CN116323667A - 结合PSMA和γ-δT细胞受体的抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及能够结合人PSMA并且能够结合人Vγ9Vδ2 T细胞受体的抗体。本发明还涉及包含本发明抗体的药物组合物，以及本发明抗体用于医学治疗的用途。
Description
技术领域
本发明涉及能够结合人PSMA并且能够结合人Vγ9Vδ2 T细胞受体的新多特异性抗体。本发明还涉及包含本发明抗体的药物组合物，以及本发明抗体用于医学治疗的用途。
背景技术
在欧洲和美国，前列腺癌是男性中最常见的癌症。局限性疾病的早期检测导致高的存活率。然而，转移的肿瘤导致存活显著降低。前列腺特异性膜抗原(prostate-specificmembrane antigen，PSMA)，也称为叶酸水解酶I或谷氨酸羧肽酶II，是药物开发的潜在靶标。PSMA是一种II型跨膜蛋白，其显示出在前列腺癌细胞上过表达，但在正常组织中低表达。
已经开发了数种PSMA靶向分子(参见例如Haberkorn et a.(2016)Clin CancerRes 22：9)，包括抗体(Chatalic et al.(2015)J Nucl Med 56：1094；WO2018098354)。还描述了双特异性PSMA+CD3 T细胞接合抗体方法(Hernandez-Hoyos et al.(2016)Mol CancerTher 15：2155；WO2016187594)。双特异性T细胞接合抗体具有肿瘤靶标结合特异性和T细胞结合特异性，并因此通过将T细胞细胞毒性重定向至恶性细胞来提高效力，参见例如Huehlset al.(2015)Immunol Cell Biol 93：290；Ellerman(2019)Methods，154：102；de Bruinet al.(2017)Oncoimmunology 7(1)：e1375641和WO2015156673。然而，结果差异显著。例如，在其中CD3结合部分与针对8种不同B细胞靶标(CD20、CD22、CD24、CD37、CD70、CD79b、CD138和HLA-DR)的结合部分组合的一项研究中，发现靶向不同肿瘤靶标的双特异性抗体在其诱导靶细胞细胞毒性能力方面显示出强变化，并且细胞毒性与抗原表达水平不相关。例如，尽管具有中间至高的HLA-DR和CD138表达水平，但靶向HLA-DR或CD138的基于CD3的双特异性抗体不能诱导细胞毒性(Engelberts et al.(2020)Ebiomedicine 52：102625)。很少有T细胞重定向治疗达到后期临床开发，这可能是由于显著的毒性、生产问题、免疫原性和实体瘤的低响应率。特别地，当T细胞接合剂包含CD3结合臂时，由于不受控的免疫活化和细胞因子释放而可能发生毒性。
因此，虽然已经取得了重大进展，但仍然需要治疗高效且具有可接受毒性的新PSMA抗体。这样的新PSMA抗体还应具有适当的药代动力学和药效学特性，并且最适宜能够以高产率和纯度进行生产。此外，需要其中发生最少的降解和聚集的这样的抗体的稳定形成。
通过本发明解决了这些需求。
发明概述
本发明提供了用于基于PSMA的治疗的新抗体。构建了这样的双特异性抗体，其中PSMA结合区与能够结合Vγ9Vδ2 T细胞受体并因此接合γδT细胞的结合区组合。出乎意料地，所述双特异性抗体能够介导自体Vγ9Vδ2 T细胞(包括肿瘤浸润性Vγ9Vδ2 T细胞)的活化，并且能够在存在自体PBMC来源Vγ9Vδ2 T细胞的情况下以非常高的效力诱导对患者来源肿瘤细胞的杀伤。使用肿瘤细胞系在低的效应细胞(γδT细胞)与靶细胞(肿瘤细胞)比下也观察到这些活性，这是重要的，因为γδT细胞仅是人T细胞的亚群，其数目可以变化。在另一方面，正常的健康组织没有受到影响，表明这些抗体用于有效且安全的癌症治疗的潜能。另外，用全人血进行的研究表明，尽管该抗体对靶细胞具有高效力，但其仅诱导低水平的细胞因子释放，表明细胞因子释放综合征的低风险。
此外，开发了包含VHH-人-Fc的新双特异性抗体形式，当其在哺乳动物宿主细胞中产生时，产生了高度均质和纯的产物。此外，该形式具有用于医学治疗的合适的药代动力学特性，并且开发了针对该产物的合适稳定制剂。不受任何特定理论的束缚，该形式的分子尺寸和降低的流体动力学半径可能高度适合于肿瘤穿透，还避免了肾过滤并通过与FcRn结合确保进行保护以免于降解。
因此，在第一方面中，本发明提供了多特异性抗体，其包含能够结合人PSMA的第一抗原结合区和能够结合人Vγ9Vδ2 T细胞受体的第二抗原结合区。
在另一些方面中，本发明涉及包含本发明抗体的药物组合物，本发明抗体在医学治疗中的用途，以及用于产生本发明抗体的核酸构建体、表达载体，以及包含这样的核酸构建体或表达载体的宿主细胞。
下文描述了本发明的另一些方面和实施方案。
附图简述
图1：抗PSMA VHH JVZ-007的人源化变体的序列比对。LV1044是原始的美洲驼(llama)来源序列；其他序列是人源化变体。
图2：双特异性VHH的半衰期延长形式的示意图。Fc沉默突变由星号表示。经修饰铰链的序列在图旁边显示，以及赋予KiH介导的异二聚化的CH3突变。HC：重链。
图3：测试人源化变体诱导T细胞脱颗粒(degranulation)的效力的T细胞活化测定(脱颗粒)。上图：使用PSMA阳性LNCaP细胞作为靶细胞的双特异性构建体的滴定。下图：在使用PC-3细胞作为靶细胞的脱颗粒测定中使用的单一高(10nM)浓度的双特异性构建体。5C8表示抗Vγ9Vδ2 TCR特异性VHH且5C8var1是其人源化变体。
图4：抗体诱导、Vγ9Vδ2 T细胞介导的对LNCaP细胞的细胞毒性。
图5：在FACS中LV1050-Fc x 5C8var1-Fc与不同细胞/细胞系的结合。上图：与PSMA阳性细胞系LNCaP和与PSMA阴性系PC-3的结合。下图：与Vγ9Vδ2 T细胞的结合。
图6：靶标依赖性、LV1050-Fc x 5C8var1-Fc诱导的Vγ9Vδ2 T细胞的活化(上图)和细胞毒性(下图)。
图7：肿瘤组织和正常前列腺组织上PSMA和CD277的表达水平以及组织中Vγ9Vδ2-T细胞的频率(作为总CD3+群的一部分)。
图8：由Vγ9Vδ2 T细胞和LV1044-5C8(“LAVA化合物”)诱导的对前列腺肿瘤细胞的细胞毒性(24小时测定)。***p＜0.05。未处理的肿瘤细胞(上图)或正常细胞(下图)的数目设置为100％。
图9：用PSMA与LV1050-5C8var1-无-C-标签之间的交联作图的相互作用。数字指示具有SEQ ID NO：30的PSMA构建体中的氨基酸位置，其基于UniProt ID Q04609，但具有不同的信号肽。PSMA构建体中的位置编号与UniProt ID Q04609中的编号对应如下：构建体中的位置＝UniProt ID Q04609中的位置+41。所示的PSMA片段在SEQ ID NO：33至36中示出。
图10：使用扩增的Vγ9Vδ2-T细胞和PSMA阳性肿瘤来源细胞系进行的脱颗粒测定。使用原代、扩增的Vγ9Vδ2-T细胞与不同的PSMA表达细胞系(LNCaP、22Rv1和VCaP细胞)共培养来测量脱颗粒。CD3-Vγ9设门中CD107a阳性(脱颗粒)细胞的百分比绘制为LV1050-Fc x5C8var1-Fc浓度的函数。
图11：使用扩增的Vγ9Vδ2-T细胞和PSMA阳性或PSMA阴性细胞进行的细胞毒性测定。使用原代、扩增的Vγ9Vδ2-T细胞与(A)LNCaP细胞(PSMA阳性细胞)，相对于LNCaP.koPSMA细胞(PSMA阴性细胞)或(B)不同的PSMA表达细胞系(LNCaP、22Rv1和VCaP细胞)共培养来测量细胞毒性。使用CytoTox-GloTM测定，通过确定的胞内蛋白酶在培养基中的活性来确定靶细胞的细胞死亡。
图12：前列腺肿瘤组织或正常(非恶性)组织中内源性存在的Vγ9Vδ2-T细胞的脱颗粒。在具有或不具有50nM LV1050-Fc x 5C8var1-Fc的情况下将前列腺肿瘤(A)和正常(非恶性)前列腺组织(B)细胞悬液与荧光标记的CD107a mAb一起孵育4小时，并通过流式细胞术来确定CD45+/CD3+/Vγ9+/Vδ2+/CD107a+细胞的百分比(表示为CD107a表达(EpCAM-/CD45+/CD3+/Vγ9+/Vδ2+的％))。相对于背景(仅培养基)表达来表示LV1050-Fc x5C8var1-Fc对CD107a表达的诱导。**P＜0.01，配对T检验；ns＝不显著。
图13：自体PMBC中存在的Vγ9Vδ2-T细胞在与患者来源前列腺肿瘤组织或正常(非恶性)前列腺组织共培养时的脱颗粒。在存在自体PBMC的情况下，在具有或不具有50nMLV1050-Fc x 5C8var1-Fc的情况下将前列腺肿瘤(A)和正常(非恶性)前列腺组织(B)细胞悬液与荧光标记的CD107a mAb一起孵育4小时，并通过流式细胞术来确定CD45+/CD3+/Vγ9+/Vδ2+/CD107a+细胞的百分比(表示为CD107a表达(EpCAM-/CD45+/CD3+/Vγ9+/Vδ2+的％))。相对于背景(仅培养基)表达来表示LV1050-Fc x 5C8var1-Fc对CD107a表达的诱导。*P＜0.05，配对T检验；ns＝不显著。
图14：在存在自体PBMC的情况下由LV1050-Fc x 5C8var1-Fc介导的肿瘤细胞裂解。在具有或不具有50nM LV1050-Fc x 5C8var1-Fc的情况下将来自前列腺肿瘤组织(A)或正常(非恶性)前列腺组织(B)的单细胞悬液与自体PBMC以10∶1的E∶T比一起培养，并孵育24小时。使用7-AAD排斥(7-AAD-exclusion)通过流式细胞术确定细胞毒性，并将其表示为相对于“靶细胞加PBMC”的裂解百分比。示出的是平均值和S.E.M(n＝3)，*P＜0.05。
图15：在接种了22Rv1前列腺癌细胞的小鼠中，LV1050-Fc x 5C8var1-Fc与PBMC的组合抑制了肿瘤生长。向NCG小鼠(n＝4至6只/组)皮下注射单独或与来自两个健康供体的PBMC组合的22Rv1前列腺癌细胞。在第0、7、14和21天，IV注射LV1050-Fc x 5C8var1-Fc(0.2或2mg/kg)或PBS。每周两次，使用卡尺测量肿瘤尺寸。当组中的平均肿瘤体积超过2,000mm3时处死小鼠。将肿瘤体积(mm3；平均值+SEM)绘制为22Rv1前列腺癌细胞接种之后天数的函数。统计学分析(ANOVA(方差分析)与Dunnett事后检验)表明，使用来自供体#1的PBMC，以0.2或2mg/kg施用LV1050-Fc x 5C8var1-Fc导致肿瘤生长率的统计学上显著的降低(***P＜0.001)，其中第34天的TGI值分别为91％和78％。使用来自供体#2的PBMC，以2mg/kg施用LV1050-Fc x 5C8var1-Fc导致显著的抗肿瘤作用(*P＜0.01)，其中第41天的TGI值为52％。
图16：在单IV剂之后人FcRn转基因小鼠中LV1050-Fc x 5C8var1-Fc的药代动力学。在人FcRn转基因小鼠(n＝4只/组)中，将LV1050-Fc x 5C8var1-Fc和人源化IgG对照抗体以每组2mg/kg、5mg/kg或10mg/kg静脉内共施用。上图示出了以不同浓度的抗体给药的三组小鼠的LV1050-Fc x 5C8var1-Fc随时间推移的浓度。下图示出了在三个剂量组中获得的LV1050-Fc x 5C8var1-Fc终末半衰期计算值(使用PK Solutions软件分析ELISA数据)。针对与IgG对照抗体共施用的每组计算的LV1050-Fc x 5C8var1-Fc半衰期是相当的，并且对应于139.9±10.2小时(2mg/kg)、160.2±13.4小时(5mg/kg)和171.7±10.6小时(10mg/kg)。
图17：在单IV剂之后NHP中不同剂量的LV1050-Fc x 5C8var1-Fc的药代动力学。在给药前测量LV1050-Fc x 5C8var1-Fc的血浆浓度并随后在施用之后0.5、1、2、4、8、24、72、120、168、336、504和528小时测量。LV1050-Fc x 5C8var1的血浆浓度(Y轴)作为时间的函数给出。
发明详述
定义
