MX2013003559A - Metodos para tratar enfermedades autoinmunitarias usando nanoesferas bioabsorbibles biocompatibles. - Google Patents

Metodos para tratar enfermedades autoinmunitarias usando nanoesferas bioabsorbibles biocompatibles.

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Abstract

Los métodos incluyen reducir o expandir selectivamente células T de acuerdo con la especificidad antigénica de las células T que usan nanoesferas biocompatibles, bioabsorbibles. Por lo tanto, la presente invención se puede usar para reducir o eliminar células T patogénicas que reconocen autoantígenos, tales como células T específicas de células beta. Como tal, la presente invención se puede usar para prevenir, tratar o mejorar enfermedades autoinmunitarias tal como IDDM. Adicionalmente, la presente invención se puede usar para expandir células T deseables, tales como células T anti-patogénicas para prevenir, tratar y/o mejorar enfermedades autoinmunitarias.

Description

MÉTODOS PARA TRATAR ENFERMEDADES AUTOINMUNITARIAS USANDO NANOESFERAS BIOABSORBIBLES BIOCOMPATIBLES CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se dirige a composiciones y métodos relacionados con inmunología y medicina. En particular, esta invención se relaciona con diagnósticos y terapéuticos para la' diagnosis y tratamiento de condiciones autoinmunitarias , particularmente diabetes.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La vacunación con antígenos. se puede usar para la introducción de tolerancia de células T en ,1a autoinmunidad . La administración de proteínas o péptidos autoantigénicos en solución pueden alterar la iniciación y/o progresión 'de la autoinmunidad en . modelos experimentales de enfermedad autóinmunitaria (Wraith y colaboradores, 1989; etzler y Wraith, 1993; Liu y Wraith, 1995; Anderton y Wraith, ',1998; Karin y colaboradores, 1994) . Sin embargo, ' los ensayos clínicos limitados en humanos que emplean estrategias similares casi invariablemente enfrentan fracaso (Weiner, 1993Í; Trentham y colaboradores, 1993; McKown y colaboradores, 1999; Pozzilli. y colaboradores, 2000; Group, D.P.T.-T.D.S. 2002; Kappos y colaboradores, 2000; Bielekova y colaboradores, 2000). Esto sugiere que los- principios que guian la elección y condición en el tratamiento se definen deficientemente y, por lo tanto, · son inadecuados, para la aplicación humana.
Los trastornos autoinmunitarios . de órganos específicos espontáneos resultan de repuestas complejas contra numerosos epítopos en múltiples antígenos que ? surgen espontáneamente en' una secuencia estocástica y frecuentemente impredecible . Esta complejidad se agrava por el hecho- 'de que los clones de linfocitos que reconocen epítopos idénticos se acoplan a moléculas de antígeno/de complejo mayores de histocompatibilidad ( HC) dentro de una amplia¦ gama de avideces, la resistencia de las cuales se correlaciona - 'con el potencial patogénico (Amrani y colaboradores, 2000; Santamaría, 2001; Liblau y colaboradores, 2002) . En consecuencia, el resultado de cualquier estrategia de inmunización para la prevención de autoinmunidad es probable que , sea afectada por la elección del autóantígeno ( s ) , dosis, periodicidad de tratamiento, y vía y forma de administración.
La diabetes tipo 1 (TlD) en ratones está asociada con células T CD8+ autorreactivas . Los ratones diabéticos no obesos (NOD) desarrollan una forma de TlD, que se asemeja estrechamente a la TlD humana, que resulta de la destrucción selectiva de células ß pancreáticas por las células T '. que reconocen una lista de crecimiento de autoaritígenos (Lieberman y DiLorenzo, 2003). Aunque la iniciación d la TID i ' requiere claramente la contribución de células CD4+, existe evidencia convincente de que la TID es dependiente de células T CD8+ (Santamaría, 2001; Liblau y colaboradores, 2002). Se ha descubierto que una fracción significativa de células CD8+ asociadas con islotes en los ratones NOD usan TCRs Val7-Ja42+ de CDR3-invariante, referido como "similar a 8.3-TCR" (Santamaría y colaboradores, 1995; Verdaguer y colaboradores, 1996; Verdaguer y colaboradores, 1997; ; DiLore¡nzo y colaboradores, 1998). Esta células, que¦ reconocen el m'imotopo NRP-A7 (definido usando bibliotecas : de ¦ péptidos de combinación) en el contexto de la' molécula MHC Kd (Anderson y colaboradores, 1999) , es ya un componente significativo de los primeros infiltrados CD8+ del islote NOD. (DiLorenzo y colaboradores, 1998; Anderson y colaboradores, 1999;- Amrani¦ y colaboradores, 2001), son diabetogénicos .(Verdaguer y colaboradores, 1996; Verdaguer y colaboradores, 1997)', y el objetivo de un péptido de la proteína relacionada con sub-unidad catalítica de glucosa-6-fosfatasa específicas de islotes (IGRP) (Lieberman y colaboradores,: 2003)', una proteína de función desconocida (Arden y colaboradores, 1999; Martin y colaboradores,. 2001). Las células CD8+ que reconocen este péptido ( IGRP206-214 , similar a NRP-A7) son inusualmente i- frecuentes en la circulación (> 1/200 células CD8+) (Lieberman y colaboradores, '2003;. Trudeau y colaboradores, 2003) . La progresión de insulitis a diabetes en ratones NOD está invariablemente acompañada por la expansión cíclica del acervo de CD8+ de IGRP2o'6-2i4-reactivo (Trudeau y colaboradores, 2003) , y por la maduración de la avidez de su contraparte asociada a islotes (Amrani y colaboradores, 2000) . Más recientemente, se ha mostrado que las células CD8+ asociadas con islotes en ratones NOD que reconocen múltiples epítopos IGRP, indicando que el IGRP es un autoantígeno dominante para células CD8+, por lo menos en T1D de murino (Han y colaboradores, 2005). Las células CD8+ asociadas, con islotes de NOD, particularmente aquellas- encontradas temprano en el i proceso de enfermedad también reconocen un epítopo de insulina (Ins -23 (Wong y colaboradores, 1999)).
Los estudios de asociación han sugerido que ciertos alelos de HLA clase I (es decir, HLA-A*0201) permiten la susceptibilidad a. la T1D humana (Fennessy y colaboradores, 1994; Honeyman y colaboradores, 1995; Tait y colaboradores, 1995; Nejentsev y colaboradores, 1997; Nakanishi y colaboradores, 1999; Robles y colaboradores, 2002) . Los estudios de patología han mostrado que las lesiones de insulitis de pacientes recientemente diagnosticados ' consisten principalmente de células. T CD8+ (HLA clase I-restringido) (Bottazzo y colaboradores, 1985; Atkinson y Maclaren, 1990; Castaño y Eisenbarth, 1990; Hanninen y colaboradores, 1992; Itoh y colaboradores, 1993; Somoza y colaboradores, 1994; Atkinson y Maclaren, 1994; Moriwaki y colaboradores, 1999; Imagawa y colaboradores, 2001), que también son la. población i de células predominantes' en pacientes tratados mediante trasplante con isoinjertos de páncreas (de gemelos idénticos) o aloinjertos (de donadores relacionados). (Sibley y colaboradores, 1985; Santamaría y colaboradores, 1992)j.
La insulina es un objetivo clave del anticuerpo y la respuesta de CD4+ en T1D tanto humana como de. murino (Wong y colaboradores, 1999; Palmer, y colaboradores, 1983; Chentoufi and Polichronakos, 2002; Toma y colaboradores, 2005; Nakayama y colaboradores, 2005; Kent y colaboradores, 2005). El epítopo hInsBi0-i8 de cadena B de insulina-, humana es presentado por- HLA-A*0201 a células CD8+- autorreactivas tanto en receptores de trasplantes de islotes (Pihkse y colaboradores, 2005) como en el curso de enfermedad espontánea (Toma, y colaboradores, 2005). Además, se han identificado cuatro péptidos adicionales de pre-insulina de ratón 1 o 2 que son reconocidos por las células ; T ' CD8+ asociadas con islote de ratones HLA-A*0201-transgénicos en el contexto de HLA-A*02O1.
El IGRP, que es codificado por un gen (localizado en el cromosoma 2q28-32 (Martin y colaboradores, 2.0Q1) ) que traslapa un sitio de susceptibilidad T1D, IDDM7 (2q31) (Pociot y McDermott, 2002; Owerbach, 2000), también se ha identificado recientemente como un autoantigeno de i células beta de relevancia potencial en la T1D humana (Takaki y colaboradores, 2006) . Dos epitopos de . enlace HLA-A*j0201 de ' IGRP humano (hIGRP228-236 y hIGRP265-273') son reconocidos por células CD8+ asociadas con islotes de ratones NOD deficientes de MHC clase I de murino que expresan un transgen (Takaki y colaboradores, 2006) . Notablemente, las CD8+ asociadas con islotes de estos ratones HLA-A*0201- transgénicos "humanizados" fueron citotóxicos a los. : islotes humanos de HLA-A*0201-positivo (Takaki y colaboradores, 2006) .
La T1D en ratones NOD se puede prevenir mediante la expansión de células T CD8+ autorreactivos de baja avidez. La administración de péptidos solubles (sin' adyuvante) es una forma efectiva . de inducir la . tolerancia de células T i especificas de antigeno (Aichele · colaboradores, 1994; Toes y colaboradores, 1996). Previamente, se ha mostrado que el tratamiento de ratones NOD pre-diabéticos con NRP-A7 ^soluble ¦· ¦ ' ' · ' alteraron la maduración de la avidez del subconjunto |CD8+ de IGRP2o6-2i4-reactivo al suprimir selectivamente los clonotipos que expresan TCRs con la afinidad más alta para el péptido/MHC (Amrani y colaboradores, 2000) . 1 Estas observaciones elevaron la posibilidad . de que la actividad anti-TID de NRP-A7 se mediara también al fomentar la ocupación del "nicho de . clonotipo de avidez alta" (vaciado por el tratamiento de NRP-A7) por clones de "baja avidez" (y potencialmente anti-diabetogénicos) . Para probar esta hipótesis, se identificaron ligandos de péptido alterados (APLs) con actividad parcial, completa o superagonistica para células T CD8+ reactivas a IGRP206-214 y se comparó su actividad anti-TID sobre un amplio intervalo de dosis. i El tratamiento crónico c n dosis moderadas de una APL de afinidad intermedia (NRP-A7) o dosis altas de un APL de baja afinidad (NRP-I4) permitió la protección de TID. Esto se, asoció con la acumulación local de células CD8+ reactivas a IGRP206-214 de baja avidez a expensas de sus contrapartes de avidez alta, que se suprimieron. Inesperadamente, el tratamiento crónico con altas dosis de una APL de alta afinidad (NRP-V7) o el ligando natural ( IGRP206-21 ) permitieron solamente la protección marginal. Sorprendentemente, los- islotes de estos ratones contuvieron casi nada de células CD8+ reactivas a IGRP206-214 pero se incrementaron las poblaciones de células CD8+ que . reconocen otros epitopos de IGRP. Esto condujo a que los inventores concluyan que la terapia de péptido en autoinmunidad puede ser más efectiva cuando fomente la ocupación del nicho de linfocitos de órganos objetivo por · clones de baja avidez, no patogénicos (Han y colaboradores, 2005) , una . predicción apoyada por la modelación · matemática (Maree y colaboradores, 2006) . Desafortunadamente, este resultado se presentó solamente dentro de un intervalo reducido de dosis- de APL y avidez (para TCRs objetivos)., sugiriendo que la terapia de péptidos es poco adecuada para prevenir o curar la TIDl De esta manera, permanece una necesidad por composiciones adicionales y métodos relacionados para el tratamiento de diabetes, asi como también otros trastornos autoinmunitarios . ¦· SUMARIO DE LA INVENCIÓN Seria difícil tratar un paciente ' con péptidos debido a que, como es el caso del IGRP, este requeriría varios miligramos de péptidos por dosis. El .suministro de complejos de antígenos/MHC, por ejemplo, complejos, de péptidó/MHC/nanoesferas (sin moléculas coestimuladoras ) , en nanoesferas biocompatibles , bioabsorbibles se proporcionan en este documento. Se .contempla que estos complejos serán más tol'erogénicos que los péptidos solos o complejos de i nanoesferas no bioabsorbibles.
Los aspectos y modalidades de esta solicitud incluyen el descubrimiento de un nuevo paradigma en el : i tratamiento de la autoinmunidad . Tradicionalmente , las vacunas se ha usado para · expandir células T capaces de permitir la protección contra patógenos o cáncer, o para suprimir células T capaces de' provocar autoinmunidad.
Aspectos de la presente invención se refieren a Un tipo i novedoso de "vacuna" que induce selectivamente la expansión de células CD8+ autorreactivas con propiedades; anti- i autoinmunitarias y, al mismo tiempo, la supresión de' ¡células CD8+ autorreactivas' con propiedades patqgénicas (autoinmunitarias) , ambas de acuerdo con la especificidad antigénica de las células T. Las célul.as T CD8+ autorreactivas anti-autoinmunitarias (células CD8+ antipatogénicas) suprimen las respuestas de células T autorreactivas en un tejido especifico (en, reclutamiento espontáneo al tejido objetivo) pero de manera . no específica de' antígeno (por ejemplo, suprimiendo localmente; otras respuestas de células T .autorreactivas) . Como resultado, el tratamiento con este tipo de vacuna. puede tanto prevenir como y/o mejorar la . T1D, ' así como también de restaurar la normoglicemia o reducir los niveles de :glucosa en los ratones NOD hiperglicémicos sin provocar inmunosupresión generalizada. Esta estrategia puede ser aplicable . al tratamiento de otras enfermedades autoinmunitarias mediadas por células T y puede ser capaz de prevenir la recurrencia de T1D en el trasplante de islotes.
Ciertas modalidades . de la presente invención se refieren a métodos para reducir o expandir selectivamente células T de acuerdo con la especificidad antigénica de las células T. Por lo tanto, se cree que la presente invención se puede usar para reducir o eliminar células T que. reconocen anti-antigenos , tales como células¦ P especificas de 'células T. Como tal, la presente invención se puede usar para prevenir, tratar, o mejorar enfermedades autoinmunitari'as tal como IDDM. Adicionalment.e, la presente invención' se puede usar para expandir células T deseables,' tales como células T que reconocen antigenos de tumor, para prevenir, tratar y/o i mejorar enfermedades combatidas por estas células' T.
Las modalidades de la invención se dirigen a métodos para diagnosticar, prevenir, o tratar un trastorno autoinmunitario que comprende administrar un complejo de antigeno/MHC/nanoesferas biocompatibles, bioabsorbibles a un sujeto en una cantidad suficiente para expandir células T I autorreactivas anti-patogénicas . Un antigeno incluye., pero no se limita a todo ó parte de un péptido, ácido . nucleico, carbohidrato, lipido u otra molécula o compuesto qué puede modular la actividad de células T o poblaciones de células , cuando en el contexto de un MHC o molécula similar a ; MHC se acopla a un substrato. La bioabsorción del complejo de nánoesferas es critica para la invención ya que previene la acumulación a largo plazo de las nánoesferas- in vivo con cualquier toxicidad acompañante que surja de la misma.; Las modalidades de la invención incluyen nánoesferas, tolerpgénicas que comprenden una narioesfera biocompatible, bioabsorbible acoplada a un. complejo de . i antigeno-MHC. El complejo de antigeno-MHC se puede ,acoplar directamente a tal nanoesfera a través de una ligadura. Una nanoesfera preferida . puede comprender adici'onalmente un núcleo de metal biocompatible, bioabsorbible y un recubrimiento biodegradable , bioabsorbible. La. nanoesfera puede comprender además un- recubrimiento o cubierta o cubierta de otras moléculas que se pueden acoplar fácilmente al complejo de antigeno-MHC (por ejemplo, estreptavidina o avidina u otras moléculas conocidas usadas para atacar porciones a las nánoesferas) . En ciertos aspectos, una nanoesfera biocompatible, bioabsorbible comprende un material seleccionado del grupo que consiste de, por ejemplo, óxido de hierro III, fosfato de tricalcio, cromo, galio, as.i como también polímeros . biocompatibles , bioabsorbibles tales como PGLA, PLLA, PGA, PDLLA, PCL, PDLGA, PLDLA, PLC (todos 'de los cuales . están disponibles de Zeus, 3737 Industrial; Blvd, Orangeburg, SC, 29118 EUA bajo el nombre comercial AbsorvMR) , ácido hialurónico, alginato, polihidroxialcanoatios , y similares. En aspectos adicionales, una narioesfera biocompatible bioabsorbible es una nan'oesfera metálica o magnetizable o¦ : superparamagnética . La narioesfera biocompatible, bioabsorbible puede comprender además un recubrimiento biodegradable formado de dextrano; poli (etilenglicol) ; poli (óxido de etileno) ; manitol; poli (hidroxialcanoatos) de la clase PHB-PHV; y otros poli ( sacáridos ) modificados tales como almidón, celulasa y quitosan.
Ciertos aspectos- de la invención incluyen métodos y composiciones que se relacionan con composiciones antigénicas incluyendo segmentos, fragmentos, o epitopos de polipéptidos , péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, lipidos y, otras moléculas que provocan, o inducen una . respuesta antigé'nica o inmune, referidos generalmente como antigenos. En aspectos particulares, el antigeno se deriva de, .es una imitacipn de, o es un antigeno aut rreactivo y/o complejos del mismo.
Los antigenos de péptido incluyen, pero no se limitan a hlnsBio-is . (HLVEALYLV ' (SEQ ID NO : 1) ) , hIGRP228-236 (LNIDLLWSV (SEQ ID NO:2 ), hIGRP265-273 (VLFGLGFAI (SEQ ID N0:3)), IGRP206-214 - (VYLKTNVFL (SEQ - ID NO:4)), NRP-A7 (KYN ANAFL (SEQ ID NO: 6)), NRP-14 (KYNIANVFL (SEQ ID NÓ:7)), NRP-V7 ( KYNKANVFL (SEQ ID NO:8)), YAI/Db (FQDENYLYL (S,EQ ID NO: 9)) y/o INS B'15-23 (LYLVCGERG (SEQ ID NO:10)),. asi como también péptidos y proteínas dados a conocer en la Publicación de E.U.A 20050202032, que se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad.
En ciertos aspectos, un antígeno de péptido para el tratamiento de T1D es GAD65ii4-i23, VMNILLQYVV (SEQ .ID NO : 14 ) ; GAD65536-545, R MEYGTTMV ' (SEQ ID NO: 15); GFAP143-i5i, NLAQTDLATV (SEQ ID NO:16); GFAP214-222, QLARQQVHV (SEQ ID NO : 17 ) ; , IA-2i72- 180 SLSPLQAEL (SEQ ID NO:18); IA-2482-490, SLAAGVKLL ,(SEQ ID NO: 19); IA-2805-8i3/ VIVMLTPLV (SEQ ID NO:20); ppIAPP5-i3, KLQVFLIVL (SEQ ID NO:21); ppIAPPg-i7, FLIVLSVAL (SEQ ID ,NÓ:22); IGRP152-i60., FLWSVFMLI (SEQ ID . NO : 23 ) ; ' . IGRP211-219, NLFLFLFAV (SEQ ID NO:24); IGRP215-223, ' FLFAVGFYL (SEQ ID NO:25); IGRP222-230, YLLLRVLNI (SEQ ID NO:26); IGRP228-236, LNIDLL SV (SEQ ID NO : 2 ) ; . IGRP265-273 , VLFGLGFAI (SEQ¦ ID| NO: 3) ; IGRP293-301, RLLCALTSL (SEQ ID. NO:27); Pro-insulinL2-io/ ALWMRLLPL (SEQ ID. NO:2'8); Pro-insulin^-n, LWMRLLPLL- '(SEQ ID NO:29); Pro-insulinL6-i4 , RLLPLLALL (SEQ ID 'NO:30) Pro- insulinB5-i4, HLCGSHLVEA (SEQ ID- NO: 31); Pro-insulanBio-i8, HLVEALYLV (SEQ ID NO:l); Pro-insulinBi4-22 , ALYLVCGER (SEQ ID NO:32); Pro-insuÍinBi5-24, LYLVCGERGF (SEQ ID NO:33).!; Pro-. insulinBi7-25, LVCGERGFF (SEQ ID NO : 34 ) ; Pro-in'sulÍnB18-.27 , VCGERGFFYT (SEQ ID NO:35); Pro-insulinB2o-27 , GERGFFYT (SEQ ID NO:36); Pro-insulinB2i-29, ERGFFYTPK (SEQ ID NO:37);. Pro- insulinB25-ci, FYTPKTRRE (SEQ ID NO:38); Pro-insulinB27-c5/ TPKTRREAEDL (SEQ ID NO: 39) ;' . Pro-insulinC20-28, SLQPLALEG (SEQ ID NO:40); Pro-insulinc25-33, ALEGSLQKR (SEQ ID NO:41); Pro- insulinc29-A5, SLQKRGIVEQ ( SEQ ID NO:42) ; Pro-insulinAi-10, GIVEQCCTSI (SEQ ID NO:43); Pro-insulinA2-10, IVEQCCTSI (SEQ ID NO:44); Pro-insulinAi2-20, SLYQLENYC (SEQ ID NO:45) o combinaciones de los mismos.
En aún aspectos adicionales los · antigenos¦ de . ' · I . I péptido asociados con esclerosis múltiplé (MS) se pueden usar -e. incluyen: MAG287-295, SLLLELEEV (SEQ ID NO: 46); KG509-517, LMWAKIGPV (SEQ ID NO: 47); MAG556-564, VLFSSDFRI (SEQ ID 'NO: 48); MBPIuo-118, SLSRFSWGA (SEQ ID NO:49); OGii4-i22, KVEDPFY V (SEQ ID NO:50); -MOGiee-nsv RTFDPHFLRV (SEQ ID NO : 51 ) ; . MÓGi72-i8o, FLRVPC KI (SEQ ID NO:52); MOG179-I88 KITLFVIVPV ' (SEQ ID NO: 53); MOGiss-ige VLGPLVALI (SEQ ID NO: 54 ); MDGi8i-i89, TLFVIVPVL (SEQ ID NO:55); MOG205-2i4, ' RLAGQFLEEL ' (SEQ ID NO: 56)·; PLP80-88, FLYGALLLÁ (SEQ ID NO: 57) o combinaciones de los mismos . · En ciertos aspectos, el complejo de antigeno-MHC se puede reticular (conjugar) a las nanoes.feras descritas en este documento. Un método no limitante para' conju'gar una nanoesfera a un complejo de. antigeno-MHC incluye '(a) hacer reaccionar un complejo de antigeno-MHC con /un agente de conjugación, formando en consecuencia un complejo de antígeno-MHC; y (b) hacer reaccionar una nanoesfera biocompatible , biodegradable al complejo de la etapa (a). En una modalidad, el método comprende concentrar el complejo de la etapa (a) antes de llevar a cabo la etapa ' .(b) . En otra modalidad, el agente de conjugación comprende . ún : agente heterobifuncional . En todavía otra modalidad, el agente de conjugación comprende DOTA-maleimida (4-maleimidobutiramidobencil-DOTA) , SMPT (4-succinimidiloxicárbonil-oí-metil-a- ( 2-piridilditio) tolueno-) , sulfo-L'C-SMPT hexanoato de (sulfosuccinimidil— 6- (a-metil-a-(2-piridiltio) toluamido) , reactivo de Traut (2-Iminotiolano-HC1), o cualquier combinación de los mismos. ' Véase la publicación de Patente de E.U.A. 20070059775; Patentes de E.U.A. Nos. 4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784; 4,·680,338; 4, 569, 789; 4,589, 071; 7,186,814 y solicitud de Patente Europea No. 188,256 planteamiento de complejos de conjugación a micropartí'culas o nanopartículas . . i Un trastorno autoinmunitario puede incluir, pero no se limita a, diabetes mellitus, rechazo de trasplante, esclerosis múltiple, deficiencia ovárica prematura, escleroderma, enfermedad de Sjogren, lupus, vitíligo, alopecia (calvicie), deficiencia poliglandular, enfermedad de Grave, hipotiroidismo,. polimiosititis, pénfigo, enfermedad de Crohn, colititis, hepatitis autoinmune, hipopituitarismo, miocardititis, enfermedad de Addison, enfermedades autoinmunitarias de la piel, uveititis, anemia perniciosa, hipoparatiroidismo, y/o artritis reumatoide. En ciertos aspectos, un componente de péptido de un complejo de antígeno/MHC/nanoesfera se deriva o se diseñan de un autoantigeno o un epitopo de autoantigeno, o, una. imitación del mismo, implicados en la respuesta autoinmünitaria 1 que se prueba, modula, ó se altera por el tratamiento. En aspectos particulares, el autoantigeno es un péptido, carbohidrato o lipido. En ciertos aspectos, un antigeno es un fragmento, epitopo, o péptido de ' una proteina, carbohidrato, o , lipido expresado por ciertas células de un sujeto,, tales como células beta pancreáticas, e incluyen, pero no se limitan a un fragmento de IGRP, Insulina, GAD o proteína IA-2. 'Varias proteínas o epítopos se han identificado para una variedad de condiciones autoinmunitarias. El autoantigeno puede ser un ; - '. I péptido, carbohidrato, lipido o similares derivados ; de un segundo componente endocrino o neurocrino, tal como célula de Schwann de peri-islotes o. similares. ' En aún aspectos adicionales de esta invención, el componente de MHC del 'complejo de antigeno/MHG/nanoesfera es un componente de polipéptido de MHC clase I o MHC clase 11 clásico o no clásico. El componente de MHC clase I i puede comprender todo o parte de una molécula HLA-A, HLA-B,j HLA-C, I i HLA-E , HLA-F, HLA-G, particularmente todo o parte j de una ! ' ¦ i molécula HLA-A, tal. como una molécula de HG . clase i I HLA- A+0201. El componente de MHC clase I no clásico quje puede comprender moléculas similares a CD1. Un componente j de MHC clase II puede comprender todo o parte de una HLA-DR, jHLA-DQ, o;HLA-DP. En ciertos aspectos, el complejo de antigend/MHC se acopla covalentemente o no covalentemente o se une ' a un ' ¦ . · .¦ . '¦ í substrato (complejo es típicamente una una modalidad, la hierro, u óxido de hierro. En otra modalidad, la nanoesfera comprende un polímero biocompatible,' bioab.sorbibke . En :. -¦ ¦ ' : ' · · I cualquier caso, la. nanoesfera se somete a' la bioabsorción in . . ¦ i ¦ · vivo tal que la . acumulación de las nanopartículas in vivo se í 1 limita. Los péptidos de la invención se pueden ¡acoplar químicamente a un substrato y en particular acoplar a través . ¦ i ' de un ligadura químico o péptido. Las moléculas de CCjl 'son n ejemplo de una molécula de MHC no clásica. Las moléculas de : ¦ -MHC no clásicas se caracterizan como no pol , conservadas entre especies y que poseen bolsas de enjlace de ligándos reducidas, profundas, hidrofóbicas . Estas bplsas de enlace son capaces.de presentar glicolípidos y ' fosfollpidos.¦ a células T Exterminadoras Naturales (NKT) . Las células NKT representan una población de linfóbitos única que coexpresa marcadores de célula NK y un receptor de células T (TCR) semi-variante . Se implican en la regulación de respuestas inmunes asociadas con una amplia gama de enfermedades.
