DE3239410A1

DE3239410A1 - Monoklonale antikoerper zu tumorassoziiertem antigen, zusammensetzungen, welche diese enthalten und deren anwendung zum tumornachweis

Info

Publication number: DE3239410A1
Application number: DE19823239410
Authority: DE
Inventors: Thomas Henry 92024 Leucadia Calif. Adams; Gary Samuel 92037 La Jolla Calif. David; Samuel Elliot 92106 San Diego Calif. Halpern
Original assignee: Hybritech Inc; University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1981-10-27
Filing date: 1982-10-25
Publication date: 1983-05-19
Also published as: SE8206073D0; FI82379B; ES516797A0; GB2109407B; ES8505482A1; JPH0564130B2; FR2515046B1; SE8206073L; DK164682C; CA1202892A; IL67068A0; NO169947C; JPS58135820A; LU84441A1; IT8223932A0; GB2109407A; FI82379C; IT1153857B; DK474182A; ATA391682A

Description

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1974) · DIPL-ING. W. EITLE · D R, R ER. N AT. K. H O FFMAN N · Dl PL.-ING. W. LEH N

DIIM..-I ItC, K. FDCHf.LL · DR. RER. NAT. B. HANSfN AIiAIII I IAcriiASSI 4 ■ D HOtKI MU U C Il Γ N «1 . Tl: I FPON (089) Vl 10117 · Tt I Γ:Χ OWViI 9 (PATH E)

Hybritech Incorporated San Diego / USA

und

The Regents of the university of California, Berkeley, CA / USA

Monoklonale Anti körper zu tumorassoziiertem Antigen, Zusammensetzungen, welche diese enthalten u!ιd deren Anwendung zum Tumorn.achweis

Die Erfindung betrifft den Nachweis von .Tumoren. Sie betrifft insbesondere monoklonale, mit Radionukliden markierte Antikörper.

Tj So. Lt. Inmjorii svinht man nach einem zuverlässigen Verfahren zum spa/, irischen Nachwej κ von von Krebs befallenen Stellen. Aus don Uij-rü'en 3 063 684 und 3 697 630 .-sind Verfcihren beJcanni , mit denen man z. B. karzinoembryonisch.es Antigen (CEA), das im Blutstrom von Humankarzinoma zirkuliert, vorkommt. Diese Methoden sind jedoch offensichtlich nicht geeignet, um die Lokalisation eines Tumors zu bestimmen. Kürzlich wurdt: vorgeschlagen, Antikörper, die ' mit radioaktiven Isotopen von Jod markiert sind, zum Nachweis von mit Tumoren vorkommenden antigenen Substa-nzen zu verwenden. So wird in US-PS 3 927 193 ein Verfall-·

ren uiil-,c3. Vurwondunq von Ant.i körpern zu CEA, das mit J

J" mark.i ort i«t, boi-.chrtabcsn. Nach dieser Patentschrift

BAD ORIGINAL

wurden Versuche durchgeführt unter Verwendung von männlichen syrischen Hamstern, denen man humanes Signet-Ringzellenkarzinom eingeführt hatte, worauf man dann markiertes Ziegen-Anti-CEA injizierte und worauf dann die Untersuchung der Tierorgane zeigte, daß Radioisotope im Tumor lokalisiert waren. Es wurde, deshalb vorqeschlngon, daß man auch die Lokalisierung einas Turne· cm beim Menschen dadurch bestimmen kann, daß man parenteral Lösungen von Antikörpern in vivo verabreicht und anschließend den Wirt einem Photospanning-Verfahren unterwirft.

Die praktische Anwendung von radi'ojodierten Antikörpern hat nicht die ursprünglichen Erwartungen erfüllt. So berichten beispielsweise Goldenberg et al., N, Eng. J. Med.

298, 1384 - 1388 (1978) 1978 _{y._jer einen gewissen Erfolg beim Scanning (Abtasten) von Menschen mit .rudiojodiortom Anti-CEA. Wegen der restlichen Hintexgrundradioaktivität hing der beschränkte Erfolg von. d.er Anwendung der Subtraktionstechnik a.b. Mach et al. berichten in N. Eng. J.

Med., 303, 5-10 (1980) über noch weniger Erfolg und konnten nur 0,1 % der verabreichten Dosis im Tumor lokalisiert finden. In ausgewählten Fällen war jedoch das Auffinden des Tumors dennoch möglich·

Es ist bekanrvt, daß die Affinitätsreinigung von heterologen Antiseren zum Erhalten der bei den früheren Tumornachweisverfahren verwendeten ÄntikÖ'i per" Lm allgemeinen den Verlust von Hochaffinitatsantikörpern ergibt, und daß die erhaltenen Antikörper eine Mischung von spezifischen Antikörpern für unterschiedliche Determinanten von Antigenen sind und hauptsächlich aus Antikörpern mit niedriger Affinität und Antikörpern, die keine spezifischen Reaktionen ergeben, besteht. Monoklonal© Antikörper kann

BAD ORIGINAL

man andererseits so auswählen, daß sie eine hohe Affinität für ausgewählte Stellen des Antigens und eine niedrige nichtspezifLsche Bindung aufweisen, überraschenderweise wurde nun gefunden, daß monoklonale Antikörper zu Tumorantigenen, die mit Radioisotopen von Jod in bekannter Weise markiert wurden, trotzdem eine schlechte Lokalisierung der Krebsstellen ergeben trotz der Tatsache, daß man o:i ne in vitro-L'mmunoreaktivität findet. Dies kann wahrscheinlich auf den Verlust von radioaktivem Jod durch den markierten Antikörper zurückzuführen sein. Es besteht infolgedessen weiterhin ein Bedürfnis nach einer zuverlässigen Technik zum in vivo-Nachweis der. genauen Lokalisierung eines Tumors.

'Gemäß der Erfindung wird ein monoklonaler Antikörper oder ein Antikörper fragment zu einem Tumorantigen entweder direkt mit einem metallischen Radionuklid oder mit einem

111

chelaLgebundenem Radionuklid, z. B. DTPA-gebundenem ■ In markiert, indem man ein chelatbildendes -Mittel mit dem Antikörper konjugiert und anschließend einen Komplex aus dem Chelatbildner und dem Radionuklid bildet. Der gebildete markierte Antikörper, oder ein Fragment davon, kann dann, wenn er einem Tumor-tragenden Wirt injiziert wird, schnell und mit hoher Spezifität den Tumor selbst lokalisieren. In einigen Fällen kann auch die Lokalisierung von entfernteren Metastasen auftreten und dadurch das Ausbreiten ύ(Η Tumors angezeigt werden. Die Lokalisierung des Tumor.«; );aim durch PhoLo£!can-nlng-Technik nachgewiesen werden. Ebenso kann man auch Mischungen von markierten monoklonalen /mtikörpern verwenden.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es somit, monoklonale Antikörper gegenüber tumorassoziierten Antigenen, die mit metallischen Radionukliden markiert sind, zu zeigen,

ORlGJNAL

Eine weitere Aufgabe der Erfindung lsi. es, ein verbessertes Verfahren zum Aufdecken ei.noss Krebses bei einem infizierten Wirt zu zeigen.

Die Lösung dieser und ähnlicher Aufgaben geht aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung und den Figuren hervor.