术语“人PSMA”在本文中使用时是指人前列腺特异性膜抗原蛋白，也称为谷氨酸羧肽酶2(EC：3.4.17.21)、细胞生长抑制基因27蛋白、叶酸水解酶1、叶酰聚-γ-谷氨酸羧肽酶(Folylpoly-gamma-glutamate carboxypeptidase，FGCP)、谷氨酸羧肽酶II(glutamatecarboxypeptidase II，GCPII)、膜谷氨酸羧肽酶(membrane glutamatecarboxypeptidase，mGCP)、N-乙酰化-α-连接的酸性二肽酶I(NAALAD酶I)或蝶酰聚-γ-谷氨酸羧肽酶(UniProtKB-Q04609(FOLH1_HUMAN))、同种型I，在SEQ ID NO：24中示出。
术语“人Vδ2”在本文中使用时是指TRDV2蛋白、T细胞受体δ变体2(UniProtKB-A0JD36(A0JD36_HUMAN)给出了Vδ2序列的一个实例)。
术语“人Vγ9”在本文中使用时是指TRGV9蛋白、T细胞受体γ变体9(UniProtKB-Q99603_HUMAN给出了Vγ9序列的一个实例)。
术语“抗体”旨在是指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一种的衍生物，其具有在通常的生理条件下以显著时段的半衰期与抗原特异性结合的能力，所述时段例如至少约30分钟、至少约45分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约12小时、约24小时或更多、约48小时或更多，约3、4、5、6、7或更多天等，或任意其他相关的在功能上限定的时期(例如足以诱导、促进、增强、和/或调节与和抗原结合的抗体相关的生理应答的时间和/或足以使抗体募集效应物活性的时间)。与抗原相互作用的抗原结合区(或抗原结合结构域)可包含免疫球蛋白分子的重链和轻链二者的可变区，或者可以是单结构域抗原结合区，例如，仅重链可变区。抗体的恒定区(如果存在的话)可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述因子包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞和T细胞)和补体系统的组分，例如C1q，即补体激活经典途径中的第一组分。然而，在一些实施方案中，抗体的Fc区已被修饰为具有惰性，“惰性”意指这样的Fc区，其至少不能结合任何Fcγ受体，诱导Fc介导的FcR交联，或诱导FcR介导的通过单独抗体的两个Fc区进行的靶抗原的交联。在另一个实施方案中，惰性Fc区另外不能结合C1q。在一个实施方案中，该抗体包含第234位和第235位的突变(Canfield和Morrison(1991)J Exp Med 173：1483)，例如，第234位的Leu至Phe突变和第235位的Leu至Glu突变。在另一个实施方案中，该抗体包含第234位的Leu至Ala突变、第235位的Leu至Ala突变和第329位的Pro至Gly突变。在另一个实施方案中，该抗体包含第234位的Leu至Phe突变、第235位的Leu至Glu突变、和第265位的Asp至Ala突变。
免疫球蛋白的Fc区定义为通常在将抗体用木瓜蛋白酶消化之后产生的抗体片段，其包含免疫球蛋白的两个CH2-CH3区和一个连接区例如铰链区。抗体重链的恒定结构域限定了抗体同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD或IgE。Fc区借助于称为Fc受体的细胞表面受体和补体系统的蛋白质来介导抗体的效应物功能。
本文中使用的术语“铰链区”旨在是指免疫球蛋白重链的铰链区。因此，例如人IgG1抗体的铰链区对应于根据EU编号的氨基酸216至230。
本文中使用的术语“CH2区”或“CH2结构域”旨在是指免疫球蛋白重链的CH2区。因此，例如人IgG1抗体的CH2区对应于根据EU编号的氨基酸231至340。然而，CH2区也可以是本文中所述的任何其他亚型。
本文中使用的术语“CH3区”或“CH3结构域”旨在是指免疫球蛋白重链的CH3区。因此，例如人IgG1抗体的CH3区对应于根据EU编号的氨基酸341至447。然而，CH3区也可以是本文中所述的任何其他亚型。
本发明中对Fc区/Fc结构域中氨基酸位置的提及是根据EU编号(Edelman et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.1969 May；63(1)：78-85；Kabat et al.，Sequences ofproteins of immunological interest.第5版-1991 NIH公布No.91-3242)。
如上所述，除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文中使用的术语抗体包括保留与抗原特异性结合的能力的抗体片段。已经表明抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来进行。涵盖在术语“抗体”之内的结合片段的一些实例包括：(i)Fab’或Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段或如WO2007059782中所述的单价抗体；(ii)F(ab′)2片段，即包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)基本上由VH和CH1结构域组成的Fd片段；和(iv)基本上由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可使用重组方法通过合成接头连接起来，使得它们能够成为单蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链抗体或单链Fv(single chain Fv，scFv)，参见例如Bird et al.，Science 242，423-426(1988)和Huston et al.，PNAS USA 85，5879-5883(1988))。除非上下文另有说明，否则这样的单链抗体涵盖在术语抗体内。尽管这样的片段通常被包括在抗体的含义之内，但是它们共同且各自独立地是本发明的独特特征，表现出不同的生物学特性和效用。除非另有指明，否则术语抗体还包括多克隆抗体、单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)、嵌合抗体和人源化抗体，以及通过任何已知技术(例如酶切割、肽合成和重组技术)提供的抗体片段。
在本发明抗体的一些实施方案中，第一抗原结合区或抗原结合区或二者均是单结构域抗体。单结构域抗体(single domain antibody，sdAb，也称为
或VHH)对于技术人员是公知的，参见例如Hamers-Casterman et al.(1993)Nature 363：446，Roovers et al.(2007)Curr Opin Mol Ther 9：327和Krah et al.(2016)Immunopharmacol Immunotoxicol 38：21。单结构域抗体包含单CDR1、单CDR2和单CDR3。单结构域抗体的一些实例是仅重链抗体(即天然不包含轻链的抗体)的可变片段、来源于常规抗体的单结构域抗体和经改造抗体。单结构域抗体可来源于任意物种，包括小鼠、人、骆驼、美洲驼、鲨鱼、山羊、兔和牛。例如，天然存在的VHH分子可来源于骆驼科(Camelidae)物种中(例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼(alpaca)和原驼(guanaco)中)产生的抗体。像完整抗体一样，单结构域抗体也能够与特定抗原选择性地结合。单结构域抗体可仅包含免疫球蛋白链的可变结构域，即CDR1、CDR2和CDR3和框架区。
本文中使用的术语“免疫球蛋白”旨在是指结构上相关的糖蛋白类别，其由两对多肽链、一对轻(L)链和一对重(H)链组成，所有四对链均可能通过二硫键相互连接。本文中使用的术语“免疫球蛋白重链”、“免疫球蛋白的重链”或“重链”旨在是指免疫球蛋白的链之一。重链通常由重链可变区(本文中缩写为VH)和限定免疫球蛋白同种型的重链恒定区(本文中缩写为CH)构成。重链恒定区通常由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。重链恒定区还包含铰链区。在免疫球蛋白(例如IgG)的结构内，两条重链通过铰链区中的二硫键相互连接。与重链一样，每条轻链通常由数个区构成；轻链可变区(variable region，VL)和轻链恒定区(constant region，CL)。此外，VH和VL区可细分为高变的区(或高变区，其可以是序列高变的和/或形成结构上限定的环)，也称为互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)，散布有更保守的区，称为框架区(framework region，FR)。每个VH和VL通常由从氨基端至羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。CDR序列可通过使用多种方法来确定，所述方法例如由Choitia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901或Kabat et al.(1991)Sequence of protein of immunologicalinterest，第五版.NIH出版物中提供的方法。用于CDR确定和氨基酸编号的多种方法可在www.abysis.org(UCL)上进行比较。
本文中使用的术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白(亚)类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)或其任意同种异型，例如IgG1m(za)和IgG1m(f)。每个重链同种型均可与kappa(κ)或lambda(λ)轻链组合。本发明的抗体可具有任何同种型。
术语“亲本抗体”应理解为与根据本发明的抗体相同的抗体，但其中亲本抗体不具有一个或更多个特定突变。本发明的“变体”或“抗体变体”或“亲本抗体的变体”是与“亲本抗体”相比包含一个或更多个突变的抗体分子。氨基酸替换可将天然氨基酸更换为另一天然存在的氨基酸，或更换为非天然存在的氨基酸衍生物。氨基酸替换可以是保守的或非保守的。在本发明的上下文中，保守替换可由以下三个表中的一个或更多个中反映的氨基酸类别内的替换来限定：
用于保守替换的氨基酸残基类别
替代的保守氨基酸残基替换类别
| 1 | A | S | T |
| 2 | D | E | |
| 3 | N | Q | |
| 4 | R | K | |
| 5 | I | L | M |
| 6 | F | Y | W |
氨基酸残基的替代物理和功能分类
在本发明的上下文中，变体中的替换表示为：
原始氨基酸-位置-替换氨基酸；
使用三字母代码或单字母代码，包括代码Xaa和X来表示氨基酸残基。因此，符号“T366W”意指变体在与亲本抗体中第366位氨基酸相对应的变体氨基酸位置处包含色氨酸对苏氨酸的替换。
此外，术语“替换”涵盖替换成其他十九种天然氨基酸中的任一种，或替换成其他氨基酸，例如非天然氨基酸。例如，第366位中氨基酸T的替换包括以下替换中的每一者：366A，366C，366D，366G，366H，366F，366I，366K，366L，366M，366N，366P，366Q，366R，366S，366E，366V，366W和366Y。
术语“全长抗体”在本文中使用时是指包含对应于通常存在于该同种型的野生型抗体中的那些的所有重链和轻链恒定结构域和可变结构域的抗体。
术语“嵌合抗体”是指其中可变区来源于非人物种(例如，来源于啮齿动物)并且恒定区来源于不同物种(例如人)的抗体。嵌合抗体可通过遗传改造来产生。开发用于治疗应用的嵌合单克隆抗体以降低抗体的免疫原性。
