2D6393-412、CYP2D6192-206、CYP2D65-19、CYP2D6293-307(对于DRB1*0301)；CYP2D6219-233、CYP2D6237-251、CYP2D615-29(对于DRB3*0202)；CYP2D6235-249、CYP2D6317-331、CYP2D6293-307(对于DRB4*0101)；CYP2D6428-442、CYP2D6237-251、CYP2D614-28(对于DRB5*0101)；CYP2D6199-213、CYP2D6450-464、CYP2D6301-315(对于DRB1*0401)；CYP2D6452-466、CYP2D659-73、CYP2D6130-144、CYP2D6193-212、CYP2D6305-324、CYP2D615-29(对于DRB1*0701)。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB202-216、ACTB170-184、ACTB245-259(对于DRB1*0301)；ACTB187-201、ACTB172-186、ACTB131-145(对于DRB3*0202)；ACTB131-145、ACTB171-185、ACTB129-143(对于DRB4*0101)；ACTB164-178、ACTB25-39、ACTB323-337(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB146-160、ACTB18-32和ACTB171-185。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：SLA334-348、SLA196-210、SLA115-129、SLA373-386、SLA186-197(对于DRB1*0301)；SLA342-256、SLA110-124、SLA299-313(对于DRB3*0202)；SLA49-63、SLA260-274、SLA119-133(对于DRB4*0101)；SLA86-100、SLA26-40、SLA331-345(对于DRB5*0101)；SLA317-331、SLA171-185、SLA417-431(对于DRB1*0401)；SLA359-373、SLA215-229、SLA111-125(对于DRB1*0701)。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD439-453、FTCD381-395、FTCD297-311(对于DRB3*0202)；FTCD525-539、FTCD218-232、FTCD495-509(对于DRB1*0301)；FTCD262-276、FTCD300-314、FTCD259-273(对于DRB4*0101)；FTCD490-504、FTCD389-403、FTCD295-309(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD271-285、FTCD498-512,和FTCD301-315。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：MPO322-336、MPO714-728、MPO617-631(对于DRB3*0202)；MPO504-518、MPO462-476、MPO617-631(对于DRB1*0301)；MPO444-458、MPO689-703、MPO248-262(对于DRB4*0101)；MPO511-525、MPO97-111、MPO616-630(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述组合物还包含药学上可接受的稳定剂、赋形剂、稀释剂或其组合。在某些实施例中，所述组合物被配制用于静脉内施用。在某些实施例中，所述组合物用于治疗自身免疫性疾病或炎症性疾病的方法中。在某些实施例中，所述组合物用于制备治疗自身免疫性疾病或炎症性疾病的药物。在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病选自由以下组成的组：I型糖尿病、多发性硬化症、复发-缓解型多发性硬化症、天疱疮、落叶型天疱疮、寻常型天疱疮、视神经脊髓炎谱系障碍、类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎、炎症性肠病、克罗恩病、乳糜泻、过敏性哮喘、系统性红斑狼疮、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病、肺气肿、银屑病、葡萄膜炎、干燥综合征、硬皮病、抗磷脂综合征、ANCA相关血管炎、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎和僵人综合征。在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是多发性硬化症。在某些实施例中，所述遍在自身抗原不是衍生自以下的多肽：髓磷脂碱性蛋白、髓磷脂相关糖蛋白、髓磷脂少突胶质细胞蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白、少突胶质细胞髓磷脂寡蛋白、髓磷脂相关的少突胶质细胞碱性蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、NOGO A、糖蛋白Po、外周髓磷脂蛋白22或2’3’-环核苷酸3'-磷酸二酯酶。在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是I型糖尿病。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是衍生自前胰岛素原、胰岛素原、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶(IGRP)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛细胞自身抗原-2(ICA2)或胰岛素的多肽。
在某些方面，本文描述了一种治疗自身免疫性疾病或炎症性疾病的方法，所述方法包括给个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含：(a)多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)，所述多个抗原-主要组织相容性复合物中的每个抗原-MHC包含与MHC分子的结合槽相缔合的不是组织特异性抗原的遍在自身抗原；和(b)具有1至100纳米直径的纳米颗粒核；其中所述抗原-MHC偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述MHC分子是MHCII类分子。在某些实施例中，所述纳米颗粒核是金属或金属氧化物。在某些实施例中，所述金属是铁。在某些实施例中，所述金属氧化物是氧化铁。在某些实施例中，所述直径在约5纳米和约50纳米之间。在某些实施例中，所述直径在约5纳米和约25纳米之间。在某些实施例中，所述多个抗原-MHC以至少10:1的抗原-MHC比纳米颗粒核的比率偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述多个抗原-MHC以不超过150:1的抗原-MHC比纳米颗粒核的比率偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述多个抗原-MHC以约0.4至约13个抗原-MHC/100nm2纳米颗粒核表面积的密度偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述抗原-MHC共价偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述抗原-MHC通过质量小于约5千道尔顿的聚乙二醇(PEG)接头共价偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述纳米颗粒核还包含生物相容包衣。在某些实施例中，所述遍在自身抗原包含衍生自以稳定状态存在于细胞内区室中或细胞内区室上的蛋白质的多肽。在某些实施例中，所述细胞内区室是胞质溶胶、线粒体、高尔基体、内质网、细胞核或质膜。在某些实施例中，所述细胞内区室是线粒体。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是丙酮酸脱氢酶复合物-E2组分(PDC-E2)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是细胞色素P450 2D6(CYP2D6)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是可溶性肝抗原(SLA)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是肌动蛋白(ACTB)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是甲酰亚胺转移酶-环化脱氨酶(FTCD)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是髓过氧化物酶(MPO)。在某些实施例中，所述细胞内区室是线粒体。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：对于DRB3*0202，PDC-E2353-367、PDC-E272-86和PDC-E2422-436；对于DRB5*0101，PDC-E2353-367、PDC-E280-94和PDC-E2535-549；对于DRB4*0101，PDC-E2629-648、PDC-E2122-135和PDC-E2249-263；以及对于DRB1*0801，PDC-E2249-263。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：PDC-E2422-436和PDC-E280-94。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：CYP2D6284-298、CYP2D6289-303、CYP2D6318-332、CYP2D6313-332、CYP2D6393-412、CYP2D6192-206、CYP2D65-19、CYP2D6293-307(对于DRB1*0301)；CYP2D6219-233、CYP2D6237-251、CYP2D615-29(对于DRB3*0202)；CYP2D6235-249、CYP2D6317-331、CYP2D6293-307(对于DRB4*0101)；CYP2D6428-442、CYP2D6237-251、CYP2D614-28(对于DRB5*0101)；CYP2D6199-213、CYP2D6450-464、CYP2D6301-315(对于DRB1*0401)；CYP2D6452-466、CYP2D659-73、CYP2D6130-144、CYP2D6193-212、CYP2D6305-324、CYP2D615-29(对于DRB1*0701)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB202-216、ACTB170-184、ACTB245-259(对于DRB1*0301)；ACTB187-201、ACTB172-186、ACTB131-145(对于DRB3*0202)；ACTB131-145、ACTB171-185、ACTB129-143(对于DRB4*0101)；ACTB164-178、ACTB25-39、ACTB323-337(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB146-160、ACTB18-32和ACTB171-185。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：SLA334-348、SLA196-210、SLA115-129、SLA373-386、SLA186-197(对于DRB1*0301)；SLA342-256、SLA110-124、SLA299-313(对于DRB3*0202)；SLA49-63、SLA260-274、SLA119-133(对于DRB4*0101)；SLA86-100、SLA26-40、SLA331-345(对于DRB5*0101)；SLA317-331、SLA171-185、SLA417-431(对于DRB1*0401)；SLA359-373、SLA215-229、SLA111-125(对于DRB1*0701)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD439-453、FTCD381-395、FTCD297-311(对于DRB3*0202)；FTCD525-539、FTCD218-232、FTCD495-509(对于DRB1*0301)；FTCD262-276、FTCD300-314、FTCD259-273(对于DRB4*0101)；FTCD490-504、FTCD389-403、FTCD295-309(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD271-285、FTCD498-512,和FTCD301-315。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：MPO322-336、MPO714-728、MPO617-631(对于DRB3*0202)；MPO504-518、MPO462-476、MPO617-631(对于DRB1*0301)；MPO444-458、MPO689-703、MPO248-262(对于DRB4*0101)；MPO511-525、MPO97-111、MPO616-630(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述复合物还包含与所述纳米颗粒核偶联的第二多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)，所述第二多个抗原-主要组织相容性复合物中的每个抗原MHC包含抗原。在某些实施例中，所述第二多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)的抗原是第二遍在自身抗原。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原包含衍生自以稳定状态存在于细胞内区室中或细胞内区室上的蛋白质的多肽。在某些实施例中，所述细胞内区室是胞质溶胶、线粒体、高尔基体、内质网、细胞核或质膜。在某些实施例中，所述细胞内区室是线粒体。在某些实施例中，所述细胞内区室是线粒体。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：对于DRB3*0202，PDC-E2353-367、PDC-E272-86和PDC-E2422-436；对于DRB5*0101，PDC-E2353-367、PDC-E280-94和PDC-E2535-549；对于DRB4*0101，PDC-E2629-648、PDC-E2122-135和PDC-E2249-263；以及对于DRB1*0801，PDC-E2249-263。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：PDC-E2422-436和PDC-E280-94。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：CYP2D6284-298、CYP2D6289-303、CYP2D6318-332、CYP2D6313-332、CYP2D6393-412、CYP2D6192-206、CYP2D65-19、CYP2D6293-307(对于DRB1*0301)；CYP2D6219-233、CYP2D6237-251、CYP2D615-29(对于DRB3*0202)；CYP2D6235-249、CYP2D6317-331、CYP2D6293-307(对于DRB4*0101)；CYP2D6428-442、CYP2D6237-251、CYP2D614-28(对于DRB5*0101)；CYP2D6199-213、CYP2D6450-464、CYP2D6301-315(对于DRB1*0401)；CYP2D6452-466、CYP2D659-73、CYP2D6130-144、CYP2D6193-212、CYP2D6305-324、CYP2D615-29(对于DRB1*0701)。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB202-216、ACTB170-184、ACTB245-259(对于DRB1*0301)；ACTB187-201、ACTB172-186、ACTB131-145(对于DRB3*0202)；ACTB131-145、ACTB171-185、ACTB129-143(对于DRB4*0101)；ACTB164-178、ACTB25-39、ACTB323-337(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB146-160、ACTB18-32和ACTB171-185。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：SLA334-348、SLA196-210、SLA115-129、SLA373-386、SLA186-197(对于DRB1*0301)；SLA342-256、SLA110-124、SLA299-313(对于DRB3*0202)；SLA49-63、SLA260-274、SLA119-133(对于DRB4*0101)；SLA86-100、SLA26-40、SLA331-345(对于DRB5*0101)；SLA317-331、SLA171-185、SLA417-431(对于DRB1*0401)；SLA359-373、SLA215-229、SLA111-125(对于DRB1*0701)。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD439-453、FTCD381-395、FTCD297-311(对于DRB3*0202)；FTCD525-539、FTCD218-232、FTCD495-509(对于DRB1*0301)；FTCD262-276、FTCD300-314、FTCD259-273(对于DRB4*0101)；FTCD490-504、FTCD389-403、FTCD295-309(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD271-285、FTCD498-512,和FTCD301-315。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：MPO322-336、MPO714-728、MPO617-631(对于DRB3*0202)；MPO504-518、MPO462-476、MPO617-631(对于DRB1*0301)；MPO444-458、MPO689-703、MPO248-262(对于DRB4*0101)；MPO511-525、MPO97-111、MPO616-630(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述组合物还包含药学上可接受的稳定剂、赋形剂、稀释剂或其组合。在某些实施例中，所述组合物被配制用于静脉内施用。在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病选自由以下组成的组：I型糖尿病、多发性硬化症、复发-缓解型多发性硬化症、天疱疮、落叶型天疱疮、寻常型天疱疮、视神经脊髓炎谱系障碍、类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎、炎症性肠病、克罗恩病、乳糜泻、过敏性哮喘、系统性红斑狼疮、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病、肺气肿、银屑病、葡萄膜炎、干燥综合征、硬皮病、抗磷脂综合征、ANCA相关血管炎、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎和僵人综合征。在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是多发性硬化症。在某些实施例中，所述遍在自身抗原不是衍生自以下的多肽：髓磷脂碱性蛋白、髓磷脂相关糖蛋白、髓磷脂少突胶质细胞蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白、少突胶质细胞髓磷脂寡蛋白、髓磷脂相关的少突胶质细胞碱性蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、NOGO A、糖蛋白Po、外周髓磷脂蛋白22或2’3’-环核苷酸3'-磷酸二酯酶。在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是I型糖尿病。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是衍生自前胰岛素原、胰岛素原、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶(IGRP)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛细胞自身抗原-2(ICA2)或胰岛素的多肽。
在本文所述的另一方面中，是治疗多发性硬化症的方法，所述方法包括给个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含：(a)多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)，所述多个抗原-主要组织相容性复合物中的每个抗原-MHC包含与MHC分子的结合槽相缔合的不是多发性硬化症特异性抗原的遍在自身抗原；和(a)纳米颗粒核，所述纳米颗粒核具有1至100纳米的直径；其中所述抗原-MHC偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述MHC分子是MHC II类分子。在某些实施例中，所述纳米颗粒核是金属或金属氧化物。在某些实施例中，所述金属是铁。在某些实施例中，所述金属氧化物是氧化铁。在某些实施例中，所述直径在约5纳米和约50纳米之间。在某些实施例中，所述直径在约5纳米和约25纳米之间。在某些实施例中，所述多个抗原-MHC以至少10:1的抗原-MHC比纳米颗粒核的比率偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述多个抗原-MHC以不超过150:1的抗原-MHC比纳米颗粒核的比率偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述多个抗原-MHC以约0.4至约13个抗原-MHC/100nm2纳米颗粒核表面积的密度偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述抗原-MHC共价偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述抗原-MHC通过质量小于约5千道尔顿的聚乙二醇(PEG)接头共价偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述纳米颗粒核还包含生物相容包衣。在某些实施例中，所述遍在自身抗原包含衍生自以稳定状态存在于细胞内区室中或细胞内区室上的蛋白质的多肽。在某些实施例中，所述细胞内区室是胞质溶胶。在某些实施例中，所述细胞内区室是线粒体。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是丙酮酸脱氢酶复合物-E2组分(PDC-E2)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是细胞色素P4502D6(CYP2D6)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是可溶性肝抗原(SLA)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是肌动蛋白(ACTB)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是甲酰亚胺转移酶-环化脱氨酶(FTCD)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是髓过氧化物酶(MPO)。在某些实施例中，所述细胞内区室是线粒体。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：对于DRB3*0202，PDC-E2353-367、PDC-E272-86和PDC-E2422-436；对于DRB5*0101，PDC-E2353-367、PDC-E280-94和PDC-E2535-549；对于DRB4*0101，PDC-E2629-648、PDC-E2122-135和PDC-E2249-263；以及对于DRB1*0801，PDC-E2249-263。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：PDC-E2422-436和PDC-E280-94。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：CYP2D6284-298、CYP2D6289-303、CYP2D6318-332、CYP2D6313-332、CYP2D6393-412、CYP2D6192-206、CYP2D65-19、CYP2D6293-307(对于DRB1*0301)；CYP2D6219-233、CYP2D6237-251、CYP2D615-29(对于DRB3*0202)；CYP2D6235-249、CYP2D6317-331、CYP2D6293-307(对于DRB4*0101)；CYP2D6428-442、CYP2D6237-251、CYP2D614-28(对于DRB5*0101)；CYP2D6199-213、CYP2D6450-464、CYP2D6301-315(对于DRB1*0401)；CYP2D6452-466、CYP2D659-73、CYP2D6130-144、CYP2D6193-212、CYP2D6305-324、CYP2D615-29(对于DRB1*0701)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB202-216、ACTB170-184、ACTB245-259(对于DRB1*0301)；ACTB187-201、ACTB172-186、ACTB131-145(对于DRB3*0202)；ACTB131-145、ACTB171-185、ACTB129-143(对于DRB4*0101)；ACTB164-178、ACTB25-39、ACTB323-337(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB146-160、ACTB18-32和ACTB171-185。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：SLA334-348、SLA196-210、SLA115-129、SLA373-386、SLA186-197(对于DRB1*0301)；SLA342-256、SLA110-124、SLA299-313(对于DRB3*0202)；SLA49-63、SLA260-274、SLA119-133(对于DRB4*0101)；SLA86-100、SLA26-40、SLA331-345(对于DRB5*0101)；SLA317-331、SLA171-185、SLA417-431(对于DRB1*0401)；SLA359-373、SLA215-229、SLA111-125(对于DRB1*0701)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD439-453、FTCD381-395、FTCD297-311(对于DRB3*0202)；FTCD525-539、FTCD218-232、FTCD495-509(对于DRB1*0301)；FTCD262-276、FTCD300-314、FTCD259-273(对于DRB4*0101)；FTCD490-504、FTCD389-403、FTCD295-309(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD271-285、FTCD498-512,和FTCD301-315。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：MPO322-336、MPO714-728、MPO617-631(对于DRB3*0202)；MPO504-518、MPO462-476、MPO617-631(对于DRB1*0301)；MPO444-458、MPO689-703、MPO248-262(对于DRB4*0101)；MPO511-525、MPO97-111、MPO616-630(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述复合物还包含与所述纳米颗粒核偶联的第二多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)，所述第二多个抗原-主要组织相容性复合物中的每个抗原MHC包含抗原。在某些实施例中，所述第二多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)的抗原是第二遍在自身抗原。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原包含衍生自以稳定状态存在于细胞内区室中或细胞内区室上的蛋白质的多肽。在某些实施例中，所述细胞内区室是胞质溶胶。在某些实施例中，所述细胞内区室是线粒体。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：对于DRB3*0202，PDC-E2353-367、PDC-E272-86和PDC-E2422-436；对于DRB5*0101，PDC-E2353-367、PDC-E280-94和PDC-E2535-549；对于DRB4*0101，PDC-E2629-648、PDC-E2122-135和PDC-E2249-263；以及对于DRB1*0801，PDC-E2249-263。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：PDC-E2422-436和PDC-E280-94。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：CYP2D6284-298、CYP2D6289-303、CYP2D6318-332、CYP2D6313-332、CYP2D6393-412、CYP2D6192-206、CYP2D65-19、CYP2D6293-307(对于DRB1*0301)；CYP2D6219-233、CYP2D6237-251、CYP2D615-29(对于DRB3*0202)；CYP2D6235-249、CYP2D6317-331、CYP2D6293-307(对于DRB4*0101)；CYP2D6428-442、CYP2D6237-251、CYP2D614-28(对于DRB5*0101)；CYP2D6199-213、CYP2D6450-464、CYP2D6301-315(对于DRB1*0401)；CYP2D6452-466、CYP2D659-73、CYP2D6130-144、CYP2D6193-212、CYP2D6305-324、CYP2D615-29(对于DRB1*0701)。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB202-216、ACTB170-184、ACTB245-259(对于DRB1*0301)；ACTB187-201、ACTB172-186、ACTB131-145(对于DRB3*0202)；ACTB131-145、ACTB171-185、ACTB129-143(对于DRB4*0101)；ACTB164-178、ACTB25-39、ACTB323-337(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB146-160、ACTB18-32和ACTB171-185。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：SLA334-348、SLA196-210、SLA115-129、SLA373-386、SLA186-197(对于DRB1*0301)；SLA342-256、SLA110-124、SLA299-313(对于DRB3*0202)；SLA49-63、SLA260-274、SLA119-133(对于DRB4*0101)；SLA86-100、SLA26-40、SLA331-345(对于DRB5*0101)；SLA317-331、SLA171-185、SLA417-431(对于DRB1*0401)；SLA359-373、SLA215-229、SLA111-125(对于DRB1*0701)。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD439-453、FTCD381-395、FTCD297-311(对于DRB3*0202)；FTCD525-539、FTCD218-232、FTCD495-509(对于DRB1*0301)；FTCD262-276、FTCD300-314、FTCD259-273(对于DRB4*0101)；FTCD490-504、FTCD389-403、FTCD295-309(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD271-285、FTCD498-512,和FTCD301-315。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：MPO322-336、MPO714-728、MPO617-631(对于DRB3*0202)；MPO504-518、MPO462-476、MPO617-631(对于DRB1*0301)；MPO444-458、MPO689-703、MPO248-262(对于DRB4*0101)；MPO511-525、MPO97-111、MPO616-630(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述组合物还包含药学上可接受的稳定剂、赋形剂、稀释剂或其组合。在某些实施例中，所述组合物被配制用于静脉内施用。在某些实施例中，所述遍在自身抗原不是衍生自以下的多肽：髓磷脂碱性蛋白、髓磷脂相关糖蛋白、髓磷脂少突胶质细胞蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白、少突胶质细胞髓磷脂寡蛋白、髓磷脂相关的少突胶质细胞碱性蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、NOGO A、糖蛋白Po、外周髓磷脂蛋白22或2’3’-环核苷酸3'-磷酸二酯酶。