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Verteilung

Ί "1 *1 "IOC*

von In und ^JJ im Gewebe j in Vergleich zur Vor-

76
teilung von Ga als Funktion der Zeit nach dem

111 1 2 'S Injizieren von Anti-CEA, das mit In und " J

■ fi 7

und Ga-Citrat markiert war in nackte,mit humanen Coloncancer infizierte Mäuse.
15

Fig. 2 zeigt eine graphische Darstellung und gibt die

Menge an In und J und Ga an, die von nackten Mäusen in zunehmender Zeit nach dem Injizieren

111 125 von in und J marki

20 trat ausgeschieden wird.

111 «ι OC £ "7

von in und J markiertem Anti-CEA und Ga-Ci-

Fig. 3 ist eine graphische Darstellung und zeigt die Ver-

111 125 teilung im Gewebe von ■ In und J in nackten Mäu-

111 125 sen 48 h nach dem Injizieren von In und J mar· 111 kiertem Anti-CEA im Vergleich zu In-Citrat und

1 25

J markiertem Humanalbumin.

Fig. 4 ist eine graphische Darstellung und zeigt das Tumor/

111 125 Gewebe-Verhältnis von In und "J im Vergleich, zu

Ga nach dem In j:l ■/. Leren, von In- und ^J'"\j-iiiar-

kiertem Anti-CEA und Ga-Citrat in nackte Mäuse als Funktion der Zeit.

BAD ORIGINAL

β m

- 10 -

Wie dargelegt, werden erfindungsgemäß monoklonale Antikörper oder Fragmente davon zu Tumor-assoziierten Antigenen direkt mit metallischen Radionukliden oder mit chelatgebundemm Radionukliden markiert. Die erfindungsgemäß verwendeten monoklonalen Antikörper sind Produkte der bekannten Hybridoma-Technologie. Hierzu wird beispielsweise auf die Originalarbeiten von Milstein und Kohler, die in Nature, 25J5, 495 - 497 (1.975) beschrieben werden, verwiesen. Kurz gesagt wird bei diesem Verfahren eine Maus oder ein anderes geeignetes Tier mit Immunogen iaij:i.:-.lert, im vorliegenden Fall mit einem tumorassoziierten Zeitigen wie CEA. Anschließend wird die immu-r nisierte Maus dann getötet und aus der Milz werden Zellen genommen, die mit Myelomaζeilen unter Ausbildung von Hybridzellen, die man als "Hybridomas" bezeichnet, vereinigt werden und die in vitro reproduziert werden können. Die Population der zellbildenden Antikörper wird selektiv kultiviert und untersucht, um Individualklorie zu isolieren, von denen jeder eine einzelne Antikörpeispezies, die spezifisch für eine spezielle Region ist ("Determinant") an der Oberfläche des Antigeiimoleküls abscheidet.

Die Individuallclone können weiterhin auf solche.· untersucht worden, die Ant:i körper der höchsten Affinität für das Anrigr-n bilden und die eine niedrige nichtspezifische Bindung aufweiten. Der für die Radiomarkierung verwendete Antikörper (der normalerweise aus Ascites isoliert wird), wird mit dem metallischen Radionuklid umgesetzt oder mit einem geeignet<>n Chelatbildner, der anschließend zum Binden des Radionuklids verwendet wird, konjugiert. Der Chelatbildner kann unter Verwendung einer großen Anzahl von Verfahren an den Antikörper gebunden werden. Da der Antikörper ein Polypeptid ist, wendet man im allge-

meinen einen Chelatbildner an, der eine reaktive Gruppe enthält, von der man weiß, daß sie zum Einführen einer Gruppe eines proteinhaltigen Substrats geeignet ist. Als geeignete reaktive Gruppen können die folgenden erwähnt werden: 0

Ch—r NCS Ch-C-N

Ch-SO₀Cl

ίο V^ ² o

Il

Ch — C—Ο—Ν

O 15 _

Ch- N-

'-- ( a,us 20

Ch- NK- C— CB,3r Ch- C- O- C— CH,CH (CH ...)

*· . Ii Ii *■ ->

0 0

25 woi-in Ch der Rest des Chelatbildner ist.

Geeignete Chelatbildner schließen eine große /anzahl von vielzähnigen Chelatbildnern, deren Liganden mit metallischen Radionukliden Komplexe bilden, ein. Zu solchen Mitteln gehören beispielsweise Polyaminocarbonsäuren der For mel

	\ , O	O	y	F "' /
Ch
	\ , S		\ F
Ch	0 Il	• ρ .
	— c —	*■°-\*
Ch	O	/ F L
	\
0

- 12 -
KOC (CH₂) ". /(CK₂-)-CO₂H \ (CH₂)CO-E

N- CH-

'■' Z

— Ct'-

R ·

(D-V ^{/X iCE}2^}-₇ ^C°2^E

worin bedeuten:

X 0 oder cine ganze Zahl (χ = O oder χ = 1 bevorzugt),
y 1 oder 2, (y = 1 bevorzugt) und
ζ eine ganze Zahl von 1 bis 7 (z = 1 oder 7 bevorzugt), und

R Wasserstoff oder eine Gruppe, durch welche der Chelatbildner mit dem Antikörper konjugiert ist oder eine
Gruppe, welche die Bindungskonstante des Chelatbildners für das Radionuklid beeinflußt.

Geeignete R-Gruppen sind insbesondere die Gruppe

worin Λ die Gruppe ist, durch welche die Konjugation erzielt wird. Beispielsweise kann A -N~ sein und wird erhalten, indem man die Gruppe -NHL diazotiert und die -NI Gruppe selbst kann man durch Reduktion einer Nitro (-N0, Gruppe erhalten, die man wiederum erhält, indem man den Phenylkern nitriert. Die Gruppe Ä kann auch

0
-NH-C-CH₂L

bedeuten, die man erhält, indem man die Gruppe -NH₂ in
bekannter Wei:,e acetyliort und worin L. eine austretende Gruppe ist, die während der Konjugation ersetzt wird,
z. B. ein Halogen, wie Chlor, Brom oder Jod (wobei Brom bevorzugt wird) . _s >.

BAD ORIGINAL

• - α β · ·

- 13 -

In anderen Fällen kann R -CH₃ oder -CH₂CgH₄OCH₂CO₂H sein.

Im Falle der Polyaminocarbonsäuren kann man die Konjugation selbst durch die Carboxylsäuregruppe bewirken, z. B. indem man eine Säureanhydridzw.i schenprodukt bildet gemäß der Lehre von Krejcarek und Tucker, Biochemical and Biophysical Research Communications, 77, 581 (1977).

Als Tolyaminocarbonsäuren werden Polyaminoosnigsäuren bevorzugt. Spezifische Poly iminocarbonsäuren, dia hier verwendet werden können, schließen Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) und Derivate davon wie Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), p-Bromoacetamidophenyl(ethylen· dinitrilotetraessigsäure)säure und 1-(p-Aminophenyl)-ethylendiaminotetraessigsäure ein, wobei man die letztere

.■-■ν zur Ermöglichung einer Konjugation in ein Diazoniumsalz ^:' überführt. Von den Chelatbildnern wird DTPA zur Zeit besonders bevorzugt.

Weitere geeignete Chelatbildner sind Polyamino(alkylonphosphor) säuren, insbesondere solche der Konnol:

ο .

