JP2021521789A - Ｉｆｎと抗ｐｄ−ｌ１抗体の融合タンパク質およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質、融合タンパク質を含む医薬組成物およびキット、ならびに腫瘍治療における融合タンパク質の適用に関する。本発明の融合タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１およびＩＦＮ受容体を同時に標的とすることができ、腫瘍微小環境におけるＩＦＮシグナルの活性化は、より強力なＴ細胞活性化を誘導することにより、腫瘍のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１治療を強化することができる。また、抗PD-L1抗体は、免疫調節分子を腫瘍組織に特異的に送達するために使用されることができる。融合タンパク質の作用により、複数のフィードフォワード応答が生成される。これにより、ターゲティング効果が高まり、毒性が低下するだけでなく、IFN療法への応答が強化され、抗腫瘍効果を最大化する。
【選択図】図１０

Description

本発明は、遺伝子工学と生物医学医療の技術分野に属し、具体的に、ＩＦＮと抗ＰＤ−Ｌ１抗体の融合タンパク質、融合タンパク質を含む薬物組成物と試薬キット、融合タンパク質の腫瘍疾病の治療における使用に関する。

プログラムされた細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）は、Ｔ細胞のＴＣＲシグナル活性化を阻害し、それによって免疫応答の強度と持続時間を短縮できる重要な免疫チェックポイント分子である。そのリガンドＰＤ−Ｌ１は一般に腫瘍細胞でアップレギュレートされ、腫瘍が免疫応答を回避するメカニズムの１つになっている。 ＰＤ−１ ／ ＰＤ−Ｌ１ブロッキング療法（ＰＤ療法と略称）は、さまざまな癌患者の腫瘍細胞に対して長期的な免疫応答を誘発する可能性がある。しかし、実際には、客観的かつ効果的な免疫反応は、ＰＤ療法を受けている少数の患者でのみ観察される。さらに、後天性ＰＤ療法における薬剤耐性もますます注目されており、そのメカニズムはまだ不明である。したがって、特定の腫瘍がＰＤ療法に反応できない、または薬剤耐性を発現できない理由の研究と分析は、ＰＤ療法関連の研究の最優先事項になっている。

一部の学者は、Ｔ細胞が免疫抑制シグナルを放出するため、ＰＤ療法が腫瘍を効果的に制御できると提案している。報告によると、ＰＤ療法の優れた効果は、十分な数の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬｓ）に関連している。ただし、リンパ球浸潤が多数存在する場合でも、ＰＤ療法だけでは腫瘍特異的Ｔ細胞の（再）活性化には効果がない場合がある。これらの場合、Ｔ細胞の（再）活性化を誘導するために、他の負の相乗的阻害剤を遮断または刺激信号をアップレギュレートする必要があるかもしれない。しかし、Ｔ細胞免疫を効果的に促進することができるシグナル分子についてはまだ多くの論争がある。

Ｉ型インターフェロンにはＩＦＮαとＩＦＮβが含まれており、樹状細胞（ＤＣ）の成熟を促進し、抗原を処理および提示することでＴ細胞を活性化し、自然免疫と適応免疫の間の架け橋として機能する。初期の研究では、Ｉ型インターフェロンは腫瘍細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを促進する効果があることがわかったため、リンパ腫、黒色腫、腎細胞腫瘍などの臨床的に特異的な腫瘍の治療に承認されている。最近の研究では、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達経路によって媒介されるＡＰＣおよびＴ細胞の活性化が、腫瘍の放射線療法および化学療法において重要な役割を果たすことが示されている。ただし、腫瘍組織におけるＩ型インターフェロンの発現は非常に低いである。外因性Ｉ型インターフェロン療法は、腫瘍の増殖と生存を阻害するだけでなく、抗腫瘍免疫応答を活性化することができるため、重要な研究対象となっている。

臨床的には、高用量のＩ型インターフェロン治療はより良い腫瘍制御効果をもたらす。ただし、ＩＦＮＡＲ受容体は正常組織で広く発現しているため、高用量のＩ型インターフェロンは、インフルエンザ様症状（発熱、頭痛など）、嘔吐、白血球減少症、貧血、血小板減少症などの症状を含む重篤な副作用を患者に引き起こす可能性がある。さらに、Ｉ型インターフェロンは免疫抑制分子ＰＤ−Ｌ１の発現をアップレギュレートすることができ、これにより抗腫瘍免疫応答が阻害され、治療効果が低下する。 Ｉ型インターフェロンによって引き起こされる全身毒性と免疫抑制をどのように克服するかは、解決すべき重要な問題である。

［発明が解決しようとする課題］
腫瘍浸潤リンパ球の存在にもかかわらず、ほとんどの患者は依然として集中的なＰＤ−１ ／ ＰＤ−Ｌ１療法に反応しない。 本発明者らは、生来の免疫抗原提示細胞の不完全な活性化が、ＰＤ−１ ／ ＰＤ−Ｌ１遮断後の腫瘍特異的Ｔ細胞の完全な活性化を制限する可能性があると考えている。 Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の局所送達は、抗原提示を回復するが、ＰＤ−Ｌ１をアップレギュレートし、そしてＴ細胞の活性化を阻害する。

［課題を解決するための手段］
従来技術の上記の制限および欠陥を克服するために、本発明は、ＰＤ−Ｌ１およびＩＦＮ受容体を同時に標的とすることができるＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１抗体（ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１）融合タンパク質を提供する。 実験では、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質が腫瘍組織に蓄積し、抗原のクロスサブミッションを大幅に増加させ、ＰＤ−Ｌ１を介した免疫抑制を克服できることが観察された。 ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質は、免疫抑制シグナルを同時に放出し、共刺激シグナルを提供してＴ細胞を（再）活性化し、腫瘍疾患の治療のための新世代の抗ＰＤ−Ｌ１抗体として使用できる。

本発明の目的は以下の技術案により実現される。

本発明は、融合タンパク質を提供し、前記融合タンパク質はインターフェロン（ＩＦＮ）とＰＤ−Ｌ１結合タンパク質を融合接続させてなるＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１であり、前記融合タンパク質はホモダイマータンパク質或いはヘテロダイマータンパク質である。

本発明の前記ホモダイマータンパク質は、第一ペプチドと第二ペプチドを含み、前記第一ペプチドと第二ペプチドが同様であり、前記第一ペプチドと第二ペプチドはＮ端からＣ端までの順でＩＦＮ、ＰＤ−Ｌ１結合タンパク質、と免疫グロブリンＦｃ区を含む。

本発明の前記ヘテロダイマータンパク質は、第一ペプチドと第二ペプチドを含み、前記第一ペプチドは第二ペプチドと異なり、前記第一ペプチドはＰＤ−Ｌ１結合タンパク質を含み、前記第二ペプチドはＩＦＮと免疫グロブリンＦｃ区を含み、ＩＦＮはＦｃ区のＮ端に位置しており、前記第一ペプチドに含まれるＦｃ区と第二ペプチドに含まれるＦｃ区は同様な、または異なるサブタイプを有する免疫グロブリンに由来する。

本発明に記載のインターフェロン（ＩＦＮ）は、Ｉ型インターフェロン、Ｉ型インターフェロン変異体、ＩＩ型インターフェロンおよび／またはＩＩＩ型インターフェロンから選択され、例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−λ１（ＩＬ−２９）、ＩＦＮ−λ２（ＩＬ−２８ａ）、ＩＦＮ−λ（ＩＬ−２８ｂ）とＩＦＮ−ωなどがあり、好ましくはＩ型インターフェロンであり、好ましくはＩＦＮ−α４であり、さらに好ましくはＩＦＮ−α４変異体であり、前記ＩＦＮはヒトソース或いはマウスソースに由来し、好ましくはＩＦＮ−α４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３）であり、さらに好ましくはＩＦＮ−α４変異体であり、さらに好ましくは変異体ｍＩＦＮ−α４（Ｌ３０Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５）、ｍＩＦＮ−α４（Ｒ１４４Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７）、ｍＩＦＮ−α４（Ａ１４５Ｇ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９）、ｍＩＦＮ−α４（Ｒ１４９Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１）、ｍＩＦＮ−α４（Ｓ１５２Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３）、ｈＩＦＮ−α２（Ｑ１２４Ｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５）である。

本発明に記載の免疫グロブリンＦｃ区は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３および／またはＩｇＧ４の定常領域アミノ酸配列から選択されることができ、好ましくはＩｇＧ１である。そのうちの、ＩｇＧ１はＡＤＣＣおよびＣＤＣ効果を誘発する強力な能力と長い血清半減期を持っており、抗体薬の最も一般的な抗体サブタイプである。ＩｇＧ２、ＩｇＧ４は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ効果を誘発する能力が弱いであるが、血清半減期は長くなる。

本発明に記載のＰＤ−Ｌ１結合タンパク質は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（完整抗体）、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片から選択することができ、前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＴｅｃｅｎｔｒｉｑ、Ｂａｖｅｎｃｉｏ、Ｉｍｆｉｎｚｉ、ＫＮ０３５、ＣＳ１００１、ＫＬ−Ａ１６７、ＳＨＲ−１３１６および／またはＹＷ２４３．５５．Ｓ７０から選択されることは好ましい。さらに好ましくは、ＰＤ−Ｌ１が結合された一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）であり、さらに好ましくはＹＷ２４３．５５．Ｓ７０である。

本発明に記載のホモダイマータンパク質の第一ペプチドと第二ペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示すアミノ酸配列を含むことが好ましい。前記ヘテロダイマータンパク質の第一ペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示すアミノ酸配列を含むことが好ましく、前記第二ペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、３７、３９、４１、４３、４５、４７に示すアミノ酸配列を含む。
本発明は、さらに、融合タンパク質の使用を提供しており、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１を腫瘍細胞に投与することで、腫瘍細胞の成長および／または移動を抑制できる。