在本文所述的另一方面中，是治疗I型糖尿病的方法，所述方法包括给个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含：(a)多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)，所述多个抗原-主要组织相容性复合物中的每个抗原-MHC包含与MHC分子的结合槽相缔合的不是I型糖尿病特异性抗原的遍在自身抗原；和(b)纳米颗粒核，所述纳米颗粒核具有1至100纳米的直径；其中所述多个抗原-MHC偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述MHC分子是MHC II类分子。在某些实施例中，所述纳米颗粒核是金属或金属氧化物。在某些实施例中，所述金属是铁。在某些实施例中，所述金属氧化物是氧化铁。在某些实施例中，所述直径在约5纳米和约50纳米之间。在某些实施例中，所述直径在约5纳米和约25纳米之间。在某些实施例中，所述多个抗原-MHC以至少10:1的抗原-MHC比纳米颗粒核的比率偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述多个抗原-MHC以不超过150:1的抗原-MHC比纳米颗粒核的比率偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述多个抗原-MHC以约0.4至约13个抗原-MHC/100nm2纳米颗粒表面积的密度偶联到所述纳米颗粒。在某些实施例中，所述抗原-MHC共价偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述抗原-MHC通过质量小于约5千道尔顿的聚乙二醇(PEG)接头共价偶联到所述纳米颗粒核。在某些实施例中，所述纳米颗粒核还包含生物相容包衣。在某些实施例中，所述遍在自身抗原包含衍生自以稳定状态存在于细胞内区室中或细胞内区室上的蛋白质的多肽。在某些实施例中，所述细胞内区室是胞质溶胶。在某些实施例中，所述细胞内区室是线粒体。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是丙酮酸脱氢酶复合物-E2组分(PDC-E2)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是细胞色素P450 2D6(CYP2D6)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是可溶性肝抗原(SLA)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是肌动蛋白(ACTB)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是甲酰亚胺转移酶-环化脱氨酶(FTCD)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原是髓过氧化物酶(MPO)。在某些实施例中，所述细胞内区室是线粒体。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：对于DRB3*0202，PDC-E2353-367、PDC-E272-86和PDC-E2422-436；对于DRB5*0101，PDC-E2353-367、PDC-E280-94和PDC-E2535-549；对于DRB4*0101，PDC-E2629-648、PDC-E2122-135和PDC-E2249-263；以及对于DRB1*0801，PDC-E2249-263。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：PDC-E2422-436和PDC-E280-94。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：CYP2D6284-298、CYP2D6289-303、CYP2D6318-332、CYP2D6313-332、CYP2D6393-412、CYP2D6192-206、CYP2D65-19、CYP2D6293-307(对于DRB1*0301)；CYP2D6219-233、CYP2D6237-251、CYP2D615-29(对于DRB3*0202)；CYP2D6235-249、CYP2D6317-331、CYP2D6293-307(对于DRB4*0101)；CYP2D6428-442、CYP2D6237-251、CYP2D614-28(对于DRB5*0101)；CYP2D6199-213、CYP2D6450-464、CYP2D6301-315(对于DRB1*0401)；CYP2D6452-466、CYP2D659-73、CYP2D6130-144、CYP2D6193-212、CYP2D6305-324、CYP2D615-29(对于DRB1*0701)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB202-216、ACTB170-184、ACTB245-259(对于DRB1*0301)；ACTB187-201、ACTB172-186、ACTB131-145(对于DRB3*0202)；ACTB131-145、ACTB171-185、ACTB129-143(对于DRB4*0101)；ACTB164-178、ACTB25-39、ACTB323-337(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB146-160、ACTB18-32和ACTB171-185。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：SLA334-348、SLA196-210、SLA115-129、SLA373-386、SLA186-197(对于DRB1*0301)；SLA342-256、SLA110-124、SLA299-313(对于DRB3*0202)；SLA49-63、SLA260-274、SLA119-133(对于DRB4*0101)；SLA86-100、SLA26-40、SLA331-345(对于DRB5*0101)；SLA317-331、SLA171-185、SLA417-431(对于DRB1*0401)；SLA359-373、SLA215-229、SLA111-125(对于DRB1*0701)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD439-453、FTCD381-395、FTCD297-311(对于DRB3*0202)；FTCD525-539、FTCD218-232、FTCD495-509(对于DRB1*0301)；FTCD262-276、FTCD300-314、FTCD259-273(对于DRB4*0101)；FTCD490-504、FTCD389-403、FTCD295-309(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD271-285、FTCD498-512,和FTCD301-315。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：MPO322-336、MPO714-728、MPO617-631(对于DRB3*0202)；MPO504-518、MPO462-476、MPO617-631(对于DRB1*0301)；MPO444-458、MPO689-703、MPO248-262(对于DRB4*0101)；MPO511-525、MPO97-111、MPO616-630(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述复合物还包含与所述纳米颗粒核偶联的第二多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)，所述第二多个抗原-主要组织相容性复合物中的每个抗原MHC包含抗原。在某些实施例中，所述第二多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)的抗原是第二遍在自身抗原。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原包含衍生自以稳定状态存在于细胞内区室中或细胞内区室上的蛋白质的多肽。在某些实施例中，所述细胞内区室是胞质溶胶。在某些实施例中，所述细胞内区室是线粒体。在某些实施例中，所述细胞内区室是线粒体。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：对于DRB3*0202，PDC-E2353-367、PDC-E272-86和PDC-E2422-436；对于DRB5*0101，PDC-E2353-367、PDC-E280-94和PDC-E2535-549；对于DRB4*0101，PDC-E2629-648、PDC-E2122-135和PDC-E2249-263；以及对于DRB1*0801，PDC-E2249-263。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：PDC-E2422-436和PDC-E280-94。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：CYP2D6284-298、CYP2D6289-303、CYP2D6318-332、CYP2D6313-332、CYP2D6393-412、CYP2D6192-206、CYP2D65-19、CYP2D6293-307(对于DRB1*0301)；CYP2D6219-233、CYP2D6237-251、CYP2D615-29(对于DRB3*0202)；CYP2D6235-249、CYP2D6317-331、CYP2D6293-307(对于DRB4*0101)；CYP2D6428-442、CYP2D6237-251、CYP2D614-28(对于DRB5*0101)；CYP2D6199-213、CYP2D6450-464、CYP2D6301-315(对于DRB1*0401)；CYP2D6452-466、CYP2D659-73、CYP2D6130-144、CYP2D6193-212、CYP2D6305-324、CYP2D615-29(对于DRB1*0701)。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB202-216、ACTB170-184、ACTB245-259(对于DRB1*0301)；ACTB187-201、ACTB172-186、ACTB131-145(对于DRB3*0202)；ACTB131-145、ACTB171-185、ACTB129-143(对于DRB4*0101)；ACTB164-178、ACTB25-39、ACTB323-337(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB146-160、ACTB18-32和ACTB171-185。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：SLA334-348、SLA196-210、SLA115-129、SLA373-386、SLA186-197(对于DRB1*0301)；SLA342-256、SLA110-124、SLA299-313(对于DRB3*0202)；SLA49-63、SLA260-274、SLA119-133(对于DRB4*0101)；SLA86-100、SLA26-40、SLA331-345(对于DRB5*0101)；SLA317-331、SLA171-185、SLA417-431(对于DRB1*0401)；SLA359-373、SLA215-229、SLA111-125(对于DRB1*0701)。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD439-453、FTCD381-395、FTCD297-311(对于DRB3*0202)；FTCD525-539、FTCD218-232、FTCD495-509(对于DRB1*0301)；FTCD262-276、FTCD300-314、FTCD259-273(对于DRB4*0101)；FTCD490-504、FTCD389-403、FTCD295-309(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD271-285、FTCD498-512,和FTCD301-315。在某些实施例中，所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：MPO322-336、MPO714-728、MPO617-631(对于DRB3*0202)；MPO504-518、MPO462-476、MPO617-631(对于DRB1*0301)；MPO444-458、MPO689-703、MPO248-262(对于DRB4*0101)；MPO511-525、MPO97-111、MPO616-630(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，所述组合物还包含药学上可接受的稳定剂、赋形剂、稀释剂或其组合。在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是I型糖尿病。在某些实施例中，所述遍在自身抗原不是衍生自前胰岛素原、胰岛素原、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶(IGRP)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛细胞自身抗原-2(ICA2)或胰岛素的多肽。
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本文描述的新颖特征在所附权利要求书中详细阐述。通过参考以下详细描述以及附图，将获得对这里描述的特征的特征和优点的更好理解，所述详细描述阐述了说明性实例，其中利用了这里描述的特征的原理，所述附图：
图1说明了通过与衍生自丙酮酸脱氢酶复合物-E2组分(PDC-E2)的肽缔合的MHCII类偶联的纳米颗粒(PBC相关的肽-主要组织相容性复合物-纳米颗粒(pMHC-NP))扩增原发性胆汁性肝硬化(PBC)相关的调节性T细胞。图1A显示NOD相比于NOD.c3c4小鼠血液中四聚体+CD4+ T细胞的作为年龄的函数的百分比。图1B显示与未治疗的NOD或NOD.c3c4小鼠或用对照Cys-NP治疗的NOD.c3c4小鼠相比，pMHC-NP治疗的NOD.c3c4小鼠的外周血中四聚体+CD4+ T细胞的百分比。图1C显示在pMHC-NP疗法结束时，来自图B的小鼠的不同器官中的四聚体+CD4+ T细胞的百分比。图1D显示用1型糖尿病相关的pMHC-NP治疗的NOD.c3c4小鼠中四聚体+CD4+ T细胞的百分比。图1E显示用包被有两种不同的PBC相关pMHC之一的NP治疗的NOD.c3c4小鼠的各种淋巴器官和肝中四聚体+CD4+ T细胞的百分比。图1F显示经pMHC-NP疗法的NOD.c3c4小鼠中扩增的四聚体+CD4+ T细胞的TR1样细胞表面标记物表达。(图1G显示在用肽脉冲的DC刺激后，分选的四聚体+CD4+TR1样细胞相比于四聚体阴性的CD4+ T细胞的离体细胞因子分泌谱。
图2说明PBC相关的pMHC-NP对PBC相关的调节性T细胞的扩增。(图2A-B)应答于PDC166/IAg7-或PDC82/IAg7-NP疗法而在体内扩增的四聚体+CD4+ T细胞上TR1样标记物的上调。图2A是代表性的FACS谱；图2B显示平均荧光强度值。图2C显示在38-44周龄NOD.c3c4小鼠中应答于PDC166/IAg7-NP疗法产生的四聚体+CD4+ T细胞上TR1细胞表面标记物的平均荧光强度值。
图3说明NOD.c3c4小鼠中肝疾病的临床特征、表型特征、免疫学特征和病理学特征。图3A显示血清TB和ALT水平随年龄的变化。图3B显示显微评分系统(左)和疾病显微评分随年龄的进展(右)。图3C显示代表性的CBD图像以及CBD直径和得分随年龄的进展。图3D显示了代表性的肝图像(上)和肝得分和重量随年龄的进展(下)。图3E显示NOD.c3c4小鼠自发产生抗PDC-E2特异性自身抗体(左)和ANA(右)。图3F描绘了由CD4+和CD8+ T细胞引起的肝炎症的代表性图像。
图4说明了使用PBC相关的pMHC-NP在PBC小鼠模型中的疾病逆转。图4A显示经PDC166/IAg7-NP、PDC82/IAg7-NP或对照(Cys-NP)治疗的NOD.c3c4小鼠血清中总胆汁酸(TBA)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平的变化。图4B显示来自PDC166/IAg7-NP、PDC82/IAg7-NP或Cys-NP治疗的NOD.c3c4小鼠的肝的代表性组织学图像(上)和平均组织学得分(下)。图4C显示代表性的胆总管宏观图像(上)，以及平均胆总管得分和直径(下)。图4D显示肝的代表性宏观图像(上)和平均肝得分和重量(下)。图4E显示用PDC166/IAg7-NP或对照Cys-NP治疗的NOD.c3c4小鼠的代表性全身图像。图4F显示治疗后抗线粒体(PDC-E2)抗体和抗核自身抗体(ANA)的滴度的变化(分别为左上两个小图和右侧小图)，以及用来自pMHC-NP相比于Cys-NP治疗的NOD.c3c4小鼠的血清染色的Hep2细胞的代表性图像(下)。图4G显示从24周龄开始(直到38-44周)治疗的小鼠中四聚体+细胞的百分比。图4H和4I显示图4G中研究的小鼠的显微(图4H)和宏观得分(图4I)。
图5说明四聚体+CD4+ T细胞的循环频率应答于与PBC相关的纳米颗粒的周期性再治疗的变化。图5A显示两个不同的小鼠，并且图5B显示对应于用PDC166/IAg7-NP治疗或不予治疗的小鼠的队列的平均值。图5C显示四聚体+CD4+ T细胞的百分比，并且图5D显示来自图5A中研究的小鼠的四聚体+CD4+ T细胞中TR1标记物染色的平均荧光强度。图5E显示了图5A-D中研究的小鼠的平均宏观CBD和肝得分。
图6说明当在疾病过程早期开始治疗时，用PBC相关pMHC-NP或PBC标准护理(UDCA)治疗对宏观和血清ALT水平(图6A)和微观(图6B)疾病得分的影响。图6C显示在图6A-B中研究的小鼠中四聚体+CD4+ T细胞的百分比。图6D和6E显示在疾病晚期开始治疗时，用PBC相关pMHC-NP或PBC标准护理(UDCA)治疗对宏观(图6D)和微观(图6E)疾病得分的影响。图6F显示在图6D-E中研究的小鼠中四聚体+CD4+ T细胞的百分比。
图7说明PBC相关pMHC-NP扩增调节性B细胞。图7A显示用pMHC-NP和大鼠-IgG(对照)或针对小鼠IL-10或TGF-β的阻断性大鼠mAb治疗的小鼠中四聚体+CD4+ T细胞的百分比。图7B和7C显示图7A中研究的小鼠的宏观(图7B)和微观(图7C)得分。图7D显示在NOD.c3c4.scid宿主的血液和淋巴器官中的四聚体+CD4+ T细胞的百分比，所述宿主用来自未治疗的NOD.c3c4供体的全脾细胞重构并且然后输注来自PDC166-181/IAg7-NP治疗的NOD.c3c4小鼠的脾CD4+ T细胞。后者在CD4+ T细胞转移后不治疗或用PDC166-181/IAg7-NP治疗。图7E显示用PDC166-181/IAg7-NP治疗的宿主的四聚体+CD4+ T细胞相比于四聚体-CD4+T细胞上的TR1标记物的代表性FACS染色直方图(上)和平均荧光强度值(下)。图7F显示A中研究的小鼠的宏观得分和测量值。图7G显示LPS激发的CD11b+细胞的细胞因子谱，所述CD11b+细胞分离自pMHC-NP治疗的相比于Cys-NP治疗的NOD.c3c4小鼠的肝引流(PLN)或非引流(MLN)淋巴结。图7H显示来自pMHC-NP相比于Cys-NP治疗的NOD.c3c4小鼠的肝枯否细胞的细胞因子谱。图7I显示pMHC-NP相比于Cys-NP治疗的NOD.c3c4小鼠肝引流(PCLN)和非引流(ILN)淋巴结或肝中B细胞的绝对数量。图7J显示pMHC-NP治疗小鼠中的B细胞绝对数量与四聚体+CD4+ T细胞绝对数量之间的相关性。图7K显示从pMHC-NP相比于Cys-NP治疗的NOD.c3c4小鼠的肝引流和非引流淋巴结或肝分离的LPS激发的B细胞的IL-10分泌水平。图7L显示在实验中仅在用pMHC-NP治疗的宿主中出现B细胞转化为产生IL-10的调节性B细胞(Breg cell)的代表性FACS图。图7M显示在用pMHC-NP或Cys-NP治疗的宿主中在肝和外周淋巴器官(含有(脾和PCLN)或缺乏(MLN)pMHC-NP诱导的TR1样CD4+ T细胞)中常规B细胞衍生的调节性B细胞的百分比。
图8说明PBC相关的pMHC-NP保留全身性免疫。图8A显示了在全身性rVV感染后4天和14天，pMHC-NP治疗的相比于未治疗的NOD.c3c4雌性小鼠的卵巢中rVV的平均滴度。图8B显示在感染PR8毒株后3天和7天在有或没有事先用HKx31株引发情况下，pMHC-NP治疗的相比于未治疗的NOD.c3c4雌性小鼠的肺中流感病毒滴度。图8C显示作为感染和治疗的函数的临床得分和体重变化。图8D显示在全身性李斯特菌感染后第3、7和14天，pMHC治疗和未治疗的NOD或NOD.c3c4小鼠的脾或肝中的李斯特菌的集落形成单位。图8E显示KLH-DNP免疫后血清抗DNP抗体滴度(n＝3/组)。图8F-8K示出了未治疗的相比于PDC166-181/IAg7-NP治疗的NOD.c3c4(n＝5/组)或注射CT26细胞的未治疗的Balb/c(n＝7)的四聚体+细胞的百分比(图8F)，宏观PBC得分和肝重量(图8G)，微观PBC得分(图8H)，肝图像(图8I)，微观肿瘤得分(图8J)和存活率(图8K)。图8L-8P显示未治疗的相比于PDC166-181/IAg7-NP治疗的NOD.c3c4(n＝5和4)或注射B16/F10细胞的未治疗的B6(n＝6)的四聚体+细胞的百分比(图8L)，宏观(图8M)和微观PBC得分(图8N)，以及肝重量和转移数(图8O)和肝图像(图8P)。图8Q显示图8L-8P中的小鼠存活率。数据对应于平均±SEM。除K、Q(对数秩)或C(双向ANOVA)外，P值通过曼-惠特尼(Mann-Whitney)U进行比较。
图9说明在人源化小鼠中通过PBC相关的pMHC-NP扩增调节性T细胞。图9A显示移植有来自DRB4*0101+PBC患者的PBMC并用三种不同的PBC相关pMHC-NP治疗的NSG宿主中代表性的四聚体染色。图9B显示应答性相比于无应答性pMHC-NP治疗的或未治疗的同窝小鼠中四聚体+CD4+细胞的平均百分比和绝对数量。图9C显示在图9A-B中研究的小鼠中TR1标记物CD49b和LAG3的平均荧光强度值(上)和二维FACS图(下)。
图10说明PBC相关的pMHC-NP能够治疗不同于PBC的肝自身免疫的模型中疾病，特别是原发性硬化性胆管炎(PSC)和自身免疫性肝炎(AIH)。图10A显示NOD.Abcb4-/-小鼠应答于pMHC-NP疗法的四聚体+CD4+ T细胞百分比。图10B显示了对应于图10A中研究的小鼠的平均原发性硬化性胆管炎得分(上)和代表性的H&E染色的或天狼猩染色的肝切片(下)，以及TBA和ALT(右列)。图10C显示感染编码hFTCD的腺病毒(发展AIH)并用三种不同的pMHC-NP类型治疗的NOD小鼠中四聚体+CD4+ T细胞的百分比。图10D显示了图10C中研究的小鼠的自身免疫性肝炎组织病理学得分(上)和代表性的H&D和天狼猩肝染色切片(下)。图10E显示图10C中小鼠中的血清ALT水平[n＝11、5、9和10只小鼠(从左至右)；2-3个实验]。
图11说明PBC和AIH相关的pMHC-NP在PSC小鼠模型中扩增调节性T细胞。图11A显示代表性的FACS染色直方图，图11B显示用PBC相关的或AIH相关的pMHC-NP治疗的NOD.Abcb4-/-小鼠(自发发展PSC)的四聚体+CD4+ T细胞相比于四聚体-CD4+ T细胞上TR1标记物的平均荧光强度值。
图12说明PBC相关的pMHC-NP在AIH小鼠模型中扩增调节性T细胞。图12A显示代表性的FACS染色直方图，图12B显示用PBC相关的或AIH相关的pMHC-NP治疗的感染了编码hFTCD的腺病毒的NOD小鼠(自发发展AIH)的四聚体+CD4+ T细胞相比于四聚体-CD4+ T细胞上TR1标记物的平均荧光强度值。
图13说明了基于遍在自身抗原的pMHC-NP以器官特异性而非疾病特异性的方式钝化肝自身免疫性疾病的能力。图13A显示用AIH相关的pMHC-NP类型治疗的NOD.c3c4小鼠中四聚体+CD4+ T细胞的百分比。图13B显示用PBC相关的、AIH相关的或T1D相关的pMHC-NP类型治疗的NOD.c3c4小鼠中的平均宏观肝得分。图13C显示用PBC相关的或AIH相关的pMHC-NP类型治疗的NOD小鼠中四聚体+CD4+ T细胞的百分比。
图14说明了PBC相关的pMHCII-NP在(NODxB6.Ifng-ARE-Del-/-)F1小鼠中的治疗作用。图14A显示用Cys-NP或PDC166-181/IAg7-NP治疗的小鼠(雄性和雌性混合)中四聚体+CD4+ T细胞的百分比。图14B显示了A中研究的小鼠的血清TBA和ALT水平。图14C显示了在A中研究的雌性小鼠的显微得分(左)和代表性的H&E染色的(右上)以及天狼猩红染色的肝切片(右下)。图14A-C中的数据分别对应于来自2-3个实验的n＝7和12只小鼠/治疗类型。
图15说明疾病相关的pMHCII-NP尽管含有PDC-E2自身反应性TR1样CD4+ T细胞，但保留了全身免疫。图15A显示在用HKx31毒株引发后7天，NP治疗的NOD.c3c4小鼠中PDC166-181/IAg7的血液和淋巴器官中PDC166-181/IAg7四聚体+CD4+ T细胞的平均百分比。数据分别对应于n＝4和5。图15B显示感染李斯特菌14天后，NP治疗的NOD.c3c4小鼠中PDC166-181/Ag7的血液和淋巴器官中PDC166-181/IAg7四聚体+CD4+ T细胞的平均百分比。数据分别对应于n＝3和5只小鼠。数据对应均值+SEM。P值通过曼-惠特尼U进行比较。
图16说明了展示来自遍在自身抗原的表位的基于pMHCII的纳米药物在NOD小鼠中钝化了复发-缓解型EAE。图16A显示pMHCII-NP治疗的具有EAE的NOD小鼠的血液、脾和宫颈LN中的四聚体+CD4+细胞的百分比。数据对应于(从上)：(i)5只Cys-NP治疗的小鼠和7只MOG36-50/IAg7-NP治疗的小鼠的MOG36-50/IAg7四聚体染色；(ii)11只Cys-NP治疗的小鼠+14只BDC2.5mi/IAg7-NP治疗的小鼠和22只PDC166-181/IAg7-NP治疗的小鼠的PDC166-181/IAg7四聚体染色(从2个实验中合并)；(iii)11只Cys-NP治疗的小鼠和8只CYPD398-412/IAg7-NP治疗的小鼠的CYPD398-412/IAg7四聚体染色(从2个实验中合并)；和(iv)14只PDC166-181/IAg7-NP治疗的小鼠和14只BDC2.5mi/IAg7-NP治疗的小鼠的BDC2.5mi/IAg7四聚体染色。图16B显示和针对脾四聚体+CD4+细胞中的TR1标记物的MFI。图16B中的数据对应于3只PDC166-181/IAg7-NP治疗的小鼠和4只BDC2.5mi/IAg7-NP治疗的小鼠。图16C显示用以下治疗的NOD小鼠的EAE得分：(i)Cys-NP(n＝9)，BDC2.5mi/IAg7-NP(n＝14)或MOG36-50/IAg7-NP(n＝8)(上)；和(ii)Cys-NP(n＝11，来自2个实验)，PDC166-181/IAg7-NP(n＝22，来自2个实验)或CYPD398-412/IAg7-NP(n＝8)(下)。图16D显示图16C中小鼠的小脑的代表性腊克沙固蓝(luxol fast blue，LFB)/H&E染色图片，显示炎性细胞浸润和脱髓鞘区域(白色箭头)。图16E显示图16D中小鼠的平均盲法组织病理学等级顺序LFB得分。在条形图中从左到右，数据对应于N＝5、7、6、8和7/NP类型。数据对应于平均值±SEM。使用双向ANOVA(图16C)或曼-惠特尼U检验(图16A，B和E)计算P值。
图17说明了展示来自遍在自身抗原的表位的基于pMHCII的纳米药物在C57BL/6小鼠中钝化慢性进行性EAE。图17A显示pMHCII-NP治疗的具有EAE的C57BL/6J小鼠的血液、脾和宫颈LN中的四聚体+CD4+细胞的百分比。数据对应于每个小图6只Cys-NP治疗的小鼠和7只pMHCII-NP治疗的小鼠的样品，用同源pMHC四聚体染色(上：MOG38-49/IAb；中：PDC94-108/IAb；和下：CYPD353-367/IAb)。图17B显示和脾四聚体+CD4+细胞中的TR1标记物的MFI。图17B中的数据对应于每个小图中7只pMHCII-NP治疗的小鼠。图17C显示pMHCII-NP治疗的具有EAE的C57BL/6J小鼠的EAE得分和初始体重变化％。数据对应于6只Cys-NP治疗的小鼠，7只MOG38-49/IAb-NP治疗的小鼠，7只PDC94-108/IAb-NP治疗的小鼠和7只CYPD353-367/IAb-NP治疗的小鼠。图17D显示图17D中小鼠的平均盲法组织病理学等级顺序LFB得分。在条形图中从左到右，数据对应于N＝6、6、6和7/pMHC-NP类型。数据对应于平均值±SEM。使用双向ANOVA(图17C)或曼-惠特尼U检验(图17A、B和D)计算P值。
图18说明自身抗原脱落使外周自身反应性T细胞对pMHCII-NP疗法有应答。图18A显示在治疗开始前(时间0)和治疗开始后2.5周和5周，pMHCII-NP治疗的相比于未治疗的NOD小鼠的血液中四聚体+CD4+细胞百分比。数据对应于(从左至右小图):(i)5只PDC166-181/IAg7-NP治疗(2个实验)；(ii)5只CYPD398-412/IAg7-NP治疗；和(iii)5只未治疗的小鼠(2个实验)。血液样品用BDC2.5mi/IAg7、PDC166-181/IAg7和CYPD398-412/IAg7四聚体染色。图18B显示PDC166-181/IAg7-NP或CYPD398-412/IAg7-NP治疗的NOD小鼠的不同淋巴器官和肝中四聚体+CD4+细胞的百分比。PCLN，门脉和腹腔LN；PLN：胰腺LN；MLN，肠系膜LN；BM，骨髓。数据对应于9只未治疗的小鼠(2个实验)、5只PDC166-181/IAg7-NP治疗的小鼠(2个实验)和5只CYPD398-412/IAg7-NP治疗的小鼠。图18C显示pMHCII-NP疗法后DT治疗的RIP-DTR转基因NOD小鼠的PCLN、PLN和脾中四聚体+CD4+细胞的百分比。数据对应于来自2个独立实验6只Cys-NP治疗的小鼠、5只BDC2.5mi/IAg7-NP治疗的小鼠、5只PDC166-181/IAg7-NP治疗的小鼠和5只CYPD398-412/IAg7-NP治疗的小鼠。将用BDC2.5mi/IAg7-NP和CYPD398-412/IAg7-NP治疗的小鼠的样品都用pMHCII四聚体(同源和非同源)进行染色。将用Cys-NP治疗的小鼠、PDC166-181/IAg7-NP治疗的小鼠和MOG36-50/IAg7-NP治疗的小鼠的样品分别用PDC166-181/IAg7或MOG36-50/IAg7四聚体染色。图18D显示针对脾四聚体+CD4+细胞中的TR1标记物的平均荧光强度(MFI)。数据表示为平均值±SEM。使用ANOVA(图18A)或曼-惠特尼U检验(图18B、C和D)计算P值。
图19说明银屑病的小鼠模型可以引发遍在自身抗原，并且遍在自身抗原pMHCII-NP疗法的施用可以减少银屑病的体征。图19A显示PDC166-181/IAg7T细胞的四聚体染色百分比。图19B显示施用PDC166-181/IAg7-NP的小鼠耳厚度的改善。
图20说明了本公开的pMHC-NP的非限制性实施例。图20A显示MHC II类二聚体的α链，其融合到包含工程改造的杵的免疫球蛋白分子的CH2和CH3结构域。图20B显示MHC II类的β链，其具有融合到MHC II类的β链上的N-末端遍在多肽(E2122-135)，并融合到包含工程改造的臼的免疫球蛋白分子的CH2和CH3结构域上。
表1说明了可用于将遍在自身抗原-MHC偶联到纳米颗粒的接头。
表2、3和4说明了在用三种不同的人PBC相关pMHC-NP类型治疗后，移植了来自DRB4*0101+PBC患者的PBMC的NSG小鼠中四聚体+CD4+ T细胞的百分比和绝对数量。
具体实施方式