KO-P TCK₂) ν

25 ■ « ..; \

N— CK

KO-? (CH₂Jy

OH

30 '

worin x, y, ζ und R die vorher angegebene Bedeutung haben. Vorzugsweise ist χ 0 oder 1, y = 1 und ζ = 1. Spezifische Polyamino(methylenphosphor)säuren (y = 1) schließen Ethylen-

0 It	■	O tt
CK 2 ίΤ" P-OH ~ ι \		-?-o:~- 1
\ ,	/-	OH
	\
c.. .c,.. _N		0 η
*Jy.*		-S-Or. I
	ΟΞ

BAD ORIGINAL

14 -

diaminotetra(mothylenphosphor)säure, Hexamethylendiamintotra (motbylenphosphor) säure und Diethylentriaipinpenta-(methylenphospUor) säiare für die erfindungsgemäße Verwendung ein.

Weitere Chelatbildner sind Polyamine der Formel

K₂K-;ch₂~--ch₂

worin X, Z und R die vorher angegebene Bedeutung haben.

Eine andere Klasse der Chelatbildner hat die Formel

OH

KO

'N-CK—CH₀

HO-P-CH-,

OH

CH

CH, P-OH ι

9^H

(4)

worin R die vorher angegebene Bedeutung hat mit der Ausnahme, daß darm, wenn R keine Gruppe ist, die eine Konjugation ermöCjücht, wenigstens eine der Phenolgruppen eine Gruppe der Formel

OK

ist, worin Λ die zuvor eingegebene Bedeutung hat.

BAD ORIGINAL

• β · ·

- 15 -

Porphyrine stellen eine weitere nützliche Klasse von Chelatbildnern dar. Für die vorliegende Erfindung sind synthetische und natürlich vorkommende Porphyrine, einschließlich Porphyrine der Formel

geeignet, worin R die vorher angegebene Bedeutung hat und R₁ Wasserstoff oder einen Substit.uenten darstellt, der als Teil eines natürlich vorkommenden Porphyrinmoleküls auftritt oder eine Gruppe, die während der Synthese eingeführt ist, bedeutet, z. B. um die Konjugation zu ermöglichen oder um die Bindungskonstante des Porphyrins zu beeinflussen. Bevorzugte Porphyrine sind Tetraphenylporphyrin (R = Phenyl, R₁ = H) oder Tetrapyridylporphyrin (R = 4-Pyridyl> R₁ = H). Ein oder mehrere der Phenyl- oder Pyridylgruppen sind mit -NH₂ oder

substituiert, worin L die zuvor angegebene Bedeutung hat oder durch andere Gruppen, die eine Konjugat.i on mit dem Antikörper ermöglichen. Die Substitution erfolgt normalerweise in para-Stellung der Phenylyruppe oder in der 2 oder 4-Stellung der Pyridyl gruppe.

,BAD ORIGINAL

- 16 -

Weitere Chelatbildner, die erfindungsgemäß verwendet worden können, sind Kronenether und deren Cryptandanaloge der allgemeinen Formeln

und

H E

H K

/ V

N · N

(6)

R R (7)

worin R die vorher angegebene Bedeutung hat. Alternativ wird die Gruppe, die die- Konjugation ermöglicht, direkt in den Kronenether oder die Cryptandstruktur eingeführt, wie dies in der folgenden Formel gezeigt wird,

worin A die vorher angehobene Bedeutung hat.

Derivate von Desferriox^min B können auch als Chelatbildner verwendet v/erden. Diese haben die Formel

BAD ORIGINAL

O OH

π t

R-CH₂-C-N -CH₂-J- - NH-

O O OH

« M I

₂-; ^-C-N

OK 0

I ti

0
II

,*7Γ C-NH-

(8)

worin R die vorher angegebene Bedeutung hat.

Auch Derivate von Enterobakbin sind als Chelatbildner 10 geeignet. Bevorzugt sind solche der Formel

ΟΠ

OU OH

CH₂- O ■■- C -CU- NJI -C—'

: Nil—CH >ν

■ CH

O=C 0

(50

< λ

-CH-

ο -I

C=O

NH

C=O

worin A die vorher angegebene Bedeutung hat.

Weiterhin sind auch carbocyclische Analoge von Enterobakt i.n geeignet. Von dlermn können Verbindungen der Formel

9

- 18 -

.OH ' OH

9 7

J—ϊν

ν Κ— C

OH OH

° K

— C—KIN" CE

CH.

CH,

CH.

CK₂-CH-CK

C=O

OK OH

(10)

worin Λ die vorher angegübeno Bedeutung hat, erwähnt werden.

Weitere als Chelatbildner geeignete carbocyclische Systeme sind solche der Forme 1

BAD ORIGINAL

- 19 -

KO HO

OK OK

C —O—CK.

und die entsprechenden Ani]ide, bei denen Λ die vorher angegebene Bedeutung hat.

Für den Fachmann ist es kleir, daß der für die Enterobaktin- und carbocyclischen Analogen gezeigte Ring weiterhin durch Substituenten, die äie Fähigkeit metallische Radionuklide zu bilden, nicht erheblich beschränken, substituiert sein können und daß man solche Substituenten einführen kann, z. B. umstellend für die Konjugation des Antikörpers einzuführen.

Eine noch weitere Gruppe der Chelatbildner umfaßt Siloxane der Formel

OK OK"

CHR CHR -CKR 0Ξ OH

-Si— 0--Si-O-Si ίΟΚ,τ-^

CH₃ (CH₂) ₃ CTl₃

(12)

BAD ORIGINAL

worin R die vorher angegebene Bedeutung hat mit der Ausnahme, daß dann, wenn R lceino. Gruppe ist, die die Konjugation ermöglicht, wenigstens eine Katecholgruppe eine Gruppe der Formel

worin A die vorher angegebene Bedeutung hat, ist. 10

Für den Fachmann ist offensichtlich, daß die vorhergehende Aufzählung von Chelatb.i Idnern nicht erschöpfend ist, sondern nur die geeigneten Chelatbildner beschreiben soll.

Die Direktmarkicrung dei Antikörper mit metallischen Radio* nuklidon kann in bekanni or Weise durchgeführt werden, indem man ein metallisches Ion an eine Stelle, des Antikörpers einführt. In einigen Fällen kann man metallische Radionuklide inkorporieren, indem man den Antikörper, gewöhnlich in Lösung, dem Radionuklid in dessen geeigneten Oxidaiionszustand aussetzt. Eine derzeit bevorzugte Methode sieht, beispielsweise eine direkte Metallisierung des Antikörpers mit : Ru vor, indem man den Antikörper mit einem ger-iyneten Rutheniumsalz, z. B. Rutheniuinlirichlorid, in einer Pufferlösung, in Berührung bringt. Geeignete Puffermit^el\sind beispielsweise Kaliumacetat, Natriumbicarborii-.t und Ttfihydroxyethylamin (Tris) .

Ein weiteres geeignetes Verfahren besteht in der Direktmetall LE.iorung des Antikörpers mit Chrom. Chromradionuklide kann man einführen, indem man ein Chromsalz des Radionuklids, z. B. Natrium- oder Kaliumchromat, mit dem An.tikörper in einer Lösung vermischt.

BAD ORIG(NAL

- 21 -

In weiteren Fällen kann mail den Antikörper zunächst chemisch modifizieren, um ihn für das Radionuklid empfänglich zu machen und ihn ^dann mit diesem umsetzen. So kann man beispielsweise die Sulfidgruppen im Antikörper reduzieren und anschließend eine -S-M-oder eine -S-M-S-Gruppe, worin M das Radionuklid ist, bilden. Die Sulfidgruppen kann man beispielsweise; unl or Verwendung von Dithiothroi toi reduzieren unter Ausbildung einer Thiolgruppe, die dann mit geeigneten Metallionen, z. B. mit solchen von Quecksilber, Silber, Zink, Blei oder Cadmium, in ihre Oxid- oder Salzform reagiert.