术语“人源化抗体”是指经遗传改造的非人抗体，其包含人抗体恒定结构域和被修饰以包含与人可变结构域的高水平序列同源性的非人可变结构域。这可通过将一起形成抗原结合位点的六个非人抗体互补决定区(CDR)移植到同源人接纳体框架区(FR)上来实现。为了完全重建亲本抗体的结合亲和力和特异性，可需要将来自亲本抗体(即非人抗体)的框架残基替换为人框架区(回复突变)。结构同源性建模可帮助鉴定框架区中对于抗体的结合特性重要的氨基酸残基。因此，人源化抗体可包含非人CDR序列、任选地包含针对非人氨基酸序列的一个或更多个氨基酸回复突变的主要人框架区，以及任选地完全人恒定区。任选地，可引入不一定是回复突变的另外的氨基酸修饰以获得具有优选特征例如亲和力和生物化学特性的人源化抗体。进行非人治疗性抗体的人源化以使其在人中的免疫原性最小化，而同时这样的人源化抗体维持非人来源抗体的特异性和结合亲和力。
术语“多特异性抗体”是指对至少两种不同的(例如至少三种)通常不重叠的表位具有特异性的抗体。这样的表位可以在同一或不同的靶抗原上。如果表位在不同的靶标上，则这样的靶标可以在同一细胞或者不同的细胞或细胞类型上。
术语“双特异性抗体”是指对两种不同的通常不重叠的表位具有特异性的抗体。这样的表位可以在同一或不同的靶标上。如果表位在不同的靶标上，则这样的靶标可以在同一细胞或者不同的细胞或细胞类型上。
不同类别的双特异性抗体的一些实例包括但不限于(i)具有互补CH3结构域以迫使异二聚化的IgG样分子；(ii)重组IgG样双靶向分子，其中所述分子的两侧各自包含至少两种不同抗体的Fab片段或Fab片段的一部分；(iii)IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的一部分融合；(iv)Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双抗体与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；(v)Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起，与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；以及(vi)基于ScFv和双抗体的抗体和重链抗体(例如，结构域抗体，
)，其中不同的单链Fv分子或不同的双抗体或不同的重链抗体(例如，结构域抗体，
)彼此融合或者与和重链恒定结构域、Fc区或其部分融合的另一种蛋白质或载体分子融合。
具有互补CH3结构域分子的IgG样分子的一些实例包括但不限于
(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、结进孔(Knobs-into-Holes)(Genentech)、CrossMAbs(Roche)和静电匹配(electrostatically-matched)(Amgen，Chugai，Oncomed)、LUZ-Y(Genentech，Wranik et al.J.Biol.Chem.2012，287(52)：43331-9，doi：10.1074/jbc.M112.397869.Epub 2012Nov 1)、DIG体和PIG体(Pharmabcine，WO2010134666，WO2014081202)、链交换工程化结构域体(Strand Exchange Engineered Domain body，SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonics(Merus，WO2013157953)、FcΔAdp(Regeneron)、双特异性IgG1和IgG2(Pfizer/Rinat)、Azymetric支架(Zymeworks/Merck，)、mAb-Fv(Xencor)、二价双特异性抗体(Roche，WO2009080254)和
分子(Genmab)。
重组IgG样双靶向分子的一些实例包括但不限于双靶向(DT)-Ig(GSK/Domantis，WO2009058383)、二合一型抗体(Two-in-one Antibody)(Genentech，Bostrom，et al2009.Science 323，1610-1614)、交联Mab(Cross-linked Mabs)(Karmanos CancerCenter)、mAb2(F-Star)、ZybodiesTM(Zyngenia，LaFleur et al.MAbs.2013 Mar-Apr；5(2)：208-18)、使用共同轻链的方法，κλBodies(NovImmune，WO2012023053)和CovX-
(CovX/Pfizer，Doppalapudi，V.R.，et al 2007.Bioorg.Med.Chem.Lett.17，501-506)。
IgG融合分子的一些实例包括但不限于双可变结构域(DVD)-Ig(Abbott)、双结构域双头抗体(Dual domain double head antibodies)(Unilever；Sanofi Aventis)、IgG样双特异性(IgG-like Bispecific)(ImClone/Eli Lilly，Lewis et al.NatBiotechnol.2014 Feb；32(2)：191-8)、Ts2Ab(MedImmune/AZ，Dimasi et al.J MolBiol.2009 Oct 30；393(3)：672-92)和BsAb(Zymogenetics，WO2010111625)、HERCULES(Biogen Idec)、scFv融合体(Novartis)、scFv融合体(Changzhou Adam Biotech Inc)和TvAb(Roche)。
Fc融合分子的一些实例包括但不限于ScFv/Fc融合体(Academic Institution，Pearce et al Biochem Mol Biol Int.1997 Sep；42(6)：1179)、SCORPION(EmergentBioSolutions/Trubion，Blankenship JW，et al.AACR 100th Annual meeting 2009(摘要#5465)；Zymogenetics/BMS，WO2010111625)、双亲和再靶向技术(Dual AffinityRetargeting Technology)(Fc-DARTTM)(MacroGenics)和双(ScFv)2-Fab(国家抗体医学研究中心——中国(National Research Center for Antibody Medicine-China))。
Fab融合双特异性抗体的一些实例包括但不限于F(ab)2(Medarex/AMGEN)、Dual-Action或Bis-Fab(Genentech)、Dock-and-
(DNL)(ImmunoMedics)、二价双特异性(Bivalent Bispecific)(Biotecnol)和Fab-Fv(UCB-Celltech)。
基于ScFv、双抗体的抗体和结构域抗体的一些实例包括但不限于双特异性T细胞接合剂(Bispecific T Cell Engager)
(Micromet，Tandem Diabody(Tandab)(Affimed)、双亲和再靶向技术(DARTTM)(MacroGenics)、单链双抗体(Single-chainDiabody)(Academic，Lawrence FEBS Lett.1998 Apr 3；425(3)：479-84)、TCR样抗体(TCR-like Antibodies)(AIT，ReceptorLogics)、人血清白蛋白ScFv融合体(Human SerumAlbumin ScFv Fusion)(Merrimack，WO2010059315)和COMBODY分子(Epigen Biotech，Zhuet al.Immunol Cell Biol.2010 Aug；88(6)：667-75)、dual targeting
(Ablynx，Hmila et al.，FASEB J.2010)、双靶向仅重链结构域抗体。
在抗体与抗原结合的背景下，术语“结合”或“特异性结合”是指抗体与预定抗原或靶标(例如人PSMA或Vδ2)的结合，例如当使用流式细胞术如本文中实施例中所述确定时，该结合通常具有对应于以下KD的亲和力：约10-6M或更小，例如10-7M或更小，例如约10-8M或更小，例如约10-9M或更小，约10-10M或更小，或约10-11M或甚至更小。或者，可使用例如表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)技术在BIAcore T200仪器中使用抗原作为配体以及结合部分或结合分子作为分析物来确定表观KD值。特异性结合意指抗体以对应于以下KD的亲和力与预定抗原结合：比其与除预定抗原或紧密相关抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的亲和力低至少十倍，例如低至少100倍，例如低至少1,000倍，例如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍。亲和力较低的程度取决于结合部分或结合分子的KD，使得当结合部分或结合分子的KD非常低(即，结合部分或结合分子是高度特异性的)时，则针对抗原的亲和力比针对非特异性抗原的亲和力低的程度可以是至少10,000倍。本文中使用的术语“KD”(M)是指抗原与结合部分或结合分子之间的特定相互作用的解离平衡常数。
在本发明上下文中，“竞争”或“能够竞争”或其变化形式是指在存在结合结合配偶体的另一分子(例如，不同的PSMA抗体)的情况下，特定结合分子(例如PSMA抗体)结合特定结合配偶体(例如PSMA)的倾向性的任何可检测的显著降低。通常来说，竞争意味着由另一分子(例如抗体)的存在导致的结合的至少约25％降低，例如至少约50％、例如至少约75％、例如至少90％降低，如通过例如ELISA分析或流式细胞术使用足量的两种或更多种竞争分子(例如抗体)来确定的。用于通过竞争性抑制来确定结合特异性的另外的方法可见于例如Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988)，Colligan et al.，eds.，Current Protocols inImmunology，Greene Publishing Assoc，and Wiley InterScience N.Y.，(1992，1993)，和Muller，Meth.Enzymol.92，589-601(1983))。在一个实施方案中，本发明的抗体与抗体LV1050结合PSMA上相同的表位和/或与抗体5C8或6H4结合Vδ2上相同的表位。用于确定结合分子(例如抗体)的表位的方法是本领域已知的。
术语“第一”和“第二”抗原结合区在本文中使用时不是指其在抗体中的方向/位置，即其相对于N或C端没有意义。术语“第一”和“第二”仅用于正确和一致地指代权利要求书和说明书中的两个不同的抗原结合区。
“能够结合Vγ9Vδ2-TCR”意指结合分子可结合Vγ9Vδ2-TCR，但不排除在不存在另一亚基的情况下结合分子与一个分开的亚基结合，即与单独的Vγ9链结合或与单独的Vδ2链结合。例如，抗体5C8是结合Vγ9Vδ2-TCR的抗体，但当Vδ2链单独表达时也结合Vδ2链。该术语也不排除抗体对两条链的组合具有特异性。
“序列同一性(％)”在本文中使用时是指不同序列共有的相同核苷酸或氨基酸位置的数目(即，％同一性＝相同位置的#/总的位置的#×100)，将为了获得最佳比对而需要引入的空位数目以及每个空位的长度考虑在内。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性可例如使用已并入到ALIGN程序(版本2.0)中的E.Meyers和W.Miller，Comput.Appl.Biosci 4，11-17(1988)的算法，使用PAM120加权残基表(weight residuetable)、为12的空位长度罚分以及为4的空位罚分来确定。
本发明的另一些方面和实施方案
如上所述，在第一主要方面中，本发明涉及包含能够结合人PSMA的第一抗原结合区和能够结合人Vγ9Vδ2 T细胞受体的第二抗原结合区的多特异性抗体。