En ciertas modalidades, las células. T expandidas por el tratamiento se han pre-activado por el proceso de enfermedad y tienen un fenotipo de memoria. En un aspecto, las células T surgen de precursores autorreactivos que reconocen el epitopo objetivo con baja avidez. La avidez se puede determinar por un ensayo¦ de enlace de. tetrámeros o similar. En un aspecto adicional, el complejo de antigeno/MHC/nanóesfera se administra antes, después o tanto antes como después del inicio de los síntomas clínicos de la enfermedad autoinmunitaria de interés. En aún ' un 'aspecto adicional, el método puede incluir una etapa que comprende evaluar un parámetro biológico de una condición autoanmune, tal como los niveles de azúcar en sangre del sujeto' anfces y/o después del tratamiento. Los métodos de la invención también pueden incluir evaluar un estado autoinmune de un sujeto, incluyendo la evaluación de cualquiera de las respuestas inmunes autorreactivas. En ciertos aspectos, la célula T es una célula T CD4+ o CD8+ o una célula. NK T (NKT) . ¦ ·. ' "i' Modalidades adicionales de la invención incluyen métodos para expandir células T autorreactivas 1 anti- patogénicas que comprenden administrar un. complejo de antigeno/MHC/nanoesfera en una cantidad suficiente . para estimular la expansión de una célula T autorreactiva anti- I patogénica. En ciertos aspectos, la célula T es una célula T r CD8+ o CD4+ o una célula N.KT . ¦ .' , En modalidades aún adicionales, la ' invención incluye métodos para proteger células de un sujeto, t l como células de los islotes pancreáticos,. . de una ' respuesta autoinmunitaria, particularmente una ¦ respuesta autoinmunitaria patogénica, que comprende administrar un sujeto o un complejo de antigeno/MHC/nanoesfera jén una cantidad suficiente para inhibir' la destrucción de las células o tejidos, que comprenden las células,' en dónde el antigeno o molécula- antigénica de, la cual se deriva es de un autoantigeno asociado con. células. !.
En todavía una modalidad adicional,- la- i'n ención incluye métodos para diagnosticar autoinmunidad que comprende evaluar la expansión inducida por tratamiento de respuestas de células T CD8+ o CD4+ anti-patogénicas como una indicación de autoinmunidad activa.
Modalidades de la invención pueden incluir métodos para prevenir, mejorar, o tratar el rechazo de tejidos • " . · ' í trasplantados por respuestas alogénicas o autoinmunitarias al ' . . i administrar un complejo de antígeno/MHC acoplado operativamente a un substrato (es decir, un complejo de antigeno/MHC/nanoesfera) a . un sujeto en una cantidad suficiente para expandir las células T. autorreactivas anti¬ patogénicas, o inducir la expansión de células anti-patogénicas que reconocen aloantigenos · o autoantígenos expresados por los tejidos u órganos trasplantados.
Las modalidades de la invención' proporcionan : . ' I métodos para incrementar o mantener el número de ¡ células funcionales, por ejemplo, células de los islotes, de. un tipo predeterminado en un mamífero al prevenir o al inhibir la muerte o exterminio celular. En ciertas modalidades, este método se usa para tratar . una ' enfermedad autoinmunitaria donde se desea la regeneración de células y/o j tejidos endógenos. Tales enfermedades autoinmunitarias incluyen, sin limitación, diabetes mellitus, esclerosis múltiple, insuficiencia ovárica prematura, escleroderma, enfermedad de Sjogren, lupus, vitíligo, alopecia (calvicie), insuficiencia poliglandular, enfermedad de Grave, hipotirpidismo, polimiosititis, pénfigo, enfermedad de Crohn, colititis, hepatitis autoinmunitaria, hipopituitarismo, miocardititis , enfermedad de Addison, enfermedades autoinmunitarias de la piel, uveititis, anemia perniciosa, hipop.áratiróidismo, artritis reumatoide y similares. Un aspecto de la invención proporciona un procedimiento terapéutico de dos! partes novedoso para la ablación de la autoinmunidad existente mientras que se vuelve a educar el sistema inmunologico.
En ciertos aspectos, el complejo de antigeno/MHC/nanoesfera no necesita ser administrado con un adyuvante a fin de inducir una- respuesta inmunit'aria, por ejemplo, una respuesta . de anticuerpos. En modalidades particulares, la composición de antigeno/MHC/nanoesfera se puede usar en conjunción con técnicas de anticuerpo policlonales y monoclonales conocidas para . producir un anticuerpo que usa. adyuvante (s) reducido o sin adyuvante.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las siguientes figuras forman parte de la presente especificación y se incluyen para mostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente' invención. La invención se puede entender mejor a manera de referencia a una o más de estas figuras en combinación con la descripción detallada de las modalidades especificas presentadas en este documento.
FIGURAS 1A-1C. Las células T CD8+ 17.6a/8.3ß autorreactivas de baja afinidad son anti-diabetogénicas .
FIGURA 1A, Frecuencia de diabetes en ratones 17.6a/8.3ß-?0? (n=95) versus 17.4a/8.3ß-?0? (n=598). FIGURA IB, Registro de insulitis en ratones Tg (n=6 para 17.6o¡/8.3ß-?0?, n=3 para 17. a/8.3ß-?0?) . FIGURA 1C, Frecuencia de diabetes; en NOD (n=56) versus LCMV-NOD (n=10 ) . ' FIGURAS 2A-2B. Biología de desarrollo del TCR 17.6a/8.3ß. FIGURA . 2A, Biología de desarrollo 'de TCR 17.6a/8.3ß versus 17.4a/8.3ß en ratones Tg. Los paneles superiores son gráficas de puntos CD4 versus CD8 representativas de esplenocitos . El panel inferior! es la comparación de la tinción de células T CD8+ con tetrámero NRP-V7/Kd. FIGURA 2B, Biología de desarrollo de los TCRs 17.6a/8.30ß versus 17,4a/8.3ß en ratones RAG-2-/- Tg. Los paneles superiores son gráficas de puntos CD4 versus CD8 representativas de esplenocitos. El panel inferior; es la comparación de la tinción de células T CD8+ con tetrámero NRP-V7/Kd. . 1 FIGURA 3. Frecuencia de la diabetes en ratones 17.6a/8.3ß-???.RAG-2-/- (n=13) versus 17.4a/8.3ß-??? .RAG-2-/-(n=106) .
FIGURAS 4A-4B. Biología de desarrollo de TCR 17.6?/8.3ß versus 17.4a/8.3 en ratones TCRa-/- Tg. i FIGURA 4A, Los paneles superiores son gráficas de puntos CD4 versus CD8 representativas de esplenocitos. El panel inferior- es la comparación de la tinción de células T CD8+ con el tetrámero NRP-V7/Kd. FIGURA 4B, ' Frecuencia de diabetes en ratones 17:.6 /8.3ß-???. TCRa-/- (n=14) versus 17.4a/8.3ß-?0?. ¡TCRa-/-(n=28) . Los valores en los paneles FACS de gráfica de¡ puntos corresponde a los porcentajes de las células dentro de cada cuadrante y los valorés en los paneles de histograma corresponden a los porcentajes de las células que se tineron positivas (medio+SE) .
FIGURAS 5A-5J. Células CD8+ 17.6a/8.3ß se diferencian espontáneamente en las células T de memoria con función reguladora. FIGURA 5A, Los perfiles FACS representativos de . células T CD8+ esplénicas de rratones 17.6a/8.3 -N0D.TCRa-/- versus 17.4a/8.3p-N0D . TCRa-/-J FIGURA 5B, Porcentaje de células T CD44hi CD122+ CD8+ dentro del bazo (n=12 para 17.6a/8.3ß-???. TCRa-/- y n=9 para 17:4?/8.30ß-NOD. TCRa-/-) , PLN (n=9 para 17.6a/8.3ß-???. TCRa-/- y n=6 para 17 ;4a/8.3ß-???. TCRa-/- ) BM (n=4 para 17.6a/8.3ß-???. TCRa-/-y n=3 para 17.4?/8.3ß-??? . TCRa-/- ) de ratones TCRa-/- Tg (medio ±SE) . Los ratones fueron de 9^18 semanas, de edad. FIGURA 5C, Perfil FACS representativo de células T CD8+ esplénicas de ratones 17.6a/8.30ß-??? . TCRa-/- teñidos con tetrámero NRP-V7/Kd versus anti-CD 122. Ab. Los valores son medio ±SE de . cinco . experimentos diferentes; FIGURA 5D, análisis fenotipico ' de células · TCD8+ esplénicas' sin tratamiento versus de memoria de ratones 17.6a/8.3ß-?f?. TCRa-/-. Los datos son representativos de por lo. menos dos experimentos para cada marcador. FIGURA' 5E, Comparación de la tinción CD122 en timocitos CD8+CD4" versus esplenocitos CD8+ de ratones TCRoT7" Tg. Los .datos son representativos de . cuatro experimentos. FIGURA 5F, captación de BrdU por células T CD8+ esplénicas de ratones TCRcf/_ Tg. FIGURA 5G, Panel superior: perfil FACS representativo de la proliferación de células T ; . i CD8+ esplénicas de ratones Tg en respuesta a ¦ las citocinas IL-2 y IL-15 (ambas a 100 ng/ml) . Panel inferior : . Expansión de pliegue de células T CD8+ sin tratamiento versus memoria de ratones 17.6a/8.30ß-???. TCRof _ en respuesta a diferentes i ¡ concentraciones de IL-2 e IL-15. Los ' datos son representativos de . por lo menos tres experimentos.. FIGURA 5H, . + ' - i Producción de células T CD8 IFN-? sin tratamiento esplénicas dé ratones 17.4a/8.3ß-???. TCRcT^ versus células T GD8+ sin tratamiento y de memoria de ratones 17.6a/8.3ß-??? . TGRof/_ en respuesta a los DCs pulsados con 1 µ?/mi de NRP-A7 después de ·. ¦ ¦ · ¦. i . ¦ · I 24 y 48 horas.. FIGURA ' 51 , Tinción de IFN-? intra-celular de células T CD8+ . sin tratamiento esplénicas de ratones 17. a/8.3ß-???. TCR _ " versus células T CD8+ sin tratamiento y dé memoria de ratones 17.6a/8.3ß-??? . TCRa- " en respuesta a los DCs pulsados con 1 pg/ml de NRP-A7 después 1 FIGURA 5J, Producción de IL-2 y proliferación en los DCs pulsados con 1 g/ml de NRP-A7 en diferentes' . puntos ' de tiempo. Los datos, en la FIGURA 5H y FIGURA ¡ 5J son representativos de cuatr.o experimentos y los- datosj en la FIGURA 51 son representativos de tres experimentos. ' j FIGURA 6. Proliferación de células T CD8+ 17.4a/8.3ß etiquetadas con CFSE. Proliferación de 'células TCD8+ 17.4a/8.3ß etiquetadas con CFSE en respuesta a los DCs pulsados con NRP-A7 en presencia de células T . CD8+ sin tratamiento versus memoria de ratones 17.6a/8 '.3ß-?0?'. TCRa" _ (panel superior) o células T CD8+ sin tratamiento de¦ ratones 17.4a/8.33-NOD versus 'LC V-NOD (panel inferior). Los datos son representativos de por lo menos cinco experimentos.
FIGURA 7A-7B. Células T CD8+ 17.6 /8.3ß de memoria exterminan APCs pulsadas con antigeno. FIGURA .7A, Citotoxicidad in vitro de células T CD8+ sin tratamiento recientemente aisladas de ratones 17.4a/8.30ß-????. TCRa~ _ versus células T CD8+ sin tratamiento y dé memoria de ratones 17.6a/8.3C^-NOD.TCRcT - · contra NRP-A7 y BM DCs. pulsados con TUM.. Los datos son representativos en tres experimentos. Los BM DCs purificados se pulsaron con 1 µ9/??1 de 'NRP-A7 o TUM y se etiquetaron con cromato de [51Cr] ^-sodio . Relación de efecto ¡objetivo =8:1 (40000 efectores : 5000 células objetivo). El sobrenadante se recolectó después de 8 horas. FIGURA 7B, Ensayo de citotoxicidad in vivo: células B pulsadas con NRP-A7 (CFSE10) o pulsadas con TUM , (CFSEhi) ¦ (paneles superiores) de DCs esplénicas y de LN recientemente aisladas (paneles inferiores) se inyectaron en hospederos Tg en una relación 1:1. Las células B de¦ DCs recientes ·· (del bazo y LNs) se aislaron usando cuentas MACS anti-B220 p anti-CDllc, pulsadas con 10 µg/ml de péptidos durante 2 horas, se lavaron, se etiquetaron con CFSE (TUM:3 µ de CFSE, '¦ NRP-A7 : 0.3 µ de CFSE) durante 3. minutos a 37 °C, se lavaron ' 3 veces y 4-5xl06 células de cada población se inyectaron en los hospederos. Después de 18 horas los ratones se sacrificaron y los esplenocitos se analizaron por FACS.
La FIGURA 8 representa una imagen aumentada de nanoesferas de PLGA ( Poli ( D, L-lactido-co-glicólido) ) conjugadas con pMHC. ' ¡ La FIGURA 9 representa las respuestas IFNy^por las células T CD8+ a los complejos de nanoesferas IGRP/Kd-PLGA en . · ¦ r la concentración de nanoparticulas/pocillo indicada, i DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se entenderá que esta invención no se limita a las modalidades particulares descritas, como tal pue;den por supuesto, variar. También se ' debe entender ¡que la terminología usada en este documento es para el propósito de describir modalidades particulares solamente, y 1 no se proponen para ser limitantes, puesto que el alcance de la presente invención se limitará solamente por las reivindicaciones adjuntas.
Se debe observar que como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un excipiente" ¡incluye una pluralidad de excipientes.
I . Definiciones A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en este ¦'. documento tienen el mismo significado como es entendido comúnmente- por una persona de experiencia ordinaria en el campo a ;la cual esta invención pertenece. Como se usa en este documento, los siguientes términos tienen los siguientes significados.
Como se usa en este documento, el término "que comprende" o "comprende" se propone para referirse a ¡que las composiciones y métodos incluyen los elementos citados,- pero no excluyen otros. "Que consiste . esencialmente¦ de" cuando se i usa para definir composiciones y. métodos, propondrá j excluir otros elementos de cualquier importancia esencial.' a la combinación para el propósito establecido. De esta manera, una composición que consiste esencialmente de .los elementos como se define n este documento no excluiría otros materiales o etapas que no afectan materialmente la característica ( s ) básica y novedosa/ · de la . invención reclamada. "Qüe consiste de" propondrá excluir más de elementos trazas de otros ingredientes y etapas de ¡métodos sustanciales. Las modalidades definidas por cada uno de estos términos de transición están dentro del alcance de esta invención. ¡ Por "biocompatible", significa que los componentes del sistema de suministro no provocarán lesión de tejidos o lesión al sistema biológico humano.. Para impartir biocompatibilidad, los polímeros y excipientes que han tenido historia de uso seguro en humanos o con estacio GRAS (Generalmente Aceptado como Seguro), se usarán de manera preferente. Por biocompatibilidad, se propone · que los ingredientes y excipientes usados en la composición serán finalmente "bioabsorbidos" o eliminados por el cuerpo sin efectos adversos al cuerpo. Para una composición que es biocompatible, y se considera como no tóxica, no debe provocar toxicidad, a las células. Simi1armente , el | término "bioabsorbible" se refiere a nanopartículas hechas a partir de materiales que se someten a bioabsorción in vivo durante un período de tiempo tal que la acumulación a largo plazo del material en el paciente se evita. En una modalidad preferida, la nanopartícula compatible se bioabsorbe durante un período de menor que 2 años, · de manera preferente menor que ; 1 año y aún más de manera preferente menor que 6 meses. La. velocidad de bioabsorción se relaciona con el tamaño de' la -partícula, el material usado, y otros factores bien . reconocidos; por el i artífice experto.' Una mezcla de materiales bioabsorbibles , biocompatibles se puede usar para formar la nanoesferas usadas en esta invención. En una modalidad, se pueden combinar óxido de hierro (III) y un polímero biocompatible, ¦ '¦ ' i bioabsorbible . Por ejemplo, el óxido de hierro (III)1 y PGLA se pueden combinar para formar una nanopartícula . i ¦ Un complejo de antígeno/MHC/nanoesfera se réfiere a la presentación de un péptido, carbohidrato, lípido, u otro I segmento, fragmento antigénico, o. epítopo de una molécula antigénica o proteína (es decir,- autopéptido o autoantígeno) sobre una superficie, tal como una nanoesfera biocompatible, biodegradable . "Antígeno" como se usa en este documento se refiere a todo, parte, fragmento, segmento de una molécula que puede inducir una respuesta inmunitaria en un- sujeto o uha expansión de células antipatogénicas. ! El término "aproximadamente" cuando se usa antes de una designación numérica, por ejemplo, temperatura, ! tiempo, cantidad, y concentración, incluyendo intervalo, ' indica aproximaciones que. pueden variar por ( + ). o ( - .) 10%, 5%, o Por "exterminio" o "extermina" significa provocar la muerte celular por ' apoptosis p necrosis. La apoptosis o necrosis se pueden mediar por cualquier ruta de| muerte celular . ' < ' '' . i "Células autoinmunitarias" incluyen, por ejemplo, esplenocitos adultos, T-linfocitos, B-linfocitos, y ¡células dé origen de médula ósea,' tal como células presentadoras de antigeno defectuosas de un mamífero, que tienen actividad hacia el organismo del cual se deriva la célula autoinmune .
Una "imitación" es un análogo .de un ligando o I péptido dado, en. donde' el análogo es sustancialmente ¡ similar 1 i al ligando. "Sustancialmente similar" propone que el ¡análogo ! ¦ · i ¦ . i tenga un perfil de enlace similar a ligando exceptoj que la ' i imitación tenga uno o más grupos funcionales o modificaciones que ascienden colectivamente a menor que aproximadamente 50%, . ménor que aproximadamente 40%, menor que : . ménor que aproximadamente 20%, menor que o menor que aproximadamente 5% del peso molecular del ' · ' . i ligando. ¡ ¦ .
' ' Una "cantidad efectiva" es una cantidad · para lograr el. propósito intencionado, por ejemplo, modulación de la actividad de células T o poblaciones de células T. Como se describe en este documento con detalle, la ; I ! ¡ cantidad efectiva, o dosificación, depende del propósito y el i antigeno y se puede determinar de acuerdo con la presente descripción . j · Una "célula T auto-reactiva" es una célula. T que reconoce un "autoantigeno", que es uña molécula producida y contenida por el mismo individuo que contiene la célula T. una célula T auto-reactiva puede ser una célula T CD8+ o una célula T CD4 + . Adicionalmente, la célula T CD4+ s;e puede clasificar como una célula TR1 (T Reguladora 1). .
Una "célula T patogénica'1' es una célula T; que es perjudicial a un sujeto que contiene la célula T. Mientras que una célula T no patogénica no sea sustancialmente perjudicial a un . sujeto, y . una célula T antipatogénica reduzca, mejore, inhibe, o niegue el peligro dé. una célula T patogénica.
Los términos "inhibición", "reducción", o "prevención", o cualquier variación de estos términos, cuando se usan en las . reivindicaciones y/o la iespeci-ficación incluyen cualquier disminución medible o inhibición completa i para lograr un resultado deseado.
El uso de la palabra "un"- o "una" cuando se¡ usan en conjunción con el término "que comprende" ' 'en las reivindicaciones y/o la especificación pueden proponer "uno", pero también es consistente con el significado de "uno o más", "por lo menos uno" y "uno o más de -uno".
El término "anti-patogénico" se refiere ai células que tienen un efecto protector contra la enfermedad causante.
'- - I ' '.. Por ejemplo, "células T CD8+ auto-reactivas anti-pato.génicas" se refiere a las células que tienen un efecto .protector contra T1D. "Células T CD8+ auto-reactivas auto-patogénicas" . 1 también se refiere a células que tienen un efecto protector contra otras enfermedades autoinmunitarias tales como aquellas listadas bajo la subsección V. titulada: OBJETIVOS DE DIAGNÓSTICOS Y TERAPÉUTICOS.
Por "nanoesfera" significa en este documento partículas discretas pequeñas que son administrables a un sujeto. En ciertas modalidades, las nanoesferas son sustancialmente esféricas en forma. El ; término "sustancialmente esféricas", como se usa en este documento, significa que la forma de las partículas no se desvía de una esfera por más de aproximadamente 10%. Varios complejos de antígeno o péptido conocido de la invención se pueden^ aplicar a, las partículas. Xas nanoesferas de esta invención varían en tamaño de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 150 µ? y, dé manera preferente, de aproximadamente 10 j nm a aproximadamente 1 µ??. Se pueden obtener partículas de nanotamaño más pequeñas, por ejemplo, por fraccionamiento mediante el cual' las partículas más grandes se dejan asentar en una.' solución acuosa. La porción superior de la solución luego se recupera. Esta porción superior se enriquece en partículas de tamaño más pequeño. El proceso se- puede repetir hasta que se genere un tamaño promedio deseado. ¡ Por toda .esta solicitud, el ·' término "aproximadamente" · se usa para indicar que un valor¦ incluye la desviación estándar de 'error para el dispositivo o método que sé emplea para determinar el valor.
El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para proponer "y/o" a menos que se indique explícitamente para referirse alternativas solamente o a las alternativas son mutuamente exclusivas, aunque la descripción apoya una definición que se refiere a solamente alternativas "y/p".
Como se usa en este documento, y . en las reivindicaciones,. los- términos "anticuerpo" o "inmunoglobulina" se usan intercambiablemente y se refieren a cualquiera de varias 'clases de proteínas estructuralmente relacionadas que funcionan como parte de la respuesta inmunitaria de un animal o recipiente, las proteínas que j incluyen IgG, IgD, IgE, IgA, IgM y proteínas relacionadas..
Como se usa en este documento los términos '"agente inmunogénico" o "inmunógeno" o . "antígeno" · sej usan intercambiablemente para describir una molécula capaz de i inducir una respuesta inmunológica contra sí misma, en la administración a un recipiente, ya sea solo, o en conjunción con un adyuvante, o presentado en un vehículo de expresión..
Como se usa en este documento, una . "molécula de amino" se refiere a cualquier aminoácido, '¦ derivado de aminoácido, o imitación de aminoácido conocido en el campo. En ciertas modalidades, los residuos de la molécula pfoteinica son secuenciales sin ninguna molécula no de amino qüe interrumpa la secuencia de residuos de molécula dé amino. En otras modalidades, la secuencia puede comprender una o más porciones de molécula no de amino. En modalidades i particulares, la secuencia de residuos de la molécula proteinica se puede interrumpir por una o más porciones de molécula no de amino. j Por consiguiente, el término "composición i proteinica" incorpora secuencias de moléculas de amino que ¦ i comprenden por lo menos uno de los 20 aminoácidos comunes en proteínas naturalmente sintetizadas, o por lo menos un aminoácido modificado o inusual. ¡ ¦ Como se usa en este documento, el término "tratamiento" o "que trata" propone · cualquier tratamiento de una enfermedad o condición en un paciente, que incluye: ¦ · prevenir o proteger contra la enfermedad o' ' condición, es decir, provocar que los ¦ síntomas clínicos j no se desarrollen, por ejemplo, en un sujeto, en riesgo de sufrir tal enfermedad o condición, previniendo en consecuencia sustancialmente el inicio de la enfermedad o condición, ' · j • inhibir la .enfermedad o condición, es decir, detener o suprimir el desarrollo de síntomas clínicos y/o • aliviar la enfermedad o condición es. decir, provocar la regresión de los síntomas clínicos.
Otros objetivos., características y ventajas-¦ de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. 'Se debe entender, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos,: aunque indican modalidades específicas de la invención, se proporcionan a manera de ilustración solamente, puesto que varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención, serán evidentes para aquellas- personas expertas en el campo a partir de esta descripción detallada.
Las observaciones a la fecha (Han y colaboradores, 2005) sugirieron que para ser efectivo en la autoinmunidad, la terapia de - péptidos tendría .que fijar 'como- 'objetivo múltiples especificidades de epítopo. Los péptidos 'solubles pueden inducir a la' tolerancia de células T específicas de péptido, pero no pueden alterar las . respuestas autoinmunitarias poliespecíficas . Los inventores razonaron que sería sumamente impráctico lograr esto con los péptidos debido a que, en el caso del IGRP solo, esto- requeriría varios miligramos de péptidos por. dosis. Debido a, que los péptidos son mucho más tolerogénicos (es decir, en cantidades menores) cuando se enlazan a las moléculas MHC en los APCs fijos ( iller y colaboradores, 1979), se contempló que el suministro sistémico de los complejos de antígeno/MHC, por i ejemplo, complejos de péptido/MHC (sin ' moléculas coestimuladoras ) en las nanoesferas podría ser más tólerogénico que los péptidos solos. Esto se cree que evolucionó a partir de ' la disponibilidad de un reactivo concebido, inicialmente para representar, la inflamación de', los islotes. Los inventores buscaron suministrar específicamente una sonda apta para la formación de imágenes por resonancia magnética (MR) para las células T CD8+ similar a 8.3 circulantes (nanoesferas de . óxido de . hierro cubiertas ¦ con complejos NRP-V7/Kd) (Moore y colaboradores, 200:4)-. En particular, -los inventores contemplaron recubrir estás nanoesferas con varios complejos de antígeno/MHC. diferentes como una forma de inducir la . supresión simultánea de múltiples especificidades de células T abajo del umbral requerido para el. desarrollo ' de TlD. de manera más sorprendente, se descubrió que los complejos pMHC unidos a un soporte sólido . funcional al expandir, en una ¡ manera específica . de epítopo, células CD8+ autorreactivas experimentadas con autoantígenos que suprimen el reclutamiento de otras especificidades autoantigénicas .' Esta vía terapéutica explota un nuevo paradigma en la progresión de respuestas autoinmunitarias clónicas que permite el| diseño racional de "nanovacunas" específicas de enfermedad capaces de alterar la autoinmunidad sin deterior la inmunidad sistémica, un objetivo buscado por mucho tiempo en la , terapia de estos trastornos.. De acuerdo' con el paradigma anterior, cualquier especificidad de epítopo solo (pMHC) implicada en la enfermedad (entre cientos) se puede usar, cuando se recubre como un ligando en las NPs, para alterar las respuestas autoinmunitarias complejas. El componénte de i . soporte de partícula/sólido es esencial, debido a que las pMHCs solubles multiméricas no pueden inducir el tipo de i respuestas inmunes inducidas por sus contrapartes acopladas a j NP. La partícula permite la multimérización superior de las pMHC y proporciona estas pMHCs con propiedades retipulantes receptoras potente. Por lo tanto, este paradigma y el procedimiento terapéutico' que permiten su descubrimiento proporcionan una plataforma para una nueva clase de terapéuticos en autoinmunidad. . ! I Se contempla que las nanoesferas recubiertas con complejos de- antígeno/MHC (complejo de antígeno/MHC/nanoesfera) se expandirá el tipo de células CD8+ autorreactivas antipatogénicas de baja . avidez que proporcionan protección de T1D en ratones tratados con APL (Han y colaboradores, 2005; Maree y . colaboradores, -2006). También se contempla que estas nanoesferas expandirán los ¦· ¦ ' I acervos pre-existentes de células T CD8+ autorreactlvas de memoria (es decir, no inducen células T de memoria de nuevo). Se cree que estos acervos pre-existentes están predominantemente comprendidos (si no exclusivamente) de clonotipos CD8+ autorreactivos de baja avidez ;- (antipatogénicos). Las contrapartes de alta avidez de estas células T (con actividad patogénica) . no sobreviven ¡ in vivo como las células de memoria, posiblemente, pero no · Limitando la invención a ninguna teoría particular, debido a que se someten a la muerte celular inducida . por activación en la exposición crónica a su autoantígeno de células, beta objetivo endógeno. Se cree que estas nanoesferas no necesitan tener que fijar como objetivo una población prevalente de células T CD8+ autorreactivas para ser efectivas: se obtuvieron resultados similares con nanoesferas recubiertas i con un complejo de péptido/MHC subdominante. Además, . se; cree que esta tecnología no requiere el diseño de los APLs de avidez definida (diferente al caso con los péptidos), y i de esta manera tiene el potencial de alojar cualquier antígeno objetivo u objetivo, de péptido/MHC. Se contempla ¡que esta tecnología restaurará la normoglicemia en los ratones NOD con T1D recientemente diagnosticada, en velocidades qué son por lo menos comparables, sino mejores, que aquellas bbtenidas con el tratamiento de mAb . anti-CD3, un procedimiento no especifico de antigeno que ha mostrado alguna ' promesa en ensayos clínicos (Herold y colaboradores, 2002; Keymeulen y colaboradores, 2005) . i .