本発明は、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質の腫瘍疾病の治療における使用、および、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質の薬物または試薬キットの製造における使用を提供する。前記腫瘍は、単独でＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の遮断に無効となる腫瘍または後期腫瘍であることは好ましく、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体の単独の治療に対して耐性がある、または無効になる腫瘍は好ましく、好ましくは、上記腫瘍がＢ細胞リンパ腫、結腸癌とメラノーマである。

本発明は、薬物製剤または薬物組成物を提供しており、前記薬物製剤の活性成分は本発明に記載の融合タンパク質ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１を含む。

本発明は、試薬キットを提供しており、前記試薬キットは本発明に記載の融合タンパク質ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１を含む。

本発明は、核酸分子を提供しており、前記核酸分子は、本発明に記載の融合タンパク質ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１をコードする。

前記核酸分子については、１）コード前記ホモダイマータンパク質をコードする核酸分子は、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示すヌクレオチド配列であり、
２）前記ヘテロダイマータンパク質をコードする核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、５、７、８、９、１０、３８、４０、４２、４４、４６、４８に示すヌクレオチド配列から選択することは好ましく、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４０、あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４２であることは好ましい。

本発明は、ベクターを提供しており、前記ベクターは上記核酸分子を含む。

本発明は、細胞を提供しており、前記細胞は、本発明に記載の融合タンパク質ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１あるいは融合タンパク質をコードする核酸分子を含み、融合タンパク質の生産に用いられる。前記細胞は、人以外の哺乳類動物の細胞から選択され、ＣＨＯとＨＥＫ２９３細胞は好ましい。

本発明は、腫瘍を治療する方法を提供しており、癌症患者へ有効量の融合タンパク質ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１の投与を含む。前記腫瘍は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断での単独治療に無効となる腫瘍である。

本発明は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の遮断での単独治療に无效となる腫瘍、または後期腫瘍を治療する方法を提供し、患者へ有效量のＩＦＮ−αと抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを含む。また、本発明は、ＩＦＮ−αと抗ＰＤ−Ｌ１抗体を同時に薬物組成物、薬物製剤または試薬キットの製造における用途を提供する。本発明は、さらに、ＩＦＮ−αと抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む薬物組成物、薬物製剤或試薬キットを提供しており、そのうち、上記のＩＦＮ−αは腫瘍内に投与される必要がある。

これを基に、本発明は、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体とＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１の併用療法、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体とＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質の薬物組成物或いは試薬キットを提供する。前記療法は、患者へ有效量の抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体とＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１を投与することを含み、前記投与は、順序に投与または同時に投与である。前記腫瘍は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の遮断での単独治療に耐性がある腫瘍、無効となる腫瘍、或いは後期腫瘍である。抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体の単独治療に耐性がある腫瘍、無効となる腫瘍は好ましい。或いは、前記腫瘍患者は、末梢リンパ球輸送欠陥／障碍に関する疾病があり、前記患者の末梢リンパ球は、腫瘍組織に移動できない。

本発明は、融合タンパク質ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１と抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体を同時に、腫瘍を治療する薬物組成物または試薬キットの製造における用途を提供する。前記腫瘍は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の遮断での単独治療に無効となる腫瘍、或いは後期腫瘍である。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の遮断で単独の治療耐性がある腫瘍、無効となる腫瘍、或いは後期腫瘍である。抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体の単独治療に耐性がある腫瘍、無効となる腫瘍は好ましい。或いは、前記腫瘍患者は、末梢リンパ球輸送欠陥／障碍に関する疾病があり、前記患者の末梢リンパ球は、腫瘍組織に移動できない。

本発明は、ＩＦＮ−αと抗ＰＤ−Ｌ１抗体を同時にＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の遮断での単独治療に无效となる腫瘍、あるいは後期腫瘍を治療する薬物組成物、薬物製剤或いは、試薬キットの製造における用途を提供し、前記ＩＦＮ−αは腫瘍内に投与する必要がある。

本発明は、ＩＦＮ−αと抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む薬物組成物、薬物製剤或いは試薬キットを提供し、前記ＩＦＮ−αは腫瘍内に投与する必要がある。

本発明は、融合タンパク質ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１の白血球のＩＦＮ受容体発現をアップレギュレートする用途を提供し、前記白血球は、ＣＤ４５＋細胞であることは好ましく、前記ＩＦＮ受容体はＩＦＮＡＲであることは好ましい。また、融合タンパク質ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１の白血球のＩＦＮ受容体発現をアップレギュレートする組成物の製造における用途を提供する。

本発明は、融合タンパク質ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１のＤＣ細胞あるいはＴＩＬ細胞の活性化における用途を提供する。また、融合タンパク質ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１の調整活性化ＤＣ細胞またはＴＩＬ細胞の組成物の製造における用途を提供する。

本発明は、融合タンパク質ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１の腫瘍常駐Ｔ細胞の活性化における用途を提供する。また、融合タンパク質ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１の腫瘍常駐Ｔ細胞の活性化の組成物の製造における用途を提供する。

上記の「用途」は、治療を目的とする用途、および、治療を目的としない用途とを両方指すことができる。

本発明は、ＩＦＮ−α４変異体を提供し、前記変異体は受容体との親和性が低下した突然変異であり、ｍＩＦＮ−α４（Ｌ３０Ａ） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５）、ｍＩＦＮ−α４（Ｒ１４４Ａ） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７）、ｍＩＦＮ−α４（Ａ１４５Ｇ） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９）、ｍＩＦＮ−α４（Ｒ１４９Ａ） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１）、ｍＩＦＮ−α４（Ｓ１５２Ａ） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３）、および／またはｈＩＦＮ−α２（Ｑ１２４Ｒ） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５）を含む。

本発明は、上記ＩＦＮ−α４変異体をコードする単離された核酸分子を提供しており、前記核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６、２８、３０、３２、３４、３６に示す通りである。

本発明は、ＩＦＮ−α４変異体の、治療腫瘍を治療する融合タンパク質或いは薬物の製造における用途を提供する。

用語と定義
特別に説明しない限り、本願に用いられる用語と定義はいずれも当分野における通常の意味であって、また、当業者に了解されている。

本願に使用されている通り、「腫瘍部位」という用語は、腫瘍細胞を含むか、または含むことが疑われるＩｎ ｖｉｖｏまたはＩｎ ｖｉｔｒｏの位置を指す。前記腫瘍部位には、固形腫瘍と、腫瘍が成長する場所に近いまたは隣接する場所が含まれる。

本願に使用されている通り、「投与」という用語は、全身および／または局所への投与を指す。「全身投与」という用語は、非局所投与を指し、その結果、投与された物質は、全身のいくつかの器官または組織に影響を及ぼし、或いは、投与された物質は、全身のいくつかの器官または組織を横断して、標的部位に到達し得る。例えば、受験者の循環系への投与の原因で、治療産物を、投与されたベクターによって複数の組織または器官で発現させることができ、または治療産物を、投与されたベクターによって特定の部位で発現させることができる。これは、例えば、自然の向性によるか、組織固有のプロモーター要素に動作可能にリンクされているためである。当業者は、全身投与が様々な形態の投与を包含することを理解し、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、腫瘍内投与、経口投与などを含むがこれらに限定されない。

「局所投与」という用語は、特定の部位またはその周辺での投与を指す。当業者は局所投与が、特定の部位への直接注射またはその周囲への注射（例えば、腫瘍内投与）などの様々な形態の投与を包含することを理解できる。

本明細書で使用されるとおり、「治療有効量」という用語は、疾患または状態（例えば、腫瘍退縮または腫瘍のサイズの縮小のための腫瘍／癌）の治療の目的を達成するために必要とされる本発明のインターフェロン、或いは、本発明のキット中の成分の量を指す。有効量は、特定の目的のために、実践および従来の方法で決定することができる。特に、治療有効量は、以下の目的を達成するために必要な量であり得る。癌細胞の数を減らす、腫瘍サイズを減らす、末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害する（すなわち、減速または停止する）、腫瘍の転移を阻害する（すなわち、減速または停止する）、腫瘍の成長を阻害する、および／または癌に関連する１つまたは複数の症状を緩和する。

「抗体」という用語は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、抗体断片（所望の生物学的または免疫学的活性を示す）を含む。本願では、「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語と抗体は同じ意味で使用される。抗体は、ＥＧＦＲ、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｎｅｕなどのような表面腫瘍抗原などの腫瘍抗原を特異的に標的とすることができる。

本発明の「腫瘍」は、Ｂ細胞リンパ腫、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、黒色腫、子宮または子宮内膜癌、口腔または喉の癌、肝臓癌、腎臓癌、胆管癌、小腸癌または虫垂癌、唾液腺癌、胸腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、脂肪腫、精巣癌、および悪性線維性組織球腫から選択することができる。

本発明の「腫瘍細胞」は、Ｂ細胞リンパ腫、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、メラノーマ、子宮癌または子宮内膜癌、口腔癌または喉癌、肝癌、腎臓癌、胆管癌、小腸癌または虫垂癌、唾液腺癌、胸腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、脂肪腫、精巣癌、および悪性線維性組織球腫の癌に由来する細胞から選択することができる。

本発明における「用途」または「使用」は、疾患治療または科学的研究などの非治療目的のための用途を意味することができる。

本発明の優れた效果：
１．本発明によって提供されるＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１およびＩＦＮ受容体の両方を標的とする。データからわかるように、ＴＭＥにおけるＩＦＮシグナルの活性化が、より強いＴ細胞活性化を誘導することによって進行腫瘍のＰＤ −１ ／ ＰＤ−Ｌ１治療を増強できる。

２．本発明によって提供されるＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質によれば、データからわかるように、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＤ−Ｌ１結合タンパク質）は、最小限の毒性で腫瘍組織に免疫調節分子を特異的に送達できる。本発明は、腫瘍標的治療のための新しい抗ＰＤ−Ｌ１抗体の発明の基礎を築く。