下文描述各种实施例。应当注意的是，特定实施例并不旨在作为穷尽性描述或作为对本文所讨论的更广泛方面的限制。结合特定实施例描述的一个方面不一定限于该实施例，并且可以用任何其他一个或多个实施例来实践。
在描述要素的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)，术语“一个”和“一种”和“所述”以及类似的参考的使用将被解释为涵盖单数和复数二者，除非本文中另外指示或与上下文明显相矛盾。在此叙述值的范围仅旨在用作个别参考所述范围内的每个单独数值的简写方法，除非在此另外指示，并且将每个单独数值结合在说明书中，就好像它在此个别引用一样。在本文描述的所有方法能够以任何适合顺序进行，除非本文另外说明或另外与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“比如”)的使用仅旨在更好地说明实施例，并且不对权利要求书的范围构成限制，除非另有说明。说明书中的语言不应当被解释为指示任何未要求保护的要素为必需的。
本文所用“抗原”是指能够诱导受试者免疫应答或免疫细胞(优选T或B细胞)扩增的分子的全部、部分、片段或区段。抗原可以是多肽、脂质、碳水化合物或核酸。
如本文所用，“个体”与“受试者”或“患者”同义。个体可以被诊断出患有疾病。所述个体可以基于以下被怀疑患有特定疾病：表现出所述疾病的至少一种症状，具有所述疾病的家族史，具有与定义所述疾病风险相关的基因型，或者具有处于或接近将使个体处于所述疾病风险的水平的一个或多个表型测量或“实验室测试”。个体可以是哺乳动物，如马、猫、狗、猪、牛、山羊或绵羊。在某些情况下，个体可以是人。
如本文所用，“约”将为本领域普通技术人员所理解，并且在某种程度上取决于其使用的上下文而变化。如果该术语的使用在本领域普通技术人员使用的上下文中是不明确的，则“约”将意味着高达特定术语的正负10％。
如本文所用，“多肽”是指通过肽键连接的具有多于约八个氨基酸残基的多个氨基酸。多肽的氨基酸可以是天然存在的或非天然的氨基酸残基。
相对于参考多肽序列的序列同一性百分比(％)是在对序列进行比对并在必要时引入缺口以获得最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过各种已知的方式实现，例如，使用公开可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。能够确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的算法。然而，出于本文的目的，氨基酸序列同一性％值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成的。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因技术公司(Genentech,Inc.)编写，其源代码已在华盛顿特区的美国版权局(U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559)以用户文档形式提交，并在那里以美国版权登记号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从加利福尼亚州南旧金山的基因技术公司公开获得，或者可以从源代码编译。应编译ALIGN-2程序以便在UNIX操作系统(包括数字UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置且不变。
在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与、跟或针对给定氨基酸序列B(其可替代地被表述为具有或包含与、跟或针对给定氨基酸序列B的特定氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％计算如下：分数X/Y的100倍，其中X是序列比对程序ALIGN-2在该程序对A和B的比对中被评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A到B的氨基酸序列同一性％将不等于B到A的氨基酸序列同一性％。除非另有特别说明，本文所用的所有氨基酸序列同一性％值都是使用ALIGN-2计算机程序如前一段所述获得的。
本文描述的本公开的uaMHC-NP的uaMHC可以由核酸编码。核酸是包含两个或更多个核苷酸碱基的多核苷酸类型。在某些实施例中，核酸是可用于将编码多肽的多核苷酸转移到细胞中的载体的组分。如本文所用，术语“载体”指的是能够运送与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是基因组整合载体，或“整合载体”，它可以整合到宿主细胞的染色体DNA中。另一种类型的载体是“附加体”载体，例如能够进行染色体外复制的核酸。能够指导其可操作地连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。合适的载体包括质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、病毒载体等。在表达载体中，用于控制转录的调控元件如启动子、增强子、多聚腺苷酸信号可以衍生自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因。也可另外掺入在宿主中复制的能力(通常由复制起点所赋予)和促进转化体识别的选择基因。可以使用衍生自病毒的载体，例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等。质粒载体可以线性化以整合到染色体位置。载体可以包括指导位点特异性整合到基因组中定义的位置或限制性位点集合的序列(例如，AttP-AttB重组)。此外，载体可包含衍生自转座元件的序列。
任何编码uaMHC的核酸或包含所述核酸的载体可转移到合适的细胞系以产生uaMHC。在某些实施例中，核酸或载体稳定地整合到细胞系的基因组中。合适的细胞系可以是Vero(ATCC CRL 81)或CHO-K1(ATCC CRL 61)细胞、HeLa细胞和L细胞。可用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于COS细胞(括COS 7细胞)；293细胞(包括293-6E细胞)；CHO细胞，包括CHO-S和DG44细胞；PER.C6TM细胞(克鲁塞尔公司(Crucell))；和NSO细胞。
本文在某些实施例中描述的是一种组合物，其包含：多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)，所述多个抗原-主要组织相容性复合物中的每个抗原-MHC包含与MHC分子的结合槽相缔合的不是组织特异性抗原的遍在自身抗原；和具有1至100纳米直径的纳米颗粒核；其中所述抗原-MHC偶联到所述纳米颗粒核。
本文在某些实施例中描述的是治疗自身免疫性疾病或炎症性疾病的方法，所述方法包括给个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含：(a)多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)，所述多个抗原-主要组织相容性复合物中的每个抗原-MHC包含与MHC分子的结合槽相缔合的不是组织特异性抗原的遍在自身抗原；(b)和具有1至100纳米直径的纳米颗粒核；其中所述抗原-MHC偶联到所述纳米颗粒核。
本文在某些实施例中描述的是治疗多发性硬化症的方法，所述方法包括给个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含：(a)多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)，所述多个抗原-主要组织相容性复合物中的每个抗原-MHC包含与MHC分子的结合槽相缔合的不是多发性硬化症特异性抗原的遍在自身抗原；(b)和纳米颗粒核，所述纳米颗粒核具有1至100纳米的直径；其中所述抗原-MHC偶联到所述纳米颗粒核。
本文在某些实施例中描述的是治疗I型糖尿病的方法，所述方法包括给个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含：(a)多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)，所述多个抗原-主要组织相容性复合物中的每个抗原-MHC包含与MHC分子的结合槽相缔合的不是I型糖尿病特异性抗原的遍在自身抗原；和(b)纳米颗粒核，所述纳米颗粒核具有1至100纳米的直径；其中所述多个抗原-MHC偶联到所述纳米颗粒核。
遍在自身抗原
本文描述了可用于治疗自身免疫性疾病和炎症性障碍的纳米颗粒组合物和方法。所述纳米颗粒组合物包含与偶联到纳米颗粒的MHC相关的多个抗原。所述纳米颗粒组合物和方法利用广泛表达的遍在自身抗原来诱导调节性T和B淋巴细胞的产生。
在某些方面，与MHC分子相缔合的抗原是遍在自身抗原。遍在自身抗原与组织特异性抗原的区别至少在于它们是由多种不相关的不同细胞类型共同表达的抗原。在某些实施例中，遍在自身抗原是通常由个体发育不同的组织表达的抗原。在某些实施例中，遍在自身抗原，其是在衍生自组织的至少两种细胞类型中表达的遍在自身抗原，所述组织起源于由外胚层、中胚层和内胚层组成的列表。在某些实施例中，遍在自身抗原是通常由功能不同的组织表达的遍在自身抗原。在某些实施例中，遍在自身抗原是在选自以下列表的至少两种组织中表达的遍在自身抗原，该列表由以下组成：神经组织、内分泌组织、结缔组织、造血细胞、肝组织、心脏组织、皮肤组织、肺组织、血管组织、肠组织和胃组织。在某些实施例中，遍在自身抗原是在神经组织和肝组织中都表达的遍在自身抗原。在某些实施例中，遍在自身抗原是在神经组织和胰腺组织中都表达的遍在自身抗原。在某个实施例中，所述遍在自身抗原是衍生自参与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多细胞类型所共有的细胞过程的蛋白质的多肽。遍在自身抗原可能是两种或更多种密切相关的蛋白所共有的序列，所述蛋白被认为是同一家族中的旁系同源物或同系物，但在不同组织中表现出差异表达。在某些实施例中，所述两种或更多种密切相关的蛋白质可以例如在两种不同的不相关组织中执行相同或相似的功能。在某个实施例中，所述遍在自身抗原是衍生自参与细胞过程的蛋白质的多肽，其中所述细胞过程是选自糖酵解、氧化磷酸化、糖生成、核苷酸生物合成、β氧化和ω氧化的代谢过程。在某些实施例中，所述遍在自身抗原选自由以下组成的列表：丙酮酸脱氢酶复合物-E2组分(PDC-E2)、细胞色素P450 2D6(CYP2D6)、甲酰亚胺转移酶-环化脱氨酶(FTCD)、可溶性肝抗原(SLA)、肌动蛋白(ACTB)和髓过氧化物酶(MPO)。
遍在自身抗原通常由管家基因编码，所述基因被用于多种细胞类型。例如，肌动蛋白是细胞骨架蛋白，有助于细胞结构、运动、细胞分裂、和囊泡运动，并且是遍在表达的。因此，许多遍在自身抗原是细胞内的，并以稳定状态驻留在特定的细胞内区室中。抗原以稳态存在于细胞位置，在所述位置可以发现抗原的最高量，例如通过显微镜或细胞分级分离确定。例如，尽管事实上可以发现肌动蛋白在细胞外与外泌体相关，但绝大多数肌动蛋白存在于细胞的胞质溶胶中。同样，许多抗原可以运输通过不同的细胞器，但主要存在于单个细胞器中。例如，许多内质网(ER)驻留蛋白会短暂地运输通过顺式高尔基体，但立即返回到ER，在那里它们以稳态驻留。
在某些实施例中，与本文所述纳米颗粒组合物一起使用的遍在自身抗原是衍生自丙酮酸脱氢酶复合物-E2组分(PDC-E2)的多肽。在某些实施例中，衍生自PDC-E2的多肽是以下任何一种或多种：对于DRB3*0202，PDC-E2353-367、PDC-E272-86和PDC-E2422-436；对于DRB5*0101，PDC-E2353-367、PDC-E280-94和PDC-E2535-549；对于DRB4*0101，PDC-E2629-648、PDC-E2122-135和PDC-E2249-263；以及对于DRB1*0801，PDC-E2249-263。在某些实施例中，衍生自PDC-E2的多肽是以下任何一种或多种：PDC-E2422-436和PDC-E280-94。在某些实施例中，衍生自PDC-E2的多肽是以下任何一种或多种：SEQ ID NO:1至12。
在某些实施例中，与本文所述纳米颗粒组合物一起使用的遍在自身抗原是衍生自细胞色素P450 2D6(CYP2D6)的多肽。在某些实施例中，衍生自CYP2D6的多肽是以下任何一种或多种：CYP2D6284-298、CYP2D6289-303、CYP2D6318-332、CYP2D6313-332、CYP2D6393-412、CYP2D6192-206、CYP2D65-19、CYP2D6293-307(对于DRB1*0301)；CYP2D6219-233、CYP2D6237-251、CYP2D615-29(对于DRB3*0202)；CYP2D6235-249、CYP2D6317-331、CYP2D6293-307(对于DRB4*0101)；CYP2D6428-442、CYP2D6237-251、CYP2D614-28(对于DRB5*0101)；CYP2D6199-213、CYP2D6450-464、CYP2D6301-315(对于DRB1*0401)；CYP2D6452-466、CYP2D659-73、CYP2D6130-144、CYP2D6193-212、CYP2D6305-324、CYP2D615-29(对于DRB1*0701)。在某些实施例中，衍生自CYP2D6的多肽是以下任何一种或多种：SEQ ID NO:13至37。
在某些实施例中，与本文所述纳米颗粒组合物一起使用的遍在自身抗原是衍生自可溶性肝抗原(SLA)的多肽。在某些实施例中，衍生自SLA的多肽是以下任何一种或多种：SLA334-348、SLA196-210、SLA115-129、SLA373-386、SLA186-197(对于DRB1*0301)；SLA342-256、SLA110-124、SLA299-313(对于DRB3*0202)；SLA49-63、SLA260-274、SLA119-133(对于DRB4*0101)；SLA86-100、SLA26-40、SLA331-345(对于DRB5*0101)；SLA317-331、SLA171-185、SLA417-431(对于DRB1*0401)；SLA359-373、SLA215-229、SLA111-125(对于DRB1*0701)。在某些实施例中，衍生自SLA的多肽是以下任何一种或多种：SEQ ID NO:53至72。
在某些实施例中，与本文所述纳米颗粒组合物一起使用的遍在自身抗原是衍生自肌动蛋白(ACTB)的多肽。在某些实施例中，衍生自ACTB的多肽是以下任何一种或多种：ACTB202-216、ACTB170-184、ACTB245-259(对于DRB1*0301)；ACTB187-201、ACTB172-186、ACTB131-145(对于DRB3*0202)；ACTB131-145、ACTB171-185、ACTB129-143(对于DRB4*0101)；ACTB164-178、ACTB25-39、ACTB323-337(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，衍生自ACTB的多肽是以下任何一种或多种：ACTB146-160、ACTB18-32和ACTB171-185。在某些实施例中，衍生自ACTB的多肽是以下任何一种或多种：SEQ ID NO:38至52。
在某些实施例中，与本文所述纳米颗粒组合物一起使用的遍在自身抗原是衍生自甲酰亚胺转移酶-环化脱氨酶(FTCD)的多肽。在某些实施例中，衍生自FTCD的多肽是以下任何一种或多种：FTCD439-453、FTCD381-395、FTCD297-311(对于DRB3*0202)；FTCD525-539、FTCD218-232、FTCD495-509(对于DRB1*0301)；FTCD262-276、FTCD300-314、FTCD259-273(对于DRB4*0101)；FTCD490-504、FTCD389-403、FTCD295-309(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，衍生自FTCD的多肽是以下任何一种或多种：FTCD271-285、FTCD498-512,和FTCD301-315。在某些实施例中，衍生自FTCD的多肽是以下任何一种或多种：SEQ ID NO:73至87。
在某些实施例中，与本文所述纳米颗粒组合物一起使用的遍在自身抗原是衍生自髓过氧化物酶(MPO)的多肽。在某些实施例中，衍生自MPO的多肽是以下任何一种或多种：MPO322-336、MPO714-728、MPO617-631(对于DRB3*0202)；MPO504-518、MPO462-476、MPO617-631(对于DRB1*0301)；MPO444-458、MPO689-703、MPO248-262(对于DRB4*0101)；MPO511-525、MPO97-111、MPO616-630(对于DRB5*0101)。在某些实施例中，衍生自MPO的多肽是以下任何一种或多种：SEQ ID NO:88至99。
本公开的末尾表5列出了另外的遍在自身抗原。在某些实施例中，与本文所述纳米颗粒组合物一起使用的遍在自身抗原衍生自表5中列出的蛋白质或多肽。在某些实施例中，与本文所述纳米颗粒组合物一起使用的遍在自身抗原衍生自表5中列出的蛋白质或多肽的人同系物。在某些实施例中，同系物或人同系物是与表5中列出的蛋白质显示至少约75％、80％、85％、90％、95％或98％同一性的蛋白质或多肽。
组织特异性抗原
本文描述的纳米颗粒组合物和方法利用不是组织特异性抗原的遍在自身抗原。许多自身免疫性疾病或炎症性疾病与针对组织特异性抗原的免疫应答有关。这对生产治疗自身免疫性疾病或炎症性疾病的药物提出了问题，因为每种疾病都需要靶向该抗原的特定药物。另外，也可以使用非特异性免疫抑制剂，但这些抑制剂与明显的全身副作用有关。
组织特异性抗原通常由受自身免疫性疾病影响的组织或细胞类型表达，例如，多发性硬化症的主要病理后果是神经系统组织的脱髓鞘，因此，用于多发性硬化症的组织特异性抗原在很大程度上局限于神经系统(例如髓鞘碱性蛋白)。组织特异性抗原是那些与特定细胞或细胞类型相关的抗原。组织特异性抗原可执行特异性功能或有助于特异性组织结构。在某些实施例中，组织特异性抗原的表达限制于下列组织中的任何一种：神经、肾、心、肺、肝、小肠、结肠、胃、肌肉、结缔组织和血管。在某些实施例中，组织特异性抗原限于下列细胞类型中的任何一种的表达：β细胞、α细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、施万细胞、肾上腺皮质细胞。
许多组织特异性抗原可能在其他细胞或组织类型中以很低的水平表达，但表达的主要来源是一种特定的细胞或组织类型。例如，显示特定基因的细胞特异性或组织类型特异性表达的单个细胞或组织类型将在mRNA或蛋白质水平上以比任何其他不相关的细胞类型至少10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或更高地表达所述基因。此外，一些组织特异性抗原在致病条件下或通过外源性刺激获得细胞特异性抗原的异位表达。目的是仅仅因为不同的细胞类型在病理或外源性条件下获得异位表达，抗原的组织特异性不丢失。例如，胰岛素是由β细胞产生的组织特异性抗原，然而由于遗传的不稳定性，一些肿瘤(被称为胰岛素瘤)会表达胰岛素，在这些类型的情况下胰岛素仍然被认为是组织特异性的。
不是遍在自身抗原的组织特异性抗原主要是与特定组织特异性自身免疫性疾病或炎症性疾病相关的抗原。
在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是多发性硬化症。在某些实施例中，不是遍在自身抗原的组织特异性抗原是衍生自以下的多肽：髓磷脂碱性蛋白、髓磷脂相关糖蛋白、髓磷脂少突胶质细胞蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白、少突胶质细胞髓磷脂寡蛋白、髓磷脂相关的少突胶质细胞碱性蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、NOGO A、糖蛋白Po、外周髓磷脂蛋白22和/或2’3’-环核苷酸3'-磷酸二酯酶。
在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是I型糖尿病。在某些实施例中，不是遍在自身抗原的组织特异性抗原是衍生自前胰岛素原、胰岛素原、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶(IGRP)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛细胞自身抗原-2(ICA2)和/或胰岛素的多肽。
在某些实施例中，自身免疫性疾病或炎症性疾病是叶状天疱疮(PF)或寻常性天疱疮(PV)。在某些实施例中，不是遍在自身抗原的组织特异性抗原是衍生自桥粒芯糖蛋白3(DG3)和/或桥粒芯糖蛋白1(DG1)的多肽。
在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是视神经脊髓炎谱系障碍(NMO)。在某些实施例中，不是遍在自身抗原的组织特异性抗原是衍生自水通道蛋白4(AQP4)的多肽。
在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是关节炎。在某些实施例中，不是遍在自身抗原的组织特异性抗原是衍生自以下的多肽：热休克蛋白、免疫球蛋白结合蛋白、异质核RNP、膜联蛋白V、钙蛋白酶抑制素、II型胶原、葡萄糖-6-磷酸异构酶、伸长因子人软骨gp39、甘露糖结合凝集素、瓜氨酸波形蛋白、II型胶原、纤维蛋白原、α烯醇化酶、抗氨甲酰化蛋白(抗-CarP)、肽基精氨酸脱亚氨酶4型(PAD4)、BRAF、纤维蛋白原γ链、间α-胰蛋白酶抑制剂重链H1、α-1-抗胰蛋白酶、血浆蛋白酶C1抑制剂、凝溶胶蛋白、α1-B糖蛋白、铜蓝蛋白、间α-胰蛋白酶抑制剂重链H4、补体因子H、α2巨球蛋白、血清淀粉样蛋白、C-反应蛋白、血清白蛋白、纤维蛋白原β链、血清转移素(serotransferin)、α2HS糖蛋白、波形蛋白和/或补体C3
在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是过敏性哮喘。在某些实施例中，不是遍在自身抗原的组织特异性抗原是衍生自DERP1和/或DERP2的多肽。
在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是炎症性肠病。在某些实施例中，不是遍在自身抗原的组织特异性抗原是衍生自拟杆菌整合酶、鞭毛蛋白、鞭毛蛋白2(Fla-2/Fla-X)或未表征的大肠杆菌蛋白(YIDX)的多肽。
在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是系统性红斑狼疮疾病。在某些实施例中，不是遍在自身抗原的组织特异性抗原是多肽H4、H2B、H1'、dsDNA、RNP、Smith(Sm)、干燥综合征相关抗原A(SS-A)/Ro、干燥综合征相关抗原B(SS-B)/La和/或组蛋白。在一些实施例中，SS-A包括但不限于RO60和RO52。在一些实施例中，组蛋白包括但不限于H4、H2B、H1。
在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是动脉粥样硬化。在某些实施例中，不是遍在自身抗原的组织特异性抗原是衍生自载脂蛋白B(ApoB)和/或载脂蛋白E(ApoE)的多肽。
在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是慢性阻塞性肺疾病(COPD)。在某些实施例中，不是遍在自身抗原的组织特异性抗原是衍生自弹性蛋白的多肽。
在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是银屑病。在某些实施例中，不是遍在自身抗原的组织特异性抗原是衍生自人adamis样蛋白5(ATL5)、抗菌肽抗微生物肽(CAP18)和/或ADAMTS样蛋白5(ADMTSL5)的多肽。
在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是葡萄膜炎。在某些实施例中，不是遍在自身抗原的组织特异性抗原是衍生自抑制蛋白(arrestin)、人视网膜S-抗原和/或光感受器间类视黄醇结合蛋白(IRBP)的多肽。
在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是干燥综合征。在某些实施例中，不是遍在自身抗原的组织特异性抗原是衍生自(SS-A)/Ro、(SS-B)/La、RO60，RO52和/或毒蕈碱受体3(MR3)的多肽。
在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是硬皮病。在某些实施例中，不是遍在自身抗原的组织特异性抗原是衍生自着丝粒自身抗原着丝粒蛋白C(CENP-C)、DNA拓扑异构酶I(TOP1)和/或RNA聚合酶III的多肽。
在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是抗磷脂综合征。在某些实施例中，不是遍在自身抗原的组织特异性抗原是衍生自β-2-糖蛋白1(BG2P1或APOH)的多肽。
在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是僵人综合征。在某些实施例中，不是遍在自身抗原的组织特异性抗原是衍生自GAD65的多肽。
抗原-主要组织相容性复合物(MHC)
本公开的纳米颗粒复合物包括偶联到遍在自身抗原-MHC的具有或不具有层和/或包衣的纳米颗粒核。一个或多个单个MHC多肽和抗原(例如，多肽)组分通过共价或非共价结合(例如通过氢键、离子键或疏水键)形成复合物。这种复合物的制备可能需要不同程度的操作，并且这些方法在文献中是众所周知的。在一些方面，抗原组分可以通过例如混合MHC和抗原组分而与MHC组分的口袋部分非共价结合；这依赖于MHC和抗原之间的天然结合亲和力。或者，在一些方面，MHC组分可以使用标准方法与抗原组分共价结合，所述标准方法例如但不限于引入已知偶联剂或光亲和标记(参见例如，Hall等人,Biochemistry[生物化学]24:5702-5711(1985))。在某些方面，抗原性组分可经由肽连接或文献中讨论的其他方法(包括但不限于经由糖蛋白上的碳水化合物基团(包括例如α-和/或β-链的碳水化合物部分)附接)可操作地偶联到MHC组分。在特定的实施例中，抗原组分可以附接到适当的MHC分子的N-末端或C-末端。可替代地，在某些实施例中，MHC复合物可以通过将抗原组分的序列并入编码MHC的序列而重组形成，使得两者都保留其功能特性。
多个遍在自身抗原-MHC可以偶联到同一个纳米颗粒核；这些复合物、MHC和/或抗原可以彼此相同或不同。
主要组织相容性分子
本文所述的遍在自身抗原与MHC分子相缔合(形成遍在自身抗原-MHC)，并与纳米颗粒偶联。抗原与MHC分子的结合沟结合。MHC分子主要结合作为多肽的抗原，但是多肽可以包含修饰，例如脂化、糖基化、磷酸化等。MHC分子可以是MHC I类分子(MHCI)或MHC II类分子(MHCII)。MHCⅠ类分子在其结合槽中结合8-10个氨基酸残基的多肽，因为结合槽在任一侧是封闭的。MHC II类分子，包括本文所述的分子，结合长度至少为8个氨基酸残基的多肽，但是可以结合更长的肽(长度为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19个氨基酸残基或更长)，因为结合槽在任一侧是开放的。
对于与人个体一起使用，本文所用的MHC分子是人(也称为人白细胞抗原，缩写为“HLA”)。在某些实施例中，MHC I类分子是经典或非经典MHC I类分子HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、CD1d，或其片段或生物等价物。在某些实施例中，MHC II类分子是HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQB1或HLA-DPB1，或其片段或生物等价物。在一些实施例中，抗原-MHC(pMHC)可以是单链构建体。在一些实施例中，pMHC可以是双链构建体。在II类MHC的情况下，HLA的β链一般将与适当的α链非共价结合，形成双链异二聚体，其中α链与β链配对。通常，MHC II类的α链表现出低得多的多态性程度，例如DRα链。
由于MHC II类复合物是包含α链和β链的异二聚体，所述异二聚体在某些条件下可能存在形成问题，或者在某些情况下本身就不稳定。当MHC II类分子部署在本文的方法或组合物中时，MHC分子可进一步包含杵臼结构。通常，所述α或β链融合到已经被修饰为包含突起的抗体CH2和CH3结构域，而所述异二聚体的相应的其他α或β链融合到已经被修饰为包含腔的抗体CH2和CH3结构域。
如本文所用，“杵臼(knob-in-hole)”或“臼杵(knob-into-hole)”是指需要在第一多肽的界面处有突起(或“杵”)并且在第二多肽的界面处有相应的腔(或“臼”)的多肽基架构，使得所述突起可以定位在所述腔中以促进异二聚体的形成。突起可以通过用较大的侧链(例如，苯丙氨酸或酪氨酸)替换来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链来构建。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换较大的氨基酸侧链，可以在第二多肽的界面中产生与突起相同或相似大小的空腔。突起和空腔可以通过合成方法制造，例如通过改变编码多肽的核酸或通过肽合成，使用本领域技术人员的常规方法。在一些实施例中，第一多肽的界面位于第一多肽中的Fc结构域上；第二多肽的界面位于第二多肽上的Fc结构域上。杵臼异二聚体及其制备和使用方法公开在以下中：美国专利号5,731,168；5,807,706；5,821,333；7,642,228；7,695,936；8,216,805；和8,679,785；和Merchant等人,NatureBiotechnology[自然生物技术],1998,16:677-681，所有这些文献以其全部内容通过引用并入本文。
可替代地或另外地，本文所述的任何抗原可包含与MHC II类α或β链的半胱氨酸残基(工程改造的或天然的)相互作用的半胱氨酸残基。这就是通常所说的半胱氨酸阱。
半胱氨酸阱可用于稳定本文所述的异二聚体。半胱氨酸捕获涉及从未结合的多肽伴侣形成共价连接的多肽复合物。在一些实施例中，半胱氨酸捕获包括在多肽伴侣的相互作用界面内的策略性选择的位置处引入半胱氨酸以形成稳定的多肽复合物。在一些实施例中，半胱氨酸捕获可稳定多肽复合物以有利于特定构象并防止解离。半胱氨酸捕获又称二硫键捕获和二硫键交联。半胱氨酸捕获的方法和应用的实例在Kufareva,等人,MethodsEnzymol.[酶学方法]570:389-420(2016)中综述。在MHC的背景下，半胱氨酸被工程改造为已知或怀疑与MHC II类二聚体的结合槽相缔合的多肽。然后在结合槽中或附近工程改造半胱氨酸，使得当多肽与结合槽缔合时，结合槽半胱氨酸可以接近并与多肽半胱氨酸形成二硫键。
在一个方面，本文提供了分离的异二聚体，所述异二聚体包含至少一个第一多肽和至少一个第二多肽，其中所述第一多肽和所述第二多肽在界面处相遇，其中所述第一多肽的界面包含可定位在所述第二多肽的界面中的工程改造的腔中的工程改造的突起；和(i)所述第一多肽包含MHC II类α1结构域，MHC II类α2结构域或其组合；并且所述第二多肽包含MHC II类β1结构域，MHC II类β2结构域或其组合；或(ii)所述第一多肽包含MHC II类β1结构域，MHC II类β2结构域或其组合；并且所述第二多肽包含MHC II类α1结构域，MHC II类α2结构域或其组合。所述第一多肽、所述第二多肽或两者可包含与所述多肽融合的抗体CH3结构域。任选地，所述第一多肽、所述第二多肽或两者包含位于MHC(α或β链)和CH3结构域之间的抗体CH2结构域。在某些实施例中，所述第一多肽包含抗体CH3结构域，并且所述抗体CH3结构域包含选自以下列表的至少一个突变，该列表由以下组成：S354C、T366W以及S354C和T366W两者(EU编号)。在某些实施例中，所述第二多肽包含抗体CH3结构域，并且所述抗体CH3结构域包含选自以下列表的至少一个突变，该列表由以下组成：Y349C、T366S、L368A、Y407V(EU编号)及其组合。在进一步的实施例中，分离的异二聚体包含任选地与所述第一或所述第二多肽共价结合的遍在自身抗原。任选地，所述遍在自身抗原包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基与所述第一或第二多肽中的半胱氨酸残基相互作用以产生半胱氨酸阱。
在一个方面，所述异二聚体的一个多肽包含MHC II类α1结构域，MHC II类α2结构域或其组合；和至少一个工程改造的突起。在一些实施例中，所述至少一个工程改造的突起不位于MHC II类α1结构域或MHC II类α2结构域处。在一些实施例中，所述工程改造的突起位于与多肽融合的抗体CH3结构域处。在一些实施例中，所述多肽任选地包含位于MHC II类α2结构域和具有工程改造的突起的CH3结构域之间的抗体CH2结构域。在某些实施例中，所述多肽包含抗体CH3结构域，并且所述抗体CH3结构域包含选自以下列表的至少一个突变，该列表由以下组成：S354C、T366W以及S354C和T366W两者(EU编号)。在另外的实施例中，所述多肽包含遍在自身抗原。任选地，所述遍在自身抗原包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基与MHCα1或β1结构域中的半胱氨酸残基相互作用以产生半胱氨酸阱。
在一个方面，所述异二聚体的一个多肽包含MHC II类β1结构域，MHC II类β2结构域或其组合；和至少一个工程改造的突起。在一些实施例中，所述至少一个工程改造的突起不位于MHC II类β1结构域或MHC II类β2结构域处。在一些实施例中，所述工程改造的突起位于与多肽融合的抗体CH3结构域处。在一些实施例中，所述多肽任选地包含位于MHC II类β2结构域和具有工程改造的突起的CH3结构域之间的抗体CH2结构域。在某些实施例中，所述多肽包含抗体CH3结构域，并且所述抗体CH3结构域包含选自以下列表的至少一个突变，该列表由以下组成：S354C、T366W以及S354C和T366W两者(EU编号)。在另外的实施例中，所述多肽包含遍在自身抗原。任选地，所述遍在自身抗原包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基与MHCα1或β1结构域中的半胱氨酸残基相互作用以产生半胱氨酸阱。