I ¦' Se cree que las composiciones de la invención se pueden usar para expandir acervos pre-existentes de . células T CD8+ autorreactivas de memoria (es- decir, no parece que son capaces de inducir células T de memoria de nuevo) . Estos acervos pre-existentes están predominantemente comprendidos (si no exclusivamente) de clonotipos CD8* autorreactivos de baja avidez ( anti-patogénicos ) . Las contrapartes- de alta avidez de estas células T (con actividad patogénica) no sobreviven in vivo como las células de memoria y existen predominantemente como células T vírgenes. Se contempla adicionalmente que las células T vírgenes se someten a la muerte celular en el acoplamiento de complejos de autoantígeno/ HC/nanoesfera en ausencia de la coestimulación y de esta manera la invención puede suprimir tanto células T patogénicas vírgenes como expandir células T de memoria antidiabetogénicas . Las composiciones descritas no necesitan fijar como objetivo una población preválente de células T CD8+ autorreactivas . que son efectivas. En- ¡ciertas modalidades, las. composiciones y métodos se pueden usar.,para incluir tolerancia de células T autorreactivas.
Se contempla que las nanoesferas biodegradables , bioabsorbibles tendrán resultados sorprendentes e inesperados comparados con los complejos de pMHC/antígeno recúbiertos sobre un soporte . sólido no biodegradable, no bioabsorbible. Eistos resultados inesperados incluyen toxicidad disminuida. La toxicidad disminuida puede referirse a una reducción en la acumulación de la nanoesfera en órganos y/o tejidos por todo el cuerpo. La toxicidad disminuida también puede referirse a una disminución en una respuesta biológica indeseadá, tal como una disminución en la inflamación o una disminución en el daño de tejido de órganos por todo el cuerpo. La inflamación y daño de tejido son, evaluaciones que se pueden determinar fácilmente por el artífice experto' ,mediante métodos conocidos. También se contempla que las naríoesferas biodegradables, bioabsorbibles sean más toleradas ! por el cuerpo. Esto puede conducir a una reducción en la dosis terapéutica o una respuesta terapéutica de incremento o más eficiente. La respuesta terapéutica ya. que se rela iona con la autoinmunidad se puede determinar por ensayos descritos en los ejemplos .
En una modalidad de la. invención,- el material biodegradable, bioabsorbible se elige por el médico' experto con base en la vida media in vivo predicha de la nanoesfera.
La vida media es una que se puede determinar fácilmente- con base en las propiedades físicas de la nanoesfera tal como el material usado y el tamaño de la nanoesfera. En una modalidad preferida, la velocidad de degradación corresponde al cuadro de tiempo que el médico determina que es en el cual se logra el efecto terapéutico máximo. Por lo tanto, se contempla que las nanoesferas biodegradables, . bioabsorbibles , tendrán potencial terapéutico mejorado y superior debido a la selección del material que se degradará dentro de : un cuadro de tiempo predicho y tendrá por lo menos efectos secundarios adversos. 1 II. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y ADMINISTRACIÓN La. presente invención incluye métodos para prevenir 0 mejorar una condición autorreactiva'. Como tal, la Invención contempla "vacunas" o modificadores de sistema inmunológico para el uso en varias modalidades. Las composiciones propuestas que . son adecuadas para el uso como una vacuna se pueden preparar a partir de moléculas autorreactivas incluyendo proteínas autorreactivas ¦ y sus fragmentos. La invención incluye composiciones que se pueden usar para inducir o modificar una respuesta inmunitaria contra un antígeno autorreact'ivo, por ej.emplo, un polipéptido, un péptido, un carbohidrato, un lípido u otra molécula o fragmento molecular y contra el desarrollo de una co dición o enfermedad provocada por tal respuesta autoinmunitaria.
Las composiciones de la ¦ invención sé pueden administrar convencionalmente de manera parenteral, mediante inyección, por ejemplo, intravenosa, subcutánea o intramuscularmente . Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones orales. Las formulaciones orales incluyen tales excipientes normalmente empleados como, por ejemplo, grados farmacéuticos de mani.tol, lactosa, almidón, ' estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, . carbonato de magnesio y similares. Etas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen aproximadamente 10% a aproximadamente 95% de ingrediente activo, ¦ de1 manera preferente de aproximadamente 25% a aproximadamente 70%.
Típicamente, las composiciones de la invención se administran en una manera compatible con la formulación de dosificación, y en tal cantidad como será terapéuticamente efectiva y modificación inmune. La cantidad que se administra depende del sujeto que se trata. Las cantidades precisas de ingrediente activo requerido para ser administrado ¡dependen de la evaluación del profesional. Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuados son del orden de diez a varios cientos de nanogramos o microgramos de complejo de antígeno/MHC/nanoesfera por administración. Los regímenes adecuados para la administración inicial y refuerzos también son variables, pero se tipifican por una administración inicial seguida por administraciones subsecuentes.
La manera de aplicación se puede variar ampliamente. Cualquiera de' los métodos convencionales para la administración de una vacuna es aplicables. Esto se cree que incluyen aplicación oral sobre una base fisiológicamente aceptable sólida o una dispersión fisiológicamente aceptable, parenteralmente, mediante inyección y similares. La dosificación del complejo de antigeno/MHC/na.noesfera dependerá de la vía de administración y variará de; acuerdo con el tamaño y la salud del sujeto. ¡ En muchos casos, será deseable tener múltiples administraciones de un complejo de péptido/MHC/nanoesifera, de aproximadamente, a lo sumo de aproximadamente o por lo menos de aproximadamente 3, . 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más. Las administraciones variarán normalmente de intervalos de 2 días a doce semana, más usualmente de intervalos de una o dos semanas. Los refuerzos periódicos en intervalos de 0.5-5 años, usualmente dos años, serán deseables para mantener la condición del sistema inmunológico . El curso de las administraciones se. puede seguir por ensayos para respuestas inmunes autorreactivas y actividad de células T.
A. Terapia de Combinación Las composiciones y métodos relacionados de la presente invención, particularmente la administración de un complejo de antigeno/MHC/nanoesfera, también se pueden usar en combinaciones .¦¦¦ con la administración de terapias adicionales. Estos incluyen, pero no se limitan1 a, la administración de terapias o tratamientos' inmunosupresores o moduladores. 1 En un aspecto, se contempla que un complejo de antigeno/MHC/nanoesfera se use en conjunción con un tratamiento de citocinas. Alternativamente, la administración de complejos de antigeno/MHC/nanoesfera se puede proceder o seguir del otro tratamiento en intervalos que varían de minutos a semanas. En modalidades donde los otros agentes y/o complejos de antigeno/MHC/nanoesfera se administra separadamente, aseguraría en general que un período de tiempo significativo no expiraría entre el tiempo' ¦ de cada suministro, tal que. el agente y el complejo de antigeno/MHC/nanoesfera aún sería capaz de ejercer un efecto ventajosamente combinado en el sujeto. En tales casos, se contempla que se pueda administrar ambas modalidades dentro de aproximadamente 12-24 horas del uno al otro, de manera más preferente, dentro de aproximadamente 6-12 horas del uno al Otro. En algunas situaciones, puede ser deseable prolongar el período de tiempo para la administración significativamente, :sin embargo, dondé varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) ¡o varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 1 u 8) transcurre entre las administraciones respectivas.
Sé pueden emplear varias combinaciones por ejemplo la administración de complejo de antigeno/MHC/nanoesfera es 5 "A" y el agente adicional es "B": ¦> A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/3/A B/B/A/B A/A/B/B . A/B/A/B A/B/B/A/ B/B/A/A' ' B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/ A/A/B/A La administración de las composiciones del 'complejo Q de péptido-MHC de la presente invención a un paciente/sujeto seguirá los protocolos generales para la administración de tales compuestos, . tomando en cuenta la toxicidad, si: la hay. Se espera que los ciclos de tratamiento se repitieran como sea necesario. También se contempla que varias terapias estándares, tal como hidratación, se pueden aplicar en combinación con la terapia descrita. ; B. Composiciones Farmacéuticas En algunas modalidades, las- composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto. Diferentes, aspectos Q de la presente invención implican administrar' una cantidad efectiva de una composición de complejo -de ¦antígeno/MHC/nanoesfera a un sujeto. Adicionalmente, tales composiciones se pueden administrar en combinación con modificadores del sistema inmunológico . Tales composiciones se disolverán o dispersarán en general en un portador o medio acuoso farmacéuticamente aceptable. : Las frases ' "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se refieren a entidades y composiciones moleculares que no producen · una' reacción adversa, alérgica, u otra reacción inconveniente cuando se administra a un animal, · o humano. Gomo se usa en este documento, "portador farmacéuticamente 'aceptable" 1 incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes de retraso isotónicos y absorción, y similares. El uso de tales medios y agentes para las sustancias, activas farmacéuticas es bien, conocido en el campo. Salvo en la medida como cualquier medio o agente convencional · sea incompatible con los ingredientes activos, su uso en las composiciones inmunogénicas y terapéuticas se contempla. 1 Los compuestos activos de la presente invención se pueden formular para la administración parenteral, por ejemplo, formulados para la inyección a través de :las vías intravenosas, intramusculares, ¦ subcutáneas ¡o aún intraperitoneales . La preparación de una composición acuosa que contenga un complejo de antigeno/MHC/nanoesfera que modifique la condición inmune del sujeto será conocida por aquellas personas de experiencia en el campo en vista de la I ¦ i presente descripción. Típicamente,, tales composiciones se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; formas sólidas adecuadas para el uso para preparar soluciones o suspensiones o en la adición de un lípido antes de la inyección también se pueden preparar; y, las preparaciones también se pueden emulsificar .¦ Las formas farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite- de ajonjolí, aceite de cacahuate, o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los. pasos la forma debe ser estéril y debe ser fluida al ' grado que se pueda inyectar fácilmente. También debe ser estable 'bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento . y se deben conservar contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. ¦ , Las composiciones se pueden formular, en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables, incluyen las sales de adición ácidas (formadas con los grupos aminos libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídricos o fosfóricos, o tales ácidos orgánicos como acéticos, Oxálicos, tartáricos, mandélicos, y similares. Las sales formadas . con los grupos cárboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidrókido de sodio, potasio, amonio, calcio, o férricos, y tales bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaina y similares.
El portador también puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etan.ol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y poli (etilenglicol) í liquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidéz apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de. un recubrimiento, . tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión, y mediante el uso de tensoactivos . La prevención de la acción de los i microorganismos se puede llevar a cabo por varios agentes antibacterianos y antifúngicos , por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isótónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede 1 llevar a cabo mediante el uso en las composiciones de los agéntes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio I y gelatina.
Se preparan soluciones inyectables estériles al . ¦ I ¦ .. incorporar los compuestos activos en la cantidad requerida en el solvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados en lo. anterior, como es requerido, seguido por esterilización. La esterilización de la- solución se hará de tal manera para no disminuir las propiedades antipatpgénicas del péptido/MHC/nanoesfera . En general, las dispersiones se preparan al ' incorporar los diversos ingredientes ¦ activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados en lo anterior. En el caso dé polvos estériles para la ¦ preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado por vacío y de secado por congelación, que 'producen un polvo del ingrediente activo, más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente esterilizada del mismo. Un método de. esterilización de la solución es filtración estéril, . sin embargo,, esta invención se propone para incluir cüalquiér método de esterilización : que no disminuya significativamente las propiedades antipatogénicas de los complejos de péptido/MHC/nanoesfera . Los métodos de esterilización que -implican calor y presión intensos, tal como autoclave, pueden comprender la estructura terciaria del complejo, disminuyendo de esta manera significativamente las propiedades anti-patogénicas de' los complejos de • i péptido/MHC/nanoesfera . ' ' ' La administración de las . composicion s de ¡ acuerdo con la presente invención será típicamente . a través de cualquier vía común.. Esto incluye, pero no' se l!imita a inyección ortotópica, intradérmica , ' sub utánea, intramuscular, intraperitoneal , intranasal, o intravenosa. En ciertas modalidades, una composición de vacuna se puede inhalar (por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 6,651,655, que se incorpora específicamente a manera de referencia; en su totalidad) .
Una cantidad efectiva de composición terapéutica profiláctica se determina con .base en el objetivo propuesto. Él término "dosis unitaria" o "dosificación" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas para el uso en un sujeto, cada unidad que contiene una cantidad predeterminada de la composición calculada para producir las respuestas deseadas planteadas, en lo anterior en asociación- con su administración, es decir, la vía y régimen apropiados. La cantidad que se administra, tanto dé acuerdo con el número de tratamientos y dosis unitaria, depende del resultado y/o protección deseados. Las -cantidades precisas 1 de la • composición también dependen en la evaluación del profesional y son peculiares a. cada uno de los factores individúales que afectan la dosis incluyen estado físico y clínico del sujeto, I vía de administración, objetivo, propuesto de tratamiento (alivio de síntomas versus cura) , y potencia, estabilidad, y toxicidad de. la composición particular. En la formulación, las soluciones se administrarán en una manera compatible con la formulación de dosificación y en tal cantidad como es terapéutica o profilácticamente efectiva. Las formulaciones I se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tal como el tipo de soluciones inyectables descritas en lo anterior. . j C. Administración In V tro o Ex Vivo Como se usa en este documento, el ¡término ', ¦ l administración in vitro se refiere a manipulaciones llevadas a,, cabo en células removidas desde o fuera de un 'sujeto, incluyendo, pero no limitado a células en el cultjivo. El término administración ex vivo se refiere a célulasj que se ; ' ' I han manipulado in vitro, y se administran subsecuentemente a un sujeto. El término administración in vivo incluye todas : I las manipulaciones llevadas a cabo dentro de un ¡ sujeto, ; i incluyendo administraciones. ' 1 En ciertos aspectos de la presente .invención, las composiciones se pueden administrar ya sea. in vitro, ex vivo, ¦ . . ¦ I o' in vivo. En ciertas modalidades in vitro, las .cé|lulas T autólogas se incuban con composiciones de esta invención. Las células luego se- pueden usar para análisis in - vitro,.- o alternativamente para la administración ex vivo.
III. COMPLEJOS DE MHC Los antigenos, incluyendo segmentos, fragmentos y otras moléculas derivadas de una especie a tigénica, incluyendo pero no limitado a péptidos, carbohidratos, lipidos u otras moléculas presentadas por moléculas MHC clásicas y no clásicas de la invención se forman en complejo típicamente o se acoplan operativamente a una molécula MHC o derivado de la misma. El reconocimiento de antígeno por los linfocitos T es restringido por complejo mayor de histocompatibilidád (MHC). Un linfocitO' T dado reconocerá un antígeno solo cuando se enlace a una molécula MHC particular. En general, los linfocitos T se estimulan solamente en presencia de moléculas auto MHC, y el antígeno es reconocido como el fragmento del antígeno enlazado a las moléculas auto MHC. La restricción de MHC define la especificidad de linfocito T en términos del antígeno reconocido y en i términos de la molécula MHC que se enlaza a su. fragmento (s) antigénico. En aspectos particulares y otros- antigenos se parearan con ciertas moléculas MHC o polipéptidos derivados de las mismas . . : ' El término "operativamente acoplado" o "recubierto" como se usa en este documento, se refiere a una situación donde el polipéptido individual' (por ejemplo, MHC) - y componentes antigénicos (por ejemplo, péptido) se combinan para formar el complejo activo antes de enlazarse en el sitio objetivo, por ejemplo, una célula inmune. Esto incluye la situación donde los componentes de complejo de polipéptido individuales se sintetizan o se expresan recombinantémente y i se aislan subsecuentemente y se combinan para formar un complejo, in vitro, antes de la administración a un sujeto; la situación donde un polipéptido quimérico o de fusión (es decir, cada componente de proteina discreto del complejo está contenido en una cadena de polipéptido individual) se i sintetiza o se expresa recombinantémente como un complejo intacto. Típicamente, los complejos de polipéptido se agregan a las nanoesferas para producir nanoesferas con complejos de polipéptido absorbidos o acoplados que tienen una relación de número de moléculas: número de relaciones de nanoesfera de aproximadamente, por lo menos aproximadamente o a lo' sumo de aproximadamente 0.1, 0.5, 1, 10, 100, 500, 1000 o más a: 1, más típicamente 0.1:1 a 50:1. El contenido de polipéptido de las nanoesferas se puede determinar usando ' técnicas estándares.
A. Moléculas MHC Los antígenos intracelulares y extracelulares presentan retos muy diferentes al sistema inmunológicp, ambos en términos de reconocimiento y respuesta apropiada. La presentación de antígenos a las células T es mediada 1 por dos ! . 1 clases distintas de moléculas MHC clase I (MHC-I) y MHC clase II (MHC-II), qué usan distintas vías de procesamiento de antigeno. Los péptidos derivados de antígenos intracelulares se presentan a las células T CD8+ por las moléculas MHC clase .. i I, que se expresan en virtualmente todas las células, mientras que los péptidos derivados de ; antígeno extracelularés se presentan a las células T CD4+ por las moléculas MHC-II, Sin embargo, existen ciertas excepciones a I . I esta dicotomía. Varios estudios han mostrado que los péptidos generados de proteínas particuladas o solubles endocítosadas se presentan en moléculas MHC-I en macrófagos así como en células dendríticas. En ciertas modalidades de la invención, un péptido particular derivado' de · un autoantígeno se identifica y . es representado · en el compléjo de péptido/MHC/nanoesfera . en el contexto de un polipéptido de MHC clase I o II apropiado. En ciertos aspectos, la ¦ ' i constitución genética de un sujeto se puede' evaluar para determinar que polipéptido MHC se va a usar para un paciente particular y un conjunto de péptidos particulares.
Las moléculas MHC no clásicas también se contemplan i I para el uso en los complejos de MHC de la invención. Las moléculas MHC no clásicas no son polimórficas, conservadas entre las especies, y poseen bolsas de enlace de ligandos, reducidas, profundas, hidrofóbicas . Estas bolsas de enlace son capaces de presentar glicolipidos y fosfolipido;s a las células T Exterminadoras Naturales (NKT) . Las ' células N T representan una población de. linfocitos única que coexpresa los marcadores de células NK y un receptor de células T semi-invariante (TCR) . Se implican en la regulación de respuestas inmunes asociadas con una amplia gama de enfermedades!.
B. Componentes Antigónicos Ciertos aspectos de la invención incluyen métodos y composiciones con relación a. las composiciones antigénicas que incluyen segmentos, fragmentos, o ¦ '.epítopos de polipéptidos, péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, lipidos y otras moléculas que provocan o inducen una respuesta antigénica, referidos en general como antigenos. En particular, los autoantigenos, o segmentos antigénicos o fragmento de tales . autoantigenos, que conducen a la destrucción de una célula a través de una ; respuesta autoinmunitaria, se pueden identificar y usar : en la fabricación de un complejo de MHC/nanoesfera descrito en este documento. Tales autoantigenos se pueden presentar en los islotes pancreáticos o células de los islotes pancreáticos o células que soportan las células de los islotes . pancreáticos .
Las modalidades de la invención incluyen composiciones .y métodos para la modulación- de una respuesta inmunitaria contra una célula particular o conjunto de células que llevan a. cabo una función fisiológica particular. 1. Componentes de Péptido y Composiciones Proteinicas Los polipéptidos y péptidos de la invención se pueden modificar mediante varias supresiones, insercibnes y/o sustituciones de aminoácido. En modalidades particulares, los polipéptidos modificados y/o péptidos son capaces de modular una respuesta inmunitaria en un sujeto. Como se usa, en este documento, una "proteína" o "polipéptido" o . "péptido" se refieren a una molécula que comprende por lo menos cinco residuos de aminoácido.' En algunas modalidades, se emplea una versión de tipo natural de una proteína o péptido, sin embargo, en muchas modalidades de . la invención, una ¡proteína o polipéptido modificado se emplea para generar un icomplejo de péptido/MHC/nanoesfera . Un complejo de péptido/MHC/nanoesfera se puede . usar para generar una i respuesta inmunitaria y/ó para modificar la población de células T del sistema inmunológico (es decir, re-educar el sistema inmunológico) . Los términos descritos en ló anterior se .pueden usar intercambiablemente en este documento. Una "proteína modificada" o "polipéptido modificado" o "péptido modificado" se refiere a una proteína o polipéptido cuya estructura química, particularmente su secuencia de aminoácidos, se altera con respecto a la proteína o polipéptido de tipo natural. En algunas modalidades, una proteína o polipéptido o péptido modificado -tiene : por lo menos una actividad o función modificada (el reconocimiento de esas proteínas o polipéptidos . o péptidos puede tener i múltiples actividades o funciones) . Se contempla específicamente que una proteína o polipéptido o péptido modificado se puede alterar con respecto a una actividad o función que todavía retiene una actividad o función de tipo natural en otros aspectos, tal como inmunogenicidad o capacidad de interactuar con otras células del sistema inmuno-lógico cuando en el contexto de un' complejo de MHC/nanoesfera . j Los péptidos de la invención incluyen cualquier péptido autorreactivo . Los péptidos . autorreactivos. incluyen, pero no se limitan, a hInsB10-i8 (HLVEALYLV (SEQ ID' NO:l)), hIGRP228-236 (LNIDLLWSV (SEQ ID NO:2)), hIGRP265-273 (VLFGLGFAI (:SEQ ID NO: 3)), IGRP206-214 (VYLKTNVFL (SEQ ID NO:4)), ¡hIGRP206-214 (VYLKTNLFL (SEQ ID NO: 5)), NRP-A7 (KYNKANAFL (SEQ ID NO:6)), NRP-I4 (KYNIANVFL (SEQ ID N0':7)), NRP-V7 ( YNKANVFL I (SEQ ID NO:8)), YAI/Db (FQDENYLYL (SEQ ID NO:9)) y/o INS Bi5-23 (LYLVCGERG (SEQ ID NO: 10)), así como . péptidos y proteínas dados a conocer en la publicación de E.U.A. 20050202,032, que se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad. Otros péptidos- que se pueden usar en conjunción con la invención como péptidos autorreactivos o como péptidos de control incluyen, pero no se limitan a INS-I9 . (LYLVCGERI (SEQ ID N0:11)), TUM (KYQAVTTTL (SEQ ID N0:12)), y G6Pase (KYCLITIFL (SEQ ID N0:13)). En ciertos aspectos, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más péptidos se pueden usar. Ejemplos de péptidos que se pueden usar en conjunción con la presente invención también incluyen aquellos proporcionados en la Tabla 1. Estos péptidos se pueden asociar con nanoesfera/moléculas ¦ MHC o múltiples péptidos se. pueden asociar con una nanoesfera común y una o más molécula MHC . · La administración de combinaciones de estos péptidos incluye la administración de una población de nanoesferas que tienen múltiples péptidos unidos y/o la administración de múltiples poblaciones de nanoesfera que tiene cada una un péptido especifico unido o una combinación de tales nanoesferas . que incluyen nanoesferas con 1, ¡2, 3, 4, 5, 6, o más péptidos unidos a 1, 2, 3, 4,' 5, 6, o más i nanoesferas.