３．本発明によって提供されるＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質は、腫瘍微小環境におけるＰＤ−Ｌ１遮断およびＩＦＮ−α受容体（ＩＦＮＡＲ）活性化を標的とする複数のフィードフォワード応答を生成することができる。標的効果を高めるだけでなく、ＩＦＮ療法への反応を高め、抗ＰＤ−Ｌ１とＩＦＮの相乗効果を実現し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１療法とＩＦＮ耐性を克服する。実験データは、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１が腫瘍組織の標的、抗原提示細胞の活性化、またＰＤ−Ｌ１阻害シグナルの遮断を同時に実験ぢ、新世代の抗ＰＤ−Ｌ１抗体として腫瘍疾患への治療に使用できる。

４．本発明により提供されるＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質をＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断と併用て使用する場合、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１耐性腫瘍のほとんどを完全に排除するとともに、記憶Ｔ細胞免疫応答を誘発する。

５．本発明によって提供される融合タンパク質は、ホモダイマーおよびヘテロダイマーの２つの構造を有し、それぞれＩｎ ｖｉｖｏおよびＩｎ ｖｉｔｒｏで高いＩＦＮ受容体結合親和性、より効果的な抗ウイルス活性、および優れた腫瘍標的性、血清半減期およびＩｎ ｖｉｖｏでの腫瘍制御性を有する。

６．本発明によって提供される融合タンパク質は、親和性が低下した変異体ＩＦＮαを含み、より特異的な標的細胞結合能力を有し、ＩＦＮの末梢オフ標的効果を回避する。

Ｉ型ＩＦＮの局所投与は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断に対する進行腫瘍の耐性を克服した。（ａ）Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）に３ｘ１０^６個のＡ２０細胞を皮下接種し、初期腫瘍（＜５０ｍｍ^３）を有するマウスを１１日目と１５日目に２００μｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体で腹腔内投与した（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ（ｉｐ））。（ｂ）進行したＡ２０腫瘍（＞１００ｍｍ^３）（ｎ＝４）を有するマウスは、１５日目と１９日目に２００μｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体で治療された。腫瘍の成長は週に２回測定された。（ｃ）（ａ）および（ｂ）に従ってマウスを治療した。３日間の治療後、排液リンパ節の細胞を分離し、照射の有無にかかわらず２日間Ａ２０細胞と共培養した。ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ測定を実行した。（ｄ）Ａ２０担癌マウス（ｎ＝５）は、１１日目と１５日目に２００μｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体で治療され（ｉｐ）、および／または１１日目に２５μｇのＩＦＮα−Ｆｃで治療された（腫瘍内注射ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ （ｉ．ｔ．））。（ｅ）Ｃ５７ＢＬ ／ ６マウスに５×１０^５のＭＣ３８細胞を接種した（ｎ＝５）。９、１２、１５日目に２００μｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体で治療（ｉ．ｐ．）、および／または９日目に２５μｇのＩＦＮα−Ｆｃで治療した。生存曲線が表示された。（ｆ）Ａ２０担癌マウス（ｎ＝５）は、１１日目に２５μｇのＩＦＮα−Ｆｃ（ｉ．ｔ。または静脈注射（ｉ．ｖ．））で治療された。黒い矢印はＩＦＮα−Ｆｃによる治療を示している。データは平均±ＳＥＭを表し、少なくとも２つの独立した実験を表した。 ＊、ｐ ＜０．０５； ＊＊、ｐ ＜０．０１； ｎ．ｓ．、有意ではない。 ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質の構造と特性を示す。 （ａ）ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質のホモダイマーまたはヘテロダイマーの概略図、ｓｃＦｖ、一本鎖可変領域断片を示す。 （ｂ〜ｃ）ＩＦＮＡＲ１^−／−Ａ２０細胞（ｂ）およびＰＤ−Ｌ１^−／−Ａ２０細胞（ｃ）に示されるタンパク質の結合を示すフローサイトメトリーである。数字は平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示している。 （ｄ）抗ウイルス感染バイオアッセイによってＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１タンパク質の生物学的活性を測定した。 ＶＳＶ−ＧＦＰウイルスに感染する前に、Ｌ９２９細胞を各タンパク質とともに一晩培養した。さらに３０時間培養した後、ウイルスに感染した細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した。（ｅ〜ｆ）Ｂａｌｂ ／ ｃマウスに３×１０^６個のＡ２０細胞を接種した（ｎ ＝ ５）。腫瘍が確立した後、２０μｇの対応するタンパク質を腫瘍内注射（ｅ、１８日目と２２日目の治療）または静脈内注射（ｆ、１１日目と１５日目）し、腫瘍サイズを週に２回測定した。 （ｇ）Ｃ５７ＢＬ ／ ６マウスに５×１０^５のＭＣ３８細胞を接種した（ｎ ＝ ４〜８）。 １４日目と１８日目に、２５μｇのコントロールまたは融合タンパク質を静脈内注射した。 （ｈ〜ｉ）マウスに２５μｇの示されたタンパク質を静脈内注射した。 ＥＬＩＳＡにより、さまざまな時点で腫瘍組織（ｈ）または血清（ｉ）のタンパク質濃度を測定した。データは平均±ＳＥＭを表し、少なくとも２つの独立した実験を表した。 ＊、ｐ ＜０．０５； ＊＊、ｐ ＜０．０１。 ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質は、副作用が少なく、Ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果が良好である。 （ａ〜ｂ）１００μｇのＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１ヘテロダイマーまたはＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＨＢｓタンパク質を、０日目と４日目に担癌マウスに静脈内注射した。図は、マウスの生存曲線（ａ）と体重の変化（ｂ）を示している。 （ｃ）１００μｇのＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１ヘテロダイマーまたはＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＨＢｓタンパク質をＭＣ３８担癌マウスに静脈内注射した。注射後６時間または２４時間で血清を採取した。サイトカインミクロスフェア検出技術（ＣＢＡ）によって、血清サイトカインレベルを測定した。（ｄ）１１日目と１５日目に、ＩＦＮα−Ｆｃ（１２．５μｇ）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（１２．５μｇ）、ＩＦＮα−Ｆｃと抗ＰＤ−Ｌ１抗体の混合物（１２．５μｇ＋１２．５μｇ）、またはＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質ヘテロダイマー（２５μｇ）を静脈内注射して、Ａ２０担癌マウス（ｎ ＝ ５）を治療した。腫瘍サイズは週に２回測定された。 （ｅ）ＭＣ３８担癌マウスを２５μｇのコントロールタンパク質またはＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１ヘテロダイマーで処理した。 ２日後、腫瘍組織を収集し、ＰＤ−Ｌ１レベルをフローサイトメトリーで測定した。 ＦＭＯ、蛍光マイナス１。 （ｆ）マウスを（ｅ）のように扱った。 ２日後に腫瘍組織を採取した。 ＣＤ４５陰性およびＣＤ４５陽性細胞におけるＩＦＮＡＲのレベルは、フローサイトメトリーによって測定された。データは平均±ＳＥＭを表し、少なくとも２つの独立した実験を表した。 ＊、ｐ ＜０．０５； ＊＊、ｐ ＜０．０１； ＊＊＊、ｐ ＜０．００１； ｎ．ｄ．、検出不可； ｎ．ｓ．、有意ではない。 宿主または腫瘍細胞で発現したＰＤ−Ｌ１は、ＩＦＮ−ＡＮＴＩ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質の抗腫瘍効果を効果的に媒介することができる。（ａ）フローサイトメトリーにより、ＷＴ Ａ２０、ＰＤ−Ｌ１^−／−Ａ２０、ＷＴ ＭＣ３８、およびＰＤ−Ｌ１^−／−ＭＣ３８細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現を測定した。 （ｂ）３０μｇのＩＦＮ−ＡＮＴＩ−ＰＤ−Ｌ１ヘテロダイマーをＷＴまたはＰＤ−Ｌ１^−／−担癌マウスに静脈内注射した。腫瘍組織は、注射後の異なる時点で収集された。融合タンパク質の濃度はＥＬＩＳＡによって測定された。 （ｃ）１１日目および１５日目のコントロールＩｇまたはＩＦＮ−ＡＮＴＩ−ＰＤ−Ｌ１によりＷＴまたはＰＤ−Ｌ１^{− ／ −}Ａ２０担癌マウスを処理した（ｎ＝４〜５）。腫瘍の成長は週に２回測定された。 （ｄ）８日目と１２日目に、ＷＴまたはＰＤ−Ｌ−／−ＭＣ３８担癌マウスをコントロールＩｇまたはＩＦＮ−ＡＮＴＩ−ＰＤ−Ｌ１で処理した（ｎ ＝ ５〜６）。 （ｅ）ＭＣ３８担癌マウスをＩＦＮ−ＡＮＴＩ−ＰＤ−Ｌ１で処理した。 ２日後、腫瘍組織が収集された。 ＣＤ４５陰性およびＣＤ４５陽性細胞のＰＤ−Ｌ１レベルは、フローサイトメトリーによって評価された。 （ｆ）ＰＤ−Ｌ１^−／−マウスにＭＣ３８細胞を接種する（ｎ＝４〜５）。１４日目と１８日目にマウスを２５μｇのコントロールＩｇまたはＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１で処理した。腫瘍の成長は週に２回測定された。データは平均±ＳＥＭを表し、少なくとも２つの独立した実験を表した。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；ｎ．ｓ．、有意ではない。 宿主細胞によって発現されるＩＦＮＡＲは、腫瘍の制御に不可欠である。（ａ）１１日目でＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１によりＡ２０担癌マウスを処理した（ｎ＝５）。ＩＦＮＡＲシグナル伝達経路を遮断するために、１１日目と１４日目にマウスを１００ μｇの抗ＩＦＮＡＲ遮断抗体腫瘍内注射（ｉ．ｔ．）で処理した。 （ｂ）フローサイトメトリーにより、ｉｎｖｉｖｏの（Ｂ２２０ ＋）ＷＴまたはＩＦＮＡＲ^−／−Ａ２０腫瘍細胞におけるＩＦＮＡＲの発現を評価した。（ｃ）１６日目および１９日目のＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１によりＩＦＮＡＲ^−／−Ａ２０担癌マウスを治療した（ｎ＝６）。腫瘍の成長は週に２回測定された。（ｄ）５×１０^５個のＭＣ３８細胞にＷＴまたはＩＦＮＡＲ１^−／−マウスを接種した。１０日目と１３日目にマウスを２５μｇのＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１で処理した（ｎ＝４〜５）。（ｅ）１１日目と１４日目のＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１により担癌マウスを治療した（ｎ＝５〜６）。抗ＣＤ８欠失抗体は９、１２、１６日目に投与された。（ｆ）ＩＦＮ−ＡＮＴＩ−ＰＤ−Ｌ１治療の２日後、ＭＣ３８腫瘍組織が分離された。腫瘍浸潤性ＤＣにおけるＣＤ８６（ＣＤ１１ｃ ＋ ＭＨＣＩＩ ＋）の発現は、フローサイトメトリーによって測定された。左の写真は代表的なパターンで、右の写真はＭＦＩを示した。データは平均±ＳＥＭで表され、少なくとも２つの独立した実験を表した。 ＊、ｐ ＜０．０５； ＊＊、ｐ ＜０．０１； ＊＊＊、ｐ ＜０．００１； ｎ．ｓ．、有意ではない。 ＰＤ−１の遮断により、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１がフィードフォワード抗腫瘍反応の誘発がさらに確保される。（ａ）Ａ２０担癌Ｂａｌｂ／ｃマウスを１５日目に２０μｇのＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１および／または１４日目と１７日目に１００μｇの抗ＰＤ−１抗体で処理した（ｎ＝４〜５）。腫瘍の成長は週に２回測定された。（ｂ）１１日目と１４日目に２５μｇのＩＦＮ−ＡＮＴＩ−ＰＤ−Ｌ１、および／または１２日目と１５日目に１００μｇの抗ＰＤ−１抗体によりＢ１６担癌Ｃ５７ＢＬ ／６マウスを治療した（ｎ＝３〜５）。（ｃ）（ａ）併用療法後に腫瘍が完全に解消したマウス（ｎ＝４）では、２．５×１０ ^７Ａ２０細胞に腫瘍を再接種した。 Ａ２０細胞を接種したナイーブマウスを対照として使用した。 （ｄ）（ａ）で同じＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１およびａｎｔｉ−ＰＤ−１でマウスを治療した（ｎ＝４）。細胞を枯渇させるために、抗ＰＤ−１抗体治療の前日からマウスに２００μｇの抗ＣＤ８抗体を注射した。 （ｅ）（ａ）に記載されているように、マウスをＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１および／またはａｎｔｉ−ＰＤ−１で処理した。治療の１２日後、腫瘍排出リンパ節を分離し、単一細胞懸濁液を調製した。細胞は、照射または非照射のＡ２０と共培養された。 ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ測定を実行した。（ｆ）Ａ２０担癌マウスから腫瘍浸潤性ＤＣ（ＣＤ１１ｃ ＋）およびＴ（ＣＤ８ ＋）細胞を分離し、照射されたＡ２０細胞の存在下で共培養した。 ＩＦＮαまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を培地に添加した。３日後、上清を回収し、ＩＦＮγレベルをＣＢＡで測定した。（ｇ）（ａ）に記載されているように、Ａ２０担癌マウスをＩＦＮ−ＡＮＴＩ−ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＰＤ−１で処理する（ｎ＝５〜６）。ＦＴＹ７２０は１４日目から１日おきに投与された。腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞を除去するために、１４日目と１７日目に３０μｇの抗ＣＤ８抗体を腫瘍に注射した。黒と青の矢印は、それぞれ抗ＰＤ−１による治療、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１による治療を示す。データは平均±ＳＥＭを表し、少なくとも２つの独立した実験を表した。 ＊、ｐ ＜０．０５； ＊＊、ｐ ＜０．０１； ＊＊＊、ｐ ＜０．００１。 ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１ヘテロダイマーは、腫瘍組織を特異的に標的とし、毒性が弱い。（ａ）３０μｇのＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１をＭＣ３８担癌マウスに静脈内注射した。注射の１、３、５日後に組織を採取した。融合タンパク質濃度はＥＬＩＳＡによって測定された。（ｂ）図３ｃに示すようにＭＣ３８担癌マウスを処理し、注射の６時間後または２４時間後に血清を収集した。血清中のサイトカインレベルはＣＢＡによって測定された。データは平均±ＳＥＭを示し、２つの重複した実験を表した。 ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１は、腫瘍浸潤性ＤＣにおけるＣＤ８０の発現をアップレギュレートする。ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１治療の２日後、ＭＣ３８腫瘍組織が分離された。フローサイトメトリーを使用して、腫瘍浸潤性ＤＣ（ＣＤ１１ｃ ＋ ＭＨＣＩＩ ＋）におけるＣＤ８０の発現を検出した。 ＮＫおよびＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＰＤ−１抗体とＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１の併用によって媒介される抗腫瘍反応において有意な役割を果たしていなかった。図６ａに示すように、Ａ２０担癌マウスを処理した（ｎ ＝ ４〜５）。 （ａ）ＮＫ細胞を除去するために、２０μｇの抗シアル酸ＧＭ１抗体を１３日目から週２回腹腔内注射した。 （ｂ）ＣＤ４ ＋ Ｔ細胞を除去するために、２００μｇの抗ＣＤ４抗体を１３日目から週２回腹腔内注射した。腫瘍の成長は週に２回測定された。データは平均±ＳＥＭを表し、２つの重複した実験を表した。黒と青の矢印は、それぞれ抗ＰＤ−１とＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１による処理を示した。 （ｃ）図６ｅに従ってマウスを処理し、脾臓を分離して、単一細胞懸濁液を調製した。細胞は、照射または非照射のＡ２０と共培養された。 ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ測定を実行した。 ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１抗体（ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１）によって媒介される抗腫瘍効果の概略モデルである。抗ＰＤ−Ｌ１は特異的にＩＦＮを腫瘍組織に運んだ（１）。インターフェロンで介されたＰＤ−Ｌ１のアップレギュレーションは、腫瘍特異的なターゲティングを強化した（２および３）。この抗体は、ＰＤ−Ｌ１ ／ ＰＤ−１シグナル伝達経路を遮断して、免疫ブレーキシグナルを放出した（３）。さらに、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１はＩＦＮＡＲの発現をアップレギュレートし（４）、これで腫瘍は治療に対してより敏感になった（５）。要するに、これらの要因はＴ細胞応答を（再）活性化することで腫瘍の成長を制御した（６）。 ＩＦＮα親和性が低下した変異体を構築した。 Ｉ型インターフェロンと受容体の間の相互作用の重要な部位に対して単一の部位特異的選択的変異を作った。 ＩＦＮα−Ｆｃ変異体の活性を検出した。ＩＦＮα−Ｆｃ変異体の生物学的活性は、抗ウイルス感染バイオアッセイによって測定された。 ＶＳＶ−ＧＦＰウイルスに感染する前に、Ｌ９２９細胞を各タンパク質とともに一晩培養した。さらに３０時間培養した後、フローサイトメトリーによってウイルス感染細胞の割合を測定し、異なる濃度のタンパク質の細胞感染への阻害率とＥＣ５０値を計算した。２つの変異体Ｒ１４４ＡとＡ１４５Ｇは活性が弱く、潜在的に好ましい標的であった。 変異体ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１のｉｎｖｉｔｒｏターゲティングテストである。ＷＴ ＰＤ−Ｌ１ ^＋ Ａ２０細胞と、前もって実験室でＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９テクノロジーでノックアウトされたＰＤ−Ｌ１−／−Ａ２０細胞を使用し、異なる濃度の二重特異性タンパク質を追加して７２時間インキュベートし、ＣＣＫ８キットによって異なる濃度のタンパク質の処理下の細胞の増殖結果を検出した。ＰＤ−Ｌ１−Ａ２０細胞とＰＤ−Ｌ１ ＋ Ａ２０細胞のＥＣ５０の比率は、この二重特異性タンパク質のターゲティングを反映できた。ｗｔ−ｍＩＦＮａ４−Ｆｃのデータで比率を正規化した後、Ｒ１４４ＡとＡ１４５Ｇはターゲティングの優れた二種類の突然変異であった。