在一个实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性抗体。在另一个实施方案中，第一抗原结合区是单结构域抗体。在另一个实施方案中，第二抗原结合区是单结构域抗体。在另一个实施方案中，第一抗原-抗原结合区和第二抗原结合区二者均是单结构域抗体。在另一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，其中第一抗原结合区是单结构域抗体并且第二抗原结合区是单结构域抗体。
在一个实施方案中，多特异性抗体与具有SEQ ID NO：2中所示序列的抗体竞争(即能够竞争)与人PSMA结合，优选地，多特异性抗体与具有SEQ ID NO：2中所示序列的抗体结合人PSMA上相同的表位。在一个实施方案中，多特异性抗体与人PSMA上包含以下氨基酸残基中的一个或更多个或全部的表位结合：R190、S197、R204、S317、R320、S322、K324、H618、S631、K729、R730和Y733，其中编号是根据UniProt序列Q04609-1。在另一个实施方案中，第一抗原结合区包含SEQ ID NO：14中所示VH CDR1序列、SEQ ID NO：15中所示VH CDR2序列和SEQ ID NO：16中所示VH CDR3序列。
在另一个实施方案中，第一抗原结合区是人源化的，其中优选地第一抗原结合区包含以下或由以下组成：
·SEQ ID NO：2中所示序列，或
·与SEQ ID NO：2中所示序列具有至少90％，例如至少92％，例如至少94％，例如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。
如上所述，本发明的多特异性抗体包含能够结合人Vγ9Vδ2-T细胞受体的第二抗原结合区。在一个实施方案中，多特异性抗体能够使人Vγ9Vδ2 T细胞活化。Vγ9Vδ2 T细胞的活化可通过基因表达和/或(表面)标志物表达(例如活化标志物，例如CD25、CD69或CD107a)和/或分泌蛋白(例如，细胞因子或趋化因子)谱来测量。在一个优选实施方案中，多特异性抗体能够诱导Vγ9Vδ2 T细胞的活化(例如CD69和/或CD25表达的上调)导致以CD107a表达提高为标志的脱颗粒(参见实施例5)和/或细胞因子产生(例如TNFα、IFNγ)。优选地，当如本文实施例5中所述进行测试时，本发明的多特异性抗体能够将对CD107a呈阳性的细胞的数目提高至少2倍，例如至少5倍。在另一个优选实施方案中，当使用Vγ9Vδ2 T细胞和LNCaP靶细胞如本文实施例5中所述进行测试时，本发明的多特异性抗体具有用于提高CD107a阳性细胞的百分比的EC50值，其为50pM或更小，例如25pM或更小，例如20pM或更小，例如15pM或更小，例如10pM或更小，或甚至5pM或更小，例如2pM或更小或者1pM或更小。
在本发明的多特异性抗体的一个实施方案中，多特异性抗体能够与人Vδ2结合。Vδ2是Vγ9Vδ2-TCR的δ链的一部分。能够与人Vδ2结合的抗体可结合完全位于Vδ2区内的表位，或者可结合作为δ链中的恒定区和Vδ2区中的残基之组合的表位。在另一个实施方案中，多特异性抗体能够与人Vγ9结合。Vγ9是Vγ9Vδ2-TCR的γ链的一部分。能够与人Vγ9结合的抗体可结合完全位于Vγ9区内的表位或者可结合作为γ链的恒定区和Vγ9区中的残基之组合的表位。与Vδ2或Vγ9结合的数个这样的抗体描述于WO2015156673中，并且它们的抗原结合区至少其CDR序列可并入在本发明的多特异性抗体中。可从中获得Vγ9Vδ2-TCR结合区的抗体的另一些实例是TCRVγ9抗体7A5(ThermoFisher)(Oberg et al.(2014)Cancer Res74：1349)和抗体B1.1(ThermoFisher)和5A6.E9(ATCC HB 9772)，二者均描述于Neuman etal.(2016)J Med Prim 45：139中。
在一个实施方案中，多特异性抗体与具有SEQ ID NO：5中所示序列的抗体竞争与人Vδ2结合或与具有SEQ ID NO：20中所示序列的抗体竞争与人Vδ2结合。在另一个实施方案中，多特异性抗体与具有SEQ ID NO：5中所示序列的抗体结合人Vδ2上相同的表位或与具有SEQ ID NO：20中所示序列的抗体结合人Vδ2上相同的表位。
在本发明的多特异性抗体的一个实施方案中，第二抗原结合区包含SEQ ID NO：17中所示VH CDR1序列、SEQ ID NO：18中所示VH CDR2序列和SEQ ID NO：19中所示VH CDR3序列，或者包含SEQ ID NO：21中所示VH CDR1序列、SEQ ID NO：22中所示VH CDR2序列和SEQID NO：23中所示VH CDR3序列。
在本发明多特异性抗体的一个实施方案中，第二抗原结合区是人源化的。
在另一个实施方案中，第二抗原结合区包含以下或由以下组成：
·SEQ ID NO：5中所示序列，或者
·与SEQ ID NO：5中所示序列具有至少90％，例如至少92％，例如至少94％，例如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。
在本发明多特异性抗体的一个实施方案中，第一抗原结合区包含SEQ ID NO：14中所示VH CDR1序列、SEQ ID NO：15中所示VH CDR2序列和SEQ ID NO：16中所示VH CDR3序列，并且其中第二抗原结合区包含SEQ ID NO：17中所示VHCDR1序列、SEQ ID NO：18中所示VHCDR2序列和SEQ ID NO：19中所示VH CDR3序列。
在本发明多特异性抗体的另一个实施方案中，第一抗原结合区包含SEQ ID NO：14中所示VH CDR1序列、SEQ ID NO：15中所示VH CDR2序列和SEQ ID NO：16中所示VH CDR3序列，并且其中第二抗原结合区包含SEQ ID NO：21中所示VH CDR1序列、SEQ ID NO：22中所示VH CDR2序列和SEQ ID NO：23中所示VH CDR3序列。
在一个实施方案中，本发明的多特异性抗体能够通过使Vγ9Vδ2 T细胞活化来介导对PSMA表达细胞例如LNCaP细胞、22Rv1细胞或VCaP细胞的杀伤。优选地，当如本文实施例6中所述进行测试时，该抗体能够通过使Vγ9Vδ2 T细胞活化以EC50值为50pM或更小，例如25pM或更小，例如20pM或更小，例如15pM或更小，例如10pM或更小，或甚至5pM或更小，例如2pM或更小或者1pM或更小来诱导对LNCaP细胞的杀伤。
在另一个实施方案中，当如本文实施例13中所述在24小时之后进行测试时，该抗体能够通过使Vγ9Vδ2 T细胞活化以EC50值为50pM或更小，例如25pM或更小，例如20pM或更小，例如15pM或更小来诱导对LNCaP、22Rv1或VCaP细胞的杀伤，优选在效应物与靶细胞的比率为1∶1和1∶10这两种情况下。
在另一个实施方案中，当如本文实施例7中所述进行测试时，本发明的多特异性抗体能够以EC50为50nM或更小，例如20nM或更小，例如10nM或更小与PSMA阳性前列腺癌细胞系LNCaP结合。在另一个实施方案中，当如本文实施例7中所述进行测试时，本发明的多特异性抗体能够以EC50为10nM或更小，例如5nM或更小，例如2nM或更小与Vγ9Vδ2 T细胞结合。在另一个实施方案中，当如本文实施例11中所述进行测试时，本发明的多特异性抗体能够以KD值为100nM或更小，例如50nM或更小与重组人PSMA蛋白结合。在另一个实施方案中，当如本文实施例11中所述进行测试时，本发明的多特异性抗体能够以KD值为10nM或更小，例如5nM或更小，例如2nM或更小，例如1nM或更小与人Vγ9Vδ2-Fc结合。
在另一个实施方案中，多特异性抗体能够介导对来自前列腺癌患者的人PSMA表达细胞的杀伤。对来自前列腺癌患者的人PSMA表达细胞的杀伤可例如如本文实施例10中所述来确定。在一个实施方案中，如在本文实施例10或实施例14中所述的测定中所确定的，本发明的多特异性抗体能够在50nM的浓度下介导超过25％，例如超过50％的特定细胞死亡。
在另一个实施方案中，多特异性抗体不能介导对PSMA阴性细胞例如PSMA阴性人细胞的杀伤。在另一个实施方案中，当如本文实施例16中所述进行测试时，多特异性抗体在多至280nM的浓度下在来自健康供体的全血中不诱导IL-2、IL-4、IL-6、IL-10或TNFα。在另一个实施方案中，当如本文实施例16中所述进行测试时，多特异性抗体在来自健康供体的全血中诱导是
的超过10倍少的IL-8和/或超过50倍少的IFNγ。
在一个实施方案中，第一抗原结合区和第二抗原结合区通过肽接头例如长度为1至20个氨基酸，例如1至10个氨基酸，例如2、3、4、5、6、7、8或10个氨基酸的接头彼此共价连接。在一个实施方案中，肽接头包含序列GGGGS或由其组成，如SEQ ID NO：6中所示。
在一些实施方案中，能够结合人PSMA的第一抗原结合区位于能够结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的第二抗原结合区的N端。
在本发明的一个实施方案中，多特异性抗体还包含半衰期延长结构域。在一个实施方案中，多特异性抗体在施用于人对象时具有长于约168小时的终末半衰期。最优选地，终末半衰期为336小时或更长。抗体的“终末半衰期”在本文中使用时是指在消除的最后阶段体内多肽的血清浓度降低50％所花费的时间。
在一个实施方案中，多特异性抗体包含Fc区。本领域中已经描述了用于制备双特异性抗体的多种方法，例如Brinkrnann and Kontermann(2017)MAbs 9：182的综述。在本发明的一个实施方案中，Fc区是包含两个Fc多肽的异二聚体，其中第一抗原结合区与第一Fc多肽融合并且第二抗原结合区与第二Fc多肽融合，并且其中第一Fc多肽和第二Fc多肽包含与形成同二聚体相比有利于形成异二聚体的非对称氨基酸突变(参见例如Ridgway et al.(1996)′Knobs-into-holes′engineering of antibody CH3 domains for heavy chainheterodimerization.Protein Eng 9：617)。在其另一个实施方案中，Fc多肽的CH3区包含所述非对称氨基酸突变，优选地，第一Fc多肽包含T366W替换并且第二Fc多肽包含T366S、L368A和Y407V替换，或反之亦然，其中氨基酸位置对应于根据EU编号系统的人IgG1。在另一个实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽中第220位的半胱氨酸残基已被缺失或替换，其中氨基酸位置对应于根据EU编号系统的人IgG1。在另一个实施方案中，该区包含SEQ ID NO：10中所示序列。
在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含使抗体具有惰性即不能介导效应物功能的突变。在一个实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽包含第234位和/或第235位的突变，优选地第一Fc多肽和第二Fc多肽包含L234F和L235E替换，其中氨基酸位置对应于根据EU编号系统的人IgG1。
在一个优选实施方案中，第一抗原结合区包含SEQ ID NO：2中所示序列，第二抗原结合区包含SEQ ID NO：5中所示序列，并且
-第一Fc多肽包含SEQ ID NO：12中所示序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO：13中所示序列，或者
-第一Fc多肽包含SEQ ID NO：12中所示序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO：13中所示序列。
在另一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26中所示序列或由其组成。
在另一个主要方面中，本发明涉及包含如本文中所述根据本发明的多特异性抗体以及可药用赋形剂的药物组合物。
抗体可根据常规技术，例如(Rowe et al.，Handbook of PharmaceuticalExcipients，2012 June，ISBN 9780857110275)中公开的那些用可药用赋形剂来配制。可药用赋形剂以及任何其他的载体、稀释剂或辅料应适合于抗体和所选择的施用方式。对药物组合物的赋形剂和其他组分的适合性基于对本发明的所选择的抗体或药物组合物的所期望生物学特性没有显著的负面影响(例如，小于对抗原结合的显著性影响(10％或更低的相对抑制，5％或更低的相对抑制等))来确定。
