CN114341175A - 包含非经典mhc的纳米颗粒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文描述了扩增非变异NKT细胞的非经典MHC‑纳米颗粒复合物。扩增非变异NKT细胞可用于治疗自身免疫性障碍或炎性障碍。

Description

包含非经典MHC的纳米颗粒及其用途
交叉引用
本申请要求2019年5月23日提交的美国临时申请62/852,055的权益，将其通过引用以其全文并入本文。
1型或非变异NKT(iNKT)细胞包含表达非变异TCR-α链的T淋巴细胞亚群。这些淋巴细胞识别由非多态性非经典MHC I类分子CD1d呈递的外源性或内源性糖脂。这些T细胞准备在以依赖上下文的方式激活后迅速产生大量的Th1(IFN-γ)型、Th2(IL-4和IL-10)型或Th17(IL-17)型细胞因子，并且与多种炎性障碍的发病机制和调节有关。参见Bendelac,A.等人(2007)“The biology of NKT cells[NKT细胞生物学].”Annu.Rev.Immunol.[免疫学年度评论]25,297-336。脂质α-半乳糖神经酰胺(αGalCer)是大多数小鼠和人iNKT细胞的有效CD1d限制性配体，并且已被用于在疫苗接种策略和癌症中引发iNKT细胞的佐剂活性，部分通过促进DC由iNKT诱导的共刺激依赖性成熟变为成熟的APC。参见Cerundolo,V.等人(2009)“Harnessing invariant NKT cells in vaccination strategies[在疫苗接种策略中利用非变异NKT细胞]”.Nat.Rev.Immunol.[自然免疫学综述]9,28-38。鉴于iNKT细胞的表型和功能异质性，全身性αGalCer递送可导致具有相反功能的iNKT细胞亚群的激活。
发明内容
本文所述的组合物和方法可以利用和引导对神经酰胺/鞘脂的免疫反应以发展抗自身免疫反应和/或抗炎反应。本文描述了可用于治疗自身免疫性障碍和炎性障碍的组合物和方法。这些组合物包含偶联到非经典MHC分子的纳米颗粒。这些非经典MHC分子包括结合到非经典MHC分子的结合槽的鞘脂NKT配体。在鞘脂配体和偶联到纳米颗粒的非经典MHC(ncMHC-NP)之间形成复合物。在该上下文中施用的鞘脂优先激活抑制性非变异NKT细胞，从而潜在地激活可以对抗炎性障碍和自身免疫性障碍的抗炎反应。
多个非经典MHC分子纳米颗粒可以与合适的药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂一起包含在配制品中，该配制品用作治疗自身免疫性疾病或炎性疾病的药物或用在治疗自身免疫性疾病或炎性疾病的方法中。影响具有大量iNKT细胞的器官(诸如肝)的疾病可能对使用本文所述的偶联到与鞘脂结合的非经典MHC分子的纳米颗粒的组合物进行的治疗干预显示出强烈反应。
本文描述了一种非经典MHC-纳米颗粒，该非经典MHC-纳米颗粒包含：鞘脂或其类似物；非经典MHC分子；和纳米颗粒；其中该鞘脂或其类似物与非经典MHC分子的结合小沟缔合，并且其中该非经典MHC分子偶联到该纳米颗粒。在某些实施例中，该非经典MHC-NP不包含免疫激活共刺激分子或细胞因子/细胞因子受体。在某些实施例中，该非经典MHC-纳米颗粒包含鞘脂或其类似物。在某些实施例中，该鞘脂或其类似物包括神经酰胺或其类似物。在某些实施例中，该神经酰胺或其类似物包括α-半乳糖神经酰胺(KRN7000)、α-C-半乳糖神经酰胺、α-葡萄糖醛酸神经酰胺、β-半乳糖神经酰胺、PBS-20、PBS-25、硫苷脂、异红细胞三糖神经酰胺(isoglobotriosylceramide，iGb3)或其组合。在某些实施例中，该神经酰胺或其类似物包括α-半乳糖神经酰胺(KRN7000)。在某些实施例中，该非经典MHC包括CD1d。在某些实施例中，该CD1d是人CD1d。在某些实施例中，该CD1d包含与SEQ ID NO:1、2和3中的任一个具有至少约90％、95％、97％、98％、99％同一性或至少约90％、95％、97％、98％、99％相同的氨基酸残基序列。在某些实施例中，该CD1d包含与SEQ ID NO:3具有至少约90％、95％、97％、98％、99％同一性或至少约90％、95％、97％、98％、99％相同的氨基酸残基序列。在某些实施例中，该CD1d包含与SEQ ID NO:3相同的氨基酸残基序列。在某些实施例中，该CD1d包含与SEQ ID NO:4具有至少约90％、95％、97％、98％、99％同一性或至少约90％、95％、97％、98％、99％相同的氨基酸残基序列。在某些实施例中，该CD1d包含与SEQ ID NO:4相同的氨基酸残基序列。在某些实施例中，该非经典MHC-纳米颗粒包含β2微球蛋白。在某些实施例中，该β2微球蛋白包含与SEQ ID NO:5具有至少约90％、95％、97％、98％、99％同一性或至少约90％、95％、97％、98％、99％相同的氨基酸残基序列。在某些实施例中，该β2微球蛋白包含与SEQ ID NO:5相同的氨基酸残基序列。在某些实施例中，该纳米颗粒包含金属、金属氧化物、金属硫化物、金属硒化物或聚合物。在某些实施例中，该金属或金属氧化物包括铁、氧化铁或金。在某些实施例中，该金属或金属氧化物包括铁或氧化铁。在某些实施例中，该纳米颗粒的直径从约1纳米至约100纳米。在某些实施例中，该直径从约5纳米至约25纳米。在某些实施例中，该非经典MHC分子共价偶联到该纳米颗粒。在某些实施例中，该非经典MHC分子通过聚合物接头共价偶联到该纳米颗粒。在某些实施例中，该聚合物包括右旋糖酐。在某些实施例中，该聚合物接头的尺寸小于约5千道尔顿。在某些实施例中，该聚合物接头包括聚乙二醇(PEG)。在某些实施例中，该非经典MHC分子以至少10:1的比率偶联到该纳米颗粒。在某些实施例中，该非经典MHC分子以不超过约1000:1的比率偶联到该纳米颗粒。在某些实施例中，该非经典MHC分子以不超过约500:1的比率偶联到该纳米颗粒。在某些实施例中，该非经典MHC分子以不超过约100:1的比率偶联到该纳米颗粒。在某些实施例中，本文描述了一种组合物，其包含多个本文所述的非经典MHC-纳米颗粒和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。在某些实施例中，该组合物被配制用于静脉内施用。在某些实施例中，该组合物被配制用于皮下施用。在某些实施例中，包含非经典MHC-纳米颗粒的组合物用于治疗自身免疫性障碍或炎性障碍。在某些实施例中，该自身免疫性障碍或炎性障包括I型糖尿病、移植排斥、多发性硬化、多发性硬化相关障碍、卵巢早衰、硬皮病、舍格林氏病/综合征、狼疮、白癜风、脱发(秃顶)、多腺体衰竭、格雷夫氏病、甲状腺功能减退、多发性肌炎、天疱疮、克罗恩氏病、结肠炎、自身免疫性肝炎、垂体功能减退、心肌炎、阿狄森氏病、自身免疫性皮肤病、葡萄膜炎、恶性贫血、甲状旁腺功能减退、类风湿性关节炎、哮喘、过敏性哮喘、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、肝硬化、视神经脊髓炎谱系障碍(德维克氏病、视神经脊髓型多发性硬化症(OSMS))、寻常型天疱疮、炎性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮(SLE)、乳糜泻、银屑病、自身免疫性心肌病、特发性扩张型心肌病(IDCM)、重症肌无力、葡萄膜炎、强直性脊柱炎、免疫介导肌病(IMM)、抗磷脂综合征(ANCA+)、动脉粥样硬化、皮肌炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿、脊髓损伤、ANCA相关血管炎、特发性肺纤维化、肺动脉高压、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或银屑病。在某些实施例中，该自身免疫性障碍或炎性障碍包括自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或肝硬化。在某些实施例中，包含非经典MHC-纳米颗粒的组合物用于产生或扩增免疫调节性非变异NKT细胞。在某些实施例中，该免疫调节性非变异NKT细胞是肝非变异NKT细胞。在某些实施例中，该免疫调节性非变异NKT细胞表达MAF。在某些实施例中，该免疫调节性非变异NKT细胞表达IL-10和/或IL-21。在某些实施例中，该免疫调节性非变异NKT细胞表达LAG3、CTLA4、SLAMF6和ITGA4中的任一种或多种。此外，本文描述了一种治疗个体的自身免疫性障碍或炎性障碍的方法，该方法包括向该个体施用非经典MHC-纳米颗粒或非经典MHC-纳米颗粒的组合物。在某些实施例中，该自身免疫性障碍或炎性障包括I型糖尿病、移植排斥、多发性硬化、多发性硬化相关障碍、卵巢早衰、硬皮病、舍格林氏病/综合征、狼疮、白癜风、脱发(秃顶)、多腺体衰竭、格雷夫氏病、甲状腺功能减退、多发性肌炎、天疱疮、克罗恩氏病、结肠炎、自身免疫性肝炎、垂体功能减退、心肌炎、阿狄森氏病、自身免疫性皮肤病、葡萄膜炎、恶性贫血、甲状旁腺功能减退、类风湿性关节炎、哮喘、过敏性哮喘、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、肝硬化、视神经脊髓炎谱系障碍(德维克氏病、视神经脊髓型多发性硬化症(OSMS))、寻常型天疱疮、炎性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮(SLE)、乳糜泻、银屑病、自身免疫性心肌病、特发性扩张型心肌病(IDCM)、重症肌无力、葡萄膜炎、强直性脊柱炎、免疫介导肌病、抗磷脂综合征(ANCA+)、动脉粥样硬化、皮肌炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿、脊髓损伤、ANCA相关血管炎、特发性肺纤维化、肺动脉高压、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或银屑病。在某些实施例中，该自身免疫性障碍或炎性障碍包括自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或肝硬化。在某些实施例中，本文描述了一种产生或扩增免疫调节性非变异NKT细胞的方法，该方法包括将本文描述的非经典MHC-纳米颗粒或包含非经典MHC-纳米颗粒的组合物与非变异NKT细胞接触。在某些实施例中，接触是在体外。在某些实施例中，本文描述了一种在个体中产生或扩增免疫调节性非变异NKT细胞的方法，该方法包括向该个体施用非经典MHC-纳米颗粒或包含非经典MHC-纳米颗粒的组合物。在某些实施例中，该免疫调节性非变异NKT细胞表达MAF。在某些实施例中，该免疫调节性非变异NKT细胞表达IL-10和/或IL-21。在某些实施例中，该免疫调节性非变异NKT细胞表达LAG3、CTLA4、SLAMF6和ITGA4中的任一种或多种。在某些实施例中，该免疫调节性非变异NKT细胞是CD4+非变异NKT细胞。
附图说明
图1说明了典范的非经典MHC分子CD1d，其包含偶联到本披露的纳米颗粒的NKT细胞配体。图1不是按比例绘制的。
图2说明了用αGalCer(KRN7000)/CD1d包被的NP对比可溶性KRN7000或未包被的NP治疗对NOD.c3c4小鼠中PBC读出的影响。CBD，胆总管。
图3说明了用αGalCer(KRN7000)/CD1d包被的NP对比未包被的NP治疗对肝(顶部)和脾(底部)iNKT细胞(用αGalCer(KRN7000)/CD1d四聚体染色)的CD4/CD8表型的影响。
图4说明了用αGalCer(KRN7000)/CD1d包被的NP对比未包被的NP治疗对肝iNKT细胞(用αGalCer(KRN7000)/CD1d四聚体染色)中PD1、CD49d、CD69和LAG3水平的影响。
图5说明了用αGalCer(KRN7000)/CD1d-NP治疗的NOD.c3c4小鼠对比对照NOD.c3c4小鼠的肝iNKT细胞中iNKT相关基因的归一化RNA表达计数(±SEM)。
图6A说明了在用αGalCer(KRN7000)/CD1d-NP治疗的NOD.c3c4小鼠(右条)对比对照NOD.c3c4小鼠(左条)的肝iNKT细胞中，描述为在iNKT1细胞中上调的基因的归一化RNA表达计数(±SEM)。
图6B说明了在用αGalCer(KRN7000)/CD1d-NP治疗的NOD.c3c4小鼠(右条)对比对照NOD.c3c4小鼠(左条)的肝iNKT细胞中iNKT2富集基因的归一化RNA表达计数(±SEM)。
图6C说明了在用αGalCer(KRN7000)/CD1d-NP治疗的NOD.c3c4小鼠(右条)对比对照NOD.c3c4小鼠(左条)的肝iNKT细胞中iNKT10富集基因的归一化RNA表达计数(±SEM)。
图6D说明了在用αGalCer(KRN7000)/CD1d-NP治疗的NOD.c3c4小鼠(右条)对比对照NOD.c3c4小鼠(左条)的肝iNKT细胞中iNKT17富集基因的归一化RNA表达计数(±SEM)。
图7说明了通过响应于治疗而上调的三种转录因子(MAF、GATA-3和VDR)对用αGalCer(KRN7000)7CD1d-NP治疗的小鼠的肝iNKT细胞对比来自对照小鼠的肝iNKT细胞的共同调节。显示的是Perfuse Force Directed聚类图。
图8说明了αGalCer/CD1d-NP诱导的肝iNKT细胞和pMHC II类-NP诱导的脾TR1样CD4+T细胞中66个基因的归一化RNA计数的比较。选择用于比较的66个基因对应于在αGalCer/CD1d-NP治疗NOD.c3c4小鼠对比对照NOD.c3c4小鼠的肝iNKT细胞中差异表达>4倍(来自总共238个差异表达的基因)并且与常规的CD4+T细胞相比在由pMHC II类包被的NP诱导的TR1样CD4+T细胞中也有差异表达的那些基因。在pMHC-NP治疗诱导的iNKT与TR1细胞中，这些基因的表达幅度相似。
图9说明了来自αGalCer/CD1d-NP治疗小鼠的肝iNKT细胞可以抑制从未治疗小鼠的肝引流LN和肝枯否细胞中分离的CD11b+APC的能力，以将模型抗原肽(IGRP206-214)呈递给同源TCR-转基因CD8+T细胞。
图10说明了与来自对照NOD.c3c4供体的肝iNKT细胞相比，来自αGalCer/CD1d-NP治疗NOD.c3c4小鼠的肝iNKT细胞可以将疾病保护转移至用来自患病NOD.c3c4供体的脾细胞重建的NOD.c3c4.scid小鼠。
图11说明了来自αGalCer/CD1d-NP治疗NOD.c3c4小鼠的肝和脾iNKT细胞，与从对照小鼠分离的那些不同，可以触发来自NOD.Il10eGFP供体(在Il10基因座中携带eGFP)的常规(IL-10/eGFP阴性)B细胞在转移7天内转化为表达IL-10/eGFP的CD1d-高/CD5+Breg细胞，即使转移的B细胞没有αGalCer脉冲，这表明该过程是由识别B细胞上CD1d呈递的内源性脂质驱动的。
图12显示了由核酸载体产生的多肽的非限制性示意图，该核酸载体可用于制备描述的非经典MHC分子(SEQ ID NO:6)。
具体实施方式
本文描述了一种非经典MHC-纳米颗粒，该非经典MHC-纳米颗粒包含：(a)鞘脂或其类似物；(b)非经典MHC分子；以及(c)纳米颗粒；其中该鞘脂或其类似物与非经典MHC分子的结合小沟缔合，并且其中该非经典MHC分子偶联到该纳米颗粒。在某些实施例中，多个非经典MHC-纳米颗粒与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起包含在足够纯以用于施用给个体的组合物中。在某些实施例中，该非经典MHC-纳米颗粒或该组合物用于产生、激活、扩增或发展免疫调节性非变异NKT细胞的方法中。在某些实施例中，该免疫调节性非变异NKT细胞是CD4+非变异NKT细胞。在某些实施例中，该免疫调节性非变异CD4+NKT细胞表达MAF。
本文描述了一种非经典MHC-纳米颗粒，该非经典MHC-纳米颗粒包含：(a)鞘脂或其类似物；(b)非经典MHC分子；以及(c)纳米颗粒；其中该鞘脂或其类似物与非经典MHC分子的结合小沟缔合，并且其中该非经典MHC分子偶联到该纳米颗粒，其中该非经典MHC-NP不包含免疫激活共刺激分子或细胞因子/细胞因子受体。在某些实施例中，多个非经典MHC-纳米颗粒与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起包含在足够纯以用于施用给个体的组合物中。在某些实施例中，该非经典MHC-纳米颗粒或该组合物用于产生、激活、扩增或发展免疫调节性非变异NKT细胞的方法中。在某些实施例中，该免疫调节性非变异NKT细胞是CD4+非变异NKT细胞。在某些实施例中，该免疫调节性非变异CD4+NKT细胞表达MAF。
本文描述了一种非经典MHC-纳米颗粒，该非经典MHC-纳米颗粒包含：(a)鞘脂或其类似物；(b)非经典MHC分子；以及(c)纳米颗粒；其中该鞘脂或其类似物与非经典MHC分子的结合小沟缔合，并且其中该非经典MHC分子偶联到该纳米颗粒，其中该鞘脂包含α-半乳糖神经酰胺。在某些实施例中，该α-半乳糖神经酰胺包含KRN7000。在某些实施例中，多个非经典MHC-纳米颗粒与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起包含在足够纯以用于施用给个体的组合物中。在某些实施例中，该非经典MHC-纳米颗粒或该组合物用于产生、激活、扩增或发展免疫调节性非变异NKT细胞的方法中。在某些实施例中，该免疫调节性非变异NKT细胞是CD4+非变异NKT细胞。在某些实施例中，该免疫调节性非变异CD4+NKT细胞表达MAF。
本文描述了一种非经典MHC-纳米颗粒，该非经典MHC-纳米颗粒包含：(a)鞘脂或其类似物；(b)非经典MHC分子；以及(c)纳米颗粒；其中该鞘脂或其类似物与非经典MHC分子的结合小沟缔合，并且其中该非经典MHC分子偶联到该纳米颗粒，其中该非经典MHC-NP不包含免疫激活共刺激分子或细胞因子/细胞因子受体，其中该鞘脂包含α-半乳糖神经酰胺。在某些实施例中，该α-半乳糖神经酰胺包含KRN7000。在某些实施例中，多个非经典MHC-纳米颗粒与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起包含在足够纯以用于施用给个体的组合物中。在某些实施例中，该非经典MHC-纳米颗粒或该组合物用于产生、激活、扩增或发展免疫调节性非变异NKT细胞的方法中。在某些实施例中，该免疫调节性非变异NKT细胞是CD4+非变异NKT细胞。在某些实施例中，该免疫调节性非变异CD4+NKT细胞表达MAF。