本発明については、以下の例でさらに詳しく説明するが、本発明は以下の内容に限定されないことを理解されたい。

材料と方法：
マウス：
雌（６〜８週齢）のＢＡＬＢ ／ ｃマウスとＣ５７ＢＬ ／ ６マウスは、Ｗｅｉｔｏｎｇ Ｌｉｈｕａ（北京、中国）から購入した。 すべてのマウスは、ＳＰＦフリーの条件下で生物物理学研究所の動物室に保管される。 動物の世話と実験は、中国科学院生物物理学研究所のガイドラインに従って行われ、ＩＡＣＵＣ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｉｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ ＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認されたプロトコルに従った。 ＰＤ−Ｌ１^−／−およびＩＦＮＡＲ１^−／−マウスは、ＵＴの南西医療センターでＳＰＦ条件下で飼育された。 動物プロトコルはＮＩＨガイドラインに準拠する。 この研究は、ＵＴサウスウエスタンメディカルセンターの動物管理使用委員会によって承認された。

細胞株および試薬：
２９３Ｆ細胞は、Ｘｕ Ｔｉｎｇ博士（Ｋａｎｇ Ｎｉｎｇ Ｊｅｒｒｙ、蘇州市、江蘇省、中国）から提供され、ＳＭＭ ２９３−ＴＩ培地（Ｍ２９３ＴＩ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）で培養された。Ａ２０、ＭＣ３８、およびＬ９２９セルラインは、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。抗ＰＤ−１遮断抗体（４Ｈ２）は、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手した。抗ＰＤ−Ｌ１抗体（１０Ｆ．９Ｇ２）および抗ＩＦＮＡＲ１抗体（ＭＡＲ１−５Ａ３）は、ＢｉｏＸＣｅｌｌ（Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ）から購入した。抗ＣＤ８（ＴＩＢ２１０）および抗ＣＤ４欠失抗体（ＧＫ１．５）は実験室で調製された。抗シアル酸ＧＭ１抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。

ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質の構築：
ヘテロダイマー：特許（特許番号：ＵＳ８２１７１４９Ｂ２）によると、ＰＤ−Ｌ１結合タンパク質（ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０）配列の軽鎖および重鎖可変領域が合成された。軽鎖と重鎖の配列をＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカーを介して接続し、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５）を重鎖のＣ末端に挿入して、ＳｃＦｖ（ＰＤ−Ｌ１）−Ｆｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）と命名し、ヘテロダイマーの第一ポリペプチドを取得した。次に、ＳｃＦｖ（ＰＤ−Ｌ１）−Ｆｃのコーディング核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）をｐＥＥ１２．４ベクター（Ｌｏｎｚａ）にクローン化した。マウスＩＦＮ−α４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３）のｃＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４）をクローン化し、（Ｇ４Ｓ）_４リンカーを介してヒトＩｇＧ１ ＦｃのＮ末端に挿入し、ヘテロダイマーの第二ポリペプチドｍＩＦＮα４−Ｆｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）を発現させて取得した。ｍＩＦＮα４−Ｆｃをコードするヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）をｐＥＥ６．４ベクター（Ｌｏｎｚａ）にクローン化した。 ＰＤ−Ｌ１結合タンパク質とＩＦＮαのヘテロ二量体化は、以前に報告されたノブツーホール（ｋｎｏｂ−ｔｏ−ｈｏｌｅｓ）技術を使用して生成された。プラスミドを２９３Ｆ細胞に１：２の比率で一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション後７日目に上清を回収した。取扱説明書（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）に従ってプロテインＡ−セファロースカラムを使用して融合タンパク質を精製した。

ヘテロダイマーの調製中に、異なるＩ型インターフェロンを使用して、第二ポリペプチドｍＩＦＮｂ−Ｆｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示す核酸をコードする）、ｈＩＦＮα２−Ｆｃ（コーディング核酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示す通り）、ｈＩＦＮｂ−Ｆｃ（コーディング核酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に示す通り）、ｍＩＦＮγ−Ｆｃ（コーディング核酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０に示す通り）も使用した。生成されたヘテロダイマーは、腫瘍細胞増殖の阻害という良好な効果があった。上記のヘテロダイマー融合タンパク質の中で、ＩＦＮα−Ｆｃが特に効果的であり、ｍＩＦＮα４−ＦｃとＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１から構成されるヘテロダイマー融合タンパク質が最も効果的である。関連する詳細な比較データはここには示されていない。

ホモダイマー：マウスＩＦＮ−α４のＣ末端をＳｃＦｖ（ＰＤ−Ｌ１）−ＦｃのＮ末端に接続して、ホモダイマー融合タンパク質の第１および第２ポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）を取得した。ヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）をｐＥＥ１２．４ベクターにクローン化し、トランスフェクション後、Ｆｃ二量体化によりホモダイマータンパク質を自発的に形成した。

フローサイトメトリー
ＰＥ−ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、融合タンパク質の結合を検出した。特異的抗体：抗ＰＤ−Ｌ１抗体（１０Ｆ．９Ｇ２）、抗ＩＦＮＡＲ１抗体（ＭＡＲ１−５Ａ３）、抗ＣＤ４５抗体（３０−Ｆ１１）、抗ＣＤ８０抗体（１６−１０Ａ１）、抗ＣＤ８６抗体（ＧＬ１） ＢｉｏＬｅｇｅｎｄまたはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅに由来した。細胞をＦＡＣＳバッファー（１％ウシ血清アルブミンおよび０．０５％ＮａＮ_３）に懸濁し、抗ＣＤ１６／３２抗体（抗ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ受容体、クローン２．４Ｇ２）で３０分間ブロッキングし、次に特異的抗体で氷上で３０分間染色した。サンプルは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒまたはＦｏｒｔｅｓｓａ ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析された。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用してデータを分析した。

ＩＦＮα抗ウイルス活性
ＶＳＶ感染に敏感なＬ９２９マウス線維芽細胞を使用して、ＩＦＮの生物学的活性を定量化した。細胞を段階希釈したＩＦＮα−ＦｃまたはＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１とともに３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞をＭＯＩ＝５のＶＳＶ−ＧＦＰに感染させ、さらに３０時間培養した。次に、細胞を収集し、４％ＰＦＡで固定した。 ＦＡＣＳＦｏｔａｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用してデータを分析した。 ＧＦＰ陽性細胞はウイルス感染細胞として定義された。

Ｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質分布の定量定量化研究
Ｂａｌｂ ／ ｃマウスの右側にＡ２０細胞（３×１０^６）を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。１５日目に、マウスに３０μｇのＩＦＮα−ＦｃまたはＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１を静脈注射した。 ３日目の灌流後、異なるマウス組織を収集し、異なる器官のホモジネート抽出物中のヒトＦｃのレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。

腫瘍の成長と治療
Ｂａｌｂ／ｃマウスの右側にＡ２０細胞（３×１０^６）を皮下注射した。 ２０μｇのＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１を静脈内注射した。ＰＤ−１シグナル伝達を遮断するために、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１治療の１日前に２週間に１回、マウスに１００μｇの抗ＰＤ−１抗体（４Ｈ２）を静脈内投与した。 ＣＤ８＋Ｔ細胞を除去するために、２００μｇの抗ＣＤ８抗体（ＴＩＢ２１０）をＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１治療の１日前に腹腔内注射した。Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を遮断するために、１００μｇの抗ＩＦＮＡＲ１抗体（ＭＡＲ１−５Ａ３）をＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１治療の１日前に注射した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側に５×１０^５のＭＣ３８細胞を皮下注射した。マウスに２５μｇのＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１を２回静脈内注射した。腫瘍体積は週に２回測定され、（長さ×幅×高さ／２）として計算された。リンパ球の輸送を遮断するために、マウスに２５μｇのＦＴＹ７２０を腹腔内注射し、遮断を維持するために２０μｇのＦＴＹ７２０を１日おきに投与した。

ＥＬＩＳＰＯＴは腫瘍抗原特異的なＴ細胞を検出した。
リンパ節（ＬＮ）または脾臓を担癌マウスから分離して、単一細胞懸濁液を調製した。６０Ｇｙｓの単回投与（１０Ｇｙｓ ／分、６分）を使用して、Ａ２０腫瘍細胞を照射した。脾細胞またはＬＮ細胞と照射された腫瘍細胞を４：１の比率で４８時間共培養した。製造元のプロトコル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従って、ＩＦＮ−γの生成はＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイキットを使用して測定された。イムノスポットアナライザー（ＣＴＬ）でサイトカインスポットを計算した。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養および機能分析
腫瘍組織を収集し、小片に切断し、消化バッファー（１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶおよび１００μｇ／ｍｌＤＮａｓｅ Ｉを含むＲＰＭＩ−１６４０培地）に再懸濁した。 ３７°Ｃで４５分間消化した後、７０μｍセルストレーナーで単細胞懸濁液を作成し、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＤＣ（ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋）をＦＡＣＳで選別した。Ｔ細胞、ＤＣ、および照射された腫瘍細胞は、ＩＦＮα（２ｎｇ ／ ｍｌ）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（１０μｇ／ ｍｌ）の条件下で１０：１：２．５の比率で培養された。 ３日後、上清を回収し、ＩＦＮ−γレベルをＣＢＡで測定した。

統計分析
データは平均±ＳＥＭとして示された。対になっていないｓｔｕｄｅｎｔ’ｓの両側ｔ検定を使用して、統計分析を比較した。分析にはＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用した。 ＊、＊＊、および＊＊＊で、それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、およびｐ＜０．００１の統計的に有意な差を示した。

実施例１：Ｉ型ＩＦＮの局所投薬は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断療法に対する腫瘍抵耐性を克服した。

最近の研究では、免疫チェックポイント遮断で治療された患者の臨床反応は、Ｔ細胞の活性化状態と腫瘍量に関連していることが示された。これと一致して、本発明は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が小さなＡ２０腫瘍（＜５０ｍｍ^３）において効果的な腫瘍制御を示すことを見出した（図１ａ）。逆に、腫瘍が大きくなると（＞１００ｍｍ^３）、抗腫瘍効果は大幅に低下した（図１ｂ）。後期腫瘍は、抗腫瘍免疫応答を阻害するためのさまざまなメカニズムを形成している可能性があった。実際、小さな腫瘍と大きな腫瘍のＴ細胞活性化を比較すると、ＰＤ−Ｌ１遮断は小さな腫瘍の強いＴ細胞活性化を誘発するが、同じ治療は後期腫瘍のＴ細胞に限定的な影響しか及ぼさないことが観察された（図１ｃ）。このデータは、Ｔ細胞の活性化の不十分が、後期腫瘍が免疫チェックポイント遮断療法に効果的に反応できない理由である可能性があることを示唆した。

この仮説をテストするために、Ｉ型ＩＦＮ（細胞毒性Ｔ細胞へのクロスサブミッションを強化する強力なサイトカイン）を提供することでＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断療法を改善できるかどうかを調査するための実験が設計された。後期腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１遮断とＩＦＮα併用療法で治療された。抗ＰＤ−Ｌ１抗体もＩＦＮα（ＩＦＮα４）も単独では腫瘍を制御できず、すべての腫瘍が最終的に進行した（図１ｄ）。印象的なことに、併用療法はより強力な抗腫瘍効果を誘発し、すべての治療されたマウスは、腫瘍の完全な根絶をもたらした（図１ｄ）。同様の相乗効果が別の腫瘍モデルＭＣ３８でも見られた（図１ｅ）。Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達は、ＩＦＮαの腫瘍内送達が腫瘍の成長を効果的に制御するため、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）で局所的に作用した（図１ｆ）。反対的に、ＩＦＮが全身的に配信されると、これらの影響は完全になくなった。