TABLA 1A epitopos restringidos de HLA clase I para TID ¦ Antigéno Epitopo¦ HLA ' Secuencia de Componentes . Referencias • aminoácidos ' GAD65 114-123 A2 VMNILLQYVV Reactividad detectada en Blancou y (SEQ' ID ratones HHD inmunizados colaboradores N0:14) y pacientes TID 2007, Panina- Bordignon y i colaboradores 1.995, Mallone y colaboradores .2007' 536- 545 A2 RMMEYGTTMV Reactividad detectada en ' Blancou y . (SEQ ID ratones. HHD inmunizados colaboradores NO: 15) con plásmidos y 2007, pacientes T1D GFAP 143- 151 A2 NLAQTDLATV Reactividad detectada en Ouyang y 5 (SEQ ID pacientes T1D colaboradores NO:16) 2006! .214-222 A2 QLARQQVHV Reactividad detectada en Ouyang y 1 (SEQ ' ID pacientes T1D colaboradores NO: 17) 20061 IÁ-2 172-180 A2 SLSPLQAEL Reactividad detectada en Ouyang y (SEQ ID pacientes T1D colaboradores NO: 18) 2006( 482-490 A2 . SLAAGV LL Reactividad detectada en Ouyang y 10 (SEQ ID: pacientes Tl'D colaboradores NO: 19) 2006' 805-813 A2 VIVMLTPLV Reactividad detectada en Blancou y (SEQ ID ratones HHD inmunizados colaboradores NO: 20) con plásmidos y 2007 pacientes T1D 1 ppIAPP 5-13 A2 KLQVFLIVL Reactividad detectada en Pana'giotopoulos (SEQ ID pacientes T1D y colaboradores y y (SEQ ID pacientes T1D ' colaboradores NO: 22) 2006 IGRP 152-160 A2 FLWSVFMLI Reactividad detectada en Ouyang y (SEQ ID pacientes T1D colaboradores NO: 23) 2006 .211-219 A2 NLFLFLFAV Reactividad detectada en Jarchum 20 y ¦ (SEQ ID pacientes T1D colaboradores NO:24) 2008 215-223 A2 FLFAVGFYL Reactividad detectada en Ouyang y (SEQ ID pacientes T1D colaboradores NO:25) 2006, Jarchum y colaboradores 2008 222-230 A2 . YLLLRVLNI Reactividad detectada en Jarchum y (SEQ ID ' pacientes T1D colaboradores NO:26) 2008 228-236 ?2 LNIDLLWSV Reactividad para el Takaki- y (SEQ ID epitopo correspondiente colaboradores NO:2) de TGRP de murino .2006 (difiriendo en 2 aminoácidos) detectado en ratones' HHD inmunizados 265-273 A2 VLFGLGFAI Reactividad detectada en Takaki (SEQ ID ratones HHD inmunizados colaboradores NO: 3) y pacientes¦ TID en el 2006; Unger inicio reciente colaboradores 2007 , Jarchum colaboradores 2008 293-301 A2 RLLCALTSL Reactividad detectada Ouyang (SEQ ID pacientes TID colaboradores NO:27) 2006 i Pro- L2-10 A2 ALWMRLLPL Reactividad detectada en Mallone insulina (SEQ ratones HHD y pacientes colaboradores NO: 28) TID- 2007 > Jarchum' colaboradores 20071 L3-11 A2 LWMRLLPLL Reactividad para el Jarchum (SEQ epitopo correspondiente colaboradores NO: 29) de pro-insulina 1 de 2007; murino . (difiriendo a 5 aminoácidos) detectada en ratones HHD L6-14 . A2 RLLPLLALL Reactividad detectada en Mallone (SEQ ID pacientes TID colaboradores NO: 30) 2007' B5-14 A2 HLCGSHLVEA Reactividad para el Jarchum (SEQ ID epitopo de pro-insulina colaboradores NO: 31) 1 de ratón (difiriendo 2007 en un aminoácido) detectada en ratones HHD , B10-18 A2 HLVEALYLV Reactividad detectada en Toma ' y (SEQ ID ratones HHD inmunizados colaboradores NO:l) y pacientes TID . 200S , Hassainya y colaboradores 2005,; Pinkse y colaboradores ' 2005 B14 -22 A3, ALYLVCGER Reactividad detectada en Toma 1 y All (SEQ ID pacientes T1D colaborador s NO:32) 2005' B15 -24 A2 LYLVCGERGF Reactividad detectada en Toma : y (SEQ ID pacientes T1D ' colaboradores NO : 33 ) 2005: B17 -25 Al, LVCGERGFF Reactividad detectada en Toma y A3 (SEQ ID pacientes T1D colaboradores NO:34) 2005, Hassainya y -colaboradores 2005 B18 -27 Al, VCGERGFFYT Reactividad detectada en Toma y A2, (SEQ ID pacientes T1D colaboradores B8, NO: 35) 20051 B18 B20 -27 Al, GERGFFYT Reactividad detectada en Toma y B8 (SEQ ID pacientes T1D colaboradores NO:36) 2005 B21 -29 A3 ERGFFYTP Reactividad detectada en Toma y (SEQ ID pacientes T1D colaboradores NO:37) 2005 .
B25 -Cl B8 FYTPKTRRE Reactividad detectada en Toma y (SEQ ID pacientes T1D colaboradores NO:38) 2005 B27 -C.5 B8. TPKTRREAEDL Reactividad detectada en Toma y (SEQ. ID pacientes T1D colaboradores NO: 39) 2005 C20 -28 A2 SLQPLALEG Reactividad detectada en Hassainya y . (SEQ ID ratones HHD inmunizados ' colaboradores NO:40) con péptidos 2005 C25 -33 Á2- ALEGSLQKR Reactividad detectada en Hassainya . y . (SEQ. ID ratones HHD inmunizados colaboradores NO: 1) con péptidos 2005 C29 -A5 A2 SLQKRGIVEQ Reactividad detectada en Hassainya y (SEQ ID ratones HHD inmunizados . colaboradores NO: 42) con péptidos 2005 Al-10 A2 GIVEQCCTSI Reactividad detectada en Hassainya y (SEQ ID' ratones HHD inmunizados colaboradores NO: 3) con péptidos . 2005 ¦ I A2-10 A2 · IVEQCCTSI Reactividad para el Jarchum y (SEQ' ID epítopo de pro-insulina colaboradores NO: 44) 1 de ' ratón 2007 correspondiente (difiriendo en un ; aminoácido) detectada en ratones HHD A12-20 A2 SLYQLENYC ¦ Reactividad detectada en Hassainya y (SEQ ID ratones HHD inmunizados colaboradores NO:45) con.péptidos 2005 GAD65: ácido glutámico descarboxilasa de 65 kDa¡, GFAP: proteína ácida fibrilar glial, IA-2 : antíge-no 2- asociado con insulinoma, ppIAPP: Proteína precursora de. polipéptido ámiloi.de de islotes, IGRP: proteína relacionada ¡ con la subunidad catalítica 6-fosfat.asa de glucosa específica de islotes Tabla IB epítopos restringidos de HLA clase I para MS Antigeno Epitopo HLA Secuencia de Comentarios Referencias aminoácidos MAG 287-295 A2 SLLLELEEV Reconocido por lineas de Tsuchida . y . (SEQ ID células T CD8+ generadas colaboradores . NO:46) de' pacientes' MS e, 1994 individuos sanos MAG ¦ .509-517 A2 LMWAKIGPV Reconocido por líneas de Tsuchida y (SEQ ID células T CD8+ generadas colaboradores .NO: 4.7 ) de pacientes MS e 1994 individuos sanos ¦ MAG 556-564 A2 VLFSSDFRI Reconocido por lineas de -Tsuchida ¦ y . (SEQ ID células T CD8+ generadas colaboradores NO:48) de pacientes MS e 1994 individuos sanos MBP 110-118 A2 , SLSRFSWGA Reconocido por lineas de Tsuchida y (SEQ ID células T CD8+ generadas colaboradores NO: 49) de pacientes MS e '1994, individuos sanos Jurewicz y colaboradores .1998 MOG . 114- 122 A2 KVEDPFYWV Reactividad detectada en Mars y (SEQ ID ratones HHD inmunizados .colaboradores NO:50) con péptidos 2007 .
MOG 166- 175 A2- . RTFDPHFLRV Reactividad detectada en Mars y (SEQ ID ratones HHD inmunizados colaboradores NO:51) con péptidos 2007 MOG 172-180 A2 FLRVPCWKI Reactividad detectada en Mars y (SEQ ID ratones HHD inmunizados colaboradores . NO:52) con péptidos 2007 MOG 179- 188 A2 KITLFVIVPV Reactividad detectada en Mars y (SEQ ID ratones HHD inmunizados colaboradores NO:53) con péptidos 2007 MOG 188- 196 A2 VLGPLVALI Reactividad ¦ detectada en Mars y (SEQ ID ratones HHD inmunizados colaboradores NO:54) con péptidos 2007 MOG 181- 189 A2 T.LFVIVPVL Reactividad detectada en Mars y (SEQ ID ratones HHD inmunizados colaboradores NO:55) con péptidos :2007 .
MOG 205-¦214 A2 RLAGQFLEEL Reactividad . detectada en Mars y (SEQ ID ratones HHD. inmunizados ¦ colaboradores NO:56) con péptidos 2007 PLP 80-8 ¡8 A2 FLYGALLLA Reconocido por lineas- de Tsuchida y (SEQ ID células T CD8+ generadas .co aboradores NO: 57) de pacientes MS e 1994, Dressel individuos sanos y colaboradores 1997 MÍ3P: proteina básica de mielina, MAG: glicoproteina asociada con mielina, MOG: glicoproteina de. oligodendrpcitos de mielina, PLP: proteirta proteolipida En ciertas . modalidades, el tamaño de una proteina. o polipéptido (de .tipo natural o modificados) , incluyendo cualquier complejo de una proteina o péptido de interés y en particular una fusión de MHC/péptido, pueden comprender, pero no se limitan a 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22., 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, i 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, ' 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, ( 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 8B-, 89, ; 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130,' 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 215, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 45.0, 475,. 500, 525, 550, 5Í75, 600, 625, 650, 675, 700, ' 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500 moléculas de amino o mayor, incluyendo cualquier intervalo o valor derivable de los mismos, o derivado de los mismos. En ciertos aspectos, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos contiguos, incluyendo derivados de los mismos, y fragmentos de un autoantigeno, tales como ¡'aquellas i secuencias de aminoácidos dadas a conocer y referidas en este documento, se pueden usar como antigenos. Se contempla que los polipéptidos se pueden mutar mediante ·· truncamiento, volviéndolos más cortos que su forma, de tipo1 natural correspondiente, pero también se podrían alterar al; fusionar o al conjugar una secuencia de proteínas heteróloga con una función particular' (por ejemplo, para presentación: como un ¦complejo de proteínas, para inmunogenicidad mejorada, etc.).
Las composiciones proteínicas se . pueden hacer mediante cualquier técnica conocida por aquellas .personas de experiencia en el campo, incluyendo (i) la expresión de proteínas, polipéptidos, o péptidos a través de técnicas biológicas moleculares estándares, (ii) el aislamiento de compuestos p'roteínicos de fuentes naturales, o Oiii) la síntesis química- de materiales proteínicos. El nucleó;tido así como también la proteína, polipéptido, y secuencias de péptidos para varios genes se han dado a conocer previamente, y se pueden encontrar en las bases de datos computarizadas reconocidas. Una de tal base de datos es las bases de datos GenBank y GenPept ' del Centro Nacional para Información de Biotecnología (o. la red Mundial en ncbi . nlm. nih . gov/ )' . Todo o parte de las regiones, de codificación para estos genes se pueden amplificar y/o expresar usando las técnicas dadas a Conocer en este documento o como sería conocido por i aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo.
Las variantes de secuencia de aminoácido de epítopos autoantigénicos y otros polipéptidos de estas composiciones pueden ser variantes de sustitución, de inserción o supresión. Una modificación en un polipéptido de la invención puede afectar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,' 9, 10, 11, '12, 13, 14, 15-, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 26, ,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 37'8, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390., ¦391, 392, 393, 394, 395,. 3.96, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, .416, 417, 418, 419, 420, 421, .422, 423, 424, 425, 426, .'427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, ¦436, 437, 438,. 439, .440, 441, 442, 443, 444, 44·5, 446, 447, 448, 449, 450, 451, .452, 453, 454, 455, 45.6, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 4!63, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474 , 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 4,87, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500 o más aminoácidos no contiguos o contiguos de. un péptido .o polipéptido, como es comparado con el tipó. natural. Un i péptido o polipéptido. que da por resultado una respuesta autoinmunitaria en particular una respuesta autoinmunitaria patológica se contempla para el. uso n los métodos de la invención. ' Las variantes de supresión carecen típicamente dé uno o más residuos de la secuencia de aminoácido, nativa o de tipo natural. Los residuos individuales se pueden suprimir o un número de aminoácidos contiguos se puede suprimir. Un codón de detección sé puede introducir (mediante sustitución I o inserción) en una secuencia de ácidos nucleicos de codificación para generar una proteina truncada. Mutantes y de inserción implican típicamente la adición de material en un punto no terminal en el polipéptido. Esto puede incluir la inserción de uno o más residuos. Las adiciones terminales, llamadas proteínas de fusión, también se pueden generar.
Las variantes de sustitución contienen típicamente el intercambio de un aminoácido por otro en uno o más sitios dentro de la proteína, y se pueden diseñar para' modular una o más propiedades del polipéptido, con o sin la pérdida de otras funciones o propiedades. Las sustituciones pueden ser conservadoras, es decir, un aminoácido se reemplaza con uno de forma y carga similar. Las sustituciones conservadoras son bien conocidas en el campo- e incluyen, por ejemplo, los cambios de: alanina a serina; arginina a lisina; asparagina a glutamina o histidina; aspartato a glutamato; cisteína a serina; glutamina a . asparagina; glutamato 'a · aspartato; glicina a prolina; histidina a asparagina o glutamina; isoleucina a leucina o valina; leucina a valina o. isoleucina; lisina . a arginina; metionina a leucina o isoleucina; fenilalanina a tirosina, leucina o · metionina; serina a treonina; treonina a serina; triptofano a tirosina; ¡tirosina á triptofano o fenilalanina; y valina a isoleucina o 'leucina. Alternativamente, las sustituciones . pueden ser no conservadoras tal que una función o actividad . de un polipéptido o péptido se afecta, tal como avidez o afinidad para un receptor (es) celular. Los cambios no conservadores implican típicamente la sustitución de un residuo con uno que es químicamente diferente, tal como un aminoácido polar o ¦ i cargado para un aminoácido no polar o no ¦ cargado, y viceversa.
Las proteínas . de la invención pueden ser recombinantes, o sintetizadas in vitro.. Alternativamente, una proteína recombinante se puede aislar de bacterias' u otra célula hospedera.
El término "codón funcionalmente equivalente" se usa en este documento para referirse a codones que codifican el mismo aminoácido, tal como los seis codones para arginina o serina y también se refiere á codones que codifican aminoácidos biológicamente equivalentes (véase la Tabla 2, a continuación) . ¦ i i TABLA 2 Tabla de Codones · aminoácidos y ácidos nucleicos pueden incluir · residuos adicionales, tales como aminoácidos en el N o C terminales ádicionales, o secuencias de ácidos nucleicos 5' o 3', respectivamente, y todavía aún son esenciales como se expone i en una de las secuencias dadas a conocer en este documento, siempre y cuando la secuencia cumpla los criterios expuestos en lo anterior, incluyendo el mantenimiento de la actividad de la proteína biológica (por ejemplo, inmunogenicidad) . La adición de secuencias terminales aplica particularmente a secuencias de ácidos nucleicos que pueden, por ejemplo, incluir varias secuencias no de codificación que flanquean ya sea las porciones 5' o 3 ' ' de la región de codificación.
Se contempla que en las composiciones de' la invención, existen entre aproximadamente 0.001 mg y aproximadamente 10 mg de la proteina total por mi. De esta manera, la concentración de proteínas en una composición puede ser dé aproximadamente, por lo menos aproximadamente .o a lo sumo aproximadamente 0.001, 0.010, 0.050, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9:.0, 9.5, 10.0, 50, 100 ug/ml o mg/ml o más (o cualquier intervalo derivable de los mismos) . De esto, aproximadamente, por lo menos aproximadamente, o lo sumo aproximadamente 1, j2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,- 15, 16, 17, 18, 1 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,i 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45', 46, 47., 48,¡ 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, .59, 60, 61, 62, 63,' 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78,1 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93/ 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% puede ser complejo de péptido/MHC/nanoesfera. · · La presente invención contempla la administración de un complejo' de péptido/MHC/nanoesfera para efectuar un .diagnóstico, tratamiento o terapia preventiva cpntra el desarrollo de una enfermedad o condición asociadas' con las .¦ · i repuestas autoinmunitarias .
Además, la' Patente de E.U.A. No, 4,554,101 (Hopp) , que se incorpora en este documento a manera de referencia, : -. ¦ ; · . 72 enseña la identificación y preparación de epítópos de secuencias de aminoácidos primarias sobre la base de hidrofilicidad. A través de los métodos dados a conocer por Hopp, una persona de experiencia en la técnica seria capaz de identificar epitopos potenciales desde adentro ¡ de una secuencia de aminoácidos' y confirmar su inmunogenicidad .
Numerosas publicaciones científicas también se han dedicado. a la predicción de una estructura secundaria y a la identificación de' epitopos, a partir de análisis de secuencias de aminoácidos (Chou & Pasman, 1974a, b; :1978a,b; 1979). Cualquiera de estas se puede usar, si se desea, para complementar las enseñanzas de Hopp en la Patente de E.U.A. No. 4, 554, 101. 2. Otros Componentes Antigénicos Las moléculas diferentes a los péptidos s'e pueden usar como antígenos o fragmentos antigénicos en complejo con las moléculas MHC, tales moléculas incluyen, pero no se limitan a carbohidratos, lípidos, moléculas pequeñas y similares. Los carbohidratos son componentes mayores de la superficie exterior de una variedad de células.1 Ciertos carbohidratos son característicos de diferentes etapas de diferenciación y muy frecuentemente estos carbohidratos son reconocidos por anticuerpos específicos.. La expresión de carbohidratos distintos se puede restringir a tipos de células especificas. Las respuestas de anticuerpo a los antigenos endometriales y de suero se han mostrado ' que son una característica común de endometr.iosis . Se ha descrito una respuesta de autoanticuerpo en suero en la endometriosis a I una variedad de antígenos previamente identificados, incluyendo glicoproteína de 2-Heremans Schmidt y ánhidrasa carbónica, que es específica para un epítopo de carbohidratos (Yeaman y colaboradores, 2002) .
C. Substratos/Nanoesferas En un cierto aspecto, los complejos dé antigeno/MHC se acoplan operativamente a un substrato. Un substrato puede estar en la forma de una nanopartícula que¦'. comprende un material biocompatible, bioabsorbible . Un substrato también puede estar en la forma de una nanopartícula tal como aquellas descritas previamente n la solicitud dé E.U.A. 12/044,435 que se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad. Las nanopartículas' pueden tener una estructura de . dimensiones variables y i conocida diversamente como una nanoesfera o nanoesfera biocompatible, biodegradable . Tales formulaciones particulares : que¦ contienen un complejo de antigeno/MHC se pueden formar mediante acoplamiento covalente o no covalente del complejo a la nanoesfera.
Las nanoesferas consisten típicamente de ün núcleo sustancialmente esférico y opcionalmente una o más. capas. El núcleo puede variar en tamaño y . composición. Además del núcleo, la nanoesfera. puede tener una o más capas para proporcionar funcionalidades apropiadas, para las aplicaciones de interés. Los espesores de las capas, si están presentes, I puéden variar dependiendo de las necesidades de las aplicaciones especificas. Por ejemplo, ' las capas pueden impartir propiedades ópticas útiles-. ' í Las capas también pueden .impartir funcionalidades químicas o biológicas, referidas en este documento como capas químicamente activas o biológicamente activas,, y 'para esas funcionalidades la capa o capas pueden variar típicamente en espesor de aproximadamente 0.001 micrómetros (1 nanómetro) a aproximadamente 10 . micrómetros o más (dependiendo del diámetro de nanoesfera deseada) , estas capas se 1 aplican típicamente sobre la superficie exterior de la .nanoesfera .
De manera preferente, las composiciones del núcleo y las capas puede variar con la condición de que las nanoesferas biocompatibles' y bioabsorbibles . El núcleo podría ser de composición homogénea, o un compuesto de dos o más clases de material dependiendo de las propiedades ' deseadas .
En ciertos aspectos, se usarán nanoesferas metálicas. Estas nanoesferas metálicas ¦ se pueden formar de Ée, Ca, Ga y similares .
Como se establece previamente, la nanoesfera puede, además del núcleo, incluyendo una o más capas. La nanoesfera puede . incluir una capa que consiste de un azúcar biodegradable u otro polímero. Ejemplos de capas biodegradables incluyen pero no se limitan ', a dextrano, i poli (etilenglicol ) ; poli (óxido de etileno) ; manitol; poli (ésteres ) basados en polilactido (PLA) , poliglicólido (PGA), policaprolactona (PCL); poli (hidroxalcanoato);S de la clase PHB-PHV; y otros poli ( sacáridos ) modificados tales como almidón, celulosa y quitosan. Adicionalmente, la nanoesfera puede incluir una capa con superficies adecuadas para unir las funcionalidades químicas para los sitios de enlace o acoplamiento químicos.
Las capas se pueden producir en las nanoesferas en una variedad de formas conocidas por aquellas personas expertas en el campo. Ejemplos incluyen técnicas de' química de sol-gel tal como se describe por Iler (1979); Brinker y j Scherer (1990). Los procedimientos adicionales para producir capas en las nanoesferas incluyen y técnicas de encapsulación tal como y Brown (1998); Pekarek colaboradores ; (1994); Hanprasopwattana (1996); Davies (1998); y referencias en las mismas. Las técnicas de deposición por Vapor también se ' j pueden usar; véase por ejemplo Golman y Shinohara (2000); y la Patente de E.Q.A. No. 6,387,498. Aún otros procedimientos incluyen técnicas de autoensamblaje de capa por capa t.al como se describe en Sukhorukov y colaboradores (1998); Caruso y colaboradores (1998); Caruso y colaboradores (1999); Patente de E.U.A. No. 6,103,379 y referencias citadas, en este documento.
Las nanoesferas se pueden ' formar al poner en contacto una fase acuosa que contiene el. complejo de antígeno/MHC y un polímero y una fase no acuosa seguido por evaporación de la fase no acuosa para ¦ provocar la coalescencia de las partículas de la fase acuosa como se enseña en la patente de E.U.A. No. 4,589,330 o 4,818,542. Los polímeros preferidos para tales preparaciones son copolímeros o polímeros naturales o sintéticos seleccionados .del grupo que consiste.de agar de gelatina, almidón, arabinogalactano, albúmina, colágeno', ácido poliglicólico, ácido' poliiláctico, glicólido-L (-) -lactido poli (episilon-caprcjlactona, poli (épsilon-caprolactona-CO-ácido láctico), poli (épsilon-caprolactone-CO-ácidd glicólico) , poli (ácido ß-hidroxi-butírico) , poli (óxido de etileno) , polietileno, . poli (alquil-2-cianoacrilato) , poli (metacrilato de hidroxietilo) , poliamidas, poli (aminoácidos) , poli (2-hidroxietil-DL-aspartamida) , poli (éster-urea) , ¦ < poli (L-fenilalanina/etilenglicol/l, 6-diisocianatohexano) . J y poli (metacrilato de metilo). Los polímeros particularmente preferidos son poliésteres, tales como ácido poliglicólico, ácido poliláctico, glicólido-L ( -) lactido poli (épsilon-caprolactona, poli (ácido épsilon-caprolactona-CO-láctico) , y poli (ácido épsilon-caprolactona-CO-glicólico) . Los. solventes útiles para disolver el polímero incluyen:; agua, hexafluoroisopropanol, cloruro de metileno, tetrahidrofurano, hexano, benceno, o sesquidrato de hexafluoroacetona .
D. Complejo de Antigeno-MHC de Acoplamiento con Nanoesfera A fin de acoplar el sustrato o nanoesferás a los complejos de antígeno-MHC se pueden aplicar las siguientes técnicas.
El enlace se puede- generar .al-''- modificar químicamente el substrato o nanoesfera lo cual 1 implica típicamente la generación de "grupos funcionales" sobre la superficie, los grupos . funcionales que son capaces de enlazarse a un complejo de antígeno-MHC, y/o enlazar la superficie opcionalmente de manera química modificada del substrato o nanopartícula con las así llamadas "moléculas de enlace" covalente o no covalentemente enlazadas seguido al hacer reaccionar el complejo de antígeno-MHC ¡con las nanoesferás obtenidas.
El término "molécula de ligadura" significa una sustancia capaz de enlazarse con el substrato o nanoesfera y también capaz de enlazarse a un complejo' de antígeno-MHC .
El término "grupos funcionales" como se usa a partir de ahora no se restringe a grupos químicos reactivos que forman enlaces covalentes, sino también incluye grupos químicos que conducen a una interacción iónica o enlaces de hidrógeno con el complejo de antígeno-MHC . Por otra parte, se debe observar que una distinción estricta entre ( "grupos funcionales" generada en la superficie y las moléculas de ligadura que llevan "grupos funcionales" no' es posible, puesto que algunas veces la modificación de la superficie requiere la reacción de moléculas de ligadura más pequeñas tal como etilenglicol con la superficie de la nanoesfera.
Los grupos funcionales o las moléculas de ligadura que los llevan se pueden seleccionar de grupos aminü, grupos de ácido carbónico, tioles, tioéteres, disulfuros, guanidino, grupos hidroxilo, grupos amina, díoles vecinales, aldehidos, grupos alfa-haloacetilo, organilos de mercurio, grupos éster, haluro ácido, tioéster ácido, anhídrido ácido, isocianatos, isotiocianatos,. haluros de ácido sulfónico, ' imidoésteres , diazoacetatos , sales de diazonio, 1 , 2-dicetonas ,¡. ácidos fosfónicos, ésteres de ácido fosfórico, ácidos sulfónicos, azoluros, imidazoles, índoles, N-maleimidas , compuestos de carbonilo insaturados alfa-beta,, arilhalogenuros o sus deri aeos .
Los' ejemplos 'no limitantes para otras moléculas de ligadura con pesos moleculares más altos son . moléculas de ácido nucleico, polímeros, copolímeros, agentes de acoplamiento polimerizables, sílice, proteínas, y moléculas similares a cadena que tiene una superficie con la polaridad opuesta con respecto al substrato o nanoesfera . · ' Los ácidos nucleicos pueden proporcionar un enlace a las moléculas de afinidad que contienen moléculas de ácido nucleicoi, aunque con una secuencia de complementariedad con respecto a la molécula de ligadura.
Como ejemplos para los agentes de acoplamiento polimerizables, se pueden citar diacetileno, ' butadieno estireno, vinilacetato, acrilato, acrilamida, compuestos de vinilo, estireno, óxido de silicona, óxido de boro, 'óxido de fósforo, boratos, pirrol, polipirroL y fosfatos. 1 La superficie, del substrato o nanoesfera < se puede modificar químicamente, por ejemplo' mediante el enlace de derivados de ácido, fosfónico que tienen grupos reactivos funcionales. Un ejemplo de estos derivados de ácido' 'fosfónico o éster de ácido fosfónico es ácido imino-bis (metile¡nfosfono) carbónico que se puede ' sintetizar de acuerdo con lat reacción de " annich- oedritzer" . Esta reacción de enlace se puede 'llevar a cabo con substrato o nanoesfera como se obtenga ¦directamente del proceso de preparación, o después de. un pretratamiento (por ejemplo con bromuro de trimetilsililo) . En el primer caso el derivado de ácido fosfónico (éster) por ejemplo puede desplazar los componentes del medio de 'reacción i que aún se enlazan a la superficie. Este desplazamiento se puede mejorar a mayores temperaturas. El bromuro de trimetilsililo, por otra parte, se cree que desalquila los agentes formadores de complejo basados en fósforo que contienen grupos alquilo, creando en consecuencia nuevos sitos de enlace para el derivado de ácido fosfónico (éster) . El derivado de ácido fosfónico (éster) o moléculas de ligadura enlazadas al mismo, pueden mostrar los mismos grupos funcionales como los proporcionados en lo . anterior. Un ejemplo adicional del tratamiento superficial de substrato o nanoesfera implica calentamiento en un diol tal como etilenglicol . Se debe observar que este tratamiento puede ser i redundante si la síntesis ya procede en un diol. Bajo estas circunstancias, el producto de síntesis obtenido directamente es probable que muestre los grupos funcionales necesarios. Este tratamiento sin embargo es aplicable a substrato o nanoesfera que se produjeron en los agentes formadores de complejo que contienen N o P. Si tal substrato o partícula se somete a un tratamiento posterior con etilengli'col , los ingredientes del medio de reacción (por ejemplp agente .1 formador de complejo) que se enlazan aún en la- superficie se pueden reemplazar por el diol y/o se pueden desalquilar.
