DE69230912T2

DE69230912T2 - Radioaktiv-markiertes metall-bindendes protein zur behandlung von arthritis

Info

Publication number: DE69230912T2
Application number: DE69230912T
Authority: DE
Inventors: Joseph R. Garlich; Kenneth Mc Millan; Jaime Simon
Original assignee: MOLLINCKRODT Inc N D GES D STA
Current assignee: MOLLINCKRODT Inc N D GES D STA
Priority date: 1991-05-30
Filing date: 1992-05-15
Publication date: 2000-12-07
Anticipated expiration: 2012-05-16
Also published as: WO1992021379A1; AU2156792A; CA2109208C; US5133956A; EP0586562B1; JP3535154B2; EP0586562A1; EP0586562A4; JPH06507908A; DE69230912D1; CA2109208A1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen von radioaktiven metallbindenden Proteinen mit hohem Molekulargewicht und auf eine Methode zur Behandlung von rheumatischer Arthritis durch die Verabreichung solcher radioaktiven Zusammensetzungen von metallbindenden Proteinen hohen Molekulargewichts.
Rheumatische Arthritis ist eine weit verbreitete Krankheit, die sich durch chronische Entzündung der Synovialmembran, die das kranke Gelenk auskleidet, auszeichnet. Derzeitige Behandlungsmethoden für schwere Fälle von rheumatischer Arthritis schließen das Entfernen der Synovialmembran ein, zum Beispiel die Synovektomie. Die operative Synovektomie hat viele Grenzen, einschließlich des Risikos des Operationsvorgangs selbst, wie auch der Tatsache, daß ein Chirurg häufig nicht die ganze Membran entfernen kann. Das zurückbleibende erkrankte Gewebe kann eventuell regenerieren, was dieselben Symptome verursacht, welche durch die Operation gemildert werden sollten.
Strahlungssynovektomie ist das strahlungsinduzierte Entfernen von erkranktem Synovial-Membrangewebe, das durch Injektion einer radioaktiven Zusammensetzung in das erkrankte Synovium durchgeführt wird. Frühe Ansätze, die Strahlungssynovektomie durchzuführen, wurden durch eine Instabilität der verwendeten radioaktiven Zusammensetzungen wie auch durch ein Austreten dieser Zusammensetzungen aus dem Synovium in die umliegenden gesunden Gewebe behindert. Die Instabilität von labilen Rakionuklid- Komplexen führte zu einer Verdrängung des Radionuklids aus dem kolloidalen Komplex und einem Zurückhalten des Radionuklids in weichen Geweben. Ein deutliches Austreten der radioaktiven Zusammensetzung aus der Injektionsstelle setzte normale Gewebe gefährlichen Strahlungsmengen aus.
Aufgrund dieser Einschränkungen wurden neue radiomarkierte Zusammensetzungen gesucht, die ein minimales Auslaufen zeigen.
Das US-Patent Nr. 4,752,464 beschreibt eine Zusammensetzung, die ein radioaktives Kolloid enthält, in dem ein Radionuklid in einer Eisenhydroxid-Matrix eingebettet ist. Radioaktive Kolloide sind in Verfahren zur Entfernung mittels Strahlung verwendbar, zum Beispiel zum Entfernen eines Synoviums in rheumatischer Arthritis, jedoch kann deren Verwendung immer noch zu einem deutlichen Austreten von Radioaktivität aus der Injektionsstelle, zum Beispiel einem Synovium, in die umliegenden normalen Gewebe führen, wodurch normale Gewebe einer unerwünschten Menge an Strahlung ausgesetzt werden. Um das Austreten zu kompensieren, wurde ein radioaktives Metall mit einer kurzen Halbwertzeit, wie zum Beispiel Dysprosium (Dy-165) mit einer Halbwertzeit von 2,3 Stunden, zur Verwendung als das markierende Radionuklid vorgeschlagen. Aufgrund seiner kurzen Halbwertzeit zerfällt der Großteil der Dy-165-Radioaktivität, bevor ein wesentliches Auslaufen eintreten kann, wodurch die Dosis an Strahlung, die normale Gewebe erreicht, minimiert wird.
