CN118434759A - 用抗-pd-l1/il-10融合蛋白治疗疾病的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供使用PD‑L1抗体‑IL‑10融合蛋白在治疗癌症和慢性病毒感染疾病中的用途以及通过促进T细胞记忆反应来预防癌症复发的用途。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求依据35U.S.C.§119(e)于2021年10月10日提交的美国临时专利申请是列号63/254,116的权益，其全部内容通过引用并入本文。本申请提交序列表生成于2022年10月1日，并以ST26可扩展标记语言形式提交，文档命名为“2022-10-07T_256-004PCT_SEQ_List.xml”，文档大小为160千字节，且其全部内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明一般涉及用PD-L1抗体-IL-10融合蛋白治疗疾病的方法，特别是使用PD-L1抗体-IL-10融合蛋白治疗癌症和慢性病毒感染疾病，以及通过促进T细胞记忆反应来预防癌症复发的方法。
背景技术
癌症代表一大类涉及异常细胞生长的疾病，其有可能侵入或扩散到身体的其他部位并称为死亡的主要原因。由于癌细胞是由正常细胞转化(癌变)的，因此癌细胞呈现的抗原表面蛋白和/或糖蛋白与宿主生物体中正常、非肿瘤细胞上存在的抗原相同或高度相似。因此，宿主生物体的免疫系统可能难以检测并区分癌细胞与正常细胞。此外，癌细胞可以采用另一种机制来逃避宿主免疫系统的检测。
程序性死亡-配体1(PD-L1)是一种跨膜蛋白，其与抑制性检查点分子PD1结合，从而抑制怀孕、自体免疫疾病和其他疾病状态例如肝炎期间的适应性免疫反应。此外，PD-L1在癌症组织中有高度表达，其表达水平被发现与肿瘤侵袭性密切相关。PD-L1的过度表达及其与其受体蛋白PD1的结合通常被认为对于癌细胞逃避被宿主生物体免疫系统破坏的机制至关重要。
白介素10或“IL-10”(也称为细胞因子合成抑制因子、CSIF、IL-10、IL10A、GVHDS或TGIF)是一种细胞因子，其在免疫调节和发炎中具有多种作用。已知IL-10可下调巨噬细胞上的Th1细胞因子、MHC第II类抗原和共刺激分子的表达。也已知IL-10可增强B细胞存活、增殖和抗体产生。IL-10可阻断NF-κB活性并涉及JAK-STAT信号转导通路的调节。IL-10能够抑制细胞如巨噬细胞和Th1 T细胞产生的促发炎细胞因子的合成，例如IFN-γ、IL-2、IL-3、TNFα和GM-CSF。它也展现出抑制抗原呈递细胞的抗原呈递能力的强大能力；然而，它也能刺激某些T细胞(Th2)和肥大细胞，并刺激B细胞成熟和抗体产生。
IL-10已被认为是肿瘤转移的潜在抑制剂和可用于免疫肿瘤学治疗的免疫刺激剂。在转基因小鼠中，IL-10的表达或IL-10的给药已被观察到可控制原发性肿瘤生长并减少转移负担。重组鼠类IL-10的PEG化形式已显示可在小鼠模型中诱导IFNγ和CD8+T细胞依赖性抗肿瘤免疫。PEG化重组人类IL-10已被证明可增强CD8+T细胞对细胞毒性分子颗粒酶B和穿孔素的分泌，并增强T细胞受体依赖性IFNγ的分泌。在临床试验中，PEG化重组人类IL-10(PEG-rHuIL-10、AM0010)被发现具有显著的抗肿瘤功效，可诱导免疫刺激性细胞因子IFNγ、IL-18、IL-7、GM-CSF和IL-4的剂量可滴定诱导。经治疗的患者也展现出外周CD8+T细胞表达标记，例如PD1、淋巴细胞活化基因3(LAG3)+和Fas配体(FasL)的活化增加，以及血清TGFβ的减少。这些发现显示IL-10治疗对人类产生主要的免疫刺激作用。
发明内容
与本领域关于抗-PD-L1/IL-10融合蛋白的理解相反，本发明基于一项令人惊讶的发现，即抗-PD-L1/IL-10融合蛋白能够促进T细胞记忆反应，而提供组合物以及使用该组合物用于治疗癌症、预防癌症复发和治疗慢性病毒感染疾病的用途。不受理论的束缚，提出抗-PD-L1/IL-10融合蛋白通过前体细胞耗尽的T细胞产生持久的记忆反应。在患有癌症或慢性病毒感染的患者中，已提出抗-PD-L1/IL-10融合蛋白会导致T细胞记忆反应，而治疗癌症或病毒感染，并预防癌症复发或慢性病毒感染。因此，本发明提供治疗方法，其中向患有癌症或慢性病毒感染的患者施用PD-L1抗体-IL-10融合蛋白，其中该PD-L1抗体-IL-10融合蛋白促进通过前体细胞耗尽的T细胞产生的持久记忆反应。
在一些具体实施方式中，本发明提供一种包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体的组合物在有需要的受试者中促进T细胞记忆反应的用途。在一些具体实施方式中，本发明提供一种包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体的组合物在制备用于在有需要的受试者中促进T细胞记忆反应的药物的用途。在一些具体实施方式中，本发明提供一种组合物，其包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体，用于在有需要的受试者中促进T细胞记忆反应。
在一些具体实施方式中，本发明提供一种包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体的组合物在有需要的受试者中治疗癌症的用途。在一些具体实施方式中，本发明提供一种包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体的组合物在制备用于在有需要的受试者中治疗癌症的药物的用途。在一些具体实施方式中，本发明提供一种组合物，其包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体，用于在有需要的受试者中治疗癌症。
在一些具体实施方式中，本发明提供一种包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体的组合物在有需要的受试者中预防癌症复发的用途。在一些具体实施方式中，本发明提供一种包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体的组合物在制备用于在有需要的受试者中预防癌症复发的药物的用途。在一些具体实施方式中，本发明提供一种组合物，其包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体，用于在有需要的受试者中预防癌症复发。
在一些具体实施方式中，本发明提供一种包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体的组合物在有需要的受试者中治疗慢性病毒感染疾病的用途。在一些具体实施方式中，本发明提供一种包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体的组合物在制备用于在有需要的受试者中治疗慢性病毒感染疾病的药物的用途。在一些具体实施方式中，本发明提供一种组合物，其包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体，用于在有需要的受试者中治疗慢性病毒感染疾病。
在一些具体实施方式中，该组合物与至少一种另外的治疗剂一起使用。在其他具体实施方式中，该至少一种另外的治疗剂为病毒疫苗。在其他具体实施方式中，该至少一种另外的治疗剂为靶向抑制性免疫检查点分子的抗体。在一些优选具体实施方式中，该至少一种另外的治疗剂选自由以下组成的组：显影剂；细胞毒性剂；血管生成抑制剂；激酶抑制剂；共刺激分子阻断剂；黏附分子阻断剂；抗细胞因子抗体或其功能片段；甲氨蝶呤；环孢菌素；雷帕霉素(rapamycin)；FK506；可检测的标记或报告子；TNF拮抗剂；抗风湿药；肌肉松弛剂；麻醉剂；非类固醇抗炎药(NSAID)；止痛剂；麻醉剂；镇静剂；局部麻醉剂；神经肌肉阻断剂；抗微生物剂；抗银屑病药；皮质类固醇；促合成代谢性类固醇；红细胞生成素；免疫接种；免疫球蛋白；免疫抑制剂；生长激素；激素替代药物；放射性药物；抗忧郁剂；抗精神病剂；兴奋剂；哮喘药物；β激动剂；吸入性类固醇；肾上腺素或其类似物；细胞因子；细胞因子拮抗剂；免疫调节剂；HBV进入抑制剂；病毒RNA抑制剂；基因编辑试剂；HBsAg分泌抑制剂；聚合酶抑制剂；干扰素；病毒进入抑制剂；病毒成熟抑制剂；核苷逆转录酶抑制剂；衣壳组装抑制剂/调节剂；cccDNA抑制剂；FXR激动剂；microRNA；以及TLR激动剂。
在一些具体实施方式中，该组合物通过选自以下组成的组的至少一种模式施用：肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、腹腔内(intracelial)、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊椎内、滑膜内、胸腔内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内和经皮。在一些具体实施方式中，该组合物每天使用一次以上、至少每天一次、至少每周一次、或至少每月一次。
在一些具体实施方式中，该PD-L1抗体为免疫球蛋白分子、Fv、经二硫键连接的Fv、单克隆抗体、scFv、嵌合抗体、单域抗体、CDR-移植抗体、双抗体、人类抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、Fab’片段、双特异性抗体、F(ab’)2片段、包含在铰链区通过二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段、dAb片段、经分离的互补决定区(CDR)、或单链抗体。在一些具体实施方式中，该PD-L1抗体包含通过接头与IL 10融合的重链(HC)；任选地，其中该接头包含选自SEQ ID NO:74、75、76、77、78和79的氨基酸序列。
在一些具体实施方式中，(a)该IL-10包含如SEQ ID NO:73、172、173、174、175、176、177、178、179或180所示的氨基酸序列；(b)该IL-10为IL-10的天然存在的或保留其细胞因子活性的工程化变体；(c)该IL-10为IL-10的保留其细胞因子活性的合成修饰形式；和/或(d)该IL-10包含一、二或四个IL-10多肽。
在一些具体实施方式中，相对于野生型IL-10的氨基酸，该IL-10包含在氨基酸位置104、位置107及其组合的取代。在一些具体实施方式中，该野生型IL-10包含与SEQ IDNO:73、172、173、174、175、176、177、178、179或180具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％同一性的氨基酸序列。在一些具体实施方式中，该取代包含：(a)R104Q；(b)R107A、R107E、R107Q和R107D中的任何一个；或者(c)其组合。在一些具体实施方式中，该取代包含R104Q/R107A、R104Q/R107E、R104Q/R107Q或R104Q/R107D。
在一些具体实施方式中，该PD-L1抗体包含(i)第一轻链互补决定区(CDR-L1)、第二轻链互补决定区(CDR-L2)和第三轻链互补决定区(CDR-L3)，以及(ii)第一重链互补决定区(CDR-H1)、第二重链互补决定区(CDR-H2)和第三重链互补决定区(CDR-H3)，其中：
(a)CDR-H1包含选自SEQ ID NO:92和123的氨基酸序列；
(b)CDR-H2包含选自SEQ ID NO:109、114和124的氨基酸序列；
(c)CDR-H3包含选自SEQ ID NO:94和110的氨基酸序列；
(d)CDR-L1包含选自SEQ ID NO:53的氨基酸序列；
(e)CDR-L2包含选自SEQ ID NO:54的氨基酸序列；
(f)CDR-L3包含选自SEQ ID NO:55、112和116的氨基酸序列。
在一些具体实施方式中，
(a)CDR-H1包含如SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ IDNO:53所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:112所示的氨基酸序列；
(b)CDR-H1包含如SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:114所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ IDNO:53所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:116所示的氨基酸序列；或者