在一个方面，所述异二聚体的一个多肽包含MHC II类α1结构域，MHC II类α2结构域或其组合；和至少一个工程改造的腔。在一些实施例中，所述至少一个工程改造的腔不位于MHC II类α1结构域或MHC II类α2结构域处。在一些实施例中，所述工程改造的腔位于与多肽融合的抗体CH3结构域处。在一些实施例中，所述多肽任选地包含位于MHC II类α2结构域和具有工程改造的腔的CH3结构域之间的抗体CH2结构域。在某些实施例中，所述多肽包含抗体CH3结构域，并且所述抗体CH3结构域包含选自以下列表的至少一个突变，该列表由以下组成：Y349C、T366S、L368A、Y407V(EU编号)及其组合。在另外的实施例中，所述多肽包含遍在自身抗原。任选地，所述遍在自身抗原包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基与MHCα1或β1结构域中的半胱氨酸残基相互作用以产生半胱氨酸阱。
在一个方面，所述异二聚体的一个多肽包含MHC II类β1结构域，MHC II类β2结构域或其组合；和至少一个工程改造的腔。在一些实施例中，所述至少一个工程改造的腔不位于MHC II类β1结构域或MHC II类β2结构域处。在一些实施例中，所述工程改造的腔位于与多肽融合的抗体CH3结构域处。在一些实施例中，所述多肽任选地包含位于MHC II类β2结构域和具有工程改造的腔的CH3结构域之间的抗体CH2结构域。在某些实施例中，所述多肽包含抗体CH3结构域，并且所述抗体CH3结构域包含选自以下列表的至少一个突变，该列表由以下组成：Y349C、T366S、L368A、Y407V(EU编号)及其组合。在另外的实施例中，所述多肽包含遍在自身抗原。任选地，所述遍在自身抗原包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基与MHCα1或β1结构域中的半胱氨酸残基相互作用以产生半胱氨酸阱。
图20A和B显示了包括工程改造的腔和工程改造的突起的工程改造的uaMHC的非限制性实施例。图20A显示了融合到免疫球蛋白CH2和CH3结构域的人MHC II类α链，SEQ IDNO:103。所述CH3结构域包含通过取代两个氨基酸S354C和T366W而产生的工程改造的杵。所述α链包含任选的c-末端半胱氨酸，以允许与官能化的接头缀合，然而该c-末端半胱氨酸可以替代地包含在β链上。图20B显示了融合到免疫球蛋白CH2和CH3结构域的人MHC II类β链，SEQ ID NO:104。所述CH3结构域包含通过取代四个氨基酸Y349C、T366S、L368A和Y407V而产生的工程改造的臼。所述β链还包含通过肽接头共价偶联到所述β链的遍在自身抗原(PDC-E2122-135)。突起-腔的相互作用有利于组装，并允许使用用于纯化免疫球蛋白的标准技术来纯化完整的uaMHC异二聚体。一旦纯化，uaMHC可以通过官能化的接头分子(例如官能化的PEG分子)偶联到合适的纳米颗粒。在某些实施例中，MHC异二聚体的α链包含与SEQ ID NO:103至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施例中，MHC异二聚体的β链包含与SEQ ID NO:104至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施例中，MHC异二聚体包含与SEQ ID NO:103至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的α链；和与SEQ ID NO:104至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的β链。在某些实施例中，所述α链和所述β链与SEQ ID NO:103或104至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同，并且SEQ ID NO:103的CH2和CH3结构域的任何一个或多个、SEQ ID NO:103的CH2和CH3结构域和/或所述遍在自身抗原中与SEQ ID NO:104中公开的相同。在某些实施例中，所述α链和所述β链与SEQ ID NO:103或104至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同，并且所述遍在自身抗原与SEQ ID NO:104中公开的相同。本领域技术人员将认识到，人MHC的α链和β链是高度多态的，因此可以耐受相对高度的可变性。本领域技术人员还将能够用SEQ ID NO:102和104中所示的MHC的α链和β链取代不同的HLA等位基因，以及取代能够结合特定的取代的等位基因的适当遍在自身抗原。这种HLA等位基因和遍在自身抗原配对在本申请的其他地方公开，例如在本申请末尾的序列列表中公开。
纳米颗粒
遍在自身抗原MHC偶联到纳米颗粒核上(uaMHC-NP)。纳米颗粒可以由多种材料制成。在某些实施例中，纳米颗粒是非脂质体和/或具有固体核。在某些实施例中，固体核可以是金属或金属氧化物。在某些实施例中，固体核可以是铁、氧化铁或金。固体核可以是高密度核，使得密度大于约2.0g/cm3、约3.0g/cm3、约4.0g/cm3、约5.0g/cm3、约6.0g/cm3或约7.0g/cm3。在某些实施例中，固体核的密度在约4.0g/cm3和约8.0g/cm3之间。在某些实施例中，固体核的密度在约5.0g/cm3和约8.0g/cm3之间。在某些实施例中，固体核的密度在约5.0g/cm3和约7.0g/cm3之间。在某些实施例中，固体核的密度在约5.0g/cm3和约6.0g/cm3之间。
所述uaMHC-NP的纳米颗粒核包含以下，或基本上由以下组成或再进一步由以下组成：例如固体核、金属核、树状大分子核、聚合物胶束纳米颗粒核、纳米棒、富勒烯、纳米壳、核壳、基于蛋白质的纳米结构或基于脂质的纳米结构。在一些方面，所述纳米颗粒核是可生物吸收和/或可生物降解的。在一些方面，所述纳米颗粒核是树状大分子纳米颗粒核，其包含以下，或可替代地基本上由以下组成或再进一步由以下组成：具有从核生长的树状结构的高度支化的大分子。在其他方面，所述树状大分子纳米颗粒核可以包含以下，或可替代地基本上由以下组成或再进一步由以下组成：基于聚(酰胺胺)的树状大分子或基于聚-L-赖氨酸的树状大分子。在某些方面，所述纳米颗粒核是聚合物胶束核，所述聚合物胶束核包含以下，或可替代地基本上由以下组成或再进一步由以下组成：组装成纳米尺度核-壳结构的两亲性嵌段共聚物。在另外的方面中，所述聚合物胶束核包含以下，或可替代地基本上由以下组成或再进一步由以下组成：使用聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺嵌段共聚物产生的聚合物胶束。在另一个方面中，所述纳米颗粒核包含以下，或可替代地基本上由以下组成或再进一步由以下组成：金属。在另一方面，所述纳米颗粒核不是脂质体。核材料的另外实例包括但不限于标准和特种玻璃、二氧化硅、聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸酯、丙烯酸聚合物、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈、聚酰胺、含氟聚合物、硅酮、纤维素、硅、金属(例如铁、金、银)、矿物(例如红宝石)、纳米颗粒(例如金纳米颗粒、胶体颗粒、金属氧化物、金属硫化物、金属硒化物和磁性材料例如氧化铁)及其复合物。在一些实施例中，氧化铁纳米颗粒核包含氧化铁(II，III)。所述核可以是均一的组成，或者是两类或更多类材料的复合物，这取决于所需的特性。在某些方面，金属纳米颗粒将被使用。这些金属颗粒或纳米颗粒可以由Au、Pt、Pd、Cu、Ag、Co、Fe、Ni、Mn、Sm、Nd、Pr、Gd、Ti、Zr、Si和In，前体，它们的二元合金，它们的三元合金和它们的金属间化合物形成。参见美国专利号6,712,997，其通过引用结合于此以用于此公开。在某些实施例中，如果纳米颗粒是生物相容的和生物可吸收的，则核和层(下文描述)的组成可以变化。所述核可以是均一的组成，或者是两类或更多类材料的复合物，这取决于所需的特性。在某些方面，将使用金属纳米球。这些金属纳米颗粒可以由Fe、Ca、Ga等形成。在某些实施例中，所述纳米颗粒包含以下，或可替代地基本上由以下组成或再进一步由以下组成：包含金属或金属氧化物如金或铁氧化物的核。
在另一方面，本文提供了包含至少一个本文所述的遍在自身抗原-MHC和纳米颗粒的uaMHC-NP，其中所述纳米颗粒是非脂质体并具有氧化铁核。
在另一方面，本文提供了包含至少一种本文所述的遍在自身抗原-MHC和纳米颗粒的uaMHC-NP，其中所述纳米颗粒是非脂质体并具有金核。
在另一个方面，本文提供uaMHC-NP，所述uaMHC-NP包含至少一种本文的遍在自身抗原-MHC和纳米颗粒，其中所述纳米颗粒是非脂质体并且具有氧化铁核；并且所述至少一种遍在自身抗原-MHC通过接头共价连接到所述纳米颗粒。
在一些方面，所述纳米颗粒核具有选自下组的直径：约1nm至约100nm；约1nm至约75nm；约1nm至约50nm；约1nm至约25nm；约5nm至约100nm；约5nm至约50nm；约5nm至约40nm；约5nm至约30nm；约5nm至约25nm；或约5nm至约20nm。在一些实施例中，所述纳米颗粒核具有以下直径：约10nm至约100nm；约10nm至约50nm；约10nm至约40nm；约10nm至约30nm；约10nm至约25nm；或约10nm至约20nm。在某些实施例中，所述纳米颗粒核具有大于约1nm、2nm、5nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、40nm或50nm的直径。在某些实施例中，所述纳米颗粒核具有小于约100nm、75nm、50nm、40nm、30nm、20nm或15nm的直径。
在一些方面，所述纳米颗粒核是树状大分子纳米颗粒核，其包含以下，或可替代地基本上由以下组成或再进一步由以下组成：具有从核生长的树状结构的高度支化的大分子。在其他方面，所述树状大分子纳米颗粒可以包含以下，或可替代地基本上由以下组成或再进一步由以下组成：基于聚(酰胺胺)的树状大分子或基于聚-L-赖氨酸的树状大分子。在某些方面，所述纳米颗粒核是聚合物胶束核，所述聚合物胶束核包含以下，或可替代地基本上由以下组成或再进一步由以下组成：组装成纳米尺度核-壳结构的两亲性嵌段共聚物。在另外的方面中，所述聚合物胶束核可以包含以下，或可替代地基本上由以下组成或再进一步由以下组成：使用聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺嵌段共聚物产生的聚合物胶束。所述树状大分子核或聚合物胶束核可进一步包含本文所述的外包衣或层。
在某些实施例中，合成树状大分子纳米颗粒或具有树状大分子纳米颗粒核的纳米颗粒的特定方法可能需要将金属离子提取到树状大分子的内部，然后随后进行化学还原以产生具有小于3nm的尺寸的几乎尺寸单分散的颗粒，例如Crooks等人,“Synthesis,Characterization,and Applications of Dendrimer-Encapsulated Nanoparticles[树状大分子包裹的纳米颗粒的合成、表征和应用]”。The Journal of Physical Chemistry[物理化学学报]B(109):692-704(2005)中公开的方法，其中所得树状大分子核组分不仅用作制备纳米颗粒的模板，而且还用于稳定纳米颗粒，使得调节溶解度成为可能，并且提供了将纳米颗粒固定在固体载体上的方法。
所述纳米颗粒核典型地由基本上球形的核和任选的一个或多个层或包衣组成。如本文所述，核可以在尺寸和组成上变化。除了所述核之外，所述颗粒可以具有一个或多个层以提供适合于目的应用的官能度。层的厚度(如果存在的话)可以根据具体应用的需要而变化。例如，层可以赋予有用的光学特性。
层还可以赋予化学或生物官能度，这里称为化学活性层或生物活性层。这些层通常应用在所述颗粒的外表面上，并且可以赋予pMHC-NP官能度。一个或多个层的厚度通常可在约0.001微米(1纳米)至约10微米或更大(取决于所需的颗粒直径)或约1nm至5nm、约1nm至约10nm、约1nm至约40nm、约15nm至约25nm、或约20nm的范围内，以及之间的范围。
所述层或包衣可以包含以下，或可替代地基本上由以下组成或再进一步由以下组成：生物可降解糖或其他聚合物。生物可降解层的实例包括但不限于葡聚糖；聚(乙二醇)；聚(环氧乙烷)；甘露醇；基于聚乳酸(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚己内酯(PCL)的聚(酯)；PHB-PHV类聚(羟基链烷酸酯)；以及其他改性的聚(糖)，例如淀粉、纤维素和壳聚糖。此外，所述纳米颗粒可包括具有用于附着用于化学结合或偶联位点的化学官能度的合适表面的层。
抗原MHC的表面化合价和密度
本文所述的遍在自身抗原-MHC以特定化合价偶联到纳米颗粒上。化合价是pMHC数量/纳米颗粒核。在某些实施例中，纳米颗粒的化合价范围可以在约1个pMHC/纳米颗粒核到约6,000个pMHC/纳米颗粒核之间。在某些实施例中，纳米颗粒的化合价范围可以在约10个pMHC/纳米颗粒核到约6,000个pMHC/纳米颗粒核之间。在某些实施例中，纳米颗粒的化合价范围可以在约50个pMHC/纳米颗粒核到约6,000个pMHC/纳米颗粒核之间。在某些实施例中，纳米颗粒的化合价范围可以在约1个pMHC/纳米颗粒核到约5000、约4000、约3000、约2000或约1000个pMHC/纳米颗粒核之间。在某些实施例中，纳米颗粒的化合价范围可以在约10个pMHC/纳米颗粒核至约5000、约4000、约3000、约2000或约1000个pMHC/纳米颗粒核之间。在某些实施例中，纳米颗粒的化合价范围可以在约50个pMHC/纳米颗粒核到约5000、约4000、约3000、约2000或约1000个pMHC/纳米颗粒核之间。在某些实施例中，纳米颗粒的化合价范围可以在约1个pMHC/纳米颗粒核至约1000个pMHC/纳米颗粒核之间，或在约10:1至约1000:1之间，或在约11:1至约1000:1之间，或在约12:1至约1000:1之间。在某些实施例中，化合价(抗原-MHC比纳米颗粒核)范围可以在约10:1至约500:1之间，或在约11:1至约500:1之间，或在约12:1至约500:1之间。在某些实施例中，化合价(抗原-MHC比纳米颗粒核)范围可以在约10:1至约200:1之间，或在约11:1至约200:1之间，或在约12:1至约200:1之间。在某些实施例中，化合价(抗原-MHC比纳米颗粒核)范围可以在约10:1至约150:1之间，或在约11:1至约150:1之间，或在约12:1至约150:1之间。在某些实施例中，化合价(抗原-MHC比纳米颗粒核)范围可以在约10:1至约100:1之间，或在约11:1至约100:1之间，或在约12:1至约100:1之间。在某些实施例中，化合价(抗原-MHC比纳米颗粒核)范围可以在约10:1至约200:1之间，约20:1至约200:1之间，约30:1至约200:1之间，约40:1至约200:1之间，或约50:1至约200:1之间。在某些实施例中，化合价(抗原-MHC比纳米颗粒核)范围可以在约10:1至约150:1之间，约20:1至约150:1之间，约30:1至约200:1之间，约40:1至约150:1之间，或约50:1至约150:1之间。在某些实施例中，化合价(抗原-MHC比纳米颗粒核)范围可以在约10:1至约100:1之间，约20:1至约100:1之间，约30:1至约100:1之间，约40:1至约100:1之间，或约50:1至约100:1之间。
在一些方面，所述纳米颗粒核具有限定化合价/核表面积的，在此也称为“密度”。在这些方面中，pMHC密度/纳米颗粒是约0.025pMHC/100nm2纳米颗粒核表面积至约100pMHC/100nm2纳米颗粒核表面积，或者可替代地是约0.406pMHC/100nm2至约50pMHC/100nm2；或者可替代地从约0.05pMHC/100nm2至约25pMHC/100nm2。在一些方面，pMHC密度/纳米颗粒是从约0.4pMHC/100nm2至约25pMHC/100nm2、或从约0.4pMHC/100nm2至约20pMHC/100nm2、或从约0.4pMHC/100nm2至约15pMHC/100nm2、或从约0.4pMHC/100nm2至约14pMHC/100nm2、或从约0.4pMHC/100nm2至约13pMHC/100nm2、或从约0.4pMHC/100nm2至约12pMHC/100nm2、或从约0.4pMHC/100nm2至约11.6pMHC/100nm2、或从约0.4pMHC/100nm2至约11.5pMHC/100nm2、或从约0.4pMHC/100nm2至约11pMHC/100nm2、或从约0.4pMHC/100nm2至约10pMHC/100nm2、或从约0.4pMHC/100nm2至约9pMHC/100nm2、或从约0.4pMHC/100nm2至约8pMHC/100nm2、或从约0.4pMHC/100nm2至约7pMHC/100nm2、或从约0.4pMHC/100nm2至约6pMHC/100nm2、或从约0.4pMHC/100nm2至约5pMHC/100nm2、或从约0.4pMHC/100nm2至约4pMHC/100nm2、或从约0.4pMHC/100nm2至约3pMHC/100nm2、或从约0.4pMHC/100nm2至约2.5pMHC/100nm2、或从约0.4pMHC/100nm2至约2pMHC/100nm2、或从约0.4pMHC/100nm2至约1.5pMHC/100nm2。
在另一方面，纳米颗粒可以具有以下pMHC密度：从约0.22pMHC/100nm2至约10pMHC/100nm2、或从约0.22pMHC/100nm2至约9pMHC/100nm2、或从约0.22pMHC/100nm2至约8pMHC/100nm2、或从约0.22pMHC/100nm2至约7pMHC/100nm2、或从约0.22pMHC/100nm2至约6pMHC/100nm2、或从约0.22pMHC/100nm2至约5pMHC/100nm2、或从约0.22pMHC/100nm2至约4pMHC/100nm2、或从约0.22pMHC/100nm2至约3pMHC/100nm2、或从约0.22pMHC/100nm2至约2pMHC/100nm2、或从约0.22pMHC/100nm2至约1.5pMHC/100nm2。在一些方面，纳米颗粒可以具有以下pMHC密度：从约0.22pMHC/100nm2至约10pMHC/100nm2、或0.24pMHC/100nm2至约9pMHC/100nm2、或从约0.26pMHC/100nm2至约8pMHC/100nm2、或从约0.28pMHC/100nm2至约7pMHC/100nm2、或从约0.24pMHC/100nm2至约4pMHC/100nm2、或从约0.5pMHC/100nm2至约3pMHC/100nm2、或从约0.6pMHC/100nm2至约1.5pMHC/100nm2。在另一方面，纳米颗粒可以具有以下pMHC密度：从约0.4pMHC/100nm2至约1.3pMHC/100nm2、或可替代地从约0.5pMHC/100nm2至约0.9pMHC/100nm2、或可替代地从约0.6pMHC/100nm2至约0.8pMHC/100nm2。
接头
在某些方面，遍在自身抗原-MHC可以通过共价键、非共价键或交联和任选地通过接头偶联中的一种或多种与纳米颗粒核偶联。在涉及一个或多个接头的方面中，接头在单个纳米颗粒核上可以彼此相同或不同。在一些实施例中，所述遍在自身抗原-MHC包含至少一种本文所述的遍在自身抗原-MHC和纳米颗粒，其中所述纳米颗粒是非脂质体并且具有金属或金属氧化物核；并且所述至少一种遍在自身抗原-MHC通过包含分子量小于5千道尔顿(kD)的聚乙二醇的接头共价连接到所述纳米颗粒。在一些实施例中，聚乙二醇具有小于1kD、2kD、3kD、4kD、5kD、6kD、7kD、8kD、9kD、或10kD的分子量。在一些实施例中，聚乙二醇用马来酰亚胺官能化。在一些实施例中，聚乙二醇具有约1kD至约5kD、约2kD至约5kD、约3kD至约5kD的分子量。在一些实施例中，聚乙二醇用马来酰亚胺官能化。在某些实施例中，接头与固体核接触的端部嵌入固体核中。在其他方面，接头的尺寸可以小于5kD，并且任选地是聚乙二醇。接头可以是表1中描述的任何接头。
Figure BDA0002601207220000481
为了将遍在自身抗原-MHC的基底或颗粒偶联到纳米颗粒，可以应用以下技术。
所述结合可以通过化学修饰所述基底或颗粒来产生，所述化学修饰通常涉及在表面上产生“官能团”，所述官能团能够结合到MHC复合物，和/或将所述表面或颗粒的任选化学修饰的表面与共价或非共价结合的所谓“连接分子”连接，随后使所述MHC或MHC复合物与所获得的颗粒反应。
官能团或带有它们的连接分子可选自氨基、碳酸基、硫醇、硫醚、二硫化物、胍基、羟基、胺基、邻二醇、醛、α-卤代乙酰基、汞有机基、酯基、酸卤化物、酸硫酯、酸酐、异氰酸酯、异硫氰酸酯、磺酸卤化物、亚胺酯、重氮乙酸酯、重氮盐、1,2-二酮、磷酸、磷酸酯、磺酸、偶氮内酯(azolides)、咪唑、吲哚、N-马来酰亚胺、α-β-不饱和羰基化合物、芳基卤化物或它们的衍生物。
具有较高分子量的其他连接分子的非限制性实例是核酸分子、聚合物、共聚物、可聚合偶联剂、二氧化硅、蛋白质和具有相对于所述基底或颗粒具有相反极性的表面的链状分子。核酸可以提供与亲和分子的连接，所述亲和分子自身包含核酸分子，尽管相对于连接分子有互补的序列。
在一些实施例中，连接分子包含聚乙二醇。在一些实施例中，连接分子包含聚乙二醇和马来酰亚胺。在一些实施例中，聚乙二醇包含C1-C3烷氧基、-R10NHC(O)R-、-R10C(O)NHR-、-R10OC(O)R-、-R10C(O)OR-中的一个或多个，其中每个R独立地是H或C1-C6烷基，并且其中每个R10独立地是键或C1-C6烷基。
pMHC可以通过多种方法偶联到纳米颗粒，一个非限制性实例包括与用带有远端-NH2或-COOH基团的PEG接头产生的至NP的缀合，其可以通过在1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)存在下形成酰胺键来实现。首先将带有-COOH基团的NP溶解在pH5.5的20mM MES缓冲液中。向NP溶液中添加N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(磺胺-NHS(sulpha-NHS)，赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)，沃尔瑟姆(Waltham)，马塞诸塞州，终浓度10mM)和EDC(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)，沃尔瑟姆，马塞诸塞州，终浓度1mM)。在室温下搅拌20分钟后，将NP溶液滴加到溶于20mM硼酸盐缓冲液(pH 8.2)中的含有pMHC单体的溶液中。将混合物再搅拌4小时。为了将MHC与NH2-官能化的NP偶联，首先将pMHC溶解在20mM MES缓冲液(pH 5.5，含100mM NaCl)中。然后向MHC溶液中添加磺胺-NHS(10mM)和EDC(5mM)。然后将活化的MHC分子添加到20mM硼酸盐缓冲液(pH 8.2)中的NP溶液中，并在室温下搅拌4小时。
为了将MHC与马来酰亚胺官能化的NP缀合，首先将pMHC与三丁基膦(TBP，1mM)在室温下孵育4小时，然后将工程改造以编码游离羧基端Cys残基的pMHC与NP在40mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0，含2mM EDTA，150mM NaCl)中混合，并在室温下孵育过夜。pMHC中的MHC通过在马来酰亚胺基团和Cys残基之间形成碳硫键与NP共价结合。
点击化学可用于将pMHC或亲和素与用叠氮化物基团官能化的NP偶联。对于该反应，MHC或亲和素分子首先与二苯并环辛基(DBCO，点击化学工具公司(Click ChemistryTools)，斯科茨代尔(Scottsdale)，亚利桑那州)试剂在室温下孵育2小时。游离DBCO分子可通过透析过夜去除。然后将MHC-或亲和素-DBCO缀合物与SFP-Z孵育2小时，导致pMHC或亲和素分子与NP之间形成三唑键。
不同MHC-NP偶联反应中的未偶联的pMHC可以使用本领域已知的方法通过广泛透析去除。非限制性实例是在4℃下用PBS(pH 7.4)进行透析通过300kD分子量截断值膜(光谱实验室(Spectrum labs))。另外，pMHC缀合的IONP可以通过磁分离来纯化。通过AmiconUltra-15单位(100kD MWCO)超滤浓缩缀合的NP并储存在PBS中。
颗粒的表面可以进行化学修饰，例如通过具有官能性反应基团的膦酸衍生物的结合。这些膦酸或膦酸酯衍生物的一个实例是可根据“Mannich-Moedritzer”反应合成的亚氨基-双(亚甲基膦)碳酸。该结合反应可以用直接从制备方法获得的或在预处理(例如用三甲基甲硅烷基溴预处理)之后获得的基底或颗粒进行。在第一种情况下，磷酸(酯)衍生物可以例如置换反应介质中仍结合在表面上的组分。这种置换可以在较高的温度下得到增强。另一方面，三甲基甲硅烷基溴被认为可以使含烷基的基于磷的络合剂脱烷基，从而为膦酸(酯)衍生物创造新的结合位点。膦酸(酯)衍生物或与其结合的连接分子可以显示与上述给出相同的官能团。基底或颗粒的表面处理的另一个实例涉及在二醇如乙二醇中加热。应当注意，如果合成已经在二醇中进行，则该处理可能是多余的。在这些情况下，直接得到的合成产物很可能显示出必要的官能团。然而，该处理适用于在含N或P的络合剂中产生的基底或颗粒。如果用乙二醇对这样的基底或颗粒进行后处理，则仍与表面结合的反应介质(例如络合剂)的成分可被二醇替代和/或可被脱烷基。
还可以用具有第二官能团的伯胺衍生物替代仍结合到颗粒表面的含N络合剂。基底或颗粒的表面也可以包被二氧化硅。二氧化硅允许有机分子相对简单的化学缀合，因为二氧化硅容易与有机接头，如三乙氧基硅烷或氯硅烷反应。颗粒表面也可以由均聚物或共聚物包被。可聚合偶联剂的实例为：N-(3-氨基丙基)-3-巯基苯甲脒、3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基酰肼和3-三甲氧基甲硅烷基)丙基马来酰亚胺。本文提及可聚合偶联剂的其他非限制性实例。这些偶联剂可以单独使用，也可以组合使用，这取决于作为包衣的要生成的共聚物的类型。
可与含有氧化过渡金属化合物的基底或颗粒一起使用的另一种表面修饰技术是通过氯气或有机氯化剂将氧化过渡金属化合物转化为相应的氧氯化物。这些氯氧化物能够与亲核试剂反应，如生物分子中经常发现的羟基或氨基。这种技术允许产生与蛋白质的直接缀合，例如，通过赖氨酸侧链的氨基。在用氯氧化物进行表面修饰后与蛋白质的缀合也可以通过使用双官能接头，如马来酰亚胺丙酸酰肼来实现。
对于非共价连接技术，具有与基底或颗粒表面相反的极性或电荷的链型分子是特别合适的。可非共价连接到核/壳纳米颗粒的连接分子的实例包括阴离子、阳离子或两性离子表面活性剂，酸性或碱性蛋白质，聚胺，聚酰胺，聚砜或聚羧酸。基底或颗粒与具有官能性反应基团的两亲性试剂之间的疏水相互作用可以产生必要的连接。特别地，具有两亲特征的链型分子，如磷脂或衍生的多糖(它们可以彼此交联)，是有用的。这些分子在表面的吸附可以通过共孵育来实现。亲和分子与基底或颗粒之间的结合也可以基于非共价、自组织键。其一个实例涉及具有生物素作为连接分子的简单检测探针和偶联亲和素或链霉亲和素的分子。
官能团与生物分子的偶联反应的方案可以在文献中找到，例如在“BioConjugateTechniques[生物缀合技术]”(Greg T.Hermanson，学术出版社(Academic Press)1996)中。生物分子(例如，MHC分子或其衍生物)可以按照有机化学的标准步骤，例如氧化、卤化、烷基化、酰化、加成、取代或酰胺化，以共价或非共价方式偶联到连接分子上。用于偶联共价或非共价结合的连接分子的这些方法可以在连接分子偶联到基底或颗粒之前或之后应用。此外，可以通过孵育实现分子与相应的预处理的基底或颗粒(例如通过三甲基甲硅烷基溴预处理)的直接结合，所述预处理的基底或颗粒由于该预处理显示出经修饰的表面(例如更高电荷或极性表面)。
纳米颗粒的合成
纳米颗粒可以通过以下来形成：使含有pMHC复合物和聚合物的水相与非水相接触，然后蒸发非水相以引起来自水相的颗粒的聚结，如美国专利号4,589,330或4,818,542中所教导的。用于这种制剂的某些聚合物是天然或合成共聚物或聚合物，其包括明胶琼脂、淀粉、阿拉伯半乳聚糖、白蛋白、胶原、聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)丙交酯聚(ε-己内酯)、聚(ε-己内酯-共-乳酸)、聚(ε-己内酯-共-乙醇酸)、聚(β-羟基丁酸)、聚(环氧乙烷)、聚乙烯、聚(烷基-2-氰基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚酰胺、聚(氨基酸)、聚(2-羟乙基DL-天冬酰胺)、聚(酯脲)、聚(L-苯丙氨酸/乙二醇/1,6-二异氰酰己烷)和聚(甲基丙烯酸甲酯)。特别地，某些聚合物是聚酯，例如聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)丙交酯聚(ε-己内酯)、聚(ε-己内酯-共-乳酸)和聚(ε-己内酯-共-乙醇酸)。用于溶解聚合物的溶剂包括：水、六氟异丙醇、亚甲基氯、四氢呋喃、己烷、苯或六氟丙酮倍半水合物。
如Perrault,S.D.等人(2009)Nano Lett[纳米通讯]9:1909-1915中所述，使用用柠檬酸钠化学还原氯化金来合成金纳米颗粒(GNP)。简言之，在剧烈搅拌下将2mL 1％的HAuCl4(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))添加到100mL H2O中，并在油浴中加热所述溶液。将6mL(对于14nm GNP)或2mL(对于40nm GNP)的1％柠檬酸钠添加到沸腾的HAuCl4溶液中，再搅拌10分钟，然后冷却至室温。通过添加1μMol用-COOH或-NH2基团官能化的硫醇-PEG接头(纳米公司(Nanocs)，马塞诸塞州)作为MHC的受体来稳定GNP。聚乙二醇化的GNP用水洗涤以除去游离的硫醇-PEG，浓缩并储存在水中以作进一步分析。用分光光度法测定NP浓度，并根据比尔定律(Beer’s law)计算NP浓度。
SFP系列氧化铁NP(SFP IONP)可以通过在表面活性剂存在下在有机溶剂中热分解乙酸铁，然后通过聚乙二醇化在水性缓冲液中使其成为溶剂来制备(Xie,J.等人(2007)AdvMater[先进材料]19:3163；Xie,J.等人(2006)Pure Appl.Chem.[纯粹与应用化学]78:1003-1014；Xu,C.等人(2007)Polymer International[聚合物国际版]56:821-826)。简言之，将2mMol Fe(acac)3(西格玛奥德里奇公司，奥克维尔(Oakville)，ON)溶解在10mL苄基醚和油胺的混合物中，并加热至100℃持续1小时，然后在氮气层保护下在回流情况下300℃持续2小时。合成的NP通过添加乙醇沉淀并且再悬浮于正己烷中。对于IONP的聚乙二醇化，将100mg不同的3.5kD DPA-PEG接头(美国杰克曼技术公司(Jenkem Tech USA))溶解在CHCl3和HCON(CH3)2(二甲基甲酰胺(DMF))的混合物中。然后将NP溶液(20mg Fe)添加到DPA-PEG溶液中，并在室温下搅拌4小时。聚乙二醇化的SFP NP通过添加己烷沉淀过夜，并且然后再悬浮于水中。通过高速离心(20,000xg，30min)去除微量聚集体，并将单分散的SFP NP储存在水中，用于进一步表征和pMHC缀合。在2N HCL中A410处用分光光度法测定IONP产物中铁的浓度。基于SFP NP的分子结构和直径(Fe3O4；直径8+1nm)(Xie,J.等人(2007)Adv Mater[先进材料]19:3163；Xie,J.等人(2006)Pure Appl.Chem.[纯粹与应用化学]78:1003-1014)，估计含有1mg铁的SFP溶液含有5x1014NP。
还可以通过热分解或加热纳米颗粒前体来制备纳米颗粒。在一个实施例中，纳米颗粒是金属或金属氧化物纳米颗粒。在一个实施例中，纳米颗粒是氧化铁纳米颗粒。在一个实施例中，纳米颗粒是金纳米颗粒。在一个实施例中，本文提供了根据本技术制备的纳米颗粒。在一个实施例中，本文提供了一种制备氧化铁纳米颗粒的方法，所述方法包括乙酰丙酮铁的热分解反应。在一个实施例中，获得的氧化铁纳米颗粒是水溶性的。一方面，氧化铁纳米颗粒适合于蛋白质缀合。在一个实施例中，所述方法包括单步热分解反应。
在一个方面，热分解发生在官能化的PEG分子的存在下。官能化的PEG接头的某些非限制性实例显示在表1中。
在一个方面，热分解包括加热乙酰丙酮铁。在一个实施例中，热分解包括在官能化的PEG分子存在下加热乙酰丙酮铁。在一个实施例中，热分解包括在苄基醚和官能化的PEG分子存在下加热乙酰丙酮铁。不受理论束缚，在一个实施例中，官能化的PEG分子用作还原剂和表面活性剂。本文提供的制备纳米颗粒的方法简化和改进了常规方法，所述常规方法使用难以被PEG分子置换或不能被PEG分子置换至完全的表面活性剂来使颗粒成为水溶性。通常，表面活性剂可能是昂贵的(例如磷脂)或有毒的(例如油酸或油酸胺)。另一方面，在不受理论约束的情况下，制造纳米颗粒的方法避免了使用常规表面活性剂的需要，从而实现高程度的分子纯度和水溶性。
在一个实施例中，热分解涉及乙酰丙酮铁和苄基醚，并且在不存在除本文所用的那些之外的常规表面活性剂的情况下。
在一个实施例中，热分解的温度为约80℃至约300℃、或约80℃至约200℃、或约80℃至约150℃、或约100℃至约250℃、或约100℃至约200℃、或约150℃至约250℃、或约150℃至约250℃。在一个实施例中，热分解发生在约1至约2小时的时间。
在一个实施例中，制备氧化铁纳米颗粒的方法包括纯化步骤，例如通过使用Miltenyi Biotec LS磁体柱。