También es posible reemplazar ¦ los. agentes formadores de complejo que contienen N enlazados aún a la superficie de la partícula mediante . derivados de amina primarios que tienen un segundo grupo funcional. La superficie del substrato o nanoesfera también se puede recubrir con sílice. La sílice permite una conjugación química relativamente simple de moléculas orgánicas puesto que la sílice reacciona fácilmente con¦ ligaduraes' orgánicos, tales como triet xisilano o clorosilano. La superficie de la nanoesfera también se puede recubrir por homo o copolímeros. Ejemplos para agentes de. acoplamiento polimeri-zables son - ( 3-aminopropil) -3-mercaptobenzamidina, 3- (trimetoxisilil) propilh'idrazida y 3- trimetoxisilil) propilmaleimida . Otros ejemplos no limitantes de agentes de acoplamiento polimerizables se mencionan en este documento. Estos agentes de acoplamiento se pueden usar individualmente o en combinación dependiendo del1 tipo de copolímero que se genera como un recubrimiento.
Otra técnica de modificación superficial que se puede usar con los substratos o nanoesferas que /contienen compuestos metálicos de transición oxidados es la conversión 'de los compuestos metálicos de transición oxidados; mediante gas de cloro o. agentes de cloración orgánicos a los oxicloruros correspondientes. Estos oxicloruros son capaces de reaccionar con nucleófilos, tales como grupos . hidroxi o amino que se encuentran frecuentemente en las biomoléculas . Esta técnica permite generar una conjugación directa1 con las proteínas, por ejemplo a través de grupo amino de las cadenas laterales de lisina. La conjugación con' las proteínas después de la modificación superficial con oxicloruros también se puede efectuar al usar un ligadura bifuncional, tal como hidrazida de ácido maleimidopropiónico . .
Para técnicas de enlace, no covalente, las · moléculas de tipo cadena que tienen una polaridad o carga opuesta a aquella de la superficie del substrato o nanóesfera son particularmente adecuadas. Ejemplos para las moléculas de ligadura que se pueden enlazar no covalentemente al núcleo/cubierta de la nanoesfera implican tensoactivos aniónicos, catiónicos o zwitteriónicos , proteínas !ácidas o básicas, poliaminas,. poliamidas, polisulfona : ? ácido policarboxílico . La interacción hidrofóbica e'ntre el substrato o la nanoesfera y él reactivo anfifílico que tiene un grupo reactivo funcional puede generar el enlace necesario. En particular, las moléculas de tipo' cadena con carácter anfifílico, tal como fosfolípidos o polisacáridos derivatizados, que se pueden retícula entre sí, son útiles. La absorción de estas moléculas sobre- la superficie; se puede lograr mediante co-incubación. El enlace entre la molécula de afinidad y el substrato o nanoesfera también se puede basar en enlaces de auto-organización, no covalentes. Un ejemplo de los mismos implica sondas de detección simples con biotina como molécula de ligadura y moléculas acopladas a .'avidina o estreptavidina .
Los protocolos para las reacciones de acoplamiento de los grupos funcionales a moléculas- biológicas se pueden encontrar en la literatura, por ejemplo en "Bioconj ugate Techniques" (Greg T. Hermanson, Academic Press 1996). La molécula biológica (por ejemplo, molécula MHC o' derivado de la misma) se puede acoplar a la molécula de' . ligadura, covalente o no covalentemente, en linea con procedimientos estándares de química orgánica tales como oxidación, halogenación, alquilación, acilación, adición, sustitución o ¦i amidación. Estos métodos para acoplar la molécula det ligadura covalente o no ; covalentemente enlazada se puederí aplicar antes del acoplamiento de la molécula de ligadura al substrato o nanoesfera o después. Adicionalmente, es! posible, por medio de incubación, efectuar un enlace directo de moléculas al substrato o nanoesferas correspondientemente pre-tratadas (por . ejemplo ¦ mediante . bromuro . de trimetilsililo) , que muestra una superficie modificada debido a este pretratámiento (por ejemplo una carga ; mayor o superficie polar) .
E. Producción de Proteínas La presente invención describe polipéptidos, péptidos, y proteínas para el uso en varias modalidades de la presente invención. Por ejemplo, péptidos específicos y sus complejos se someten a ensayo por sus capacidades de1 inducir o modular una respuesta inmunitaria. En modalidades específicas, todo o parte de los péptidos o proteínas de la invención también se pueden sintetizar en solución o en un soporte sólido de acuerdo con técnicas convencionales. Varios sintetizadores automáticos son comercialmente disponibles y se pueden usar de acuerdo con protocolos conocidos. Véase, por ejemplo, Stewart y Young (1984);' Tam y colaboradores (1983); Merrifield (1986); y Barany y Merrifield (1979), cada uno incorporado en este documento a manera de referencia. Alternativamente, se puede emplear tecnología., de DNA recombinante en donde una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de la invención se inserta en un vector de expresión, se transforma o se transfecta en una célula hospedera apropiada y se cultiva bajo condiciones adecuadas para la expresión.
Una modalidad de la invención incluye el uso de transferenci de genes a · las células., incluyendo ^microorganismos, para la producción de proteína. El; gen para . -.' ¦ ¦ ¦ · 85 la proteína de interés se puede transferir en células hospederas apropiadas seguido por. el cultivo de las, células bajo las condiciones apropiadas. Se puede emplear un ácido nucleico que codifique virtualmente cualquier polipép,tido . La generación de vectores de expresión recombinan.tes y los elementos incluidos en este documento, son conocidos1 por una persona experta en el campo y se plantean brevemente en este documento. Ejemplos de lineas de células hospederas de mamífero incluyen, pero no se limitan a células Vero¡ y HeLa, otras líneas de células B y T, tales como CEM,. 721.'221, H9, Jurkat, Raji, así. como también líneas de células de ovario de hámster chino, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T31, RIN y células MDCK. Además, se puede elegir una cepa de célula hospedera que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto génico en la manera deseada. Tales modificaciones (por j ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de los productos proteínicos pueden ser importantes para la función de .. la proteína.. Diferentes células hospederas tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y. modificación postraduccional ' de las proteínas. Las líneas de células apropiadas o i sistemas hospederos se pueden elegir para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña expresada.
Se puede usar una variedad de sistemas de selección incluyendo, pero no limitado a timidina cinasa HSV, hipoxantina-guanina-fosforibosiltransferasa, y genes de adenina-fosforibosiltransferasa, en células tk-, hgprt- o aprt, respectivamente. También, la resistencia a antimetabolitos se puede usar como la base de selección: para dhfr, que confiere resistencia al trimetoprim y metotrexato; gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico; neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G418; e hygro, que confiere resistencia a la higromicina.
F. Ácidos Nucleicos La presente invención puede incluir polinucleótidos recombinantes que codifican las proteínas, polipéptidos , péptidos de la invención. Las secuencias de ácidos nucleicos para autoantígenos y moléculas . MHC para presentar los autoantígenos, se incluyen y se pueden usar para preparar un complejo de péptidó/MHC.
Como se usa en esta solicitud, el 1 término "polinucleótido" se refiere a una molécula de ácido' nucleico que y sea es recombinante o se ha aislado libre < de ácido ¦nucleico genómicó total. Incluido dentro del; término ."polinucleótido" son oligonucleótidos (residuos de 100 ácidos nucleicos o menos en longitud), ' vectores reconjbinantes, incluyendo, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos,! virus, y ¦i similares. Los polinucleótidos incluyen, en ciertos' aspectos, secuencias reguladoras, aislada sustancialmente de sus genes de origen natural o secuencias de sus genes de origen' natural o secuencias de codificación de proteínas. Los polinucleótidos pueden ser RNA, DNA, análogos de. los mismos, o una combinación de' los mismos. 1 En este aspecto, el término "gen", "polinucleótido" , o "ácido nucleico" se usan para · referirse . a un ácido nucleico que codifica una proteína, polipéptido, o péptido (incluyendo cualquier secuencia requerida para la transcripción apropiada,, modificación postraduccional, o localización). Como será entendido por aquellas personas expertas en el campó, este término . incluye secuencias genómicas, casetes de expresión, secuencias de cDNA, y segmentos de ácido nucleico diseñados más pequeños que expresan, o se pueden adaptar para expresar, proteínas, polipéptidos, dominios, péptidos, proteínas ·. de fusión y imitantes. Un ácido nucleico que codifica todo o parte de un polipéptido puede contener una secuencia de ácido, nucleico contigua que codifica todo o una porción de tal polipéptido de las siguientes longitudes: 10, 20, 30, 40, 5.0, 60, 70, 80, 90, ¦ 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, . 290, 300, 310, '320, ¦330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400,. 410, 420, ',430, 440., 441, 450, 460, 470, 48.0, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, .750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080,- 1090, 1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, . 7500, 8000, 9000, \ 10000, o más '. nucleótidos, nucleósidos, o pares base. También se contempla1 que un polipéptido particular de una especie dada se puede codificar por ácidos nucleicos que contienen variaciones naturales que tienen secuencias de ácidos nucleicos ligeramente diferentes pero, no obstante, codifican las mismas o la proteína, polipéptido o péptido sustancialmente similares.
En modalidades particulares, la invención se refiere a segmentos de ácido nucleico aislado y 1 vectores recombinantes que incorporan secuencias de a ácido' nucleico que codifican un autoantígéno y/o una molécula1 MHC . El término "recombinante" se puede, usar en. conjunción con un polipéptido o el nombre de un polipéptido, y esto s'e refiere en general a un polipéptido producido- a partir de una molécula de ácido nucleico que se ha ' manipulado iri vitro o que es un producto de replicación de tal molécula.' i Los segmentos de ácido nucleico usados en la ¦' ' '.' ' ¦' 1 presente invención, sin considerar ¦ la longitud ! de la secuencia de codificación misma, se pueden combinar con otras secuencias de ácidos nucleicos, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios . de enzima de restricción adicionales, sitios de clonación múltiples, otros segmentos de codificación, : y similares, tal que su longitud total puede variar considerablemente. Por lo tanto se contempla que un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier . longitud se puede emplear, con la longitud total que se limita de manera preferente por la facilidad de preparación . y usp ' en el protocolo de ácido nucleico recombinante propuesto. En algunos casos, una secuencia de ácido , nucleico puede codificar una secuencia de polipéptidos con secuencias de codificación heterólogas. adicionales, por ejemplo para permitir la purificación del polipéptido, transporte, -secreción, modificación postraduccional, o para beneficios terapéuticos tal como fijación de objetivo o eficacia. Una etiqueta u otro polipéptido heterologo se pueden agregar a la secuencia de codificación de polipéptido modificado/ en donde "heterólogos" se refiére a un polipéptido que no es1 el mismo como el polipéptido modificado. · ' · IV. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO Y TERAPÉUTICOS A. Respuesta inmunitaria y Ensayos , Como se plantea en lo anterior, la invención se refiere para evocar o modificar una respuesta inmunitaria en un sujeto contra un autoantigeno . En una modalidad, la respuesta o condición inmunitaria resultante puede proteger contra o tratar a un sujeto que tiene, se sospecha que tiene, o en riesgo de desarrollar una enfermedad o síntomas relacionados con una respuesta inmunitaria. 1. Inmunoensayos La presente invención incluye la implementación de ensayos serológicos para evaluar si y en qué grado una respuesta inmunitaria está presente, inducida, evocada, o modificada por un complejo de. péptido/MHC/nanoesfera . Existen muchos tipos de inmunoensayos que se pueden implementar. Los inmunoensayos incluidos por la presente invención ¡incluye, pero no se limitan a,, aquellos descritos en la Patente de E.U.A. No. 4,367,110 (ensayo de intercalación de anticuerpos monoclonales dobles) y a Patente de E.U.A. No. 4,452,901 (técnica de western blot) . Otros ensayos ¡incluyen inmunoprecipitación de ligandos' etiquetados e inmunocitoquimica, ambos in vitro e in vivo.
Un método para cuantificar el número de células T i GD8+ especificas de antigenos circulantes es el ensayo de tetrámeros. En este ensayo, un epitopo especifico se 'enlaza a formas tetraméricas sintéticas de moléculas MHC Clase I fluorescentemente etiquetadas. Puesto que las células T CD8+ reconocen el antígeno en la forma de péptidos| cortos enlazados a las moléculas Clase I, las células con el receptor de células T apropiado se enlazará a los tetrámeros etiquetados y se puede cuantificar por citometria · de flujo. Aunque este método es menos consumidor de tiempo' que un ensayo ELISPOT, el ensayo de tetrámero mide solamente el enlace, no la función. No todas las células que se: enlazan. a un antigeno particular se activan necesariamente. Sin embargó, la correlación entre los ensayos · ELISPOT, de tetrámero y de citotoxicidad se han mostrado (Goulder y colaboradores, 2000) .
Los inmunoensayos son en general ensayos dé enlace.
Ciertos inmunoensayos preferidos son los diversos^ 'tipos de ensayos inmunoabsorbentes enlazados a enzimas ¦. (ELISAs) , radioinmunoensayos (RIA) o ensayos, basados en cuentas, tal como la tecnología Luminex . RTM . , son conocidos en la! técnica. La detección inmunohistoquímica que usa secciones¦' de tejido también es particularmente útil. , En un ejemplo de ELISA, los anticuerpos o antígenos se inmovilizan sobre una superficie seleccionada, tal como un pocilio en una placa de microtítulo de poliesfireno, tira reactiva, o soporte de columna. Luego, una composición de prueba sospechosa de contener el' antígeno deseado o anticuerpo, ' tal como una muestra clínica, :se agreta a los . pocilios. Después del enlace, y. lavado para remover complejos inmune no específicamente enlazados, el ánjzígeno o anticuerpo enlazado se puede detectar. La detección se logra en general mediante la adición de otro anticuerpo específico para el antígeno o anticuerpo deseado, que se enlaza a una etiqueta detectable. Este tipo de ELISA es conocido como un "ELISA de intercalación". La detección' también se puede lograr por la adición de un segundo anticuerpo específico para el antígeno deseado, seguido por la adición de un tercer anticuerpo que tiene afinidad de' enlace para el' segundo anticuerpo, con el tercer anticuerpo que se enlaza a una etiqueta detectable. Variaciones en las técnicas ELISA son conocidas por aquellas personas de experiencia en el campo.
Los ELISA de competición también son posibles en los cuales las muestras de prueba compiten para enlazarse con cantidades conocidas de antígenos o anticuerpos etiquetados. La cantidad de especies reactivas en la muestra desconocida se determina al mezclar la muestra con las 1 especies etiquetadas conducidas antes o durante la incubación con células recubiertas. La presencia dé especies reactivas en la muestra actúa para reducir la cantidad de · especies etiquetadas disponibles para enlazarse al pocilio y de esta manera reduce la señal final. 1 Independientemente del formato empleado, los ELISA tienen ciertas características en común, tal como recubrimiento, incubación o enlace, lavado para ¡ remover especies específicamente no enlazadas, y detección de los complejos inmunes enlazados.
El antígeno a anticuerpos también se pueden enlazar i a un soporte sólido, tal como en la forma de placa, cuentas, tira reactiva, membrana, o matriz de columna y la muestra que se analiza se aplica al antígeno o anticuerpo inmovilizado. En el recubrimiento de una placa con ya sea antígeno o anticuerpo, incubarán en general los pocilios de la 'placa con una solución del antígeno o anticuerpo, ya sea durante la noche o durante un período especificado. Los pocilios de la placa luego se lavarán para remover el . material incompletamente adsorbido. Cualquiera de las superficies disponibles restantes de los pocilios luego se "recubren" con una proteína no específica que es antigénicamente ne'utra con respecto a los antisueros de prueba. Estos incluyen ¡albúmina de suero bovino (BSA) , caseína, y soluciones de polvo de i leche. El recubrimiento permite el bloqueo de los filtros de adsorción no específicos en la superficie inmovilizadora y de esta manera reduce el fondo provocado por el enlace no específico de los antisueros sobre la superficie. ! En los ELISA, es más acostumbrado usar uri ¡medio de detección secundario o terciario antes que un procedimiento directo. De esta manera, después del enlace del antigeno o anticuerpo al pocilio, el recubrimiento con un material no reactivo para reducir el fondo, y el lavado para remover el material no enlazado, la superficie inmovilizadora se pone en contacto con la muestra clínica o biológica que se. somete- a prueba bajo condiciones efectivas para permitir la formación del complejo' inmune (antigeno/anticuerpo). La detecpión del complejo inmune que requiere un ligando o anticuerpo de enlace secundario etiquetado, o . un ligando o anticuerpo de enlace secundario en conjunción con un anticuerpo terciario etiquetado o tercer ligando de enlace.
B. Evaluación de una Respuesta o Condición Autoinmune Además del uso de proteínas, polipéptidos , y/o péptidos trata o prevenir una condición autoinmune, la presente invención contempla el uso de estos . polipéptidos, proteínas, y/o péptidos en una variedad de formas, incluyendo la detección de la presencia de autoantígenos o. una condición autoinmune para. ' diagnosticar la presencie' ' de : ciertas poblaciones o condiciones de células autorreactivas . De acuerdo con la invención, . un . método para¦ detectar la presencia de autorreactividad implica las etapas de obtener una muestra de un individuo, por ejemplo, de l sangré, saliva, tejidos, hueso, músculo, cartílago o piel de una persona. Después del aislamiento de la muestra, los ensayos de diagnóstico que usan los polipéptidos, proteínas, y/o péptidos de la presente invención se pueden llevar a cabo I para detectar la presencia de. autorreactividad, y tales técnicas de ensayó para determinar tal en una muestra son conocidos por aquellas personas expertas en el campo e incluyen métodos tales como ensayos de tejtrámero, inmunoensayos , análisis de western blot, y/o ensayos ELISA.
Como se usa en este' documento la fráse "respuesta inmunitaria" o su equivalente "respuesta inmunológica" se refiere al desarrollo de una célula (mediada por células T específicas de antígeno o sus productos de secreción) dirigida contra un antígeno o un epítopo relacionado de un antígeno. Una respuesta inmunitaria celular es inducida por la presentación de epítopos de polipéptido en asociación con moléculas MHC Clase I o Clase II, para activar ! células auxiliares CD4+ específicas de antígeno y/o células '· T citotóxicas CD8+. La respuesta también puede implicar la activación de otros componentes. : Para propósito de esta especificación i y las reivindicaciones acompañantes los términos "epítopo" y "determinante antigénico" se usan intercambiablemente para referirse a un sitio en un antígeno al cual las células B y/o . ¦ ¦ ¦ i T responden o que reconocen epítopos de. células B se pueden formar tanto a partir de aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento ' terciario i de una proteina. Los epitopos formados a partir de aminoácidos contiguos se retienen típicamente : en la exposición para desnaturalizar los solventes mientras que los epitopos formados por el plegamiento terciario 'se ' pierden típicamente en el tratamiento con la desnaturalización de los solventes. Un epítopo incluye típicamente por lo menos 3, y más usualmente, por lo menos 5 u. 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial ' de epitopos incluyen, por ^ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia, magnética nuclear tridimensional . Véase, por ejemplo, Epitope Mappi.ng Protocols (1996) . Las células T reconocen epitopos' contiguos de aproximadamente nueve aminoácidos para las células CD8 o aproximadamente 13-15 aminoácidos para las células CD . Las células T que reconocen el epitopo .se pueden identificar por ensayos in vitro que miden la proliferación dependiente de antígeno, como es determinado por la incorporación de 3H-timidina por las células T cebadas en respuesta a un epítopo (Burke y colaboradores,' 1994), por el exterminio dependiente de antígeno (ensayo de linfocito T citotóxico, Tigges y colaboradores, 1996) o por la secreción de citocinas. La presencia de una respuesta inmunológica mediada por células se puede determinar mediante ensayos de proliferación (células T CD4+) o ensayos CTL (linfocitos T citotóxicos) .
Como se usa en este documento y ¡en las reivindicaciones, los términos "anticuerpo" o "inmunoglobulina" se usan intercambiablemente y se refieren a cualquiera de varias clases de proteínas estructuralmente relacionadas que funcionan como parte de la respuesta inmunitaria de un animal o receptor, que las proteínas que incluyen IgG, IgD, IgE,' IgA, IgM y proteínas relacionadas.
Opcionalmente, un autoantígeno o e . manera preferente un epítopo de un autoantígeno, se pueden ? conj ugar químicamente a,, o expresar, como, una proteína. de fusión con otras proteínas, tales como proteínas MHC y proteínas ¦ f relacionadas con MHC. - ' Como se usa en este documento los términos "agente inmunogénico" o "inmunógéno" o "antígeno" se usan intercambiablemente para describir una molécula . papaz de inducir una respuesta inmunológica contra sí misma en la administración a un recipiente, ya sea sola, en conjunción con un adyuvante, o presentada en un vehículo de expresión.
C . Métodos de Tratamiento Un método de la presente invención incluye el tratamiento para una enfermedad o condición provocada por uno o más autoantígenos . Un polipéptido inmunogénico de la invención se puede proporcionar para inducir o modificar una respuesta inmunitaria en · una persona que tiene, se sospecha de tener, o está en riesgo de desarrollar una condición- o enfermedad autoinmunitaria . Los métodos se pueden emplear con respecto a individuos quienes han probado ser positivos para autorreactividad o quienes se consideran que están en riesgo para desarrollar tal condición o condición relacionada.