Erfindungsgemäß verwendbare Radionuklide sind solche, die mit vielzahnigen CheJatbi.'ldneru stabile Komplexe bilden oder die unter geeigneten Bedingungen sich direkt mit dem Antikörper vereinigen. Die Radionuklide werden so ausgewählt, daß sie eine Halbwertszeit und andere Strahlungscharakteristika aufweisen, daß man sie sicher in den menschlichen Körper einführen kann und daß man sie auch sicher verwerfen kann. Eine große Anzahl von Radionukliden ist für die Anwendung beim Menschen untersucht worden. Diese Radionuklide kann man in folgende Gruppen einteilen:

Die Porphyrin- (!formel 5), Kronenether- (Formel 6) und Cryptand- (Formel 7) Chelatbildner sind besondere geeignet, um Radionuklide mit einain 12-Ox:i rlations/.us-i-and zu binden.

1 Q'im ^li 7 UV "I f) rr Γι 7

Beispielsweise bilden ^IJjmPt, tfi, Co, ' Ag, Cu

52
und Mn stabile Komplexe in ihrem +2-0xidationsirustand.

30 ■

Die Chelatbildner der Formeln 1 bis 5 und 9 bis 12 bilden stabile Komplexe mit Radionukliden im +3-Oxidationszustnnd. Radionuklide, die stabile Komplexe im +3-Ox:ida-

.BADORIGiNAL

dationszustand bilden, sxnd Fe, In, In, Tc, ⁶⁸Ga, ⁵⁷Ga, ¹⁶⁹Yb, ⁵⁷Co, ¹⁶⁷Tm, ¹⁴⁶Gd, ¹⁵⁷Dy, ^95mNb, ¹⁰³Ru, ⁹⁷Ru, ⁹⁹Rh, ^101mRh und ²⁰¹Tl. .Chelatbildner mit Katecholgruppen der Formeln 9. bis 12 sind besonders zusammen mit

Radionukliden, die in vivo sehr mobil sind, insbesondere

52

mit Radionukliden des Eisens, wie Fe, geeignet.

Radionuklide, die man direkt an einen Antikörper binden

? fi Ί 197 1 0 ζ ? Ω "3 Q 7 kann, sind die folgenden: Hg, Hg, Ag, Pb, Ru,

10 ¹⁰³Ru, ⁹⁹Rh, ^101mRh und ⁴⁸Cr.

Die am meisten geeigneten Radionuklide sind if-Emittenten mit einer Energie zwischen 100 und 400 keV und Halbwertszeiten im Bereich von etwa 5 h bis 5 Tagen.

Aus Gründen, die bisher nicht genau bekannt sind, widerstehen gewisse individuelle monoklonale Antikörper zu Tumorantigenen einer direkten .Metallisierung. Um durch diese Route Radioisotope zu inkorporieren, ist"⁵ es erforderlich, sorgfältig spezifische Antikörper auszuwählen. Deshalb wird derzeit bevorzugt, ein Radionuklid an einen Antikörper zu binden, indam man die flexiblere Arbeitsweise wählt, bei der man zuerst einen Chelatbildner· zu dem Antikörper konjugiert und dann einen Komplex mit dem Radionuklid bildet.

Hierbei bevorzugt man besonders die Verwendung von In (t 1/2 - 2,8 Tage) als 1adionuklid zusammen mit DTPA als Chelatbildner.

Das erfindungsgemäße Verfahren,kann man allgemein zum Nachweis von Tumoren unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern zu den tumorassoziierten Antigenen anwenden,. Außer CEA kann man beispielsweise auch Melanoma-assoziierte Antigene, (^--Fötoprolcin, Ferritin, Humanchoriogonadotropin, Zinkglycinatmarl·.er und Prostaticsäurephosphatase (PAP) als Immunogens zuin Stimulieren der Produktion der

BAD ORIGINAL

• ·

— 2 i —

vorerwähnten monoklonalen Antikörper einwenden. Bei der praktischen Anwendung wird der markierte Antikörper in einer geeigneten parente.valon Lösung dem Patienten injiziert. Nachdem eine genügende Zeil: abgelaufen ist, wird der Patient einer Photoscannierujig zum Nachweis der Stellen einer lokalisierten Strahlung unterworfen, die einen Tumor und/oder dessen Metastasen anzeigen.

Die nachfolgenden Beispiele wurden mit. monoklonalen

1 '■> 5 111

Antikörpern zu CEA, markier!: mit " J und In durchgeführt und zeigen den Vorteil der Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die mit Chelat-gebundenan Radio<nukliden markiert sind zum Nachweis von Tumoren gemäß der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu Verfahren, 'bei denen man Jod-markierte Antikörper verwendet.

1. Herstellung von radiomarkiectem Anbi-CEA

Monoklonales Anti-CEA, erhältlich von I-Iybritech, Ine,

1 25
La Jolla, CA, wurde mit . J' unter Anwendung der Methode von Bolton und Hunter, Biochem. J., 1_33, 529-39 (1973) markiert. Das Produkt wurde durch eine Sephadex G-25-Säule fließen gelassen und das fertige Material enthielt weniger als 0,5 % an freiem Jodid. Dia Markierung des radiomarkierten monoklonalen Antikörpers betrug mehr als 80 % mit Pferde-Antimam:-Antikörper _r gebunden an Sepharose und mehr als 75 % mit CEA, gebunden an Scpharoso.

Das gleiche monoklonale Anti-CEA wurde mit In unter Verwendung von konjugiertem DTPA, als Chelatbildner nach dem Verfahren von Krejcarek und Tucker, Biochemical and Biophysical Research Communications, 77. 581 (1977) markiert.

.BAD ORIGINAL

Das Reaktionsprodukt wurde gereinigt, indem man es durch eine Sephadex G-75-Säule hindurchlaufen ließ. Die Antigen-

bindung war vergleichbar zu der, die von den ^J J-markierten Antikörper gezeigt wurde. Das Markierungsvarfahren beeinflußte nicht die Affinitätskonstante Ka für den Antikörper in bezug auf den nichtchelierten Antikörper, wie dies durch Titrieren mit CEA festgestellt wurde.

Die in vitro-Stabilitäten der markierten Anti-CEA--Antikörper wurde bestimmt, indem man einen Teil des Materials in einer parenteralen Lösung, enthaltend sterile normale Kochsalzlösung, U.S.P., bei 37°C während 72 h inkubierte und dann auf die Gegenwart von freiem Radiumnuklid chromatographisch untersuchte. Die Antikörperlösungen wurden auf Bakcr-Aluminiumoxid 1 B-Streifen punktförmig aufgebracht und in einer 50 %igen wäßrigen Acetonlö.-sung entwickelt. Das proteingebundene Radionuklid verbleibt am Ursprungsort, während freies Radionuklid wandert. IS[ach der Inkubatioiisperiode zeigte das radioj'odierte Material weniger als 3 % Aktivität, die als freies Jodid vorlag. Durch Lagerung bei 4⁰C wurde diese um 50 % vermindert. Unter den gleichen Beding
vergleichbare Stabilität.