在一个实施例中，纳米颗粒在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中在约4℃下稳定，没有任何可检测的降解或聚集。在一个实施例中，纳米颗粒稳定至少6个月。
在一个方面，本文提供了一种制备纳米颗粒复合物的方法，所述方法包括使pMHC与本文提供的氧化铁纳米颗粒接触。不受理论约束，pMHC在其羧基末端编码半胱氨酸，所述半胱氨酸可在约pH 6.2至约pH 6.5下与官能化的PEG中的马来酰亚胺基团反应约12至约14小时。
在一个方面，制备纳米颗粒复合物的方法包括纯化步骤，例如通过使用MiltenyiBiotec LS磁体柱。
调节性免疫细胞类型
本公开的uaMHC-NP复合物将自身反应性T细胞重编程或分化为T调节性细胞或TR1细胞。在某些实施例中，TR1细胞表达IL-10。在某些实施例中，TR1细胞分泌IL-10。在某些实施例中，TR1细胞表达CD49b。在某些实施例中，TR1细胞表达LAG-3。具有这些表型特征的T细胞可用于治疗个体的炎症性病症或自身免疫性病症。在某些实施例中，uaMHC-NP复合物可用于在施用后将个体中的自身反应性T细胞重编程或分化为TR1细胞的方法。这种方法以抗原特异性的方式产生TR1细胞。
本公开的遍在自身抗原-MHC可用于生成B调节性细胞。在某些实施例中，本公开的遍在自身抗原-MHC部署在产生表达高水平CD1d、CD5和/或IL-10分泌的B细胞的方法中。B调节性细胞也通过Tim-1的表达来鉴定。在某些实施例中，uaMHC-NP复合物可用于在施用后诱导个体中的B调节性细胞的方法中。这种方法以抗原特异性的方式产生B调节性细胞。
药物组合物和施用
本文提供了用于治疗和预防疾病的遍在自身抗原-MHC-NP的药物组合物。所述组合物包含以下，或者可替代地基本上由以下组成或者再进一步由以下组成：本文所述的纳米颗粒复合物和载体。
本公开的组合物可以常规地通过注射，例如静脉内、皮下或肌肉内进行肠胃外施用。适用于其他施用方式的其他配制品包括口服配制品。口服配制品包括通常使用的赋形剂，如例如，医药级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释配制品或粉末的形式，并含有约10％至约95％、优选约25％至约70％的活性成分。根据本公开内容，本领域技术人员将已知含有修饰受试者免疫状况的抗原-MHC-纳米颗粒复合物的水性组合物的制备。在一个实施例中，遍在自身抗原-MHC-纳米颗粒复合物被全身性地施用。在特定实施例中，可静脉内施用遍在自身抗原-MHC-NP复合物或包含多个遍在自身抗原-MHC-N复合物的组合物。
通常，以与剂量配制品相容的方式施用本文所述的遍在自身抗原-MHC-NP，并以治疗有效和免疫修饰的量施用。施用量取决于有待治疗的受试者。需要施用的活性成分的精确量取决于医生的判断。然而，合适的剂量范围为每次施用十至几百纳克或微克抗原/MHC/纳米颗粒复合物。初始施用和增强施用的合适方案也是可变的，但其典型的是初始施用随后是后续施用。
应用的方式可以有很大的不同。任何常规的疫苗施用方法都是适用的。这些被认为包括口服应用在生理上可接受基础上的固体或在生理上可接受的分散体中，通过注射等进行肠胃外应用。抗原/MHC/纳米颗粒复合物的剂量将取决于施用途径，并根据受试者的尺寸和健康状况而变化。遍在自身抗原MHC-NP可以通过任何合适的途径施用，包括静脉内、皮下、皮内、肌内、直肠或腹腔内。在某些实施例中，自身抗原-MHC-NP是肠胃外施用。在某些实施例中，自身抗原-MHC-NP是静脉内施用。在某些实施例中，自身抗原-MHC-NP是皮下施用。
在许多情况下，期望对遍在自身抗原-MHC-NP进行多次施用，约、至少约、或至多约3、4、5、6、7、8、9、10或更多次施用。施用通常间隔1、2、3、4、5、6或7天至十二周，更通常间隔一至两周。每隔一天、一周两次、每周、每双周、每月或0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4或5年(通常为两年)间隔的定期增强将是理想的，以维持免疫系统的状况。施用过程之后可进行自身反应性免疫应答、同源TR1细胞和T细胞活性的测定。
在某些方面中，不包括纳米颗粒核和任何生物可吸收/生物相容外层的遍在自身抗原-MHC-NP的单剂量包括约0.001mg/kg至约2.0mg/kg、或约0.001mg/kg至约1.5mg/kg、或约0.001mg/kg至约1.4mg/kg、或约0.001mg/kg至约1.3mg/kg、或约0.001mg/kg至约1.2mg/kg、或约0.001mg/kg至约1.1mg/kg、或约0.001mg/kg至约1.0mg/kg。在一些实施例中，单剂量包括从约0.004mg/kg至约1.014mg/kg、或从约0.02mg/kg至约0.811mg/kg、或从约0.041mg/kg至约0.608mg/kg、或从约0.061mg/kg至约0.507mg/kg、或从约0.081mg/kg至约0.405mg/kg、或从约0.121mg/kg至约0.324mg/kg、或从约0.162mg/kg至约0.243mg/kg。在一些实施例中，单剂量包括从约0.004mg/kg至约1.015mg/kg、或从约0.004mg/kg至约1.0mg/kg、或从约0.004mg/kg至约0.9mg/kg、或从约0.004mg/kg至约0.8mg/kg、或从约0.004mg/kg至约0.7mg/kg、或从约0.004mg/kg至约0.6mg/kg、或从约0.004mg/kg至约0.5mg/kg、或从约0.004mg/kg至约0.4mg/kg、或从约0.004mg/kg至约0.3mg/kg、或从约0.004mg/kg至约0.2mg/kg、或从约0.004mg/kg至约0.1mg/kg。在此，mg/kg是指每千克受试者体重施用的遍在自身抗原-MHC或不考虑MHC组分情况下的遍在自身抗原的毫克。
自身免疫性疾病和炎症性疾病
本发明的遍在自身抗原-MHC可用于治疗自身免疫性障碍和炎症性障碍。自身免疫性障碍或炎症性障碍包括产生于并针对个体自身组织或器官的疾病或障碍或其表现或由此导致的病症。在一个实施例中，它是指由与正常身体组织和抗原反应的T细胞的产生所导致的或因其而加重的病症。在一个实施例中，它是指由与正常身体组织和抗原反应的抗体的产生所导致的或因其而加重的病症。自身免疫性障碍或炎症性障碍的实例包括但不限于关节炎(类风湿性关节炎如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风或痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、急性免疫性关节炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、II型胶原诱导的关节炎、传染性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、银屑病关节炎、斯泰尔病、脊椎关节炎、和幼年类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎(arthritis chronica progrediente)、畸形性关节炎、原发性慢性多发性关节炎、反应性关节炎、和强直性脊柱炎)、炎症性过度增生性皮肤病、银屑病(如斑块型银屑病、滴状银屑病(gutatte psoriasis)、脓疱型银屑病、和指甲型银屑病)、特应性(包括特应性疾病如花粉热和乔布斯综合征)、皮炎(包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、剥脱性皮炎、过敏性皮炎、过敏性接触性皮炎、疱疹样皮炎、麻木性皮炎、脂溢性皮炎、非特异性皮炎、原发性刺激性接触性皮炎、和特应性皮炎)、X连锁高IgM综合征、过敏性眼内炎性疾病、荨麻疹(如慢性过敏性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹)、肌炎、多发性肌炎/皮肌炎、青少年皮肌炎、中毒性表皮坏死、硬皮病(包括全身性硬皮病)、硬化症(例如全身性硬化症；多发性硬化症(MS)，例如脊髓光学型MS、原发性进展型MS(PPMS)、和复发-缓解型MS(RRMS)；进行性系统性硬化症、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化、和共济失调性硬化症)、视神经脊髓炎谱系障碍(NMO，也称为德维克病(Devic’s Disease)或德维克综合征(Devic’s Syndrome))、炎症性肠病(IBD)(例如，克罗恩病；自身免疫介导的胃肠道疾病；结肠炎如溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎、显微镜下结肠炎、胶原性结肠炎、结肠炎息肉病、坏死性小肠结肠炎、和透壁性结肠炎；和自身免疫性炎症性肠病)、肠道炎症、坏疽性脓皮病、结节性红斑、原发性硬化性胆管炎、呼吸窘迫综合征(包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS))、脑膜炎、葡萄膜的全部或部分发炎、虹膜炎、脉络膜炎、自身免疫性血液障碍、类风湿性脊柱炎、类风湿性滑膜炎、遗传性血管性水肿、脑神经损伤(如脑膜炎中的)、妊娠疱疹、类天疱疮妊娠、阴囊瘙痒、自身免疫性卵巢早衰、由于自身免疫性病症导致的突发性听力丧失、IgE介导的疾病，例如过敏反应、过敏性鼻炎和特应性鼻炎、脑炎如拉斯穆森(Rasmussen)脑炎和边缘和/或脑干脑炎、葡萄膜炎(如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎、或自身免疫性葡萄膜炎)、肾小球肾炎(GN)伴或不伴肾病综合征(如慢性或急性肾小球肾炎如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜或膜增生性GN(MPGN)(包括I型和II型)、和快速进展的GN、或增生性肾炎)、自身免疫性多腺内分泌衰竭、龟头炎(包括局限性浆细胞性龟头炎、龟头皮炎)、离心性环状红斑、持续性色素异常红斑、多形红斑、环状肉芽肿、光泽苔藓、硬化萎缩性苔藓、慢性单纯性苔藓、棘状苔藓、扁平苔藓、片状鱼鳞病、表皮松解性角化过度、癌前角化病、坏疽性脓皮病、过敏病症和应答、过敏反应、湿疹(包括过敏性或特应性湿疹、脂肪性湿疹、难产性湿疹、和水泡性掌跖湿疹)、哮喘(如支气管哮喘、支气管性气喘、和自身免疫性哮喘)、涉及T细胞浸润和慢性炎症应答的病症、妊娠期间针对外来抗原如胎儿A-B-O血型的免疫反应、慢性肺部炎症性疾病、自身免疫性心肌炎、白细胞粘附缺陷、狼疮(包括狼疮性肾炎、狼疮性脑炎、小儿狼疮、非肾性狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮和盘状红斑狼疮、脱发性狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)如皮肤性SLE或亚急性皮肤性SLE、新生儿狼疮综合征(NLE)、和播散性红斑狼疮)、I型糖尿病、II型糖尿病、和成人潜伏性自身免疫性糖尿病(或1.5型糖尿病)。还设想了与以下相关的免疫应答：由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应、结节病、肉芽肿病(包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳肉芽肿病、或粒细胞缺乏症)、血管炎(包括血管炎、大血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安)大动脉炎)、中血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎/结节性动脉周围炎)、显微镜下多动脉炎、免疫性血管炎、CNS血管炎、皮肤血管炎、过敏性血管炎、坏死性血管炎如全身性坏死性血管炎、和ANCA相关性血管炎(如变应性肉芽肿性血管炎(Churg-Strauss vasculitis)或综合征(CSS)和ANCA相关性小血管炎))、颞动脉炎、再生障碍性贫血、自身免疫性再生障碍性贫血、库姆斯阳性贫血(Coombs positive anemia)、布-戴二氏贫血综合征(Diamond Blackfan anemia)、溶血性贫血、免疫性溶血性贫血(包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA))、艾迪生病、自身免疫性中性粒细胞减少症、全血细胞减少、白细胞减少、与白细胞渗出有关的疾病、CNS炎症性疾病、阿尔茨海默病、帕金森病、多器官损伤综合征(如继发于败血症、创伤、或出血)、抗原抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、抗磷脂抗体综合征、抗磷脂综合征、过敏性神经炎、白塞病/综合征、卡斯特莱曼综合征(Castleman’s syndrome)、肺出血肾炎综合征(Goodpasture’s syndrome)、雷诺综合征(Reynaud’s syndrome)、干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、史蒂文斯—约翰逊综合征(Stevens-Johnson syndrome)、类天疱疮如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮、天疱疮(包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、黏液膜类天疱疮型天疱疮、和红斑型天疱疮)、自身免疫性多内分泌病、赖特病或赖特综合征(Reiter’s disease or syndrome)、热损伤、子痫前期、免疫复合物障碍如免疫复合物肾炎、抗体介导的肾炎、多神经病、慢性神经病如IgM多神经病或IgM介导的神经病、自身免疫性或免疫介导的血小板减少症如特发性血小板减少性紫癜(ITP)(包括慢性或急性ITP、获得性血小板减少性紫癜)、巩膜炎(如特发性脑巩膜炎、表层巩膜炎)、睾丸和卵巢的自身免疫性疾病(包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎)、原发性甲状腺功能减退、甲状旁腺功能减退、自身免疫性内分泌疾病(包括甲状腺炎(如自身免疫性甲状腺炎、桥本氏病、慢性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎)、或亚急性甲状腺炎)、自身免疫性甲状腺疾病、特发性甲状腺功能减退、或格雷夫氏病)、多腺综合征如自身免疫性多腺综合征(或多腺内分泌病综合征)、副肿瘤综合征(包括神经副肿瘤综合征如兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征或伊顿-兰伯特(Eaton-Lambert)综合征)、僵硬的人或僵硬的人综合征、脑脊髓炎如变态反应性脑脊髓炎或变态反应性脑脊髓炎和实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)、重症肌无力如胸腺瘤相关的重症肌无力、小脑变性、神经肌强直、眼阵挛或眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)、感觉神经病变、多灶性运动神经病变、希汉氏综合征(Sheehan’ssyndrome)、自身免疫性肝炎、慢性肝炎、狼疮性肝炎、巨细胞肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎、淋巴间质性肺炎(LIP)、闭塞性细支气管炎(非移植性)相比于NSIP、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、伯杰氏病(Berger’s disease)(IgA肾病)、特发性IgA肾病、线性IgA皮肤病、急性发热性中性粒细胞皮肤病、角膜下脓疱性皮肤病、短暂棘层松解性皮肤病、肝硬化如原发性胆汁性肝硬化和肺硬化症、自身免疫性肠病综合征、腹腔疾病或腹腔的疾病、口炎性腹泻(麸质肠病)、难治性口炎性腹泻、特发性口炎性腹泻、冷球蛋白血症、淀粉样变性侧索硬化症(ALS；卢格里格病(Lou Gehrig’s disease))、冠状动脉疾病、自身免疫性耳病如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性听力损失、多软骨炎如难治性或复发性或再发性多软骨炎、肺泡蛋白沉积症、科根综合征(Cogan’ssyndrome)/非梅毒性间质性角膜炎、贝尔氏麻痹(Bell’s palsy)、斯威特病/综合征(Sweet’s disease/syndrome)、酒渣鼻自身免疫性、带状疱疹相关疼痛、淀粉样变、非癌性淋巴细胞增多症、原发性淋巴细胞增多症(其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多症(例如，良性单克隆丙种球蛋白病和意义不明的单克隆丙种球蛋白病、MGUS))、周围神经病变、副肿瘤综合征、管道病变如癫痫、偏头痛、心律失常、肌肉障碍、耳聋、失明、周期性麻痹、CNS管道病变、自闭症、炎性肌病、局灶性或节段性或局灶节段性肾小球硬化(FSGS)、内分泌眼病、葡萄膜视网膜炎、脉络膜视网膜炎、自身免疫性肝病、纤维肌痛、多发性内分泌衰竭、施密特氏综合征(Schmidt’s syndrome)、肾上腺炎、胃萎缩、老年性痴呆、脱髓鞘疾病(例如自身免疫性脱髓鞘疾病和慢性炎症性脱髓鞘多发性神经病)、德勒斯勒综合症(Dressler’ssyndrome)、斑秃、全秃、CREST综合征(钙质沉着症、雷诺现象(Raynaud’s phenomenon)、食管动力障碍、肢端硬化、和毛细血管扩张)、男性和女性自身免疫性不孕(例如、由于抗精子抗体)混合结缔组织病、恰加斯病(Chagas’disease)、风湿热、复发性流产、农民肺、多形性红斑、心脏切开术后综合征、库欣综合征(Cushing’s syndrome)、鸟迷肺(bird-fancier’slung)、过敏性肉芽肿性脉管炎、良性淋巴细胞性脉管炎、阿尔波特氏综合征(Alport’ssyndrome)、肺泡炎如过敏性肺泡炎和纤维性肺泡炎、间质性肺病、输血反应、麻风病、疟疾、寄生虫病(如利什曼病、锥虫病、血吸虫病、蛔虫病)、曲霉菌病、山姆波特综合征(Sampter’ssyndrome)、卡普兰综合征(Caplan’s syndrome)、登革热、心内膜炎、心内膜心肌纤维化、弥漫性间质性肺纤维化、间质性肺纤维化、肺纤维化、特发性肺纤维化、囊性纤维化、眼内炎、升降性红斑(erythema elevatum et diutinum)、胎儿成红细胞增多病、嗜酸性筋膜炎、舒尔曼综合症(Shulman’s syndrome)、费蒂综合症(Felty’s syndrome)、丝虫病、睫状体炎，例如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性或慢性)、或者是富克斯睫状体炎(Fuchs’cyclitis)、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、人免疫缺陷病毒(HIV)感染、SCID、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、埃可病毒感染、脓毒症、内毒素血症、胰腺炎、甲状腺炎、细小病毒感染、风疹病毒感染、疫苗接种后综合征、先天性风疹感染、爱泼斯坦－巴尔二氏病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、腮腺炎、埃文氏综合征(Evan’ssyndrome)、自身免疫性性腺衰竭、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham’s chorea)、链球菌后肾炎、血栓性脉管炎、甲状腺毒症、脊髓痨、脉络膜炎、巨细胞多肌痛、慢性超敏性肺炎、干燥性角结膜炎、流行性角结膜炎、特发性肾病综合征、微小病变肾病、良性家族性缺血-再灌注损伤、移植器官再灌注、视网膜自身免疫、关节发炎、支气管炎、慢性阻塞性气道/肺疾病、矽肺病、口疮、口疮性口炎、动脉硬化性障碍、无精子产生症、自身免疫溶血、博克氏病(Boeck’sdisease)、冷球蛋白血症、杜普伊特伦挛缩(Dupuytren’s contracture)、晶状体过敏性眼内炎、过敏性肠炎、麻风结节性红斑、特发性面神经麻痹、慢性疲劳综合征、风湿热、哈曼-里奇二氏病(Hamman-Rich’s disease)、感觉性听力损失、阵发性血红蛋白尿、性腺功能减退、区域性回肠炎、白细胞减少、传染性单核细胞增多症、横贯性脊髓炎、原发性特发性粘液水肿、肾病、交感性眼炎(ophthalmia symphatica)、肉芽肿性睾丸炎、胰腺炎、急性多发性神经根炎、坏疽性脓皮病、狄奎凡甲状腺炎(Quervain’s thyreoiditis)、获得性脾萎缩、非恶性胸腺瘤、白癜风、中毒性休克综合征、食物中毒、涉及T细胞浸润的病症、白细胞粘附缺陷、与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应相关的免疫应答、涉及白细胞渗出的疾病、多器官损伤综合征、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、过敏性神经炎、自身免疫性多内分泌病、卵巢炎、原发性粘液水肿、自身免疫性萎缩性胃炎、交感神经性眼炎、风湿性疾病、混合结缔组织病、肾病综合征、胰岛炎、多内分泌衰竭、自身免疫性多腺综合征I型、成人发作性特发性甲状旁腺功能减退(AOIH)、心肌病，例如扩张型心肌病、获得性大疱性表皮松解症(EBA)、血色病、心肌炎、肾病综合征、原发性硬化性胆管炎、化脓性或非化脓性鼻窦炎、急性或慢性鼻窦炎、筛窦炎、额窦炎、上颌窦炎、或蝶窦炎、嗜酸性粒细胞相关疾病如嗜酸性粒细胞增多症、肺浸润性嗜酸性粒细胞增多症、嗜酸性粒细胞增多症-肌痛综合征、吕弗勒氏综合症(Loffler’s syndrome)、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、热带性肺嗜酸性粒细胞增多症、支气管肺炎曲菌病、含有曲菌球或嗜酸性粒细胞的肉芽肿、过敏反应、血清阴性脊椎关节炎、多内分泌自身免疫性疾病、硬化性胆管炎、巩膜的、外膜的、慢性皮肤黏膜的念珠菌病、布鲁顿综合征(Bruton’s syndrome)、短暂性低氧症nal缺血、威－奥二氏综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)、毛细血管扩张性共济失调综合征、血管扩张、与胶原病相关的自身免疫性疾病、风湿病、神经疾病、淋巴结炎、血压降低性应答、血管功能障碍、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、肾缺血、脑缺血、和伴随血管化的疾病、过敏性超敏反应障碍、肾小球肾炎、再灌注损伤、缺血再灌注障碍、心肌或其他组织的再灌注损伤、淋巴瘤性气管支气管炎、炎症性皮肤病、具有急性炎症组分的皮肤病、多器官功能衰竭、大疱性疾病、肾皮质坏死、急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎症性疾病、眼和眼眶炎症性疾病、粒细胞输注相关综合征、细胞因子诱导的毒性、发作性睡病、急性严重炎症、慢性顽固性炎症、肾盂炎、动脉内膜增生、消化性溃疡、瓣膜炎、肺气肿、斑秃、脂肪组织炎症/II型糖尿病、肥胖相关的脂肪组织炎症/胰岛素抵抗、和子宫内膜异位。
在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性障碍可包括但不限于I型和II型糖尿病、糖尿病前期、移植排斥、多发性硬化症、多发性硬化症相关障碍、卵巢早衰、硬皮病、干燥症/综合征、狼疮、白癜风、脱发(秃顶)、多腺体衰竭、格雷夫斯病、甲状腺功能减退、多发性肌炎、天疱疮、克罗恩病、结肠炎、自身免疫性肝炎、垂体功能减退、心肌炎、艾迪森病、自身免疫性皮肤病、葡萄膜炎、恶性贫血、甲状旁腺功能减退和/或类风湿性关节炎。其他目的适应症包括，但不限于，哮喘、过敏性哮喘、原发性胆汁性肝硬化、肝硬化、视神经脊髓炎谱系障碍(德维克病(Devic’s disease)、视神经脊髓多发性硬化(OSMS))、寻常型天疱疮、炎症性肠病(IBD)、关节炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、乳糜泻、银屑病、自身免疫性心肌病、特发性扩张型心肌病(IDCM)、重症肌无力、葡萄膜炎、强直性脊柱炎、免疫介导的肌病、前列腺癌、抗磷脂综合征(ANCA+)、动脉粥样硬化、皮肌炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺气肿、脊髓损伤、创伤性损伤、烟草诱导的肺破坏、ANCA相关的血管炎、银屑病、硬化性胆管炎、原发性硬化性胆管炎以及中枢神经系统和周围神经系统疾病。
在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性障碍可包括但不限于I型糖尿病、多发性硬化症、乳糜泻、原发性胆汁性肝硬化、天疱疮、落叶型天疱疮、寻常型天疱疮、视神经脊髓炎谱系障碍、关节炎(包括类风湿性关节炎)、过敏性哮喘、炎症性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、系统性红斑狼疮、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病、肺气肿、银屑病、自身免疫性肝炎、葡萄膜炎、干燥综合征、硬皮病、抗磷脂综合征、ANCA相关血管炎和僵人综合征。在另一方面，疾病相关抗原是肿瘤或癌症相关抗原。
在某些实施例中，自身免疫性疾病complex或炎症性障碍可包括选自原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎和原发性硬化性胆管炎的肝脏自身免疫性疾病。在某些实施例中，uaMHC-NP复合物用于治疗原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎和/或原发性硬化性胆管炎的方法中。在某些实施例中，治疗原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎和/或原发性硬化性胆管炎的方法包括施用uaMHC-NP复合物，其中所述遍在自身抗原是衍生自以下中的任何一种或多种的多肽：丙酮酸脱氢酶复合物-E2组分(PDC-E2)、细胞色素P450 2D6(CYP2D6)、可溶性肝抗原(SLA)、肌动蛋白(ACTB)、甲酰亚胺转移酶-环化脱氨酶(FTCD)和髓过氧化物酶(MPO)。在某些实施例中，治疗原发性胆汁性肝硬化的方法包括施用uaMHC-NP复合物，其中所述遍在自身抗原是衍生自以下中的任何一种或多种的多肽：细胞色素P4502D6(CYP2D6)、可溶性肝抗原(SLA)、肌动蛋白(ACTB)、甲酰亚胺转移酶-环化脱氨酶(FTCD)和髓过氧化物酶(MPO)。在某些实施例中，治疗自身免疫性肝炎的方法包括施用uaMHC-NP复合物，其中所述遍在自身抗原是衍生自以下中的任何一种或多种的多肽：丙酮酸脱氢酶复合物-E2组分(PDC-E2)、可溶性肝抗原(SLA)、肌动蛋白(ACTB)、甲酰亚胺转移酶-环化脱氨酶(FTCD)和髓过氧化物酶(MPO)。在某些实施例中，治疗原发性硬化性胆管炎的方法包括施用uaMHC-NP复合物，其中所述遍在自身抗原是衍生自以下中的任何一种或多种的多肽：丙酮酸脱氢酶复合物-E2组分(PDC-E2)、细胞色素P450 2D6(CYP2D6)、可溶性肝抗原(SLA)、肌动蛋白(ACTB)和髓过氧化物酶(MPO)。
在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性障碍可包括多发性硬化症。在某些实施例中，所述自身免疫性疾病或炎症性障碍可包括复发-缓解型多发性硬化症。在某些实施例中，所述uaMHC-NP复合物用于治疗多发性硬化症的方法中。在某些实施例中，治疗多发性硬化症的方法包括施用uaMHC-NP复合物，其中所述遍在自身抗原是衍生自以下中的任何一种或多种的多肽：丙酮酸脱氢酶复合物-E2组分(PDC-E2)、细胞色素P450 2D6(CYP2D6)、可溶性肝抗原(SLA)、肌动蛋白(ACTB)、甲酰亚胺转移酶-环化脱氨酶(FTCD)和髓过氧化物酶(MPO)。
药学上可接受的稳定剂、赋形剂和稀释剂
在某些实施例中，本公开的uaMHC-NP复合物包含在包含一种或多种药学上可接受的稳定剂、赋形剂、载体和稀释剂的药物组合物中。在某些实施例中，本公开的uaMHC-NP复合物悬浮于无菌溶液中施用。在某些实施例中，所述溶液包含0.9％NaCl。在某些实施例中，所述溶液还包含以下中的一种或多种：缓冲液，例如醋酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐和羟甲基氨基甲烷(Tris)；表面活性剂，例如聚山梨酯80(吐温80)、聚山梨酯20(吐温20)和泊洛沙姆188；多元醇/二糖/多糖，例如葡萄糖、右旋糖、甘露糖、甘露醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖和葡聚糖40；氨基酸，例如甘氨酸或精氨酸；抗氧化剂，例如抗坏血酸、蛋氨酸；或螯合剂，例如EGTA或EGTA。在某些实施例中，本公开的uaMHC-NP复合物冷干地装运/储存并且在施用之前重构。在某些实施例中，冻干的uaMHC-NP复合物配制品包含膨胀剂，例如甘露醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖或葡聚糖40。冻干配制品可以包含在由玻璃构成的小瓶中。uaMHC-NP复合物在配制时，无论重构与否，均可在一定的pH下缓冲，一般小于7.0。在某些实施例中，pH可以在4.5和6.5之间、4.5和6.0之间、4.5和5.5之间、4.5和5.0之间、或5.0和6.0之间。在某些实施例中，uaMHC-NP复合物可配制用于静脉内注射。在某些实施例中，uaMHC-NP复合物可配制用于口服摄入。在某些实施例中，uaMHC-NP复合物可配制用于肠胃外、肌内或组织内注射。在某些实施例中，uaMHC-NP复合物可以在没有任何免疫佐剂或旨在增加或减少免疫应答的其他化合物或多肽的情况下配制和/或施用。
实例
以下说明性实施例代表本文描述的组合物和方法的实施例，并不意味着以任何方式进行限制。
实例1-通过PBC相关的pMHC II类-NP，TR1样CD4+ T细胞形成和扩增
NOD.c3c4小鼠(携带抗糖尿病的B6衍生的染色体3和4区域)自发地发展出类似于人PBC的自身免疫性胆道疾病形式。参见Irie,J.,等人J.Exp.Med.[实验医学杂志]203,1209-1219。与>90％的患者一样，这些小鼠针对丙酮酸脱氢酶(PDC)复合物的E2和E3BP组分产生致病性T细胞和B细胞应答。参见Kita,H.等人J.Clin.Invest.[临床研究杂志]109,1231-1240。在NOD.c3c4小鼠中以及在人中，这些自身免疫应答促进胆管上皮细胞的破坏，导致胆汁淤积，小胆管增生，最终导致肝衰竭。
为了设计PBC相关的基于pMHC II类的纳米药物，我们在鼠PDC-E2中计算机模拟地寻找能够与NOD/NOD.c3c4小鼠MHC II类分子(I-Ag7)结合的15mer肽。选择编码两个这样的表位(PDC-E2166-181和PDC-E282-96)的基于I-Ag7的pMHC进行实验。以T1D相关的I-Ag7结合性BDC2.5模拟表位作为阴性对照。这些复合物在慢病毒转导的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生，通过按顺序镍和链霉亲和素标签亲和色谱纯化，并通过游离羧基端半胱氨酸共价包被到氧化铁纳米颗粒上，所述氧化铁纳米颗粒是在马来酰亚胺官能化的聚乙二醇存在下通过热分解乙酰丙酮铁(III)(Fe(acac)3)产生的，如Singha,S.等人Nature Nanotechnology[自然纳米技术]12,701-710所述。
pMHC四聚体染色研究表明，NOD.c3c4(但不是NOD)小鼠的PDC-E2166-181/IAg7和PDC-E282-96/IAg7反应性T细胞亚群水平随年龄而增加，如图1A所示(上下颠倒的三角形，中间和右侧小图)。相反，与NOD小鼠不同，NOD.c3c4小鼠含有可忽略不计的T1D相关的BDC2.5mi/IAg7反应性亚群，如图1A所示(三角形，中间和右侧小图)，这一结果与这两个品系的PBC相比于T1D的倾向一致。因此，NOD.c3c4小鼠肝自身免疫的进展伴随着PDC-E2特异性CD4+ T细胞的大小和/或循环活性的增加。
为了确定PBC相关的pMHC II类NP是否能在NOD.c3c4小鼠中触发PDC-E2特异性TR1样CD4+ T细胞的形成和扩增，我们首先用显示PDC-E2166-181/IAg7 pMHC的NP或对照NP(Cys-NP)治疗15周龄的NOD.c3c4小鼠(当疾病已明确时)(静脉内每周两次，多达13.5周)。与用裸NP治疗的小鼠或未治疗的NOD小鼠相比，治疗触发了循环PDC-E2166-181/IAg7四聚体+CD4+ T细胞的外周频率的快速增加(在2.5周内)，如图1B所示(正方形，左侧和中间小图)。随访结束时对小鼠的研究证实PDC-E2166-181/IAg7-NP诱导的同源CD4+ T细胞的扩增是全身性的，其中在脾、骨髓、肝和肝引流(门脉和腹腔淋巴结)中的频率增加，但非引流淋巴结(相比于肠系膜淋巴结(MLN))中的频率不增加，如图1C所示。
相反，用包衣有T1D相关的BDC2.5/I-Ag7 pMHC的NP治疗NOD.c3c4不触发TR1细胞形成或扩增(图1B右侧小图和图1D)。这一结果与这些纳米药物完全作用于自身抗原经历的T细胞一致；NOD.c3c4小鼠不会发生胰岛炎症，因此预期不会含有抗原激活的BDC2.5mi/IAg7-自身反应性CD4+ T细胞。
在另外的小鼠队列中的实验证明，PDC-E2166-181/IAg7-NP诱导的同源CD4+ T细胞的扩增是肽特异性的，没有任何可检测到的PDC-E282-96/I-Ag7反应性CD4+ T细胞的扩增(图1E，顶行)。事实上，与年龄匹配的未治疗小鼠中检测到的水平相比，这些小鼠中PDC-E2166-181/IAg7特异性CD4+ T细胞的扩增伴随着所有检查的器官中PDC-E282-96/I-Ag7反应性CD4+ T细胞频率的显著降低(图1E，顶行)。这表明PDC-E2166-181/IAg7特异性CD4+ T细胞亚群在某种程度上抑制了其PDC-E282-96/I-Ag7反应性对应物对内源性自身抗原暴露的应答性增殖。