本文描述了一种非经典MHC-纳米颗粒，该非经典MHC-纳米颗粒包含：(a)鞘脂或其类似物；(b)非经典MHC分子；以及(c)纳米颗粒；其中该鞘脂或其类似物与非经典MHC分子的结合小沟缔合，并且其中该非经典MHC分子偶联到该纳米颗粒。在某些实施例中，多个非经典MHC-纳米颗粒与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起包含在足够纯以用于施用给个体的组合物中。在某些实施例中，该非经典MHC-纳米颗粒或该组合物用于治疗个体的自身免疫性病症或炎性病症的方法中。在某些实施例中，该自身免疫性病症或炎性病症是影响肝的自身免疫性病症或炎性病症。
本文描述了一种非经典MHC-纳米颗粒，该非经典MHC-纳米颗粒包含：(a)鞘脂或其类似物；(b)非经典MHC分子；以及(c)纳米颗粒；其中该鞘脂或其类似物与非经典MHC分子的结合小沟缔合，并且其中该非经典MHC分子偶联到该纳米颗粒，其中该非经典MHC-NP不包含免疫激活共刺激分子或细胞因子/细胞因子受体。在某些实施例中，多个非经典MHC-纳米颗粒与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起包含在足够纯以用于施用给个体的组合物中。在某些实施例中，该非经典MHC-纳米颗粒或该组合物用于治疗个体的自身免疫性病症或炎性病症的方法中。在某些实施例中，该自身免疫性病症或炎性病症是影响肝的自身免疫性病症或炎性病症。
本文描述了一种非经典MHC-纳米颗粒，该非经典MHC-纳米颗粒包含：(a)鞘脂或其类似物；(b)非经典MHC分子；以及(c)纳米颗粒；其中该鞘脂或其类似物与非经典MHC分子的结合小沟缔合，并且其中该非经典MHC分子偶联到该纳米颗粒，其中该鞘脂包含α-半乳糖神经酰胺。在某些实施例中，该α-半乳糖神经酰胺包含KRN7000。在某些实施例中，多个非经典MHC-纳米颗粒与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起包含在足够纯以用于施用给个体的组合物中。在某些实施例中，该非经典MHC-纳米颗粒或该组合物用于治疗个体的自身免疫性病症或炎性病症的方法中。在某些实施例中，该自身免疫性病症或炎性病症是影响肝的自身免疫性病症或炎性病症。
本文描述了一种非经典MHC-纳米颗粒，该非经典MHC-纳米颗粒包含：(a)鞘脂或其类似物；(b)非经典MHC分子；以及(c)纳米颗粒；其中该鞘脂或其类似物与非经典MHC分子的结合小沟缔合，并且其中该非经典MHC分子偶联到该纳米颗粒，其中该非经典MHC-NP不包含免疫激活共刺激分子或细胞因子/细胞因子受体，其中该鞘脂包含α-半乳糖神经酰胺。在某些实施例中，该α-半乳糖神经酰胺包含KRN7000。在某些实施例中，多个非经典MHC-纳米颗粒与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起包含在足够纯以用于施用给个体的组合物中。在某些实施例中，该非经典MHC-纳米颗粒或该组合物用于治疗个体的自身免疫性病症或炎性病症的方法中。在某些实施例中，该自身免疫性病症或炎性病症是影响肝的自身免疫性病症或炎性病症。
在以下描述中，阐述了某些特定细节以便提供对各实施例的透彻理解。然而，本领域的技术人员将理解，可以在没有这些细节的情况下实践提供的实施例。除非上下文另外要求，否则在以下整个说明书和权利要求书中，词语“包含(comprise)”及其变型(例如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”)应以开放、包容的意义来解释，即解释为“包括但不限于”。如本说明书和所附权利要求书中所用，除非内容另外明确指出，否则单数形式“一种/个(a/an)”和“该”包括复数指示物。还应该注意的是，术语“或”通常以其包括“和/或”的意义来使用，除非内容另外清楚地指明。此外，本文提供的标题仅是为了方便，而不解释所要求保护的实施例的范围或含义。
当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”意味着排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物将不排除不会实质上影响要求保护的发明的一个或多个基本和新颖特征的其他材料或步骤。用于治疗或预防给定疾病的组合物可基本上由所述活性成分组成，不包括额外的活性成分，但包括其他非活性组分，诸如赋形剂、载体或稀释剂。“由……组成”应指排除多于痕量元素的其他成分和实质性方法步骤。由这些过渡项(transition term)中的每一个定义的实施例都在本披露的范围内。
如本文所用，术语“约”是指在所述量附近变化10％的量。
如本文所用，术语“个体”、“患者”或“受试者”可互换使用，并且是指被诊断出、怀疑患有或有发展至少一种疾病的风险的个体，所述组合物和方法可用于治疗该至少一种疾病。在某些实施例中，该个体是哺乳动物。在某些实施例中，该哺乳动物是小鼠、大鼠、兔、狗、猫、马、母牛、绵羊、猪、山羊、美洲驼、羊驼或牦牛。在某些实施例中，该个体是人。
如本文所用，术语“治疗(treat或treating)”是指对个体的生理或疾病状态的干预，其被设计为或旨在改善与所述生理或疾病状态相关的至少一种体征或症状。本领域技术人员将认识到，在患有疾病的个体的异质群体中，并非所有个体都会对给定的治疗产生同等或完全的反应。关于影响肝的治疗，如由标准实验室测试所确定的，这些治疗可以降低或稳定选自丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)和γ-谷氨酰转肽酶(GGT)的一种或多种肝酶的水平。如通过MRI或活组织检查所确定的，肝治疗还可以降低或稳定肝纤维化的量、储存在肝中的脂质的量、肝的大小和/或重量。影响肝的治疗可以减少炎性免疫细胞浸润的量，减少炎性细胞因子(例如，IFNγ)或趋化因子的量，增加抑制性免疫调节性细胞(诸如抑制性非变异NKT细胞)的量，或增加抑制性细胞因子(诸如IL-10)的量。
如本文所用，“颗粒”或“纳米颗粒”意在描述可施用于受试者的小的离散颗粒。在某些实施例中，颗粒的形状是基本上球形的。如本文所用，术语“基本上球形”意指颗粒的形状不会偏离球体超过约10％。可以将本披露的各种已知的抗原或多肽复合物应用于颗粒。本文所述的颗粒或纳米颗粒可包含由第一材料制成的核，以及任选地由第二材料制成的层。这些层可具有增强颗粒的整体稳定性、溶解性或生物利用度的特性。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。多肽(包括所提供的非经典MHC和非经典MHC多肽链和其他肽，例如接头和结合肽)可以包含氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如，糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。在一些方面，只要蛋白质保持所需的活性，则多肽可以含有对原生或天然序列的修饰。这些修饰可能是有意的，如通过定点诱变，也可能是偶然的，诸如通过产生蛋白质的宿主的突变或通过由于PCR扩增而导致的错误。
相对于参考多肽序列的序列同一性百分比(％)是在对序列进行比对并在必要时引入缺口以获得最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过各种已知的方式实现，例如，使用公开可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。能够确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的算法。然而，出于本文的目的，氨基酸序列同一性％值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成的。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因技术公司(Genentech,Inc.)编写，其源代码已在华盛顿特区的美国版权局(U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559)以用户文档形式提交，并在那里以美国版权登记号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从加利福尼亚州南旧金山的基因技术公司公开获得，或者可以从源代码编译。应编译ALIGN-2程序以便在UNIX操作系统(包括数字UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置且不变。
在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与、跟或针对给定氨基酸序列B(其可替代地被表述为具有或包含与、跟或针对给定氨基酸序列B的特定氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％计算如下：100乘以分数X/Y，其中X是在A和B的程序比对中通过序列比对程序ALIGN-2评定为相同匹配的氨基酸残基数，其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的％氨基酸序列同一性将不等于B与A的％氨基酸序列同一性。除非另外特别说明，否则本文使用的所有％氨基酸序列同一性值都是使用ALIGN-2计算机程序如刚才前一段所述获得的。
本文所述的多肽可由核酸编码。核酸是包含两个或更多个核苷酸碱基的多核苷酸类型。在某些实施例中，核酸是可用于将编码多肽的多核苷酸转移到细胞中的载体的组分。如本文所用，术语“载体”指的是能够运送与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是基因组整合载体，或“整合载体”，它可以整合到宿主细胞的染色体DNA中。另一种类型的载体是“附加体”载体，例如能够进行染色体外复制的核酸。能够指导其可操作地连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。合适的载体包括质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、病毒载体等。在表达载体中，用于控制转录的调节元件如启动子、增强子、多聚腺苷酸信号可以衍生自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因。也可另外掺入在宿主中复制的能力(通常由复制起点所赋予)和促进转化体识别的选择基因。可以使用衍生自病毒的载体，例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等。质粒载体可以线性化以整合到染色体位置。载体可以包括指导位点特异性整合到基因组中定义的位置或限制性位点集合的序列(例如，AttP-AttB重组)。此外，载体可包含衍生自转座元件的序列。
本文所述的核酸可以储存在“主”细胞库中或在其中运输。主细胞库包含编码含在合适细胞系中的本文所述的任何非经典MHC分子的核酸以及低温防腐剂。在某些实施例中，该细胞系是细菌细胞系(例如，大肠杆菌(E.coli))。在某些实施例中，细胞系是哺乳动物细胞系(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或人胚肾(HEK)细胞)。合适低温保护剂包括例如甘油(约10％至约20％)或DMSO(约10％至约20％)。主细胞库可以储存在能够承受冷冻至约-80℃或约196℃的合适容器中。
非经典MHC分子
如本文所用，“非经典MHC分子”或“非经典MHC”是指除经典MHC I类或MHC II类分子之外的MHC分子。在某些实施例中，该非经典MHC分子包含CD1d。在某些实施例中，该非经典MHC分子包含人CD1d。
本文描述了偶联到非经典MHC分子的纳米颗粒。在某些实施例中，偶联到纳米颗粒的非经典MHC分子包含与CD1d多肽的结合槽缔合的CD1d多肽。在某些实施例中，偶联到纳米颗粒的非经典MHC分子基本上由CD1d多肽组成。在某些实施例中，偶联到纳米颗粒的非经典MHC分子由CD1d多肽组成。与高度等位基因的经典MHC分子相比，CD1d蛋白在很大程度上是非变异的。该CD1d蛋白由人CD1D基因编码。在某些实施例中，本文所述的CD1d多肽是与人CD1d多肽(SEQ ID NO:1)至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的人CD1d多肽。在某些实施例中，该CD1d多肽包含长度为至少约50、75、100、150、200、250、300个或更多个氨基酸的多肽。在某些实施例中，病原体相关抗原包含长度小于约100、150、200、250、300、350个氨基酸的多肽。当在适当的细胞系统中产生时，CD1d将包含合适信号序列，诸如内源信号序列或异源信号序列。将在内质网中切割和去除这种信号序列。在某些实施例中，该CD1d分子包含与人CD1d多肽(SEQ ID NO:2)至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的信号序列被切割的CD1d分子。不同的生产系统可能导致进一步的N末端修剪，从而导致从SEQID NO:2的N末端去除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸。本文使用的CD1d分子还可包含跨膜结构域、细胞内结构域或两者的缺失。在某些实施例中，该CD1d分子包括与人CD1d多肽(SEQ ID NO:3)至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的信号序列被切割的跨膜/细胞内结构域缺失的CD1d分子。CD1d的序列可以进一步包含来自SEQ ID NO:3的N末端或C末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸的缺失。在某些实施例中，该CD1d分子包含与人CD1d多肽(SEQ ID NO:4)至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的信号序列被切割的跨膜/细胞内结构域缺失的CD1d分子。CD1d的序列可以进一步包含来自SEQ ID NO:4的N末端或C末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸的缺失。在某些实施例中，该CD1d多肽与SEQ ID NO:1、2、3或4约90％至100％相同或90％至100％相同。在某些实施例中，该CD1d多肽与SEQ ID NO:1、2、3或4约90％至约91％、约90％至约92％、约90％至约93％、约90％至约94％、约90％至约95％、约90％至约96％、约90％至约97％、约90％至约98％、约90％至约99％、约90％至约100％、约91％至约92％、约91％至约93％、约91％至约94％、约91％至约95％、约91％至约96％、约91％至约97％、约91％至约98％、约91％至约99％、约91％至100％、约92％至约93％、约92％至约94％、约92％至约95％、约92％至约96％、约92％至约97％、约92％至约98％、约92％至约99％、约92％至约100％、约93％至约94％、约93％至约95％、约93％至约96％、约93％至约97％、约93％至约98％、约93％至约99％、约93％至100％、约94％至约95％、约94％至约96％、约94％至约97％、约94％至约98％、约94％至约99％、约94％至100％、约95％至约96％、约95％至约97％、约95％至约98％、约95％至约99％、约95％至100％、约96％至约97％、约96％至约98％、约96％至约99％、约96％至100％、约97％至约98％、约97％至约99％、约97％至100％、约98％至约99％、98％至100％或约99％至100％相同。在某些实施例中，该CD1d多肽与SEQ ID NO:1、2、3或4约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同。在某些实施例中，该CD1d多肽与SEQ ID NO:1、2、3或4至少约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或99％相同。在某些实施例中，该CD1d多肽与SEQ IDNO:1、2、3或4至多约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％相同。在某些实施例中，该CD1d多肽与SEQ ID NO:1、2、3或4中的任一个相同。
体内Cd1d与β2m缔合以促进NKT细胞的衔接。因此，ncMHC-NP也可以包含β2m多肽。在某些实施例中，本文所述的CD1d多肽是与人β2m多肽(SEQ ID NO:5)至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的β2m多肽。在某些实施例中，该β2m多肽包含长度为至少约10、20、30、40、50、75、100或更多个氨基酸的多肽。在某些实施例中，病原体相关抗原包含长度小于约100、75、50、40、30、20或10个氨基酸的多肽。β2m的序列可以进一步包含来自SEQ IDNO:5的N末端或C末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸的缺失。该β2m多肽可以进一步通过接头偶联到Cd1d多肽。在某些实施例中，该β2m多肽可以进一步通过接头偶联到Cd1d多肽的N末端。在某些实施例中，该β2m多肽可以进一步通过接头偶联到Cd1d多肽的C末端。在某些实施例中，该接头是柔性多肽接头。此类接头包括Gly-Ser接头(G3S1)X或(G4S1)X。在某些实施例中，X是任何整数，诸如1、2、3、4或5。
该CD1d-β2m多肽可以作为单一多肽表达和纯化。在某些实施例中，本文所述的CD1d-β2m多肽是与人CD1d-β2m多肽(SEQ ID NO:6)至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的人CD1d-β2m多肽。在某些实施例中，本文所述的CD1d-β2m多肽包含与CD1d-β2m多肽(SEQ ID NO:6氨基酸1至427)至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的CD1d-β2m多肽。在某些实施例中，本文描述了一种核酸，其包含编码与CD1d-β2m多肽(SEQ ID NO:6氨基酸1至427)至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的多肽的核酸序列。
在某些实施例中，该CD1d多肽包含C末端半胱氨酸或赖氨酸以允许偶联到官能化的接头或层。在某些实施例中，该接头或层是官能化的PEG或右旋糖酐分子。