Die Verwendung von radioaktiven Metallen mit einer kurzen Halbwertzeit schränkt die Verwendbarkeit der therapeutischen Strahlungsmethode hinsichtlich zweier wichtiger Punkte stark ein. Einerseits verlieren radioaktive Zusammensetzungen, die mit Isotopen mit kurzer Halbwertzeit hergestellt sind, eine deutliche Menge an Radioaktivität wegen des Abklingens während des Versendens zu entfernten Orten. Zweitens müssen große Mengen an radioaktiven Materialien verwendet werden, um eine therapeutische Dosis einer Zusammensetzung, die ein radioaktives Metall mit einer kurzen Halbwertzeit enthält, zu erreichen. Als ein Ergebnis davon muß klinisches Personal mit großen Mengen an radioaktiven Materialien umgehen.
Daher verbleibt immer noch eine Notwendigkeit für eine therapeutische radioaktive Zusammensetzung, die nach der Injektion in ein Synovium längere Zeit an der Stelle der Injektion verbleibt, zum Beispiel innerhalb eines Synoviums. Ein verlängertes Zurückhalten an der Stelle der Injektion würde die Verwendung von Radionukliden mit einer längeren Halbwertzeit in therapeutischen Verfahren, einschließlich der Strahlungs- Synovektomie, erlauben, ohne die Sorge um ein wesentliches Austreten aus der Injektionsstelle und der Aussetzung von normalen Geweben an Strahlung.
Es wurde nun gefunden, daß, wenn radioaktive Zusammensetzungen, die aus Radionukliden und metallbindenden Proteinen mit hohem Molekulargewicht hergestellt werden, in ein Synovium injiziert werden, diese für eine verlängerte Zeitspanne an der Injektionsstelle zurückgehalten werden, ohne ein wesentliches Austreten von Radioaktivität. Radioaktive Zusammensetzungen, die aus metallbindenden Proteinen mit hohem Molekulargewicht hergestellt werden, können mit Radionukliden mit längeren Halbwertzeiten hergestellt werden als bisher in Verfahren zum Entfernen mittels Strahlung verwendet wurden, wodurch die Befürchtung von deutlichem Austreten aus der Injektionsstelle und somit die Strahlungsexposition von normalen Geweben minimiert wird.
Die Erfindung stellt die Verwendung eines metallbindenden Proteins und eines therapeutischen Radionuklids, das in der Lage ist, an das Protein zu binden, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von rheumatischer Arthritis zur Verfügung, wobei das Radionuklid ein beta-Strahler mit einer Halbwertzeit von 2 Stunden bis 7 Tage ist und das Protein ein Molekulargewicht mit mehr als 50.000 hat.
Die Erfindung stellt außerdem einen Kit zur Behandlung von rheumatischer Arthritis bereit, wobei der Kit solch ein metallbindendes Protein in einem ersten Teil und solch ein Radionuklid in einem zweiten Teil enthält.
Die Erfindung stellt außerdem ein pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein therapeutisches Radionuklid, das Ho-166, Sm-153, Re-186, Y-90, La-140, Gd-159, Yb-175, Rh-105, Lu-177, In-115m, Dy-165, Re-188 oder Sc-47 ist, zusammen mit einem metallbindenden Protein enthält, das in der Lage ist, das Radionuklid zu binden, wobei das Protein ein Molekulargewicht von größer als 50.000 aufweist.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen metallbindende Proteine mit hohem Molekulargewicht, die mit therapeutischen Radionukliden komplexiert sind, ein. Die metallbindenden Proteine sind solche, die ein hohes Molekulargewicht, wie es in Abwesenheit der gebundenen Metalle bestimmt wurde, aufweisen, zum Beispiel solche mit einem Molekulargewicht von größer als 50.000, bevorzugt größer als 100.000, und besonders bevorzugt größer als 250.000.