如预期的，在这些小鼠中扩增的PDC-E2166-181/IAg7四聚体+CD4+ T细胞表达TR1细胞标记物LAG-3、CD49b和LAP，如图1F和图2A和2B所示。此外，与它们的四聚体阴性对应物不同，这些小鼠的脾四聚体+CD4+ T细胞应答于PDC-E2166-181(但不是BDC2.5)肽脉冲的骨髓来源的DC而产生TR1细胞因子IL-10但不产生IFNγ、IL-2、IL-4、IL-9或IL-17(图1G)。在用展示第二基于PDC-E2的pMHC(PDC-E282-96/I-Ag7)的NP治疗的小鼠中获得了类似的结果，其中同源的PDC-E282-96/I-Ag7反应性TR1样CD4+ T细胞显著扩增，并且PDC-E2166-181/IAg7反应性CD4+ T细胞的频率显著降低，如图1B(中心)和1E(下)和图2A和2B所示，表明上述结果不是PDC-E2上任何特定表位的特性。
上述数据共同证明，PDC-E2肽/IAg7-NP有效地触发NOD.c3c4小鼠中同源TR1样CD4+T细胞的形成和扩增，正如先前对相应疾病模型中T1D、EAE和CIA相关的pMHC II类NP所述。
实例2-通过疾病相关的pMHC II类NP，已建立的PBC的逆转
当与年龄匹配的NOD小鼠相比较时，6-8周龄NOD.c3c4小鼠开始展示血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平升高、显微镜下胆管上皮增生、胆道白细胞浸润、大量胆管受累(接近受影响的门脉三联管的最大数目)和胆总管(CBD)宏观增大(图3A和3C)。图3B示出了用于量化微观分析的示例性评分矩阵。到约15-16周，这些体征恶化，小鼠开始显示总血清胆红素(TB)水平升高(图3A)高滴度的抗线粒体/PDC-E2特异性自身抗体(NOD小鼠中不存在；图3E)和肝疾病的肉眼体征(胆汁囊肿)(图3D)。所有这些疾病体征的严重程度在约24周龄时达到峰值(图3A-3D)，与CD4+和CD8+ T细胞大量浸润胆管上皮细胞(图3F)、高滴度的抗核自身抗体(图3E)和肝重量近三倍的增加(图3D)相一致。
我们测试了PDC-E2166-181/IAg7-、PDC-E282-96/I-Ag7-和BDC2.5/I-Ag7-NP在15周龄(这一年龄是这些小鼠肝自身免疫性得以良好建立的年龄)NOD.c3c4小鼠中的治疗特性。小鼠每两周接受20ug的pMHC-NP或同等剂量的对照(Cys结缀合的NP；Cys-NP)，持续9-13.5周。用PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗导致血清ALT和TB水平(图4A)、胆管受累、胆管上皮增殖和白细胞浸润(图4B)、胆总管直径和宏观得分(图4C)、肝重量和宏观肝得分(图4D)以及腹围(图4E)显著降低。尽管治疗没有降低在疗法开始时发现的自身抗体滴度，但它明显地钝化了自身抗体形成的进展，如用PDC-E2166-181/IAg7-NP、PDC-E282-96/I-Ag7-NP治疗的小鼠相比于对照NP治疗的小鼠中抗PDC-E2和抗核自身抗体滴度的显著降低所证明的(图4F)。用第二PBC相关的pMHC-NP化合物(PDC-E282-96/I-Ag7-NP)和T1D相关的(但与PBC无关的)对应物(BDC2.5/I-Ag7-NP)进行的另外研究证实了这些化合物的疾病特异性(图4C和4D)。
当在疾病严重程度的高峰(24周龄)开始治疗时，也获得了类似的结果。对用PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗14-20周(38-44周龄)后的小鼠的分析揭示了TR1样CD4+ T细胞的全身性扩增(图4G和图2C)，并表明疾病体征的幅度(图4H和4I)显著低于开始治疗的年龄时所看到的，这表明通过PBC特异性纳米药物解决肝炎症促进了先前存在的肝损伤的修复。
实例3-连续治疗相比于间歇治疗
pMHC-NP治疗全身性地触发同源TR1细胞的形成和扩增，导致这些细胞在大多数淋巴器官以及自身免疫性炎症部位积聚(参见图1-3)。此外，这些TR1细胞在血液中循环，它们在血液中的存在可以作为衡量再治疗需要的生物标志物。为了研究这一问题，并确定同源TR1样CD4+ T细胞的循环水平是否可用于指导治疗决策，我们取消了从15至24周龄已经用PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗的NOD.c3c4小鼠的治疗。然后，我们每两周测量外周血中PDC-E2166-181/IAg7四聚体+CD4+ T细胞的百分比，并且再次治疗动物，其中四聚体+细胞的百分比已经下降到治疗取消时值的约50％；当下一次预定测量的四聚体+值恢复时，再次取消治疗，并重复此循环直到小鼠达到50周龄。尽管在小鼠之间存在相当大的差异(图5A)，在大多数动物中，在治疗取消后的4-6周内，外周血四聚体+TR1细胞含量逐渐下降到原始值的约50％，但这些动物的再次治疗迅速恢复了这些值(图5B)。与未治疗小鼠或从24至38-44周龄连续治疗的小鼠的数值相比，间歇治疗不损害药效学(TR1-样CD4+ T细胞的全身扩增)(图5C和5D)或治疗的治疗效果，包括减少的胆总管直径/肉眼评分和肝重量/肉眼评分(图5E)。
实例4-pMHC-NP相比于标准护理剂
熊去氧胆酸(UDCA，亲水性胆汁酸)是针对PBC的标准护理剂。参见Charatcharoenwitthaya,P.等人Long-term survival and impact of ursodeoxycholicacid treatment for recurrent primary biliary cirrhosis after livertransplantation[熊去氧胆酸治疗肝移植术后复发性原发性胆汁性肝硬化的长期生存和影响].Liver Transpl.[肝转移]13,1236-1245。UDCA具有抗胆汁淤积作用，刺激肝胆分泌，从而保护胆管细胞免受疏水性胆汁酸的毒性作用。虽然在疾病过程早期给药对约50％的患者有效，但在PBC晚期无效。
通过补充UDCA的食物对6周龄NOD.c3c4小鼠连续9周口服UDCA对PBC的进展具有治疗作用，这表现为与未治疗小鼠相比，肝得分和肝重量的降低(尽管ALT、CBD得分或CBD直径没有降低)(图6A)，以及胆管受累和胆管增生的减少(尽管白细胞浸润没有减少)(图6B)。然而，当在疾病进展的晚期(24周龄)给予UDCA时，它没有任何上述治疗效果，除了与未治疗的动物相比CBD直径非常显著地减小之外，这可能是因为它的抗胆汁淤积作用(图6D和6E)。
相反，PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗在6周龄和24周龄的动物中都具有高度显著的治疗效果，如通过所检查的所有读数的严重程度的显著降低来证明(图6A-6E)。正如预期的那样，这与同源TR1样CD4+ T细胞的全身性扩增相关(图6F)。
实例5-疾病抑制需要IL-10、TGFb和CD4+ T细胞
为了确定TR1样pMHC-NP扩增的PDC-E2166-181/IAg7 CD4+ T细胞逆转疾病是否由TR1细胞因子IL-10和/或TGFb介导，我们比较了PDC-E2166-181/IAg7-NP对15周龄NOD.c3c4小鼠(用阻断性抗IL10或抗TGFb mAb或大鼠IgG治疗5周)的免疫和治疗作用。尽管细胞因子阻断没有显著抑制PDC-E2166-181/IAg7特异性TR1样CD4+ T细胞的扩增(图7A)，但与用大鼠-IgG治疗的年龄匹配的NOD.c3c4小鼠相比细胞因子阻断抑制了它们的治疗效果(图7B和7C)。从PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗的NOD.c3c4小鼠中纯化的脾CD4+ T细胞可将疾病抑制作用转移到用来自患病NOD.c3c4小鼠的脾细胞重构的NOD.scid.c3c4宿主中，并且用PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗宿主增强了这种作用，如图7D-7F所示。
实例6-疗法诱导的局部和近端APC的促炎特性的抑制
为了确定PDC-E2166-181/IAg7-NP逆转PBC是否与特异性抑制助长疾病的APC相关，我们比较了从PDC-E2166-181/IAg7-NP和对照NP治疗的动物分离的门脉(引流)相比于肠系膜(非引流)淋巴结CD11b+细胞以及肝枯否细胞的细胞因子和趋化因子谱。来自对照NP治疗的动物的门脉淋巴结的LPS激发的CD11b+细胞比它们的肠系膜淋巴结对应物分泌显著更高水平的多种促炎细胞因子和趋化因子(图7G)。相反，PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗的小鼠的门脉淋巴结CD11b+细胞比它们的肠系膜淋巴结对应物和从对照NP治疗的动物分离的CD11b+细胞分泌显著更低水平的这类促炎介质(图7G)。同样，从PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗的小鼠的肝分离的枯否细胞分泌显著更低水平的一些这些介质(图7H)。因此，用PBC相关的pMHC II类NP治疗NOD.c3c4小鼠中的PDC-E2特异性TR1 CD4+细胞的全身性扩增与局部和近端APC类型的促炎特性的显著抑制有关，可能是由于肝衍生的PDC-E2自身抗原物质的摄取增加。
实例7-PBC相关的纳米药物促进调节性B细胞的局部形成
胰腺β细胞特异性TR1 CD4+ T细胞促进B细胞募集到胰腺及其引流淋巴结，以及促进产生抗糖尿病IL-10的调节性B细胞的局部形成。为了确定在PBC情况下PDC-E2特异性TR1CD4+ T细胞是否也是如此，我们调查了PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗的小鼠的肝、门脉和肠系膜淋巴结中B细胞和PDC-E2166-181/IAg7特异性TR1细胞的绝对数之间是否存在统计学上显著的相关性。PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗的小鼠的肝和门静脉，但不是肠系膜淋巴结，具有比来自对照NP治疗的动物的那些显著更高数量的PDC-E2166-181/IAg7-四聚体+细胞和B-细胞(图7I)。肝和门脉淋巴结中四聚体+和B-细胞数呈统计学上相关；在PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗的小鼠的肠系膜淋巴结中没有看到这种相关性(图7J)。因此，同源TR1细胞向PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗的小鼠肝和肝引流淋巴结的增强的募集促进了B细胞的局部积聚。
为了确定PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗的小鼠肝和门脉淋巴结B细胞是否可以富集调节性B细胞，我们比较了相应的B细胞应答于LPS刺激而产生IL-10的能力。PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗的小鼠肝和门脉(但不是肠系膜)淋巴结B细胞产生显著水平的IL-10；对照NP治疗动物的肝和门脉淋巴结B细胞均不产生IL-10(图7K)。因此，TR1 CD4+ T细胞B细胞到肝和引流淋巴结的增强的募集与产生IL-10的B细胞的局部形成相关。
为了进一步证实TR1细胞募集与调节性B细胞形成之间的直接关系，我们确定了积聚在PDC-E2166-181/IAg7治疗的小鼠的脾、肝和门脉淋巴结(但不是肠系膜淋巴结)中的PDC-E2166-181/IAg7特异性TR1细胞促进PDC-E2166-181肽脉冲的常规(IL-10/eGFP-)B-细胞从NOD.Il10-eGFP报告小鼠分化为CD1d高/CD5+/eGFP+后代的能力。如图7K-7M所示，脾、肝和门脉淋巴结(含同源TR1细胞)中有明显的调节性B细胞形成，但肠系膜淋巴结(缺乏同源TR1细胞)中没有。当综合考虑时，这些结果表明PDC-E2特异性TR1细胞促进常规B细胞募集和分化为调节性B细胞样细胞。
实例8-保留全身性免疫
为了确定PDC-E2166-181/IAg7特异性TR1细胞的持续扩增是否导致全身免疫的抑制，我们比较了PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗的NOD.c3c4小鼠的以下能力：清除全身性痘苗病毒感染，对致死性流感感染产生效应T细胞应答，对细胞内细菌感染(李斯特菌)产生保护性免疫，以及对同种异体肿瘤肝转移产生局部免疫应答。NOD.c3c4小鼠队列接受双周剂量的PDC-E2166-181/IAg7-NPS或对照NP，持续9周。疗法结束时，小鼠静脉注射重组痘苗病毒。感染后14天，两个队列的雌性小鼠的卵巢中的病毒滴度在两个队列的小鼠中相似，并且显著低于在感染高峰时发现的病毒滴度，表明pMHC-NP疗法不损害针对病毒感染的细胞的细胞免疫(图8A)。
为了进一步探讨这一点，我们用流感病毒HKx31(H3N2)的实验室毒株通过腹腔注射感染PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗或未治疗的NOD.c3c4小鼠，以诱导针对通过鼻内途径给予的H1N1流感毒株(PR8)的随后潜在致命性感染的异源免疫，所述H1N1流感毒株具有MHC I类限制性表位。如图8B和8C所示，治疗和未治疗的小鼠针对PR8感染具有保护性免疫，如肺组织中的病毒载量和活动性感染的临床体征所证明的。
在感染细胞内病原体单核细胞增生李斯特菌(LM)的小鼠中也获得了类似的结果，这种病原体通常不引起慢性感染。LM感染的PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗的和未治疗的NOD.c3c4小鼠在清除脾和肝的细菌方面同样有效，这与针对这种细胞内病原体的未受损免疫力一致(图8D)。
PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗的和未治疗的NOD.c3c4小鼠在用半抗原-载体缀合物DNP-钥孔戚血蓝蛋白(KLH)免疫后也产生类似滴度的抗二硝基苯(DNP)抗体(图8E)。
最后，与未治疗的NOD.c3c4小鼠或同系宿主(分别为Balb/c和C57BL/6J)相比，抑制PBC的PDC-E2特异性TR1样CD4+ T细胞的全身性扩增和肝积聚(图8F和8L)并不损害经治疗的NOD.c3c4小鼠对脾内注射后引起的同种异体结肠癌(CT26)和黑色素瘤(B16)肝转移产生免疫应答的能力(图8F-8K和8L-8Q)。因此，尽管靶向遍在表达的抗原，PDC-E2166-181/IAg7特异性TR1细胞并不损害针对外来抗原或肿瘤抗原的免疫力。
实例9-具有PBC的人源化小鼠
在一些研究中，DRB4*0101和DRB1*0801与PBC相关。为了确定PBC中的HLA单倍型多样性，我们对154例西班牙PBC患者进行了高分辨率HLA-DRB1分型。40.3％的患者表达DRB1*0701，25％表达DRB1*0301+，14％表达DRB1*0801+。由于DRB1*0701+和携带其他DRB1等位基因的单倍型携带寡态HLA-DRB4基因座，我们也对这些患者进行了DRB4*0101分型。所有PBC患者中的61.7％携带DRB4*0101等位基因。
已经描述了来自PDC-E2与这些HLA-DRB类型中的两种(DRB4*0101和DRB1*0801)结合的若干个T细胞表位，包括PDC-E2249-262(GDLLAEIETDKATI；DRB4*0101-结合物)、PDC-E2122-135(GDLIAEVETDKATV；也是DRB4*0101-结合物)、PDC-E2249-263(GDLLAEIETDKATIG；DRB1*0801)和PDC-E2629-643(AQWLAEFRKYLEKPI；DRB1*0801)。因此，我们表达并纯化了PDC-E2122-135/DRB4*0101、PDC-E2249-262/DRB4*0101和PDC-E2629-643/DRB1*0801复合物，并产生了展示这些复合物中每一个的氧化铁纳米颗粒，如所述。
为了探讨上述观察的转化意义，我们测试了这三种人PBC相关的pMHC II类NP在用来自11名DRB4*0101+和5名DRB1*0801+PBC患者的PBMC重构的NOD.scid/Il2rg-/-(NSG)宿主(PBL-NSG小鼠，表2、3和4)中扩增同源TR1样CD4+ T细胞的能力。然后对输注PBMC的NSG宿主进行8-10剂量的20μg pMHC-NP静脉内治疗(每周两次，持续5周)。一只小鼠没有移植，另外三只在治疗终止前死于GvHD。作为对照，我们输注第二小鼠/供体，并用对照(非pMHC包衣的NP)处理。在脾、肝、门脉/腹腔和腋窝淋巴结中分析同源CD4+ T细胞的扩增。相比于未治疗的对照组，我们在所有用PDC-E2122-135/DRB4*0101-NP治疗的6/6PBL-NSG小鼠，用PDC-E2249-262/DRB4*0101-NP治疗的5/6PBL-NSG小鼠和用PDC-E2629-643/DRB1*0801-NP治疗的4/5PBL-NSG小鼠的脾和/或肝和LN中看到四聚体+CD49b+LAG-3+CD4+ T细胞扩增(表2、3、和4)。经治疗的应答小鼠在脾、肝和淋巴结(图9A和9B)中的四聚体+细胞的百分比和绝对数量显著高于对照NP治疗的小鼠或无应答小鼠，并且这些细胞表达TR1标记物CD49b和LAG-3(图9C)。
表2
Figure BDA0002601207220000741
表3
Figure BDA0002601207220000751
表4
Figure BDA0002601207220000752
Figure BDA0002601207220000761
实例10-疾病相比于器官特异性
鉴于与较小的器官(如内分泌胰腺)相比，肝等器官具有较大的自身抗原负荷并且PDC-E2是一种在几乎所有细胞类型中表达的自身抗原，我们的结果提出了以下问题：PBC相关纳米药物(即PDC-E2166-181/IAg7-NP)是否是疾病(PBC)或器官(肝)特异性的，还是也能够钝化肝远端自身免疫性炎症。
原发性硬化性胆管炎(PSC)是一种慢性胆汁淤积性疾病，以肝内外胆管炎症为特征，导致纤维闭塞性胆管炎，具有中、大胆管周围管周纤维化和胆管上皮退行性改变，这进展为门脉性和胆汁性肝硬化，最终肝硬化。人类PSC常与炎症性肠病相关，并伴有高发的非典型核周抗中性粒细胞胞浆(pANCA)，但不伴有抗线粒体自身抗体。参见Fickert,P.等人Characterization of animal models for primary sclerosing cholangitis(PSC)[原发性硬化性胆管炎(PSC)动物模型的表征].J.Hepatol.[肝病杂志]60,1290-1303。Abcb4基因敲除小鼠自发形成一种硬化性胆管炎形式，其与人PSC非常相似并且由以下引发：胆汁磷脂分泌受损导致胆管细胞受损。参见Pollheimer,M.J.&Fickert,P.Animal models inprimary biliary cirrhosis and primary sclerosing cholangitis.[原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎的动物模型]Clin.Rev.Allergy Immunol.[过敏免疫学临床综述]48,207-217,doi:10.1007/s12016-014-8442-y(2015)。
自身免疫性肝炎(AIH)的特征是门脉单核细胞浸润肝实质，这与抗核和/或平滑肌(AIH 1型)或抗肝肾微粒体或抗肝胞浆1型自身抗体的存在有关，这些抗体分别特异性地靶向微粒体细胞色素P450IID6(CYP2D6)或甲酰亚胺转移酶环化脱氨酶(FTCD)(AIH 2型)。参见Longhi,M.S.等人Aetiopathogenesis of autoimmune hepatitis.[自身免疫性肝炎的发病机理]J.Autoimmun.[自身免疫杂志]34,7-14。最近的研究表明，用编码人肝自身抗原甲酰亚胺转移酶环化脱氨酶(Ad-FTCD)的复制缺陷型腺病毒感染NOD小鼠引发类似AIH 2型的慢性自身免疫性肝炎。参见Hardtke-Wolenski,M.等人Genetic predisposition andenvironmental danger signals initiate chronic autoimmune hepatitis driven byCD4+ T cells[遗传易感性和环境危险信号启动CD4+ T细胞驱动的慢性自身免疫性肝炎]Hepatology[肝病]58,718-728。
导致PSC和AIH的大胆管和肝实质损害可触发PDC-E2的释放和能够对PDC-E2166-181/IAg7-NP疗法应答的同源自身反应性CD4+ T细胞的引发。如果是这样，疗法应触发TR1样PDC-E2166-181/IAg7特异性CD4+T细胞的扩增，并在识别局部和近端PDC-E2负载的APC后抑制局部炎症。可替代地，在PSC和/或AIH中脱落到炎症环境中的PDC-E2的量可能不足以产生经历PDC-E2166-181/IAg7的CD4+ T细胞，因此不足以产生对PDC-E2166-181/IAg7-NP的免疫和治疗应答。
为了验证这些可替代的可能性，我们首先研究了PDC-E2166-181/IAg7-NP在NOD.Abcb4-/-小鼠中触发同源TR1样CD4+ T细胞扩增和逆转PSC的能力。值得注意的是，与对照NP治疗的对照相比，PDC-E2166-181/IAg7-NP触发了这些动物中同源TR1样CD4+ T细胞的全身性扩增，并逆转了已建立的疾病，如图10A-10B和11A和11B所示。
接下来，我们调查了在Ad-FTCD诱导的AIH中是否也是如此。我们比较了mFTCD58-72/IAg7-NP和CYPD398-412/IAg7-NP(AIH相关)与PDC-E2166-181/IAg7-NP(PBC相关)在AD-FTCD感染的NOD小鼠体内的药效学和治疗活性。所有三种化合物以与未经处理的Ad-FTCD感染的动物相比类似的程度(图10C和图12A和12B)触发这些动物中同源TR1样CD4+T细胞的形成和扩增，并且这伴随着肝炎症(如图10C和10D中所示)和血清ALT水平(如图10E所示)的显著降低。
在用CYPD398-412/IAg7-NP治疗的NOD.c3c4小鼠中也出现了这种基于遍在自身抗原的pMHC-纳米药物以器官而非疾病特异性的方式钝化肝自身免疫的能力(图13A-13C)。事实上，后者与PDC-E2166-181/IAg7-NP在扩增同源TR1细胞(图13A)和在15周龄小鼠中钝化PBC(图13B)方面同样有效。相反，PDC-E2166-181/IAg7-NP和CYPD398-412/IAg7-NP都没有触发10周龄糖尿病前期NOD小鼠中的同源TR1 CD4+ T细胞的扩增(图13C)，这与β细胞特异性BDC2.5/IAg7-、IGRP4-22/IAg7-或IGRP128-145/IAg7-NP的情况不同，推测是因为β细胞中的PDC-E2和CYPD含量不足以引发同源CD4+ T细胞的激活。
总之，这些观察表明，丰富水平的PDC-E2(线粒体)、CYPD2D6和FTCD抗原(分别是高尔基体驻留的或胞浆的)在肝细胞(AIH)或胆管上皮细胞损伤(PBC和PSC)后被递送到局部和近端APC，使得自身反应性CD4+ T细胞引发、由pMHC-NP产生同源TR1细胞以及抑制局部和近端自身抗原负载的APC成为可能。
实例11-在另一PBC模型中的治疗作用
NOD.c3c4模型并没有完全重现人PBC的免疫病理学，所述人PBC的免疫病理学特征是女性患病率、进展到肝纤维化和没有肝囊肿形成。携带IFNγ3'-非翻译区富含腺苷酸尿苷酸的元件(ARE)缺失(ARE-Del+/-)的B6小鼠具有失调的Ifng基因座，并发展形成PBC形式，其与人疾病类似，主要影响雌性，并且与TBA上调、抗PDC-E2自身抗体的产生、门脉管和小叶肝炎症、胆管损伤、肉芽肿形成和纤维化相关。图14A-C显示，与用对照NP治疗小鼠相比，用PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗(NODxB6.ARE-Del-/-)F1小鼠抑制了TBA和ALT水平的上调、肝炎症和纤维化。
实例12-遍在自身抗原pMHCII-NP尽管含有PDC-E2自身反应性TR1样CD4+ T细胞，但保留了全身免疫。
用流感病毒(HKx31-H3N2-)的实验室毒株通过腹腔注射感染PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗或未治疗的NOD.c3c4小鼠，以诱导针对通过鼻内途径给予的H1N1流感毒株(PR8)的致命性感染的异源免疫。尽管如图15A所示全身存在同源TR1样CD4+ T细胞，但如图8B-8C所示，如肺组织中的病毒载量和活动性感染的临床体征所证明的，pMHCII-NP治疗的NOD.c3c4小鼠针对PR8感染具有保护性免疫。
在感染细胞内病原体单核细胞增生李斯特菌(LM)的小鼠中也获得了类似的结果。LM感染的PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗的和未治疗的NOD.c3c4小鼠在清除脾和肝的细菌方面同样有效(如图8D所示)，这与针对这种细胞内病原体的未受损免疫力一致(如图15B所示)。
实例13-遍在自身抗原pMHC-NP治疗小鼠EAE
一个尚未回答的问题是，这些展示来自遍在抗原的表位的肝病相关纳米药物是肝特异性的，或可替代地，也能钝化肝外自身免疫。为了研究这一点，比较PDC-E2166-181/IAg7-NP和CYPD398-412/IAg7-NP(展示遍在表位)相比于BDC2.5/IAg7-NP(展示β细胞特异性表位)和MOG36-50/IAg7-NP(展示中枢神经系统特异性表位)的能力，以观察是否有任何一种能够钝化MOG36-55诱导的NOD小鼠中EAE的复发-缓解形式。BDC2.5/IAg7-NP在这些动物中(在血液和脾中)扩增同源TR1样CD4+ T细胞，其程度与它们在未受EAE影响的NOD小鼠中的扩增程度相似，但是这些细胞在CNS引流的颈淋巴结(CLN)中不存在(图16B)，并且不具有抗致脑炎活性，如图16C所示(少突胶质细胞不表达嗜铬粒蛋白A)。
值得注意的是，CYPD398-412/IAg7-NP和PDC-E2166-181/IAg7-NP也在这些小鼠中触发同源TR1样细胞扩增(图16B)，但与BDC2.5/IAg7-NP不同，抑制CNS炎症和脱髓鞘以及EAE复发的进展和严重程度(图16C、16D和16E)。这与CLN中同源TR1样细胞的积聚有关，如图16A所示。重要的是，这些作用不是NOD遗传背景特异性的，因为它们也见于用以下基于CYPD和PDC表位/IAb的纳米药物治疗的C57BL/6小鼠：与Cys-NP和MOG36-49/IAb-NP(分别为阴性和阳性对照)相比，PDC94-108/IAb-NP和CYPD353-367/IAb-NP扩增了血液、脾和CLN中的同源TR1样CD4+ T细胞(图17A和B)，并且钝化了这些小鼠中MOG35-55诱导的EAE的慢性形式的进展，如图17C和D所示。
总之，这些观察表明，在少突胶质细胞损伤(在EAE中)后，显著水平的两种不同的遍达自身抗原PDC-E2和CYPD2D6被递送到局部和近端APC，使得自身反应性CD4+ T细胞引发，由pMHC-NP产生同源TR1细胞，这些TR1细胞在CNS引流淋巴结中募集和积聚，并且抑制局部炎症。
实例14-β细胞凋亡诱导使NOD小鼠对遍在自身抗原pMHC-NP应答
用PDC-E2166-181/IAg7-NP(PBC相关)和CYPD398-412/IAg7-NP(AIH相关)治疗糖尿病前期的10周龄NOD小鼠没有触发相对于内源性BDC2.5/IAg7特异性CD4+ T细胞的同源TR1样CD4+ T细胞在血液(图18A)或受检的任何器官包括肝脏(图18B)中的扩增，如用pMHC四聚体测量。
这些结果表明，糖尿病前期NOD小鼠中的自发β细胞杀伤不触发经历PDC-E2或CYPD自身抗原的T细胞的形成，所述T细胞能够对相应的纳米药物产生应答。有三种可替代的可能性可以解释这些结果：1)这些抗原从胆管细胞和肝细胞释放(在肝自身免疫性疾病中)，但不从死亡的β细胞释放(在T1D中)；2)抗原从NODβ细胞释放，但NOD小鼠不输出能够对这些遍在自身抗原作出应答的同源自身反应性T细胞；或3)抗原从β细胞释放，并且小鼠含有同源自身反应性T细胞，但释放的抗原量不足以引发这些T细胞。
为了区分上述三种可能性，我们在非糖尿病雌性NOD小鼠的胰腺β细胞中表达了X染色体连锁的、大鼠胰岛素启动子驱动的人白喉毒素受体(hDTR)转基因。然后用DT处理这些小鼠，以同时杀伤50％的β细胞(由于X染色体失活，只有50％的β细胞表达hDTR)。然后，我们用PDC-E2166-181/IAg7-NP、CYPD398-412/IAg7-NP(肝脏自身免疫相关)、BDC2.5/IAg7-NP(T1D相关，阳性对照)、MOG36-50/IAg7-NP(中枢神经系统自身免疫性疾病特异性，阴性对照)或Cys包被的NP(阴性对照)治疗DT治疗和未治疗的小鼠，并使用pMHC四聚体计数脾、肝引流淋巴结(门脉和腹腔LN，PCLN)和胰腺LN(PLN)中同源自身反应性T细胞的存在。正如预期的那样，MOG36-50/IAg7-NP在这些小鼠中不触发同源四聚体+CD4+T细胞的扩增(MOG是一种少突胶质细胞特异性蛋白，其不在胰腺β细胞中表达)(图18C，右下面小图)。相反，PDC-E2166-181/IAg7-和CYPD398-412/IAg7-NP都触发了DT治疗的小鼠的脾和PLN中表达TR1标记物LAG3、LAP和CD49b的显著数量的同源四聚体+CD4+ T细胞的扩增和积聚，其程度与BDC2.5/IAg7-NP治疗的动物中的BDC2.5/IAg7四聚体+ T细胞所见的程度相似(图18C，左下小图和上小图，以及图18D)。
这些发现证实了我们以前的观察，即pMHC-NP诱导的TR1细胞的形成和扩增需要经历自身抗原的T细胞的存在，这类细胞的引发需要抗原从表达的细胞类型脱落，以及NOD小鼠的外周储库通常具有靶向遍在表达的抗原的原初CD4+T细胞特异性。
实例15-遍在自身抗原pMHC-NP在诱导的银屑病小鼠模型中抑制银屑病的体征
在银屑病相关小鼠模型-咪喹莫特(IMQ)诱导模型中检测了遍在自身免疫性疾病相关的pMHC-NP的能力。该小鼠模型是临床前银屑病研究中应用最广泛的小鼠模型之一。NOD/Ltj小鼠用5％的IMQ局部治疗6天，休息8天。第一次应用在小鼠的背部，随后应用在耳朵上。在第二次应用于耳朵上之后开始给小鼠施用PDC-E2166-181/IAg7-或CYPD398-412/IAg7-NP。根据PASI(银屑病面积和严重程度指数)标准对小鼠进行银屑病症状分析，所述标准测量红斑、鳞屑和皮肤厚度；检测小鼠脾、颈淋巴结(CV LN)和肝腹腔淋巴结(HC LN)中PDC和CYPD四聚体+CD4 T细胞的扩增。如图19A所示，PDC-E2166-181/IAg7在本模型中扩增，表明这些细胞是由IMQ处理诱导的炎症所引发的。图19B显示，通过用PDC-E2166-181/IAg7-或CYPD398-412/IAg7-NP治疗，耳厚度得到改善，同时没有鳞屑和红斑(未显示)。这些实验是初步的，但表明不同的自身免疫性/炎症性疾病模型针对能够被遍在自身抗原相关的pMHC-NP修饰的遍在自身抗原引发T细胞。
实例16-选择本文使用的方法
小鼠
NOD/LtJ、BALB/c、C57BL/6、NOD.scid.Il2rg-/-(NSG)、NOD.c3c4和FVB/N.Abcb4-/-(Abcb4或ATP-结合盒转运体，亚家族B，成员4)小鼠购自杰克森实验室(JacksonLaboratory)(巴尔港(Bar Harbor)，缅因州)。从H.Young(NIH，贝塞斯达(Bethesda)，马里兰州)获得IFNγARE-Del-/-B6小鼠。用(NOD.c3c4 x NOD.scid)F1小鼠与NOD.c3c4小鼠回交五代，然后将scid突变杂合并且B6染色体3和4区间(来自NOD.c3c4小鼠)纯合的小鼠互交，得到NOD.c3c4.scid小鼠。将来自FVB/N-Abcb4-/-小鼠的突变Abcb4等位基因回交到NOD/Ltj背景上6代，然后进行互交，获得NOD.Abcb4-/-小鼠。(NODxB6.IFNg ARE-Del-/-)F1小鼠通过IFNγARE-Del-/-和NOD/LtJ小鼠互交产生。通过将来自C57BL/6.Il10tm1Flv小鼠(杰克森实验室)的Il10tm1Flv等位基因回交到NOD/Ltj背景上10代获得NOD.Il10tm1Flv(泰格公司(Tiger))小鼠。通过将来自转基因B6小鼠的X染色体连锁的、大鼠胰岛素启动子驱动的人白喉毒素受体(RIP-DTR)转基因回交到NOD背景中10代以上获得RIP-DTR.NOD转基因小鼠。
细胞系、病原体和肿瘤
CHO-S、BSC-1、MDCK、293T、B16/F10和CT26细胞系购自ATCC(马纳萨斯(Manassas)，弗吉尼亚州)。单核细胞增生李斯特菌从DMX公司(费城，宾夕法尼亚州)获得。
抗体与流式细胞术
抗小鼠CD4(RM4-5)、CD5(53-7.3)、CD19(1D3)、B220(RA36B2)和CD49b(HMa2)的FITC、PE、APC、PerCP或生物素缀合的mAb和链霉亲和素-PerCP购自BD生物科学公司(BDBiosciences)(圣地亚哥，加利福尼亚州)。抗鼠LAG-3mAb(C9B7W)购自e生物科学公司(eBioscience)(圣地亚哥，加利福尼亚州)。抗潜伏相关的TGF-β(LAP)抗体(TW7-16B4)来自生物传奇公司(BioLegend)(圣地亚哥，加利福尼亚州)。用生物素化的pMHC单体制备了PE缀合的pMHC II类四聚体。pMHCⅡ类四聚体染色和表型标记物分析基本上按照所述进行，但稍作修改。简单地说，在亲和素孵育(在室温下15分钟)后，血液白细胞以及来自脾、淋巴结、肝单核细胞和骨髓细胞的单细胞悬液首先用pMHC四聚体(5μg ml-1)在FACS缓冲液(0.05％叠氮化钠和在PBS中的1％FBS)中在37℃下染色60min，然后用FITC缀合的抗小鼠CD4(5μg ml-1)和PerCP缀合的抗小鼠B220(2μg ml-1；作为‘转储(dump)’通道)在4℃下染色30min。洗涤后，固定细胞(在PBS中的1％多聚甲醛)并用FACScan、FACSaria或BD LSRII流式细胞仪分析。为了进行表型分析，细胞与抗FcR Ab孵育，然后用在FACS缓冲液中1:100稀释的细胞表面标记物抗体(对于抗CD49b和抗LAP Ab在4℃，对于抗LAG-3Ab在37℃)染色，然后用pMHC四聚体、FITC缀合的抗小鼠CD4(5μg ml-1)和PerCP缀合的抗小鼠B220染色。染色后，将细胞洗涤、固定、并通过流式细胞术进行分析。所有分析均采用FlowJo软件。