111 Unter den gleichen Bedingungen zeigte In-Anti-CEA eine

2. Verteilungsstudien bei nackten Mäusen

Gewebeverteilungsstudien bei radiomarkierten monoklonalen Mäuse-Anti-CEA wurden an mit 0,5 bis 1,0 g Humancolontumoron versehenen nackten Mäusen durchgeführt. Die Mäuse hatten ein Gewicht zwischen 17 und 28 g (Mittel etwa 23 g). Die Tumoren waren durch subkutane Injektion von Minze ent-· halten CEA-bildenden Humanfcolonadenocarzinomazellen

BAD ORIGINAL

leitet worden. Die Verteilungsstudien wurden 3 Wochen später durchgeführt. Es wurden zwei Versuche durchgeführt. Beim ersten Versuch wurden 19 Tiere in vier Gruppen von 4 bits 6 eingeteilt und intravenös (IV) mit 0,1 ml einer sterilen normalen Kochsalzlösung U.S.P., enthaltend 0,5

1 25
Mikrokurie an J Anti-CEA-Antikörper (etwa 0,3 Mikrograiran Antikörper) ■injiziert und als Kontrolle wurde trägerfreies ° Ga*-Citrä\t v-erwond<rt, einem bekannten nichtspezifischen Humanoplantumornachweisinittels. Die Injektionen wurden ohne Anästhesie unter Verwenduag einer 100 Mikroliter Hamilton-Spritze aus- Genauigkeitsgründen durchgeführt. Tiere, bei denen die Dosis teilweise in den Schwanz infiltrierte, wurden von den Untersuchungen ausgeschlossen. Im Anschluß an die Injektion wurden die "Mäuse in sterile metabolische Käfige mit erhöhtem Drahtboden, .so daß sich Urin und Feces darunter ansammeln konnte, gehalten. Unterhalb des Bodens wurde sterile 4x4 Gaze deract gepackt, daß diese nicht von den Tieren angeknabbert werden konnte. Die Mäuse wurden in einen reinen Rcium bei 4,4°C (4O⁰F) gehalten und erhielten sterile Nahrung und Wasser ad libitum und wurden dann in Gruppen 4, 24, 48 bzw. 72 h nach der Injektion des Tracers tjetötet.

Die Mäuse wurden mit Ether anästhesiert und Blutproben wurden durch direkte Herzpunktur entnommen. Dann wurden die Mäuse durch Zervikaldislokation getötet. Während der nachfolgenden Sezierung wurden der Tumor, die Leber, die Nieren, Muskel, Herz, Lungen, Femur und Milz herausgenommen, zweimal mit Wasser, einmal mit 10 %igem Forinalin gespült, trocken getupft und dann auf einex* analytischen Waage feucht gewogen. Der Mac;enc:ingan<j und die Eingeweide wurden gleichfalls entfernt und gev.'O'jen. Blut, Muokol und

BAD ORIGINAL

-■26· -

Knochen wurden bei der Berechnung der Gesamtmenge mit 7 %, 40 % bzw. 10 % des Gesamtkörpergewichts angenommen. Die Messung der Radioaktivität wurde mit einem Auto-Gamma-Qucllen-Counter durchgeführt, dessen Fenster über dem

125 93 27-35 keV-Photopeak von J und dem keV-Photopeak von

Ga eingestellt waren. Der Zähler war so prog.cammiert, daß er bei 10 min oder bei einer Million Zahlungen nicht ansprach, um dadurch die statistische Signifikanz für solche Proben mit niedrigstem Aktivitätsniveau zu er-. zielen. Korrektionen für Hintergarundsaktivität und den reziproken Beitrag der iostopischen Aktivität zwischen den Fenstereinstellungen wurden durchgeführt unter Verwendung von Quellen, wobei man ähnliche Gleichungen zu lösen hatte. Die Aktivität in den Proben wurde dann mit

\5 Standards des injizierten Materials verglichen und die Ergebnisse werden ausgedrückt als Prozent der injizierten Dosis pro Gramm und als Prozent der injizierten Dosis pro Organ. Die Tumor zu Gewebe-Verhältnisse wurden aus den Frozentangaben von Dosis/g berechnet. Die Aktivitat im Darm, im Urin und in der Feces wurde als Prozentsatz der gesamtinjizierten Dosis berechnet.

Bei der zweite η Untersuchung wurden 27 nackte Mäuse mit den gleichen Tumoren aus dem gleichen Humancolon cane er in fünf Gruppen von 7 bis 8 Tieren eingeteilt. Eine Gruppe diente zur Kontrolle und erhielt gleichzeitig IV 1. Mikro-

125
kurie. J Human so rumalbum.in (0,0f mg HSA) und 3 Mikrokurie

111
trägorfroies In-Citrat (0,01 mg Citrat) injiziert und wurden 48 h nccn der Injektion getötet. Bei den verbleibender vier Gruppen erhielten die Tiere gleichzeitig Injektionen von Mikrokuries In-markiertem Anti-CEA (1,5 Mikrogramm Ant ikörper) und 5 Mikrokuries trägerfreiem

Ga-Citrat. Die Gruppen wurden 4, 24, 48 bzw. 72 h danach getötet.

BAD ORIGINAL

— 27 —

Die Sezierung des Gewebes, die Probezubereitung für die Radioassay, die'Zähltechnik und die Berechnung wurde

111

wie oben durchgeführt. Im Falle von In wurde das Spektrometer so eingestellt, daß es das 24 7 keV Photopeak unter Verwendung eines 4 0 keV Fensters (210 - 25 0 keV) zählte, während Ga mit einem 30 keV-Fenster, das das 93 kcV-Photopeak überlappte, gezählt wurde. Diese Einstellungen ergaben in weniger als 10 % reziproka Beiträge der Radioaktivität.

Wie in Fig. 1 gezeigt wird, stiegen die Konzentrationen

111
an In-Anti-CEA unter Lokalisierung des Tumors während der Zeitdauer des Experiments ständig an. 23 % der injizierten Dosis war nach 72 h angesammelt, und aus den Ergebnissen kann man entnehmen, daß dieses Niveau sogar noch höher wäre, wenn noch spätere Proben genommen worden waren, Das Niveau im Blut nahm dagegen während dieses Zeitraumes ab. Die Leber zeigte eine schnelle Aufnahme nach 4 h, worauf sich dann eine Zeit mit wenig Veränderung .anschloß und dann eine Erhöhung bis 72 h. Die anderen Gewe he zeigten wenig Veränderung während der Versuchsdauer.

Das Niveau an Ga im Tumor blieb im Laufe des Versuches

111 ziemlich konstant und lag bei etwa 1/4 des In-Anti-CEA bei 72 h. Das Niveau von Ga im Blui fiel ständig ab, während die Leberkonzentrationen ein Muster zeigten, das

111
ziemlich ähnlich den des · In-markiorten Antikörpers war.

Die Muskelkonz-entration an Ga fiel bis 4 8 h ab und ver-. lief dann gleichmäßig, 'während die Knochenkonzentration während der Zeit im wesentlichen gleich blieb.

Die Menge an Jodid in de'm Tumor zeigte einen Peak nach 4 h

BAD ORIGINAL

und wax- anfange etwas größer' als die Menge an Indium und nahm dann unregelmäßig v/ährend des weiteren Versuchs

111

ab und betrug nur 1/10 der von In bei 7 2 h. Zu dieser Zeit trat zweimal soviel Ga in dem Tumor auf als J.