In dem Begriff "metallbindendes Protein" bezeichnet das Wort "Metall" ein Metallkation, worin ein Teil des Metalls radioaktiv ist. Der Begriff "metallbindendes Protein" bezeichnet ein Protein, das natürlicherweise die Fähigkeit besitzt, Metallkationen zu binden; der Begriff "bindend" bezeichnet eine Anziehung zwischen dem Protein und dem Metallkation, einschließlich kovalenter oder ionischer Bindungen, die durch Standardtechniken nach dem Mischen des Proteins und des Metallkations in einer wäßrigen Lösung gemessen werden können, wie zum Beispiel das Trennen von Proteinen, die Metallkationen enthalten, von nicht-metallbindenden Proteinen durch Gelpermeationschromatographie, Dialyse, Ionenaustauschchromatographie, Elektrophorese, Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) oder Dünnschichtchromatographie. Der Begriff "metallbindendes Protein" bezeichnet außerdem ein Protein, das durch Konjugation eines metallchelatbildenden Liganden an das Protein modifiziert wurde. Das Wort "Protein" schließt Proteine, die nur Aminosäuren enthalten, die durch Peptidbindungen verknüpft sind, und konjugierte Proteine, die Aminosäuren plus Nucleinsäuren, Zucker oder Lipide enthalten, ein. Das metallbindende Protein ist bevorzugt inert, um das Metall getrennt von dem Protein zu halten, wenn es in vivo verwendet wird. Im Laufe der Zeit unterliegt das Protein der Biodegradation, jedoch tritt das Metall während der gewünschten Behandlungszeit nicht ohne weiteres aus dem Protein aus.
Beispiele von bevorzugten metallbindenden Proteinen mit hohem Molekulargewicht schließen Ferritin, Transferrin, Hämoglobin, Ceruloplasmin, Hämozyanin und andere Proteine, die inherent Metallkationen binden können, wie auch Proteine, die durch Zusetzen eines bifunktionellen Chelatbildners modifiziert wurden, um dem Protein eine Metallbindungskapazität zu verleihen, ein. Ein Beispiel für ein bevorzugtes metallbindendes Protein ist Ferritin, ein Eisenspeicherprotein mit einem ungefähren Molekulargewicht von 460.000 in Abwesenheit der gebundenen Metalle. Ferritin enthält einen zentralen strukturellen Kern, der in der Lage ist, bis zu 4.500 Eisenatome pro Molekül zu binden.
Die bevorzugten metallbindenden Proteine mit hohem Molekulargewicht der vorliegenden Erfindung schließen auch Proteine mit hohem Molekulargewicht wie zum Beispiel Immunoglobuline ein, die durch das Zusetzen eines bifunktionellen Chelatbildners modifiziert wurden, um ihnen eine Metallbindungskapazität zu verleihen. Die Zugabe eines bifunktionellen Chelatbildners befähigt das Protein dazu, Metalle stabil zu binden.
Ein bifunktioneller Chelatbildner ist eine chemische Verbindung, die einen metallchelatbildenden Anteil, der in der Lage ist, Metalle zu maskieren oder damit Chelate zu bilden, und eine reaktive Gruppe aufweist, durch die die Verbindung kovalent an ein Protein gekoppelt ist. Bifunktionelle Chelatbildner zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung sind solche, die Polyamiocarboxylate oder Polyaminophosphonate als den metallchelatbildenden Anteil enthalten. Bevorzugt sind bifunktionelle Chelatbildner, die cyclische Polyaminocarboxylate oder cyclische Polyamino phosphonate enthalten, wie etwa makrocyclische Heteroringe mit insgesamt 12 bis 16 Atomen im Ring.