V. OBJETIVOS DE DIAGNÓSTICO Y TERAPÉUTICOS Modalidades de la invención se pueden usar para tratar o mejorar una variedad de. enfermedades mediadas inmunes o autoinmunitarias , por ejemplo, diabetes, rechazo de injerto, etc. "Enfermedad autoinmunitaria" incluye enfermedades o trastornos que surgen de y se dirigen contra los tejidos u órganos propios de un individuo o · manifestación de los mismos o una condición que resulte de los mismos. En i una modalidad, se refiere a una condición que resulta de, o se agrava por, la producción por las células T 1 que ¦ son reactivas con tejidos y antigenos corporales normales. Ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmúnitariós incluyen, pero no se limitan a artritis (artritis reumatoide tales como artritis aguda, artritis reumatoide crónica, gota o artritis gotosa, artritis gotosa aguda, ' artritis inmunológica aguda, . artritis inflamatoria crónica, ' artritis degenerativa, artritis inducida por · colágeno tipo II, artritis infecciosa, artritis de Lyme, artritis proliferativa, artritis, psoriática, enfermedad de, Still, artritis vertebral, y artritis reumatoide 'juvenil, osteoartritis, artritis crónica progresiva, ¡artritis deformante, poliartritis crónica primaria, artritis reactiva, y espondilitis anquilosante), enfermedades de la piel hiperproliferativa inflamatorias, psoriasis tal como psoriasis de placa, psoriasis de gota, psoriasis pus'tular, y psoriasis de las uñas, atopia¦ incluyendo enfermedades atópicas tales como fiebre del heno y- síndrome de Job, dermatitis incluyendo dermatitis de contacto, dermatitis de contacto crónica, dermatitis exfoliante, dermatitis alérgica, dermatitis de contacto alérgica, dermatitis herpetiformis , dermatitis numular, dermatitis seborreica, dermatitis no específica, dermatitis de contacto irritante primaria, y dermatitis atópica, síndrome de IgM hiper-enlazado a x, enfermedades inflamatorias infraoculares alérgicas, urticaria tales como urticaria alérgica crónica, y urticaria idiopática crónica, incluyendo urticaria autoinmuné crónica, miositis, polimiositis/dermatomiositis, ¦ dermatomiositis juvenil, necrolisis epidérmica tóxica, escleroderma (incluyendo escleroderma sistémica') , esclerosis tales como esclerosis sistémica, esclerosis múltiple (MS) tal como MS' espino-óptica, . MS progresiva primaria (PPMS), y MS -¡remitente residiyante (RRMS) , . esclerosis sistémica progresiva, ' aterosclerosis , arteriesclerosis, esclerosis diseminada, esclerosis atáxica, neuromielitis óptica' (NMO) , enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) (por ejemplo, enfermedad de Crohn, enfermedades gastrointestinales mediadas autoinmunitarias, . colitis tales' como- colitis ulcerativa, colitis ulcerosa, colitis microscópica, colitis colagenosa, colitis poliposa, enterocolitis necrotizante, y 1 colitis transmural, y enfermedad inflamatoria del intestino autoinmune) , inflamación del .intestino, pioderma gangrenosum, eritema nodosum, colangitis esclerosante primaria, síndrome de dificultad respiratoria, incluyendo síndrome de dificultad respiratoria adulta o aguda (ARDS)', meningitis-, inflamación de todo o parte de la uvea, iritis, coroiditis, un trastorno hemato.lógico autoinmune, ' espondilitis reumatoide, sinovitis reumatoide, angioedema herditaria, daño del nervio cranial como en meningitis, herpes gestationis, pemfigoide gestationis, pruritis escroti, deficiencia ovárica. prematura autoinmune, pérdida del oído repentina debido a una condición autoinmune, enfermedades mediadas por IgE tales como anafilaxis y rinitis, alérgica y atópica, encefalitis tal como encefalitis de Rasmussen y encefalitis límbica y/o del tallo cerebral, uveítis, tal como uveítis anterior,1 uveítis .anterior aguda, uveítis, uveítis' granulomatosa, uveítis no .granulomatosa, uveítis fagoantigenia, uveítis. posterior,, o uveitis autoinmune, glomerulonefritis (GN) con y sin síndrome nefrótico tal como glomerulonefritis crónica o aguda tal como GN primaria, GN mediada inmune, GN membranosa (nefropatía membranosa), GN membranosa idiopática o nefropatía membranosa idiopática, GN proliferativa de. la membrana o membranosa (MPGN) , incluyendo de Tipo I y de Tipo II, y GN rápidamente progresiva, nefritis proiiferativa, . insuficiencia endocrina j poliglandular autoinmune, balanitis incluyendo balanitis circumscripta plasmacelularis , balanopostitis , eritema annulare centrifugum, eritema dyschromicum perstans, eritema multiform, granuloma annulare, liquen nitidus, liquen sclerosu.s et atrophicus, liquen simplex chronicus, liquen i spinulosus, liquen planus, ichtiosis lamelar, hiperceratosis epidermolítica, ceratosis premaligna, pioderma gangrenosum, condiciones y respuestas alérgicas, · reacción alérgica, eccema incluyendo eccema alérgica o atópica, eccema asteatótica, eccema dishidrótica, y eccema palmoplantar vesicular, asma tal como asma bronquial, . asma bronquial, y asma autoinmune, condiciones que implican la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, reacciones inmunes contra antígenos extraños tales como grupos sanguíneos A-B-0 fetales durante el embarazo, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, miocarditis autoinmune, deficiencia de adhesión de leucocitos, lupus, incluyendo lupus : nefritis, ' lupus cerebritis, lupus pediátrico, lupus no renal, lupus extrarenal, lupus discoide y lupus discoide eritematoso, lupus de alopecia, lupus sistémico eritematoso (SLE) ital como SLE cutáneo o SLE cutáneo o subagudo, síndrome de lupus neonatal (NLE) , y lupus eritematoso disseminatus , diabetes mellitus juvenil (Tipo I), incluyendo diabetes mellitus dependientes de insulina pediátrica . (IDDM) , y, diabetes j mellitus adulto (diabetes de Tipo II) . También se contemplan respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad ¡aguda y retrasada mediada por citocinas y T-linfocitos , sarcoidosis, gfanulomatosis incluyendo granulomatosis linfdmatoide , granulomatosis de Wegener, agranulocitosis , vasculitidos , incluyendo vasculitis, vasculitis de vasos ' grandes (incluyendo polimialgia reumática .y arteritis ·¦ de células T gigantes (de Takayasu) ) , vasculitis de vasos · medianos . ' i (incluyendo enfermedad de Kawasaki y póliarteritis nodosa/periarteritis nodosa) , póliarteritis microscópica, inmunovasculitis , .·' vasculitis CNS, vasculitis ¡cutánea, vasculitis de hipersensibilidad, vasculitis necrotizante tal como vasculitis necrotizante sistémica y vasculitis asociadas con ANCA, tal como vasculitis, o síndrome de Churg-Strauss (CSS) y vasculitis de vasos pequeños asociadas cbn ANCA, arteritis temporal, anemia aplásica, anemia . aplásica autoinmune, anemia positiva Coombs, anemiá' . de Diamond Blackfan, anemia hemolitica o . anemia hemolitica' inmune incluyendo anemia . hemolitica autoinmune (AIHA) , enfermedad de Addison, neutropenia autoinmune, panci.topen.ia,· leucopenia, enfermedades que implican diapedesis de leucocitos, trastornos inflamatorios de CNS, enfermedad de ALzheimer, enfermedad de Parkinson, síndrome de lesión de órganos múltiples, tales como aquellos secundarios a septicemia, trauma o hemorragia, enfermedades mediadas por complejo de antígeno-anticuerpo> enfermedad de membrana . basa'l anti-glomerular, síndrome de anticuerpos antí-fos'folípidos , neuritis alérgica, enfermedad/síndrome de Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de 'Reynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide tal como penfigoide bulloso y penfigoide de la piel,' pénfigo (incluyendo pénfigo vulgaris, pénfigo foliaceus, penfigoide de la membrana mucosa, y pénfigo erit matoso) , poliendocrinopatías autoinmunitarias, enfermedad · ó ' síndrome de Reiter, lesión térmica, preeclampsia ,¦ un trastorno complejo inmune tal como nefritis complejo inmune, nefritis mediada por anticuerpos, polineuropatías, neuropatía crónica tal como polineuropatías Ig o neuropatía mediadas , por IgM, trombocitopenia autoinmune o mediada inmune tal como púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) incluyendo ITP crónica o aguda, escleritis tal como cerato-escleritis · idiopática, episcleritis, enfermedad autoinmunitaria de los testículos y ovarios incluyendo orquitis y ooforitis . autoinmune, hipotiroidismo primario,' hipoparatiroidismo, ' enfermedades endocrinas autoinmunitarias , incluyendo tiroiditis tal como tiroiditis autoinmune, enfermedad de Hashimoto, .tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto), o tiroiditis sub-aguda, i enfermedad de la tiroides autoinmune, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Grave, síndrome póliglandulares tales como síndromes póliglandulares autoinmunitarios (o síndromes de endocrinopatía poliglandular ) , síndromes paraneoplásicos, incluyendo síndromes paraneoplásicos neurológicos tales como síndrome miastánico de · Lambert-Eaton o, síndrome de Eaton-Lambert, síndrome del hombre rígido o persona rígida, encefalomielitis tal como encefalomielitis alérgica o encefalomielitis alérgica y encefalomielitis alérgica experimental (EAE) , miastenia gravis tal como miastenia gravis asociada con timoma, degeneración cerebelar, neuromiotonia, síndrome de opsoclonus u o.psoclonus myoclonus (OMS) , y neuropatía sensorial, neuropatía motora multifocal, síndrome de Sheehan, hepatitis autoinmune,' hepatitis crónica, hepatitis lupoide> hepatitis de células T gigantes, hepatitis activa crónica o hepatitis activa crónica autpinmune, neumonitis intersticial lihfoide (LIP) , .' bronquiolitis obliterans (no de trasplante) vs. NSIP, síndrome de' Guillain- Barre, enfermedad de Berger (neuropatía de IgA) , neuropatía de IgA idiopática, dermatosis de IgA lineal, dermatosis neutrofílica febril aguda dermatosis postular sübcorneal, dermatosis acantolítica transitoria. Cirrosis, tal como cirrosis biliar primaria y pneumonocirrosis , síndrome de entoropatía autoinmune, enfermedad Celiaca o Coeliaca, enfermedad celiaca (enteropatía de gluteno.) , enfermedad refractaria, enfermedad idiopática, crioglobulinemia, esclerosis lateral amilotrófica (ALS; enfermedad , de Lou Gehrig) , enfermedad de arteria coronaria, enfermedad inmune del oído tal como enfermedad del oído interior autoinmune (AIED) , pérdida del oído autoinmune, policondritis al como policondritis refractaria o resilivante, proteinosis alveolar pulmonar, síndrome de Cogan/queratitis intersticial no sinfilítica, parálisis -de Bell, enfermedad/síndrome de Sweet, rosácea autoinmune, dolor asociado con zoster, amiloidosis, linfocitosis no cancerosa, una linfocitis primaria, que incluye linfocitis de células B monoclonales (por 'ejemplo, gamopatía monoclonal benigna y gamopatía monoclonal de importancia no determinada, MGUS)-, neuropatía .periférica, síndrome paraneoplásico, ' canelopatías tal como epilepsia, migraña, arritmia, trastornos musculares, sordera, ¡ceguera, parálisis periódica, y canelopatías del CNS, . autismo, miopatía inflamatoria, glomeruloesclerosis focal o . segmental o' focal segmental (FSGS), optalmopatia endocrina, uveoretinitis , corioretinitis, trastorno hepatológico autoinmune, fibromialgia, insuficiencia endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, adrenalitis, atrofia gástrica, demencia presenil, enfermedades ¦ de desmielinación ' tale's como enfermedades de desmielinación autoinmunitarias y polineuropatía de desmielinación inflamatorias qrónicas, síndrome de Dressler, alopecia creata, alopecia greata, alopecia totalis, síndrome de CREST (calcinosis,' fenómeno de Raynaud, dismotilidad esofágica, esclerodactil) , y telangiectasia) , infertilidad autoinmune de hombres y mujeres, por ejemplo, debido a ¦ anticuerpoSj antiespermatozoarios, enfermedad de tejido conjuntivo mezclada, enfermedad de Chagas, fiebre reumática, absorción recurrente, pulmón de granjero, eritema multiforme, síndrome de pos-cardiotomía, síndrome de. Cushing, pulmón de entusiasta de aves, angiitis granulomatosa alérgica, angiitis linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolitis. tal como alveolitis alérgica y alveolitis fibrosante, enfermedad del pulmón intersticial, reacción a la transfusión, leprosia,- malaria, enfermedades parasíticas tales como leishmaniasis , quipanosomiasis , esquistosomiasis , ascariasis, aspergillosis , síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, fibrosis ¦ pulmonar intersticial difusa, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis del pulmón intersticial, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopáticá, fibrosis. quistica, endoltalmitis, eritema elevatum et diutinum, eritroblastosis fetalis, faciitis eosinofílica,- síndrome dé Shulman, síndrome de Felty, flariasis, ciclitis tal como ciclitis crónica, ciclitis heterocrónica, iridocclitis (aguda o crónica) , o ciclitis de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, .'infección por virus de inmunodeficiencia humana (VIH), SCID, síndrome de deficiencia inmune adquirida (SIDA), infección . por- ecovirus, sepsis, endotoxemia, pancreatitis, tiroxicosis, infección de i parvovirus, infección por virus de rubéola, síndromes' de posvacunación, infección por rubéola congénita, infección por virus de Epstein-Barr , paperas, síndrome de' -Evan, insuficiencia gonadal autoinmune, corea de Sydenham, nefritis pos-estreptocócica, tromboangitis ubiterans, tirotoxicosis , tabes dorsalis, corioiditis, polimialgia de células T gigantes, pneumonitis de hipersensibilidad ¡crónica, queratoconjunctivitis sicca, queratoconj unctivitis epidémica, síndrome nefrítico idiopático, nefropatía de cambio mínimo, lesión de reperfusión familiar e isquemia benigna, reperfusión de trasplante de órganos, autoinmunidad retinal, inflamación articular, bronquitis, enfermedad ·. de vías ¦ ·'.¦ I ¦ aéreas/pulmonar obstructiva crónica, silicosis, 1 . aftas, estomatitis aftosa, trastornos arterioscleróticos , asperniogenese, hemolisis autoinmune, enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, endoftalmia facoanafiláctica, enteritis alérgica, · eritema ' nodosum leprosum, parálisis facial idiopática, síndrome de fatiga crónica, fiebre reumática, enfermedad de Hamman-Rich,i pérdida de oído sensoneural, hemoglobinuria paroxismática, hipogonadismo, ileitis regionalis, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversal,. mixedema idiopática primaria, nefrosis, . oftalmía simpática, orquitis granulomatosa, pancreatitis, poliradiculitis aguda,, poderma gangrenosum, tiroiditis de Quervain, atrofia ésplénica adquirida, timoma no maligno, vitíligo, síndrome de choque tóxico, envenenamiento por alimentos, condiciones que implican infiltración de células T, deficiencia de adhesión de leucocitos, respuestas inmunitarias asociadas' con hipersensibilidad aguda y retrasada mediadas' por cifeocinas . y linfocitos T, enfermedades que implican diapedesis de leucocitos, síndrome de lesión de órganos múltiples, enfermedades mediadas por complejo de antígeno-anticuerpo, enfermedad de membrana basal antiglomerular , : neuritis alérgica, poliendocrinopatías autoinmunitarias', opforitis, mixedema primaria, gastritis atrófica autoinmune, oftalmía simpática, enfermedades reumáticas, enfermedad de tejido conjuntivo mezclada, , síndrome . nefrótico, nsulitis, insuficiencia poliendocrina, hipoparatiroidismo . idiopá.tico adulto, tipo I del síndrome poliglandular auto inmune' (AOIH) , cardiomiopatía tal como cardiomiopatía dilatada, epidermolisis hullosa acquisita (EBA) , hemocromatosis, miocarditis, síndrome nefrótico, colangitis esclerotizante primaria, sinusitis purulenta o no purulenta, s.inusitjis aguda o crónica, sinusitis etmoide, frontal, maxilar o esfenoide, trastorno relacionado con eosinófilos tal como eosinofilia, eosinofilia por infiltración pulmonar, síndrome de eosinofilia-mialgia, síndrome de Loffler, ¦ neumonía éosinofílica crónica eosinofilia pulmonar tropical, aspergillosis bronconeumónica, aspergilloma, o granulomas que contienen eosinófilos, anafilaxis, espondiloartritidos seronegativos, enfermedad autoinmunitaria poliendocrina, colangitis esclerotisante, esclera, episclera, caijididiasis mucocutánea crónica, síndrome de i Bruton, hipogammaglobulinemia¦ transitoria de la infancia, síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome de . telangiectasia ¡ ataxia, angiectasis, trastornos autoinmunitarios asociados1 con la enfermedad de colágeno, reumatismo, enfermedad neürológic'a, linfadenitis, reducción en la respuesta de presión sanguínea, disfunción vascular,' lesión de tejidos, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia renal, ' , isquemia ¦ .i ¦ : 1 ' cerebral, y vascularización acompañante de enfermedad, trastornos de hipersensibilidad alérgicos,' glomerulonefritis, lesión de reperfusión, trastorno de reperfusión isquémica, lesión de repérfusión del miocardio u otros tejidos, traqueobronquitis . linfomatosa, dermatosis inflamatorias, dermatosis con componentes inflamatorios ¦ agudos, insuficiencia de órganos múltiples, enfermedades a.'mpollosas , necrosis cortical renal, meningitis pulurenta aguda ¡ u otros trastornos inflamatorios del sistema nervioso central, trastornos inflamatorios oculares y orbitales,, síndromes asociados · con transfusión de granulocitos, toxicidad ,inducida por citoquinas, . narcolepsia, inflamación seria; aguda, inflamación intratable crónica, pielitis, hiperplasia endoarterial , úlcera péptica, valvulitis y endometriosis .
EJEMPLOS VI . EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proporcionan- para el propósito de ilustrar varias modalidades de la invención y no se proponen para limitar la presente invención en cualquier i forma. Una persona experta en el campo apreciará fácilmente que la presente invención está bien adaptada para 'llevar a cabo los objetivos y obtener los fines y; 'ventajas mencionadas, así como aquellos objetivos, fines, y 'ventajas inherentes en este documento'. Los presentes ejemplos, junto con los métodos descritos en este documento son actualmente representativos de modalidades preferidas, son ejemplares, y no se proponen como¦ limitaciones en el alcance, de la invención. Los cambios en los mismos y otros usos que se incluyen dentro del espíritu de la invención como se define por el alcance, de las reivindicaciones se presentarán paira aquellas personas expertas en el campo.' ¡ EJEMPLO 1 Protección TlD Mediante Tratamiento con Nanoesferas Recubiertas con Péptido/MHC Protección de diabetes por' el tratamiento con nanoesferas superparamagnéticas recubiertas con monómeros NRP-V7/Kd. Para estudiar si las nanoesferas recubiértas con NRP-V7/Kd son tolerogénicas in vivo, ratones NOD transgénicos 8.3-TCR se trataron (también referidos como ratones 8.3-NOD o Val7.4+TCR-TG adicionalmente de manera posterior) con varias inyecciones i.v. de un volumen pequeño de nanoesferas (5 µ?, que llevan 0.6 pg de NRP-V7, una vez cada. 3 días). Se contempla que los acervos de células T CD8+ esplénicas de IGRP206-2i4-reactivo de alta ' avidez transgénicos de estos ratones se agotarán significativamente. También se 'contempla que las células T CD8+ no suprimidas se anergizarán .por el tratamiento .
Para estudiar la efectividad . de la "multiplexación" , las nanoesferas se recibirán con 6 monómeros de péptido/MHC diferentes. Los cohortes de( ratones NOD de tipo natural se tratarán con un acervo de estas nanoesferas, con nanoesferas recubiertas con un péptido de control (TUM) /Kd, o con nanoesferas 'recubiertas con NRP-V7/ d. Se contempla que los ratones NOD. tratados con nanoesferas recubiertas con NRP-V7/Kd (una vez cada 2-3 semanas) se protegerán altamente de TID mientras que los ratones 'tratados con nanoesferas río recubiertas, nanoesferas recubiertas con avidina-biotina, nanoesferas recubiertas con TUM/ Kd o péptido NRP V7 solo, no se protegerán probablemente de la TID.1 Expansión sistémica de clonotipos de baja avidez por el tratamiento con nanoesferas recubiertas con monómeros NRP-V7/Kd. Los estudios se harán empleando nanoesferas radioactivamente etiquetadas para determinar su distribución de tejido. Se contempla que habrá una distribución de tejido sistémico en todas las edades de los ratones examinados. Se contempla que el tratamiento de los ratones con · las nanoesferas no conducirá a, niveles de suero incrementados de citocinas que resulten de la estimulación de diversos tipos de células inmunes, incluyendo células T CD8+ de NRP-V7 reactivo. ' , Se cree que los ratones tratados con nanoesferas recubiertas con NRP-V7/Kd tendrán acervos, significativamente incrementados de células CD8+ de tetrámero NRP-V7/Kd circulantes y de intra-islotes en el final del periodo de seguimiento (32 semanas), como es comparado con aquellos de los animales no diabéticos igualados en la edad tratados con nanoesferas de control. Se contempla además que. las- células T GD8+ de intra-islotes de los ratones tratados con nanoesferas NRP-V7/Kd se enlazarán a los tetrámeros NRP-V7/Kd con significativamente menor avidez (mayor Kd) que . aquellos encontrados en los islotes de los ratones de control, sugieren que el tratamiento de nanoesferas fomentará la expansión de clonotipos de baja avidez anti-patogénicos a expensas de sus contrapartes de alta avidez patogénicas en una manera dependiente de dosis.
Para investigar el reconocimiento y captación de las nanoesferas recubiertas con NRP V7/K/Kd, los inventores evaluarán la presencia de fluorescencia verde (enlazada a la molécula de avidina del complejo de péptido-MHC ¡ np) en diferentes subpoblaciones de esplenocitos de ratones' NOD que expresan un TCR de NRP-V7-reactivo transgénico asi como en ratones NOD no transgénicos , de tipo natural. Se contempla que la inyección de nanoesferas NRP-V7/Kd, la fluorescencia verde no solo se detectará en el subconjunto de células T CD8+ de ratones transgénicos TCR y, a un grado mucho menos, en el subconjunto, de células CD8+ de ratones no transgénicos . Se cree que no habrá detección de . acumulación de fluorescencia, verde en los sübconjuntos de células T, B CD4+ CDllb+, o CDllc+ esplénicas de cualquier tipo dé ratones.
Las propiedades anti-diabetogénicas de nanoesferas recubiertas con un complejo de péptido/MHC ( DMKi38-i46 D ). auto- antigénico subdominante. Los inventores ' investigarán1 · si los e'fectos protectores de la avenida terapéutica anterior fueron una peculiaridad de las células T CD8+ de NRP-V7-reac¡tivo (un subconjunto de células T autorreactivas prevalentes en ratones NOD) , o un fenómeno aplicable a otras, especificidades autoantigénicas menos dominantes. Para este í fin, los ratones se tratarán con cuentas recubiertas con un péptido que se deriva de otro autoantigeno que es presentado b ' 1 por D y es fijado como objetivo por un acervo mucho más pequeño de células T CD8+ autorreactivas diabetogénicas (residuos 138-146 de Distrofia Miotónica Cinasa;. DMK;¡ en este documento referida como "DMKi38-i46/Db" ) (Liebeorman y colaboradores, 2004). Se contempla que el tratamiento de ratones' NOD con nanoesferas récubiertas con DMKi38-i46/Db provocarán expansiones significativas de células T CD8+ de DMKi38-i46/Db-reactivo circulantes, esplénicas y - de intra- islotes y permitirá la. protección de diabetes significativa. Se contempla además que la expansión de. células T I in vivo serán especificas de antigeno debido a las . nanpesferas recubiertas con D Ki38-1 6/Db, probablemente no expandirán a células T CD8+ de NRP-V7-reactivo '. y las nanoesferas recubiertas con NRP-V7/Kd probablemente no expandirán las células T de DMKi38-i46/Db-reactivo ..
El reclutamiento deteriorado de otras especificidades de células CD8+ de IGRP-autorreactivo para islotes en ratones tratados con nanoesferas recubiertas- con NRP-V7/Kd- o DMKi38-i45/bb- . Los inventores investigarán si el reclutamiento de células CD8+ de NRP-V7- y/o DMKi3B-i46/Db-reactivo de baja avidez de nanoesferas expandidas deteriorar el reclutamiento de otras especificidades de células T autorreactivas de células beta a los islotes. Esto se hará al comparar la respuesta de las células CD8+ asociadas1 con los islotes de los ratones tratados con nanoesferas de ¡control, recubiertas con NRP-V7/Kd- o DMKi38-i46/Db- aun panejl de 76 epitopos de IGRP diferentes asi como DMKi38-i46. 'Se espera que las células CD8+ asociadas a los islotes de los ratones tratados con nanoesferas recubiertas, con NRP-V7/Kd- y recubiertas con DMKi38-i46/Db- producirán significativamente más IFN-? en respuesta a NRP-V7 y DMKi38-i46, respectivamente, que aquellas aisladas de los ratones de control. Se contempla que habrá producciones significativas en el número de 'epitopos capaces de inducir . respuestas de IFN-? significativas por las · ¦ i células CD8+ asociadas' con islotes de ratones trataIdos con nanoesferas recubiertas con NRP-V7/Kd o DMK138_146/Db-, como es comparado con aquellos de los ratones tratados con nanoesferas de control, sugiriendo el reclutamiento y/o acumulación deteriorados.
Se cree que las nanoesferas recubiertas con NRP-V7/Kd- y DMKi38-i46/Db- inducirán altas tasas de remisión de di abetes en ratones NOD recientemente diabéticos. Se llevarán a cabo estudios para investigar la capacidad de¦ la terapia de nanoesferas para restaurar la normoglicemia en ' ratones diabéticos recientemente diagnosticados. Los cohortes de ratones se supervisarán dos veces a la semana para los j niveles de glucosa en sangre y se .considerarán niperglicémicos a =10.5 mM de glucosa en sangre. Los ratones se distribuirán de forma aleatoria en ratones que reciben nanoesferas recubiertas con TU /Kd-' o nanoesferas recubiertas con NRP-V7/Kd- (inyecciones dos veces a la semana). La mitad de una unidad de insulina subcutánea también se administrará una vez al dia a los ratones que muestren glicosuria, para reducir los estréses de células beta y fomentar* la regeneración de células beta. Los cohortes adicionales de ratones recibirán nanoesferas recubiertas con DMKi38-i46/Db- - El tratamiento con anticuerpo anti-CD3 monoclonal '(20 g/d durante 5 días), que se ha mostrado que' induce lai remisión estable en un porcentaje variable de animales en diferentes estudios, se usará como un control positivo. Se contempla que la mayoría de ratones tratados con nanoesferas recubiertas con NRP-V7/K - serán no normoglicémicos dentro' ele .5-12 semanas de tratamiento. Del mismo modo, se contempla además que la mayoría de ratones . tratados con nanoesferas recubiertas con DM i38-i46/Db- serán normoglicémicos. Se espera que la mayoría de ratones que reciben nanoesferas rec'ubiertas con. TUM/Kd- de control progresen a la .. hiperglicemia i manifiesta .
Para investigar si los efectos de tratamiento en los ratones diabéticos son de larga duración, el tratamiento se retirará después, de 4 semanas consecutivas de normoglicemia y los ratones se supervisarán para recurrencia diabetes. Los efectos de tratamiento en el tamaño del acervo I positivo de tetrámero circulante se evaluará en el retiro de tratamiento, 4 semanas después y en el momento; de la hiperglicemia recurrente. Se contempla que habrá una disminución en el tamaño de acervo de células T reactivas de tetrámeros circulantes 4 semanas después del tese de tratamiento. En esté caso, la reactivación del acervo de células T autorreactivas de baja avidez ^expandido, ya sea por autoantígeno endógeno .(es decir, en animales pre-diabéticos ) o por inyecciones de refuerzo de nanoesferas (es .decir, en animales diabéticos con una masa células beta, 'gravemente reducida) pueden ser requeridos para protección de largo plazo.
Se contempla que las pruebas de tolerancia de glucosa intraperitoneal · (IPGTTs) en '¦ ratones- no tratados curados versus diabéticos y no diabéticos mostrarán que el i primero tiene curvas de tolerancia de glucosa casi- idénticas a aquellas mostradas por los animales no tratados no diabéticos y significativamente mejores que aquellos ' que corresponden a ratones diabéticos. Además, se cree que los animales curados tendrán niveles de insulina en suero pos-pandrial que son estadísticamente comparables con aquellos observados en ratones no tratados no diabéticos y significativamente mayor que aquellos que corresponden a animales no tratados diabéticos. ¦ · Investigación de si las nanoesferas recubierbas con Póptido/MHC pueden "discriminar" efectivamente entre las células T CD8+ de alta y baja avidez autorreactivas . La mayoría de células CD8+ de IGRP206-2Í4-reactivas emplean: cadenas Val7-Ja42 de CDR3 invariante pero- las cadenas VDj heterógenas "de maduración de avidez" de este subcon unto de células T durante la diabetogénesis se asocia con cambios en el uso de 3 elementos Val7 diferentes. Que estos 3 elementos Va diferentes permitan las diferencias en la . avidez del enlace de ligando (.Va17.5>Val7.4>Val7.6) se confirmó en los e.studios de transfectantes TCRap que expresan las 3' cadenas V.OÍ17-JOÍ42 de CDR3 invariante diferentes en el contexto de una i sola cadena TCR (Han y colaboradores, 2005) . Para investigar si las nanoesferas recubiertas con péptido/MHC pueden de hecho fijar como objetivo diferencialmente células T que reconocen el ligando con avidez diferente, la capacidad de las nanoesferas recubiertas con NRP-V7/Kd para inducir la "terminación" de las células CD8 en estos transfectantes se evaluará. Se contempla que más células Val7.5+ que las células Val7.4+ o Val7.6+, formarán tapas por- 5 minutos de incubación con nanoesferas recubiertas con NRP-V7/Ku->. Este resultado indicaría que las nanoesferas. recubiertas pon NRP- V7/Kd- pueden de hecho discriminar entre las células T de i alta y baja avidez y proporcionarán una explicación de por qué estas nanoesferas suprimen preferencialmérite los clonotipos de alta avidez vírgenes.