使用以下mAb分析NSG植入的人T细胞：FITC缀合的抗CD4(OKT4，生物传奇公司)，APC缀合的抗CD19(HIB19，BD生物科学公司，圣何塞，加利福尼亚州)，PerCP缀合的多克隆山羊抗LAG-3 IgG(R&D系统公司(R&D Systems)，明尼阿波利斯(Minneapolis)，明尼苏达州)，生物素缀合的抗CD49b(AK7，皮尔斯抗体公司(Pierce Antibodies)，赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马塞诸塞州)和eFluor 450缀合的链霉亲和素(e生物科学公司)。简单地说，脾细胞和胰腺淋巴结细胞在室温下与亲和素(0.25mg ml-1，在FACS缓冲液中)孵育30min，洗涤并用四聚体(5μg ml-1)在37℃下染色1小时，洗涤并与FITC缀合的抗CD4(2/100)、APC缀合的抗CD19(5/100；用作‘转储’通道)、PerCP缀合的抗LAG-3(8/100)和生物素缀合的抗CD49b(4/100)在4℃下孵育45min。洗涤后，将细胞与eFluor 450-缀合的链霉亲和素在4℃温育30min，洗涤，在PBS中的1％PFA中固定，并用FACSCanto II(BD生物科学公司)分析hCD4+/hCD19-门内的细胞。
pMHC单体和肽
从编码单顺反子信息的慢病毒转导的CHO-S细胞上清液中纯化重组pMHC II类单体，其中复合物的肽-MHCb和MHCa链被核糖体跳跃P2A序列分开。所述肽通过柔性GS接头拴在MHCb链的氨基末端，并且工程改造了MHCa链，在其羧基末端编码BirA位点、6xHis标签、双链霉亲和素标签和游离Cys。通过连续镍和Strep-
Figure BDA0002601207220000831
色谱纯化分泌的、自组装的pMHCII类复合物，并用于包被到NP上或如上所述处理用于生物素化和四聚体形成。使用RANKPEP(http://imed.med.ucm.es/cgi-bin/rankpep_mif.cgi)，以7.54作为阈值得分，基于预测的MHCII结合能力选择鼠单体构建体中编码的表位。PDC-E2166-181的得分低于阈值，但被选择用于实验，因为它包含在PDC-E2(AMA的抗原靶标)的脂酰结合结构域中。对于CYPD和FTCD表位预测，我们使用第二种在线算法(GPS-MBA)(http://mba.biocuckoo.org/)，并选择RANKPEP和GPS-MBA预测的肽段进行实验。hPDC-E2122-135、hPDC-E2249-262(均包含在PDC-E2的脂酰结合结构域内)和hPDC-E2629-643已经在前面描述过。不同表位的序列如下：PDC-E2166-181/IAg7(LAEIETDKATIGFEVQ)、PDC-E282-96/IAg7(EKPQDIEAFKNYTLD)、FTCD58-72/IAg7(VVEGALHAARTASQL)、CYPD398-412/IAg7(LITNLSSALKDETVW)、2.5mi/IAg7(AHHPIWARMDA)、hPDC-E2122-135/DRB4*0101(GDLIAEVETDKATV)、hPDC-E2249-262/DRB4*0101(GDLLAEIETDKATI)和hPDC-E2629-643/DRB1*0801(AQWLAEFRKYLEKPI)。合成的PDC-E2166-181、2.5mi、和mMOG36-55(EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)肽购自金斯瑞公司(Genscript)(皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州)。每个肽的氨基酸残基数与相应抗原的成熟形式中发现的氨基酸残基数相对应。
纳米颗粒、pMHCII-NP合成和纯化
将pMHC包被在聚乙二醇化的氧化铁NP(PFM-NP)(如所述(2)制备)上。简单地说，通过在2kD甲氧基-PEG-马来酰亚胺存在下Fe(acac)3的热分解得到PFM-NP。使用磁性(MACS)柱(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)，奥本(Auburn)，加利福尼亚州)纯化NP。在40mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0，含2mM EDTA，150mM NaCl)中，将游离半胱氨酸(对照)或携带游离羧基末端Cys的pMHC与马来酰亚胺官能化的PFM在室温下缀合过夜。使用磁柱将pMHC缀合的NP与游离pMHC分离，通过0.2μm过滤器过滤灭菌，并在4℃的水或PBS中储存。用透射电镜、动态光散射、以及天然凝胶电泳和变性凝胶电泳进行质量控制。采用Bradford测定(赛默飞世尔科技公司)和SDS-PAGE测量pMHC含量。
表达FTCD的腺病毒的产生
利用In-
Figure BDA0002601207220000841
HD克隆技术和Stellar感受态细胞(克隆技术公司(Clontech)，山景城(Mountain View)，加利福尼亚州)将hFTCD DNA序列直接克隆到Adeno-X腺病毒系统3(CMV)中，获得表达人甲酰亚胺转移酶环化脱氨酶(Ad-hFTCD)(以AIH 2型的靶自身抗原)的复制缺陷型腺病毒。克隆的Ad-FTCD在Ad-293 T细胞中扩增，用Adeno-X Maxi纯化试剂盒(克隆技术公司)纯化。用终点稀释测定或Adeno-X快速滴度试剂盒(克隆技术公司)测量病毒滴度。
熊去氧胆酸治疗
将5-6或24周龄的雄性和/或雌性NOD.c3c4小鼠的队列不予治疗，饲喂补充有0.5％UDCA的饲料(BOC科学公司(BOC Sciences)，厄普顿(Upton)，纽约州；试验饲料公司(TestDiet)，里士满(Richmond)，印第安那州)，或分别用pMHCII-NP治疗14或9周，并处死进行pMHCII四聚体染色、PBC评分和生化测试。
在NOD.c3c4、(NOD x B6.IFNg ARE-Del-/-)F1和NOD/Ltj小鼠中的pMHCII-NP疗法
除非另有说明，否则将具有已建立PBC的15周龄雄性和/或雌性NOD.c3c4小鼠的队列不予治疗，或每周两次用20mg pMHCII-NP或Cys-NP(i.v.)治疗9周。肝病评分包括对囊肿含量(0-5)、肝重量和CBD直径(0-4)的宏观评估，以及对胆管受累(0-4)、胆管增生(0-4)和单核细胞浸润(0-4)的微观评估，基本如所述(23)。在其他实验中，治疗开始于疾病的高峰(年龄24周)，每周给予两次，持续14-20周。间歇治疗包括在15-24周龄期间每周治疗小鼠两次，然后取消治疗，直到四聚体+细胞的百分比下降到治疗取消时所见水平的约50％(在外周血中的测量每两周进行一次)，再治疗小鼠，每周两次，直到四聚体+细胞的百分比达到原始值，并重复此周期直到50周龄。
在体内细胞因子阻断实验中，每周两次腹腔内注射针对HRPN(rIgG1)、IL-10(JES5-2A5)或TGF-β(1D11)(BioXcell，West Lebanon，NH)的mAb，每剂量500mg，持续2周，然后每剂量200mg，持续7周。将小鼠随机化进入细胞因子中和mAb治疗组(抗IL-10或TGFβ)或HRPN大鼠IgG1组。
在涉及(NOD x B6.IFNg ARE-Del-/-)F1小鼠的实验中，10周龄的雄性和雌性小鼠被治疗5-6周。肝组织病理学评分按上述进行。简单地说，严重程度得分通过对门脉炎症，小叶炎症和肉芽肿形成从0-4评分，以及胆管损伤从0-2评分来获得。门脉炎症和胆管损伤的程度根据病变面积与未病变面积之比从0-4进行评分。小叶炎症和肉芽肿形成的程度根据每个样本的病变数目从0-4进行评分。纤维化的严重程度以0-6级进行评分。
使用NOD小鼠的研究涉及静脉内施用20mg pMHCII-NP或Cys-NP每周两次持续共5周来治疗10周龄糖尿病前期雌性NOD/Ltj小鼠队列。
针对NOD.c3c4小鼠中EAE的pMHCII-NP疗法
在异氟烷麻醉下尾基部以上的侧翼区域的任一侧，皮下施用在CFA中的250mgpMOG36-55来免疫12-14周龄的雄性和雌性NOD.c3c4小鼠。小鼠在相对于肽免疫的第0天和第2天静脉内接受百日咳毒素350ng。小鼠在免疫后第0天称重并评分，然后从第14天开始每天称重并评分，并以5分标度绘制得分。在免疫第32天，所有得分<3的小鼠被随机化就用Cys-NP或pMHCII-NP治疗。所有小鼠每周治疗2次，持续9周。如上所述对小鼠进行PBC体征评分。
针对NOD.Abcb4-/-小鼠中PSC的pMHCII-NP疗法
将具有已建立PSC的5-6周龄雄性和/或雌性NOD.Abcb4-/-小鼠的队列每周两次用20mg pMHCII-NP或Cys-NP(i.v.)治疗5-6周。组织病理学病变采用Ishak评分系统进行分级，所述评分系统评估胆道性胆管炎的纤维化(0-6)和坏死性炎症后遗症，包括界面肝炎(0-4)、融合坏死(0-6)、小叶炎症(0-4)和门脉炎症(0-4)。
针对NOD小鼠中AIH的pMHCII-NP疗法
通过用编码人FTCD的腺病毒(Ad-hFTCD，1010个斑形成单位(PFU)i.v.)感染5-6周龄雌性NOD/Ltj小鼠，来诱导AIH。4周后，每周两次用20mg的pMHCII-NP或Cys-NP(i.v.)治疗具有已建立的AIH的小鼠队列，持续共5-6周。组织病理学评分采用上述Ishak评分法进行。
人PBMC重构的NSG宿主中的pMHCII-NP疗法
将来自HLA-DRB4*0101+PBC患者的PBMC使用抗CD8 mAb包被的磁珠(美天旎生物技术公司，奥本，加利福尼亚州)耗减CD8+ T细胞，并静脉注射(2x107)进入8-10周龄的NSG宿主中。从PBMC输注后第5天开始，用30-40mg pMHC-NP对小鼠进行治疗，每周两次，持续5周，或不予治疗。在肝、外周LN、脾和骨髓(未显示)中测量疗法诱导的同源CD4+ T细胞扩增。如果至少两个不同器官中的四聚体+T细胞百分比高于未治疗宿主的平均±10标准差值，则小鼠被认为是应答者。
一般适应性免疫的评估
将pMHCII-NP治疗的雌性小鼠和未治疗的雌性小鼠静脉内注射2x106PFU重组痘苗病毒(rVV)，并且分别于感染后第4天和第14天处死。对样品进行pMHCII四聚体染色和rVV滴度测量。简言之，在含有2％FBS的DMEM中收集两者的卵巢，均质化，冻融3次，然后超声处理(3轮，每轮20秒)。将裂解物的系列稀释液在37℃下加入汇合的BSC-1细胞培养物中持续1h，用无血清DMEM洗涤两次，然后用含有2％FCS和0.4％羧甲基纤维素(CMC；西格玛公司(Sigma)，圣路易斯(Saint Louis)，密苏里州)的DMEM覆盖。第3天，丢弃覆盖层，用结晶紫染色细胞层，计数斑数量。
为了评估细胞对流感感染的应答，首先将pMHCII-NP治疗和未治的小鼠以106EID50/小鼠腹腔内施用HKx31(H3N2)毒株机进行引发。在引发后7d后处死一个队列的小鼠并进行四聚体染色以确认引发期间存在pMHC-NP特异性TR1样细胞。30d后，在麻醉下用鼻内剂量的PR8病毒(一种致命性H1N1流感毒株(8x104EID50/小鼠)再次感染其他队列的引发的小鼠。PR8-激发的小鼠每天称重，并根据毛皮皱折的程度、运动能力下降、蜷缩的外观以及呼吸急促和/或吃力从0-4进行临床评分。7d后处死小鼠，进行四聚体染色和流感病毒滴度测量。简而言之，将肺收集在无血清的DMEM中，均质化并冻融3次。将裂解物的系列稀释液在RT下加入汇合的MDCK细胞培养物中持续1h并洗涤。培养物用含0.4％CMC的DMEM覆盖2-3天，洗涤，固定，用结晶紫染色计数斑数量。
通过静脉内施用单核细胞增生李斯特菌的103个菌落形成单位(cfu)感染pMHCII-NP治疗和未治疗的小鼠来测定细胞内细菌的细胞免疫。感染后7d或14d处死小鼠，对样品进行四聚体染色和细菌负荷测定。简而言之，将脾和肝切成若干块，称重并在含有0.35％Triton X-100的PBS中均质化。然后将裂解物的系列稀释液铺在含有5mg/ml红霉素的牛心浸液琼脂上，在37℃下孵育24-48h，并计数菌落数。
脾内注射B16/F10黑色素瘤和CT26结肠癌肿瘤到同系(分别为C57BL/6J或Balb/c)或同种异体宿主(pMHC-NP治疗的或未治疗的NOD.c3c4 m小鼠)后，确定对肝转移肿瘤的细胞免疫。在异氟烷吸入麻醉下，在腹部做一个小切口以部分暴露脾。将肿瘤细胞(对于B16/F10和CT26分别为在100mL PBS中0.2x106和0.1x106)缓慢注射1min到暴露的脾中。十分钟后，切除脾，缝合腹膜层和皮肤层。术后5-7d内恢复pMHCII-NP疗法，并持续至随访结束。小鼠被监测至19-21d，并被安乐死以进行四聚体染色、PBC评分和肿瘤负荷测量。在注射B16/F10的小鼠中，通过测量肝重量和计算转移瘤的数量来评估肿瘤负荷，转移瘤与肝实质易于区分。在注射CT26的动物中，通过测量转移瘤占据的肝面积(HPA)，对肿瘤负荷进行组织学评分。
为了评估体液免疫，pMHCII-NP治疗的小鼠和未治疗的小鼠腹腔内施用在CFA中的100mg DNP-KLH(阿尔法诊断国际公司(Alpha Diagnostic International)，圣安东尼奥(San Antonio)，德克萨斯州)进行免疫，并且3周后进行增强。10d后处死小鼠，以使用抗DNPIg ELISA试剂盒(阿尔法诊断国际公司)测量血清抗DNP抗体滴度。
细胞因子分泌测定
来自pMHCII-NP治疗的小鼠的脾和门脉/腹腔淋巴结(PCLN)细胞悬浮液富集CD4+T细胞，耗减CD19+B细胞(EasySepTM小鼠CD19阳性选择试剂盒，干细胞技术公司(Stem cellTechnologies)，温哥华，不列颠哥伦比亚省(Vancouver，BC))和CD8+ T细胞(CD8磁性颗粒，BD生物科学公司)。细胞用pMHCII四聚体染色，并且通过流式细胞仪分选。分选的细胞(2-3x104)用2μg ml-1肽脉冲的骨髓衍生的DC(2x104)激发。48小时后，收集上清液，用于通过
Figure BDA0002601207220000881
测量细胞因子含量。
为了确定pMHCII-NP疗法是否促进分泌IL-10的B细胞的募集/形成，使用CD19富集试剂盒(干细胞技术公司)富集肠系膜LN、PCLN和肝细胞悬浮液中的B细胞。在含10％FCS的RPMI-1640培养基中，用LPS(1μg ml-1，西格玛公司)一式两份地刺激细胞(2-3x105(200mL中)/孔)24h。通过
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测量上清液中IL-10的水平。
淋巴结CD11b+细胞和肝枯否细胞的分离及体外刺激
通过在37℃下在胶原酶D(1.25μg mL-1)和DNA酶I(0.1μg mL-1)中消化15分钟从LN获得CD11b+细胞，洗涤，用抗FcR Ab孵育，并用抗CD11b mAb包被的磁珠(BD生物科学公司)纯化。用LPS(2μg ml-1)刺激纯化的细胞(2-3x105(200mL中)/孔)3天，并且使用
Figure BDA0002601207220000892
多重细胞因子测定来分析上清液中的细胞因子含量。
为了分离枯否细胞(KC)，将治疗和未治疗的小鼠的肝切碎，并在15ml 0.05％胶原酶的HBSS溶液中于37℃消化20-30min。通过尼龙网(0.7μm)过滤所得的细胞悬浮液，并在4℃以50xg离心3min，以去除组织碎片和肝细胞。通过在4℃下以300xg离心5分钟来沉淀上清液中的细胞。将主要由非实质肝免疫细胞、KC、窦内皮细胞和星状细胞构成的细胞沉淀重新悬浮于33％
Figure BDA0002601207220000894
溶液中，并且以350xg离心30min分离单核细胞。将沉淀重悬于含有10％FCS的DMEM中(5x106个细胞ml-1)，并以1-3x107个细胞/孔铺板在6孔板上，并在5％CO2气氛中于37℃孵育2-3h。通过用PBS温和洗涤除去非贴壁细胞。通过胰蛋白酶消化(5min，0.25％胰蛋白酶)收集粘附的级分(富含KC)。将得到的细胞悬浮液以1-2x105/200mL/孔铺板在96孔板中，并用LPS(2mg ml-1)刺激3天。使用
Figure BDA0002601207220000893
多重细胞因子测定来分析上清液中的细胞因子含量。
抑制的过继转移
将来自未治疗的小鼠或经12个剂量的PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗的小鼠的脾CD4+T细胞(107)过继转移(i.v.)进入10-14周龄的性别匹配的NOD.c3c4.scid宿主中。一天后，将接受者用来自具有建立的PBC(>35周龄)的性别匹配的NOD.c3c4供体小鼠的4x107个完整脾细胞进行过继转移。输注了来自pMHCII-NP治疗的供体的CD4+ T细胞的小鼠队列中的一个进一步用12个剂量的PDC-E2166-181/IAg7-NP治疗。6周后处死接受者进行四聚体染色和PBC评分。
体内调节性B细胞诱导测定
用EasySep小鼠B细胞分离试剂盒(干细胞技术公司)富集NOD.Il10tm1Flv(泰格公司)小鼠脾B细胞，并用BDC2.5mi或PDC166-181肽(10μg ml-1)在37℃下脉冲作用2h。经肽脉冲的B细胞用PBS洗涤两次，用PKH26(西格玛公司)标记，并输注(3×106)进入pMHC-NP治疗或未治疗的小鼠。7d后处死宿主，用抗B220-APC和生物素化的抗CD1d或抗CD5 mAb标记其脾、MLN、PCLN和肝单核细胞，然后用链霉亲和素-PerCP标记其脾、MLN，PCLN和肝单核细胞。用流式细胞术分析PKH26+B细胞是否存在eGFP+/CD1d高和eGFP+/CD5+细胞。
组织学和免疫组织化学
肝用10％福尔马林固定2d，石蜡包埋，切成5μm切片，并且用H&E或天狼猩红染色。为了进行免疫组织化学，将肝组织包埋在组织-Tek OCT中，切成30μm冰冻切片，在-80℃储存在载玻片上。载玻片用冷丙酮固定，用PBS洗涤，用1:10稀释的在PBS中的30％H2O2处理，用PBS洗涤，用在PBS中的10％正常山羊血清封闭，再次洗涤，并且用抗小鼠CD4(GK1.5)或CD8(Lyt-2)抗体染色(1.5h，4℃)。洗涤后，载玻片用生物素化的山羊抗大鼠二抗(1:200稀释)染色，与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的链霉亲和素孵育，然后与3,3-二氨基联苯胺(DAB)底物孵育。载玻片在安装前用苏木精复染。
ALT和TBA测定
血清中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平使用赛默飞世尔科技公司的试剂盒按照制造商的方案进行测定。简言之，将血清样品与预先加热的(37℃)InfinityTM ALT(GPT)液体稳定试剂以1:10的比例混合，并在340nm波长，37℃在纳米滴中以1min间隔采集OD读数持续3min。如试剂盒所述，通过使用线性回归绘制吸光度相比于时间来计算斜率，并乘以一个因子以获得血清中的ALT水平(U/L)。按照所述的改进的制造商方案，使用TBA酶促循环测定试剂盒(双酶公司(Diazyme)，博威(Poway)，加利福尼亚州)分析血清总胆汁酸(TBA)水平。
抗核和抗线粒体自身抗体测量
使用NOVA
Figure BDA0002601207220000911
HEp-2载玻片试剂盒(依诺瓦诊断公司(Inova Diagnostics)，圣地亚哥，加利福尼亚州)确定血清中抗核自身抗体(ANA)的存在。采用半定量方法测量ANA滴度。简言之，血清样品在PBS中连续稀释(1:160，1:320，1:640，1:1280和1:2560)，然后加载到预先固定的Hep-2底物载玻片中，洗涤，用含5％正常驴血清(1:200稀释)的PBS中的FITC缀合的山羊抗小鼠IgG染色，洗涤，安装并在荧光显微镜下读取。
通过ELISA测定抗线粒体PDC-E2抗体的血清水平。简而言之，将ELISA板用PDC-E2蛋白(5μg ml-1，100mL)(苏摩迪克公司(SurModics Inc.)，伊甸草原(Eden Prairie,)，明尼苏达州)在室温下包被过夜。洗涤平板，用在PBS中的3％干脱脂乳(pH 7.4，150ml)封闭，并与连续稀释的血清样品(100ml，用试剂稀释剂制备的1:250稀释液)在室温下孵育2h。洗涤孔，与100mL HRP-缀合的抗小鼠IgG(在试剂稀释剂中1:2000)在室温下孵育2h，并洗涤。最后，将孔与100mL DAB底物在黑暗中于室温孵育20分钟。用50mL 2N H2SO4停止酶促反应后，使用ELISA酶标仪在450nm波长处测量吸收。通过计算对照NOD血清样品的平均OD±2SD(阳性指数)，并将对应于NOD.c3c4血清样品的OD值除以所述阳性指数，从而计算阳性抗体活性(PAA)水平，其中值>1.0对应于PAA。
统计分析
除非另有说明，否则图例中提到的样品大小值对应于从不同实验中收集的受检小鼠总数。数据在GraphPad Prism 6中使用曼-惠特尼U-检验、卡方、对数秩(曼特尔-考克斯(Mantel-Cox))、皮尔逊相关，双向ANOVA或使用霍尔姆-西达克(Holm-Sidak)校正的多重t检验分析进行比较。P值<0.05被认为是统计学上显著的。图上仅显示具有统计意义的P值。
虽然已经示出和在本文所述了本发明的优选实施例，仅通过举例的方式来提供这样的实施例对本领域技术人员将是显而易见的。许多变化、改变和替换将会对本领域的技术人员发生而不脱离本发明的范围。应该理解，在实践本发明中可以采用本文描述的本发明的实施例的各种替代方案。
本说明书中提及的所有出版物、专利申请、授权专利和其他文件均通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物、专利申请、授权专利或其他文件被明确地并单独地指出通过引用整体并入。在与本公开中的定义相抵触的程度上，排除了通过引用并入的文本中包含的定义。
当前描述的实施例
以下实施例提供了本发明的特定组合物和用途的非穷尽列表。
1.在本文描述的某一方面中，是一种组合物，所述组合物包含：
a)多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)，所述多个抗原-主要组织相容性复合物中的每个抗原-MHC包含与MHC分子的结合槽相缔合的不是组织特异性抗原的遍在自身抗原；和
b)纳米颗粒核，其直径在1纳米和100纳米之间；
其中所述抗原-MHC偶联到所述纳米颗粒核。
2.如实施例1所述的组合物的实施例，其中所述MHC分子是MHC II类分子。
3.如实施例1所述的组合物的实施例，其中所述纳米颗粒核是金属或金属氧化物。
4.如实施例3所述的组合物的实施例，其中所述金属是铁。
5.如实施例3所述的组合物的实施例，其中所述金属氧化物是氧化铁。
6.如实施例1至5中任一项所述的组合物的实施例，其中所述直径在约5纳米和约50纳米之间。
7.如实施例6所述的组合物的实施例，其中所述直径在约5纳米和约25纳米之间。
8.如实施例1至7中任一项所述的组合物的实施例，其中所述多个抗原-MHC以至少10:1的抗原-MHC比纳米颗粒核的比率偶联到所述纳米颗粒核。
9.如实施例1至8中任一项所述的组合物的实施例，其中所述多个抗原-MHC以不超过150:1的抗原-MHC比纳米颗粒核的比率偶联到所述纳米颗粒核。
10.如实施例1至9中任一项所述的组合物的实施例，其中所述多个抗原-MHC以约0.4至约13个抗原-MHC/100nm2纳米颗粒核表面积的密度偶联到所述纳米颗粒核。
11.如实施例1至10中任一项所述的组合物的实施例，其中所述抗原-MHC共价偶联到所述纳米颗粒核。
12.如实施例1至11中任一项所述的组合物的实施例，其中所述抗原-MHC通过质量小于约5千道尔顿的聚乙二醇(PEG)接头共价偶联到所述纳米颗粒核。
13.如实施例1至12中任一项所述的组合物的实施例，其中所述纳米颗粒核还包含生物相容包衣。
14.如实施例1至13中任一项所述的组合物的实施例，其中所述遍在自身抗原包含衍生自以稳定状态存在于细胞内区室中或细胞内区室上的蛋白质的多肽。
15.如实施例14所述的组合物的实施例，其中所述细胞内区室是胞质溶胶、线粒体、高尔基体、内质网、细胞核或质膜。
16.如实施例14所述的组合物的实施例，其中所述细胞内区室是线粒体。
17.如实施例1至13中任一项所述的组合物的实施例，其中所述遍在自身抗原是丙酮酸脱氢酶复合物-E2组分(PDC-E2)。
18.如实施例1至13中任一项所述的组合物，其中所述遍在自身抗原是细胞色素P4502D6(CYP2D6)。
19.如实施例1至13中任一项所述的组合物的实施例，其中所述遍在自身抗原是肌动蛋白(ACTB)。
20.如实施例1至13中任一项所述的组合物的实施例，其中所述遍在自身抗原是可溶性肝抗原(SLA)。
21.如实施例1至13中任一项所述的组合物的实施例，其中所述遍在自身抗原是甲酰亚胺转移酶-环化脱氨酶(FTCD)。
22.如实施例1至13中任一项所述的组合物的实施例，其中所述遍在自身抗原是髓过氧化物酶(MPO)。
23.如实施例17所述的组合物的实施例，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：PDC-E2353-367；PDC-E272-86；PDC-E2422-436；PDC-E2353-367；PDC-E280-94；PDC-E2535-549；PDC-E2629-648；PDC-E2122-135 PDC-E2249-263；和PDC-E2249-263。
24.如实施例17所述的组合物的实施例，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：PDC-E2422-436和PDC-E280-94。
25.如实施例18所述的组合物的实施例，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：CYP2D6284-298；CYP2D6289-303；CYP2D6318-332；CYP2D6313-332；CYP2D6393-412；CYP2D6192-206；CYP2D65-19；CYP2D6293-307；CYP2D6219-233；CYP2D6237-251；CYP2D615-29；CYP2D6235-249；CYP2D6317-331；CYP2D6293-307；CYP2D6428-442；CYP2D6237-251；CYP2D614-28；CYP2D6199-213；CYP2D6450-464；CYP2D6301-315；CYP2D6452-466；CYP2D659-73；CYP2D6130-144；CYP2D6193-212；CYP2D6305-324；和CYP2D615-29。
26.如实施例19所述的组合物的实施例，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB202-216；ACTB170-184；ACTB245-259；ACTB187-201；ACTB172-186；ACTB131-145；ACTB131-145；ACTB171-185；ACTB129-143；ACTB164-178；ACTB25-39；和ACTB323-337。
27.如实施例19所述的组合物的实施例，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB146-160；ACTB18-32；和ACTB171-185。
28.如实施例20所述的组合物的实施例，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：SLA334-348；SLA196-210；SLA115-129；SLA373-386；SLA186-197；SLA342-256；SLA110-124；SLA299-313；SLA49-63；SLA260-274；SLA119-133；SLA86-100；SLA26-40；SLA331-345；SLA317-331；SLA171-185；SLA417-431；SLA359-373；SLA215-229；和SLA111-125。
29.如实施例21所述的组合物的实施例，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD439-453；FTCD381-395；FTCD297-311；FTCD525-539；FTCD218-232；FTCD495-509；FTCD262-276；FTCD300-314；FTCD259-273；FTCD490-504；FTCD389-403；和FTCD295-309。
30.如实施例21所述的组合物的实施例，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD271-285；FTCD498-512；和FTCD301-315。
31.如实施例22所述的组合物的实施例，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：MPO322-336；MPO714-728；MPO617-631；MPO504-518；MPO462-476；MPO617-631；MPO444-458；MPO689-703；MPO248-262；MPO511-525；MPO97-111；和MPO616-630。
32.如实施例1至31中任一项所述的组合物的实施例，所述组合物还包含与所述纳米颗粒核偶联的第二多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)，所述第二多个抗原-主要组织相容性复合物中的每个抗原MHC包含抗原。
33.如实施例32所述的组合物的实施例，其中所述第二多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)的抗原是第二遍在自身抗原。
34.如实施例32所述的组合物的实施例，其中所述第二遍在自身抗原包含衍生自以稳定状态存在于细胞内区室中或细胞内区室上的蛋白质的多肽。
35.如实施例34所述的组合物的实施例，其中所述细胞内区室是胞质溶胶、线粒体、高尔基体、内质网、细胞核或质膜。
36.如实施例34所述的组合物的实施例，其中所述细胞内区室是线粒体。
37.如实施例34所述的组合物的实施例，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：PDC-E2353-367；PDC-E272-86；PDC-E2422-436；PDC-E2353-367；PDC-E280-94；PDC-E2535-549；PDC-E2629-648；PDC-E2122-135 PDC-E2249-263；和PDC-E2249-263。
38.如实施例34所述的组合物的实施例，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：PDC-E2422-436和PDC-E280-94。
39.如实施例34所述的组合物的实施例，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：CYP2D6284-298；CYP2D6289-303；CYP2D6318-332；CYP2D6313-332；CYP2D6393-412；CYP2D6192-206；CYP2D65-19；CYP2D6293-307；CYP2D6219-233；CYP2D6237-251；CYP2D615-29；CYP2D6235-249；CYP2D6317-331；CYP2D6293-307；CYP2D6428-442；CYP2D6237-251；CYP2D614-28；CYP2D6199-213；CYP2D6450-464；CYP2D6301-315；CYP2D6452-466；CYP2D659-73；CYP2D6130-144；CYP2D6193-212；CYP2D6305-324；和CYP2D615-29。
40.如实施例34所述的组合物的实施例，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB202-216；ACTB170-184；ACTB245-259；ACTB187-201；ACTB172-186；ACTB131-145；ACTB131-145；ACTB171-185；ACTB129-143；ACTB164-178；ACTB25-39；和ACTB323-337。
41.如实施例34所述的组合物的实施例，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB146-160；ACTB18-32；和ACTB171-185。
42.如实施例34所述的组合物的实施例，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：SLA334-348；SLA196-210；SLA115-129；SLA373-386；SLA186-197；SLA342-256；SLA110-124；SLA299-313；SLA49-63；SLA260-274；SLA119-133；SLA86-100；SLA26-40；SLA331-345；SLA317-331；SLA171-185；SLA417-431；SLA359-373；SLA215-229；和SLA111-125。
43.如实施例34所述的组合物的实施例，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD439-453；FTCD381-395；FTCD297-311；FTCD525-539；FTCD218-232；FTCD495-509；FTCD262-276；FTCD300-314；FTCD259-273；FTCD490-504；FTCD389-403；和FTCD295-309。