要約すると、上記のデータは、Ｉ型ＩＦＮとＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断療法が相乗効果を持ち、後期腫瘍を制御できることを示した。これは、最適な抗腫瘍効果を達成するために、インターフェロンをＴＭＥに標的とさせる必要があることも示した。

実施例２：腫瘍組織へのＩＦＮの特異的送達のためのＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質の構築
ほとんどの患者は、インターフェロンによる、腫瘍への局所薬投与が実施されることができない。さらに、Ｉ型ＩＦＮの全身送達は、通常、有限的な抗腫瘍活性と重篤な副作用がある。サイトカインを含む標的抗体は、免疫調節分子の局所送達のための効果的な戦略であることが証明されている。ただし、治療標的となる腫瘍特異的分子を特定することは非常に困難である。ＰＤ−Ｌ１は腫瘍組織で高度に発現していることが報告されている。最近の研究では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体がＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍組織に特異的に蓄積することが示されている。また、ＩＦＮは、その抗腫瘍機能に加えて、ＰＤ−Ｌ１の発現を強力に誘導し、腫瘍に対するＴ細胞の反応を阻害する可能性がある。この中和効果を克服し、ＴＭＥにおける免疫（再）活性化の相互促進を実現するために、本発明は、ＩＦＮおよび抗ＰＤ−Ｌ１抗体を使用して融合タンパク質ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１を構築することで、腫瘍組織におけるＰＤ−Ｌ１の発現をさらにアップレギュレートすることができ、これにより、抗体の蓄積が増加することを提案する。

この仮説を検証するために、本発明は、ホモダイマーまたはヘテロダイマーの形態として抗ＰＤ−Ｌ１抗体一本鎖可変領域フラグメント［ｓｃＦｖ（ＰＤ−Ｌ１）］およびＩＦＮαを含む融合タンパク質を生成した（図２ａ）。得られたＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質（ＩＦＮ−α４を使用）を評価するために、ＰＤ−Ｌ１またはＩＦＮ−α受容体１（ＩＦＮＡＲ１）との親和性を試験した。Ａ２０細胞は、ＰＤ−Ｌ１受容体とＩＦＮ受容体の両方も陽性である。したがって、Ａ２０細胞の１つの受容体をノックアウトし、融合タンパク質と別の受容体の結合をテストした。ＰＤ−Ｌ１を発現するＩＦＮＡＲ１^−／−Ａ２０細胞では、融合タンパク質は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と同様の親和性を示した（図２ｂ）。ＩＦＮＡＲを発現するＰＤ−Ｌ１^−／−Ａ２０細胞では、ＩＦＮ−Ｆｃまたはホモダイマーと比較して、ヘテロダイマーの結合が減少した（図２ｃ）。

注記：「＋」は結合強度を意味し、「−」は結合なしを意味し、空白は実験なしを意味した。

融合タンパク質は、Ｌ９２９細胞が小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）により感染されることを効果的に避け、ＩＦＮの抗ウイルス活性が変化しないことを示した（図２ｄ）。

要約すると、これらのデータは、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１のホモダイマーおよびヘテロダイマー融合タンパク質が、効果的なＩＦＮ生物学的活性を維持しながらＰＤ−Ｌ１に結合できることを示した。

実施例３：後期腫瘍を制御するための抗ＰＤ−Ｌ１を介したＩＦＮの標的送達
Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（ＩＦＮ−α４）融合タンパク質の強力な活性を考慮して、我々は、それがＩｎ ｖｉｖｏで腫瘍増殖を制御できるかどうかをさらに研究した。進行したＡ２０腫瘍のマウスを融合タンパク質（ｉ．ｔ．）で治療した。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は腫瘍の成長を制御できませんでしたが、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質のヘテロダイマーとホモダイマーはほとんどの治療マウスで抗ＰＤ−Ｌ１耐性を克服して、完全な腫瘍退縮を誘発した（２ｅ）。

融合タンパク質の標的効果を試験するために、Ａ２０担癌マウスを融合タンパク質で体系的に治療した。驚くべきことに、ホモダイマーはＩＦＮ受容体への結合親和性が高く、ｉｎ ｖｉｔｒｏでより効果的な抗ウイルス活性を示したが（図２ｃおよび２ｄ）、ｉｎ ｖｉｖｏで送達した場合、ホモダイマーではなくヘテロダイマーのみは、腫瘍の成長を効果的に抑制することができた（図２ｆ）。ＭＣ３８モデルでも同様の効果が観察された（図２ｇ）。この違いがｉｎ ｖｉｖｏでの異なるダイナミクスによるものかどうかを知りたかった。さらなる実験結果は、ホモダイマーと比較して、腫瘍組織におけるヘテロダイマーの蓄積レベルがはるかに高いことを示した（図２ｈ）。さらに、ヘテロダイマーの血清半減期は大幅に増加した（図２ｉ）。これらのデータはまた、ヘテロダイマーがより 優れた抗腫瘍効果を有することを示唆しており、ヘテロダイマーがＩｎ ｖｉｖｏ研究のより優れた候補であることを示した。

要約すると、これらのデータは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるＩＦＮの標的送達が効果的な抗腫瘍効果を誘発し、腫瘍制御の改善につながることを示した。

実施例４：腫瘍を標的としたＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１は、毒性が低く、強い抗腫瘍活性を示した
Ｉ型ＩＦＮの使用は、システム配信中の深刻な副作用のために制限されている。ＩＦＮ（ＩＦＮ−α４）を有する抗ＰＤ−Ｌ１抗体のｉｎ ｖｉｖｏ毒性をテストするために、高用量のヘテロダイマー（ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１）または非標的コントロールＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＨＢｓ（ａｎｔｉ−Ｂ肝炎ウイルス表面タンパク質）融合タンパク質を使用した。ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＨＢｓの２回目の注射後、担癌マウスは重度の体重減少、活動低下、毛皮のひだとの症状が現れ、すべてのマウスは１日以内に死亡した（図３ａ）。反対的に、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１で処理されたマウスはいずれも、死亡しておらず、軽度の体重減少後に回復した（図３ａおよび３ｂ）。ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質は腫瘍に蓄積したが、正常組織には蓄積しなかった（図７ａ）。

副作用をよりよく評価するために、最初の注射後に血清サイトカインレベルを測定した。印象的なのは、非標的ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＨＢｓが炎症性サイトカインＴＮＦ、ＩＦＮ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の高度な発達を誘発した（図３ｃおよび図７ｂ）。

ＩＦＮ−ＦＣと抗ＰＤ−Ｌ１抗体の単純な混合物は、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質のような相乗効果を生み出さなかったため、腫瘍特異的ターゲティングは融合タンパク質の抗腫瘍効果に不可欠であった（図３ｄ）。

要約すると、これらのデータは、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１が腫瘍組織を標的にして腫瘍の成長を阻害でき、毒性の副作用が少ないことを示した。

実施例５：ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１アップレギュレートＴＭＥにおけるＰＤ−Ｌ１とＩＦＮＡＲ受容体
Ｉ型ＩＦＮはＰＤ−Ｌ１発現を誘導するための最も効果的なサイトカインであるため、ＴＭＥのＰＤ−Ｌ１レベルは、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（ＩＦＮ−α４ヘテロダイマー）による全身治療後に測定された。ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１は、腫瘍組織におけるＰＤ−Ｌ１の発現を有意に増加させた（図３ｅ）。ＰＤ−Ｌ１発現の増加は、融合タンパク質の腫瘍特異的蓄積を促進する可能性がある。興味深いことに、ＣＤ４５ ＋細胞（白血球）のＩＦＮ受容体のレベルも増加し（図３ｆ）、細胞がＩＦＮ処理に対して感じやすくなった。要約すると、データは、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１が複数のフィードフォワード応答を生成したが、これにより、腫瘍のターゲティングと抗腫瘍効果がさらに強化される可能性があることを示した。

実施例６：インターフェロン融合タンパク質の抗腫瘍作用に対して腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１のは必要でない
多くの腫瘍細胞は、免疫応答を回避するための戦略としてＰＤ−Ｌ１を過剰発現する。ＰＤ−Ｌ１は、腫瘍外の多くの細胞で炎症性サイトカインによってさらに誘発される可能性がある。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断療法が腫瘍細胞に作用するのか、或いは非腫瘍細胞に発現されるＰＤ−Ｌ１に作用するのかは、まだ結論付けられていない。腫瘍細胞中のＰＤ−Ｌ１がＩＦＮを有する抗ＰＤ−Ｌ１抗体に必要かどうかを確定するために、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して腫瘍細胞中のＰＤ−Ｌ１をノックアウトした。ＰＤ−Ｌ１の発現は、ノックアウト後のＡ２０およびＭＣ３８腫瘍細胞で完全に排除された（図４ａ）。ＩＦＮｓはＰＤ−Ｌ１の発現を誘発する可能性がある。ＩＦＮαによって刺激された場合、野生型（ＷＴ）細胞はＰＤ−Ｌ１をアップレギュレートしたが、ノックアウト細胞は依然としてＰＤ−Ｌ１を発現しなかった（データは示していない）。

腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１がターゲティングに必要かどうかをテストするために、融合タンパク質ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（ＩＦＮ−α４ヘテロダイマー）を使用してＷＴまたはＰＤ−Ｌ１ノックアウト（ＰＤ−Ｌ１−／−）の担癌マウスを処理した。腫瘍組織のタンパク質レベルを測定した。驚いたことに、腫瘍細胞がＰＤ−Ｌ１を発現しているかどうかに関係なく、融合タンパク質は腫瘍組織に蓄積した（図４ｂ）。ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１を使用して腫瘍を治療するとき、ＰＤ−Ｌ１ノックアウト腫瘍とＷＴ腫瘍の両方を効果的に制御できた（図４ｃおよび４ｄ）。これらのデータは、腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１が抗腫瘍効果に必要ではないことを示した。