药物组合物可包含稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、洗涤剂(例如非离子洗涤剂，例如吐温20或吐温80)、稳定剂(例如糖或不含蛋白质的氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或适合于包含在药物组合物中的其他材料。另一些可药用赋形剂包括与本发明的抗体在生理上相容的任意和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等张剂、抗氧化剂和吸收延迟剂等。
在一个实施方案中，药物组合物包含本发明的多特异性抗体(优选包含Fc区的抗体)、缓冲剂和抗氧化剂，其中组合物的pH为5.4至7.4，例如5.4至6.1。
在另一个实施方案中，药物组合物包含本发明的多特异性抗体、缓冲剂和甲硫氨酸，其中组合物的pH为5.4至7.4，例如5.4至6.1。
在另一个实施方案中，药物组合物包含本发明的多特异性抗体、缓冲剂、蔗糖、聚山梨醇酯80和甲硫氨酸，其中组合物的pH为5.4至7.4，例如5.4至6.1。
在另一个实施方案中，药物组合物包含本发明的多特异性抗体、组氨酸或乙酸钠缓冲液、蔗糖、聚山梨醇酯80和甲硫氨酸，其中组合物的pH为5.4至7.4，例如5.4至6.1。
优选地，缓冲液浓度为5至25mM，例如10mM。优选地，蔗糖浓度为100至500mM，例如250mM至300mM，例如280mM。优选地，聚山梨醇酯80浓度为0.005％至0.1％，例如0.01％至0.05％，例如0.02％。优选地，甲硫氨酸浓度为0.2mM至5mM，例如0.5mM至2mM，例如1mM。优选地，组合物中的多特异性抗体包含Fc区。
因此，在一个优选实施方案中，药物组合物包含含有Fc区的本发明的多特异性抗体、组氨酸或乙酸钠缓冲液、蔗糖、聚山梨醇酯80和甲硫氨酸，其中组合物的pH为5.4至7.4，例如5.4至6.1。
因此，在另一个优选实施方案中，药物组合物包含含有Fc区的本发明的多特异性抗体、10M组氨酸或乙酸钠缓冲液、280mM蔗糖、0.02％聚山梨醇酯80和1mM甲硫氨酸，其中组合物的pH为5.5或6.0。
优选地，例如Fc区是包含两个Fc多肽的异二聚体，其中第一抗原结合区与第一Fc多肽融合并且第二抗原结合区与第二Fc多肽融合，并且其中第一Fc多肽和第二Fc多肽包含与形成同二聚体相比有利于形成异二聚体的非对称氨基酸突变。优选地，Fc多肽的CH3区包含所述非对称氨基酸突变，其中优选地第一Fc多肽包含T366W替换并且第二Fc多肽包含T366S、L368A和Y407V替换，或反之亦然。此外，优选地，第一Fc多肽和第二Fc多肽中第220位的半胱氨酸残基已被缺失或替换和/或者第一Fc多肽和第二Fc多肽还包含第234位和/或第235位的突变，其中优选地第一Fc多肽和第二Fc多肽包含L234F和L235E替换。
此外，优选地，组合物中的多特异性抗体包含含有SEQ ID NO：2中所示序列的第一抗原结合区，含有SEQ ID NO：5中所示序列的第二抗原结合区，并且
·第一Fc多肽包含SEQ ID NO：12中所示序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO：13中所示序列，或者
·第一Fc多肽包含SEQ ID NO：12中所示序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO：13中所示序列，并且药物组合物包含10M组氨酸或乙酸钠缓冲液、280mM蔗糖、0.02％聚山梨醇酯80和1mM甲硫氨酸，其中组合物的pH为5.5或6.0。优选地，抗体浓度为0.1mg/ml至20mg/ml，例如为0.1至10mg/ml，例如0.5mg/ml至2mg/ml，例如1mg/ml。
在另一个主要方面中，本发明涉及如本文中所述根据本发明的多特异性抗体，其用作药物。
根据本发明的多特异性抗体能够产生有益于通过Vγ9Vδ2 T细胞杀伤肿瘤细胞，特别是PSMA阳性肿瘤细胞的微环境。
因此，在一个优选实施方案中，多特异性抗体用于治疗癌症。在另一个优选实施方案中，多特异性抗体用于治疗前列腺癌，例如转移性或非转移性前列腺癌。在另一个实施方案中，多特异性抗体用于治疗其中PSMA在原发性或转移性肿瘤的肿瘤新血管系统或肿瘤相关内皮细胞上表达的癌症，所述原发性或转移性肿瘤包括结直肠癌、肺癌、乳腺癌、子宫内膜和卵巢癌、胃癌、肾细胞癌、尿路上皮癌、肝细胞癌、口腔鳞癌、甲状腺肿瘤和胶质母细胞瘤。在另一个实施方案中，多特异性抗体用于治疗头颈部腺样囊性癌(adenoid cysticcarcinoma of the head and neck)。
类似地，本发明涉及治疗疾病的方法，其包括将如本文中所述根据本发明的多特异性抗体施用于由此需要的人对象。在一个实施方案中，所述疾病是癌症，例如前列腺癌，例如转移性或非转移性前列腺癌。
在一些实施方案中，抗体作为单一治疗施用。然而，本发明的抗体也可以以组合治疗，即与和待治疗的疾病或病症相关的其他治疗剂组合施用。
“治疗”及其变化形式是指以减轻、改善、阻止、根除(治愈)或预防症状或疾病状态为目的施用有效量的根据本发明的抗体。“有效量”是指在必要的剂量下和时间段内有效实现期望的治疗结果的量。多肽(例如抗体)的有效量可根据因素，例如个体的疾病阶段、年龄、性别和体重以及抗体在个体中引发期望应答的能力而变化。有效量也是其中治疗有益作用超过了抗体的任何毒性或有害作用的量。本发明抗体的有效量的示例性非限制性范围为约0.1μg/kg至100mg/kg，例如约1μg/kg至50mg/kg，例如约0.01至20mg/kg，例如约0.1至10mg/kg，例如约0.5、约0.3、约1、约3、约5或约8mg/kg。施用可通过任意合适的途径进行，但是通常是肠胃外的，例如静脉内、肌内或皮下。
本发明的多特异性抗体通常重组产生，即通过在合适的宿主细胞中表达编码该抗体的核酸构建体，随后从细胞培养物中纯化所产生的重组抗体。核酸构建体可通过本领域公知的标准分子生物学技术产生。通常使用表达载体将构建体引入到宿主细胞中。合适的核酸构建体和表达载体是本领域已知的。适合于抗体重组表达的宿主细胞是本领域公知的，并且包括CHO、HEK-293、Expi293F、PER-C6、NS/0和Sp2/0细胞。
因此，在另一个方面中，本发明涉及编码根据本发明的多特异性抗体的核酸构建体。在一个实施方案中，构建体是DNA构建体。在另一个实施方案中，构建体是RNA构建体。
在另一个方面中，本发明涉及包含编码根据本发明的多特异性抗体的核酸构建体的表达载体。
在另一个方面中，本发明涉及宿主细胞，即重组宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞，优选CHO细胞，其包含一种或更多种编码根据本发明的多特异性抗体的核酸构建体，或者含有编码根据本发明的多特异性抗体的核酸构建体的表达载体。
因此，在另一个方面中，本发明涉及产生本发明的多特异性抗体，优选包含Fc区的本发明的多特异性抗体，其通过在合适的宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞，例如CHO细胞)中(共)表达一种或更多种编码多特异性抗体的核酸构建体，随后从细胞培养物或除去细胞之后的上清液纯化所产生的重组抗体。
表1：序列表。
实施例
实施例1：PBMC分离和人供体来源Vγ9Vδ2-T细胞培养物的产生
从健康的供体志愿者收集全血。或者，从血液供应服务机构Sanquin(bloodsupply service Sanquin)获得血沉棕黄层并将其用于分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。使用LymphoprepTM密度梯度离心分离PBMC。然后使用与山羊抗小鼠IgG微珠组合的FITC标记的抗TCR Vδ2小鼠单克隆抗体(Mab)，通过磁激活细胞分选(magnetic-activated cell sorting，MACS)从健康供体PBMC中分离Vγ9Vδ2-T细胞。每7天用由以下组成的饲养细胞混合物(feeder cell mix)刺激纯化的Vγ9Vδ2-T细胞：重悬于补充有10IU/mL IL-7、10ng/mL IL-15和50ng/ml PHA的Roswell ParkMemorial Institute(RPMI)培养基中的来自两个健康供体的经辐照PBMC和EB病毒(Epstein Barr Virus)转化的B细胞系(JY)。在用于实验之前总是对扩增的Vγ9Vδ2-T细胞培养物进行纯度测试，并且总是发现＞95％的Vγ9和Vδ2双阳性。
实施例2：抗PSMA VH H JVZ-007和抗Vγ9Vδ2 VHH 5C8的人源化
将骆驼科来源的抗PSMA VHH JVZ-007的氨基酸序列(LV1044；SEQ ID NO：1)(JNucl Med.2015 Jul；56(7)：1094-9，补充数据)与人V基因数据库进行比对，并且发现最接近的人种系匹配是IGHV3-74*01。基于人与美洲驼来源序列之间框架区的序列差异，设计了两种人源化变体(SEQ ID NO：2至3)，参见图1中的比对。
然后将JVZ-007和这两种突变体与抗Vγ9Vδ2 VHH 5C8(WO2015156673中所述的Vδ2结合抗体)(SEQ ID NO：4)或5C8var1(5C8的人源化变体)(SEQ ID NO：5)以以下双特异性VHH形式组合：抗PSMA VHH-接头-抗Vγ9Vδ2 VHH。接头序列为GGGGS(SEQ ID NO：6)。为了纯化和检测目的，在一些构建体中添加了C端C标签(EPEA序列)，其前面是三个丙氨酸残基。所得构建体的序列在SEQ ID NO：7至9中示出。
实施例3：双特异性VHH形式的半衰期延长形式的设计
基于含Fc的形式，设计了双特异性VHH形式的半衰期延长形式。将VHH序列与以下经略微修饰的人IgG1铰链区偶联：氨基酸残基216至230(EU编号)，其改变为AAASDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：10)。这省略了通常与另一条重链桥接的半胱氨酸，并用三个丙氨酸替代了铰链序列上的“EPK”。将该经修饰铰链与IgG1(G1m17，G1m(z)同种异型序列)-CH2和-CH3序列(SEQ ID NO：11)偶联。对CH2序列进行修饰以包含Fc沉默突变(L234F，L235E)，并对CH3序列进行修饰以包含一个“结”突变(T366W)(SEQ ID NO：12)或产生“孔”的三个突变(T366S、L368A和Y407V)(SEQ ID NO：13)。这种“结进孔”(Knob-into-Hole，KiH)技术诱导两条链的优先异二聚化。图2中示意性地示出了所得构建体。
实施例4：双特异性VHH分子和含Fc的构建体的克隆、表达和纯化
将双特异性VHH分子的氨基酸序列反向翻译成cDNA，并随后进行密码子优化以用于在人细胞中表达。添加调节元件：N端Kozak序列和C端终止密码子(包括用于克隆的BamH1和Not1限制性位点)，并将cDNA制备成合成基因。将cDNA克隆到合适的载体中并验证其序列。通过在HEK293_E细胞中瞬时转染所得质粒来进行蛋白质的表达。通过蛋白A亲和色谱和制备型尺寸排阻色谱从培养物上清液纯化蛋白质。
将含Fc的构建体的两条蛋白质链的氨基酸序列反向翻译成编码cDNA，添加必要的调节元件(Kozak序列、终止密码子和克隆位点BamH1和Not1)并对cDNA进行密码子优化以用于表达。通过合成基因合成制备cDNA，并且通过将cDNA分别克隆到合适的载体中来制备编码两条蛋白质链中的任一条的表达质粒。对所得质粒进行序列验证并随后将其用于使用不同比率的两种质粒(1∶2、1∶1和2∶1)转染悬浮生长的CHO细胞。使用蛋白A亲和色谱从培养物上清液纯化分泌的蛋白质，并将其经缓冲液交换至PBS。通过制备型尺寸排阻色谱进一步纯化蛋白质。
实施例5：抗PSMA VHH JVZ-007的人源化变体的测试