Ein Beispiel von im Stand der Technik bekannten Verbindungen, die aktiviert werden können und als bifunktionelle Chelatbildner gemäß der vorliegenden Erfindung fungieren, umfaßt 1,4,7-Triscarboxymethyl-1,4,7,10- tetraazacyclododecan und Analoge davon, offenbart in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung 292 689, 2-(p-Nitrobenzyl)-1,4,7,10- tetraazacyclododecan-N,N',N",N'''-tetraessigsäure, offenbart in J. Am. Chem. Soc., 11, 6206-6207 (1988), PA--DOTA (α-[2-(4-Aminophenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure), PA-DOTMA (α-[2-(4-Aminophenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1- essigsäure-4,7; 10-tris(methylessigsäure), BA-DOTA (α-(4-Aminophenyl)- 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure), OMe-BA-DOTA (α- (5-Amino-2-methoxyphenyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure) und EA-D03A tl-[2-(4-Aminophenyl)ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-4,7,10-triessigsäure), offenbart in der PCT-Anmeldung WO89/12631, offengelegt am 28. Dezember 1989 : 1,4,7,10- Tetraazacyclododecan-N,N',N",N'''-tetraessigsäure, 1,4,7,10-Tetraazacyclotridecan-N,N',N",N'''-tetraessigsäure, 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan-N,N',N",N'''-tetraessigsäure und 1,5,9,13-Tetraazacyclohexadecan-N,N',N",N'''-tetraessigsäure, offenbart in US-Patent 4,678,667, sowie Derivate von Diethylentriaminpentaessigsäure, offenbart in US-Patent 4,831,175.
Im Stand der Technik bekannte Polyaminophosphonate, die aktiviert werden können und als bifunktionelle Chelatbildner fungieren, sind 1,4-7,10- Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetramethylenphosphonsäure und Analoge davon, offenbart in US-Patent 4,882,142, und die Polyaminophosphonate, wie etwa 1,3-Propandiamin-N-(carboxypropyl)-N,N',N'-trimethylenphosphonsäure, Ethylendiamin-N-(4-aminophenethyl)-N,N',N', -trimethylenphosphonsäure, Ethylendiamintetramethylenphosphonsäure, 1-(Carboxy)ethylen diamintetramethylenphosphonsäure, 1-(4-Aminobenzyl)ethylendiamintetramethylenphosphonsäure, N"-(4-Aminophenyl)-dipropylentriamin- N',N',N"",N""-tetramethylenphosphonsäure und N"-(4-Aminophenethyl)- diethylentriamin-N',N',N''',N'''-tetramethylenphosphonsäure.
Die Aminophosphonsäuren können durch eine Anzahl von bekannten Synthesetechniken hergestellt werden. Von besonderer Wichtigkeit ist die Reaktion einer Verbindung, die wenigstens einen reaktiven Aminwasserstoff enthält, mit einer Carbonylverbindung (Aldehyd oder Keton) und phosphoriger Säure oder Derivaten davon, wie in US-Patent 3,288,846 und von Moeritzer und Irani, J. Org. Chem., 31, 1603 (1966) beschrieben.
Methoden zur Herstellung der bifunktionellen Chelatbildner sind allgemein gut bekannt. In einer Methode werden eine oder mehrere Carbonsäuregruppen eines Polyamins, Polycarbonsäurechelatbildners durch Umwandlung in solche aktivierenden Gruppen wie innere oder gemischte Anhydride, aktivierte Ester (z. B. para-Nitrophenyl, N-Hydroxysuccinimid, usw.) oder mit anderen Derivaten, welche dem Fachmann bekannt sind, aktiviert. Die aktivierte Säuregruppe wird dann mit dem Protein umgesetzt. Das Metallion wird dann dem Protein-Chelatbildner-Komplex zugegeben.
Eine andere Methode zur Herstellung eines bifunktionellen Chelatbildners ist, einen chelatbildenden Liganden mit einer einzelnen reaktiven Gruppe, wie etwa ein Isothiocyanat, herzustellen, der mit dem chelatbildenden Anteil an einer Position verbunden ist, die die Stärke, mit der der chelatbildende Ligand das Metallion bindet, nicht wesentlich verringert. Ein Artikel von M. W. Brechbiel et al., Inorg. Chem. 25, 2772-2781 (1986) veranschaulicht dieses zweite Verfahren. Beispiele anderer proteinbindender funktioneller Gruppen von bifunktionellen Chelatbildnern schließen elektrophile oder nucleophile Einheiten, wie zum Beispiel Bromacetamid-, Maleimid-, Imidoester-, Thiophthalimid-, N-Hydroxysuccininylester-, Pyridyldisulfid-, Phenylazid-, o-Acylisoharnstoff-, Anhydrid-, Diazonium-, Carboxyl-, Amino-, Acylhydrazid-, Semicarbazid- und Thiosemicarbazidgruppen ein.