(c)CDR-H1包含如SEQ ID NO:123所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:124所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQID NO:53所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
在一些具体实施方式中，该抗体包含与选自SEQ ID NO:111、115和125的序列具有至少90％同一性的重链可变区(VH)氨基酸序列；和/或与选自SEQ ID NO:56、113和117的序列具有至少90％同一性的轻链可变区(VL)氨基酸序列；任选地，其中：
(a)该抗体包含与SEQ ID NO:111具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQ ID NO:113具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(b)该抗体包含与SEQ ID NO:115具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQ ID NO:117具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；或者
(c)该抗体包含与SEQ ID NO:125具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQ ID NO:56具有至少90％同一性的VL氨基酸序列。
在一些具体实施方式中，该抗体包含与选自SEQ ID NO:157、158和160的序列具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列；和/或与选自SEQ ID NO:135、137和141的序列具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；任选地，其中该抗体包含：
(a)如SEQ ID NO:157所示的HC氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:135所示的LC氨基酸序列；
(b)如SEQ ID NO:158所示的HC氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:137所示的LC氨基酸序列；
(c)如SEQ ID NO:160所示的HC氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:141所示的LC氨基酸序列。
在一些具体实施方式中，该抗体包含一通过接头与IL-10多肽融合的重链(HC)，其中该HC-IL-10融合氨基酸序列与选自SEQ ID NO:134、136和140的序列具有至少90％的同一性；以及轻链(LC)，其与选自SEQ ID NO:135、137和141的序列具有至少90％的同一性；任选地，其中该抗体包含：
(a)如SEQ ID NO:134所示的HC-IL-10融合氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:135所示的LC氨基酸序列；
(b)如SEQ ID NO:136所示的HC-IL-10融合氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:137所示的LC氨基酸序列；或
(d)如SEQ ID NO:140所示的HC-IL-10融合氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:141所示的LC氨基酸序列。
在一些具体实施方式中，该PD-L1抗体包含一通过接头与IL-10融合的重链(HC)，其中该抗体包含(i)第一轻链互补决定区(CDR-L1)、第二轻链互补决定区(CDR-L2)和第三轻链互补决定区(CDR-L3)，以及(ii)第一重链互补决定区(CDR-H1)、第二重链互补决定区(CDR-H2)和第三重链互补决定区(CDR-H3)，其中：
(a)CDR-H1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQID NO:7所示的氨基酸序列；
(b)CDR-H1包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；
(c)CDR-H1包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ IDNO:21所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；
(d)CDR-H1包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ IDNO:29所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；
(e)CDR-H1包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ IDNO:37所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；
(f)CDR-H1包含如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ IDNO:45所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列；
(g)CDR-H1包含如SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ IDNO:53所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:112所示的氨基酸序列；
(h)CDR-H1包含如SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:114所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ IDNO:53所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:116所示的氨基酸序列；或者
(i)CDR-H1包含如SEQ ID NO:123所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:124所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQID NO:53所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
在一些具体实施方式中，该抗体包含与选自SEQ ID NO:4、12、20、28、36、44、111、115和125的序列具有至少90％同一性的重链可变区(VH)氨基酸序列；和/或与选自SEQ IDNO:8、16、24、32、40、48、56、113和117的序列具有至少90％同一性的轻链可变区(VL)氨基酸序列；任选地，其中：
(a)该抗体包含与SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQID NO:8具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(b)该抗体包含与SEQ ID NO:12具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQID NO:16具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(c)该抗体包含与SEQ ID NO:20具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQID NO:24具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(d)该抗体包含与SEQ ID NO:28具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQID NO:32具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(e)该抗体包含与SEQ ID NO:36具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQID NO:40具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(f)该抗体包含与SEQ ID NO:44具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQID NO:48具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(g)该抗体包含与SEQ ID NO:111具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQ ID NO:113具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(h)该抗体包含与SEQ ID NO:115具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQ ID NO:117具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；或者
(i)该抗体包含与SEQ ID NO:125具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQ ID NO:56具有至少90％同一性的VL氨基酸序列。
在一些具体实施方式中，该抗体包含HC-IL-10融合氨基酸序列，其具有与选自SEQID NO:80、81、82、134、136和140的序列至少90％的同一性；以及轻链(LC)氨基酸序列，其具有与选自SEQ ID NO:135、137、141、143、145和147的序列至少90％的同一性；任选地，其中：
(a)该HC-IL-10融合氨基酸序列如SEQ ID NO:80所示，以及该LC氨基酸序列如SEQID NO:143所示；
(b)该HC-IL-10融合氨基酸序列如SEQ ID NO:81所示，以及该LC氨基酸序列如SEQID NO:145所示；
(c)该HC-IL-10融合氨基酸序列如SEQ ID NO:82所示，以及该LC氨基酸序列如SEQID NO:147所示；
(d)该HC-IL-10融合氨基酸序列如SEQ ID NO:134所示，以及该LC氨基酸序列如SEQ ID NO:135所示；
(e)该HC-IL-10融合氨基酸序列如SEQ ID NO:136所示，以及该LC氨基酸序列如SEQ ID NO:137所示；或者
(f)该HC-IL-10融合氨基酸序列如SEQ ID NO:140所示，以及该LC氨基酸序列如SEQ ID NO:141所示。
在一些具体实施方式中，其中：
(a)该蛋白质使MC/9细胞增殖增加至少25％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％或更多；
(b)该蛋白质使活化的CD8 T细胞的IFNγ和颗粒酶B生产增加至少25％、至少50％、至少100％或更多；和/或
(c)该抗体使同基因小鼠肿瘤模型在第28天测量的肿瘤体积降低至少25％、至少50％、至少75％或更多，其中该小鼠肿瘤模型选自：CT26结肠癌和EMT6乳腺癌。
附图说明
图1说明抗-PDL1/IL-10融合蛋白会增强混合淋巴细胞反应(MLR)中的T细胞活化。人类CD4 T细胞从PBMC分离出，并在抗-PDL1/IL-10融合蛋白(阿维鲁单抗(Avelumab))/IL10、HSYPP411C/IL10、YP7G/IL10、YP11F/IL10、YT7A/IL10、YT7H/IL10和YT10H/IL10)存在下与同种异体成熟DC共培养。在第5天用ELISA(Biolegend)测量上清液中的IFNγ浓度。
图2说明抗-PDL1/IL-10融合蛋白在肿瘤中的积累。(A)全身体内和(B)头颈鳞状细胞癌HNSC/Q1-luc携带肿瘤小鼠静脉注射经vivoTag680-标记的抗-PDL1/IL-10(150μg)24小时后，脾脏和肿瘤的离体荧光图像。