在4小时脱颗粒测定中测试了经纯化含双特异性VHH的人源化变体的诱导靶标依赖性T细胞活化的能力。如实施例1中所述通过磁激活细胞分选(MACS)从PBMC分离Vγ9Vδ2T细胞并进行扩增。总是对用于实验的扩增的Vγ9Vδ2 T细胞进行纯度检查，并且发现在FACS中Vγ9和Vδ2染色的双阳性＞95％。将经纯化、扩增的Vγ9Vδ2 T细胞与相同数目的PSMA阳性LNCaP(ATCC，目录号CRL-1740)靶细胞(效应物∶靶标(E∶T)细胞之比为1∶1)和一定浓度范围的双特异性构建体一起孵育。在孵育4小时之后，通过在FACS中染色来确定表达CD107a的T细胞的百分比。
图3示出了PSMA VHH JVZ-007的人源化变体在诱导依赖于抗原阳性细胞系LNCaP的Vγ9Vδ2 T细胞脱颗粒方面显示出强效力。然而，当使用抗原阴性细胞系PC-3时，单一高浓度的双特异性构建体没有引起T细胞的显著活化。
实施例6：由双特异性VHH和含Fc的对应物介导的细胞毒性
将双特异性VHH LV1050-5C8var1的两个VHH序列重格式化成包含如上所述的人IgG1 Fc的半衰期延长分子，产生SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26中所示构建体(5C8var1-Fc和LV1050-Fc)。
测试双特异性VHH构建体LV1050-5C8var1和含Fc的对应物5C8var1-Fc x LV1050-Fc(在本文中也称为LV1050-Fc x 5C8var1)二者其通过使Vγ9Vδ2 T细胞活化来诱导对LNCaP细胞的细胞毒性的能力。
图4示出了双特异性VHH以及含有相同VHH序列的含Fc的对应物二者能够以E∶T比为1∶1在24小时之后诱导100％肿瘤细胞裂解。包含原始抗PSMA VHH JVZ-007的双特异性VHH LV1044-5C8与人源化形式LV1050-5C8var1一样有效，并且这二者均比含Fc的对应物5C8var1-Fc x LV1050-Fc略微更强效。发现LV1050-5C8var1和LV1044-5C8的EC50值分别为2.2pM和1.6pM，并且5C8var1-Fc x LV1050-Fc的为10.5pM。对于后续实验，出于表达目的，向编码含Fc的链的两种构建体添加C端赖氨酸，产生了SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28中所示编码序列。对所产生多肽进行的分析表明C端赖氨酸被剪掉(clip off)(数据未示出)，从而产生了与由不编码C端赖氨酸的构建体产生的那些多肽相同的多肽。
实施例7：在FACS中LV1050-Fc x 5C8var1-Fc与靶标阳性细胞的结合
如上所述克隆、表达和纯化双特异性含Fc的构建体5C8var1-Fc x LV1050-Fc。为了测试该分子与PSMA的结合，测试一定浓度范围的抗体与PSMA阳性前列腺癌细胞系LNCaP和抗原阴性细胞系PC-3的结合。用多克隆抗人IgG抗体进行检测。
为了测试LV1050-Fc x 5C8var1-Fc与Vγ9Vδ2 T细胞的结合，使用用针对VHH的两种不同单克隆抗体(45H8和96A3F5；Genscript，目录号分别为CP001/18L001614和A01994)进行的检测，在FACS染色中测试了一定浓度范围的化合物(100nM及其半对数稀释)的结合。
图5示出了该分子与PSMA特异性地结合(左图)，因为其对PSMA阴性细胞系PC-3没有可测量的染色，但显示出与LNCaP细胞的强结合。测量的结合EC50为7.3nM。通过FACS测量的Vγ9Vδ2 TCR的亲和力为1.7nM(右图)。
实施例8：先导双特异性抗体LV1050-Fc x 5C8var1-Fc诱导强效靶标依赖性T细胞活化和靶细胞裂解
为了测量双特异性T细胞接合剂的效力，将靶标阳性LNCaP细胞与一定浓度范围的该分子和固定数目的Vγ9Vδ2 T细胞(效应物∶靶标之比为1∶1)一起孵育。然后通过在孵育四小时之后在FACS中对T细胞上的CD107a表达进行染色来测量T细胞活化。在24小时之后通过测量FACS(7AAD染色)中活细胞数目来测量细胞毒性。图6示出了LV1050-Fc x 5C8var1-Fc诱导强效T细胞活化，如由CD107a表达所证明的。另外，这对LNCaP靶细胞产生了强细胞毒性作用。发现细胞毒性EC50值对于所测试的两种双特异性VHH分子实质上相同(对于LV1044-5C8(在本实验中产生，没有AAAEPEA标签)和LV1050-5C8var1均为1.9pM)，而对于LV1050-Fc x 5C8var1-Fc略高(9.4pM)。
实施例9：患者来源肿瘤和正常组织中的Vγ9Vδ2-T细胞频率和配体表达
在对患有非转移性前列腺癌的患者进行根治性前列腺切除术之后获得前列腺肿瘤组织。分析了肉眼检查的正常组织(macroscopically normal tissue)以及肿瘤组织二者。用手术刀片将组织切成小块，并将其重悬于由补充有以下的Iscove改良Dulbecco培养基(Iscove Modified Dulbecco Medium，IMDM)构成的解离培养基中：0.1％DNA酶I(Roche)、0.14％胶原酶A、100IU/mL青霉素钠/100μg/mL硫酸链霉素/2.0mM L谷氨酰胺和5％FcS。将组织块转移至无菌烧瓶并在磁搅拌器上在37度下孵育45分钟。在该孵育之后，使细胞悬液运行通过100μM细胞过滤器。肿瘤组织总共解离三次且正常组织解离两次，在此之后洗涤细胞并准备使用台盼蓝排除法进行活细胞计数。使用用AF700标记的抗CD45 mAb、PerCP-Cy5.5标记的抗CD3 mAb、APC标记的抗TCR Vγ9 mAb和BV711标记的抗TCR Vδ2 mAb在FACS中进行染色，来分析解离的肿瘤组织和正常组织中Vγ9Vδ2-T细胞的存在情况。使用BV421标记的抗EpCAMmAb、FITC标记的抗PSMA mAb和PE标记的抗CD277 mAb来确定肿瘤细胞和正常细胞上靶标EpCAM、PSMA和CD277的表达。
图7示出了肿瘤组织与正常组织之间的PSMA表达以及CD277表达二者中存在显著差异。对切除的组织进行宏观检查并随后将其确定为肿瘤组织或正常组织。这随后在FACS中通过对肿瘤的EpCAM阳性染色(其与PSMA表达相关)得到进一步证实。PSMA在正常组织中几乎不存在但在解离的肿瘤细胞上显著表达。CD277(BTN3A)表达在肿瘤上也更高度地表达，但是该差异缺乏统计学显著性。相比之下，Vγ9Vδ2-T细胞在肿瘤组织和正常组织二者中的频率在很大程度上相当，其中正常组织具有略高的百分比。
实施例10：使用患者来源靶细胞进行的对LV1044-5C8的功能性分析
为了确定双特异性构建体介导Vγ9Vδ2-T细胞针对患者来源靶细胞的细胞毒性的潜能，将解离的肿瘤细胞和正常细胞的悬液在具有或不具有50nM化合物和Vγ9Vδ2-T细胞培养物的情况下以1∶1的效应物∶靶标(E∶T)比在37℃下孵育24小时。使用生死标志物(life-death marker)7AAD和123计数eBeads来确定活靶细胞的数目。
图8示出了Vγ9Vδ2 T细胞能够以靶细胞和Vγ9Vδ2 T细胞依赖性方式诱导对患者来源肿瘤细胞的肿瘤细胞杀伤。大部分缺乏PSMA表达的正常组织不受Vγ9Vδ2 T细胞的影响，即使在存在50nM双特异性抗体的情况下。然而，PSMA阳性肿瘤细胞在24小时之后被显著杀伤，但仅是在存在效应细胞和双特异性抗体二者的情况下。
实施例11：使用生物层干涉术进行的LV1050-Fc x 5C8var1-Fc对人PSMA和Vγ9Vδ2 TCR的亲和力测定
使用生物层干涉术(biolayer interferometry，BLI)来确定LV1050-Fc x5C8var1-Fc对重组人PSMA和人Vγ9Vδ2 TCR的亲和力。作为配体，将12.5μg/mL生物素化的hPSMA或5μg/mL hVγ9Vδ2-Fc(由SEQ ID NO：31和32组成)加载到链霉亲和素生物传感器上。作为分析物，使用LV1050-Fc x 5C8var1-Fc的两倍系列稀释物：范围为3.125至200nM，与配体PSMA组合；范围为0.03125至20nM，与配体hVγ9Vδ2-Fc组合。如表2中所示，LV1050-Fc x 5C8var1-Fc与人PSMA结合的KD值为32±1.2nM，并且与人Vγ9Vδ2 TCR结合的KD为0.64±0.16nM。
表2：使用生物层干涉术进行的LV1050-Fc x 5C8var1-Fc对人PSMA和Vγ9Vδ2 TCR的亲和力测定
实施例12：表位作图
为了确定PSMA上被LV1050-Fc x 5C8var1-Fc中并入的VHH所结合的表位，将LV1050-5C8var1-无-c-标签(SEQ ID NO：29)(包含与LV1050-Fc x 5C8var1-Fc相同的PSMA结合VHH结构域)用于由CovalX AG开发的表位作图技术(Pimenova et al.(2008)J MassSpectrom 43：185)。简言之，使重组PSMA蛋白(SEQ ID NO：30)与LV1050-5C8var1-无-c-标签结合，交联，暴露于不同的蛋白酶，并通过高分辨率质谱来分析所得肽(交联或不交联)。
结果表明VHH与图9中所示的构象表位结合。发现以下残基与该抗体具有直接相互作用：R149、S156、R163、S276、R279、S281、K283、H577、S590、K688、R689和Y692。这些残基对应于UniProt序列Q04609-1中的残基R190、S197、R204、S317、R320、S322、K324、H618、S631、K729、R730和Y733。已经在FOLH1基因中鉴定出的罕见单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)均未出现在该表位中，表明LV1050-5C8var1-无-c-标签并因此LV1050-Fc x 5C8var1-Fc能够结合靶标的所有相关的已鉴定SNP变体。
实施例13：使用肿瘤来源细胞系进行的对LV1050-Fc x 5C8var1-Fc的进一步功能性分析
在4小时内在体外测定中使用脱颗粒标志物CD107a(LAMP-1)的表达作为读出来确定LV1050-Fc x 5C8var1-Fc诱导PSMA依赖性Vγ9Vδ2-T细胞活化的能力。在不存在或存在不同浓度的LV1050-Fc x 5C8var1-Fc(范围为10fM至3.16nM)的情况下，将从来自健康供体的PBMC分离的扩增的Vγ9Vδ2 T细胞与PSMA表达前列腺来源癌细胞系LNCaP、VCaP或22Rv1以1∶1的效应物∶靶细胞比一起培养。收获细胞并通过流式细胞术来确定CD107a的细胞表面表达。在存在所有PSMA表达肿瘤细胞系的情况下，LV1050-Fc x 5C8var1-Fc诱导非常强效的Vγ9Vδ2-T细胞活化(图10)，其中EC50值在pM范围内(表3)。
表3：在使用Vγ9Vδ2-T细胞和PSMA阳性肿瘤细胞系的体外测定中，在LV1050-Fc x5C8var1-Fc下，Vγ9Vδ2-T细胞脱颗粒和Vγ9Vδ2-T细胞介导的肿瘤细胞毒性的EC50值
接下来，在同一共培养物中在24小时时使用发光测定对来自垂死/死亡肿瘤细胞的胞内蛋白酶的释放进行定量(CytoTox-GloTM细胞毒性测定，Promega)，来确定LV1050-Fcx 5C8var1-Fc诱导靶标依赖性、Vγ9Vδ2-T细胞介导的肿瘤细胞杀伤的能力。LV1050-Fc x5C8var1-Fc以与针对脱颗粒相同范围的EC50值(表3)诱导对LNCaP、VCaP和22Rv1细胞的强靶标依赖性和Vγ9Vδ2-T细胞介导的细胞毒性(图11B)。
另外，Vγ9Vδ2-T细胞未被单独的LV1050-Fc x 5C8var1-Fc(在不存在肿瘤细胞的情况下)活化，也未观察到其中PSMA表达被消除的肿瘤细胞(LNCaP.koPSMA)的裂解(图11A)。
为了研究不同E∶T比对LV1050-Fc x 5C8var1-Fc(测试浓度范围：10fM至3.2nM)效力的影响，在24小时细胞毒性测定中使靶标LNCaP细胞的数目保持恒定(即50,000)，同时改变效应Vγ9Vδ2-T细胞的数目以获得不同的E∶T比(1∶1、1∶10和1∶100)。如表4中所示，由LV1050-Fc x 5C8var1-Fc诱导的Vγ9Vδ2-T细胞介导的细胞毒性的平均EC50值在E∶T比为1∶1至1∶10之间相当(分别为17±13pM和9.9±6.5pM)，而在E∶T比为1∶100时，观察到的细胞毒性水平太低而不能准确计算EC50值。尽管测定中LV1050-Fc x 5C8var1-Fc的效力(EC50)未受影响，但与E∶T比为1∶1相比，在E∶T比为1∶10中观察到的最大裂解百分比显著降低(数据未示出)。因此，LV1050-Fc x 5C8var1-Fc的效力(即在测定中测量的EC50)不受不同E∶T比的强影响。