Die Modifizierung von Proteinen durch die Zugabe von bifunktionellen Chelatbildnern kann durch im Stand der Technik bekannte Methoden erreicht werden. Üblicherweise umfassen diese Methoden die Bildung einer kovalenten Verknüpfung eines Aminosäurerests des Proteins und einer funktionellen Gruppe des bifunktionellen Chelatbildners, der zur Proteinbindung fähig ist.
Das Binden eines therapeutischen radioaktiven Metalls an ein Protein mit hohem Molekulargewicht oder an ein Protein-Chelatbildner-Konjugat kann erreicht werden, indem das metallbindende Protein einer wäßrigen Lösung eines Metallions bei einem pH von ungefähr 3 bis ungefähr 12, bevorzugt bei ungefähr 4 bis ungefähr 9, ausgesetzt wird.
Den bifunktionelle Chelatbildner kann man mit einem therapeutischen radioaktiven Metall umsetzen und den Komplex anschließend an ein Protein anhängen. Alternativ kann ein Protein erst durch den Zusatz des bifunktionellen Chelatbildners modifiziert werden und das modifizierte Proteinkonjugat dann mit einem therapeutischen radioaktiven Metall umgesetzt werden.
Radionuklide zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind beta- Strahler mit Halbwertzeiten im Bereich von 2 Stunden bis 7 Tagen. Bevorzugte Radionuklide sind die Radionuklide Holmium (Ho-166), Samarium (Sm- 153), Rhodium (Rh-105), Lutetium (Lu-177), Indium (In-115 m), Dysprosium (Dy-165), Yttrium (Y-90), Lanthan (La-140), Gadolinium (Gd-159), Ytterbium (Yb-175), Rhenium (Re-186), (Re-188) und Scandium (Sc-47). Bevorzugter sind die Radionuklide Ho-166, Sm-153, Re-186, Re-188, Rh-105, Lu- 177, In-155m und Dy-165.
Die jeweiligen Radionuklide können durch im Stand der Technik bekannte Methoden hergestellt werden. Beispielsweise wird in einem nuklearen Reaktor ein Nuklid mit Neutronen beschossen, um ein Nuklid mit zusätzlichen Neutronen in seinem Kern zu erhalten. Zum Beispiel:
Ho-165 + Neutron = Ho-166 + gamma
Typischerweise können die gewünschten Radionuklide durch Bestrahlen eines geeigneten Zielstoffes, wie etwa eines Metalloxids, hergestellt werden. Eine andere Methode, um Radionuklide zu erhalten, ist das Beschießen von Nukliden mit Partikeln in einem linearen Beschleuniger oder Zyklotron. Noch ein anderer Weg, um Radionuklide zu erhalten, ist, sie aus Mischungen von Spaltprodukten zu isolieren.
Das Verhältnis der Menge von radioaktivem Metall zu der Menge des metallbindenden Proteins mit hohem Molekulargewicht, die bei der Herstellung der Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, variiert entsprechend dem spezifischen Protein, das radiomarkiert wird, seiner Spezifität und seiner Metallbindungskapazität. Beispielsweise hat das metallbindende Protein Ferritin ein Molekulargewicht von ungefähr 460.000 in Abwesenheit von gebundenen Metallen, und natürlicherweise kann ein Molekül dieses Proteins bis zu 4.500 Eisenatome binden. Eine solch hohe Bindungskapazität würde ein molares Verhältnis von bis zu 1 : 4.500 Ferritin : Metall erlauben. Im Gegensatz dazu bindet das metallbindende Protein Transferrin, das ein ungefähres Molekulargewicht von 77.000 hat, nur 2 Eisenatome pro Molekül, was ein molares Verhältnis von 1 : 2 Transferrin : Metall erlaubt.