125

Die Zählrate fir J ira gesamten Gewebe nahm sehr schnell vom Maximum bei. 4 h ab und erreichte in einigen Fällen Hintergrundniv.üaus bei 43 h.

Die Exhretions'laten (Fig. 2) zeigten einen, ständigen An-

111

stieg in In des Urins zwischen-24 und 72 h und erreichton ein Maximum von 14 % der injizierten Dosis. Die

111

Feceskonzentration an In blieb bei 24 und 48 h ziemlich konstant und erhöhte sich nach 72 h auf \'l %, während die Menge in den Eingaweiden verhältnismäßig konstant wäh-'rend dor gesamten Periode blieb und niemals 5 '■'■> der Dosis überstieg.

Das Ga.-Exkretionsmu:;tcr war ähnlich dem des In, zeigte aber mohr Tracer in den Eingeweiden und dn den Feces, als

111 '

2 0 man bei In feststellte und weniger im Urin.

125

Nahezu $0 % der ^JJ Radioaktivität wurde währcind der ersten 24 h im Urin eliminiert und 75 % nach 48 h.

ι 25
Weitere 5 % an · J gingen in, der Feces verloren. Somit sind nach 72 h etwa 80 % des ursprünglichen initiierten

1 25

J von dem Tier ausgeschieden worden. Die Chromatographie

1 2 '5
von J im Urin zeigte, daß das meiste davon in Form freien Jodids vorlag, wobei eine zweite Spezie ; wahrschein-

1 2 '3
lieh fireics J, das m.i.! irgendeiner! anderen Verbindung

30 als einem Protein in komplexer Form gebunden war.

111

Fig. 3 zeigt die Daten für ■^lIn~markiertes Anti-CEÄ nach

111 125

48 h uiid vergleicht diese mJ t Indiumeitrat und ' IHSA.

BAD ORJGINAL

111
Das In-Citrat wurde zur Kontrolle für alles Indium verwendet, das aus dem Antikörper abgetrennt worden sein

1 25
könnte, während das IHSZx als nichtspezifische Protein-

111
kontrolle verwendet wurde. Das In-Änti-CEÄ zeigte ein viel differenziertertes ,Verteilungsmuster gegenüber dem

111

In-Citrat und konzentrierte; sich im Tumor wirksamer um

den !Faktor 10. Die Aufnahme· dor beiden anderen Tracer dxxrch die anderen Gewebe waren ebenfalls unterschiedlich. Die Tumorkonz-entration . an ¹¹IIISA betrug 20 % der von ¹¹¹In-Anti-CEA, war aber immer noch um 50 ¥> größer als die von

¹²⁵J-Anti-CEA. Die ¹²⁵I1ISA-Verteilung in dem Nichttumorgcwebe ist ebenfalls sehr unterschiedlich von der des In-

1 25 Anti-CEA-Produktes. Es ist besonders bedeutsam, daß IHSA, das lange als ein stabiles jodiertes Protein angesehen wurde, eine nahezu 60 %ige Ausscheidung (43 % davon im Urin) nach 48 h zeigte, waf.; bemerkenswert mit der obigen

1 25 Feststellung übereinstimmt, daß · j-Anti-CE/x gleichfalls im Urin gefunden wurde. Die Urinfraktion stellt wahrscheinlich freies Jpdid dar.

111 Die 'iumor/Gewebe-Verhältnisse (Fig. 4) zeigen In-Anti-CEA als überlegen gegenüber Ga hinsichtlich aller Gewebe mit Ausnahme von Blut und liegeii in diesem Falle etwa gleich mit g_a- Die" J-Anti-CEA-Vcrhältnisse sind zwar

1 "T *l C\ 1

offensichtlich gegenüber solchen, die: von In und Ga bei einigen Geweben gezeigt werden, vorzuziehen, führen aber dennoch auf eine falsche Fährte, weil sie von niedri-

125 gen J-Nivcaus im normalen kalisation im Tumor stammen.

125
gen J-Nivcaus im normalen Gewebe einstelle von einer Lo-

eindeutig als Tumorlokalisjerungsmiti el ungeeignet. Die

1 25 Aufgrund der vorhergehenden Versuche ist J-Anti-CEA

JSAp ORIGINAL

schnelle und extensive Dehalogenierung erniedrigt die Tumortracerkon^entration und erhöht den Bluthintergrund und verbietet daher dessen Verwendung zum Kreb.snachweis ohne komplizierte Subtraktionstechniken. Tatsächlich enthielt der Krebs nach 72 h die zweifache Menge des nichtspezifischen . Ga auf einer pro Gramm-Basis im Vergleich zu ""³J. Weiterhin' sind die Tumor/Blut-Verhält-

f ""7

nisse bei Ga besser als bei dem jodierten Antikörper.

Berück.sichti gl man, daß Ga als ungeeignet angesehen

wird, Adenokai zinoma des Colon aufzuzeigen, so werden

die Schwierigkeiten, die. von Mach et al. in In, Eng. J.

Med. , 303, 5-10 (1980) berichtet -werden, leiche verständ-

125

lieh. Diese Daten, bei denen J verwendet wurde, demonstrieren eindeutig, daß ohne eine Subtraktionstechnik

131 131

bei der Verwendung von J große Dosen von J-markiertem Material verabreicht werden müssen, um die erforderlichen Tumorkonzentrationen für einen wirksamen Nachweis zu liefern. Dries würde bedeuten, daß ein Patient eine hohe Strahlungsdosis erhält wegen der physikalischen Halb-

wertszeit von 8 Tagen und der 608 keV Beta-Komponente von 131-

Im Gegenr-atz (Tazu ermöglicht der große Prozentsatz der

111
injizierten D< sis an In-Anti-CEA, die vom Ttiinor aufgenommen w:i.rd,urd die günstigeren physikalischen Eigenschaften von · In die Injektion von niedrigeren Mengen an Radiopharrnaxeul-i ka, während di.e Kfachweir.bajrkeit verbessert und die Strahlung: dosis, welcher dor Patient ausgesetzt ist, minimalisiert wird.

111 Die Tumor-zu-Hintergrunc-Verbältnisse, die von In Anti-CEA gebildet werden, liegen in einem Bereich, der ausreicht,

BAD ORfG/NAL

- 31 -

. um den Nachweis zu ermöglichen, und zwar wegen der großen Menge der Radionuklidlokalisätion im Tumor. Weiterhin kann man den Daten entnehmen, daß der Tumor Radiomarkierungen aufgenommen hat, die einstmals in anderen Geweben inkorporieriwaren oder daran hafteten.

Einzelne Mäuse wurden 4, 24, 48 und 72 h nach der Injek-

111
tion von In-markier-bem Änti-CEA unter Verwendung einer Phogam H P Anger~gamma~Kamera photoradiologisch abgetastet. Nach 48 h war der^ Tumor gut definiert, ohne daß man eine Subtraktionstechnik anwenden mußte. Nach 72 h war die Tumordefinition sogar noch verstärkt.

Die in vivo-Stabilität und daher auch die E.i'gnung für die 'Verwendung zum Tumornachweis durch einen direktmarkierten monoklonalen Antikörper wird in den folgenden Versuchen gezeigt, bei denen ein monoklonales Antimelanoma, markiert

1 03
mit Ru im Vergleich zu dem gleichen Antikörper,markiert

ι 25 mit J, gezeigt wird.