Las células CD8+ que expresan el V<xl7.6/8.3,ß TCR de baja afinidad son anti-diabetogénicas . Para investigar si las células T CD8+ autorreactivas de baja avidez; tienen : ¦ i propiedades anti-diabetogénicas in vivo, el ?a17.6/8.3ß TCR de IGRP2o 6-2i4_réactivo de baja afinidad 'se : expresó transgénicamente en ratones NOD (referido en este, documento como "Val7.6+"; que tiene una afinidad inferior de ~;10 veces que el 8.3-TCR (Val7'.4+) ; Teyton y Santamaría, datos no publicados) . Se ha mostrado que este TCR fomenta la selección positiva de células CD8+, pero claramente menor que el 8.3-TCR (V l7.4+) (Han y colaboradores, 2005). Como resultado, los ratones Val7.6+ TCR-TG contienen pocos timocitos y esplenocitos CD8 reactivos de tetrámero NRP-V7 ,que los ratones Val7.4+ TCR-TG. Adicionalmente, las células, CD8+ de tetrámero+ (alto y bajo) de ratones Val7.6+ TCR-TG isecretan menos IFN-? (e IL-2) que aquellos derivados de ratones V l7.4+ TCR-TG en la estimulación de péptido in vitro, y son exterminadores ineficientes de objetivos RMA-SKd pulsados con NRP-V7-, compatibles con su baja avidez. para el ligando (Han y colaboradores, 2005; y los datos no se muestran)-. Más importantemente, estos ratones se protegen casi- completamente de la diabetes (solamente 2 de 70 hembras han desarrollado Tl.D) e insulitis [registros de <0.4 vs >3 (de un máximo de 4) en ratones Val7.'6+ vs . V l7.4+ ' TCR-TG, respectivamente (P<0.012)] (FIGURA 1A y FIGURA IB).. ·' Esto es un contraste marcado a lo que se presenta en los ratones NOD que expresan un. TCR no auto-reactivo , y relevante que reconoce un epítopo LCMV (ratones LCI^IV TCR-TG NOD). Como se reporta previamente por Serreze y colaboradores (2001), y se confirma por el uso en este documento, estos ratones desarrollan T1D esencialmente similar a los ratones NOD de tipo natural y reclutan células '. CD8+ de IGRP206-214-reactivo endógenas a los islotes (completamente ausentes en los islotes de ratones Val7.6+ TCR-TG ice) (FIGURA 1C).. De esta manera, diferente a los Val7.4+ y LCMV TCRs (pro-diabetogénicos y neutros, respectivamente), el Val7.6+ TCR parece que tiene propiedades anti-diabetogénicas . . ; Independientemente del hecho de que la mayoría de células T TG de estos ratones Val7.6+ TCR-TG ! enlazan tetrámeros débilmente o ninguno en absoluto, una fracción de las células que existen en el timo se enlazan al tetrémero con aparente alta avidez (es decir, con mfi alta); (FIGURA 2A) . Los inventores sospechan que las células T CD8+ con bajos tetrámeros (lo) y tetrámeros negativos de estos ratones se originan de timocitos CD4+CD8+ que expresan el TG 'TCR pero se someten a la selección positiva en los TCRs endógenos (es i decir, cadenas TCRa) . Las células con altos tetrámeros, por otra parte, se originarían de los timocitos 'CD4+ |CD8+ que solamente expresan las cadenas TG TCRa y, debido a¡ su baja afinidad para el péptido/MHC, solamente, se pueden someter a la selección positiva si expresan mayores niveles del TG TCR que los normales. Esta interpretación se soporta por la observación de que, en ratones que expresan el V l7.6+ TCR en un fondo RAG-2~ _, las únicas células que maduran son ¡aquellas que enlazan tetrámeros con alta avidez (FIGURA 2B) . De manera importante, estos dos tipos de . ratones RAG-2- ~ TCR-TG desarrollan diabetes con incidencia similar (FIGURA '3). De esta manera, los inventores sospechan que las células T CD8+ de tetrámero-lo y de tetrámero que maduran en. ratones RAG-2+Val7.6 TCR-TG inhiben el potencial diabetogénico¡ de sus contrapartes con altos -tetrámeros (lo que provoca diabetes en los ratones RAG" _ TCR-TG) . Estos resultados se. reprodujeron en acopios de los ratones Val7.6 TCR-TG que ll van una eficiencia de TCR-C endógena que imposibilita la expresión de las cadena TCR endógenas (es decir, no transgénicas ) (FIGURAS 4A y 4B) .
Ratones Val7.6+ (pero no Val7.4+) TCR-TG generan espontáneamente un acervo de células CD8+ de memoria con actividades inmunosupresoras . Estudios citofluorométricos de las . células T CD8+ positivas de tetrámero contenidas en. los órganos linfóides diferentes de los ratones Val7.6+ TCR-TG y los ratones Val7.6 TCR-TG deficientes de TCR-Ca- revélaron la presencia de acervos agrandados de células CD8+ CD44hi y CD44hiCD122+ como es comparado con los ratones Val . + TCR-TG en el bazo, nodos linfáticos -y, especialmente, la médula ósea, un depósito conocido de células T de memoria (FIGURAS 5A ' y 5B) . De manera importante, -esto se 'presenta principalmente dentro del subconjunto de. tetrámero bajo, pero no en el tetrámero alto, que no contiene células ¦ CD122+ (.FIGURA 5C) . Estas células expresan marcadores descritos tanto en linfocitos de memoria centrales como efectores (.FIGURA 5D) , y se encuentran predominantemente eri los; órganos linfoides periféricos pero no en el. timo, sugiriendo un origen periférico (FIGURA '5E) . Adicionalmente, los en'sayos de incorporación BrdU sugirieron que proliferan in vivo (FIGURA 5F) . Funcionalmente, estas células similares a memoria se comportan claramente como células T "de memoria", tomo las células CD8+ Val7.6+(pero no V l7.4+) TCR-TG esplénicas purificadas proliferan vigorosamente en las respuestas a IL-2 o IL-15 en ausencia de APCs . y antigeno (FIGURA 5G) . Adicionalmente, producen rápidamente IFN-? en la estimulación con el antigeno in vitro (FIGURAS 5H y. 51) . Sin embargo, ni proliferan tampoco producen interléucina-2 en la estimulación antigénica in vitro (FIGURA 5J) . .Este perfil funcional es altamente reminiscente de aquel del subconjunto de células T CD4+CD25+ (supresoras) reguladoras. En conjunto', estos' datos sugieren que las células CD8+ VOÍ17.6+ (pero no Val7.4+) TCR-TG tienen una capacidad incrementada para . hacer células T de memoria de larga vida (en uno o más encuentros de antigenos), presumiblemente capaces de sobrevivir indefinidamente en la respuesta a señales homeostáticas, aún. en ausencia del antigeno.
Estas observaciones condujeron a los inventores a sospechar que la "actitud" homeostática . superior 'de estas qélulas. T de baja avidez de memoria, de otra manera incapaces de exterminar células beta, contribuye a su actividad antidiabetogénica (es decir, al permitir una ventaja competitiva sobre su mayor avidez, pero mayormente a células beta, vírgenes exterminadoras de clonotipos, y/o al inhibir su activación) . Para evaluar lo último, la capacidad de las células T CD8+ CD122+ y CD122-Val7.6+ TCR-TG se evaluaron por su capacidad de inhibir la proliferación de células T CD8+ esplénicas etiquetadas con CFSE de ratones Val7.4Í TCR-TG NOD. Como se muestra en la FIGURA 6,. las células^ T CD8+ CD122+ (pero no CD122") Val7.6+ TCR-TG inhibieron casi completamente la · proliferación de sus contrapartes de células T vírgenes de mayor avidez.
Consistentes con la idea de que el1 acervo espontáneamente expandido ' de las ¦ células T CD8+ autorreactivas de baja avidez de. memoria (CD122+) en¡ ratones Yal7.6+ TCR-TG NOD es el tratamiento . s(istémico antidiabetogénico (i.v.) de ratones Val7.6+ y V l7.4+ TCR-TG con DCs pulsadas con NRP-V7, un mAb agonístico contra CD40, o un mAb agonístico contra 4-1BB (para mejorar la activación/supervivencia de las células T CD8+) , indujeron un rápido inicio de la diabetes en. ratones Val7.4+ TCR¡-TG NOD, pero fueron incapaces de inducir la enfermedad en; ratones Val?.6+ TCR-TG (Tabla.4). ' , TABLA 4 Tratamientos que promueven el inicio del desarrollo de células T de memoria y la precipitación de expansión de la diabetes en los ratones 17.4a/8.3p-TG NOD, pero no1 en los ratones 17. ßa/8.3p- G NOD. ! 3 inyecciones de mAb Anti-CD40 o mAb Anti-4-??? de 100 pg i.p. con intervalos de 3-4 días de 2 inyecciones de DCs derivados de médula ósea activados con 106 LPS pulsados con 1.00 g/ml de ratones NRP-V7 se siguieron para la diabetes por lo menos 8 semanas después de la última, inyección. ¦ ¡ La capacidad de las células T CD8+ CD122+ Val7.6+ TCR-TG suprime las respuestas de las células T diabetogénicas cognadas y no cognadas (es decir, dirigidas contra ipéptidos autoantigénicos diferentes al ' péptido auto-antigénieo objetivo de estas células T supresoras IGRP206-214"" ) condujo a los inventores a sospechar que podrían afectar su actividad supresora al fijar como objetivo células que presenta células que. presenta antigenos (APCs) . Los ensayos de citotoxicidad (liberación de 51Cromo) que emplean DCs pulsadas' con péptido como células objetivo y células CD8+ CD122+ o CD122-V l7.6+ y CD122-Val7. + TCR-TG como efectoras indicaron que las primera, pero no las últimas fueron capaces de lisar específicamente de las DCs pulsadas con NRP-V7 in vitro (FIGURA 7A) . Los inventores confirmaron que esto también fue cierto, in vivo. Transfundieron números iguales de células B pulsadas con NRP-V7 y pulsadas, con TUM (etiquetadas ??? bajas o' altas concentraciones del tinte CFSE, respectivamente) en • i ratones V l7.6+ TCR-TG y Val7.4+ TCR-TG y días después se sacrificaron los hospederos para investigar que ¡ células habían ' sobrevivido a la transparencia. Como se muestra en la FIGURA 7B, mientras que las células B pulsadas con NRP-V7 sobrevivieron solamente en ratones V l7.4+ TCR-TG, las células B pulsadas con el péptido de control ' negativo TUM sobrevivieron en ambas cepas TCR-TG. Virtualmente se obtuvieron resultados idénticos cuando las DCsm. antes que las células B, se usaron como APCs (FIGURA 7B) . Estos datos sugieren que las células T CD8+ CD122+ Val7.6+ TCR-TG- de baja avidez suprimen las respuestas de las . células T diabetogénicas cognadas y no cognadas al exterminar las APCs cargadas con autoantígeno .
Investigar si las nanoesferas recubiertas con NRP- V7/ d inducen la expansión de células CD8+ autorreactivas de memoria de baja avidez (tetrámero intermedio) en ratones NOD de tipo natural.. Se contempla que el tratamiento de. los ratones NOD con las nanoesferas recubiertas con péptido/MHC darán por resultado las apariciones de los clonotipos de alta avidez, y la expansión y reclutamiento de células T CD8+ de baja avidez, reclutamiento deteriorado de . otras especificidades reactivas de epitop.o IGRP -a los islotes, y la protección de diabetes.
Para evaluar si las células T CD8+ con ' cuentas i expandidas en los ratones NOD de tipo natural son. células T de memoria de baja avidez de supervivencia prolongada, los inventores analizaron la presencia de marcadores de memoria (CD44 y CD122) en las células T CD8+ positivas de tetrámero NRP-V7/Kd contenidas en el bazo y médula ósea de los ratones tratados con nanoesferas recubiertas con NRP-V7/Kd. Se contempla que las poblaciones expandidas de células positivas de tetrámero contenidas en el bazo y la médula de estos ratones contendrá . orcentajes incrementados de células T CD8+ CD44hi y CD44hiCD122+T , sugiriendo que ' el tratamiento de nanoesferas NRP-V7/Kd incrementa el tamaño de los acervos de células T CD44hi y el tetrámero +CD44hiCD 122+. ' : Se contempla . que las células T similares á las de memoria que se expanden por la terapia in vivo con nanoesferas recubiertas con NRP-V7/Kd- se comportarán; similar a las células T CD8+ CD122+ Val7.6+ TCR-TG de memoria que se acumulan espontáneamente en los ratones Val7.6+ TCR-TG: ni producen IL-2 tampoco proliferan, todavía producen altos niveles de IFN-? en respuesta a la estimulación, antigenica in vitro. Se contempla además que, en la activación con' mAb anti-CD3 e IL-2, estas células T similares a memora suprimirán eficientemente la proliferación de células T CD8+ respondedoras etiquetadas con CFSE V l7.4+ TCR-TG in vitro.
Nanoesferas recubiertas con péptido/MHC expanden las células T de memoria de baja avidez pre-existentes. Se cree que las nanoesferas recubiertas con péptido/MHC no tendrán células T de memoria dé nuevo, sino más bien expandirán los acervos pre-existentes de las células T de memoria. Se contempla que el tratamiento de ratones ¡ NOD con nanoesferas recubiertas con TUM/Kd- no inducirán la expansión sistémica de las células T CD8+ reactivas de ¡TUM. Se contempla además que el tratamiento de ratones B 10.H2g7 con nanoesferas. recubiertas con NRP-V7/Kd- no inducirá una expansión significativa del . subconjunto de células T CD8+ NRP-V7/Kd tetrámero+ en todos los órganos linfoides y la expansión . sistémica de las células T CD8+ reactivas de tetrámero en ratones NOD tratadas con nanoesferas será significativamente más efectivo cuando se inicia en el principio de la diabetes que en la etapa pre-diabética .
También se cree que, diferentes a las células T CD8+ vírgenes, que tienen a someterse a la apoptosis en la ligación de TCR en ausencia de . la pos-estimulación, las células T CD8+ de memoria son independientes de coestimulación para el crecimiento.
Para investigar la hipótesis anterior formalmente, los inventores determinarán si las nanoesferas recübiertas con IGRP2o6-2i.4/ d- pueden expandir las células T CD8+ con • i I GRP206-2i4/Kd-reactivo en una cepa NOD dirigida a gentes que expresan una forma mutante de I GRP en la cual ^los dos residuos de TCR de contacto de IGRP206"214 se han reemplazado con alaninas (K209A y F213A) . Los alelos fijados como . i objetivos (en este documento referidos como FLEX1 o NOD. IGRPK209A/F213AKI ki) se retro-cruzan en el. fondo NOD (de 129) usando el procedimiento de. velocidad congénico, para asegurar la capacidad homocigótica para los alelos NOD en todos los . i sitios Idd. Debido a que las células T CD8+ que maduran en estos ratones específicos de genes nunca se exp:onen al IGRP206-214 in vivo, estos ratones no pueden : generar espontáneamente células T CD8+ de IGRP206-2i4/ d-reactivo de ; ' i memoria. A pesar del hecho de que éstos ratones desarrollan tanto diabetes como insulitis (no mostrada), sus células T CD8+ asociadas a islotes reconocen los epítopos en IGRP, pero están desprovistos completamente de clonotipos GD8+ de IGRP206- 214-reactivo . Se contempla que los ratones NOD FLEXl- homocigotos tratados con dosis óptimas dé nanpesferas recubiertas con IGRP206-2i4 Kd-no contendrán acervos expandidos .i de células T CD8+ de IGRP206-2i<i/ d-reactivo en, sus órganos linfoides. Esto sugerirá que las nanoesferas recubiertas con péptido/MHC expandirán los acervos pre-existentes de las células T de memoria con propiedades supresoras y no pueden generar células T de memoria de nuevo. . ¦'.·. ! · '. Puesto que los clonotipos.de baja avidez (es decir, en ratones Val7.6+ TCR-TG) parece que son más eficientes en la generación de la progenie de células T de memoria que sus contrapartes de alta avidez (es. decir, en ratones Val7.4+ TCR-TG) durante . la ' diabetogénesis , se cree que las nanoesferas recubiertas con péptido/MHC- funcionan al j inducir la supresión de los clonotipos de alta avidez vírgenes y la expansión de los acervos pequeños de clonotipos de baja avidez de memoria pre-existentes.
Ejemplo 2 Prueba de la Capacidad de las Nanoesferas de Óxido de; Hierro Recubiertas con Complejos de Póptido/HLA Relevante de Diabetes Tipo 1. Humana para Restaurar la Normoglicemia Ratones "humanizados" que expresan transgenes HLA y complejos de péptido/HLA disponibles para los estudios propuestos . Como se menciona en lo anterior,, los péptidos derivados de insulina e IGRP son objetivos primarios de las células T CD8+ en ratones NOD de tipo natural. La evaluación de las moléculas MHC humanas (Human Leukocyte Antigeríos, HLA) presentaron péptidos derivados de estos dos autoa;ntigenos durante la diabetogénesis que está siendo investigada en ! ratones NOD transgénicos HLA "humanizados". Los estudios se enfocaron inicialmente en el HLAA*0201, una molécula: MHC que se expresa por casi 50% de ciertos grupos étnicos. Este estudio emplea la cepa designada ??.ß2 mnull.HHD, que carece del gen de macroglobulina ß2 de murino y expresa el constructo de monocadena. quimérico HHD (Pascólo y colaboradores, 1997). Este constructo codifica el ß2p? humano covalentemente enlazado a los dominios al y a2 del HLA-A*0201 humano, y el a3, transmembrana, y dominio citoplásmicos de H- 2Db de- murino. Aunque la cepa expresa solamente HLA-A*0201, y rio las moléculas MHC clase I de murino endógenas, es susceptible la diabetes, con 55% de hembras afectadas de 30 semanas de edad (Takaki y colaboradores, 2006) . Dos jepitopos de IGRP humano (hIGRP228-236 y hIGRP265-273 ) que se enlazan al HLA-A*0201 son reconocidos por las células T CD8+ asociadas con islotes de estos ratones y las células T CD8+ aisladas de los islotes de los ratones ?0?.ß2 mnull.HHD son citot¡óxicas a los islotes de HLA-A*0201-positivo humanos (Takaki y j colaboradores, 2006 ) . Los tetrámeros de péptido'/HLA-A*0201 se hicieron usando uno de estos péptidos. Para facilitar el enlace de estos tetrámeros por las moléculas CD8 de murino, el dominio a3 (enlace CD8) del complejo HLA-A*'o201 se reemplazó con aquel de la molécula H-2 Kb de ' murino. Los i resultados de estos estudios han establecido la utilidad de estos ratones para la identificación de células T restringidas de HLA-A*0201 y los autoantigenos de · células beta de relevancia potencial a la T1D humana '(Takaki y colaboradores 2006) . Con base en la descripción actual, se puede identificar los -péptidos humanos que son fijados como objetivo por las células T restringidas de HLA-A*0201 de los pacientes con T1D. Además, los. inventores han 'generado Í I ratones NOD que expresan HLA-A*1101, HLA-B*0702, ' o HLA- Cw*0304. Estos ratones también tienen el ß2p? de murino reemplazado con el ß2p? humano al cruzarlos con la.cepja NOD.p2 mnull.h32m (Hamilton- illiams y colaboradores, 2001) . Los tres transgenes HLA se expresan bien, y las tres cepas de HLA transgénicos son susceptibles a la diabetes/ ¡ Tomados conjuntamente los H.LAs de esos animales "humanizados" son representativos dé los cuatro supertipos de HLA diferentes ¡ HLA-A2, HLA-A3, HLA-B7, y HLA-C1, respectivamente (Sidney y colaboradores , 1996 ; Doytchinova y colaboradores, 2004 ) Estas frecuencias . de genes de los alelos HLA-A*1101, HLA- B.*0702, o HLA-Cw*0304 pueden ser tan¦ altas como 23%, 11%, o 10%, respectivamente, dependiendo del grupo étnico examinado (Cao y colaboradores, 2001) . La cobertura de la población puede ser de más de 90%, dependiendo del grupo étnico considerado, cuando los cuatro supertípos se fij!an como objetivo (Sidney y colaboradores, 1996; Doytchinova y colaboradores, 2004; Cao y colaboradores, 2001). ' Esta consideración es significativa con respecto a la traducción de estos estudios a humanos. Estos animales también como las cepa NOD. ß2????11. HHD previamente descritas son disponibles para estudios adicionales.
En este ejemplo los inventores proponen un diseño en como traducir estas observaciones en los ratones NOD de ' i tipo natural a los ratones NOD HLA . transgénicos "humanizados". El objetivo es investigar si el tratamiento con nanoesferas recubiertas con varios complejos péptido/HLA diferentes fijan como objetivo acervos de célulasj T CD8+ autorreactivas relevantes a la T1D humana pueden proteger a los ratones de la diabetes así como restaurar la normoglicemia en sus contrapartes .recientemente diagnosticadas. En este punto los inventores presentan un procedimiento traduccional para identificar combinaciones relevantes de péptido/HLA de T1D para el uso en la T1D humana.. Específicamente, ' los inventores contémplan que las nanoesferas recubiertas con los complejos de péptido/HLA- A*0201 autoant igénicos relevantes de T1D diferentes permitirán la protección de la diabetes y curarán la T1D en los ratones NOD . ß2p???11. HHD (que- expresan . Una persona de experiencia . en el campo esta descripción para el uso con otros epitopos relacionados con otras enfermedades autoinmunitarias , usando composiciones y métodos similares , a aquellos usados con la insulina' y/o epitopos IGRP presentados por otras moléculas HLA eri ratones HLA-transgénicos "humanizados" a las células T CD8+ asociadas con islotes, para incluir otras composiciones y métodos. Una persona de experiencia será capaz de identificar las condiciones de tratamiento mínimas y el tipo de complejos de ? péptido/HLA que permitirán beneficios terapéuticos ( máximos así como los requerimientos para la existencia pre- terapéutica de células ' T CD8+ de baja avidez de memoria para el éxito terapéutico y la identificación de las combinaciones de péptido/HLA adicionales que cubren tantos individuos en ¦ i diferentes grupos étnicos como sea posible. ; Síntesis de nanoesferas. Las nanoesferas. se sintetizan y se caracterizan en los niveles físicos y químicos esencialmente como se describe previamente. (Moore y colaboradores, 2004), pero usando monómeros de péptido/HLA- A 0201 biotinilados . La molécula MHC del complejo, sé compone I de microglobulina ß2 humana y una forma quimérica de HLA-A*0201 humano en el · cual sus dominio al y a2 .se fusionan al dominio OÍ3 del H-2 Kb de murino (para .facilitar el reconocimiento por la molécula CD8 de murino) . Como péptidos autoantigénicos se usan varios derivados de insulina e IGRP diferentes (tal como, por ejemplo, hInsBio-i8/ I1IGRP228-236 y hIGRP265-273 ) que se han mostrado que son reconocidos por las células. T CD8+ asociadas con islotes en el contexto de HLA-A*0201. Los monómeros de péptido/HLA-A*0201 biptinilados se agregarán en una relación molar de 4 moles de biotina por mol I de avidina . Las proteínas biotiniladas se ·.' agregarán en 1 múltiples porciones (aproximadamente 0.4 moles de biotina. por avidina) durante un período de 24 horas a 4°C con baja agitación (10 rpm) . Las zonas resultantes se purifican en una columna de separación magnética (Milteny Biotec) .· Un monómero i consistió de un péptido de enlace HLA-A*0201 no relacionado 1 con formado en complejo con moléculas HLA-A*0201 se usan para la síntesis de la sonda de control negativo. El tamaño de la nanoesfera, relaxividad (cambio en la velocidad de relajación por mM) , número de sitios de enlace de biotina, y contenido de hierro y proteína son medidos.
Administración de nanoesferas . Los cohortes de .10- 15 ratones NOD. P2mnu11. HHD hembras se trataron con nanoesferas recubiertas con cada uno de los diferentes complejos de péptido/HLA referidos en lo anterior o un complejo de péptido ( nfluenza') /HLA de control negativo (0.01, 0.05, 0.1, : 0.5 y 1 µ? de equivalentes de péptido, una dosis cada 3 semanas de 4 a 30 semanas de' edad, o dos dosis/semana comenzando en la 10 semanas de edad durante 5 semanas consecutivas). La · eixpansión periférica de las células T CD8+ especificas de antigeno se documentará al teñir células mononucleares de sangre, con mAb anti-CD8 y tetrámeros de péptido/MHC (antes del inicio del tratamiento y en el retiro del tratamiento) . Los ratones se exterminarán en el inicio de hiperglicemia o al final del estudio. Los ratones individuales se estudiarán por citometría de flujo multicolor para presencia de células T CD8+ tetrámero+ (CD69~, CD44hi, CD62Lhi o CD62L10, CD122f, Ly6C+) de memoria centrales y/o efectoras en diferentes órganos linfoides (bazo, nodos linfáticos) , médula ósea (un depósito conocido de células T de memoria), hígado, pulmón e ¡islotes. La avidez de enlace de tetrámeros se medirá como se describe (Han y colaboradores, 2005; Amrani y colaboradores,' 2000). Los inventores contemplan que el tratamiento induce la expansión sistémica de células CD8+ tetrámero* de memoria centrales y efectoras de baja avidez y la acumulación preferencial (pero no exclusiva) de estas células -T en la médula, nodos linfáticos pancreáticos (PLNs) e islotes.
Administración de múltiples dosis de complejo de póptido/MHC. En otro estudio, los cohortes de ratones se tratarán con una, dos, tres o cuatro inyecciones de una dosis efectiva, que los inventores contemplan que son similares para todos estos complejos que muestran eficacia terapéutica en otros estudios (a 4, 7, 10 y 13 semanas) . Se espera que la protección requiera una o más de una dosis (para expandir el acervo de células T de baja avidez de memoria arriba del umbral protector) y que la población de células T de| memoria tetrámero+ CD8+ expandidas desaparecerá progresivamente de la circulación para acumularse en la médula ósea, PLNs, e isletas .
Administración de complejos de póptido/MHC en el inicio de hiperglicemia . Los ratones se tratarán en el inicio de hiperglicemia (>10.5 mM/1) con un protocolo de tratamiento de nanoesferas más agresivo (1-5 iq de equivalentes de péptido dos veces a la semana durante 5 semanas) . Los controles negativos . y positivos recibirán nanoesferas recubiertas con un complejo de péptido/HLA irrelevante o mAb anti-CD3 (una inyección i.v. diaria de '20 µg durante 5 -días (Haller, 2005)), respectivamente. A los ratones se les extraerá sangre inmediatamente antes del¦ , inicio del tratamiento para evaluar los porcentajes de línea base de las células T CD8+ tetrámero positivo en la circulación. La reversión de la T1D se considerará cuando los valjores de glucósidos en sangre se estabilicen' a <10 mM/1 durante por lo menos -4 semanas en las cuales el tratamiento se retira en el tratamiento de tiempo. A los ratones se les' extrae sangre nuevamente para confirmar la presencia de 1 acervos significativamente expandidos de células T tetrámer.o positivo CD8+ circulantes. Los animales son seguidos mediante, por lo i menos 8-12 semanas adicionales para asegurar la remisión estable. Los ratones se sacrifican al final del periodo de observación para establecer la persistencia a largó plazo de los acervos expandidos, de las células T .tetrámero-ppsitivos CD8+ de memoria . en diferentes órganos linfáticos' y no linfáticos. El tejido del páncreas también se recolectará para análisis histológico. Se espera que la remisión a largo plazo se asocie con la presencia de numerosos islotes pequeños desprovistos de infiltración celular mononuclear . Es decir, diferente a la situación en los ratones pre-diabéticos donde el tratamiento se espera que fomente la ocupación de islotes inflamados por las células T de memoria protectoras, los tratamientos en los ratones diabéticos se predice para promover la acumulación de las células T' de memoria protectoras en los nodos linfáticos pancreáticos (además de otros depósitos de células T de memoria), pero no en los islotes, (presumiblemente islote recién nacidos que carecen de potencial inflamatorio) . . ' : Las nanoesferas recubiertas con péptido/HLA funcionan al inducir la supresión de clonotipos de alta avidez vírgenes. Los inventores contemplan que las células T CD8+ autorreactivas de baja avidez tienden a acumularse como células de memoria durante la progresión de TID (enj números pequeños) y que las nanoesferas recubiertas con péptido/HLA funcionan al inducir . la supresión de clonotipos de alta avidez vírgenes (debido a el accionamiento de TCR 1 sin coestimulación) y la expansión de acervos .' pequeños de clonotipos de baja avidez de memoria pre-existentes (coestimulación-independiente). En parte, esto se deriva de la observación de que el tratamiento de los ratones con un complejo de péptido irrelevante (de un tumor antigénico, (TUM/H-2 Kd) no indujo la expansión periférica de lasj células T CD8+ tetrámero reactivo TUM/Kd arriba del fondo (véase en lo i anterior) . Estas células CD8+ autorreactivas de baja avidez de memoria que inhiben' la activación de las contrapartes de alta avidez vírgenes (presumiblemente menos ajustadoras) al competir para recursos estimuladores (es decir, antígeno/MHC sobre DCs, citocinas, etc.). De hecho, existe evidencia en otros sistemas que las células de memoria pueden competir efectivamente con las células T vírgenes para ; señales homeostáticas (es decir, IL-15) (Tan. y colaboradores^ 2002). Al hacer contactos estables con las DCs cargadas con autoantígeno en las PLNs, estos clonotipos de baja avidez de memoria prevalentes también inhibirían la activación de otras especificidades de células T autorreactivas.