如本文所述和本申请人所示，NKT细胞存在许多不同的亚群，其中一些是炎性的，而一些是调节性或抗炎性的。申请人已发现，在纳米颗粒的上下文中，呈递给NKT细胞的CD1d糖脂抗原将iNKT细胞重新编程为可用于治疗自身免疫性疾病和炎性疾病的新的调节性iNKT细胞亚群。
CD1d将糖脂抗原呈递给iNKT细胞。本文所述的ncMHC-NP包含与非经典MHC分子的结合槽结合的糖脂配体。在某些实施例中，该ncMHC-NP的非经典MHC包含CD1d或由CD1d组成。在某些实施例中，该非经典MHC-纳米颗粒包含鞘脂或其类似物。在某些实施例中，该鞘脂或其类似物包括神经酰胺或其类似物。在某些实施例中，该神经酰胺或其类似物包括α-半乳糖神经酰胺(KRN7000)、α-C-半乳糖神经酰胺、α-葡萄糖醛酸神经酰胺、β-半乳糖神经酰胺、PBS-20、PBS-25、硫苷脂、异红细胞三糖神经酰胺(iGb3)、GSL-1、α-葡萄糖醛酸神经酰胺、磷脂酰肌醇甘露糖苷(PIM)、PIM4、五甲基二氢苯并呋喃磺酸苯酯(PPBF)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)或其组合。在某些实施例中，该神经酰胺或其类似物包括α-半乳糖神经酰胺(KRN7000)、α-C-半乳糖神经酰胺、α-葡萄糖醛酸神经酰胺、β-半乳糖神经酰胺、PBS-20、PBS-25、硫苷脂、异红细胞三糖神经酰胺(iGb3)或其组合。在某些实施例中，该神经酰胺或其类似物包括α-半乳糖神经酰胺(αGalCer或KRN7000)。在某些实施例中，该CD1d包含一个、两个、三个、四个、五个或六个不同的神经酰胺配体。在某些实施例中，该CD1d包含单一类型的神经酰胺配体。在某些实施例中，该神经酰胺配体包括αGalCer或KRN7000。在某些实施例中，该神经酰胺源自鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)(包囊鞘氨醇单胞菌(S.capsulata)、少动鞘氨醇单胞菌(S.paucimobilis)和维提弛鞘氨醇单胞菌(S.wittichii))或鼠埃立克体(Ehrlichia muris)的细菌神经酰胺。
参考图1，本文描述的ncMHC-NP的特定非限制性实施例包含核101，其任选地被亲水层102包围。该ncMHC进一步包含含有鞘脂配体104的多个CD1d分子103。该配体与CD1d分子的结合槽缔合，使得iNKT细胞的非变异α-βT细胞受体105可以与配体相互作用。核101可适合地包含致密材料，并且在某些实施例中，该致密材料包含金属或金属氧化物。该可选层102可以是亲水性生物相容性材料，诸如聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐或甘露醇。该层可以进一步被官能化，使得CD1d分子103可以偶联到该层。技术人员将会认识到，由于空间位阻，并非该层的每个分子都会或可以偶联到CD1d分子。此外，该层在基本上均匀地包被颗粒的同时可以将复合物的总直径增加至少约5nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、40nm或50nm。此外，该层可以是单一类型的亲水性分子或不同类型的混合物，第一种类型与CD1d分子缀合，并且第二种类型提供了稳定性、溶解性、生物利用度和/或生物吸收所需的其他特性。在某些实施例中，该ncMHC-NP不包含免疫激活共刺激分子或细胞因子/细胞因子受体。
纳米颗粒
ncMHC-NP的纳米颗粒适合地由致密的非脂质体材料制成。该ncMHC-NP的纳米颗粒核包含以下，或基本上由以下组成或再进一步由以下组成：例如固体核、金属核、树状大分子核、聚合物胶束纳米颗粒核、纳米棒、富勒烯、纳米壳、核壳、基于蛋白质的纳米结构或基于脂质的纳米结构。在一些方面，该纳米颗粒核是可生物吸收和/或可生物降解的。在一些方面，该纳米颗粒核是树状大分子纳米颗粒核，其包含以下，或可替代地基本上由以下组成或再进一步由以下组成：具有从核生长的树状结构的高度支化的大分子。在其他方面，该树状大分子纳米颗粒核可以包含以下，或可替代地基本上由以下组成或再进一步由以下组成：基于聚(酰胺胺)的树状大分子或基于聚-L-赖氨酸的树状大分子。在某些方面，该纳米颗粒核是聚合物胶束核，该聚合物胶束核包含以下，或可替代地基本上由以下组成或再进一步由以下组成：组装成纳米尺度核-壳结构的两亲性嵌段共聚物。在其他方面，该聚合物胶束核包含以下，或可替代地基本上由以下组成或再进一步由以下组成：使用聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺嵌段共聚物产生的聚合物胶束。在其他方面，该纳米颗粒核包含以下，或可替代地基本上由以下组成或再进一步由以下组成：金属。在另一方面，该纳米颗粒核不是脂质体。核材料的另外实例包括但不限于标准和特种玻璃、二氧化硅、聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸酯、丙烯酸聚合物、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈、聚酰胺、含氟聚合物、硅酮、纤维素、硅、金属(例如，铁、金、银)、矿物(例如，红宝石)、纳米颗粒(例如，金纳米颗粒、胶体颗粒、金属氧化物、金属硫化物、金属硒化物和磁性材料诸如氧化铁)及其复合物。在一些实施例中，氧化铁纳米颗粒核包含氧化铁(II，III)或由其组成。该核可以是均一的组成，或者是两类或更多类材料的复合物，这取决于所需的特性。在某些方面，金属纳米颗粒将被使用。这些金属颗粒或纳米颗粒可以由Au、Pt、Pd、Cu、Ag、Co、Fe、Ni、Mn、Sm、Nd、Pr、Gd、Ti、Zr、Si和In，前体，它们的二元合金，它们的三元合金和它们的金属间化合物形成。参见美国专利6,712,997，将其通过引用以其全文并入本文。在某些实施例中，如果纳米颗粒是生物相容的和生物可吸收的，则核和层(下文描述)的组成可以变化。该核可以是均一的组成，或者是两类或更多类材料的复合物，这取决于所需的特性。在某些方面，将使用金属纳米球。这些金属纳米颗粒可以由Fe、Ca、Ga等形成。在某些实施例中，该纳米颗粒包含以下，或可替代地基本上由以下组成或再进一步由以下组成：包含金属或金属氧化物诸如金、铁或铁氧化物的核。
纳米颗粒核的尺寸范围可以在约1nm到约1μm之间。在某些实施例中，该纳米颗粒核的直径小于约1μm。在其他实施例中，该纳米颗粒核的直径小于约500nm、小于约400nm、小于约300nm、小于约200nm、小于约100nm、小于约90nm、小于约80nm、小于约75nm、小于约70nm、小于约60nm、小于约50nm、小于约40nm或小于约30nm。在其他实施例中，该纳米颗粒核的直径大于约5nm、大于约6nm、大于约7nm、大于约7nm、大于约8nm、大于约9nm、大于约10nm、大于约12nm、大于约15nm、大于约16nm、大于约17nm、大于约18nm、大于约19nm、大于约20nm或大于约21nm。在某些实施例中，该纳米颗粒核的直径从约1nm至约10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、75nm或100nm。在某些实施例中，该纳米颗粒核的直径从约5nm至约10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、75nm或100nm。在某些实施例中，该纳米颗粒核的直径从约6nm至约10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、75nm或100nm。在某些实施例中，该纳米颗粒核的直径从约7nm至约10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、75nm或100nm。在某些实施例中，该纳米颗粒核的直径从约8nm至约15nm、20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、75nm或100nm。在某些实施例中，该纳米颗粒核的直径从约9nm至约15nm、20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、75nm或100nm。在某些实施例中，该纳米颗粒核的直径从约10nm至约15nm、20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、75nm或100nm。在某些实施例中，该纳米颗粒核的直径从约11nm至约15nm、20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、75nm或100nm。在某些实施例中，该纳米颗粒核的直径从约12nm至约20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、75nm或100nm。在某些实施例中，该纳米颗粒核的直径从约13nm至约20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、75nm或100nm。在某些实施例中，该纳米颗粒核的直径从约14nm至约20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、75nm或100nm。在某些实施例中，该纳米颗粒核的直径从约15nm至约20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、75nm或100nm。在某些实施例中，该纳米颗粒核的直径从约16nm至约20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、75nm或100nm。在某些实施例中，该纳米颗粒核的直径从约17nm至约25nm、30nm、40nm、50nm、75nm或100nm。在某些实施例中，该纳米颗粒核的直径从约18nm至约25nm、30nm、40nm、50nm、75nm或100nm。在某些实施例中，该纳米颗粒核的直径从约19nm至约25nm、30nm、40nm、50nm、75nm或100nm。在某些实施例中，该纳米颗粒核的直径从约20nm至约25nm、30nm、40nm、50nm、75nm或100nm。在某些实施例中，该纳米颗粒核的直径从约21nm至约25nm、30nm、40nm、50nm、75nm或100nm。
在特定实施例中，该纳米颗粒核的直径从约1nm至约100nm；从约1nm至约75nm；从约1nm至约50nm；从约1nm至约25nm；从约1nm至约25nm；从约5nm至约100nm；从约5nm至约50nm；从约5nm至约40nm；从约5nm至约30nm；从约5nm至约25nm，或从约5nm至约20nm。在一些实施例中，该纳米颗粒核的直径从约10nm至约60nm、从约10nm至约50nm、从约10nm至约40nm、从约10nm至约30nm、从约10nm至约25nm、从约10nm至约20nm。在一些实施例中，该纳米颗粒核的直径从约15nm至约50nm、从约15nm至约40nm、从约15nm至约35nm、从约15nm至约30nm、从约15nm至约25nm。
该纳米颗粒典型地由基本上球形的核和任选的一个或多个层或包衣组成。如本文所述，核可以在尺寸和组成上变化。除了该核之外，该颗粒可以具有一个或多个层以提供适合于目的应用的官能度。层可以赋予化学或生物官能度，这里称为化学活性层或生物活性层。这些层通常应用在所述颗粒的外表面上，并且可以向ncMHC-NP赋予官能度。该一层或多层的厚度范围通常可以在约1nm到100nm之间。层的厚度可在从约1nm至约5nm、从约1nm至约10nm、从约1nm至约40nm或从约1nm至约50nm之间变化。在某些实施例中，该层可以被吸附到纳米颗粒核上。在某些实施例中，该层可以使用基于核组合物的任何合适的化学共价偶联到纳米颗粒核。例如，如果该纳米颗粒包含金属或金属氧化物，则该层可以通过配位共价键偶联到纳米颗粒核。
该层或包衣可以包含以下，或可替代地基本上由以下组成或再进一步由以下组成：生物可降解糖或其他聚合物。生物可降解层的实例包括但不限于葡聚糖；聚(乙二醇)(PEG)；聚(环氧乙烷)；甘露醇；基于聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚己内酯(PCL)的聚(酯)；PHB-PHV类的聚(羟基链烷酸酯)；以及其他改性多糖(poly(saccharides))，诸如淀粉、纤维素和壳聚糖。此外，该纳米颗粒可包括具有用于附加用于化学结合或偶联位点的化学官能度的合适表面的层。
可以以本领域技术人员已知的多种方式在纳米颗粒上产生层。实例包括溶胶-凝胶化学技术，诸如如下中所述：Iler,Chemistry of Silica[二氧化硅化学],约翰·威利父子出版公司(John Wiley&Sons),1979；Brinker和Scherer,Sol-gel Science[溶胶-凝胶科学],Academic Press[学术出版社],(1990)。在纳米颗粒上产生层的其他方法包括表面化学和封装技术，诸如如下中所述：Partch和Brown,J.Adhesion[粘接杂志],67:259-276,1998；Pekarek等人,Nature[自然],367:258,(1994)；Hanprasopwattana,Langmuir[朗缪尔],12:3173-3179,(1996)；Davies,Advanced Materials[先进材料],10:1264-1270,(1998)；以及其中的参考文献。也可以使用气相沉积技术；参见例如，Golman和Shinohara,Trends Chem.Engin.[化工趋势],6:1-6,(2000)；和美国专利号6,387,498。还有其他方法包括逐层自组装技术，诸如如下中所述：Sukhorukov等人,Polymers Adv.Tech.[先进技术聚合物],9(10-11):759-767,(1998)；Caruso等人,Macromolecules[大分子],32(7):2317-2328,(1998)；Caruso等人,J.Amer.Chem.Soc.[美国化学会志],121(25):6039-6046,(1999)；美国专利号6,103,379和其中引用的参考文献。
多个非经典MHC分子可以以特定化合价偶联到纳米颗粒。化合价是ncMHC复合物数量/纳米颗粒核。在某些实施例中，该纳米颗粒的化合价范围可以在约1个ncMHC复合物:1个纳米颗粒核(1:1)到约6000个ncMHC复合物:1个纳米颗粒核(6000:1)之间。在一些实施例中，化合价从约1:1至约6000:1、从约1:1至约5500:1、从约1:1至约5000:1、从约1:1至约4000:1、从约1:1至约3500:1、从约1:1至约3000:1、从约1:1至约2500:1、从约1:1至约2000:1、从约1:1至约1500:1、从约1:1至约1000:1、从约1:1至约500:1、从约1:1至约400:1、从约1:1至约300:1、从约1:1至约200:1、从约1:1至约100:1或从约1:1至约50:1。在一些实施例中，化合价从约2:1至约6000:1、从约2:1至约5500:1、从约2:1至约5000:1、从约2:1至约4000:1、从约2:1至约3500:1、从约2:1至约3000:1、从约2:1至约2500:1、从约2:1至约2000:1、从约2:1至约1500:1、从约2:1至约1000:1、从约2:1至约500:1、从约2:1至约400:1、从约2:1至约300:1、从约2:1至约200:1、从约2:1至约100:1或从约2:1至约50:1。在一些实施例中，化合价从约5:1至约6000:1、从约5:1至约5500:1、从约5:1至约5000:1、从约5:1至约4000:1、从约5:1至约3500:1、从约5:1至约3000:1、从约5:1至约2500:1、从约5:1至约2000:1、从约5:1至约1500:1、从约5:1至约1000:1、从约5:1至约500:1、从约5:1至约400:1、从约5:1至约300:1、从约5:1至约200:1、从约5:1至约100:1或从约5:1至约50:1。在一些实施例中，化合价从约8:1至约6000:1、从约8:1至约5500:1、从约8:1至约5000:1、从约8:1至约4000:1、从约8:1至约3500:1、从约8:1至约3000:1、从约8:1至约2500:1、从约8:1至约2000:1、从约8:1至约1500:1、从约8:1至约1000:1、从约8:1至约500:1、从约8:1至约400:1、从约8:1至约300:1、从约8:1至约200:1、从约8:1至约100:1或从约8:1至约50:1。在一些方面，化合价从约10:1至约6000:1、从约20:1至约5500:1、从约10:1至约5000:1、从约10:1至约4000:1、从约10:1至约3500:1、从约10:1至约3000:1、从约10:1至约2500:1、从约10:1至约2000:1、从约10:1至约1500:1、从约10:1至约1000:1、从约10:1至约500:1、从约10:1至约400:1、从约10:1至约300:1、从约10:1至约200:1、从约10:1至约100:1或从约10:1至约50:1。在一些实施例中，化合价从约15:1至约6000:1、从约15:1至约5500:1、从约15:1至约5000:1、从约15:1至约4000:1、从约15:1至约3500:1、从约15:1至约3000:1、从约15:1至约2500:1、从约15:1至约2000:1、从约15:1至约1500:1、从约15:1至约1000:1、从约15:1至约500:1、从约15:1至约400:1、从约15:1至约300:1、从约15:1至约200:1、从约15:1至约100:1或从约15:1至约50:1。在一些实施例中，化合价从约20:1至约6000:1、从约20:1至约5500:1、从约20:1至约5000:1、从约20:1至约4000:1、从约20:1至约3500:1、从约20:1至约3000:1、从约20:1至约2500:1、从约20:1至约2000:1、从约20:1至约1500:1、从约20:1至约1000:1、从约20:1至约500:1、从约20:1至约400:1、从约20:1至约300:1、从约20:1至约200:1、从约20:1至约100:1或从约20:1至约50:1。
制备非经典MHC分子的方法