图3说明抗-PDL1/IL-10会增强T细胞反应。同基因大肠直肠癌CT26携带肿瘤小鼠(n＝7)在植入后7天随机分组，之后以IL10-Fc(3mg/kg)、抗-PDL1/IL-10(6mg/kg)或抗-PDL1/TGFbR(6mg/kg)治疗，每周两次，持续3周。用ELISA(Biolegend)测量治疗后(第29天)的(A)IL-18和(B)CXCL9的血清浓度。显示平均值±SD。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图4说明抗-PDL1/IL-10增强肿瘤控制的能力是依赖于肿瘤-驻留细胞的活性增加。与FTY720(其抑制淋巴细胞从次级淋巴器官流出)共治疗并没有降低某些小鼠(尽管不是所有小鼠)的抗肿瘤活性。同基因乳腺癌EMT6携带肿瘤小鼠(n＝6)在第10天被随机分组，每天使用载剂(1％乙醇)或FTY720(2mg/kg，PO)治疗，持续2周。从第11天开始每周两次施用抗-PDL1(10mg/kg)或抗-PDL1/IL-10(12mg/kg)，持续4周。(A)每周测量两次肿瘤生长。(B)生存曲线。显示平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图5说明抗-PDL1/IL-10治疗允许原发性肿瘤“治愈”的小鼠之后出现继发性肿瘤排斥，显示持久的T细胞记忆保护。同基因EMT6携带肿瘤小鼠(n＝7)在植入后7天随机分组，并以抗-PDL1(5mg/kg)、抗-PDL1/IL-10(6mg/kg)或抗PDL1/TGFbR治疗(6mg/kg)治疗，每周两次，持续3周。(A)原发性肿瘤研究的生存曲线。对于再挑战研究，肿瘤“治愈”后5周(第67天)，该治愈和原始Balb/c小鼠(n＝5)被植入EMT6肿瘤细胞，以及(B)监测肿瘤生长4周。显示平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图6说明抗-PDL1/IL-10突变体控制肿瘤生长并增强T细胞反应。同基因大肠直肠癌CT26携带肿瘤小鼠在植入后7天随机分组，之后用1mg/kg抗-PDL1/IL-10或抗-PDL1/IL-10突变体(R107A、R104Q/R107A)治疗，每周两次，持续3周。(A)每周测量两次肿瘤生长。(B)用ELISA(Biolegend)测量治疗后(第28天)的CXCL9血清浓度。显示平均值±SD。*p<0.05，**p<0.01。
图7说明从经抗-PDL1/IL10治疗的携带肿瘤小鼠分离出的肿瘤-浸润淋巴细胞(TIL)具有更佳的记忆反应。C57BL/6小鼠接种YUMM1.7-GP33黑色素瘤细胞，并在第9天接受早期活化的Tcf7GFP P14 T细胞的静脉注射过继细胞转移，之后在第10天和第14天进行PBS或抗-PDL1/IL-10治疗。PEX种群被进一步分选出并转移到原始接受者中进行LCMV-Arm再挑战。经再挑战后，该经抗-PDL1/IL-10治疗的TIL展现出更好的免疫质量，其共抑制受体(A)PD1和(B)TIM3的表达水平降低，以及(C)PD-1+TIM3+LAG3+细胞种群减少，与PBS处理组相比。PEX为前体细胞耗尽的T细胞。
图8说明抗-PDL1/IL-10治疗会增强PEX-依赖性持久肿瘤保护。C57BL/6小鼠在第0天皮下接种YUMM1.7-GP33肿瘤细胞并在第6天接受早期活化的Tcf7DTR-GFP P14 T细胞的静脉注射过继细胞转移。携带肿瘤小鼠进一步在第8天腹腔注射施用抗-PDL1/IL-10，每三天一次，直到肿瘤变得无法检测到。三周后，对无肿瘤小鼠进行腹腔注射PBS或DT 3次，以在一周内消除TCF1+DTR-表达细胞，之后皮下注射接种B16-GP33细胞。年龄匹配的原始小鼠接种B16-GP33黑色素瘤细胞作为肿瘤恶化的阳性对照(原始)组。监测(A)肿瘤生长和(B)无肿瘤存活4周。未消除PEX的无肿瘤小鼠对照组(Ctrl)仍保持无肿瘤状态，而DT治疗组于再挑战后第14至16天即可观察到B16-GP33肿瘤病变，显示抗-PDL1/IL10-引起的持久保护为PEX-依赖性。PEX为前体细胞耗尽的T细胞。
具体实施方式
本发明基于以下惊人的发现提供治疗方法和相关组合物：能够促进T细胞记忆反应的抗-PD-L1/IL-10融合蛋白可用于治疗癌症、预防癌症复发和治疗病毒感染疾病，优选为慢性病毒感染。因此，本发明提供治疗癌症、癌症复发和病毒感染的方法，其中向有需要的患者施用抗-PD-L1/IL-10融合蛋白。可用于该方法和组合物中的抗-PD-L1/IL-10融合蛋白能够诱导、增强和促进T细胞记忆反应。如下文更详细地描述，该治疗方法和相关组合物因此能够刺激和/或恢复正常免疫功能，其能够有效地治疗来自有需要的受试者的癌症、预防癌症复发、以及治疗病毒感染。
术语及技术
对于本文及随附的权利要求的描述，单数形式“一(a)”及“一个(an)”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“蛋白质”包括一个以上的蛋白质，提及“化合物”是指一个以上的化合物。“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(includes)”，以及“包括(including)”的使用是可互换的，且其目的并非进行限制。应进一步理解的是，在各种具体实施方式的描述使用术语“包含(comprising)”的情况下，本领域内技术人员将理解，在某些特定情况下，可使用“基本上由～组成(consisting essentially of)”或“由～组成(consisting of)”的语言来替代地描述具体实施方式。
在提供数值范围的情况下，除非上下文另有明确规定，否则应理解为，在该范围的上限与下限之间，该数值的每个中间整数以及该数值的每个中间整数的每十分之一，除非上下文另有明确规定，以及该指定范围内的任何其他指定值或中间值，皆包含在本发明内。这些较小范围的上限与下限可以独立地包括在较小范围内，且也包含在本发明内，受该范围内的任何特别排除的限制。该指定范围包括这些上下限的一个或两者，排除上下限的(i)任何一个或(ii)二者的范围也包括于本发明中。例如，“1至50”包括“2至25”、“5至20”、“25至50”、“1至10”等。
一般而言，本文所使用的命名法以及本文所述的技术和程序包括本领域内技术人员充分理解和常用的那些，例如Sambrook et al.,“Molecular Cloning-A LaboratoryManual”(2nd Ed.),Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989(以下称为“Sambrook”)；”Current Protocols in Molecular Biology”,F.M.Ausubel et al.,eds.,Current Protocols,a joint venture between GreenePublishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.(supplemented through 2011)(以下称为“Ausubel”)；”Antibody Engineering”,Vols.1and 2,R.Kontermann andS.Dubel,eds.,Springer-Verlag,Berlin and Heidelberg(2010)；”MonoclonalAntibodies:Methods and Protocols”,V.Ossipow and N.Fischer,eds.,2nd Ed.,HumanaPress(2014)；”Therapeutic Antibodies:From Bench to Clinic”,Z.An,ed.,J.Wiley&Sons,Hoboken,N.J.(2009)；以及Phage Display,Tim Clackson and Henry B.Lowman,eds.,Oxford University Press,United Kingdom(2004)中描述的一般技术与方法学。
本发明中引用的所有出版物、专利、专利申请，以及其他文献出于所有目的通过引用整体并入本案，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请、或其他文献被单独指出用于所有目的通过引用整体并入本案。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定具体实施方式且不旨在进行限制。为了解释本发明的目的，将应用以下术语描述，且在适当的情况下，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
如本文所用，“PD-L1”(或“PDL1”)是指跨膜蛋白、程序性死亡-配体1，并且如本文所用，其涵盖人类、食蟹猴、小鼠的PD-L1蛋白，以及这些蛋白质的任何同种型。各种示例性PD-L1蛋白的氨基酸序列为本领域已知，并在下表2和后附序列表中提供。
如本文所用，“IL10”或“IL-10”是指细胞因子白介素10，也称为细胞因子合成抑制因子(CSIF)，并且还旨在包括白介素10的天然存在的变体、基因工程变体、和/或合成修饰形式，保留其细胞因子功能。各种示例性IL-10多肽及重组型IL-10融合构建体的氨基酸序列提供于下表1及后附的序列表中。其他保留细胞因子功能的示例性基因工程化和/或修饰的IL-10多肽为本领域中已知的(请参见例如，US 7,749,490 B2；US2017/0015747 A1；Naing,A.et al.“PEGylated IL-10(Pegilodecakin)Induces Systemic ImmuneActivation,CD8+T Cell Invigoration and Polyclonal T Cell Expansion in CancerPatients.”Cancer Cell 34,775-791.e3(2018)；Gorby,C.et al.“Engineered IL-10variants elicit potent immunomodulatory effects at low ligand doses.”SciSignal 13,(2020)；Yoon,S.I.et al.“Epstein-Barr virus IL-10engages IL-10R1 by atwo-step mechanism leading to altered signaling properties.”J Biol Chem 287,26586-26595(2012))。
如本文所用，“融合蛋白”是指以非天然存在的构型连接(或“融合”)的两个或更多蛋白质和/或多肽分子。本发明的示例性融合蛋白包括“IL10-Fc”融合蛋白，其包含在其C-端通过多肽接头序列与免疫球蛋白Fc区多肽共价连接的IL10多肽。本发明的融合蛋白也包括“抗体融合物”，即抗体共价性缀合(或融合)至多肽或蛋白质，通常通过接头与抗体轻链(LC)或重链(HC)末端连接。本发明的示例性抗体融合物包括抗-PD-L1抗体融合至重组IL10多肽，其通过15个氨基酸多肽接头(例如SEQ ID NO:74)连接抗体重链的C-端与IL10多肽的N-端。抗体融合物在本文中以“抗体/多肽”命名法来标记以表明融合组成，例如“Ab/IL10”或“抗-PD-L1/IL10”。如本文别处所述，本发明的抗体融合体可包括全长IgG抗体，其包含重链-轻链对的二聚体复合物，其中每个重链C-端通过多肽接头序列连接至IL10多肽。下表2和所附序列表中提供各种示例性融合蛋白的氨基酸序列。
如本文所用，“多肽接头”或“接头序列”是指两个或更多氨基酸的链，该链的每个末端共价连接至不同的多肽分子，因而发挥缀合或融合不同多肽的作用。通常，多肽接头包含5至30个氨基酸的多肽链。众多的多肽接头是本领域内已知的，并可用于本发明的组合物和方法中。本发明的组合物和方法中包括的示例性多肽接头包括(GGGGS)n、(SSSSG)n、(GGGG)(SGGGG)n、(EAAAK)n、(XP)n、ENLYFQ(-G/S)，通常，其中n为1至6，以及本文别处公开的其他特定接头序列。
“抗-PD-L1抗体”或“结合PD-L1的抗体”是指以足够的亲和力结合PD-L1，使得该抗体可作为靶向PD-L1的治疗剂和/或诊断剂的抗体。在一些具体实施方式中，该抗-PD-L1特异性抗体与不相关的非PD-L1抗原的结合程度小于该抗体与PD-L1结合的约20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％，如通过例如放射免疫测定(RIA)或表面等离子共振(SPR)测量。在一些具体实施方式中，本发明的抗-PD-L1抗体具有<1μΜ、<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM、或<1pM(例如10-8M或更低，如自10-8M至10-13M，如自10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。