La manifestación de la expansión de célulasj T (y la 1 actividad anti-diabetogénica) de las nanoesferas recubiertas con péptido/HLA requiere la expresión del autoantígeno objetivo endógeno en células beta. La expresión j de los aútoantígenos objetivos endógenos se cree que son la fuente del estímulo que induce la formación de los acervos de células T CD8+ autorreactivas de baja avidez de memoria que s expanden subsecuentemente por . el tratamiento de nanoesferas. Una deficiencia de IGRP se introduciráj en los ratones NOD. 2mnull.HHD. Estos ratones se tratarán con nanoesferas recubiertas con . hIGRP228-236 ' (reactividad j cruzada con mIGRP228-236) y. hIGRP265-273 (idéntica a mIGRP265-|73) /HLA-A*0201- (Takaki y colaboradores, 2006). Los- ¡ratones NÓD. 2mnu11. IGRPnull.HHD se tratarán con dosis óptimas de nanoesferas recubiertas con los dos complejos, de IGRP/HLA.
Los inventores contemplan que el tratamiento no inducirá la expansión/reclutamiento de las células CD8+ de péptido hiGRP/HLA-reactivas correspondientes. ¦ ¦ ' ! i 1 Si la expresión de IGRP es dispensable para el desarrollo de diabetes (se sabe que la falta de expresión de i IGRP no es letal, ya que las ratas no lo expresan) y los ratones desarrollan espontáneamente diabetes, también se predice que el tratamiento de nanoesferas no protegerá los ratones de la T1D (no habrá células T CD8+ de IGRP-reactivo ¦ i ·. · de memoria) . En contraste, se cree que el tratamiento con nanoesferas recubiertas con complejos de HLA-A*0201 y epítopos de insulina inducirá la expansión de los acervos de células T de memoria correspondientes y serán protectoras, ya que los ratones continuarán expresando insulina. .
Es posible que los tipos de .nanoesferas ; que se someten a prueba en este documento no induzcan expansiones de células T significativas en todos los ratones. Esto dependerá probablemente en si la población de células T correspondientes se ha sometido previamente al cebado1 in vivo antes del inicio del tratamiento. Puede ser útil/necesario estudiar cohortes adicionales de ratones tratados con I . ¦ cbmbinaciones de varios tipos de nanoesferas diferentes. Obviamente, es concebible que, contrario a la predicción del inventor, el tratamiento de nanoesferas podría' ser capaz de inducir de nuevo la formación de acervos de células T: de baja avidez de memoria. En este caso, sin embargo, los inventores contemplan que estas células no serán protectoras debido a que no serán capaces de acoplar los complejos de IGRP/HLA-A*0201 endógenos . sobre las ; DCs eri ratones NOD. ß2?????11. IGRPnull.HHD tratados. ¡ ¦ ¦ . :¦ ¦ í Ratones que expresan hIGRP. . Los inventores han generado varias lineas de ratones que expresan un transgen IGRP humano conducido por el promotor de insulina de rata y han comparado los niveles de la expresión del transgen humano en cada una de estas lineas a aquel del sitio de codificación mIGRP endógeno por la RT-PCR en tiempo real. Aunque los niveles de expresión del . transgen fueron altamente variables de linea a linea, los niveles de expresión fueron consistentes entre diferentes individuos dentro de lais lineas individuales. En una de estas lineas (#1114) los niveles de expresión del hIGRP fueron equivalentes a aquellos del mIGRP.
Los inventores introducirán este transgen RIP-hIGRP en los ratones NOD. 2mnu11. IGRPnull.HHD y los ratones h 2m/HLA-A*1101, HLA-B*0702, o · HLA-Cw*0304 -transgénicos OD. p2mnu11. IGRPnu11, para identificar los epitopos adicionales en el hIGRP que son objetivos de las respuestas de células T CD8+ en el conteo dé estos cuatro alelos HLA diferentes. Las células T CD8+ asociadas con islotes de estos ratones se clasificarán para reactividad contra . las bibliotecas de péptidos hIGRP HLA-A*0201, HLA-Á* · 1101, HLA-B*0702 · y de enlace HLA-Cw*0304.
Las nanoesferas recubiertas con complejo de péptido/HLA correspondientes luego se someterán. a prueba para eficacia antidiabetogénica en los ratones ?ß2 .m/HLA-A*1101 , HLA-B*0702, o HLA-Cw*0304-transgénicos NOD . ß2???a11. IGRPnu11. El ' - i objetivo completo de este ejercicio es expandirse sobre el repertorio de las combinaciones de péptido/HLA que sej podrían usar para tratar tantos pacientes como sea posible. '· Optimización de propiedades terapéuticas NP y conjugación pMHC. Los estudios en marcha que usan¦. c'omplej os de pMHC clase I se hicieron para optimizar el tamaño NP y la densidad, así como también la valencia de- pMHC. Esto se hizo usando NP de oro, ya que son más propensas a estos tipos de estudios que el óxido de hierro. Esto también ha ayudado a los inventores a mostrar que la capacidad de la pMHC-NP de expandir de la memoria de las células T auto-reguladoras es independiente de la composición química del núcleo' NP (óxido de hierro vs . oro) . Se hizo trabajo extensivo con las NPs de oro de diferentes diámetros y los datos sugieren que las NPs de <14 nm en diámetro son benéficas junto con las líneas que apuntan a más pequeñas por. ser el tamaño NP óptimo. El . enlace direccional de múltiples pMHCs a la superficie NP (>50-200/NP) a través de su estabilización carboxiterminal y adecuada de las. NPs recubiertas para permitir la concentración de altas densidades de partícula (>10A10/uL) sin comprometer la monodispersión de las NPs o estabilidad. Al someter a prueba estas nanovacunas de clase ' I en los ratones NOD pre-diabéticos , los inventores establecieron un intervalo trabajable de dosis de N.P y valencia de pMHC que permite la expansión significativa de células T. CD8+ autoreguladoras cognadas in vivo (-10-20 ' veces) . Los inventores han establecido que la dosis total de las' pMHC .es clave, y que se obtienen mejores resultados cuando se administran mayores números de NPs pequeñas recubieftas con pocos pMHCs que menos números de NPs más grandes redubiertas en valencias pMHC mayores (para la misma cantidad de pMHC totales) . Estas condiciones también reducen la acumulación de tejido y permiten el suministro de niveles terapéuticos de pMHC en dosis posibles más bajas de metal.· En una modalidad preferida, se usan regímenes de dosificación con base en las siguientes suposiciones : ! .
Suposiciones: nanopartículas de óxido de hierro de 4. nm recubiertas con aritígeno pMHC en una .densidad sujficiente ? que la cantidad total de proteínas por dosis ! es de aproximadamente 1 pg a 25 pg.
Por ejemplo, el pg) = (1.34 x 1013 pMHC/dosis a Hierro total por dosis (4nm) de NPs (1 pg-15 . pg) = (3.73xl012 Nps/dosis a 5.60xl013 Nps/dosis) . ¦ 1 Se entiende que- la cantidad de pMHC pór dosis' puede variar de tan bajo como 0.1 pg a 500 pg.
Como ejemplo, en un paciente humano de 60 kg, la cantidad de pMHC por dosis puede variar de 0.24.a 6.0-8 mg con el entendimiento de que esto corresponde de 1 g !a 25 · µ? planteado en lo anterior. También como lo anterior, esta dosis se puede cambiar para corresponder de 0.1 µg a 500 µg.
Las partículas de óxido de hierro de 4 nm descritas en lo anterior proporcionan eficacia mejorada relativa con las nanopartículas de oro que tienen un diámétro de 14 nm sugiriendo que las partículas más pequeñas tienen utilidad mejorada. Se entiende que el término "óxido de hierro" se propone por estar incluyendo todos los óxidos de hierro disponibles o conocidos por el artífice experto e incluyen por medio de ejemplo, hidróxidos de hierro.
Ejemplo 3 NANOESFERAS RECUBIERTAS CON PÉPTIDO-MHC CLASE II MONOESPECÍFICAS Producción de los complejos de pMHC clase II relevantes de T1D. A fin de probar la hipótesis de que las nanoesferas recubiertas con complejos de péptido/I-Ag7 relevantes de TÍD también podrían la protección ·' de T1D y curar la TID en ratones NOD, varios complejos de péptido/I-Ag7 diferentes se pueden construir a . partir de las siguientes cinco secuencias de péptido de TlD-relevante y de control: mimotopo BDC2.5: AHHPIWARMDA (SEQ ID No. 59);' IGRP^e-ns : TAALSYTISRMEESSVTL (SEQ ID No. 60); IGRP4-22: LHRSGVLI IHHLQEDYRTY . (SEQ ID No . 61); . IGRPi95-2i4 : HTPGVHMASLSVYLKTNVFL. (SEQ ID Ño. 62); e Insulina B9.23: SHLVEALYLVAGERG (SEQ ID No. 63) . Como controles negativos, el complejo de péptido de G6P isomerasa (LSIALHVGFDH; SEQ ID No. 64)/I-Ag7 (autocontrol de p HC) , y dos . complejos' de lisozima de huevo de gallina (HEL14-22 -RHGLDNYRG; ' SEQ ID - No. 65- y HEL -25 -A KRHGLDNYRGYSL; SEQ ID No. 66-)/I-Ag7 (controles de pMHC extraños) se pueden usar. Los monómeros de I-Ag7 i recombinantes se genera como se describe previamente. Brevemente, los constructos finales en el código pRMHa3 vector para las secuencias líderes naturales, seguido por las secuencias de péptidos descritas en lo anterior, y los dominios extracitoplasmáticos de las cadenas a y b de I-Ag7, respectivamente. Ambas cadenas se extienden en la secuencia dé ligadura (SSAD) , un sitio de escisión de trombina i(LVPRGS) y una secuencia de cremallera de leucina ácida o básica para la cadena a y.b; respectivamente, seguido por seis residuos de histidina consecutivos.. Una secuencia de biotinilación #85 sigue la cremallera ácida en la cadena. Los constructos de DÑA„ se co-transfectan en las células SC2 de Drosophila melanogaster junto con · un gen de resistencia a la puromicina para generar líneas de células estables. Para una preparación a grande escala (12 litros), . se recolectan proteínas recombinantes mediante flujo tangencial de sobrenadantes de células inducidas por CuS04 y ' se purifican mediante cromatografía por afinidad de quelato de metal, cromatografía de intercambio aniónico, así como también cromatografía de exclusión de tamaño. La biotiñilación de las moléculas purificadas se lleva a cabo usando , la enzima BirA. La biotinilación se mide por la inmunosupresión en lasi cuentas de estreptavidina-agarosa y el análisis subsecuente por el SDS-PAGE. Estos complejos . se pueden conjugar : a las nanoesferas bioabsorbibles, biodegradables . Estos monómeros también se pueden usar para producir tetrámeros conjugados con . fluorocromo para enumerar las células ¡T CD4+ autorreactivas cognadas, tanto antes como después del tratamiento con las nanoesferas recubiertas con pÚHC. Los complejos de pMHC biot inilado.s purificados luego se pueden recubrir sobre las nanoesferas. Para .los estudios propuestos en este documento., los inventores, pueden producir los complejos de pMHC recombinantes en células de mosca, como en lo anterior, pero usando un. diseño de constructo diferente que incremente la valencia total de las pMHCs que se pueden recubrir sobre las. nanoesferas individuales: dímeros de pMHC fusionados al IgG2a Fc.
Optimización de las propiedades terapéuticas de la nanoesfera y conjugación de pMHC. Los estudios que usan complejos de pMHC clase I se pueden hacer para optitnizar el tamaño y la densidad de la nanoesfera, asi como la valencia del pMHC . El tamaño, densidad, carga y monodispersidad de las nanoesferas se puede medir por espectrometría, microscopía electrónica de transmisión (TEM) y dispersión de luz dinámica. Las muestras' de nanoesferas se' pueden concentrar, conjugar con las tiol-PEG-NH2-pMHCs de 3.4 kD, se: pueden lavar y concentrar en densidades altas (~l'01Vml) sin comprometer la monodispersión.
Se contempla que las nanoesferas de 5-15' nm en diámetro son óptimas. Nuevos protocolos de síntesis permitirán el enlace direccional de múltiples pMHCs para la superficie de la nanoesfera (hasta 200/nanoesferas, por ejemplo) a través de su estabilización carboxiterminal y adecuada de la nanoesfera recubierta para., permitir la concentración a altas densidades de partícula (>1010/uL) sin comprometer la monodispersión o estabilidad. ¡ Estas nanovacunas de clase I se pueden someter a prueba en ratones NOD pre-diabéticos. para establecer un intervalo trabajáble de dosis de nanoesfera y valencia de pMHC que permita la expansión masiva de células T CD8+ autoreguladoras cognadas in vivo. Se contempla que el tratamiento de ratones diabéticos recientemente diagnosticados con estas nanoesferas de pMHC será suficientemente alto en la · restauración . de la normoglicemia . Se contempla que los mejores ..resultados se obtendrán cuando se administren mayores números de nanoesferas pequeñas recubiertas con pocas pMHCs ' que pocos números de nanoesferas más .grandes recubiertas en , mayores valencias de pMHC (para la misma cantidad de pMHC total) . Se contempla . además que estas condiciones y las propiedades bioabsorbibles y biodegradables de las nanoesferas reducirá la acumulación de tejido y permitirá el suministro de niveles terapéuticos de pMHC en dosis más bajas posibles.
, Reversión de la hiperglicemia en ratones NOD mediante el tratamiento con nanoesferas recubiertas con pMHC clase II relevantes de T1D. Se contempla que las nanoesferas biodegradables, bioabsorbibles recubiertas con pMHC clase II pueden revertir la hiperglicemia en ratones NOD diabéticos recientemente diagnosticados, esencialmente como se describe para las nanoesferas. recubiertas con pMHC clase 'I. Los ratones NOD diabéticos se pueden tratar dos veces a la semana con 7.5 pg de NPs.. Los ratones se consideran curados" cuando permanecen normoglicémicos durante 4 semanas consecutivas. Se contempla que las nanoesferas de 2.5mi/I-Ag7 revertirán la hiperglicemia en casi todos los ratones sometidos a ¡prueba. La hiperglicemia se puede medir,, por ejemplo, mediante pruebas de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTTs) . Se contempla que la mayoría sino todos .'. los ratones hiperglicémicos . tratados con nanoesferas de IGRPi28-i4'5/I~Ag7-, nanoesferas de B9-23/I^Ag7- y nanoesferas de IGRP4-22/I_Ag7-serán normoglicémicos . Como un control, las nanoesferas recubiertas con GPl282-292/I_Ag7 (un autoantígeno irrelevante de T1D) y HELi,j-22/I-Ag7 · (un antigeno extraño se puede usar) . Se contempla que estos experimentos mostrarán . que las nanoesferas "monóespecíficas" recubiertas con varios complejos de pMHC clase II relevantes de T1D diferentes pueden ser por lo menos tan efectivas en la inducción de la reversión de T1D como las nanoesferas recubiertas con pMHC clase I. En algunos casos, se cree que el refuerzo podría, ser necesario para mantenimiento en largo plazo consistente y universal de la normoglicemia .
Nanoesferas recubiertas con pMHC clase II relevantes de T1D y la expansión de células T CD4+ autoreguladoras similares a Trl y de fenotipo de memoria cognadas. Se contempla que la sangre, bazo, nodos' linfáticos pancreáticos (PLNs), nodos linfáticos mesentéricos (MLNs) y médula ósea de ratones diabéticos de 50 semanas de edad luego se pueden volver normoglicémicos . por el tratamiento con nanoesferas de 2.5mi/I-A7 revelarán un porcentaje significativamente incrementado de células T tetrámero+ CD4+ 2.5mi/I-Ag7 en todos los órganos examinados excepto en el MLNs, como es . comparado con los ratones. estudiados inmediatamente en el inicio de la diabetes o en animales no tratados no diabéticos de edad igualada. Se cree :que, se detectará la expansión de células T CD4+ serán específicas de antígeno y no de expansión en los acervos de las células T CD4+ autorreactivos no cognadas. Se contempla que el mantenimiento de la expansión de células T autoreguladoras será necesaria . para el mantenimiento sostenido ' de la normoglicemia . Los análisis fenotípicos de estas células de tetrámero+ 2.5mi/I-Ag7 expandidas con NP versus de tetrámero 2.5mi/I-A97 pueden revelar un fenotipo similar a ; memoria (CD62low, CD44high y regulación por' incremento ¦ de CD69 moderada). Estas células pueden ser CD25- y FoxP3-. 'Esto se puede confirmar en los. ratones NOD que expresan FoxP3-eGFP, en los cuales las células Treg expresan constitutivamente eGFP. Él tratamiento de estos ratones a 10 semanas de edad con nanoesferas de 2.5mi/I-Ag puede expandir las células T CD4+ tetrámero"1" eGFP- 2.5mi . Funcional en los estudios in vitro de las células T tetrámero+ CD4+ de .2.5mi/I-Ag7 clasificadas con FACS pueden determinar si proliferan en respuesta a las DCs pulsadas con el cognado, pero no él polipéptido no cognado y si secretan IL-10 e IFNy.1 . Estos estudios se . pueden hacer usando el ELISA y la tecnología luminex. Se, contempla que estas células T CD4+ similar a Trl expresarán altos niveles de TGF de superficie celular.: Se contempla que las células de tetrámero+ expandidas con nanoesferas de p HC clase II, pero' no sus contrapartes de tetrámero, suprimirán efectivamente la ¦' i proliferación de las células CD8+ especificas de LCMV Gp33 vírgenes contra Gp33 y las DCs pulsadas con péptido 2.5mi (reconocidos por las células C.D4+ Trl tetrámeros"1" y respondedoras, respectivamente). Se cree además que la adición de un mAb anti-IL10 a los cultivos inhibirá parcialmente' esta actividad supresora, como es ;¦ comparado con los cultivos que reciben TgG de rata de control. Se cree que los experimentos en ratones diabéticos tratados con nanoesferas de IGRP4-22/I-A97 y el bloqueo del anti-IL-Í.0 o IgG de rata (como un control), también como los experimentos en los ratones NOD deficientes de perforina mostrarán que la réstauración de la. normoglicemia por las nanoesferas 'de pMHC clase II es dependiente de IL-10- y perforina. Se contempla además que - la IFNy. es necesaria para el desarrollo > de las células Trl que pueden expandir las nanoesferas de pMHC pero para su actividad supresora. Las células T autorreactivas cognadas se pueden expandir en respuesta a la terapia de nanoesferas de pMHC en ratones IFNy-/- que pueden tener un fenotipo Th2 (que. producen IL-4 e IL-10. en respuesta a la estimulación del péptido ex vivo), mientras que aquellos que se expanden en ratones. IL-10-/- pueden producir IFNy; e IL-4 . . - I pero no IL-10. Estos resultados indicarían que lá- ^eversión de la diabetes es mediada por células similares' a Trll Ejemplo EXPANSIÓN DE CÉLULAS T USANDO NANOESFERAS E IGRP/KD-PLGA.
Las nanoesferas de IGRP206-214/Kd-PLGA inducen la activación de. células T CD8+ cognadas in vitro. Este ensayo se llevó a cabo esencialmente como se describe por; Ts'ai y colaboradores, Immunity (2010) 32, 568-680 que se incorpora en este documento a manera de referencia. Brevemente, las células T CD8+ transgénicas (TCR) del receptor de células T específico de IGRP206-214 /Kd vírgenes purificadas de .' ratones 813-NOD se cultivaron con nanoesferas de IGRP206-214 /Kd-PLGA durante 48 horas. Los sobrenadantes se sometieron ai ensayo para el IFN-gamma. Las células se pulsaron con 1 µ?? de- [3H]-timidina y se recolectaron. El CPM y la IFN-gamma se midieron en relación con el número de nanoesferas por pocilio. lEsto se representa en la Figura 9. La Figura 8 representa üna imagen aumentada de las partículas de PLGA conjugadas con IGRP/Kd. Las partículas de ' PLGA se hicieron de acuerdo ¡con. lo siguiente: concentración: 100 nm (PLGA: .20 mg/mL in 1.5 mL) .
Tamaño de DLS : 154.72 nm Conjugación de pMHC: conjugadas con. 5¦ mg de IGRP/Kd con 2 mL de partículas de PLGA Volumen final: 2 mL REFERENCIAS Las siguientes referencias, . al¦' grado que proporcionen un procedimiento ejemplar u otros detalles complementarios para aquellos expuestos en este documento, se incorporan específicamente en este documento a manera de referencia en su totalidad.
Patente de E .U ..A. No. 4, 367, 110 Patente de E .U .A. No. 4,452,901 .
Patente de E .U .A. No. 4, 554, 101 Patente de E .U .A. NO. 4, 589, 330 Patente de E .U .A. No. 4, 818, 5'42 Patente de E .U .A. No". 6, 103, 379 Patente de E .U .A. No. 6, 387, 498 Patente de E .U .A. No. 6, 651, 655 Patente de E .U .A. No. 6, 712, 997 Publicación <de E. U.A. 20050202032 Solicitud de Patente de E. U.A. No. 12/044,435 . ' Aichele y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA,..91 : 444-448, 1994.
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Claims (22)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito, la presente invención, se . cpnsider.a como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: . REIVINDICACIONES
1. El uso de. una cantidad suficiente de un complejo de antígeno-MHC acoplado operativamente ; a una nánoesfera biocompatible, bioabsorbible en la preparación de un medicamento para prevenir o ' tratar ..un' trastorno autoinmunitario en. un sujeto.
2. El uso de una cantidad suficiente de un complejo de nánoesfera de autoantigeno, epítopo-MHC-biocompatible, biodegradable en la preparación : de un medicamento para expandir y/o desarrollar poblaciones de • i células T autorreactivas anti-patogénicas en un sujetoj.
3. El uso de conformidad con la reivindicación 2, en donde una pluralidad de epitopos de anti-antígenp están contenidos en el complejo de epitopo de autoantigeno-MHC, biocompatible, biodegradable.
4. . El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde la pluralidad de epitopos de autoantigeno se derivan de un solo autoantigeno.
5. El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde la pluralidad de epitopos de autoantigeno se, derivan de una pluralidad de autoantigénos .¦ '
6. El uso de conformidad con la reivindicación 5, en donde la población expandida de células T autorreactivas antipatogénicas son especificas de antigeno pero se suprimen en una manera no especifica de antigeno. ¦ .
7. El uso de conformidad con cualquiera, de las reivindicaciones 2, 4 o 5, en donde la administración del complejo de nanoesfera · biocompatible, bioabsorbible agota la población de células T autorreactivas patogénicas cognadas.
. 8. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2, 4 o 5, en donde el medicamento agota la población de células T autorreactivas patogénicas no cognadas .
9. Un complejo de nanoesfera de . epitppo de autoantigeno-MHC, biocompatible, bioabsorbible, caracterizado porque comprende un núcleo biocompatible y un recubrimiento i · biodegradable sobre la superficie exterior del núcleo.;.
10. El complejo de nanoesfera de epitopo de anti- antigeno-MHC, biocompatible, bioabsorbible de conformidad con la reivindicación. 9, caracterizado porque el núcleo biocompatible está compuesto de óxido de hierro. (III) .
11. El complejo de ¦ nanoesfera de'' epitopo de autoantigeno-MHC, biocompatible, bioabsorbible de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el recubrimiento bioabsorbible se selecciona de . dextrano, manitol y poli (etilenglicol) .
12. El complejo de nanoesfera de epítopo de autoantígeno-MHC biocompatible, bioabsorbible de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la nanoesfera se enlaza covalentemente al grupo MHC del complejo de epítopo de autoantígeno-MHC en donde el enlace es opcionalménte a través de una ligadura. . '
13. El uso de una cantidad .· suficiente ''de un complejo de antígeno-MHC acoplado operativamente ( a una nanoesfera biocompatible .en la preparación de un medicamento I para inhibir el inicio de una enfermedad autoinmunit ria en donde la molécula MHC comprende moléculas MHC clase II.
14. El uso de conformidad con la reivindicación 13, en donde las células T autorreactivas son células CD4+ TR.l .
15. El uso de conformidad con la reivindicación 14, en donde las células CD4+ TR1 se caracterizan por la expresión de IL-10-e IFNy. '
16. El uso de un complejo de antígeno-MHC acoplado operativamente a una · nanoesfera biocompatible en la preparación de un medicamento para tratar el componente inflamatorio de una enfermedad autoinmunitária en un 'sujeto que sufre de una enfermedad autoinmunitaria, en donde la molécula HC comprende- moléculas MHC clase II y el 'antigeno especifico para la . enfermedad autoinmunitaria.
17. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde la molécula MHC es una molécula MHC clase II.
18. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde las células T autorrea.ctivas son células CD4+ TR1.
19. El uso de conformidad con la reivindicación 18, en donde las células CD4+ TR1 se caracterizan' por la expresión de IL-10 e IFN7.
20. El uso de conformidad con la reivindicación 13 o 16, en donde la nanoesfera se forma a partir de .uno o más materiales biocompatibles , bioabsorbibles .
21. El uso de una cantidad suficiente de un complejo de antigeno-MHC acoplado operativamente 1 a una nanoesfera biocompatible en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad autoinmunitaria en un paciente en necesidad del mismo, en donde la molécula MHC comprende moléculas MHC tanto de clase I como clase II.
22. El uso de .conformidad con la reivindicación 21, en donde la enfermedad autoinmunitaria es diabetes tipo
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