纳米颗粒可以通过以下来形成：将含有ncMHC复合物和聚合物的水相与非水相接触，然后蒸发非水相以引起来自水相的颗粒的聚结，如美国专利号4,589,330或4,818,542中所教导的。用于这种制剂的某些聚合物是天然或合成共聚物或聚合物，其包括明胶琼脂、淀粉、阿拉伯半乳聚糖、白蛋白、胶原、聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)丙交酯聚(ε-己内酯)、聚(ε-己内酯-共-乳酸)、聚(ε-己内酯-共-乙醇酸)、聚(β-羟基丁酸)、聚(环氧乙烷)、聚乙烯、聚(烷基-2-氰基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚酰胺、聚(氨基酸)、聚(2-羟乙基DL-天冬酰胺)、聚(酯脲)、聚(L-苯丙氨酸/乙二醇/1,6-二异氰酰己烷)和聚(甲基丙烯酸甲酯)。特别地，某些聚合物是聚酯，诸如聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)丙交酯聚(ε-己内酯)、聚(ε-己内酯-共-乳酸)和聚(ε-己内酯-共-乙醇酸)。用于溶解聚合物的溶剂包括：水、六氟异丙醇、亚甲基氯、四氢呋喃、己烷、苯或六氟丙酮倍半水合物。
本文所述的ncMHC可以通过前面提到的层或(如果没有层存在)通过接头分子偶联到纳米颗粒。在某些实施例中，此类接头分子包含聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐或甘露醇，基本上由其组成或由其组成。在某些实施例中，此类接头分子包含聚乙二醇(PEG)、基本上由其组成或由其组成。在某些实施例中，此类接头分子包含右旋糖酐、基本上由其组成或由其组成。此类层和接头可以用能够与ncMHC形成共价键的基团进行官能化或衍生化。该反应可以是任何合适的反应，包括但不限于胺到胺、巯基到巯基、胺到巯基、羧基到胺或巯基到羧基。在某些实施例中，该ncMHC通过ncMHC上的NHS酯和伯胺(例如，赖氨酸残基)的反应偶联到该接头或层。在某些实施例中，该ncMHC通过ncMHC上的亚胺酯和伯胺(例如，赖氨酸残基)的反应偶联到该接头或层。在某些实施例中，该ncMHC通过ncMHC上的酰胺基和巯基(例如，半胱氨酸残基)的反应偶联到该接头或层。在某些实施例中，该ncMHC通过ncMHC上的马来酰亚胺基和巯基(例如，半胱氨酸残基)的反应偶联到该接头或层。在某些实施例中，该ncMHC通过ncMHC上的马来酰亚胺基和伯胺基的反应偶联到该接头或层。在某些实施例中，该ncMHC通过ncMHC上的卤代乙酰基和巯基的反应偶联到该接头或层。在某些实施例中，该ncMHC通过ncMHC上的卤代乙酰基和伯胺基团的反应偶联到该接头或层。在某些实施例中，ncMHC通过ncMHC上的吡啶二巯基和巯基的反应偶联到该接头或层。在某些实施例中，该ncMHC通过NCMHC上的吡啶二巯基和伯胺基的反应偶联到该接头或层。在某些实施例中，该ncMHC通过ncMHC上的碳二亚胺和伯胺基的反应偶联到该接头或层。在某些实施例中，该ncMHC通过异双官能接头偶联到该接头或层。在某些实施例中，该ncMHC通过ncMHC上的马来酰亚胺/酰肼和巯基的反应偶联到该接头或层。在某些实施例中，该ncMHC通过ncMHC上的吡啶二巯基/酰肼和巯基的反应偶联到该接头或层。在某些实施例中，该交联剂是光反应性交联剂。
如所述(Perrault,S.D.等人(2009)Nano Lett[纳米通讯]9:1909-1915)，使用用柠檬酸钠化学还原氯化金来合成金纳米颗粒(GNP)。简言之，在剧烈搅拌下将2mL 1％的HAuCl4(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))添加到100mL H2O中，并在油浴中加热所述溶液。将6mL(对于14nm GNP)或2mL(对于40nm GNP)的1％柠檬酸钠添加到沸腾的HAuCl4溶液中，再搅拌10分钟，然后冷却至室温。通过添加1μMol用-COOH或-NH2基团官能化的硫醇-PEG接头(纳米公司(Nanocs)，马塞诸塞州)作为MHC的受体来稳定GNP。聚乙二醇化的GNP用水洗涤以除去游离的硫醇-PEG，浓缩并储存在水中以作进一步分析。用分光光度法测定NP密度，并根据比尔定律(Beer’s law)计算NP密度。
氧化铁NP(SFP IONP)也可以通过铁盐(诸如乙酸铁)在有机溶剂中在表面活性剂存在下的热分解产生，然后通过聚乙二醇化在水性缓冲液中形成溶剂(Xie,J.等人(2007)Adv Mater[先进材料]19:3163；Xie,J.等人(2006)Pure Appl.Chem.[纯粹与应用化学]78:1003-1014；Xu,C.等人(2007)Polymer International[国际聚合物]56:821-826)。简言之，将2mMol Fe(acac)3(西格玛奥德里奇公司，奥克维尔(Oakville)，ON)溶解在10mL苄基醚和油胺的混合物中，并加热至100℃持续1小时，然后在氮气层保护下在回流情况下300℃持续2小时。合成的NP通过添加乙醇沉淀并且再悬浮于正己烷中。对于IONP的聚乙二醇化，将100mg不同的3.5kDa DPA-PEG接头(美国杰克曼技术公司(Jenkem Tech USA))溶解在CHCl3和HCON(CH3)2(二甲基甲酰胺(DMF))的混合物中。然后将NP溶液(20mg Fe)添加到DPA-PEG溶液中，并在室温下搅拌4小时。聚乙二醇化的SFP NP通过添加己烷沉淀过夜，并且然后再悬浮于水中。通过高速离心(20,000xg，30min)去除痕量聚集体，并将单分散的SFP NP储存在水中，用于进一步表征和ncMHC缀合。在2N HCL中A410处用分光光度法测定IONP产物中铁的浓度。基于SFP NP(Fe3O4；8+1nm直径)的分子结构和直径(Xie,J.等人(2007)Adv Mater[先进材料]19:3163；Xie,J.等人(2006)Pure Appl.Chem.[纯粹与应用化学]78:1003-1014)，申请人估计含有1mg铁的SFP溶液含有5x 1014个NP。
还可以通过热分解或加热纳米颗粒前体来制备纳米颗粒。在一个实施例中，纳米颗粒是金属或金属氧化物纳米颗粒。在一个实施例中，纳米颗粒是氧化铁纳米颗粒。在一个实施例中，纳米颗粒是金纳米颗粒。在一个实施例中，本文提供了根据本技术制备的纳米颗粒。在一个实施例中，本文提供了一种制备氧化铁纳米颗粒的方法，该方法包括乙酰丙酮铁的热分解反应。在一个实施例中，获得的氧化铁纳米颗粒是水溶性的。在一方面，该氧化铁纳米颗粒适合于蛋白质缀合。在一个实施例中，该方法包括单步热分解反应。
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Figure BDA0003479802460000261
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在一方面，热分解发生在官能化的PEG分子的存在下。Singha等人“Peptide-MHC-based nanomedicines for autoimmunity function as T-cell receptormicroclustering devices[基于肽-MHC的自身免疫功能纳米药物作为T细胞受体微聚类装置发挥作用].”Nat Nanotechnol.[自然纳米技术]2017年7月；12(7):701-710中描述了热分解以产生具有官能化的PEG接头的可溶性的稳定的纳米颗粒。官能化的PEG接头的某些非限制性实例显示在表1中。
在一方面，热分解包括加热铁盐。在一方面，热分解包括加热乙酰丙酮铁。在一个实施例中，热分解包括在官能化的PEG分子存在下加热乙酰丙酮铁。在一个实施例中，热分解包括在苄基醚和官能化的PEG分子存在下加热乙酰丙酮铁。
不受理论的束缚，在一个实施例中，官能化的PEG分子用作还原剂和表面活性剂。本文提供的制备纳米颗粒的方法简化和改进了常规方法，该常规方法使用难以被PEG分子置换或不能被PEG分子置换至完全的表面活性剂来使颗粒成为水溶性。通常，表面活性剂可能是昂贵的(例如磷脂)或有毒的(例如油酸或油酸胺)。在另一方面，在不受理论约束的情况下，制造纳米颗粒的方法避免了使用常规表面活性剂的需要，从而实现高程度的分子纯度和水溶性。
在一个实施例中，热分解涉及乙酰丙酮铁和苄基醚，并且在不存在除本文所用的那些之外的常规表面活性剂的情况下。
在一个实施例中，热分解温度为约80℃至约300℃、或约80℃至约200℃、或约80℃至约150℃、或约100℃至约250℃、或约100℃至约200℃、或约150℃至约250℃、或约150℃至约250℃。在一个实施例中，热分解发生在约1至约2小时的时间内。
在一个实施例中，制备氧化铁纳米颗粒的方法包括纯化步骤，例如通过使用Miltenyi Biotec LS磁体柱。
在一个实施例中，纳米颗粒在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中在约4℃下稳定，没有任何可检测的降解或聚集。在一个实施例中，纳米颗粒稳定至少6个月。
在一方面，本文提供了一种制备纳米颗粒复合物的方法，所述方法包括将ncMHC与本文提供的氧化铁纳米颗粒接触。不受理论约束，ncMHC在其羧基末端编码半胱氨酸，该半胱氨酸可在约pH 6.2至约pH 6.5下与官能化的PEG中的马来酰亚胺基团反应约12至约14小时。
在一方面，制备纳米颗粒复合物的方法包括纯化步骤，例如通过使用MiltenyiBiotec LS磁体柱。
在某些方面，ncMHC复合物可以通过以下中的一种或多种方式偶联到纳米颗粒核：共价、非共价偶联，或交联，以及任选地通过接头偶联。在某些方面，该接头包括聚乙二醇或右旋糖酐。在某些方面，该接头是聚乙二醇或右旋糖酐。在其他方面，接头的尺寸可以小于5kD，并且任选地是聚乙二醇。在其他方面，接头的尺寸可以小于5kD，并且任选地是右旋糖酐。在涉及一个或多个接头的方面中，接头在单个纳米颗粒核上可以彼此相同或不同。
术语“连接分子”或“接头”是指能够与基底或颗粒连接并且还能够与MHC复合物连接的物质。
在某些实施例中，该接头包括分子量小于500道尔顿的聚乙二醇。在一些实施例中，聚乙二醇具有小于1kD、2kD、3kD、4kD、5kD、6kD、7kD、8kD、9kD、或10kD的分子量。在一些实施例中，聚乙二醇具有高达并且包括1kD、2kD、3kD、4kD、5kD、6kD、7kD、8kD、9kD、或10kD的分子量。在一些实施例中，聚乙二醇具有约1kD至约5kD、约2kD至约5kD、或约3kD至约5kD的分子量。在一些实施例中，聚乙二醇用马来酰亚胺官能化。在一些实施例中，将聚乙二醇用羧基官能化。在某些实施例中，接头与固体核接触的端部嵌入固体核中。在某些实施例中，将接头与固体核接触的端部吸附到固体核中。在某些实施例中，与实心核接触的接头末端与实心核，尤其是与金属核(铁、氧化铁或金等)形成配位共价键。
接头与纳米颗粒的偶联可以通过化学修饰该基底或颗粒来产生，该化学修饰通常涉及在表面上产生“官能团”，所述官能团能够结合到ncMHC复合物，和/或将该表面或颗粒的任选化学修饰的表面与共价或非共价结合的所谓“连接分子”连接，随后使该ncMHC或ncMHC复合物与所获得的颗粒反应。
上文所用的术语“官能团”不限于形成共价键的反应性化学基团，还包括导致与MHC复合物的离子相互作用或氢键的化学基团。此外，应该注意的是，在表面产生的“官能团”和带有“官能团”的连接分子之间不可能有严格的区别，因为有时表面的改性需要较小的连接分子诸如乙二醇与颗粒表面反应。
官能团或带有它们的连接分子可选自氨基、碳酸基、硫醇、硫醚、二硫化物、胍基、羟基、胺基、邻二醇、醛、α-卤代乙酰基、汞有机基、酯基、酸卤化物、酸硫酯、酸酐、异氰酸酯、异硫氰酸酯、磺酸卤化物、亚胺酯、重氮乙酸酯、重氮盐、1,2-二酮、膦酸、磷酸酯、磺酸、偶氮内酯(azolides)、咪唑、吲哚、N-马来酰亚胺、α-β-不饱和羰基化合物、芳基卤化物或它们的衍生物。
具有较高分子量的其他连接分子的非限制性实例是核酸分子、聚合物、共聚物、可聚合偶联剂、二氧化硅、蛋白质和具有相对于该基底或颗粒具有相反极性的表面的链状分子。核酸可以提供与亲和分子的连接，所述亲和分子自身包含核酸分子，尽管相对于连接分子有互补的序列。
在一些实施例中，连接分子包含聚乙二醇。在一些实施例中，连接分子包含聚乙二醇和马来酰亚胺。在一些实施例中，聚乙二醇包含C1-C3烷氧基、-R10NHC(O)R-、-R10C(O)NHR-、-R10OC(O)R-、-R10C(O)OR-中的一个或多个，其中每个R独立地是H或C1-C6烷基，并且其中每个R10独立地是键或C1-C6烷基。
作为可聚合偶联剂的实例，可以引用联乙炔、苯乙烯丁二烯、乙酸乙烯酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯基化合物、苯乙烯、氧化硅、氧化硼、氧化磷、硼酸盐、吡咯、聚吡咯和磷酸盐。
ncMHC复合物可以通过多种方法偶联到纳米颗粒。一个非限制性实例包括与用带有远端-NH2或-COOH基团的PEG接头产生的至NP的缀合，其可以通过在1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)存在下形成酰胺键来实现。首先将带有-COOH基团的NP溶解在pH 5.5的20mM MES缓冲液中。向NP溶液中添加N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(磺胺-NHS(sulpha-NHS)，赛默飞世尔科技公司(Thermo scientific)，沃尔瑟姆(Waltham)，马塞诸塞州，终浓度10mM)和EDC(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)，沃尔瑟姆，马塞诸塞州，终浓度1mM)。在室温下搅拌20分钟后，将NP溶液滴加到溶于20mM硼酸盐缓冲液(pH 8.2)中的含有ncMHC单体的溶液中。将混合物再搅拌4小时。为了将MHC与NH2-官能化的NP缀合，首先将ncMHC复合物溶解在20mM MES缓冲液(pH 5.5，含100mM NaCl)中。然后向MHC溶液中添加磺胺-NHS(10mM)和EDC(5mM)。然后将活化的MHC分子添加到20mM硼酸盐缓冲液(pH8.2)中的NP溶液中，并在室温下搅拌4小时。
为了将MHC与马来酰亚胺官能化的NP缀合，首先将ncMHC复合物与三丁基膦(TBP，1mM)在室温下孵育4小时，然后将工程改造以编码游离羧基端Cys残基的ncMHC与NP在40mM磷酸盐缓冲液(pH6.0，含2mM EDTA，150mM NaCl)中混合，并在室温下孵育过夜。ncMHC复合物的MHC通过在马来酰亚胺基团和Cys残基之间形成碳硫键与NP共价结合。
点击化学可用于将ncMHC或亲和素与用叠氮化物基团官能化的NP缀合。对于该反应，首先在室温下将MHC或亲和素分子与包含二苯并环辛基(DBCO)官能团的合适试剂一起孵育，例如：DBCO-NHS(Click Chemistry Tools，亚利桑那州斯科特代尔)试剂，持续2小时。含有游离DBCO的分子可通过透析过夜去除。然后将MHC-或亲和素-DBCO缀合物与SFP-Z孵育2小时，导致ncMHC或亲和素分子与NP之间形成三唑键。
不同ncMHC-NP缀合反应中的未缀合的ncMHC复合物可以使用本领域已知的方法通过广泛透析去除。非限制性实例是在4℃下通过300kDa分子量截断值膜(光谱实验室(Spectrum labs))用PBS(pH 7.4)进行透析的。可替代地，ncMHC缀合的IONP可以通过磁分离来纯化。通过Amicon Ultra-15单位(100kDa MWCO)超滤浓缩缀合的NP并储存在PBS中。
基底或颗粒的表面可以进行化学修饰，例如通过具有官能性反应基团的膦酸衍生物的结合。这些膦酸或膦酸酯衍生物的一个实例是可根据“Mannich-Moedritzer”反应合成的亚氨基-双(亚甲基膦)碳酸。该结合反应可以用直接从制备方法获得的或在预治疗(例如用三甲基甲硅烷基溴预治疗)之后获得的基底或颗粒进行。在第一种情况下，膦酸(酯)衍生物可以例如置换反应介质中仍结合在表面上的组分。这种置换可以在较高的温度下得到增强。另一方面，三甲基甲硅烷基溴被认为可以使含烷基的基于磷的络合剂脱烷基，从而为膦酸(酯)衍生物创造新的结合位点。膦酸(酯)衍生物或与其结合的连接分子可以显示与上述给出相同的官能团。基底或颗粒的表面治疗的另一个实例涉及在二醇如乙二醇中加热。应当注意，如果合成已经在二醇中进行，则该治疗可能是多余的。在这些情况下，直接得到的合成产物很可能显示出必要的官能团。然而，该治疗适用于在含N或P的络合剂中产生的基底或颗粒。如果用乙二醇对这样的基底或颗粒进行后治疗，则仍与表面结合的反应介质(例如络合剂)的成分可被二醇替代和/或可被脱烷基。
还可以用具有第二官能团的伯胺衍生物替代仍结合到颗粒表面的含N络合剂。基底或颗粒的表面也可以包被二氧化硅。二氧化硅允许有机分子相对简单的化学缀合，因为二氧化硅容易与有机接头，如三乙氧基硅烷或氯硅烷反应。颗粒表面也可以由均聚物或共聚物包被。可聚合偶联剂的实例为：N-(3-氨基丙基)-3-巯基苯甲脒、3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基酰肼和3-三甲氧基甲硅烷基)丙基马来酰亚胺。本文提及可聚合偶联剂的其他非限制性实例。这些偶联剂可以单独使用，也可以组合使用，这取决于作为包衣的要生成的共聚物的类型。
可与含有氧化过渡金属化合物的基底或颗粒一起使用的另一种表面修饰技术是通过氯气或有机氯化剂将氧化过渡金属化合物转化为相应的氧氯化物。这些氯氧化物能够与亲核试剂反应，诸如生物分子中经常发现的羟基或氨基。这种技术允许产生与蛋白质的直接缀合，例如，通过赖氨酸侧链的氨基。在用氯氧化物进行表面修饰后与蛋白质的缀合也可以通过使用双官能接头，如马来酰亚胺丙酸酰肼来实现。
对于非共价连接技术，具有与基底或颗粒表面相反的极性或电荷的链型分子是特别合适的。可非共价连接到核/壳纳米颗粒的连接分子的实例包括阴离子、阳离子或两性离子表面活性剂，酸性或碱性蛋白质，聚胺，聚酰胺，聚砜或聚羧酸。基底或颗粒与具有官能性反应基团的两亲性试剂之间的疏水相互作用可以产生必要的连接。特别地，具有两亲特征的链型分子，诸如磷脂或衍生的多糖(它们可以彼此交联)，是有用的。这些分子在表面的吸附可以通过共孵育来实现。亲和分子与基底或颗粒之间的结合也可以基于非共价、自组织键。其一个实例涉及具有生物素作为连接分子的简单检测探针和偶联亲和素或链霉亲和素的分子。
官能团与生物分子的偶联反应的方案可以在文献中找到，例如在“BioConjugateTechniques[生物缀合技术]”(Greg T.Hermanson,学术出版社(Academic Press)1996)中。生物分子(例如，MHC分子或其衍生物)可以按照有机化学的标准步骤，例如氧化、卤化、烷基化、酰化、加成、取代或酰胺化，以共价或非共价方式偶联到连接分子上。用于偶联共价或非共价结合的连接分子的这些方法可以在连接分子偶联到基底或颗粒之前或之后应用。此外，可以通过孵育实现分子与相应的预治疗的基底或颗粒(例如通过三甲基甲硅烷基溴预治疗)的直接结合，所述预处理的基底或颗粒由于该预处理显示出经修饰的表面(例如更高电荷或极性表面)。