前のデータは、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１がＴＭＥでのＰＤ−Ｌ１の発現をアップレギュレートするようフィードフォワードループを作成することを示した（図３ｅ）。腫瘍細胞と間質細胞の両方がＰＤ−Ｌ１を発現できるため、腫瘍組織の異なる細胞サブグループでＰＤ−Ｌ１の発現レベルをテストした。ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１治療は、腫瘍および間質細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現を有意にアップレギュレートした（図４ｅ）。腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１は必要ないので、宿主細胞にＰＤ−Ｌ１が必要かどうかを知りたかった。興味深いことに、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−Ｌ１欠損マウスの腫瘍増殖をうまく制御した（図４ｆ）。要約すると、これらのデータは、宿主細胞または腫瘍細胞で発現されたＰＤ−Ｌ１が、融合タンパク質の腫瘍標的化および抗腫瘍効果を媒介するのに十分であることを示した。

実施例７：ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質はＴＭＥにおけるＡＰＣとＴ細胞の活化促進
次に、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達が抗腫瘍効果に必要かどうかを調査した。ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質（ヘテロダイマー）での治療中に、マウスを抗ＩＦＮＡＲ遮断抗体で処理した。抗ＩＦＮＡＲ抗体は、融合タンパク質の抗腫瘍効果を完全に排除し、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の重要な役割を示唆した（図５ａ）。

ＩＦＮＡＲは腫瘍と宿主細胞で発現した。腫瘍細胞のＩＦＮ受容体が必要かどうかをテストするために、腫瘍細胞のＩＦＮＡＲ１をノックアウトした（図５ｂ）。興味深いことに、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１は、Ａ２０．ＩＦＮＡＲ１^−／−腫瘍を有するマウスの腫瘍増殖を効果的に抑制した（図５ｃ）。

腫瘍細胞のＩＦＮ受容体は必要ないため、宿主細胞に発現する受容体が必要かどうかを調べた。ＭＣ３８腫瘍をＷＴまたはＩＦＮＡＲ^−／−マウスに接種し、融合タンパク質で処理した。実験において、抗腫瘍効果が欠損マウスで消失したことが観察され、インターフェロン受容体が宿主においてより重要な役割を果たすことを示唆した（図５ｄ）。

ＣＤ８＋Ｔ細胞は抗腫瘍効果に必要である。ＣＤ８＋Ｔ細胞が抗ＣＤ８抗体で遮断されると、抗腫瘍効果は完全に排除された（図５ｅ）。以前の研究では、Ｉ型ＩＦＮがＴＭＥでのＤＣクロスプレゼンテーションを強化し、Ｔ細胞の活性化を改善することが示された。実際、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１処理により、ＤＣ活性化のマーカー分子ＣＤ８６およびＣＤ８０の発現が増加した（図５ｆおよび図８）。コントロールとして、ＩＦＮ−Ｆｃで処理した腫瘍ではＤＣの有意な活性化は観察されず、腫瘍特異的ターゲティングの重要な役割を示した。

要約すると、これらのデータは、ＩＦＮ融合タンパク質が主に宿主細胞におけるＩＦＮシグナル伝達を介してその抗腫瘍効果を媒介することを示した。

実施例８：ＰＤ−Ｌ１抗体によるＩＦＮの標的送達はＰＤ−１遮断療法への腫瘍耐性を克服した
後期腫瘍は、一般的にＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断療法に耐性がある。実際、抗ＰＤ−１抗体も抗ＰＤ−Ｌ１抗体治療も、後期Ａ２０腫瘍の成長を制御することはできない（図６ａ）。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断と比較して、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質（ＩＦＮ−α４ヘテロダイマー）はより優れた抗腫瘍効果を示した。ただし、一部の腫瘍は、初期制御後に最終的に再発した（図２ｆ−２ｇ）。免疫療法後のＰＤ−Ｌ１の過剰発現は、Ｔ細胞を介した腫瘍制御をさらに制限する可能性がある。したがって、抗ＰＤ−１抗体とＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１の併用療法は、ＩＦＮまたはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断療法に対する腫瘍の抵耐性を克服できると仮定した。実際、併用療法はより良い腫瘍制御をもたらし、後期腫瘍はほぼ完全に解消した（図６ａ）。

Ｂ１６Ｆ１０メラノーマは、ＰＤ−１ ／ ＰＤ−Ｌ１遮断療法に耐性のあるよく知られたマウス腫瘍モデルである。以前の報告と一致して、ＰＤ−１ ／ ＰＤ−Ｌ１遮断は、Ｂ１６Ｆ１０モデルの腫瘍増殖に影響を与えなかった（図６ｂ）。ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１治療は、一部の腫瘍だけを制御した。興味深いことに、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１遮断の併用療法は、抗腫瘍効果を大幅に改善した。

ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１によって媒介される抗腫瘍反応が長期の防御Ｔ細胞免疫につながるかどうかをテストするために、併用療法後に腫瘍が完全な解消したマウスに致死量のＡ２０細胞を再度接種した。すべてのマウスは再攻撃された腫瘍に抵抗し、融合タンパク質が記憶適応免疫応答を誘導したことを確認した（図６ｃ）。

併用療法に必要な細胞集団を決定するために、併用療法を受けたマウスを抗ＮＫ、ＣＤ４＋、またはＣＤ８＋Ｔ細胞欠失抗体で治療した。ＣＤ８ ＋ Ｔ細胞がない場合、抗腫瘍効果は完全に消失した（図６ｄ）。反対的に、ＮＫまたはＣＤ４ ＋ Ｔ細胞の削除では制限がある効果がある（図９ａ−９ｂ）。治療後に腫瘍特異的Ｔ細胞が産生されるかどうかを検出するために、細胞をリンパ節または脾臓組織から分離し、照射されたＡ２０腫瘍細胞と共培養した。腫瘍特異的Ｔ細胞応答を評価するためにＩＦＮ−αＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の遮断だけでは、Ｔ細胞の活性化に限定的な影響があった（図６ｅおよび図９ｃ）。反対的に、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（ＩＦＮ−α４ヘテロダイマー）は、より良い応答を誘導した。重要なことに、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１遮断治療の併用により、腫瘍特異的Ｔ細胞の数が大幅に増加した（図６ｅおよび図９ｃ）。

明確なｉｎｖｉｔｒｏシステムでＩＦＮ、ＰＤ−Ｌ１および腫瘍細胞の効果をテストするために、ＴＭＥをよりよく再現し、ｉｎｖｉｖｏで確立された腫瘍からＤＣおよびＴ細胞を分離した。細胞は、ＩＦＮ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、またはその２つの併用の存在下で３日間共培養された。単剤療法の効果はこんなに高くなかったが、ＩＦＮと抗ＰＤ−Ｌ１抗体の併用療法は、Ｔ細胞のＩＦＮγ産生を有意に増加させた（図６ｆ）。

要約すると、これらのデータは、インターフェロンとＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断療法の併用が、強力な腫瘍特異的Ｔ細胞応答を協調的に誘導し、後期腫瘍免疫チェックポイント遮断に対する腫瘍抵耐性を克服できることを示した。

実施例９：ＩＦＮの標的送達により腫瘍常駐Ｔ細胞を活性化させ、腫瘍抑制に用いられた
データは、腫瘍特異的Ｔ細胞が抗腫瘍免疫応答において重要な役割を果たすことを示した。これらのＴ細胞は、２つの主要な供給源に由来する可能性があった。すでに腫瘍組織にあるＴ細胞と、末梢から腫瘍組織に移動した新たに活性化されたＴ細胞であった。ＩＦＮは、ＤＣを刺激してＴＩＬを活性化するだけでなく、Ｔ細胞を引き付けるケモカインを増加させることもできた。どのＴ細胞集団が必要かをテストするために、ＦＴＹ７２０を使用して末梢リンパ球の腫瘍組織への輸送を遮断した。興味深いことに、リンパ球の輸送が遮断された場合でも、コントロール群と同様に、ＩＦＮとＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断の併用も腫瘍を制御できた（図６ｇ）。これらのデータは、ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（ＩＦＮ−α４ヘテロダイマー）による既存のＴ細胞の再活性化が腫瘍制御に十分であることを示した。一致するように、ＣＤ８ ^＋ Ｔ細胞の局所的な欠失は、すべての抗腫瘍効果を減少させた（図６ｇ）。要約すると、これらのデータは、ＰＤ−Ｌ１遮断がＴ細胞枯渇の状態を逆転させることができ、ＩＦＮが腫瘍制御のために部分的に回収された常在Ｔ細胞を効果的に再活性化することを示した。

実施例１０：ＩＦＮαに対する親和性が低減した変異体の構築
受容体ＩＦＮＡＲに結合するＩＦＮαの既知の重要なアミノ酸部位については、部位特異的変異が行われた。特定の変異部位については、図１１を参照する。親和性が低下したＩＦＮα変異体をスクリーニングする。 ＩＦＮα変異体のアミノ酸配列およびこれをコーデイング核酸配列については、本明細書の配列表のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５〜３６を参照する。

実施例１１：ＩＦＮα−Ｆｃ変異体の活性検測
ＩＦＮα−Ｆｃ変異体の生物学的活性は、抗ウイルス感染バイオアッセイによって測定された。ＶＳＶ−ＧＦＰウイルスに感染する前に、Ｌ９２９細胞を各タンパク質と混合し、一晩培養した。３０時間の培養後、フローサイトメトリーによってウイルス感染細胞の割合を測定し、異なる濃度のタンパク質の細胞感染に対する阻害率とＥＣ５０値を計算した（図１２）。結果は、構築された変異体はすべてある程度の活性の低減があることを示した。その中で、２つの変異体Ｒ１４４ＡとＡ１４５Ｇは最も弱い活性を持ち、潜在的な好ましいターゲットであった。