1 03
1, Herstellung von Ru-markiertem Anti-Melanoma

1 03
Eine wäßrige Lösung aus 220 μΐ ^l RuCl., (erhältlich von New England Nuclear, Inc.) wurde zu 100 μΐ einer gesättigten Kaliumacetatlösung gegeben. Der pH wurde mit 70 μΐ 10 M NaOH auf 5,3 eingestellt. Zu dieser Losung des Radionuklids wurdon 500 μΐ einer 0,5 μg/μl-Lösung von Mäuse-Anti-Melanoma-Antikörper gegeben, und die Mischung wurde 1 h bei Raumtemperatür inkubiert. Der pH wurde durch Zugabe von 20 μ.1 μθ M NaOH auf 7,2 eingestellt und die Zubereitung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das ungebundene Material wurde, von dem an den Antikörper gebundenen Metall abgetrennt, indem man das Rcaktionsgemisch

ORIGfNAL

32 -

über eine Sephadex-G-50-öäule laufen ließ und mit Phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einem pH von 7,2 eluierte. Proteinhaltigo Fraktionen wurden gesammelt und zusammengegeben und für in vivo-Untersuchungen an Maus cm verwendet.

.2«. Ve.rt.eilungs Untersuchungen bei normalen Mäusen

Gewebeverteilungsuntersuchungen v/urden an normalen BALB-C-

1 03

Mäusen unter Verwendung von Ru-markierten Anti-Melanoma nach dem vorhergehenden Verfahren hergestellt worden war,

1 25

und von J-markierten Anti-Melanoma, das in gleicher Weise wie für die Markierung von Anti-CEA hergestellt worden war, durchgeführt. Die Mäuse wurden in zwei Gruppen aufge-

12¹S 103

teilt, denen intravenös jeweils ~J-markierter bzw. Rumarkierter Antikörper injiziert wurde. Dann wurden die Mäuse nach 24, 48, 72 bzw. 96 h getötet, seziert und die Organradioaktivität wie bei den vorhergehenden Untersuchungen mit monoklonalem Anti-CEA bestimmt. Die Gewebeverteilung

125 103

von J und Ru wird in der nachfolgenden Tabelle gezeigt.

ORIGIWAL

125 103 Gewebeverteilung von J und Ru nach der Injizierung von markiertem Melanoma-Anti-

körper zu verschiedenen Zeiten bei Normal-BALB-C Mäusen*

4 h

24 h

48 h

72 h

	7. T	Dosis / 0 r κ a n •-125 Ru-103	3 60	28,3 3,32	8,1 .63
BlUt⁺ . ·χ . fa . d.	4^J t:	,17	.,58 736	4 6	,33 467
Leber . " χ + s . el.	] ■1 ■ χ	2,6 .87	3,3 ,24	3 ;	,11 2 84
MiXz χ +s.d.	1 »1	,27 181	17,96 12,1	7	629 119
Niere * +s . <! .	1 O;	,94 135	0,	,61 .02
Herz ' . χ + s . -J .	^s? 0:	792 I¹Sl	7 1	34 6 027
Muskell" · 3c +s.d.	15,2 2,5 6	ö, 0,	,01 4 64
Femur 3c +s.d.	o,	. 2 o,	,72 64 6
Lunge "χ +s.d.	■ 2 C;	7	3,88 2 2,2
Eingewei- X de +s.d.	2 ή	■ +
Tierga- "χ wicht Bereich (g)

% Dcsis	/Or»an
• J-12 5	Ru-103
11,7 10,8	12,5 1,74
5,22 O₁ 8 6 4	4 2,9 4 ,84
0,520 0,053	2,6 4 0. 4 9 8
0,784 0,091	5,15 0,352
δ,/,0 3	0,32 7 0, 0 4 9
12,. 5 2,34	8,6 4 1,55
0,189 ,'0,04 6 '	0.253 0,O'i 5
1,13 0,.271	0/017 0,133
5,61 3,16	6.11 0,817
16.3 +	1,63
14,6 -	19,8

% Dosis	/CTrßan
-J-125	Ru-103
13,0 6,66 ■	6,97 . 0,550
5,27 0,904	4 7,2 6,4 2
(7,340 0,04 9	1,95 0,24 8
0*6 41 0,073	4,21 O₁ 2 8 4
0,340. fl.C36	ff, 301 0>017
11,6 2,48	3,17 1,88
0,163 0,035	(7,241 0,041
0,S7S 0,131	0,612 0,079
6.Oi 0, 704	5,51 0, 4 6 0
14 >⁸ ±	1,79
11,6 -	17,1

η =

10

0,263 0,236

Q. 0 6 0 0,0 51

9.56 6,98

l', 00 0,906

0,150 0,252

Oj 019 ö,030

1,17 0,5 85

0,281 0/082

5,22 4,70

0,501 0,523

14,95 + 1,80

13.1 - 18,2 10

9

7. Dosis/ Or r 0 η	Ru-103	χ Dosis/orp.jin	Hu-103
J-125	5,54 0,6 78	J-125	3,30 0,24 4
11,8 6,88	41,2 4 ,14	13,2 0,9 29	39,3 4,34
4,54 1,03	1,94 0.3.11	3,!! 6 0,395	1,98 0, 2 6 3
0, 2 S 4 0,025	3.68 0,203	0,252 0,022	3,21 0,188
0,542 0,063	0,460 0,034

0,	220	0,	20 7	I
0;	037.	0)	015	U)
				OJ
8	,05.	6	,66
G,	641	O₁	A 82	I

0,106 (7,200-0,014 O₁

0,855 0,4 0,159 ö,O75

3,9 4 4,01 O₁12 9 /7.2 9

15.95 + .1,21 14,0 - 17,5 0

Die Daten geben das Mittel (X) von η Tieren +_ Standardabweichung (s. d.) an. Blut wurde mit 7 % Muskel mit 40 % des Tiergewichtes angenommen.

ItItK » » I »

CO CD -C--

- 3Ί

125 Die Daten in der Tabelle zeigen, daß J-markiertes

Anti-Melanoma rasch dehalogenierte, ebenso wie dies bei mit J-markiertem Anti-CEA eintrat, während Rumarkiertes Anti-Melanoma stabil war. Diese Feststellungen werden durch die Tatsache bestätigt, daß das Niveau an

1 25

J im Blut 4 h nach der Injektion sehr hoch ist und

zu niedrigen aber konstanten Niveaus nach 24 bis 96 h

abfällt. Im Gegensatz dazu wird das Niveau von Ru verhältnismäßig schnell aus dem Blut freigegeben und konzen-

1.0 triert sich in der Leber, wie man bei einem nichttumorinfizierten Wirt annehmen würde. Die Niveaus bei Milz und Niere waren bei den Mäusen, denen Ru-markiertes Anti-Melanoma injiziert worden war, in Überoinstimmung mit der in vivo-Stabilität.

Es ist bekannt, dciß CEA und einige andere tumorassozxierte Antigene durch den Tumor abgeschieden oder ausgebreitet werden. In solchen Fällen kann das Auftreten von Hintergrundsstrahlung, die dadurch verursacht wird, daß das im Blut oder in andere)ι Geweben zirkulierende Antigen sich mit markiertem Antikörper verbindet, reduziert werden, indem man zu Anfang unmarkierten Antikörper verabreicht, der sich mit dein zirkulierenden Antigen vereinigt. Dadurch könnte auch die hohe Leberaufnahme an markiertem AntikÖ3:per vermindert werden.. Nach einer ausreichenden Zeit gibt man dann markierten Antikörper zu und dan Subjekt wird radiophoto-untersucht, um die Stelle der lokalisierten Strahlung zu bestimmen.