触发免疫调节性非变异NKT细胞形成的方法
在某些实施例中，本文描述了一种新的iNKT细胞，该iNKT细胞表达MAF、IL-10、IL-21和至少一种选自LAG3、CTLA4、SLAMF6、ITAG4及其组合的细胞表面标记物。在某些实施例中，将细胞在体外培养或扩增。此类细胞可以通过本文所述的ncMHC-鞘脂纳米颗粒在体外培养或扩增。此类培养或扩增可以在体外或在扩增后在施用了本文所述ncMHC纳米颗粒的个体体内进行引发。在某些实施例中，可以向有需要的个体施用培养的或体外扩增的iNKT细胞。在某些实施例中，将细胞施用于以自体方式提供NKT细胞的个体。
本文披露的ncMHC-NP可用于产生调节性非变异NKT细胞的方法。在某些实施例中，ncMHC-NP可用于在个体肝中产生免疫调节性iNKT细胞的方法。在某些实施例中，ncMHC-NP可用于产生表达高水平免疫调节性iNKT细胞标记物的免疫调节性iNKT细胞的方法，该免疫调节iNKT细胞标记物选自：LAG3、CTLA4、SLAMF6、ITAG4及其组合。在某些实施例中，ncMHC-NP可用于产生表达高水平免疫调节性iNKT细胞标记物LAG3的免疫调节性iNKT细胞的方法。在某些实施例中，ncMHC-NP可用于产生表达高水平免疫调节性iNKT细胞标记物CTLA4的免疫调节性iNKT细胞的方法。在某些实施例中，ncMHC-NP可用于产生表达高水平免疫调节性iNKT细胞标记物SLAMF6的免疫调节性iNKT细胞的方法。在某些实施例中，ncMHC-NP可用于产生表达高水平免疫调节性iNKT细胞标记物ITAG4的免疫调节性iNKT细胞的方法。在某些实施例中，ncMHC-NP可用于产生表达高水平MAF的免疫调节性iNKT细胞的方法。在某些实施例中，ncMHC-NP可用于产生表达高水平IL-10和IL-21的免疫调节性iNKT细胞的方法。可以使用用于RNA或蛋白质检测的标准测定来确定高水平的表达。在某些实施例中，该非经典MHC-NP不包含免疫激活共刺激分子或细胞因子/细胞因子受体。在某些实施例中，该免疫调节性非变异NKT细胞是DC4+非变异NKT细胞。在各种实施例中，将高水平的免疫调节性细胞标记物与未治疗、媒介物治疗或用缺乏CD1d分子或与CD1d分子结合的神经酰胺配体的纳米颗粒治疗的情况相比。在各种实施例中，将高水平的免疫调节性细胞标记物与施用“游离”而不与ncMHC-NP结合的αGalCer的治疗的情况相比。在某些实施例中，高水平是指与对照(例如，未治疗、媒介物治疗、用缺乏CD1d分子的纳米颗粒治疗或施用不与ncMHC-NP结合的αGalCer治疗)相比增加25％、50％、75％、100％或更多。当提及标记物的阳性时，不认为所述标记物的高表达是公认的，所有细胞都可能表达非常低水平的给定细胞表面或细胞内标记物，然而，除非与对照(例如，假治疗或同型对照)相比，这些水平显著到足以返回可感知的结果，否则不认为这些细胞表达标记物。
在某些实施例中，本文描述了一种在个体中产生调节性非变异NKT细胞的方法，该方法包括向有需要的个体施用非经典MHC-纳米颗粒复合物，该非经典MHC-纳米颗粒复合物包含：鞘脂或其类似物；非经典MHC分子；和纳米颗粒；其中该鞘脂或其类似物与非经典MHC分子的结合小沟缔合，并且其中该非经典MHC分子偶联到该纳米颗粒。在某些实施例中，该施用是静脉内的或皮下的。在某些实施例中，该施用是静脉内的。在某些实施例中，该个体患有自身免疫性病症或炎性病症。在某些实施例中，该调节性非变异NKT细胞表达高水平的标记物，其选自：LAG3、CTLA4、SLAMF6、ITAG4及其组合。在某些实施例中，该非经典MHC-NP不包含免疫激活共刺激分子或细胞因子/细胞因子受体。在某些实施例中，该调节性非变异NKT细胞是CD4+非变异NKT细胞。
在某些实施例中，本文描述了一种在个体的肝中产生调节性非变异NKT细胞的方法，该方法包括向有需要的个体施用非经典MHC-纳米颗粒复合物，该非经典MHC-纳米颗粒复合物包含：鞘脂或其类似物；非经典MHC分子；和纳米颗粒；其中该鞘脂或其类似物与非经典MHC分子的结合小沟缔合，并且其中该非经典MHC分子偶联到该纳米颗粒。在某些实施例中，该施用是静脉内的或皮下的。在某些实施例中，该施用是静脉内的。在某些实施例中，该个体患有肝自身免疫性病症或肝炎性病症。在某些实施例中，该肝自身免疫性病症或肝炎性病症选自由非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、肝硬化或其组合组成的清单。在某些实施例中，该调节性非变异NKT细胞表达高水平的标记物，其选自：LAG3、CTLA4、SLAMF6、ITAG4及其组合。在某些实施例中，该非经典MHC-NP不包含免疫激活共刺激分子或细胞因子/细胞因子受体。在某些实施例中，该调节性非变异NKT细胞是CD4+非变异NKT细胞。
在某些实施例中，本文描述了一种在个体中产生调节性非变异NKT细胞的方法，该方法包括向有需要的个体施用非经典MHC-纳米颗粒复合物，该非经典MHC-纳米颗粒复合物包含：鞘脂或其类似物；非经典MHC分子；和纳米颗粒；其中该鞘脂或其类似物与非经典MHC分子的结合小沟缔合，并且其中该非经典MHC分子偶联到该纳米颗粒。在某些实施例中，该施用是静脉内的或皮下的。在某些实施例中，该施用是静脉内的。在某些实施例中，该个体患有自身免疫性病症或炎性病症。在某些实施例中，该调节性非变异NKT细胞表达高水平的IL-10、IL-21或IL-10和IL-21两者。在某些实施例中，该非经典MHC-NP不包含免疫激活共刺激分子或细胞因子/细胞因子受体。在某些实施例中，该调节性非变异NKT细胞是CD4+非变异NKT细胞。
在某些实施例中，本文描述了一种在个体的肝中产生调节性非变异NKT细胞的方法，该方法包括向有需要的个体施用非经典MHC-纳米颗粒复合物，该非经典MHC-纳米颗粒复合物包含：鞘脂或其类似物；非经典MHC分子；和纳米颗粒；其中该鞘脂或其类似物与非经典MHC分子的结合小沟缔合，并且其中该非经典MHC分子偶联到该纳米颗粒。在某些实施例中，该施用是静脉内的或皮下的。在某些实施例中，该施用是静脉内的。在某些实施例中，该个体患有肝自身免疫性病症或肝炎性病症。在某些实施例中，该肝自身免疫性病症或肝炎性病症选自由非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、肝硬化或其组合组成的清单。在某些实施例中，该调节性非变异NKT细胞表达高水平的IL-10、IL-21或IL-10和IL-21两者。在某些实施例中，该非经典MHC-NP不包含免疫激活共刺激分子或细胞因子/细胞因子受体。在某些实施例中，该调节性非变异NKT细胞是CD4+非变异NKT细胞。
在某些实施例中，本文描述了一种在个体中产生调节性非变异NKT细胞的方法，该方法包括向有需要的个体施用非经典MHC-纳米颗粒复合物，该非经典MHC-纳米颗粒复合物包含：鞘脂或其类似物；非经典MHC分子；和纳米颗粒；其中该鞘脂或其类似物与非经典MHC分子的结合小沟缔合，并且其中该非经典MHC分子偶联到该纳米颗粒。在某些实施例中，该施用是静脉内的或皮下的。在某些实施例中，该施用是静脉内的。在某些实施例中，该个体患有自身免疫性病症或炎性病症。在某些实施例中，该调节性非变异NKT细胞表达MAF。在某些实施例中，该非经典MHC-NP不包含免疫激活共刺激分子或细胞因子/细胞因子受体。在某些实施例中，该调节性非变异NKT细胞是CD4+非变异NKT细胞。
在某些实施例中，本文描述了一种在个体的肝中产生调节性非变异NKT细胞的方法，该方法包括向有需要的个体施用非经典MHC-纳米颗粒复合物，该非经典MHC-纳米颗粒复合物包含：鞘脂或其类似物；非经典MHC分子；和纳米颗粒；其中该鞘脂或其类似物与非经典MHC分子的结合小沟缔合，并且其中该非经典MHC分子偶联到该纳米颗粒。在某些实施例中，该施用是静脉内的或皮下的。在某些实施例中，该施用是静脉内的。在某些实施例中，该个体患有肝自身免疫性病症或肝炎性病症。在某些实施例中，该肝自身免疫性病症或肝炎性病症选自由非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、肝硬化或其组合组成的清单。在某些实施例中，该调节性非变异NKT细胞表达MAF。在某些实施例中，该非经典MHC-NP不包含免疫激活共刺激分子或细胞因子/细胞因子受体。在某些实施例中，该调节性非变异NKT细胞是CD4+非变异NKT细胞。
治疗自身免疫性障碍或炎性障碍的方法
在另一方面，本文提供了使用包含本文披露的ncMHC-NP、由其组成或基本上由其组成的组合物治疗自身免疫性疾病或炎性疾病的方法。在一些实施例中，该疾病是自身免疫性疾病或障碍。在一些实施例中，该疾病是炎性疾病或障碍。
在一些实施例中，该自身免疫性障碍或疾病和炎性障碍或疾病可以包括但不限于I型糖尿病、移植排斥、多发性硬化、多发性硬化相关障碍、卵巢早衰、硬皮病、舍格林氏病/综合征、狼疮、白癜风、脱发(秃顶)、多腺体衰竭、格雷夫氏病、甲状腺功能减退、多发性肌炎、天疱疮、克罗恩氏病、结肠炎、自身免疫性肝炎、垂体功能减退、心肌炎、阿狄森氏病、自身免疫性皮肤病、葡萄膜炎、恶性贫血、甲状旁腺功能减退、类风湿性关节炎、哮喘、过敏性哮喘、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性胆管炎、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、视神经脊髓炎谱系障碍(德维克氏病、视神经脊髓型多发性硬化症(OSMS))、寻常型天疱疮、炎性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮(SLE)、乳糜泻、银屑病、自身免疫性心肌病、特发性扩张型心肌病(IDCM)、重症肌无力、葡萄膜炎、强直性脊柱炎、免疫介导肌病、抗磷脂综合征(ANCA+)、动脉粥样硬化、皮肌炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿、脊髓损伤、ANCA相关血管炎、特发性肺纤维化、肺动脉高压、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或银屑病。
在一些实施例中，该自身免疫性障碍或疾病和炎性障碍或疾病是肝自身免疫性疾病或炎性疾病。在某些实施例中，该肝自身免疫性障碍或炎性障碍包括自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎病(NASH)或肝硬化。在某些实施例中，该肝自身免疫性障碍或炎性障碍包括自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎或原发性胆汁性肝硬化。
本披露的组合物可以常规地通过注射，例如，静脉内、皮下、皮内或肌肉内进行肠胃外施用。适用于其他施用方式的其他配制品包括口服配制品。口服配制品包括通常使用的赋形剂，如例如，医药级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释配制品或粉末的形式，并含有约10％至约95％、优选约25％至约70％的活性成分。根据本披露，本领域技术人员将已知含有改良受试者免疫状况的nc-MHC-纳米颗粒复合物的水性组合物的制备。在某些实施例中，可以吸入组合物(例如，美国专利号6,651,655，其通过引用以其全文具体并入)。在一个实施例中，该ncMHC-纳米颗粒复合物被全身性地施用。在特定实施例中，可静脉内施用ncMHC-NP复合物或包含多种ncMHC-NP复合物的组合物。
通常，以与剂量配制品相容的方式施用本披露的组合物，并以治疗有效和免疫修饰的量施用。施用量取决于有待治疗的受试者。需要施用的活性成分的精确量取决于医生的判断。然而，合适的剂量范围为每次施用十至几百纳克或微克鞘脂配体/ncMHC/纳米颗粒复合物。初始施用和增强施用的合适方案也是可变的，但其典型的是初始施用随后是后续施用。
应用的方式可以有很大的不同。任何常规的疫苗施用方法都是适用的。这些被认为包括口服应用在生理上可接受基础上的固体或在生理上可接受的分散体中，通过注射等进行肠胃外应用。该鞘脂配体/ncMHC/纳米颗粒复合物的剂量将取决于施用途径，并根据受试者的尺寸和健康状况而变化。
在许多情况下，期望对鞘脂配体/ncMHC/纳米颗粒复合物进行多次施用，约、至少约、或至多约3、4、5、6、7、8、9、10或更多次施用。施用通常间隔1、2、3、4、5、6或7天至十二周，更通常间隔一至两周。每隔一天、一周两次、每周、每双周、每月或0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4或5年(通常为两年)间隔的定期增强将是理想的，以维持免疫系统的状况。施用过程之后可进行自身反应性免疫应答、同源TR1细胞和T细胞活性的测定。
在某些方面，不包括纳米颗粒核和任何外层的ncMHC复合物的单剂量包括约0.001mg/kg至约2.0mg/kg、或约0.001mg/kg至约1.5mg/kg、或约0.001mg/kg至约1.4mg/kg、或约0.001mg/kg至约1.3mg/kg、或约0.001mg/kg至约1.2mg/kg、或约0.001mg/kg至约1.1mg/kg、或约0.001mg/kg至约1.0mg/kg。在一些实施例中，单剂量包括从约0.004mg/kg至约1.014mg/kg、或从约0.02mg/kg至约0.811mg/kg、或从约0.041mg/kg至约0.608mg/kg、或从约0.061mg/kg至约0.507mg/kg、或从约0.081mg/kg至约0.405mg/kg、或从约0.121mg/kg至约0.324mg/kg、或从约0.162mg/kg至约0.243mg/kg。在一些实施例中，单剂量包括从约0.004mg/kg至约1.015mg/kg、或从约0.004mg/kg至约1.0mg/kg、或从约0.004mg/kg至约0.9mg/kg、或从约0.004mg/kg至约0.8mg/kg、或从约0.004mg/kg至约0.7mg/kg、或从约0.004mg/kg至约0.6mg/kg、或从约0.004mg/kg至约0.5mg/kg、或从约0.004mg/kg至约0.4mg/kg、或从约0.004mg/kg至约0.3mg/kg、或从约0.004mg/kg至约0.2mg/kg、或从约0.004mg/kg至约0.1mg/kg。
药学上可接受的赋形剂、载体和稀释剂
在一些实施例中，ncMHC-NP被配制成药物组合物。将药物组合物以常规方式使用一种或多种药学上可接受的无活性成分配制，这些成分有助于将活性剂加工成药学上使用的制剂。适当的配制品取决于所选择的施用途径。可在例如如下中找到本文所述的药物组合物的概述：Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学的科学与实践],第十九版(宾夕法尼亚州伊斯顿：麦克出版社，1995)；Hoover,John E.,Remington’sPharmaceutical Sciences[雷明顿制药科学],麦克出版公司,伊斯顿,宾夕法尼亚州,1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.编,Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型],马塞尔·德克尔,纽约,纽约州,1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems[药物剂型和药物递送系统],第七版(利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins))1999，将其通过引用并入本文以用于此披露。
药物组合物还可包括表面活性剂、分散剂和/或粘度调节剂。这些剂包括可以控制药物通过液体介质的扩散和均匀性或造粒方法或混合方法的材料。在一些实施例中，这些剂还促进包衣或溶蚀性骨架(eroding matrix)的有效性。示例性的扩散促进子/分散剂包括例如亲水性聚合物、电解质、
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60或80、PEG、泰洛沙泊、聚乙烯吡咯烷酮(PVP；商业上称为
Figure BDA0003479802460000392
)和基于碳水化合物的分散剂(诸如像羟丙基纤维素(例如，HPC、HPC-SL和HPC-L)、羟丙基甲基纤维素(例如，HPMC K100、HPMC K4M、HPMC K l5M和HPMC Kl00M)、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、乙酸羟丙基甲基纤维素硬脂酸酯(HPMCAS)、非晶纤维素)、硅酸镁铝、三乙醇胺、聚乙烯醇(PVA)、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)、与环氧乙烷和甲醛的4-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯酚聚合物(也称为泰洛沙泊)、泊洛沙姆(例如，作为环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物的Pluronics
Figure BDA0003479802460000401
和
Figure BDA0003479802460000402
以及泊洛沙姆188)；和泊洛沙胺(例如，Tetronic
Figure BDA0003479802460000403
也称为泊洛沙胺
Figure BDA0003479802460000404
其是通过将环氧丙烷和环氧乙烷依次添加到乙二胺中而衍生的四官能嵌段共聚物(巴斯夫公司(BASF Corporation)，新泽西州帕西帕尼))、聚乙烯吡咯烷酮Kl2、聚乙烯吡咯烷酮Kl7、聚乙烯吡咯烷酮K25、或聚乙烯吡咯烷酮K30、聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S-630)、聚乙二醇(例如，聚乙二醇的分子量可为约300至约6000、或约3350至约4000、或约4000至约5400)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚山梨醇酯-80、海藻酸钠、树胶(诸如像黄蓍胶和阿拉伯树胶、瓜尔胶、黄原胶(包括黄胞胶))、糖、纤维素制品(诸如像羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠)、聚山梨醇酯-8O、海藻酸钠、聚乙氧基化脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚乙氧基化脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚维酮、卡波姆、聚乙烯醇(PVA)、海藻酸盐、壳聚糖及其组合。增塑剂诸如纤维素或三乙基纤维素也可用作分散剂。在一些情况下，该药物组合物包含在0.01％和0.5％(w/v)之间的表面活性剂。在一些情况下，该药物组合物包含0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.4％或0.5％(w/v)的表面活性剂。