如本文所用，“T细胞记忆反应”是指在T细胞先前遇到其特异性抗原并对其作出反应之后，或在T细胞已从活化的T细胞分化之后，T细胞的活化。例如，尽管肿瘤特异性记忆T细胞仅占T细胞总量的一小部分，但它们在人类的整个生命周期中对肿瘤细胞的监视发挥着重要作用。当肿瘤特异性记忆T细胞遇到表达其特异性肿瘤抗原的肿瘤细胞时，该记忆T细胞立即被活化并克隆倍增。活化并倍增的T细胞分化为效应T细胞，其可高效杀死肿瘤细胞。记忆T细胞对于建立和维持T细胞的长期肿瘤抗原特异性反应非常重要。在本发明中，具有记忆反应的活化T细胞特异性辨识癌细胞上的抗原，使得此类T细胞可治疗癌性或肿瘤病症或预防癌症的复发、恶化或转移，同时避开癌细胞的防御机制。
如本文所用，“抗体”是指包含与特定抗原特异性结合或进行免疫性反应的一个或多个多肽链的分子。本发明的示例性抗体包括天然抗体、完整抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、多特异性(或异源缀合)抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、抗原-结合抗体片段(例如，Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv、rIgG和scFv片段)、抗体融合物和合成抗体(或抗体模拟物)。
“全长抗体”、“完整抗体”或“整个抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有含有本文定义的Fc区的重链的抗体。
“抗体片段”或“抗原结合片段”是指全长抗体的一部分，其能够结合与全长抗体相同的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。抗体有五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中某些被进一步分为亚型(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。
“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高度变异区(HVR)(请参见，例如，Kindt et al.,KubyImmunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91)。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离出结合特定抗原的抗体，以分别筛选出互补的VL或VH结构域的库(请参见，例如，Portolano et al.,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson et al.,Nature 352:624-628(1991))。
如本文所用，“互补决定区”或“CDR”是指可变区的高度变异区内具有最高序列变异性和/或参与抗原辨识的区域。通常，天然抗体由具有6个CDR的4条链组成；重链可变区中的三个VH(H1、H2、H3)，轻链可变区中的三个VL(L1、L2、L3)。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)出现在L1的氨基酸残基24-34、L2的氨基酸残基50-56、L3的氨基酸残基89-97、H1的氨基酸残基31-35、H2的氨基酸残基50-65，以及H3的氨基酸残基95-102(Kabat等人，同上)。除了VH中的CDR-H1之外，CDR通常包含形成高度变异环的氨基酸残基。
“框架”或“FR”是指除了高度变异区(HVR)残基之外的可变区残基。可变区的FR通常由四个FR域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以下列顺序出现在VH(或VL)：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
如本文所用，“单克隆抗体”是指从实质上同质的抗体群体获得的抗体，即，包含该群体的各抗体为相同的和/或结合至相同的表位，除了可能的变体抗体(例如，变体抗体含有天然存在的突变或在单克隆抗体的产生过程中产生的突变，且通常仅少量存在)。与通常包括针对不同决定位(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备相反，单克隆抗体制备的每种单克隆抗体是导向抗原上的单个决定位。因此，术语“单克隆”表示该抗体的特征是从实质上同质的抗体群体获得的，且不应解释为需要通过任何特定方法产生该抗体。举例而言，欲使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于，杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法、以及利用含有全部或部分人类免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述的制备单克隆抗体的此类方法及其他示例性方法。
“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而该重链和/或轻链的其余部分衍生自不同的来源或物种的抗体。
“人源化抗体”是指嵌合抗体，其包含来自非人类HVR的氨基酸序列及来自人类FR的氨基酸序列。在某些具体实施方式中，人源化抗体将包含实质上全部至少一个，通常两个可变区，其中所有或实质上所有FTVR(如CDR)皆对应于非人类抗体的那些，且所有或实质上所有的FR对应于人类抗体的那些。人源化抗体任选地可包含衍生自人类抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”，如非人类抗体，是指已进行人源化的抗体。
本文所使用的“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均衍生自人类种系免疫球蛋白序列。此外，如果该抗体含有恒定区，则此恒定区也衍生自于人类种系免疫球蛋白序列。本发明的人类抗体可包括不由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文所使用的术语“人抗体”并不旨在包括其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已被移植到人类框架序列上的抗体。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的强度总和。“结合亲和力”是指反映结合配对成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用平衡解离常数(KD)表示。亲和力可通过本领域已知的一般方法来测量，包括本文所描述的那些。以下描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性具体实施方式。
“特异性地结合”或“特异性结合”是指抗体与抗原的结合，其亲和力值不超过约1x10-7M。
“治疗(treatment,treat,treating)”是指试图改变待治疗的受试者病症的自然病程，并可进行预防或在临床病理学过程中进行的临床干预。期望的治疗结果可包括但不限于，预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少该疾病的任何直接或间接的病理后果、预防转移、降低恶化速度、改善或缓解疾病状态、以及缓解或改善预后。举例而言，癌症或病毒感染的治疗可包括向受试者施用治疗有效量的包含PD-L1抗体-IL-10融合蛋白的药物组合物，以预防癌症或病毒感染、推迟其发展、减缓其恶化、或根除癌症或病毒感染。
“药物组合物”或“组合物”或“制剂”是指一种制备物形式，其允许活性成分的生物活性有效，且不含对施用该制剂的受试者具有毒性的另外的成分。
如本文所用的，“唯一活性剂”是指一种药物制剂中的活性剂，其为提供或预期提供相关药理作用以治疗受试者的待治疗病症的唯一活性试剂。包含唯一活性剂的药物制剂不排除在该制剂中存在一个或多个非活性剂，例如，药学上可接受的载体。“非活性剂”为预期不提供或不明显有助于旨在治疗该受试者病症的相关药学作用的试剂。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外的对其施用的受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，“治疗有效量”是指达成期望的治疗或预防结果，例如治疗或预防受试者的疾病、病症、或病况的活性成分或试剂(如药物组合物)的量。在受试者患有癌症或病毒感染的情况下，该治疗剂的治疗有效量是指该量在一定程度上减少、预防、抑制和/或缓解与癌症或病毒感染相关的一种或多种症状，包括在受试者中可检测到的病毒载量和/或病毒Ag的量。对于癌症或病毒感染的治疗性处理，体内功效可例如通过评估症状的持续时间、严重度和/或复发、反应率(RR)、反应持续时间、和/或生活质量来测量。
“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于灵长类(例如，人类和非人类灵长类动物，例如猴)、啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)、兔子和家养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)。
本文提及的“有需要的受试者”包括患有HBV感染的患者，例如HBV携带者、患有慢性HBV感染者、患有持续性HBV者、或处于HBV感染风险者。
如本文所用，“免疫检查点分子”是指发挥调节免疫系统通路并因此防止其不必要地攻击细胞的作用的分子。许多免疫检查点分子是治疗癌症和病毒感染的免疫疗法(例如使用阻断抗体)的靶标。目前免疫疗法靶标的示例性免疫检查点分子包括PD1、PD-L1、CTLA-4、TIGIT、LAG3、PVRIG、KIR、TIM-3、CRTAM、BTLA、CD244、CD160、LIGHT、GITR、4-1BB、OX40、CD27、TMIGD2、ICOS、CD40、CD47、SIRPa、NKG2D、NKG2A、TNFRSF25、CD33、CEA、Epcam、GPC3、CD200、CD200R、CD73、CD83、CD39、TRAIL、CD226、以及VISTA。
各种具体实施方式的详细描述
I.IL-10
人类IL-10细胞因子是两个178个氨基酸的多肽亚单位的同二聚体蛋白质。IL-10通过由两个IL-10受体-1(IL-10Rα亚单位)和两个IL-10受体-2(IL-10Rβ亚单位)蛋白组成的受体复合物传递信号。因此，功能性受体由四个IL-10受体分子组成。IL-10与IL-10Rα的结合会通过JAK1和Tyk2磷酸化IL-10受体的细胞质尾部来诱导STAT3信号转导。IL-10主要由单核细胞产生，少量由淋巴细胞产生，即第II型T辅助细胞(TH2)、肥大细胞、CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞、以及活化T细胞和B细胞的某些亚群。经PD1触发后，IL-10可由单核细胞产生。下表1提供本发明实施例中使用的人类IL-10多肽的氨基酸序列及其序列标识符的概括。这些序列也包括在后附的序列表中。
表1：重组IL-10多肽和多肽接头
除了天然存在的人类IL-10之外，保留IL-10的细胞因子功能的多种工程化和/或合成修饰的IL-10多肽是本领域已知的。PEG化的IL-10，Pegilodecakin，已被证实保留天然存在的人类IL-10的抗肿瘤免疫监视功能。请参见Naing,A.et al.“PEGylated IL-10(Pegilodecakin)Induces Systemic Immune Activation,CD8+T Cell Invigoration andPolyclonal T Cell Expansion in Cancer Patients.”Cancer Cell 34,775-791.(2018)。工程化的IL-10变体R5A11已被证明对IL10R2具有更高的亲和力，在人类CD8+T细胞中展现出增强的信号转导活性，并增强CAR-T细胞的抗肿瘤功能。请参见Gorby,C.et al.“Engineered IL-10variants elicit potent immunomodulatory effects at lowligand doses.”Sci Signal 13,(2020)。来自Epstein-Barr病毒的IL-10与IL-10R1的结合较弱，但保留人类IL10的免疫抑制细胞因子活性，同时失去诱导某些细胞的免疫刺激活性的能力。请参见Yoon,S.I.et al.“Epstein-Barr virus IL-10engages IL-10R1 by atwo-step mechanism leading to altered signaling properties.”J Biol Chem 287,26586-26595(2012)。US 7,749,490 B2和US2017/0015747 A1描述工程化的IL-10突变体(例如F129S-IL10)，在MC/9细胞增殖试验中展现出较低的免疫刺激活性。通常，预期保留一些IL-10细胞因子功能的任何工程化或修饰形式的IL-10多肽可用于本发明的任何一个抗-PD-L1/IL10融合蛋白组合物和方法中。