表4：使用不同E∶T比的由LV1050-Fc x 5C8var1-Fc介导的Vγ9Vδ2-T细胞细胞毒性的EC20、EC50和EC90值。
实施例14：使用患者来源靶细胞进行的对LV1050-Fc x 5C8var1-Fc的功能性分析
获得患者来源非转移性前列腺癌组织，并如实施例9中所述处理正常(非恶性)组织和肿瘤组织。
作为Vγ9Vδ2-T细胞活化的量度，在存在或不存在50nMLV1050-Fc x 5C8var1-Fc的情况下确定解离的前列腺样品(来自正常(非恶性)组织或原发性肿瘤组织的0.5×105至1×105个解离的细胞)中存在的Vγ9Vδ2-T细胞上的脱颗粒标志物CD107a(LAMP-1；使用PE标记的抗人CD107a(Thermofisher)检测)的上调。在4小时之后，通过CD107a表达来测量Vγ9Vδ2-T细胞的脱颗粒，并通过基于流式细胞术的测定(确定EpCAM-/CD45+/CD3+/Vγ9+/Vδ2+/CD107a+细胞的百分比)进行分析。
此外，确定了在存在前列腺肿瘤组织或正常(非恶性)组织的情况下在所培养的自体患者PMBC中LV1050-Fc x 5C8var1-Fc引发Vγ9Vδ2-T细胞脱颗粒的能力。出于该目的，使用与上述相同的方法，不同之处在于在此以效应物与靶标(E∶T；PBMC∶前列腺细胞)之比为10∶1添加自体PBMC并孵育24小时。
在解离的前列腺癌组织而不是在非恶性前列腺组织中，LV1050-Fc x 5C8var1-Fc诱导了组织浸润Vγ9Vδ2-T细胞脱颗粒的统计学上显著的提高。与在没有双特异性抗体的情况下进行组织细胞孵育相比，观察到显著更高百分比的CD107a表达Vγ9Vδ2-T细胞(图12A)。在正常组织中，LV1050-Fc x 5C8var1-Fc不诱导组织浸润Vγ9Vδ2-T细胞的脱颗粒(图12B)。
另外，确定了LV1050-Fc x 5C8var1-Fc在与患者前列腺肿瘤组织或正常(非恶性)组织共培养时使自体PMBC中的Vγ9Vδ2-T细胞活化的能力。与单独孵育肿瘤组织细胞和自体PMBC相比，在存在LV1050-Fc x 5C8var1-Fc的情况下共培养产生显著更高百分比的CD107a表达Vγ9Vδ2-T细胞(图13A)。当将LV1050-Fc x 5C8Var1-Fc添加至自体PMBC和正常(非恶性)前列腺组织的培养物时，未观察到自体PBMC中Vγ9Vδ2-T细胞的活化(图13B)。
除使用E∶T比为10∶1之外，如实施例10中所述在前列腺肿瘤细胞或正常(非恶性)前列腺细胞和自体PBMC的共培养物中测试了由LV1050-Fc x 5C8var1-Fc诱导的特异性细胞毒性。LV1050-Fc x 5C8var1-Fc在存在自体PBMC的情况下诱导统计学上显著的肿瘤细胞裂解，而正常(非恶性)前列腺细胞未被裂解(图14)。
实施例15：LV1050-Fc x 5C8var1-Fc的体内治疗效力
对免疫缺陷NCG小鼠皮下接种以2∶1之比与人PBMC混合的5×106个22Rv1细胞(22Rv1∶PBMC)。本研究中使用来自在CD3+T细胞中显示出不同的Vγ9Vδ2-T细胞频率的2个供体(供体#1(21.9％Vγ9Vδ2-T细胞)和供体#2(8.8％Vγ9Vδ2-T细胞))的PBMC。从肿瘤细胞和PBMC接种之日开始，每周(第0、7、14和21天)IV施用LV1050-Fc x 5C8var1-Fc(0.2mg/kg或2mg/kg)或磷酸缓冲盐水(phosphate buffered saline，PBS)。使用卡尺在两个维度(dimension)上测量肿瘤尺寸，每周两次。当组中平均肿瘤体积超过2,000mm3时将小鼠处死。
对于注射来自供体#1的PBMC的小鼠，以0.2或2mg/kg施用LV1050-Fc x 5C8var1-Fc在第34天(当处死对照(经PBS处理)组中的小鼠时；图15A)分别产生了91％和78％的统计学上显著的肿瘤生长抑制(tumor growth inhibition，TGI)值。对于注射来自供体#2的PBMC的小鼠，在第41天(当处死相应经PBS处理组中的小鼠时)观察到的TGI值对于用0.2和2mg/kg的LV1050-Fc x 5C8var1-Fc处理的小鼠分别为23％和52％(图15B)。对于供体#2，针对所施用化合物的最高剂量发现TGI的统计学显著性。
实施例16：全血细胞因子释放评价
使用来自30名健康供体的新鲜全血，使用溶液相测定进行体外细胞因子释放测定。将不同浓度的LV1050-Fc x 5C8var1-Fc(范围为280至8.75nM)与全血一起孵育24小时，并使用免疫测定来测量血浆中七种细胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ和肿瘤坏死因子(TNF)α)的水平。
(西妥昔单抗(cetuximab))和
(阿仑单抗(alemtuzumab))作为对照化合物包括在测定中，其在在临床中分别诱导低和高的细胞因子释放。葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B，SEB)用作所有测试细胞因子释放的阳性测定对照。
结果总结在表5中示出。LV1050-Fc x 5C8var1-Fc仅诱导IL-8和IFN-γ的释放。LV1050-Fc x 5C8var1-Fc诱导的IL-8释放与
诱导的IL-8释放相当，所述
是已知在患者中不诱导细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome，CRS)(或已知诱导低水平的细胞因子)的抗体。LV1050-Fc x 5C8var1-Fc诱导的IFN-γ释放与
相比略高，但观察到的最高IFN-γ释放远低于由
诱导的释放，所述
是临床上与CRS相关的抗体。重要的是，LV1050-Fc x 5C8var1-Fc没有诱导任何IL-6释放，所述IL-6是CRS中的重要细胞因子(Tanaka et al(2016)Immunotherapy 8：959)。
在其中将LV1050-Fc x 5C8var1-Fc包被至高结合96孔板，然后与来自10名健康供体的新鲜全血一起孵育的体外细胞因子释放测定中，获得了类似的结果。在此，LV1050-Fcx 5C8var1-Fc诱导了非常低(中值)水平的IL-6和LV-8，这与低响应比较物
相当，并且没有观察到TNFα释放。与
相比，LV1050-Fc x 5C8var1-Fc在每个测试化合物浓度下均诱导更高(中值)水平的IFNγ，但中值水平显著低于由
诱导的中值水平。
表5：健康供体的新鲜血液样品中由LV1050-Fc x 5C8var1-Fc诱导的细胞因子释放谱(pg/mL)。
通过体外细胞因子释放测定在30名健康供体的新鲜血液样品中测量的针对每种药物/剂量组合的中值细胞因子水平(pg/mL)。
实施例17：药代动力学
LV1050-Fc x 5C8var1-Fc包含人Fc结构域，所述人Fc结构域预期通过与人FcRn受体结合来延长该化合物的体内半衰期。为了验证这一点，将LV1050-Fc x 5C8var1-Fc与人IgG对照以2mg/kg、5mg/kg和10mg/kg的三个单IV剂共施用于人FcRn Tg32 SCID小鼠(Jackson实验室：JAX)。在施用之后的不同时间点(5分钟、8小时、1、3、7、10、14、17、21和28天)收集血液样品，并使用抗原捕获ELISA评估LV1050-Fc x 5C8var1-Fc的浓度。在该模型系统中获得的结果表明，LV1050-Fc x 5C8var1-Fc在这些转基因小鼠中的半衰期范围为140至172小时(5.8至7.2天，图16)，与该系统中基于IgG的抗体的半衰期相当。
还在非人灵长类(non-human primate，NHP)中评价了LV1050-Fc x 5C8var1-Fc的药代动力学。使用30分钟IV输注，向三只雌性食蟹猴(cynomolgus monkey)给予单IV剂的LV1050-Fc x 5C8var1-Fc(0.14、0.77和2.27mg/kg(每剂1只动物))。LV1050-Fc x5C8var1-Fc的半衰期为150至166小时(6.3至6.9天)(图17)，这与不与食蟹猴直向同源靶标结合的基于IgG的人源化抗体的半衰期(Walker et al.(2019)PLOS ONE 14：e0217061)一致。观察到暴露的剂量成比例提高。表6中提供了药代动力学参数。
表6：在单IV剂之后食蟹猴中LV1050-Fc x 5C8var1-Fc的药代动力学参数。
CL＝清除率；(n)Cmax＝(归一化的)给药之后的最大浓度；(n)AUC∞＝(归一化的)从时间点t＝0小时到无穷大的浓度与时间曲线下的面积；Tmax＝给药之后达到最大浓度的时间；t1/2＝消除半衰期；Vz＝表观分布体积。
实施例18：与转染率无关的均质产物
将编码LV1050-Fc x 5C8var1-Fc的相关两条抗体重链的cDNA各自克隆到适于生产的表达载体中。使用不同比(1∶1、1∶1.25、1∶1.5、1.25∶1和1.5∶1)的含有LV1050-Fc或5C8var1-Fc的表达载体用于转染适于生产的细胞。然后选择对两种不同抗生素具有抗性的细胞，并通过补料分批生产从所选的细胞库(cell pool)中产生抗体。对所产生抗体进行尺寸排阻高效液相色谱(Size Exclusion High Performance Liquid Chromatography，SE-HPLC)分析显示出高的产物纯度(二聚体含量)：93.2％至96.4％的分泌的蛋白质处于预期的分子尺寸，与转染率无关(表7中的主峰面积)。建立反相HPLCd(RP-HPLC)分析以进一步区分单体(LV1050-Fc和5C8var1-Fc)和同二聚体(LV1050-Fc x LV1050-Fc和5C8var1-Fc x5C8var1-Fc)与预期的LAVA异二聚体(LV1050-Fc x 5C8var1-Fc)。所有克隆库(clonepool)样品均显示出高含量的预期异二聚体LAVA LV1050-Fc x 5C8var1-Fc，为86.1％至94.9％。克隆库DGC8-T1P、-T3P和-T5P显示出百分比升高的5C8var1-Fcx5C8var1-Fc二聚体。
表7：通过转染不同比率的含有LV1050-Fc或5C8var1-Fc的表达载体获得的克隆库的SE-HPLC的结果。
HMW-高分子量；LMW-低分子量
实施例19：LV1050-Fc x 5C8var1-Fc的配制
从所选细胞克隆中，通过以下获得LV1050-Fc x 5C8var1-Fc产物：在生物反应器系统中产生，并且在收获和纯化之后使用四种类型的配方缓冲液以0.5mg/mL和10mg/mL的蛋白质浓度配制：
使配制样品经受数种储存条件(限定如下)持续多至12周。另外，进行了数项应力测试(stress test)：
·储存在5℃±3℃下
·储存在-80℃±10℃下
·加速储存条件为25℃±2℃/60％相对湿度(relative humidity，RH)±5％
·在40℃±2℃/75％RH±5％下热应激
·冷冻/解冻循环：将样品完全冷冻至-80±10℃。随后，在使样品在室温(15至25℃)下完全解冻之后，进行五次冷冻/解冻循环。
·搅拌应力：将样品在室温(EP15℃至25℃)下以240rpm搅拌7天。
·氧化：样品中掺入0.01％(v/v)过氧化氢(H2O2)并将其在25℃±2℃/60％RH±5％下孵育7天。
·光稳定性：在25℃±2℃/60％RH±5％下施加＞1200,000勒克斯小时和＞200瓦特小时/平方米的近紫外线能量。
初始(＝t0)5℃±3℃样品用作参考。使用以下分析方法分析样品：
对于-80℃±10℃、5℃±3℃和25℃±2℃的储存温度/60％RH±5％，针对清晰度、颜色、pH、A280(UV-VIS)、杂散光、SE-HPLC、CIEX-HPLC、CE-SDS和PSMA结合、差示扫描和肽指纹方面的稳定性随着时间推移的研究的结果高度相当。测量结果表明，该产物在所选缓冲液条件下高度稳定，并且随着时间推移仅观察到轻微影响。