Dio vorhergehende Bcschrc ibung hat die Verwendung eines ein-· zigon monoklonalen Antikörpers, der mit einem Radionuklid markiert ist, betont, aber es liegt im Bereich der Erfindung, auch zwei oder sogar mehr markierte monoklonale Antikörper zu verwenden, um unterschiedliche Antigenbestimmungen durchzuführen. Die verschiedenen Antikörper werden

BAD ORIGINAL

- 35 -

so ausgesucht, daß sie die Bindung des Antigens an einen anderen Antikörper nicht stören. Durch die Verwendung von mehreren nichtstörenden markierten Antikörpern kann die Nachweisbarkeit des Tumors noch vergrößert werden, weil das Antigen eine höhere Kapazität für den markierten Antikörper hat. Die Verwendung von mehreren Antikörpern ist besonders geeignet, um solche Tumore zu zeigen, deren assoziiertes Antigen in einer niedrigen Konzentration vorliegt.

Claims

PAT E N TAN \ VAX.'!¹ K

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) ■ Dl PL.-I NG. W. EITLE . D R. KER. N AT. K.1IOFFMANN · Dl PL-1 NG. W. LEIIN

DIPL.-ING. K. FOCHSLH . DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSF. -1 . D-8000 MÖNCHEN 81 · TELEFON (089) Pl IOC/ . TELEX 05-29619 (PATHE)

37 715 ο/Sm.

liybritech Incorporated San Diego / USA

und

The Regents of the university of California Berkeley, California / USA

Monoklonale Antikörper zu tuinorassoziiertem Antigen, Zusammensetzungen, welche diese enthalten und deren Anwendung zum Tumor-

nachweis

Paten-i-an.M ρ rüc he

. Monoklonaler Antikörper zu einem te'norassoziierten Antigen, an dem ein metallisches Radionuklid direkt oder mittels eines Chelatbildner^;, der mit dem Antikörper konjugiert ist, gebunden ist.
5
2. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Chelatbildner ausgewählt ist aus Polyaminocarbonsäuron, Polyamino(alkylenphosphor)säuren, Polyamiden, Porphyrinen, Kronenethern, Cry ρ ta η den, Dos J! c-rv i o>:fmn'n l'· und Deri.vaton

BAD ORIGINAL

• β · ·

davon und Enterobaktinen und carbocyclischen Analogen davon.
3. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß der Chelatbildner eine PoIyaminocarbonsäüre der Formel

KO₂C iCK₂)_y

KO₂C-(CH₂ )_ν

/(CK₂^CO₂H

N- CH JCE₂-

₂-T

N-CK (CH,

worin χ 0 oder eine ganze Zahl, y 1 oder 2, ζ eine ganze Zahl von 1 bis 7 und R Wasserstoff oder eine Gruppe, durch welche der Chelatbildner mit dem Antikörper konjugiert ist oder eine Gruppe, welche die Bindungskonstante des Chelatbildners für das Radionüklid beeinflußt, bedeutet .

■
4. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 2, dadurch ge

kennzeichnet ,

phosphor)säure die Formel ο

HO-F

daß die .Polyamino (alkylen^-

0Ξ

(CH₂T^₇-P-OH

OH · 0Ξ

hat, worin X O oder eine ganze Zahl, y 1 oder 2, ζ eine ganze Zahl von 1 bis 7 und R Wasserstoff oder eine Gruppe , welche die Bindungskonstante des Chelatbildners für das Radionüklid beeinflußt, bedeutet.

BAD ORIGINAL

ο _
5. Monoklonaler Antikörper gemäß Ansprüchen 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet , daß R ausgewählt ist aus Wasserstoff, Methyl, -GH₂C₆H₄OCH₂CO₂H und -CgH₄-A, worin A ein Diazoniumsalz oder ein Vorläufer davon oder

5 0

Il

-NH-C-CH₃L, worin L eine während der Konjugation ausgestoßene Gruppe ist, bedeutet.
6. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 5, dadurch g e kennzeichnet, daß X=O und R

ν \ Q

-C₆H₄-NC-CH₂Br

ist. 15
7. Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß der Chelatbildner eine PoIyaminocarbonsäure und X 1 und R

Il

20 -C₆H₄-NH-C-CH₂Br

ist.
8. Monoklonaler Antikörper gnmäß Anspruch 2, dadurch g e kennzeichnet, daß der Chelatbildner ausgewählt

ist aus Ethylendlaminototiraesüigsäuro, p-Bromoacetylamidodiphenyl(ethylendinitrilotetraossigsäure), 1 -(p-Aminophenyl)-ethylendiaminotetraess.Lgsäure und Diethylentriaminopentaessigsäure.
30
9. Monoklonaler Antikörper gemäß Ansprüchen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet , daß das Radionuklid ein if-Strahler mit einer Halbwertszeit von 5 h bis 5 Tagen Act, dessen Jf-Kniis.sioncn eine JiDor-

35 gic von 100 bis 400 KeV habnn.

BAD ORIGINAL
10. Monoklonaler Antikörper gemäß Ansprüchen 1, 2, 3, 4, 5 , 6 , 7, 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Radionuklid ausgewählt ist aus ¹⁹⁵¹¹¹Pt, ⁵⁷Ni, ⁵⁷CO, ¹⁰⁵Ag, ⁶⁷Cu, ⁵²Mn, ⁵²Fe, ^l13min,

^99mTc, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ¹⁶⁹Yb, ¹⁶⁶Tm, ¹⁶⁷Tm, ¹⁴⁶Gd, ¹⁵⁷Dy, ^95mNb, ¹⁰³Ru, ⁹⁷Ru, ⁹⁹RU, ^101mRh und ²⁰¹Tl, ²⁰³Hg, ¹¹⁷Hg, ¹⁰⁵Ag, ²⁰³Pb, ⁹⁹Rh und ⁴ⁱbr.
11. Monoklonaler Antikörper gemäß Ansprüchen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 1, 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das tumorassoziierte Antigen ein karzinoembryonischen Antigen, eine &-Fötoprotein, Ferritin, Humanchoriogonadotripin, Zinkglycinatmarker, Prostaticsäurephosphatase oder Melanoma-assoziiertes Antigen ist. -
12. Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet , daß sie in einer Lösung für die parenterale Verabreichung einen monoklonalen Antikörper zu einem tumorassoziierten Antigen gemäß den Ansprüchen 1, 2, 3, 4,· 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder 11 enthält.
13. Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, dadurcn gekennzeichnet , daß sie eine Mischung aus 2 oder mehr der monoklonalen Antikörper enthält.
14. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gemäss den Ansprüchen 1 bis 13 zum Nachweis der Lokalisation eines

Tumors.

körper konjugiert ist, gebunden enthält und
b) daß wan die Person einem Photoscanningverfabren unterwirft zur IVir.tsteJ lung der- Stelle, an welcher der Antikörper in dein Menschen lokalisiert ist, was durch die Emission der Strahlung des Radionuklide angezeigt wird.
15. Verwendung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß der monoklonale Antikörper
gemäß Ansprüchen'1,"2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10_f 11, oder 13 definiert ist.

BAD ORIGINAL