在某些实施例中，本文所述的ncMHC-NP包含在具有增溶剂、乳化剂或分散剂的药物组合物中。在某些实施例中，增溶剂可允许超过至少约0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL或20mg/mL的ncMHC-NP的高浓度溶液。水性药物组合物中的卡波姆用作乳化剂和粘度调节剂。在某些实施例中，该药学上可接受的赋形剂包含卡波姆或由其组成。在某些实施例中，该卡波姆包含卡波姆910、卡波姆934、卡波姆934P、卡波姆940、卡波姆941、卡波姆1342或其组合或由其组成。水性药物组合物中的环糊精用作增溶剂和稳定剂。在某些实施例中，该药学上可接受的赋形剂包含环糊精或由其组成。在某些实施例中，该环糊精包含α环糊精、β环糊精、γ环糊精或其组合或由其组成。药物组合物中的卵磷脂可用作增溶剂。在某些实施例中，该增溶剂包含卵磷脂或由其组成。药物组合物中的泊洛沙姆用作乳化剂、增溶剂和分散剂。在某些实施例中，该药学上可接受的赋形剂包含泊洛沙姆或由其组成。在某些实施例中，该泊洛沙姆包含泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338、泊洛沙姆407或其组合或由其组成。药物组合物中的聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯用作乳化剂、增溶剂、表面活性剂和分散剂。在某些实施例中，该药学上可接受的赋形剂包含聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯或由其组成。在某些实施例中，该聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯包含聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯21、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯61、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81、聚山梨醇酯85、聚山梨醇酯120或其组合或由其组成。药物组合物中的聚氧乙烯硬脂酸酯用作乳化剂、增溶剂、表面活性剂和分散剂。在某些实施例中，该药学上可接受的赋形剂包含聚氧乙烯硬脂酸酯或由其组成。在某些实施例中，该聚氧乙烯硬脂酸酯包含聚氧乙烯2硬脂酸酯、聚氧乙烯4硬脂酸酯、聚氧乙烯6硬脂酸酯、聚氧乙烯8硬脂酸酯、聚氧乙烯12硬脂酸酯、聚氧乙烯20硬脂酸酯、聚氧乙烯30硬脂酸酯、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯100硬脂酸酯、聚氧乙烯150硬脂酸酯、聚氧乙烯4二硬脂酸酯、聚氧乙烯8二硬脂酸酯、聚氧乙烯12二硬脂酸酯、聚氧乙烯32二硬脂酸酯、聚氧乙烯150二硬脂酸酯或其组合或由其组成。药物组合物中的山梨糖醇酯用作乳化剂、增溶剂、非离子表面活性剂和分散剂。在某些实施例中，该药学上可接受的赋形剂包含脱水山梨糖醇酯或由其组成。在某些实施例中，该脱水山梨糖醇酯包含脱水山梨糖醇月桂酸酯、脱水山梨糖醇油酸酯、脱水山梨糖醇棕榈酸酯、脱水山梨糖醇硬脂酸酯、脱水山梨糖醇三油酸酯、脱水山梨糖醇倍半油酸酯或其组合或由其组成。在某些实施例中，可以用蛋白质载体实现溶解性。在某些实施例中，该蛋白质载体包括重组人白蛋白。
在某些实施例中，本披露的非经典MHC-纳米颗粒包含在包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体和稀释剂的药物组合物中。在某些实施例中，本披露的非经典MHC纳米颗粒悬浮于无菌溶液中施用。在某些实施例中，该溶液包含约0.9％NaCl。在某些实施例中，该溶液包含约5％的右旋糖。在某些实施例中，所述溶液还包含以下中的一种或多种：缓冲液，例如，乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐和羟甲基氨基甲烷(Tris)；表面活性剂，例如，聚山梨醇酯80(Tween 80)、聚山梨醇酯20(Tween 20)和泊洛沙姆188；多元醇/二糖/多糖，例如，葡萄糖、右旋糖、甘露糖、甘露醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖和葡聚糖40；氨基酸，例如，甘氨酸或精氨酸；抗氧化剂，例如抗坏血酸、蛋氨酸；或螯合剂，例如，EDTA或EGTA。
在某些实施例中，本披露的非经典MHC纳米颗粒冷干地装运/储存并且在施用之前重构。在某些实施例中，冻干的抗体配制品包含膨胀剂，例如甘露醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐40或其组合。冻干配制品可以包含在由玻璃或其他合适的非反应性材料构成的小瓶中。
该非经典MHC-纳米颗粒在配制时，无论重构与否，均可在一定的pH(一般小于8.0)下缓冲。在某些实施例中，该pH可以在4.5和8.0之间、4.5和7.5之间、4.5和7.0之间、4.5和6.5之间、4.5和6.0之间、4.5和5.5之间、4.5和5.0之间。在某些实施例中，pH可以在5.0和6.0、6.5、7.0、7.5或8.0之间。在某些实施例中，pH可以在6.0和6.5、7.0、7.5或8.0之间。
本文还描述了包含ncMHC和一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体的水性药物组合物。在某些实施例中，该稀释剂、赋形剂或载体包含表面活性剂、增溶剂或乳化剂。在某些实施例中，该稀释剂、赋形剂或载体包含pH缓冲剂。在某些实施例中，水性组合物中ncMHC的浓度为约0.1mg/mL至约10mg/mL。在某些实施例中，水性组合物中ncMHC的浓度为约0.1mg/mL至约0.2mg/mL、约0.1mg/mL至约0.4mg/mL、约0.1mg/mL至约0.5mg/mL、约0.1mg/mL至约0.8mg/mL、约0.1mg/mL至约1mg/mL、约0.1mg/mL至约2mg/mL、约0.1mg/mL至约3mg/mL、约0.1mg/mL至约4mg/mL、约0.1mg/mL至约5mg/mL、约0.1mg/mL至约10mg/mL、约0.2mg/mL至约0.4mg/mL、约0.2mg/mL至约0.5mg/mL、约0.2mg/mL至约0.8mg/mL、约0.2mg/mL至约1mg/mL、约0.2mg/mL至约2mg/mL、约0.2mg/mL至约3mg/mL、约0.2mg/mL至约4mg/mL、约0.2mg/mL至约5mg/mL、约0.2mg/mL至约10mg/mL、约0.4mg/mL至约0.5mg/mL、约0.4mg/mL至约0.8mg/mL、约0.4mg/mL至约1mg/mL、约0.4mg/mL至约2mg/mL、约0.4mg/mL至约3mg/mL、约0.4mg/mL至约4mg/mL、约0.4mg/mL至约5mg/mL、约0.4mg/mL至约10mg/mL、约0.5mg/mL至约0.8mg/mL、约0.5mg/mL至约1mg/mL、约0.5mg/mL至约2mg/mL、约0.5mg/mL至约3mg/mL、约0.5mg/mL至约4mg/mL、约0.5mg/mL至约5mg/mL、约0.5mg/mL至约10mg/mL、约0.8mg/mL至约1mg/mL、约0.8mg/mL至约2mg/mL、约0.8mg/mL至约3mg/mL、约0.8mg/mL至约4mg/mL、约0.8mg/mL至约5mg/mL、约0.8mg/mL至约10mg/mL、约1mg/mL至约2mg/mL、约1mg/mL至约3mg/mL、约1mg/mL至约4mg/mL、约1mg/mL至约5mg/mL、约1mg/mL至约10mg/mL、约2mg/mL至约3mg/mL、约2mg/mL至约4mg/mL、约2mg/mL至约5mg/mL、约2mg/mL至约10mg/mL、约3mg/mL至约4mg/mL、约3mg/mL至约5mg/mL、约3mg/mL至约10mg/mL、约4mg/mL至约5mg/mL、约4mg/mL至约10mg/mL、或约5mg/mL至约10mg/mL。在某些实施例中，水性组合物中ncMHC的浓度为约0.1mg/mL、约0.2mg/mL、约0.4mg/mL、约0.5mg/mL、约0.8mg/mL、约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约5mg/mL或约10mg/mL。在某些实施例中，水性组合物中ncMHC的浓度为至少约0.1mg/mL、约0.2mg/mL、约0.4mg/mL、约0.5mg/mL、约0.8mg/mL、约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL或约5mg/mL。在某些实施例中，水性组合物中ncMHC的浓度为至多约0.2mg/mL、约0.4mg/mL、约0.5mg/mL、约0.8mg/mL、约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约5mg/mL或约10mg/mL。
本文还描述了试剂盒，其在合适的容器中包含一种或多种本文所述的非经典MHC纳米颗粒和一种或多种选自以下的其他组分：使用说明；稀释剂、赋形剂、载体和施用装置。
在某些实施例中，本文描述了一种制备自身免疫性病症或炎性病症治疗剂的方法，该方法包括将一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂与本披露的非经典MHC纳米颗粒混合。在某些实施例中，本文描述了一种制备用于储存或运输的自身免疫性疾病或炎性疾病治疗剂的方法，该方法包括冻干本披露的一种或多种非经典MHC纳米颗粒。
本文还描述了一种制备本披露的非经典MHC-纳米颗粒的方法，该方法包括将偶联到纳米颗粒的非经典MHC分子与鞘脂或其类似物接触。在某些实施例中，该鞘脂或其类似物包括α-半乳糖神经酰胺。在某些实施例中，该非经典MHC-NP不包含免疫激活共刺激分子或细胞因子/细胞因子受体。在某些实施例中，该非经典MHC-纳米颗粒包含鞘脂或其类似物。在某些实施例中，该鞘脂或其类似物包括神经酰胺或其类似物。在某些实施例中，该神经酰胺或其类似物包括α-半乳糖神经酰胺(KRN7000)、α-C-半乳糖神经酰胺、α-葡萄糖醛酸神经酰胺、β-半乳糖神经酰胺、PBS-20、PBS-25、硫苷脂、异红细胞三糖神经酰胺(iGb3)或其组合。在某些实施例中，该神经酰胺或其类似物包括α-半乳糖神经酰胺(KRN7000)。在某些实施例中，该非经典MHC包括CD1d。在某些实施例中，该CD1d是人CD1d。在某些实施例中，该CD1d包含与SEQ ID NO:1、2和3中的任一个具有至少约90％、95％、97％、98％、99％同一性或至少约90％、95％、97％、98％、99％相同的氨基酸残基序列。在某些实施例中，该CD1d包含与SEQ ID NO:3具有至少约90％、95％、97％、98％、99％同一性或至少约90％、95％、97％、98％、99％相同的氨基酸残基序列。在某些实施例中，该CD1d包含与SEQ ID NO:3相同的氨基酸残基序列。在某些实施例中，该CD1d包含与SEQ ID NO:4具有至少约90％、95％、97％、98％、99％同一性或至少约90％、95％、97％、98％、99％相同的氨基酸残基序列。在某些实施例中，该CD1d包含与SEQ ID NO:4相同的氨基酸残基序列。在某些实施例中，该非经典MHC-纳米颗粒包含β2微球蛋白。在某些实施例中，该β2微球蛋白包含与SEQ ID NO:5具有至少约90％、95％、97％、98％、99％同一性或至少约90％、95％、97％、98％、99％相同的氨基酸残基序列。在某些实施例中，该β2微球蛋白包含与SEQ ID NO:5相同的氨基酸残基序列。在某些实施例中，该纳米颗粒包含金属、金属氧化物、金属硫化物、金属硒化物或聚合物。在某些实施例中，该金属或金属氧化物包括铁、氧化铁或金。在某些实施例中，该金属或金属氧化物包括铁或氧化铁。在某些实施例中，该纳米颗粒的直径从约1纳米至约100纳米。在某些实施例中，该直径从约5纳米至约25纳米。在某些实施例中，该非经典MHC分子共价偶联到该纳米颗粒。在某些实施例中，该非经典MHC分子通过聚合物接头共价偶联到该纳米颗粒。在某些实施例中，该聚合物包括右旋糖酐。在某些实施例中，该聚合物接头的尺寸小于约5千道尔顿。在某些实施例中，该聚合物接头包括聚乙二醇(PEG)。在某些实施例中，该非经典MHC分子以至少10:1的比率偶联到该纳米颗粒。在某些实施例中，该非经典MHC分子以不超过约1000:1的比率偶联到该纳米颗粒。在某些实施例中，该非经典MHC分子以不超过约500:1的比率偶联到该纳米颗粒。在某些实施例中，该非经典MHC分子以不超过约100:1的比率偶联到该纳米颗粒。
实例
以下说明性实例代表本文所述的组合物和方法的实施例，并不意味着以任何方式进行限制。
实例1-用αGalCer/CD1d包被的纳米颗粒治疗NOD.c3c4小鼠抑制原发性胆汁性胆管炎
肝是iNKT细胞最大的器官库。在肝炎症中，iNKT募集通常会加剧组织损伤。αGalCer诱导的iNKT细胞激活可诱导肝损伤。参见Biburger,M.等人(2005)“Alpha-galactosylceramide-induced liver injury in mice is mediated by TNF-alpha butindependent of Kupffer cells[α-半乳糖神经酰胺诱导的小鼠肝损伤由TNF-α介导，但与枯否细胞无关].”J.Immunol.[免疫学杂志]175,1540-1550。此外，iNKT细胞的微生物激活可以触发肝自身免疫。参见Mattner,J.等人(2005)“Exogenous and endogenousglycolipid antigens activate NKT cells during microbial infections[外源性和内源性糖脂抗原在微生物感染期间激活NKT细胞].”Nature[自然]434,525-529。iNKT细胞也已被证明在以下项的发病机制中发挥关键作用：伴刀豆球蛋白A诱导的肝炎(Takeda,K.等人2000“Critical contribution of liver natural killer T cells to a murinemodel of hepatitis[肝自然杀伤T细胞对肝炎小鼠模型的关键贡献].”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]97,5498-5503)；酒精性肝炎(Huang,W.等人,(2018)“The Role of CD1d and MR1 Restricted T Cells in the Liver[CD1d和MR1限制性T细胞在肝中的作用].”Front.Immunol.[免疫学前沿]9,2424)；缺血再灌注损伤(Kuboki,S.等人2009“Distinct contributions of CD4+T cell subsets in hepaticischemia/reperfusion injury[CD4+T细胞亚群在肝缺血/再灌注损伤中的不同贡献].”Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.[美国生理学杂志-胃肠和肝生理学]296,G1054-1059)；以及药物引起的肝损伤(Kimura,K.等人2009“Pathological role of CD44on NKT cells in carbon tetrachloride-mediated liver injury[CD44在四氯化碳介导的肝损伤中对NKT细胞的病理学作用].”Hepatol Res[肝病研究]39,93-105)。此外，人原发性胆汁性胆管炎(PBC)中肝iNKT细胞的频率升高，并且将遗传iNKT细胞缺陷引入PBC的鼠模型中显著降低了病理学。参见Chuang等人,2008“Natural killer T cells exacerbateliver injury in a transforming growth factor beta receptor II dominant-negative mouse model of primary biliary cirrhosis[自然杀伤T细胞在原发性胆汁性肝硬化的转化生长因子β受体II负显性小鼠模型中加剧肝损伤].”Hepatology[肝病]47,571-580。
令人惊讶的是，如图2中所示，用αGalCer/CD1d包被的纳米颗粒(NP)而非单独的αGalCer治疗NOD.c3c4小鼠对NOD.c3c4小鼠中的自发性PBC样疾病具有显著的抑制作用。αGalCer/CD1d-NP治疗触发脾脏和淋巴结中iNKT含量的轻微下降(肝引流和非引流)，并且这些细胞的循环频率略有增加(未显示)。如图3中所示，来自αGalCer/CD1d-NP治疗NOD.c3c4小鼠的脾和肝相关iNKT细胞富含CD4+CD8-iNKT，以牺牲CD4-CD8-iNKT细胞为代价；并且如图4中所示，如通过流式细胞术测量的，与来自对照(未治疗或Cys-NP治疗)小鼠的肝iNKT细胞相比表达显著更高水平的PD1、CD49d、CD69和Lag-3。
实例2-用αGalCer/CD1d包被的纳米颗粒治疗NOD.c3c4小鼠诱导一组独特的iNKT细胞