在40℃±2℃/75％RH±5％的应力条件下检测到明显的影响，特别是在五周时，能够区分测试的缓冲液和浓度。对在40℃±2℃/75％RH±5％下且5周保存的样品进行的CIEX-HPLC分析表明，在该时间点，对于所有测试的缓冲液和产物浓度，主要变体的含量降至低于60％。与基于乙酸盐的制剂相比，在基于组氨酸的制剂中观察到主要变体百分比的略微较低的降低。
CE-SDS结果显示，随着时间推移在40℃下储存导致产物的LMW物质略微提高多至5％。对于缓冲液1和3中的10mg/mL样品，这种影响略微更明显。然而，发现抗体非常稳定，即使在40℃±2℃/75％RH±5％的强应力条件下持续5周也是如此。
在40℃±2℃/75％RH±5％下，5周时间点的PSMA结合数据显示出缓冲液1和3中10mg/mL样品的EC50强提高。在PSMA结合测定中测量的EC50的提高与在SE-HPLC分析中观察到的相对HMW物质量的略微提高(分别从0.3％和0.2％提高至0.6％和0.7％)相关。
来自应力测试(冷冻/解冻(五次F/T循环)、光应力、搅拌应力和氧化应力)的结果显示出与温度稳定性研究不同的排序。在温度稳定性研究中，缓冲液3中10mg/mL样品显示出超出其预定分析阈值的最高量的结果，而应力稳定性研究显示，与其他条件相比，缓冲液1中0.5mg/mL样品有超出其预定分析阈值的提高的结果。
LC-MS分析显示，添加甲硫氨酸(存在于缓冲液2和缓冲液4中)来防止产物氧化是有效的。
总之，LV1050-Fc x 5C8var1-Fc在缓冲液2和缓冲液4中配制时最稳定。表8中示出了温度稳定性、应力稳定性和整体稳定性(温度加应力)超出其预定分析阈值的结果的总和的概述。
对于最终配方，选择10mM组氨酸+280mM蔗糖+0.02％聚山梨醇酯80，pH 6.0+1mM甲硫氨酸，蛋白质浓度为0.5至10mg/mL。
表8：温度稳定性、应力稳定性和整体稳定性(温度加应力)超出其预定分析阈值的结果的总和。
Claims (41)
1.多特异性抗体，其包含能够结合人PSMA的第一抗原结合区和能够结合人Vγ9Vδ2 T细胞受体的第二抗原结合区。
2.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是双特异性抗体。
3.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一抗原结合区是单结构域抗体。
4.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第二抗原结合区是单结构域抗体。
5.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体与具有SEQ ID NO：2中所示序列的抗体竞争与人PSMA结合，优选地，其中所述多特异性抗体与具有SEQ ID NO：2中所示序列的抗体结合人PSMA上相同的表位。
6.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO：14中所示VH CDR1序列、SEQ ID NO：15中所示VH CDR2序列和SEQ ID NO：16中所示VH CDR3序列。
7.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一抗原结合区是人源化的，其中优选地，所述第一抗原结合区包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：2中所示序列，或者与SEQ ID NO：2中所示序列具有至少90％，例如至少92％，例如至少94％，例如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。
8.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体能够使人Vγ9Vδ2 T细胞活化。
9.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体能够与人Vδ2结合。
10.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体与具有SEQ ID NO：5中所示序列的抗体竞争与人Vδ2结合，或者与具有SEQ ID NO：20中所示序列的抗体竞争与人Vδ2结合。
11.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体与具有SEQ ID NO：5中所示序列的抗体结合人Vδ2上相同的表位，或者与具有SEQ ID NO：20中所示序列的抗体结合人Vδ上相同的表位。
12.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO：17中所示VH CDR1序列、SEQ ID NO：18中所示VH CDR2序列和SEQ ID NO：19中所示VH CDR3序列，或者包含SEQ ID NO：21中所示VH CDR1序列、SEQ ID NO：22中所示VH CDR2序列和SEQ ID NO：23中所示VH CDR3序列。
13.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第二抗原结合区是人源化的，其中优选地，所述第二抗原结合区包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：5中所示序列，或者与SEQ ID NO：5中所示序列具有至少90％，例如至少92％，例如至少94％，例如至少96％，例如至少98％序列同一性的序列。
14.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO：14中所示VH CDR1序列、SEQ ID NO：15中所示VH CDR2序列和SEQ ID NO：16中所示VH CDR3序列，并且其中所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO：15中所示VH CDR1序列、SEQID NO：18中所示VH CDR2序列和SEQ ID NO：19中所示VH CDR3序列。
15.根据权利要求1至8中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体能够与人Vγ9结合。
16.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体能够介导Vγ9Vδ2 T细胞对PSMA表达细胞例如LNCaP细胞的杀伤。
17.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体能够介导对来自前列腺癌患者的人PSMA表达细胞的杀伤。
18.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一抗原结合区和所述第二抗原结合区通过肽接头共价连接。
19.根据权利要求18所述的多特异性抗体，其中所述肽接头包含SEQ ID NO：6中所示序列或由其组成。
20.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述能够结合人PSMA的第一抗原结合区位于所述能够结合人Vγ9Vδ2 T细胞受体的第二抗原结合区的N端。
21.根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体还包含半衰期延长结构域。
22.根据权利要求20所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体在施用于人对象时具有长于约168小时的终末半衰期。
23.根据权利要求1至17、21或22中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含Fc区。
24.根据权利要求23所述的多特异性抗体，其中所述Fc区是包含两个Fc多肽的异二聚体，其中所述第一抗原结合区与第一Fc多肽融合并且所述第二抗原结合区与第二Fc多肽融合，并且其中第一Fc多肽和第二Fc多肽包含与形成同二聚体相比有利于形成异二聚体的非对称氨基酸突变。
25.根据权利要求24所述的多特异性抗体，其中所述Fc多肽的CH3区包含所述非对称氨基酸突变，优选地其中第一Fc多肽包含T366W替换并且第二Fc多肽包含T366S、L368A和Y407V替换，或反之亦然，其中氨基酸位置对应于根据EU编号系统的人IgG1。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的多特异性抗体，其中第一Fc多肽和第二Fc多肽中第220位的半胱氨酸残基已被缺失或替换，其中氨基酸位置对应于根据EU编号系统的人IgG1。
27.根据权利要求23至26中任一项所述的多特异性抗体，其中第一Fc多肽和第二Fc多肽还包含第234位和/或第235位处的突变，优选地其中第一Fc多肽和第二Fc多肽包含L234F和L235E替换，其中氨基酸位置对应于根据EU编号系统的人IgG1。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO：2中所示序列，所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO：5中所示序列，并且其中：
·第一Fc多肽包含SEQ ID NO：12中所示序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO：13中所示序列，或者
·第一Fc多肽包含SEQ ID NO：12中所示序列并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO：13中所示序列。
29.药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的多特异性抗体以及可药用赋形剂。
30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述多特异性抗体是根据权利要求23至28中任一项所述的抗体，并且其中所述药物组合物包含缓冲剂、蔗糖、聚山梨醇酯80和甲硫氨酸，其中所述组合物的pH为5.4至7.4，例如为5.4至6.1。
31.根据权利要求1至28中任一项所述的多特异性抗体，其用作药物。
32.根据权利要求1至28中任一项所述的多特异性抗体，其用于治疗癌症。
33.根据权利要求1至28中任一项所述的多特异性抗体，其用于治疗前列腺癌。
34.根据权利要求1至28中任一项所述的多特异性抗体，其用于治疗其中PSMA在原发性或转移性肿瘤的肿瘤新血管系统或肿瘤相关内皮细胞上表达的癌症，所述原发性或转移性肿瘤包括来自结直肠癌、肺癌、乳腺癌、子宫内膜和卵巢癌、胃癌、肾细胞癌、尿路上皮癌、肝细胞癌、口腔鳞癌、甲状腺肿瘤和胶质母细胞瘤。
35.根据权利要求1至28中任一项所述的多特异性抗体，其用于治疗头颈部腺样囊性癌。
36.治疗疾病的方法，其包括将根据权利要求1至28中任一项所述的多特异性抗体施用于有此需要的人对象。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述疾病是癌症。
38.核酸构建体，其编码根据权利要求1至28中任一项所述的多特异性抗体。
39.表达载体，其包含根据权利要求38所述的核酸构建体。
40.宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞，优选CHO细胞，其包含根据权利要求38所述的核酸构建体或根据权利要求39所述的表达载体。
41.用于产生根据权利要求1至28中任一项所限定的多特异性抗体，优选根据权利要求23至28中任一项所限定的多特异性抗体的方法，其通过以下实现：在合适的宿主细胞，例如哺乳动物细胞，优选CHO细胞中(共)表达一种或更多种编码所述多特异性抗体的核酸构建体，随后纯化所产生的重组抗体。
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