実施例１２：変異型ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１のＩｎ ｖｉｔｒｏターゲティング試験
ＷＴ ＰＤ−Ｌ１ ＋ Ａ２０細胞とＰＤ−Ｌ１−／−Ａ２０細胞を使用して、異なる濃度のタンパク質で処理された細胞の増殖結果がＣＣＫ８キットによって検出された。結果は、変異体ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１は、野生型融合タンパク質と比較して、ターゲティング欠失を伴うＰＤ−Ｌ１−／−Ａ２０細胞の増殖を阻害するためのＥＣ５０値が低いことを示した。ターゲティングが存在しているＰＤ−Ｌ１^＋／＋Ａ２０細胞では、細胞増殖阻害に対する変異型ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１と野生型融合タンパク質のＥＣ５０値に有意差はなかった（図１３）。変異型ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質の第一のポリペプチドＡｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１（ＳｃＦｖ（ＰＤ−Ｌ１）−Ｆｃ）のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示され、第二ポリペプチド変異型ｍＩＦＮａ４ −Ｆｃのアミノ酸配列を下表に示す。

ＰＤ−Ｌ１^−／−Ａ２０細胞とＰＤ−Ｌ１^＋／＋Ａ２０細胞のＥＣ５０の比率は、この二重特異性タンパク質のターゲティングを反映できる。比率を正規化し、ｗｔ−ｍＩＦＮａ４−Ｆｃのデータと比較した後、Ｒ１４４ＡとＡ１４５Ｇが２つの最もターゲティングがよい変異であることがわかり、これら２つの変異融合タンパク質が、ＰＤ−Ｌ１陽性標的細胞を特異的に標的化できるとともに、他の細胞でのＩＦＮＡＲシグナル伝達経路の活性化を回避できる、ことを示唆した。

活性が低下したＩＦＮα変異体と標的タンパク質の融合後、標的細胞でのみＩＦＮＡＲ活性化を誘導することができる。ＩＦＮを使用する場合の周辺のオフターゲットを避けた。本発明によって構築された変異体ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１は、腫瘍の治療には大きな可能性がある。

上記の説明は、本発明の好ましい実施形態にすぎず、本発明を限定することを意図するものではない。本発明の精神および原理の範囲内で行われる修正、同等の置換、改良などは、本発明の保護の範囲内に含まれるものとする。

Claims (22)

1. 融合タンパク質であって、
   インターフェロン（ＩＦＮ）とＰＤ−Ｌ１結合タンパク質を融合接続させてなるＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１であり、前記融合タンパク質はホモダイマータンパク質或いはヘテロダイマータンパク質であり、
   好ましくは、前記ホモダイマータンパク質は、第一ペプチドと第二ペプチドを含み、前記第一ペプチドと第二ペプチドが同様であり、前記第一ペプチドと第二ペプチドはＮ端からＣ端までの順でＩＦＮ、ＰＤ−Ｌ１結合タンパク質、と免疫グロブリンＦｃ区を含み、
   好ましくは、前記ヘテロダイマータンパク質は、第一ペプチドと第二ペプチドを含み、前記第一ペプチドは第二ペプチドと異なり、前記第一ペプチドはＰＤ−Ｌ１結合タンパク質を含み、前記第二ペプチドはＩＦＮと免疫グロブリンＦｃ区を含み、ＩＦＮはＦｃ区のＮ端に位置しており、前記第一ペプチドに含まれるＦｃ区と第二ペプチドに含まれるＦｃ区は同様なサブタイプを有する免疫グロブリンに由来する、
   ことを特徴とする融合タンパク質。
2. 前記インターフェロン（ＩＦＮ）は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−λ１（ＩＬ−２９）、ＩＦＮ−λ２（ＩＬ−２８ａ）、ＩＦＮ−λ（ＩＬ−２８ｂ）およびＩＦＮ−ωのようなＩ型インターフェロン、Ｉ型インターフェロン変異体、ＩＩ型インターフェロンおよび／またはＩＩＩ型インターフェロンから選択させ、
   前記ＩＦＮはヒトソースあるいはマウスソースに由来でき、
   Ｉ型インターフェロンは、好ましくＩＦＮ−α４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３）であり、さらに好ましくＩＦＮ−α４変異体であり、さらに好ましく変異体ｍＩＦＮ−α４（Ｌ３０Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５）、−α４（Ｒ１４４Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７）、ｍＩＦＮ−α４（Ａ１４５Ｇ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９）、ｍＩＦＮ−α４（Ｒ１４９Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１）、ｍＩＦＮ−α４（Ｓ１５２Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３）、ｈＩＦＮ−α２（Ｑ１２４Ｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５）である、
   ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
3. 前記免疫グロブリンＦｃ区は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３および／またはＩｇＧ４の定常領域アミノ酸配列から選択され、好ましくはＩｇＧ１である、
   ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
4. 前記ＰＤ−Ｌ１結合タンパク質は抗ＰＤ−Ｌ１抗体、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片から選択され、前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＴｅｃｅｎｔｒｉｑ、Ｂａｖｅｎｃｉｏ、Ｉｍｆｉｎｚｉ、ＫＮ０３５、ＣＳ１００１、ＫＬ−Ａ１６７、ＳＨＲ−１３１６および／またはＹＷ２４３．５５．Ｓ７０から選択すれば好ましく、さらに好ましくは一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）であり、さらに好ましくはＹＷ２４３．５５．Ｓ７０である、
   ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
5. １）前記ホモダイマータンパク質の第一ペプチドと第二ペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示すアミノ酸配列であり、
   ２）前記ヘテロダイマータンパク質第一ペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示すアミノ酸配列を含み、第二ペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、３７、３９、４１、４３、４５、４７に示すアミノ酸配列を含む、
   ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
6. 請求項１〜５に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸分子であって、
   １）前記ホモダイマータンパク質をコードする核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示すヌクレオチド配列であり、
   ２）前記ヘテロダイマータンパク質をコードする核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、５、７、８、９、１０、３８、４０、４２、４４、４６、４８に示すヌクレオチド配列から選択され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４０、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４２は好ましい、
   ことを特徴とする核酸分子。
7. 請求項６に記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
8. 請求項１〜５のいずれかに記載の融合タンパク質および／または請求項６に記載の核酸分子の薬物組成物または試薬キットの製造における使用であって、
   好ましくは、前記薬物組成物は、腫瘍を治療する薬物組成物であり、
   好ましくは、前記腫瘍は、単独でＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の遮断に無効となる腫瘍または後期腫瘍であり、好ましくは、前記薬物組成物は、Ｂ細胞リンパ腫、メラノーマ和結腸癌を治療する薬物組成物である、前記使用。
9. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１を含む、
   ことを特徴とする薬物製剤、薬物組成物あるいは試薬キット。
10. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１、あるいは、前記融合タンパク質をコードする核酸分子を含み、生産融合タンパク質を生産する細胞であって、
    前記細胞は人以外の哺乳類動物の細胞であり、好ましくは、ＣＨＯとＨＥＫ２９３細胞である、
    ことを特徴とする細胞。
11. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１と抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体の併用の、腫瘍を治療する薬物組成物あるいは試薬キットの製造における用途。
12. 前記腫瘍はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断の単独治療に対して無効になる腫瘍あるいは後期腫瘍であり、
    好ましくは、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体の単独の治療に対して耐性がある、または無効になる腫瘍である、
    ことを特徴とする請求項１１に記載の用途。
13. 前記腫瘍の患者は、末梢リンパ球輸送欠陥／障碍に関する疾病があり、前記患者の末梢リンパ球は、腫瘍組織に移動できない、
    ことを特徴とする請求項１１に記載の用途。
14. ＩＦＮ−αと抗ＰＤ−Ｌ１抗体の併用の、治療腫瘍を治療する薬物組成物、薬物製剤あるいは試薬キットの製造における用途であって、
    前記ＩＦＮ−αは腫瘍内に投与される、
    ことを特徴とする用途。
15. 請求項１４に記載の用途であって、
    前記腫瘍は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の遮断の単独治療に無効となる腫瘍であり、
    ＩＦＮの単独治療に無効となる腫瘍、あるいは後期腫瘍であり、
    好ましくは、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体の単独治療に対して耐性がある腫瘍である、
    ことを特徴とする用途。
16. ＩＦＮ−αと抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む薬物組成物、薬物製剤あるいは試薬キットであって、前記ＩＦＮ−αは腫瘍内に投与される必要がある、
    ことを特徴とする薬物組成物、薬物製剤あるいは試薬キット。
17. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１の白血球におけるＩＦＮ受容体発現をアップレギュレートする用途であって、
    好ましくは、前記白血球は、ＣＤ４５＋細胞であり、
    好ましくは、前記ＩＦＮ受容体はＩＦＮＡＲである、
    ことを特徴とする薬物組成物、薬物製剤あるいは試薬キット。
18. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１のＤＣ細胞あるいはＴＩＬ細胞の活性化における用途。
19. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質ＩＦＮ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１の腫瘍常駐Ｔ細胞の活性化における用途。
20. ＩＦＮ−α４変異体であって、
    前記変異体は、受容体との親和性が低下した突然変異であり、ｍＩＦＮ−α４（Ｌ３０Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５）、ｍＩＦＮ−α４（Ｒ１４４Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７）、ｍＩＦＮ−α４（Ａ１４５Ｇ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９）、ｍＩＦＮ−α４（Ｒ１４９Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１）、ｍＩＦＮ−α４（Ｓ１５２Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３）、および／またはｈＩＦＮ−α２（Ｑ１２４Ｒ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．35）を含む、
    ことを特徴とする変異体。
21. 請求項２０に記載の変異体をコードする単離された核酸分子であって、
    前記核酸分子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６、２８、３０、３２、３４、３６に示す配列である、
    ことを特徴とする核酸分子。
22. 請求項２０に記載のＩＦＮ−α４変異体の、治療腫瘍を治療する融合タンパク質或いは薬物の製造における用途。

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