在一些具体实施方式中，该IL-10可为IL-10突变蛋白，相对于野生型IL-10的氨基酸，其在位置104、位置107及其组合的氨基酸上包含一个或多个取代。在一具体实施方式中，该取代可包含：R104Q；R107A、R107E、R107Q和R107D的任何一个；或其组合。在一些具体实施方式中，本发明的IL-10突变蛋白包含与SEQ ID NO:73、172、173、174、175、176、177、178、179或180具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列，且进一步包含对应于以下氨基酸取代的氨基酸取代：(a)R104Q；(b)R107A；(c)R107E；(d)R107Q；(e)R107D；(f)R104Q/R107A；(g)R104Q/R107E；(h)R104Q/R107Q；以及(i)R104Q/R107D。
III.抗PD-L1抗体和抗PD-L1/IL-10融合蛋白
在一些具体实施方式中，本发明以各种众所周知的免疫球蛋白特征的氨基酸和编码核苷酸序列的术语(例如，CDR、FR、VH、VL结构域，以及全长重链和轻链)提供抗-PD-L1抗体的结构。下表2提供本发明的抗-PD-L1抗体(包括抗体融合物)的序列及其序列标识符的概括描述。这些序列包括在后附的序列表中。
表2：抗-PD-L1抗体融合序列
抗-PD-L1抗体的药物组合物与制剂
本发明还提供了包含抗-PD-L1抗体-IL-10融合蛋白的药物组合物和药物制剂。在一些具体实施方式中，本发明提供一种药物制剂，其包含本文所述的抗-PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体。在一些具体实施方式中，该抗-PD-L1抗体-IL-10融合蛋白是该药物组合物的唯一活性试剂。此类药物制剂可通过将具有所希望纯度的抗-PD-L1抗体-IL-10融合蛋白与一种或多种药学上可接受的载体混合来制备。通常，此类抗体制剂可制备为水溶液(请参见例如美国专利号6,171,586和WO2006/044908)或冷冻干燥制剂(请参见例如美国专利号6,267,958)。
药学上可接受的载体通常在使用的剂量与浓度下对接受者无毒。众多这类药学上可接受的载体是本领域内众所周知的(请参见如Remington’s Pharmaceutical Sciences16th edition,Osol,A.Ed.(1980))。可用于本发明制剂中的示例性药学上可接受的载体可包括但不限于：缓冲溶液，如磷酸盐、柠檬酸盐、及其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸与蛋氨酸；防腐剂(例如，十八烷基二甲基芐基氯化铵；六甲氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚、丁醇、或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间-甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘胺酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖类、二糖类、及其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂(如EDTA)；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如，锌-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。
用于本发明制剂中的药学上可接受载体也可包括间质药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)(请参见例如，美国专利公开号2005/0260186与2006/0104968)，如人类可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白(如rHuPH20或BaxterInternational,Inc.)。
还预期本文所公开的制剂可含有除了抗-PD-L1-IL-10融合蛋白之外的活性成分，该活性成分对于该制剂施用的受试者的待治疗特定适应症为必要的。优选地，任何另外的活性成分具有与抗-PD-L1抗体-IL-10融合蛋白活性互补的活性，且这些活性不会彼此产生不利影响。
如本文别处所公开的，包括实施例，已显示本发明的抗-PD-L1抗体可与IL10多肽组合使用，以在治疗癌症中提供改善的治疗效果。因此，在一些具体实施方式中，本发明提供可用于治疗癌症的药物组合物或制剂，其包含PD-L1拮抗剂(例如抗-PD-L1)和IL10激动剂(例如IL10)。此外，关于本发明的抗-PD-L1抗体作为此类药物制剂或组合物中的PD-L1拮抗剂的用途，也可考虑使用其他拮抗剂，包括但不限于shRNA、siRNA、miRNA、PD-L1的小分子抑制剂或其组合。用于此类药物组合物或制剂的PD-L1小分子抑制剂可包括在临床开发中的已知化合物，包括但不限于AUNP12(Aurigene)、CA-170(Aurigene/Curis)和BMS-986189(Bristol-Myers Squibb)。除了本发明的抗-PD-L1抗体之外，其他可用于在药物组合物或制剂中与IL10组合的已知抗-PD-L1抗体可包括任何与PD-L1结合的已知抗体，包括处于癌症治疗临床开发阶段者，例如阿替利珠单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、德瓦鲁单抗(Durvalumab)、洛达利单抗(Lodapolimab)、FAZ053(BAP058-hum13)和MDX-1105，其在本文别处描述。
如本文别处所述，在一些具体实施方式中，本发明提供用于组合疗法的药物组合物或制剂，其包含PD-L1拮抗剂和IL10激动剂。在一些具体实施方式中，此组合可以包含抗-PD-L1抗体融合物的单个药物组合物或制剂来提供，该抗-PD-L1抗体融合物具有通过多肽接头(例如SEQ ID NO:74、75、76、77、78或79所示的接头序列)与IL10共价融合的抗-PD-L1抗体。证实此类抗PD-L1抗体融合物(例如，PHS102/IL10)及使用其于药物组合物中且可在众多同基因小鼠癌症模型中降低肿瘤体积的实施例，提供于本文的其他地方，包括实施例一节中。有关抗-PD-L1抗体融合物的产生、亲和力成熟和鉴定的详细信息可参考PCT公开号WO2021231741A2的实施例，其通过引用并入本文。
在一些具体实施方式中，该药物组合物包含抗-PD-L1抗体和用于癌症治疗的另外的活性试剂，例如免疫检查点抑制剂。可用于此类具体实施方式的检查点抑制剂包括但不限于第二抗体，其具有对免疫检查点分子抗原的特异性。在一些具体实施方式中，该第二抗体具有对选自PD1、LAG3、CTLA-4、A2AR、TIM-3、BTLA、CD276、CD328、VTCN1、IDO、KIR、NOX2、VISTA、OX40、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、GITR、ICOS的免疫检查点分子的特异性。在至少一个具体实施方式中，该药物组合物包含抗-PD-L1抗体和另外的活性试剂，其中该另外的活性试剂为具有对免疫检查点分子PD1的特异性的抗体。可用于本文所公开的药物组合物实施方式的具有对PD1的特异性的示例性抗体包括但不限于派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、匹迪利珠单抗(pidilizumab)、多斯塔利单抗(dostarlimab)和HX008。
活性成分可被包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合化制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或巨乳液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。
在一些具体实施方式中，该制剂可为抗体和/或其他活性成分的持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有该抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形物品形式，例如薄膜或微胶囊。
通常，施用于受试者的本发明制剂是无菌的。无菌制剂可使用已知的技术轻易地制备，例如通过无菌过滤膜进行过滤。
施用抗-PD-L1抗体-IL-10融合物的模式
根据治疗方法向有需要的受试者施用包含抗-PD-L1抗体-IL-10融合物的组合物或制剂，可通过促进T细胞记忆反应而提供保护受试者免受和/或治疗癌症、癌症复发或病毒感染的疗效。
在本发明治疗方法的一些具体实施方式中，通过全身性递送试剂或将试剂递送至所希望的靶组织的任何施用模式，向受试者施用包含抗-PD-L1抗体-IL-10融合物的抗-PD-L1抗体-IL-10融合组合物或制剂。全身性施用通常是指，除了将抗体直接使用至目标靶位点、组织或器官以外，在某个位点将抗体施用至受试者，使得该抗体或其制剂进入受试者的循环系统，并因此进行新陈代谢的任何模式，和其他类似过程。
因此，可用于本发明通过促进T细胞记忆反应来治疗癌症、癌症复发或病毒感染的方法中的施用模式可包括但不限于注射、输注、滴注和吸入。注射施用可包括静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊椎内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。
在本发明方法的具体实施方式中，该抗-PD-L1抗体-IL-10融合物可通过选自由以下组成的组的至少一种途径施用至有需要的受试者：肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、腹腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包膜内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊椎内、滑膜内、胸腔内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内和经皮。在一具体实施方式中，抗-PD-L1抗体-IL-10可静脉施用至有需要的受试者。
在一些具体实施方式中，抗-PD-L1抗体-IL-10的制剂被配制为使得抗体在肠道中受到保护免于失活。因此，该治疗方法可包含该制剂的口服施用。
在一些具体实施方式中，本发明提供包含抗-PD-L1抗体-IL-10的组合物或制剂作为药物的用途，以通过促进T细胞记忆反应来治疗癌症、癌症复发或病毒感染的用途。此外，在一些具体实施方式中，本发明也提供包含抗-PD-L1抗体-IL-10的组合物或制剂在制造或制备用于通过促进T细胞记忆反应来治疗癌症、癌症复发或病毒感染的药物的用途。在进一步具体实施方式中，该药物用于通过促进T细胞记忆反应来治疗癌症、癌症复发或病毒感染的方法中，该方法包含向有需要的受试者施用有效量的该药物。在某些具体实施方式中，该药物进一步包含有效量的至少一种另外的治疗剂或治疗。
在进一步的具体实施方式中，该药物用于通过促进受试者中的T细胞记忆反应来治疗癌症、癌症复发或病毒感染，包含向该受试者施用有效量的药物，以通过促进T细胞记忆反应来治疗癌症、癌症复发或病毒感染。
为了通过促进T细胞记忆反应来治疗癌症、癌症复发或病毒感染，本发明的组合物和制剂中包含的抗-PD-L1抗体-IL-10的适当的剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于多种因素，包括疾病的严重性和病程、施用抗体是用于预防或治疗目的、对患者施用的先前疗法、患者的临床病史和对抗体的反应以及主治医生的判断。
一般而言，可用于本发明的方法的治疗方案可由有需要的受试者的医疗人员决定。当包含在本文所述的组合物和制剂中时，本发明的抗-PD-L1抗体-IL-10可适当地一次或在一系列治疗中施用至患者。本文考虑多种给药方案，包括但不限于在不同时间点单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