44.如实施例34所述的组合物的实施例，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD271-285；FTCD498-512；和FTCD301-315。
45.如实施例34所述的组合物的实施例，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：MPO322-336；MPO714-728；MPO617-631；MPO504-518；MPO462-476；MPO617-631；MPO444-458；MPO689-703；MPO248-262；MPO511-525；MPO97-111；和MPO616-630。
46.如实施例1至45中任一项所述的组合物的实施例，所述组合物还包含药学上可接受的稳定剂、赋形剂、稀释剂或其组合。
47.如实施例1至46中任一项所述的组合物的实施例，所述组合物被配制用于静脉内施用。
48.如实施例1至47中任一项所述的组合物的实施例，所述组合物用于治疗自身免疫性疾病或炎症性疾病的方法中。
49.如实施例1至47中任一项所述的组合物的用途，所述组合物用于制备治疗自身免疫性疾病或炎症性疾病的药物。
50.如实施例49所述的组合物或用途的实施例，其中所述遍在自身抗原或所述第二遍在自身抗原不是衍生自以下的多肽：髓磷脂碱性蛋白、髓磷脂相关糖蛋白、髓磷脂少突胶质细胞蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白、少突胶质细胞髓磷脂寡蛋白、髓磷脂相关的少突胶质细胞碱性蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、NOGO A、糖蛋白Po、外周髓磷脂蛋白22或2’3’-环核苷酸3'-磷酸二酯酶。
51.如实施例49所述的组合物或用途的实施例，其中所述遍在自身抗原或所述第二遍在自身抗原不是衍生自前胰岛素原、胰岛素原、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶(IGRP)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛细胞自身抗原-2(ICA2)或胰岛素的多肽。
Figure BDA0002601207220000971
Figure BDA0002601207220000981
Figure BDA0002601207220000991
Figure BDA0002601207220001001
本文公开的序列
Figure BDA0002601207220001002
Figure BDA0002601207220001011
Figure BDA0002601207220001021
Figure BDA0002601207220001031
Figure BDA0002601207220001041
Figure BDA0002601207220001042

Claims (104)

1.一种用于治疗自身免疫性疾病或炎症性疾病的组合物，所述组合物包含：
a)多个抗原-主要组织相容性复合物(抗原-MHC)，所述多个抗原-主要组织相容性复合物中的每个抗原-MHC包含与MHC分子的结合槽相缔合的遍在自身抗原，其中所述遍在自身抗原不是所述自身免疫性疾病或炎症性疾病的组织特异性抗原；和
b)纳米颗粒核，其直径在1纳米和约100纳米之间；
其中所述抗原-MHC偶联到所述纳米颗粒核或围绕所述纳米颗粒核的生物相容层。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述MHC分子是MHCII类分子。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述纳米颗粒核是金属或金属氧化物。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述金属是铁。
5.如权利要求3所述的组合物，其中所述金属氧化物是氧化铁。
6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述直径在约5纳米和约50纳米之间。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述直径在约5纳米和约25纳米之间。
8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述多个抗原-MHC以至少10:1的抗原-MHC比纳米颗粒核的比率偶联到所述纳米颗粒核。
9.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述多个抗原-MHC以不超过约150:1的抗原-MHC比纳米颗粒核的比率偶联到所述纳米颗粒核。
10.如权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述多个抗原-MHC以约0.4至约13个抗原-MHC/100nm2纳米颗粒核表面积的密度偶联到所述纳米颗粒核。
11.如权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述抗原-MHC共价偶联到所述纳米颗粒核。
12.如权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述抗原-MHC通过质量小于约5千道尔顿的聚乙二醇(PEG)接头偶联到所述纳米颗粒核。
13.如权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒核还包含生物相容包衣。
14.如权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述遍在自身抗原包含衍生自以稳定状态存在于细胞内区室中或细胞内区室上的蛋白质的多肽。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述细胞内区室是胞质溶胶、线粒体、高尔基体、内质网、细胞核或质膜。
16.如权利要求14所述的组合物，其中所述细胞内区室是线粒体。
17.如权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述遍在自身抗原是丙酮酸脱氢酶复合物-E2组分(PDC-E2)。
18.如权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述遍在自身抗原是细胞色素P4502D6(CYP2D6)。
19.如权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述遍在自身抗原是肌动蛋白(ACTB)。
20.如权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述遍在自身抗原是可溶性肝抗原(SLA)。
21.如权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述遍在自身抗原是甲酰亚胺转移酶-环化脱氨酶(FTCD)。
22.如权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述遍在自身抗原是髓过氧化物酶(MPO)。
23.如权利要求17所述的组合物，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：PDC-E2353-367；PDC-E272-86；PDC-E2422-436；PDC-E2353-367；PDC-E280-94；PDC-E2535-549；PDC-E2629-648；PDC-E2122-135PDC-E2249-263；和PDC-E2249-263。
24.如权利要求17所述的组合物，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：PDC-E2422-436和PDC-E280-94。
25.如权利要求18所述的组合物，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：CYP2D6284-298；CYP2D6289-303；CYP2D6318-332；CYP2D6313-332；CYP2D6393-412；CYP2D6192-206；CYP2D65-19；CYP2D6293-307；CYP2D6219-233；CYP2D6237-251；CYP2D615-29；CYP2D6235-249；CYP2D6317-331；CYP2D6293-307；CYP2D6428-442；CYP2D6237-251；CYP2D614-28；CYP2D6199-213；CYP2D6450-464；CYP2D6301-315；CYP2D6452-466；CYP2D659-73；CYP2D6130-144；CYP2D6193-212；CYP2D6305-324；和CYP2D615-29。
26.如权利要求19所述的组合物，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB202-216；ACTB170-184；ACTB245-259；ACTB187-201；ACTB172-186；ACTB131-145；ACTB131-145；ACTB171-185；ACTB129-143；ACTB164-178；ACTB25-39；和ACTB323-337。
27.如权利要求19所述的组合物，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB146-160；ACTB18-32；和ACTB171-185。
28.如权利要求20所述的组合物，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：SLA334-348；SLA196-210；SLA115-129；SLA373-386；SLA186-197；SLA342-256；SLA110-124；SLA299-313；SLA49-63；SLA260-274；SLA119-133；SLA86-100；SLA26-40；SLA331-345；SLA317-331；SLA171-185；SLA417-431；SLA359-373；SLA215-229；和SLA111-125。
29.如权利要求21所述的组合物，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD439-453；FTCD381-395；FTCD297-311；FTCD525-539；FTCD218-232；FTCD495-509；FTCD262-276；FTCD300-314；FTCD259-273；FTCD490-504；FTCD389-403；和FTCD295-309。
30.如权利要求21所述的组合物，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD271-285；FTCD498-512；和FTCD301-315。
31.如权利要求22所述的组合物，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：MPO322-336；MPO714-728；MPO617-631；MPO504-518；MPO462-476；MPO617-631；MPO444-458；MPO689-703；MPO248-262；MPO511-525；MPO97-111；和MPO616-630。
32.如权利要求1至31中任一项所述的组合物，所述组合物还包含与所述纳米颗粒核偶联的第二多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)，所述第二多个抗原-主要组织相容性复合物中的每个抗原MHC包含抗原。
33.如权利要求32所述的组合物，其中所述第二多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)的抗原是第二遍在自身抗原。
34.如权利要求32所述的组合物，其中所述第二遍在自身抗原包含衍生自以稳定状态存在于细胞内区室中或细胞内区室上的蛋白质的多肽。
35.如权利要求34所述的组合物，其中所述细胞内区室是胞质溶胶、线粒体、高尔基体、内质网、细胞核或质膜。
36.如权利要求34所述的组合物，其中所述细胞内区室是线粒体。
37.如权利要求33所述的组合物，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：PDC-E2353-367；PDC-E272-86；PDC-E2422-436；PDC-E2353-367；PDC-E280-94；PDC-E2535-549；PDC-E2629-648；PDC-E2122-135PDC-E2249-263；和PDC-E2249-263。
38.如权利要求33所述的组合物，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：PDC-E2422-436和PDC-E280-94。
39.如权利要求33所述的组合物，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：CYP2D6284-298；CYP2D6289-303；CYP2D6318-332；CYP2D6313-332；CYP2D6393-412；CYP2D6192-206；CYP2D65-19；CYP2D6293-307；CYP2D6219-233；CYP2D6237-251；CYP2D615-29；CYP2D6235-249；CYP2D6317-331；CYP2D6293-307；CYP2D6428-442；CYP2D6237-251；CYP2D614-28；CYP2D6199-213；CYP2D6450-464；CYP2D6301-315；CYP2D6452-466；CYP2D659-73；CYP2D6130-144；CYP2D6193-212；CYP2D6305-324；和CYP2D615-29。
40.如权利要求33所述的组合物，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB202-216；ACTB170-184；ACTB245-259；ACTB187-201；ACTB172-186；ACTB131-145；ACTB131-145；ACTB171-185；ACTB129-143；ACTB164-178；ACTB25-39；和ACTB323-337。
41.如权利要求33所述的组合物，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB146-160；ACTB18-32；和ACTB171-185。
42.如权利要求33所述的组合物，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：SLA334-348；SLA196-210；SLA115-129；SLA373-386；SLA186-197；SLA342-256；SLA110-124；SLA299-313；SLA49-63；SLA260-274；SLA119-133；SLA86-100；SLA26-40；SLA331-345；SLA317-331；SLA171-185；SLA417-431；SLA359-373；SLA215-229；和SLA111-125。
43.如权利要求33所述的组合物，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD439-453；FTCD381-395；FTCD297-311；FTCD525-539；FTCD218-232；FTCD495-509；FTCD262-276；FTCD300-314；FTCD259-273；FTCD490-504；FTCD389-403；和FTCD295-309。
44.如权利要求33所述的组合物，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD271-285；FTCD498-512；和FTCD301-315。
45.如权利要求33所述的组合物，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：MPO322-336；MPO714-728；MPO617-631；MPO504-518；MPO462-476；MPO617-631；MPO444-458；MPO689-703；MPO248-262；MPO511-525；MPO97-111；和MPO616-630。
46.如权利要求1至45中任一项所述的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的稳定剂、赋形剂、稀释剂或其组合。
47.如权利要求1至46中任一项所述的组合物，所述组合物被配制用于静脉内施用。
48.如权利要求1至47中任一项所述的组合物，其中所述自身免疫性疾病或炎症性疾病选自由以下组成的组：I型糖尿病、多发性硬化症、复发-缓解型多发性硬化症、天疱疮、落叶型天疱疮、寻常型天疱疮、视神经脊髓炎谱系障碍、类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎、炎症性肠病、克罗恩病、乳糜泻、过敏性哮喘、系统性红斑狼疮、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病、肺气肿、银屑病、葡萄膜炎、干燥综合征、硬皮病、抗磷脂综合征、ANCA相关血管炎、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎和僵人综合征。
49.如权利要求48所述的组合物，其中所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是多发性硬化症。
50.如权利要求49所述的组合物，其中所述遍在自身抗原或所述第二遍在自身抗原不是衍生自以下的多肽：髓磷脂碱性蛋白、髓磷脂相关糖蛋白、髓磷脂少突胶质细胞蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白、少突胶质细胞髓磷脂寡蛋白、髓磷脂相关的少突胶质细胞碱性蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、NOGO A、糖蛋白Po、外周髓磷脂蛋白22或2’3’-环核苷酸3'-磷酸二酯酶。
51.如权利要求48所述的组合物，其中所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是I型糖尿病。
52.如权利要求51所述的组合物或用途，其中所述遍在自身抗原或所述第二遍在自身抗原不是衍生自前胰岛素原、胰岛素原、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶(IGRP)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛细胞自身抗原-2(ICA2)或胰岛素的多肽。
53.一种治疗个体中的自身免疫性疾病或炎症性疾病的方法，所述方法包括给个体施用组合物，所述组合物包含：
a)多个抗原-主要组织相容性复合物(抗原-MHC)，所述多个抗原-主要组织相容性复合物中的每个抗原-MHC包含与MHC分子的结合槽相缔合的遍在自身抗原，其中所述遍在自身抗原不是所述自身免疫性疾病或炎症性疾病的组织特异性抗原；和
b)纳米颗粒核，其直径在1纳米和约100纳米之间；
其中所述抗原-MHC偶联到所述纳米颗粒核或围绕所述纳米颗粒核的生物相容层。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述MHC分子是MHCII类分子。
55.如权利要求53或54所述的方法，其中所述纳米颗粒核是金属或金属氧化物。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述金属是铁。
57.如权利要求55所述的方法，其中所述金属氧化物是氧化铁。
58.如权利要求53至57中任一项所述的方法，其中所述直径在约5纳米和约50纳米之间。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述直径在约5纳米和约25纳米之间。
60.如权利要求53至59中任一项所述的方法，其中所述抗原-MHC以至少10:1的抗原-MHC比纳米颗粒核的比率偶联到所述纳米颗粒核。
61.如权利要求53至60中任一项所述的方法，其中所述抗原-MHC以不超过约150:1的抗原-MHC比纳米颗粒核的比率偶联到所述纳米颗粒核。
62.如权利要求53至61中任一项所述的方法，其中所述抗原-MHC以约0.4至约13个抗原-MHC/100nm2纳米颗粒核表面积的密度偶联到所述纳米颗粒核。
63.如权利要求53至62中任一项所述的方法，其中所述抗原-MHC共价偶联到所述纳米颗粒核。
64.如权利要求53至63中任一项所述的方法，其中所述抗原-MHC通过质量小于约5千道尔顿的聚乙二醇(PEG)接头偶联到所述纳米颗粒核。
65.如权利要求53至64中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒核还包含生物相容包衣。
66.如权利要求53至65中任一项所述的方法，其中所述遍在自身抗原包含衍生自以稳定状态存在于细胞内区室中或细胞内区室上的蛋白质的多肽。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述细胞内区室是胞质溶胶、线粒体、高尔基体、内质网、细胞核或质膜。
68.如权利要求66所述的方法，其中所述细胞内区室是线粒体。
69.如权利要求53至68中任一项所述的方法，其中所述遍在自身抗原是丙酮酸脱氢酶复合物-E2组分(PDC-E2)。
70.如权利要求53至65中任一项所述的方法，其中所述遍在自身抗原是细胞色素P4502D6(CYP2D6)。
71.如权利要求53至65中任一项所述的方法，其中所述遍在自身抗原是肌动蛋白(ACTB)。
72.如权利要求53至65中任一项所述的方法，其中所述遍在自身抗原是可溶性肝抗原(SLA)。
73.如权利要求53至65中任一项所述的方法，其中所述遍在自身抗原是甲酰亚胺转移酶-环化脱氨酶(FTCD)。
74.如权利要求53至65中任一项所述的方法，其中所述遍在自身抗原是髓过氧化物酶(MPO)。
75.如权利要求69所述的方法，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：PDC-E2353-367；PDC-E272-86；PDC-E2422-436；PDC-E2353-367；PDC-E280-94；PDC-E2535-549；PDC-E2629-648；PDC-E2122-135PDC-E2249-263；和PDC-E2249-263。
76.如权利要求69所述的方法，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：PDC-E2422-436和PDC-E280-94。
77.如权利要求70所述的方法，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：CYP2D6284-298；CYP2D6289-303；CYP2D6318-332；CYP2D6313-332；CYP2D6393-412；CYP2D6192-206；CYP2D65-19；CYP2D6293-307；CYP2D6219-233；CYP2D6237-251；CYP2D615-29；CYP2D6235-249；CYP2D6317-331；CYP2D6293-307；CYP2D6428-442；CYP2D6237-251；CYP2D614-28；CYP2D6199-213；CYP2D6450-464；CYP2D6301-315；CYP2D6452-466；CYP2D659-73；CYP2D6130-144；CYP2D6193-212；CYP2D6305-324；和CYP2D615-29。
78.如权利要求71所述的方法，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB202-216；ACTB170-184；ACTB245-259；ACTB187-201；ACTB172-186；ACTB131-145；ACTB131-145；ACTB171-185；ACTB129-143；ACTB164-178；ACTB25-39；和ACTB323-337。
79.如权利要求71所述的方法，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB146-160；ACTB18-32；和ACTB171-185。
80.如权利要求72所述的组合物，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：SLA334-348；SLA196-210；SLA115-129；SLA373-386；SLA186-197；SLA342-256；SLA110-124；SLA299-313；SLA49-63；SLA260-274；SLA119-133；SLA86-100；SLA26-40；SLA331-345；SLA317-331；SLA171-185；SLA417-431；SLA359-373；SLA215-229；和SLA111-125。
81.如权利要求73所述的方法，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD439-453；FTCD381-395；FTCD297-311；FTCD525-539；FTCD218-232；FTCD495-509；FTCD262-276；FTCD300-314；FTCD259-273；FTCD490-504；FTCD389-403；和FTCD295-309。
82.如权利要求73所述的方法，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD271-285；FTCD498-512；和FTCD301-315。
83.如权利要求74所述的方法，其中所述遍在自身抗原选自由以下组成的组：MPO322-336；MPO714-728；MPO617-631；MPO504-518；MPO462-476；MPO617-631；MPO444-458；MPO689-703；MPO248-262；MPO511-525；MPO97-111；和MPO616-630。
84.如权利要求53至83中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含与所述纳米颗粒核偶联的第二多个抗原-主要组织相容性复合物(MHC)，所述第二多个抗原-主要组织相容性复合物中的每个抗原MHC包含抗原。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述第二多个抗原-主要组织相容性(MHC)复合物的抗原是第二遍在自身抗原。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述遍在自身抗原包含衍生自以稳定状态存在于细胞内区室中或细胞内区室上的蛋白质的多肽。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述细胞内区室是胞质溶胶、线粒体、高尔基体、内质网、细胞核或质膜。
88.如权利要求86所述的方法，其中所述细胞内区室是线粒体。
89.如权利要求85所述的方法，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：PDC-E2353-367；PDC-E272-86；PDC-E2422-436；PDC-E2353-367；PDC-E280-94；PDC-E2535-549；PDC-E2629-648；PDC-E2122-135PDC-E2249-263；和PDC-E2249-263。
90.如权利要求85所述的方法，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：PDC-E2422-436和PDC-E280-94。
91.如权利要求85所述的方法，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：CYP2D6284-298；CYP2D6289-303；CYP2D6318-332；CYP2D6313-332；CYP2D6393-412；CYP2D6192-206；CYP2D65-19；CYP2D6293-307；CYP2D6219-233；CYP2D6237-251；CYP2D615-29；CYP2D6235-249；CYP2D6317-331；CYP2D6293-307；CYP2D6428-442；CYP2D6237-251；CYP2D614-28；CYP2D6199-213；CYP2D6450-464；CYP2D6301-315；CYP2D6452-466；CYP2D659-73；CYP2D6130-144；CYP2D6193-212；CYP2D6305-324；和CYP2D615-29。
92.如权利要求85所述的方法，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB202-216；ACTB170-184；ACTB245-259；ACTB187-201；ACTB172-186；ACTB131-145；ACTB131-145；ACTB171-185；ACTB129-143；ACTB164-178；ACTB25-39；和ACTB323-337。
93.如权利要求85所述的方法，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：ACTB146-160；ACTB18-32；和ACTB171-185。
94.如权利要求85所述的方法，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：SLA334-348；SLA196-210；SLA115-129；SLA373-386；SLA186-197；SLA342-256；SLA110-124；SLA299-313；SLA49-63；SLA260-274；SLA119-133；SLA86-100；SLA26-40；SLA331-345；SLA317-331；SLA171-185；SLA417-431；SLA359-373；SLA215-229；和SLA111-125。
95.如权利要求85所述的方法，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD439-453；FTCD381-395；FTCD297-311；FTCD525-539；FTCD218-232；FTCD495-509；FTCD262-276；FTCD300-314；FTCD259-273；FTCD490-504；FTCD389-403；和FTCD295-309。
96.如权利要求85所述的方法，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：FTCD271-285；FTCD498-512；和FTCD301-315。
97.如权利要求85所述的方法，其中所述第二遍在自身抗原选自由以下组成的组：MPO322-336；MPO714-728；MPO617-631；MPO504-518；MPO462-476；MPO617-631；MPO444-458；MPO689-703；MPO248-262；MPO511-525；MPO97-111；和MPO616-630。
98.如权利要求53至97中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含药学上可接受的稳定剂、赋形剂、稀释剂或其任何组合。
99.如权利要求53至98中任一项所述的方法，其中所述组合物被配制用于静脉内施用。
100.如权利要求53至99中任一项所述的方法，其中所述遍在自身抗原或所述第二遍在自身抗原不是衍生自以下的多肽：髓磷脂碱性蛋白、髓磷脂相关糖蛋白、髓磷脂少突胶质细胞蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白、少突胶质细胞髓磷脂寡蛋白、髓磷脂相关的少突胶质细胞碱性蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、NOGO A、糖蛋白Po、外周髓磷脂蛋白22或2’3’-环核苷酸3'-磷酸二酯酶。
101.如权利要求53至99中任一项所述的方法，其中所述遍在自身抗原或所述第二遍在自身抗原不是衍生自前胰岛素原、胰岛素原、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶(IGRP)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛细胞自身抗原-2(ICA2)或胰岛素的多肽。
102.如权利要求53至101中任一项所述的方法，其中所述自身免疫性疾病或炎症性疾病选自由以下组成的组：I型糖尿病、多发性硬化症、复发-缓解型多发性硬化症、天疱疮、落叶型天疱疮、寻常型天疱疮、视神经脊髓炎谱系障碍、类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎、炎症性肠病、克罗恩病、乳糜泻、过敏性哮喘、系统性红斑狼疮、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病、肺气肿、银屑病、葡萄膜炎、干燥综合征、硬皮病、抗磷脂综合征、ANCA相关血管炎、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎和僵人综合征。
103.如权利要求102所述的方法，其中所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是多发性硬化症。
104.如权利要求102所述的方法，其中所述自身免疫性疾病或炎症性疾病是I型糖尿病。
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