上述结果表明，αGalCer/CD1d-NP治疗可能触发了免疫调节性iNKT细胞亚群的形成。为了研究这一点，对从αGalCer/CD1d-NP治疗对比未治疗NOD.c3c4小鼠分类的肝iNKT细胞进行了RNA测序(RNAseq)研究。事实上，这些研究表明，除了各种细胞表面免疫调节分子(诸如Lag3、PD1、CTLA4和TIGIT等)外，αGalCer/CD1d-NP已将iNKT细胞重新编程为免疫调节细胞因子IL-10和IL-21以及转录调节因子c-maf高度上调的亚群。在考虑已知在各种iNKT细胞亚群中表达的基因时(Gapin,L.(2016).“Development of invariant naturalkiller T cells[非变异自然杀伤T细胞的发展]”Curr.Opin.Immunol.[免疫学新观点]39,68-74)，其中这些iNKT细胞亚群包括iNKT1(Zbtb16(PLZF)-低、Tbx21(Tbet)+、Gata3-、Rorc(RORgt)-、Foxp3-、Maf-、Cd24-、Cd44+、Klrb1(NK1.1)+、Ifng+、IL2-、Il4+、Il17-、Il10-、Il21-、Il2rb(Cd122)+、Mirlet7(LET-7)+、Znf683(HOBIT)-高)、iNKT2(Zbtb16-高、Tbx21-、Gata3+、Rorc-、Maf-、Foxp3-、Cd24-、Cd44+、Klrb1-、Ifng-、Il2-、Il4+、Il17-、Il10-、Il21-、Il17rb+、Tnfsf11(RANKL)+)；以及iNKT17(Zbtb16-int、Tbx21-、Gata3-、Rorc+、Foxp3-、Maf-低、Cd24-、Cd44+、Klrb1-低/-、Il2-、il4-、Ifng-、Il17+、Il10-、Il21-、Tgfbr2+、Tnfsf11+)，未治疗NOD.c3c4小鼠的肝iNKT细胞显现相当独特(Zbtb16+、Tbx21+、Gata3+、Rorc-低、Foxp3-、Maf-低、Cd24-低、Cd44+、Klrb1+、Il2-、Il4-低、Ifng+、Il17-、Il10-、Il21-、Il2rb+、Il17rb-低、Tgfbr2+、Mirlet7-、Znf683-、Tnfsf11--)。值得注意的是，来自经治疗动物的肝iNKT细胞与后者有些相似，除了它们是Rorc-、Maf-高、Il10-高、Il21-高、Il2rb+、Il17rb-和Tgfbr2-低。此外，它们表达高水平的Lag3、Ctla4、Slamf6和Itga4(CD49d)(在未治疗小鼠的肝iNKT细胞中均呈阴性)，显著下调Il7r、Itgae(CD103)、Ccr6和Tnfrsf14(BTLA)，并且是Nrp1-。根据可用的基因表达数据(Il10+、Klrb1-低、Nfil3+(E4BP4，其调节IL-10和IL-13表达)、Nrp1+、Itga4+、Itgae-、Ctla4+、Fr4+、Bcl6-、Il7r+、Slamf6-高、Icos+)，经治疗小鼠的肝iNKT细胞也不同于αGalCer诱导的NKT10细胞(Sag等人,2014)。与这些iNKT10细胞不同，来自经治疗小鼠的肝iNKT细胞是Nfli3-、Nrp1-低、Fr4-、Bcl6-低和Il7r-低。同样，它们显现也不同于iNKT-FH细胞(表达Icos)，因为它们表达低水平的Bcl6并且缺乏Cxcr5的表达，或来自淋巴结FoxP3+iNKT细胞(Monteiro,M.等人(2010).“TGF-β诱导的调节性Foxp3+非变异NKT细胞的识别”J.Immunol.[免疫学杂志]185,2157-2163)、脂肪组织驻留FoxP3-Il2+、Il10+、Zbtb16-Nfil3+iNKT细胞(Lynch,L.等人(2015)“Regulatory iNKT cells lack expression of the transcription factor PLZFand control the homeostasis of T(reg)cells and macrophages in adipose tissue[调节性iNKT细胞缺乏转录因子PLZF的表达并控制脂肪组织中的T(reg)细胞和巨噬细胞的稳态]”Nat.Immunol.[自然免疫学]16,85-95)或最近描述的Breg诱导的FoxP3-Zbtb16+Nfil3-iNKT细胞(Oleinika,K.等人(2018)“CD1d-dependent immune suppressionmediated by regulatory B cells through modulations of iNKT cells[调节性B细胞通过调节iNKT细胞介导的CD1d依赖性免疫抑制]”Nature communications[自然通讯]9,684)。通过将来自αGalCer/CD1d-NP治疗小鼠和未治疗小鼠的肝iNKT RNAseq数据与来自Engel等人的iNKT1、iNKT2、iNKT10和iNKT17 RNAseq数据(Engel,I.等人(2016).“Innate-like functions of natural killer T cell subsets result from highly divergentgene programs[自然杀伤T细胞亚群的先天样功能源于高度不同的基因程序]”Nat.Immunol.[自然免疫学]17,728-739.)进行比较，证实了这些观察结果(图6A至图6D)。
为了确定在αGalCer/CD1d-NP治疗小鼠和未治疗小鼠的肝iNKT细胞之间观察到的一些基因表达差异是否至少部分是由它们独特的转录因子表达谱驱动的，测定了与差异表达基因的表达相关的这些转录因子。如图7所示，135个上调的蛋白质编码基因中的66个(71个下调的对应基因中没有一个)由Maf、Gata3和Vdr共同调节，这三个转录因子是显著上调的。
有趣的是，还发现许多这些免疫调节分子响应于pMHCII-NP疗法在NOD中出现的TR1样CD4+T细胞中上调(Clemente-Casares等人,2016)。有趣的是，在αGalCer/CD1d-NP治疗小鼠与未治疗小鼠的肝iNKT细胞中的238个差异表达基因中，与常规的非同源CD4+T细胞相比，在pMHCII-NP治疗小鼠的同源TR1样CD4+T细胞中还发现138个(58％)上调。对治疗诱导的iNKT和TR1细胞的RNA-seq谱的进一步比较揭示，在αGalCer/CD1d-NP治疗小鼠的肝iNKT细胞中差异表达的238个基因中有91个与TR1细胞共享。图8显示了这些基因中的66个的归一化基因计数，在经治疗小鼠与未治疗小鼠的iNKT细胞的肝基因表达具有>4倍的差异，显示出高度相似的表达水平。因此，这些αGalCer/CD1d-NP诱导的肝iNKT细胞被称为iNKTR1细胞。
实例3-用αGalCer/CD1d包被的纳米颗粒治疗NOD.c3c4小鼠诱导调节性iNKT细胞和Breg细胞
接下来研究了疾病抑制的机制。如图9中所示，来自αGalCer/CD1d-NP治疗小鼠的肝iNKT细胞可以抑制从未治疗小鼠的肝引流LN和肝枯否细胞中分离的CD11b+APC的能力，以将模型抗原肽(IGRP206-214)呈递给同源TCR转基因CD8+T细胞。此外，如图10所示，与来自对照NOD.c3c4供体的肝iNKT细胞相比，来自αGalCer/CD1d-NP治疗NOD.c3c4小鼠的肝iNKT细胞可以将疾病保护转移至用来自患病NOD.c3c4供体的脾细胞重建的NOD.c3c4.scid小鼠。αGalCer7CD1d-NP治疗野生型NOD.c3c4小鼠的治疗活性只能部分被IL-10阻断抑制，并且在较小程度上被IL-4而不是IFNγ阻断抑制，这表明除IL-10外，还涉及细胞因子和/或机制。
上述RNA表达数据与同pMHCII-NP诱导的TR1样CD4+T细胞的转录相似性和细胞因子/细胞因子受体阻断数据相结合，表明αGalCer/CD1d-NP的抗炎活性涉及在产生IL-21/IL-10的肝iNKT细胞下游出现的调节性细胞网络的形成。为了进一步了解下游细胞靶标，使用旋转盘共聚焦活体显微镜检查来追踪经治疗和未治疗Ifng-δ-ARE+/-(NOD x B6)F1小鼠的肝中的αGalCer/CD1d-NP诱导的iNKT细胞、枯否细胞和B淋巴细胞，这些小鼠也会发展自发性PBC样疾病。为了在体内追踪iNKT细胞，使用Cxcr6GFP/+小鼠，其中60％-80％的肝eGFP+细胞是iNKT细胞，其余是NK和T细胞(Geissmann等人,2005；Liew等人,2017)。在肝无菌性损伤中，iNKT细胞识别内皮细胞、枯否细胞和其他表达CD1d的肝细胞上的内源性糖脂配体，导致促炎性CCR2+Ly6Chi单核细胞转化为调节性CX3CR1+Ly6C低单核细胞，这一过程由iNKT细胞衍生的IL-4驱动。与未治疗小鼠相比，在Cxcr6GFP/+Ifng-δ-ARE+/-(NOD x B6)F1小鼠中，每两周一次的αGalCer/CD1d-NP治疗触发肝iNKT细胞数量的大量增加。在最后一次给药后4天对这些小鼠的肝进行成像显示这些iNKT细胞随机分布在整个肝中，并且具有高度运动性(寻找并衔接相当静态的B细胞)，在体内用荧光染料标记的抗CD19 mAb标记，而不是用F4/80特异性mAb标记的枯否细胞。这些相互作用不会显现导致B细胞死亡。尽管未治疗小鼠的肝中有相似数量的B细胞，但它们确实在相同程度上参与与Cxcr6+细胞的相互作用。正如预期的那样，当在αGalCer/CD1d-NP剂量后4小时内成像时，这些iNKT细胞停止移动，与激活状态一致。参见Lee,W.Y.等人(2010).“An intravascular immune response to Borreliaburgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells[对伯氏疏螺旋体的血管内免疫反应涉及枯否细胞和iNKT细胞]”Nat.Immunol.[自然免疫学]11,295-302。
选择性肝内iNKT-B细胞相互作用是出乎意料的，因为基本上所有的肝细胞，包括肝细胞、肝窦内皮细胞、肝细胞和肝星状细胞，都可以向iNKT细胞呈递内源性抗原配体(Geissmann,F.等人(2005)“Intravascular immune surveillance by CXCR6+NKT cellspatrolling liver sinusoids[通过巡检肝窦的CXCR6+NKT细胞进行血管内免疫监督]”PLoS Biol.[公共科学图书馆·生物学]3,e113；和Lee等人同上)。据报道，滤泡辅助iNKT细胞亚群可以为滤泡B细胞提供同源(通过识别在脂质抗原特异性B细胞上的CD1d的上下文中的内源性脂质)和非同源辅助T细胞(通过促进激活识别B细胞上的同源pMHCII的TFH细胞，也通过CD1d限制性相互作用)，并且边缘区B细胞可以触发iNKT细胞激活。还显示，同源iNKT-B细胞相互作用可导致人Breg样细胞的体外分化并触发具有这种特性的鼠CD8-iNKT细胞的早期增加。这些观察结果与活体成像观察结果以及αGalCer/CD1d-NP诱导的iNKTR1细胞和B细胞之间CD1d限制性相互作用的作用相结合，表明这些iNKTR1细胞可能负责驱动局部B细胞分化为产生IL-10的Breg细胞并且这些B细胞可能直接或间接地促进治疗活性的可能性。先前已经显示，由基于pMHC II类的纳米药物引发的TR1样CD4+T细胞不是以TGFα、IFNγ和IL-10独立的方式而是以IL-21依赖的方式触发B至Bre分化。参见Clemente-Casares,X.等人(2016)“Expanding antigen-specific regulatory networks to treatautoimmunity[扩大抗原特异性调节网络以治疗自身免疫]”Nature[自然]530,434-440。
由于αGalCer/CD1d-NP诱导的iNKTR1细胞表达的IL-21和IL-10mRNA水平是未治疗小鼠的肝iNKT细胞的数百倍，并且由于IL-21R阻断消除了αGalCer/CD1d-NP的治疗活性，研究了iNKTR1细胞是否可以驱动Breg细胞的形成。这是通过将Il10基因座中携带eGFP转基因的αGalCer脉冲或非脉冲B细胞转移到αGalCer/CD1d-NP治疗或未治疗NOD.c3c4小鼠中来完成的，并计算了在7天内获得eGFP表达的转移的CD5+和CD1d高B细胞的频率。显然，在经治疗动物中形成了Breg细胞，但未治疗动物中没有，这与B细胞是否用αGalCer脉冲无关(图12)。因此，αGalCer/CD1d-NP治疗触发iNKTR1细胞形成，然后通过以CD1d限制的方式识别一个或多个内源性B细胞抗原配体来驱动Breg细胞形成。
总的来说，这些实例显示，αGalCer/CD1d包被的NP可以容易地触发肝iNKT细胞分化为新的调节性iNKT细胞亚群(在本文中称为iNKTR1细胞)，这可以显著抑制PBC小鼠模型中的慢性肝炎症，并且可能还有其他肝炎性疾病和自身免疫性疾病。因此，这些化合物可以提供这种和其他慢性肝炎症疾病以及其他地方可能的炎症疾病的治疗方案。
实例4-用αGalCer/CD1d包被的纳米颗粒治疗小鼠诱导具有独特表型的iNKT细胞
Figure BDA0003479802460000511
Figure BDA0003479802460000521
Figure BDA0003479802460000531
Figure BDA0003479802460000541
Figure BDA0003479802460000551
实例5-Cd1d纳米颗粒的负载
下面披露了用αgalCer负载CD1d纳米颗粒的方案的实例
试剂：
1.PBS(ETF)-pH 7.2-7.4
2.PBST(ETF)(PBS中的0.5％Tween 20)
3.CD1d-NP
KRN7000(开曼化学公司(CAYMANCHEMICAL COMPANY)，目录号11208)
方案：
1.在将脂质加入到溶液中之前，使CD1d-NP颗粒溶液至37℃。
2.制备2L沸水(dd)。
3.计算负载所需的KRN7000(开曼化学公司，目录号11208)的量。所需的KRN7000量＝(CD1d的总量(mg)/64)x摩尔过量的KRN7000:CD1d。例如，对于1mg CD1d，所需的KRN7000(如果我们在反应中使用12:1KRN7000:CD1d)＝(1/64)x 12＝0.1875mg。考虑：KRN7000的MW为856D，且CD1d为55kD
4.将KRN7000溶解在100％DMSO中，最终浓度为1mg/mL。
5.使水浴至70℃-80℃并超声处理5分钟，将包含KRN7000/DMSO溶液的试管置于水浴中。(注意：该超声处理步骤制备单分散KRN7000溶液，其有助于有效负载CD1d分子)。
8.计算用于脂质负载的反应的总体积。对于0.255mg与NP颗粒缀合的CD1d，最终反应体积将是2.5mL的PBS和0.05％的Tween 20。计算：考虑到CD1d-NP溶液中的CD1d浓度为1mg/mL CD1d-NP-NP，0.255mL；PBST(0.5％Tween 20)，0.25mL；PBS，1.948mL；KRN溶液，0.047mL
9.将KRN7000溶液添加到纳米颗粒溶液中。
10.添加所需量的PBST且混合均匀。
11.添加PBS以使最终体积为计算得出的。
12.混合均匀并在37℃下孵育2-3小时，然后可以在4℃下储存溶液。
13.通过磁柱纯化颗粒。
虽然本文已经显示和描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域技术人员显而易见的是，此类实施例仅以举例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，现在本领域技术人员将想到许多改变、变化和取代。应该理解的是，本文所述的本发明的实施例的各种替代方案可用于实践本发明。
本说明书中提及的所有出版物、专利申请、授权专利和其他文件均通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物、专利申请、授权专利或其他文件被明确地并单独地指出通过引用以其全文并入。在与本披露中的定义相抵触的程度上，排除了通过引用并入的文本中包含的定义。
本文披露的序列：
SEQ ID NO:1人CD1d
MGCLLFLLLWALLQAWGSAEVPQRLFPLRCLQISSFANSSWTRTDGLAWLGELQTHSWSN
DSDTVRSLKPWSQGTFSDQQWETLQHIFRVYRSSFTRDVKEFAKMLRLSYPLELQVSAGC
EVHPGNASNNFFHVAFQGKDILSFQGTSWEPTQEAPLWVNLAIQVLNQDKWTRETVQWLL
NGTCPQFVSGLLESGKSELKKQVKPKAWLSRGPSPGPGRLLLVCHVSGFYPKPVWVKWMR
GEQEQQGTQPGDILPNADETWYLRATLDVVAGEAAGLSCRVKHSSLEGQDIVLYWGGSYT
SMGLIALAVLACLLFLLIVGFTSRFKRQTSYQGVL
SEQ ID NO:2信号序列被切割的人CD1d
EVPQRLFPLRCLQISSFANSSWTRTDGLAWLGELQTHSWSNDSDTVRSLKPWSQGTFSDQQWETLQHIFRVYRSSFTRDVKEFAKMLRLSYPLELQVSAGCEVHPGNASNNFFHVAFQGKDILSFQGTSWEPTQEAPLWVNLAIQVLNQDKWTRETVQWLLNGTCPQFVSGLLESGKSELKKQVKPKAWLSRGPSPGPGRLLLVCHVSGFYPKPVWVKWMRGEQEQQGTQPGDILPNADETWYLRATLDVVAGEAAGLSCRVKHSSLEGQDIVLYWGGSYTSMGLIALAVLACLLFLLIVGFTSRFKRQTSYQGVL
SEQ ID NO:3信号序列被切割的缺乏TM和胞质结构域的人CD1d
EVPQRLFPLRCLQISSFANSSWTRTDGLAWLGELQTHSWSNDSDTVRSLKPWSQGTFSDQQWETLQHIFRVYRSSFTRDVKEFAKMLRLSYPLELQVSAGCEVHPGNASNNFFHVAFQGKDILSFQGTSWEPTQEAPLWVNLAIQVLNQDKWTRETVQWLLNGTCPQFVSGLLESGKSELKKQVKPKAWLSRGPSPGPGRLLLVCHVSGFYPKPVWVKWMRGEQEQQGTQPGDILPNADETWYLRATLDVVAGEAAGLSCRVKHSSLEGQDIVLYWGGSYTS
SEQ ID NO:4CD1d
EVPQRLFPLRCLQISSFANSSWTRTDGLAWLGELQTHSWSNDSDTVRSLKPWSQGTFSDQQWETLQHIFRVYRSSFTRDVKEFAKMLRLSYPLELQVSAGCEVHPGNASNNFFHVAFQGKDILSFQGTSWEPTQEAPLWVNLAIQVLNQDKWTRETVQWLLNGTCPQFVSGLLESGKSELKKQVKPKAWLSRGPSPGPGRLLLVCHVSGFYPKPVWVKWMRGEQEQQGTQPGDILPNADETWYLRATLDVVAGEAAGLSCRVKHSSLEGQDIVLYWGGSYT
SEQ ID NO:5b2M
IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM
SEQ ID NO:6-编码CD1d和b2m两者的单多肽
MGSLQPLATLYLLGMLVASSLGIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGEVPQRLFPLRCLQISSFANSSWTRTDGLAWLGELQTHSWSNDSDTVRSLKPWSQGTFSDQQWETLQHIFRVYRSSFTRDVKEFAKMLRLSYPLELQVSAGCEVHPGNASNNFFHVAFQGKDILSFQGTSWEPTQEAPLWVNLAIQVLNQDKWTRETVQWLLNGTCPQFVSGLLESGKSELKKQVKPKAWLSRGPSPGPGRLLLVCHVSGFYPKPVWVKWMRGEQEQQGTQPGDILPNADETWYLRATLDVVAGEAAGLSCRVKHSSLEGQDIVLYWGGSYTSGSGSGSGSLGGIFEAMKMELRDHHHHHHNWSHPQFEKGGGGSGGGGSGGSSAWSHPQFEKC
SEQ ID NO:7编码CD1d和b2m两者的单多肽的核酸序列
ATGGGTTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTGGGTATGCTGGTCGCTAGCAGCCTCGGAATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCTATGTGTCTGGGTTTCATCCATCCGACATTGAAGTTGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACTTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTACACTGAATTCACCCCCACTGAAAAAGATGAGTATGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACTTTGTCACAGCCCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGACATGGGTGGCGGAGGGTCTGGAGGAGGGGGATCTGGAGGTGGAGGCTCCGGAGGAGGTGGATCAGGAGGAGGTGGAGAAGTCCCGCAAAGGCTTTTCCCCCTCCGCTGCCTCCAGATCTCGTCCTTCGCCAATAGCAGCTGGACGCGCACCGACGGCTTGGCGTGGCTGGGGGAGCTGCAGACGCACAGCTGGAGCAACGACTCGGACACCGTCCGCTCTCTGAAGCCTTGGTCCCAGGGCACGTTCAGCGACCAGCAGTGGGAGACGCTGCAGCATATATTTCGGGTTTATCGAAGCAGCTTCACCAGGGACGTGAAGGAATTCGCCAAAATGCTACGCTTATCCTATCCCTTGGAGCTCCAGGTGTCCGCTGGCTGTGAGGTGCACCCTGGGAACGCCTCAAATAACTTCTTCCATGTAGCATTTCAAGGAAAAGATATCCTGAGTTTCCAAGGAACTTCTTGGGAGCCAACCCAAGAGGCCCCACTTTGGGTAAACTTGGCCATTCAAGTGCTCAACCAGGACAAGTGGACGAGGGAAACAGTGCAGTGGCTCCTTAATGGCACCTGCCCCCAATTTGTCAGTGGCCTCCTTGAGTCAGGGAAGTCGGAACTGAAGAAGCAAGTGAAGCCCAAGGCCTGGCTGTCCCGTGGCCCCAGTCCTGGCCCTGGCCGTCTGCTGCTGGTGTGCCATGTCTCAGGATTCTACCCAAAGCCTGTATGGGTGAAGTGGATGCGGGGTGAGCAGGAGCAGCAGGGCACTCAGCCAGGGGACATCCTGCCCAATGCTGACGAGACATGGTATCTCCGAGCAACCCTGGATGTGGTGGCTGGGGAGGCAGCTGGCCTGTCCTGTCGGGTGAAGCACAGCAGTCTAGAGGGCCAGGACATCGTCCTCTACTGGGGTGGGAGCTACACCTCCGGTAGTGGTAGTGGTAGTGGATCTCTGGGTGGTATCTTCGAGGCTATGAAGATGGAGCTGCGCGATCATCACCATCACCATCACAACTGGAGCCACCCTCAGTTCGAGAAGGGAGGTGGAGGCTCAGGAGGTGGAGGCTCTGGAGGCTCTAGTGCATGGAGCCACCCTCAGTTCGAGAAGTGTTGA

Claims (54)

1.一种非经典MHC-纳米颗粒，该非经典MHC-纳米颗粒包含：
a)鞘脂或其类似物；
b)非经典MHC分子；以及
c)纳米颗粒；
其中该鞘脂或其类似物与该非经典MHC分子的结合小沟缔合，并且其中该非经典MHC分子偶联到该纳米颗粒。
2.如权利要求1所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该非经典MHC-NP不包含免疫激活共刺激分子或细胞因子/细胞因子受体。
3.如权利要求1或2所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该非经典MHC-纳米颗粒包含鞘脂。
4.如权利要求1至3中任一项所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该鞘脂或其类似物包括神经酰胺或其类似物。
5.如权利要求4所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该神经酰胺或其类似物包括α-半乳糖神经酰胺(KRN7000)、α-C-半乳糖神经酰胺、α-葡萄糖醛酸神经酰胺、β-半乳糖神经酰胺、PBS-20、PBS-25、硫苷脂、异红细胞三糖神经酰胺(iGb3)或其组合。
6.如权利要求5所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该神经酰胺或其类似物包括α-半乳糖神经酰胺(KRN7000)。
7.如权利要求1至6中任一项所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该非经典MHC包括CD1d。
8.如权利要求1至7中任一项所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该CD1d是人CD1d。
9.如权利要求1至8中任一项所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该CD1d包含与SEQ IDNO:1、2、3和4中的任一个具有至少约90％、95％、97％、98％、99％同一性或至少约90％、95％、97％、98％、99％相同的氨基酸残基序列。
10.如权利要求9所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该CD1d包含与SEQ ID NO:3具有至少约90％、95％、97％、98％、99％同一性或至少约90％、95％、97％、98％、99％相同的氨基酸残基序列。
11.如权利要求9所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该CD1d包含与SEQ ID NO:3相同的氨基酸残基序列。
12.如权利要求9所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该CD1d包含与SEQ ID NO:4具有至少约90％、95％、97％、98％、99％同一性或至少约90％、95％、97％、98％、99％相同的氨基酸残基序列。
13.如权利要求4所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该CD1d包含与SEQ ID NO:4相同的氨基酸残基序列。
14.如权利要求1至13中任一项所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该非经典MHC-纳米颗粒包含β2微球蛋白。
15.如权利要求14所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该β2微球蛋白包含与SEQ ID NO:5具有至少约90％、95％、97％、98％、99％同一性或至少约90％、95％、97％、98％、99％相同的氨基酸残基序列。
16.如权利要求14所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该β2微球蛋白包含与SEQ ID NO:5相同的氨基酸残基序列。
17.如权利要求1至16中任一项所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该非经典MHC-纳米颗粒包含金属、金属氧化物、金属硫化物、金属硒化物或聚合物。
18.如权利要求14所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该金属或金属氧化物包括铁、氧化铁或金。
19.如权利要求14所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该金属或金属氧化物括含铁或氧化铁。
20.如权利要求1至19中任一项所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该纳米颗粒的直径从约1纳米至约100纳米。
21.如权利要求20所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该直径从约5纳米至约25纳米。
22.如权利要求1至21中任一项所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该非经典MHC分子共价偶联到该纳米颗粒。
23.如权利要求1至22中任一项所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该非经典MHC分子通过聚合物接头共价偶联到该纳米颗粒。
24.如权利要求23所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该聚合物包括右旋糖酐。
25.如权利要求23所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该聚合物接头的尺寸小于约5千道尔顿。
26.如权利要求23或25所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该聚合物接头包括聚乙二醇(PEG)。
27.如权利要求1至26中任一项所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该非经典MHC分子以至少10:1的比率偶联到该纳米颗粒。
28.如权利要求1至26中任一项所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该非经典MHC分子以不超过约1000:1的比率偶联到该纳米颗粒。
29.如权利要求1至26中任一项所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该非经典MHC分子以不超过约500:1的比率偶联到该纳米颗粒。
30.如权利要求1至26中任一项所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该非经典MHC分子以不超过约100:1的比率偶联到该纳米颗粒。
31.一种组合物，其包含多个如权利要求1至30中任一项所述的非经典MHC-纳米颗粒和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
32.如权利要求31所述的组合物，其被配制用于静脉内施用。
33.如权利要求31所述的组合物，其被配制用于皮下施用。
34.如权利要求1至30中任一项所述的非经典MHC-纳米颗粒或如权利要求31至33中任一项所述的组合物，其用于治疗自身免疫性障碍或炎性障碍。
35.如权利要求34所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该自身免疫性障碍或炎性障包括I型糖尿病、移植排斥、多发性硬化、多发性硬化相关障碍、卵巢早衰、硬皮病、舍格林氏病/综合征、狼疮、白癜风、脱发(秃顶)、多腺体衰竭、格雷夫氏病、甲状腺功能减退、多发性肌炎、天疱疮、克罗恩氏病、结肠炎、自身免疫性肝炎、垂体功能减退、心肌炎、阿狄森氏病、自身免疫性皮肤病、葡萄膜炎、恶性贫血、甲状旁腺功能减退、类风湿性关节炎、哮喘、过敏性哮喘、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、肝硬化、视神经脊髓炎谱系障碍(德维克氏病、视神经脊髓型多发性硬化症(OSMS))、寻常型天疱疮、炎性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮(SLE)、乳糜泻、银屑病、自身免疫性心肌病、特发性扩张型心肌病(IDCM)、重症肌无力、葡萄膜炎、强直性脊柱炎、免疫介导肌病、抗磷脂综合征(ANCA+)、动脉粥样硬化、皮肌炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿、脊髓损伤、ANCA相关血管炎、特发性肺纤维化、肺动脉高压、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或银屑病。
36.如权利要求34所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该自身免疫性障碍或炎性障碍包括自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或肝硬化。
37.如权利要求34所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该自身免疫性障碍或炎性障碍包括自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎或原发性胆汁性肝硬化。
38.如权利要求1至30中任一项所述的非经典MHC-纳米颗粒或如权利要求31至33中任一项所述的组合物，其用于产生、发展或扩增免疫调节性非变异NKT细胞。
39.如权利要求38所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该免疫调节性非变异NKT细胞是肝非变异NKT细胞。
40.如权利要求38或39所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该免疫调节性非变异NKT细胞表达MAF。
41.如权利要求38或39所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该免疫调节性非变异NKT细胞表达IL-10、IL-21或两者。
42.如权利要求38或39所述的非经典MHC-纳米颗粒，其中该免疫调节性非变异NKT细胞表达LAG3、CTLA4、SLAMF6、ITGA4或其任何组合。
43.一种治疗个体的自身免疫性障碍或炎性障碍的方法，该方法包括向该个体施用如权利要求1至30中任一项所述的非经典MHC-纳米颗粒或如权利要求31至33中任一项所述的组合物，从而治疗患有该自身免疫性障碍或炎性障碍的该个体。
44.如权利要求43所述的方法，其中该自身免疫性障碍或炎性障包括I型糖尿病、移植排斥、多发性硬化、多发性硬化相关障碍、卵巢早衰、硬皮病、舍格林氏病/综合征、狼疮、白癜风、脱发(秃顶)、多腺体衰竭、格雷夫氏病、甲状腺功能减退、多发性肌炎、天疱疮、克罗恩氏病、结肠炎、自身免疫性肝炎、垂体功能减退、心肌炎、阿狄森氏病、自身免疫性皮肤病、葡萄膜炎、恶性贫血、甲状旁腺功能减退、类风湿性关节炎、哮喘、过敏性哮喘、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、肝硬化、视神经脊髓炎谱系障碍(德维克氏病、视神经脊髓型多发性硬化症(OSMS))、寻常型天疱疮、炎性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮(SLE)、乳糜泻、银屑病、自身免疫性心肌病、特发性扩张型心肌病(IDCM)、重症肌无力、葡萄膜炎、强直性脊柱炎、免疫介导肌病、抗磷脂综合征(ANCA+)、动脉粥样硬化、皮肌炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿、脊髓损伤、ANCA相关血管炎、特发性肺纤维化、肺动脉高压、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或银屑病。
45.如权利要求43所述的方法，其中该自身免疫性障碍或炎性障碍包括自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或肝硬化。
46.一种产生、激活、发展或扩增免疫调节性非变异NKT细胞的方法，该方法包括将如权利要求1至30中任一项所述的非经典MHC-纳米颗粒或如权利要求31至33中任一项所述的组合物与非变异NKT细胞接触。
47.如权利要求46所述的方法，其中该接触是在体外。
48.一种在个体中产生或扩增免疫调节性非变异NKT细胞的方法，该方法包括向该个体施用如权利要求1至30中任一项所述的非经典MHC-纳米颗粒或如权利要求31至33中任一项所述的组合物。
49.如权利要求46至48中任一项所述的方法，其中该免疫调节性非变异NKT细胞表达MAF。
50.如权利要求46至48中任一项所述的方法，其中该免疫调节性非变异NKT细胞表达IL-10、IL-21或两者。
51.如权利要求46至48中任一项所述的方法，其中该免疫调节性非变异NKT细胞表达LAG3、CTLA4、SLAMF6、ITGA4或其任何组合。
52.如权利要求46至48中任一项所述的方法，其中该免疫调节性非变异NKT细胞是CD4+非变异NKT细胞。
53.一种制备非经典MHC-纳米颗粒的方法，该方法包括将偶联到纳米颗粒的非经典MHC分子与鞘脂或其类似物接触。
54.如权利要求53所述的方法，其中该鞘脂或其类似物包括α-半乳糖神经酰胺。
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