在该方法的一些具体实施方式中，包含抗-PD-L1抗体-IL-10的组合物可以一天一次以上、至少一天一次、至少一周一次或至少一个月一次施用至有需要的受试者。
取决于癌症、癌症复发或病毒感染的类型和严重度，本发明制剂中约1μg/kg至15mg/kg的抗-PD-L1抗体-IL-10为用于向人类受试者施用的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开施用、或是通过连续输注。通常，抗体的施用剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。在一些具体实施方式中，可向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一次或多次剂量。
剂量施用可维持数天或更长时间，这取决于受试者的状况，例如，施用可以持续至癌症、癌症复发或病毒感染得到充分治疗，如通过本领域已知的方法所确定。在一些具体实施方式中，可施用初始较高的负载剂量，之后施用一个或多个较低剂量。然而，其他剂量方案可能有用。剂量施用的治疗效果进展可通过常规技术和试验来监测。
因此，在本发明方法的一些具体实施方式中，抗-PD-L1抗体-IL-10的施用包含约1mg/kg至约100mg/kg的每日剂量。在一些具体实施方式中，抗-PD-L1抗体-IL-10的剂量包含至少约1mg/kg、至少约5mg/kg、至少约10mg/kg、至少约20mg/kg、或至少约30mg/kg的每日剂量。
与其他治疗剂的组合治疗方法
在本发明的具体实施方式中，该方法可更包含施用至少另外的治疗剂的步骤。例如，该另外的治疗剂可与抗-PD-L1抗体-IL-10组合物组合施用至有需要的受试者—例如与抗-PD-L1抗体-IL-10组合物同时施用；在施用抗-PD-L1抗体-IL-10组合物之前施用；或在施用抗-PD-L1抗体-IL-10组合物之后施用。在一些具体实施方式中，该另外的治疗剂可包含针对癌症、癌症复发或病毒感染的另外的治疗、或针对与癌症、癌症复发或病毒感染相关的疾病或症状的治疗。预期在组合治疗方法中，通过与治疗剂组合施用抗-PD-L1抗体-IL-10组合物，可改善该治疗剂的功效。不受理论的束缚，通常认为在施用治疗有效量的抗-PD-L1抗体-IL-10组合物和任选的另外的治疗剂后，可诱导或增强有需要受试者中对癌症、癌症复发或病毒感染的免疫反应；可降低癌症的尺寸或严重程度；可诱导与病毒相关的血清转化；或者，可降低有需要受试者体内的病毒量，甚至降低到无法检测到的水平。此外，增强的免疫反应可包含进一步调节免疫系统活性的抗体或细胞因子的产生。
在具体实施方式中，进行该包括施用至少另外的治疗剂的方法，其中该另外的治疗剂为病毒疫苗。如本文别处所述，可用于组合治疗方法中的病毒疫苗可包括用于预防的病毒疫苗，以及用于治疗已被病毒感染的受试者的治疗性疫苗。在一些具体实施方式中，该治疗性疫苗选自DNA疫苗、病毒载体疫苗、蛋白质疫苗和多肽疫苗。
如本文别处所述，抑制性免疫检查点分子为某些病毒感染以及癌症的治疗靶标。因此，在具体实施方式中，进行该包括施用至少另外的治疗剂的方法，其中该另外的治疗剂为靶向抑制性免疫检查点分子的抗体。在一些具体实施方式中，该抑制性免疫检查点分子选自PD1、PD-L1和CTLA-4。在一些具体实施方式中，该靶向抑制性免疫检查点分子的抗体选自抗-PD1、抗-PD-L1和抗-CTLA-4。
在本发明的其他具体实施方式中，该另外的治疗剂可选自由以下组成的组：治疗剂；显影剂；细胞毒性剂；血管生成抑制剂；激酶抑制剂；共刺激分子阻断剂；黏附分子阻断剂；抗-细胞因子抗体或其功能片段；甲氨蝶呤；环孢菌素；雷帕霉素(rapamycin)；FK506；可检测的标记或报告子；TNF拮抗剂；抗风湿药；肌肉松弛剂；麻醉剂；非类固醇抗炎药(NSAID)；镇痛剂；麻醉剂；镇静剂；局部麻醉剂；神经肌肉阻断剂；抗微生物剂；抗银屑病药；皮质类固醇；合成代谢类固醇；促红细胞生成素；免疫接种；免疫球蛋白；免疫抑制剂；生长激素；激素替代药物；放射性药物；抗忧郁药；抗精神病药；兴奋剂；哮喘药物；β激动剂；吸入性类固醇；肾上腺素或其类似物；细胞因子；以及细胞因子拮抗剂；免疫调节剂。
在一些具体实施方式中，该另外的治疗剂选自病毒进入抑制剂、病毒RNA抑制剂、基因编辑剂、病毒抗原分泌抑制剂、聚合酶抑制剂、干扰素、病毒成熟抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂、衣壳组装抑制剂/调节剂、cccDNA抑制剂、FXR激动剂、microRNA、TLR激动剂和免疫调节剂。
实施例
本发明的各种特征和具体实施方式在以下代表性示例中示出，其旨在说明而非限制。本领域内技术人员将容易理解，该具体实施方式仅是对本发明的说明，在后附的权利要求中更全面地描述。本申请中所述的每个具体实施方式和特征应被理解为可与其中包含的每个具体实施方式互换和组合。
实施例1：双功能抗-PDL1/IL-10融合蛋白的产生
A.重组抗-PDL1/IL-10融合蛋白的产生
重组IL10-Fc融合蛋白被设计为将人类IL-10基因融合至人类IgG1-Fc的N-端，中间由14个氨基酸接头分隔。重组抗-PDL1/IL-10融合蛋白设计为通过将人类IL-10(WT、R107A或R104Q/R107A)基因融合至抗-PDL1(阿替利珠单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、德瓦鲁单抗(Durvalumab)、PHS102、HSYPP31F、HSYPP411C、YP7G、YP11F、YT6D、YT7A、YT7H、或YT10H)IgG1抗体片段的C-端，中间以14个氨基酸接头分隔。使用Thermo基因合成服务来获得所希望的基因片段(其前接分泌重组蛋白所需的IL-2分泌序列)，并将其克隆至哺乳动物表达载体中。该融合蛋白是于经转染的ExpiCHO细胞中表达。
B.重组抗体的纯化
抗体在ExpiCHO-S细胞(Thermo Scientific)中瞬时表达。在噬菌体指数生长期间，6x106个ExpiCHO-S细胞以ExpiFectamine CHO转染试剂盒(Thermo Scientific)，以20μg编码IL10-Fc或抗-PDL1/IL-10融合蛋白的载体瞬时转染。转染后18至22小时，将ExpiFectamine CHO Enhancer和ExpiCHO Feed加入烧瓶中。将细胞培养8天。将每种培养物的上清液离心，之后通过0.45μm过滤器进行过滤。
使用蛋白A琼脂糖快速流动微珠(GE Healthcare)从经转染的细胞上清液纯化出抗体。以PBS清洗抗体加载管柱，之后用0.1M甘胺酸(pH 2.5)直接洗脱至1/10体积的1MTris缓冲液(pH 9.0)中。合并含有抗体的分液并以PBS进行透析。在还原剂存在和不存在的情况下，用SDS-PAGE检验纯化抗体的质量。
关于抗-PD-L1抗体融合物的产生、亲和力成熟和鉴定的细节可参见PCT公开号WO2021231741A2，其通过引用并入本文。
实施例2：抗-PDL1/IL-10融合蛋白增强混合淋巴细胞反应(MLR)中抗原呈递细胞(APC)介导的T细胞活化
此实施例阐明了抗-PDLl/IL-10增强MLR中T细胞活化的能力的研究。已知IFNγ产量的增加与T细胞效应子功能有关。
材料与方法：人类外周血液获取自健康捐赠者。外周血单核细胞(PBMC)立即使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)以密度梯度离心分离。为了作为同种异体APC，首先使用来自捐赠者A的抗-人类CD14缀合磁珠(Miltenyi Biotec)分离出CD14+单核细胞。对于未成熟树突状细胞(DC)的产生，将单核细胞与GM-CS F(20ng/mL)和IL-4(20ng/mL)一起在补充有10％FBS的RPMI1640中培养6天。用于成熟DC的产生，是将未成熟的DC用LPS(500ng/mL)处理24小时。成熟DC在37℃下，以40μg/mL丝裂霉素C处理30分钟，之后与T细胞共培养。
使用获自捐赠者B的抗-人类CD4缀合磁珠(Miltenyi Biotec)分离出CD4+T细胞。将应答CD4 T细胞以4×106个细胞/mL重新悬浮于培养基中，并添加50μL的T细胞至所有孔中，仅含DC的孔除外。将刺激子DC以4×106个细胞/mL重新悬浮于培养基中，并在所有孔中加入50μL DC，仅含CD4 T细胞的孔除外。另外的100μL的含有0.1-2μg IL10-Fc或抗-PDL1/IL-10融合蛋白(阿维鲁单抗(Avelumab)/IL10、HSYPP411C/IL10、YP7G/IL10、YP11F/IL10、YT7A/IL10、YT7H/IL10或YT10H/IL10)的培养基添加到96孔U底平板中的CD4T-DC培养物中。共培养物在37℃下静置。5天后，根据制造商的说明书，用ELISA(Biolegend)测量上清液中释放的IFN-γ浓度。
结果：如图1所示，在MLR试验中，相对于IL10-Fc对照组，示例性抗-PDL1/IL-10融合蛋白能够增强T细胞活化。
实施例3：抗-PDL1/IL-10融合蛋白在肿瘤中的积累
此实施例说明抗-PDLl/IL-10在HNSC模型中的肿瘤组织内积累的能力的研究。
材料与方法：根据制造商的说明书使用近红外线(NIR)荧光染料标记试剂盒(VivoTag 680XL,PerkinElmer)标记纯化的抗-PDL1/IL-10融合蛋白(阿维鲁单抗(Avelumab)/IL10)。HNSC/Q1-2Lucferiease为来自亲代MTC-Q 1(小鼠口腔癌细胞系)的荧光酶表达的亚系，由Kuo-Wei Chang博士(台湾阳明交通大学牙医学系)友情提供。将HNSC/Q1-2Lucferiease肿瘤细胞皮下接种至同基因C56BL/6小鼠，用于肿瘤生长。2周生长期后，HNSC/Q1-2Lucferiease携带肿瘤小鼠静脉注射150μg经VivoTag680-标记的抗-PDL1/IL-10(阿维鲁单抗(Avelumab)/IL10)24小时，之后使用Xenogen IVIS100成像系统进行体内生物发光和荧光检测。用于抗-PDL1/IL-10的生物分布，分离出具有VivoTag680信号的小鼠组织，包括肿瘤和脾脏，以通过使用Vectra Polaris成像系统(Akoya Biosciences)进行荧光检查来确认抗-PDL1/IL-10的存在。
结果：如图2所示，静脉注射施用后，抗-PDL1/IL-10特异性地积累在肿瘤中，而不是脾脏或其他组织。
实施例4：抗-PDL1/IL-10增强体内T细胞反应
此实施例说明抗-PDL1/IL-10治疗会增加与T细胞反应相关的细胞因子的血清浓度的能力的研究
材料与方法：BALB/c小鼠(6-8周龄)皮下植入5×105个CT26细胞(ATCC CRL-2638)。8天后，当肿瘤体积达到50-100mm3时，将小鼠随机分至各治疗组。之后对小鼠进行腹膜内(i.p.)注射，每周两次，持续3周，以施用PBS对照、3mg/kg IL10-Fc(92kDa)、6mg/kg抗-PDL1/TGFbR(阿维鲁单抗(Avelumab)/TGFβR2，M7824，177kDa)或6mg/kg抗-PDL1/IL-10(阿维鲁单抗(Avelumab)/IL10，185.5kDa)。在第29天采集血液样本。用ELISA试剂盒(Biolegend)测量小鼠CXCL9和IL-18的血清浓度。
结果：如图3所示，与对照组和抗-PDL1/TGFbR组相比，抗-PDL1/IL-10组的IL-18血清浓度显著升高。此外，与其他三组相比，CXCL9血清浓度也大幅升高。
实施例5：抗-PDL1/IL-10增强肿瘤控制的能力取决于肿瘤-驻留细胞活性的增加
此实施例说明抗PDLl/IL-10介导的肿瘤控制对于肿瘤-驻留细胞依赖性的研究。
材料与方法：BALB/c小鼠(6-8周龄)皮下植入5×105个EMT6细胞(ATCC CRL-2755)。10天后，当肿瘤体积达到50-100mm3时，将小鼠随机分至各治疗组。携带EMT6肿瘤的小鼠(n＝6)每天使用载体(1％乙醇，PO)或FTY720(2mg/kg，PO)治疗，持续2周。从第11天开始每周两次腹腔注射PBS、抗-PDL1(阿维鲁单抗(Avelumab))(10mg/kg)或抗-PDL1/IL-10(阿维鲁单抗(Avelumab)/IL10)(12mg/kg)，持续4周。通过卡尺每周两次测量肿瘤体积直至研究结束。
结果：如图4所示，与抗-PDL1组相比，抗PDL1/IL-10组的肿瘤体积较小且存活率较高，表明抗-PDL1/IL-10对于肿瘤控制很重要。与FTY720(其抑制淋巴细胞从次级淋巴器官流出)共治疗，在某些小鼠(但不是所有小鼠)中并没有降低抗-PDL1/IL-10的抗肿瘤活性。
实施例6：抗-PDL1/IL-10治疗产生持久的T细胞记忆保护
本实施例说明抗-PDLl/IL-10产生持久抗肿瘤免疫反应的能力的研究。
材料与方法：将BALB/c小鼠(6-8周龄)的右后胁腹区域皮下植入5×105个EMT6细胞(ATCC CRL-2755)。7天后，当肿瘤体积达到50-100mm3时，将小鼠随机分至各治疗组。之后，小鼠(n＝7)每周两次腹腔内注射PBS、抗-PDL1(5mg/kg)、抗-PDL1/IL-10(6mg/kg)或抗-PDL1/TGFbR(6mg/kg)，持续3周。对于再挑战研究，肿瘤“治愈”5周后(第67天)，将治愈的原始Balb/c小鼠(n＝5)在左后胁腹区域皮下植入EMT6肿瘤细胞。通过卡尺每周两次测量肿瘤体积直至研究结束。
结果：如图5和表3所示，与抗-PDL1治疗和抗-PDL1/TGFbR治疗相比，抗-PDL1/IL-10治疗显示出更高的存活率和肿瘤生长抑制。类似地，针对再挑战研究，5周无肿瘤的经抗-PDL1/IL10治疗小鼠是用EMT6细胞刺激。与原始小鼠100％形成肿瘤相比，在接下来的一个月内没有小鼠长出新肿瘤，这表明抗-PDL1/IL10可引发持久的肿瘤特异性T细胞反应和记忆保护。
表3：EMT6肿瘤研究中肿瘤生长抑制、治愈小鼠数量和中位数总存活率的概括。
实施例7：抗-PDL1/IL-10突变蛋白控制肿瘤生长并增强T细胞反应
此实施例说明抗-PDL1/IL-10突变体控制肿瘤生长和增强T细胞反应的能力的研究
材料与方法：BALB/c小鼠(6-8周龄)皮下植入5×105个CT26细胞(ATCC CRL-2638)。7天后，当肿瘤体积达到50-100mm3时，将小鼠随机分至各治疗组。之后向小鼠腹腔内注射1mg/kg抗-PDL1/IL-10或抗-PDL1/IL-10突变体(R107A、R104Q/R107A)，每周两次，持续3周。用ELISA试剂盒(Biolegend)测量小鼠CXCL9的血清浓度。
结果：如图6所示，抗-PDL1/IL-10突变蛋白、抗-PDL1/IL-10_R107A和抗-PDL1/IL-10_QA显现出与抗-PDL1/IL-10WT类似的肿瘤生长曲线。此外，与对照组相比，CXCL9的血清浓度也大幅增加，这表明与对照组相比，抗-PDL1/IL-10组(不论是与IL-10WT或IL-10突变蛋白组合)的T细胞反应增强。
实施例8：从经抗-PDL1/IL10治疗的携带肿瘤小鼠分离出的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)展现出更好的记忆反应
此实施例说明从经抗-PDL1/IL10治疗的携带肿瘤小鼠分离出的PEX展现出更好的记忆反应。
材料与方法：在第0天C57BL/6小鼠皮下接种8×105个YUMM1.7-GP33肿瘤细胞，之后在植入后第9天以静脉注射过继转移2×106个早期活化的Tcf7GFP P14 T细胞。表达P14TCR的T细胞对淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒(LCMV)的gp33表位具有特异性。携带肿瘤的小鼠进一步在第10天和第14天进行腹腔内注射施用PBS或125μg抗-PDL1/IL-10(阿维鲁单抗(Avelumab)/IL10)。在第15天收获肿瘤后，根据标记物TCF7-GFP+PD-1+TIM3-进一步分选出前体细胞耗竭的CD8+TIL，之后转移到原始接受者小鼠中。第二天，经TIL转移的小鼠进一步接受LCMV-Arm(2×105CFU)再挑战。最后，收集脾脏，并在感染后第8天对转移的细胞进行分析。
结果：图7描述了再挑战后，经抗-PDL1/IL-10治疗的TIL展现出更好的免疫质量，其中(A)PD1和(B)TIM3的共抑制受体的表达量降低，以及(C)与PBS处理组相比，PD-1+TIM3+LAG3+细胞群减少。
实施例9：抗-PDL1/IL-10治疗增强前体细胞耗竭T细胞(PEX)依赖性持久肿瘤保护
本实施例说明经抗-PDL1/IL-10增强的持久肿瘤保护为PEX依赖性
材料与方法：在第0天，C57BL/6小鼠皮下接种8×105个YUMM1.7-GP33肿瘤细胞，之后在植入后第6天以静脉注射过继转移4×106个早期活化的Tcf7DTR-GFP P14 T细胞。从第8天开始，携带肿瘤小鼠进一步进行腹腔内注射125μg抗-PDL1/IL-10(阿维鲁单抗(Avelumab)/IL10)，每三天一次，直到肿瘤变得无法检测。三周后，对无肿瘤小鼠进行腹腔注射3次PBS或1.5μg白喉毒素(DT)，以在1周内消除表达TCF1+白喉毒素受体(DTR)的细胞。最后，所有无肿瘤小鼠均进行皮下注射接种2×105个B16-GP33黑色素瘤细胞，每隔一天监测一次肿瘤生长。年龄匹配的原始小鼠也接种B16-GP33细胞作为肿瘤进展的阳性对照。
结果：如图8所示，年龄匹配的原始小鼠接种B16-GP33黑色素瘤细胞作为肿瘤进展的阳性对照组(原始)。监测(A)肿瘤生长和(B)无肿瘤存活期4周。未消除前体细胞耗竭T细胞(PEX)的无肿瘤小鼠对照组(Ctrl)仍维持无肿瘤状态，而DT治疗组在再挑战后第14至16天即可观察到B16-GP33肿瘤病变，说明抗-PDL1/IL10-诱导的持久保护为PEX依赖性。
尽管出于清楚及理解的目的通过实例及说明的方式详细描述本发明的前述公开内容，但是包括本文描述的实例、描述，以及具体实施方式的本发明内容是出于说明性目的，旨为示例性，不应该被解释为局限本发明内容。本领域内技术人员将清楚，可以对本文描述的范例、描述，以及具体实施方式进行各种修饰或改变，并且将包括于本发明内容以及所附权利要求的精神及范围内。此外，本领域内技术人员将认知到多种与本文描述者等效的方法及程序。所有此类等效物应被理解为于本发明内容的范围内并且由所附权利要求涵盖。本发明的另外的具体实施方式在以下权利要求中阐述。
Claims (34)
1.一种包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体的组合物在有需要的受试者中促进T细胞记忆反应的用途。
2.一种包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体的组合物在制备用于在有需要的受试者中促进T细胞记忆反应的药物的用途。
3.一种组合物，其包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体，用于在有需要的受试者中促进T细胞记忆反应。
4.一种包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体的组合物在有需要的受试者中治疗癌症的用途。
5.一种包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体的组合物在制备用于在有需要的受试者中治疗癌症的药物的用途。
6.一种组合物，其包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体，用于在有需要的受试者中治疗癌症。
7.一种包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体的组合物在有需要的受试者中预防癌症复发的用途。
8.一种包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体的组合物在制备用于在有需要的受试者中预防癌症复发的药物的用途。
9.一种组合物，其包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体，用于在有需要的受试者中预防癌症复发。
10.一种包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体的组合物在有需要的受试者中治疗慢性病毒感染疾病的用途。
11.一种包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体的组合物在制备用于在有需要的受试者中治疗慢性病毒感染疾病的药物的用途。
12.一种组合物，其包含治疗有效量的PD-L1抗体-IL-10融合蛋白和药学上可接受的载体，用于在有需要的受试者中治疗慢性病毒感染疾病。
13.如权利要求3、6、9或12中任一项所述的组合物，其中该组合物与至少一种另外的治疗剂一起使用。
14.如权利要求13所述的组合物，其中该至少一种另外的治疗剂为病毒疫苗。
15.如权利要求13所述的组合物，其中该至少一种另外的治疗剂为靶向抑制性免疫检查点分子的抗体。
16.如权利要求13所述的组合物，其中该至少一种另外的治疗剂选自由以下组成的组：显影剂；细胞毒性剂；血管生成抑制剂；激酶抑制剂；共刺激分子阻断剂；黏附分子阻断剂；抗细胞因子抗体或其功能片段；甲氨蝶呤；环孢菌素；雷帕霉素(rapamycin)；FK506；可检测的标记或报告子；TNF拮抗剂；抗风湿药；肌肉松弛剂；麻醉剂；非类固醇抗炎药(NSAID)；止痛剂；麻醉剂；镇静剂；局部麻醉剂；神经肌肉阻断剂；抗微生物剂；抗银屑病药；皮质类固醇；促合成代谢性类固醇；红细胞生成素；免疫接种；免疫球蛋白；免疫抑制剂；生长激素；激素替代药物；放射性药物；抗忧郁剂；抗精神病剂；兴奋剂；哮喘药物；β激动剂；吸入性类固醇；肾上腺素或其类似物；细胞因子；细胞因子拮抗剂；免疫调节剂；HBV进入抑制剂；病毒RNA抑制剂；基因编辑试剂；HBsAg分泌抑制剂；聚合酶抑制剂；干扰素；病毒进入抑制剂；病毒成熟抑制剂；核苷逆转录酶抑制剂；衣壳组装抑制剂/调节剂；cccDNA抑制剂；FXR激动剂；microRNA；以及TLR激动剂。
17.如权利要求3、6、9或12中任一项所述的组合物，其中该组合物通过选自以下组成的组的至少一种模式施用：肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、腹腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包膜内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊椎内、滑膜内、胸腔内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内和经皮。
18.如权利要求3、6、9或12中任一项所述的组合物，其中该组合物一天使用一次以上、至少一天一次、至少一周一次、或至少一个月一次。
19.如权利要求1至2、4至5、7至8或10至11中任一项所述的用途，或如权利要求3、6、9或12中任一项所述的组合物，其中该PD-L1抗体为免疫球蛋白分子、Fv、经二硫键连接的Fv、单克隆抗体、scFv、嵌合抗体、单域抗体、CDR-移植抗体、双抗体、人类抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、Fab’片段、双特异性抗体、F(ab’)2片段、包含在铰链区通过二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段、dAb片段、经分离的互补决定区(CDR)、或单链抗体。
20.如权利要求1至2、4至5、7至8或10至11中任一项所述的用途，或如权利要求3、6、9或12中任一项所述的组合物，其中该PD-L1抗体包含通过接头与IL 10融合的重链(HC)；任选地，其中该接头包含选自SEQ ID NO:74、75、76、77、78和79的氨基酸序列。
21.如权利要求1至2、4至5、7至8或10至11中任一项所述的用途，或如权利要求3、6、9或12中任一项所述的组合物，其中：
(a)该IL-10包含如SEQ ID NO:73、172、173、174、175、176、177、178、179或180所示的氨基酸序列；
(b)该IL-10为IL-10的天然存在，或保留其细胞因子活性的工程化变体；
(c)该IL-10为IL-10的保留其细胞因子活性的合成修饰形式；和/或
(d)该IL-10包含一、二或四个IL-10多肽。
22.如权利要求1至2、4至5、7至8或10至11中任一项所述的用途，或如权利要求3、6、9或12中任一项所述的组合物，其中，相对于野生型IL-10的氨基酸，该IL-10包含在氨基酸位置104、位置107及其组合的取代。
23.如权利要求22所述的用途或组合物，其中该野生型IL-10包含与SEQ ID NO:73、172、173、174、175、176、177、178、179或180具有至少80％、优选至少90％、更优选至少95％同一性的氨基酸序列。
24.如权利要求23所述的用途或组合物，其中该取代包含：
(a)R104Q；
(b)R107A、R107E、R107Q和R107D中的任何一个；或者
(c)其组合。
25.如权利要求24所述的用途或组合物，其中该取代包含R104Q/R107A、R104Q/R107E、R104Q/R107Q或R104Q/R107D。
26.如权利要求1至2、4至5、7至8或10至11中任一项所述的用途，或如权利要求3、6、9或12中任一项所述的组合物，其中该PD-L1抗体包含(i)第一轻链互补决定区(CDR-L1)、第二轻链互补决定区(CDR-L2)和第三轻链互补决定区(CDR-L3)，以及(ii)第一重链互补决定区(CDR-H1)、第二重链互补决定区(CDR-H2)和第三重链互补决定区(CDR-H3)，其中：
(a)CDR-H1包含选自SEQ ID NO:92和123的氨基酸序列；
(b)CDR-H2包含选自SEQ ID NO:109、114和124的氨基酸序列；
(c)CDR-H3包含选自SEQ ID NO:94和110的氨基酸序列；
(d)CDR-L1包含选自SEQ ID NO:53的氨基酸序列；
(e)CDR-L2包含选自SEQ ID NO:54的氨基酸序列；
(f)CDR-L3包含选自SEQ ID NO:55、112和116的氨基酸序列。
27.如权利要求26所述的用途或组合物，其中：
(a)CDR-H1包含如SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:112所示的氨基酸序列；
(b)CDR-H1包含如SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:114所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:116所示的氨基酸序列；或者
(c)CDR-H1包含如SEQ ID NO:123所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:124所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ IDNO:53所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
28.如权利要求26所述的用途或组合物，其中该抗体包含与选自SEQ ID NO:111、115和125的序列具有至少90％同一性的重链可变区(VH)氨基酸序列；和/或与选自SEQ ID NO:56、113和117的序列具有至少90％同一性的轻链可变区(VL)氨基酸序列；任选地，其中：
(a)该抗体包含与SEQ ID NO:111具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQ IDNO:113具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(b)该抗体包含与SEQ ID NO:115具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQ IDNO:117具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；或者
(c)该抗体包含与SEQ ID NO:125具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQ IDNO:56具有至少90％同一性的VL氨基酸序列。
29.如权利要求26所述的用途或组合物，其中该抗体包含与选自SEQ ID NO:157、158和160的序列具有至少90％同一性的重链(HC)氨基酸序列；和/或与选自SEQ ID NO:135、137和141的序列具有至少90％同一性的轻链(LC)氨基酸序列；任选地，其中该抗体包含：
(a)如SEQ ID NO:157所示的HC氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:135所示的LC氨基酸序列；
(b)如SEQ ID NO:158所示的HC氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:137所示的LC氨基酸序列；
(c)如SEQ ID NO:160所示的HC氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:141所示的LC氨基酸序列。
30.如权利要求26所述的用途或组合物，其中该抗体包含通过接头与IL-10多肽融合的重链(HC)，其中该HC-IL-10融合氨基酸序列与选自SEQ ID NO:134、136和140的序列具有至少90％的同一性；以及轻链(LC)，其具有与选自SEQ ID NO:135、137和141的序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列；任选地，其中该抗体包含：
(a)如SEQ ID NO:134所示的HC-IL-10融合氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:135所示的LC氨基酸序列；
(b)如SEQ ID NO:136所示的HC-IL-10融合氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:137所示的LC氨基酸序列；或者
(c)如SEQ ID NO:140所示的HC-IL-10融合氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:141所示的LC氨基酸序列。
31.如权利要求1至2、4至5、7至8或10至11中任一项所述的用途，或如权利要求3、6、9或12中任一项所述的组合物，其中该PD-L1抗体包含通过接头与IL-10融合的重链(HC)，其中该抗体包含(i)第一轻链互补决定区(CDR-L1)、第二轻链互补决定区(CDR-L2)和第三轻链互补决定区(CDR-L3)，以及(ii)第一重链互补决定区(CDR-H1)、第二重链互补决定区(CDR-H2)和第三重链互补决定区(CDR-H3)，其中：
(a)CDR-H1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列；
(b)CDR-H1包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQID NO:15所示的氨基酸序列；
(c)CDR-H1包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；
(d)CDR-H1包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；
(e)CDR-H1包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；
(f)CDR-H1包含如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列；
(g)CDR-H1包含如SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:112所示的氨基酸序列；
(h)CDR-H1包含如SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:114所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:116所示的氨基酸序列；或者
(i)CDR-H1包含如SEQ ID NO:123所示的氨基酸序列、CDR-H2包含如SEQ ID NO:124所示的氨基酸序列、CDR-H3包含如SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列、CDR-L1包含如SEQ IDNO:53所示的氨基酸序列、CDR-L2包含如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，以及CDR-L3包含如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
32.如权利要求31所述的用途或组合物，其中该抗体包含与选自SEQ ID NO:4、12、20、28、36、44、111、115和125的序列具有至少90％同一性的重链可变区(VH)氨基酸序列；和/或与选自SEQ ID NO:8、16、24、32、40、48、56、113和117的序列具有至少90％同一性的轻链可变区(VL)氨基酸序列；任选地，其中：
(a)该抗体包含与SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQ IDNO:8具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(b)该抗体包含与SEQ ID NO:12具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQ IDNO:16具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(c)该抗体包含与SEQ ID NO:20具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQ IDNO:24具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(d)该抗体包含与SEQ ID NO:28具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQ IDNO:32具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(e)该抗体包含与SEQ ID NO:36具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQ IDNO:40具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(f)该抗体包含与SEQ ID NO:44具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQ IDNO:48具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(g)该抗体包含与SEQ ID NO:111具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQ IDNO:113具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(h)该抗体包含与SEQ ID NO:115具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQ IDNO:117具有至少90％同一性的VL氨基酸序列；
(i)该抗体包含与SEQ ID NO:125具有至少90％同一性的VH氨基酸序列；以及与SEQ IDNO:56具有至少90％同一性的VL氨基酸序列。
33.如权利要求31所述的用途或组合物，其中该抗体包含HC-IL-10融合氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO:80、81、82、134、136和140的序列具有至少90％的同一性，以及轻链(LC)氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO:135、137、141、143、145和147的序列具有至少90％的同一性；任选地，其中：
(a)该HC-IL-10融合氨基酸序列如SEQ ID NO:80所示，以及该LC氨基酸序列如SEQ IDNO:143所示；
(b)该HC-IL-10融合氨基酸序列如SEQ ID NO:81所示，以及该LC氨基酸序列如SEQ IDNO:145所示；
(c)该HC-IL-10融合氨基酸序列如SEQ ID NO:82所示，以及该LC氨基酸序列如SEQ IDNO:147所示；
(d)该HC-IL-10融合氨基酸序列如SEQ ID NO:134所示，以及该LC氨基酸序列如SEQ IDNO:135所示；
(e)该HC-IL-10融合氨基酸序列如SEQ ID NO:136所示，以及该LC氨基酸序列如SEQ IDNO:137所示；或者
(f)该HC-IL-10融合氨基酸序列如SEQ ID NO:140所示，以及该LC氨基酸序列如SEQ IDNO:141所示。
34.如权利要求1至2、4至5、7至8或10至11中任一项所述的用途，或如权利要求3、6、9或12中任一项所述的组合物，其中：
(a)该蛋白质使MC/9细胞增殖增加至少25％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％或更多；
(b)该蛋白质使活化的CD8 T细胞的IFNγ和颗粒酶B生产增加至少25％、至少50％、至少100％或更多；和/或
(c)该抗体使同基因小鼠肿瘤模型在第28天测量的肿瘤体积降低至少25％、至少50％、至少75％或更多，其中该小鼠肿瘤模型选自：CT26结肠癌和EMT6乳腺癌。
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