Üblicherweise sind die bifunktionellen Chelatbildner, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, in der Lage, ein Atom eines Metallkations pro Molekül des Chelatbildners zu binden (damit einen Chelatkomplex zu bilden), und üblicherweise bindet ein Molekül Protein pro Mole kül eines Chelatbildners. Daher beträgt das Molverhältnis von Chelatbildner-Proteinkonjugat zu Metall üblicherweise wenigstens 1 : 1 Protein- Konjugat : Metall. Es ist möglich, daß ein Proteinmolekül mehr als ein bifunktionelles Chelatbildnermolekül bindet und daher das Verhältnis von Metall zu Protein ansteigt; jedoch ist ein Konjugat-Verhältnis von wenigstens 1 : 1 bevorzugt.
In den radioaktiven Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung muß das metallbindende Protein nicht gesättigt sein, d. h. vollständig mit radioaktivem Metall besetzt sein. Eine vorgegebene Masse des Proteins kann mit radioaktivem Metall komplexiert werden, um eine radioaktive Zusammensetzung herzustellen, die ein molares Verhältnis von Protein zu Metall von 1 zu weniger als oder gleich der Bindekapazität des metallbindenden Proteins hat.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten radioaktive Metalle, die mit metallbindenden Proteinen mit hohem Molekulargewicht komplexiert sind, in einem physiologisch annehmbaren Träger. Beispiele für geeignete physiologisch annehmbare Träger schließen wäßrige Träger, wie z. B. phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), Glykole oder Salzlösungen ein. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können einem Patienten zu therapeutischen Behandlungen durch im Stand der Technik bekannte Methoden verabreicht werden, zum Beispiel intravenös oder durch Injektion. Beispielsweise kann eine Ferritin-Ho-166- Zusammensetzung in Salzlösung hergestellt werden und zur Strahlungssynovektomie in ein Gelenk injiziert werden.
Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung haben feste oder flüssige Form. Diese Formulierungen können in Form eines Kits vorliegen, so daß die verschiedenen Komponenten zur passenden Zeit vor der Verwendung gemischt werden. Üblicherweise bedürfen die Formulierungen eines pharma zeutisch annehmbaren Trägers, egal ob sie vorgemischt oder als ein Kit vorliegen.
Die Menge der radioaktiven Zusammensetzung, die dem Patienten verabreicht wird, hängt von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich dem spezifischen Radionuklid, seiner spezifischen Aktivität und Abstrahlung, dem besonderen Typ an therapeutischer Behandlung, zum Beispiel die Art der Injektionsstelle, die Dauer der gewünschten Therapie und der Krankheitstyp, der behandelt wird, sowie der Menge an Radioaktivität, die an der Injektionsstelle gewünscht ist.
Eine therapeutische Dosierung an Radioaktivität ist eine solche, die genügt, um das therapeutische Ergebnis der Entfernung durch die Strahlung zu erreichen, wenn eine solche Dosis einem Patienten verabreicht wird, zum Beispiel eine Menge, die genügt, um die Synovialmembran zu entfernen, wenn sie in Gelenkhaut eines Patienten injiziert wird. Üblicherweise wird eine therapeutische Dosis eine solche sein, die ungefähr 5 Gy bis 1.500 Gy überbringt. Eine bevorzugte Dosis ist eine solche, die von ungefähr 20 Gy bis 500 Gy in die Injektionsstelle überbringt. Gy bedeutet "Grays" wobei 1 Gy 100 rads entspricht.
Die Erfindung wird im weiteren durch die Betrachtung der folgenden Beispiele erläutert, die nur beispielhaft für die vorliegende Erfindung sein sollen.

Beispiel 1: Herstellung von Ferritin - Sm-153 durch Metallaustausch

Eine 50 ul Menge Ferritin, das gebundenes Eisen enthält (100 mg/ml, MW 900.000) wurde in ein Fläschchen gegeben, das 150 ul 0,1 M Natriumcitrat mit 10 ul einer Sm-153-Lösung (3 · 10&supmin;&sup4; M in 0,1 N HCl) bei einem pH von 7 enthält. Diese Lösung wurde fünf Minuten lang auf 80ºC erhitzt. Nach dem Erhitzen wurden 100 ul der Lösung in eine 10 cm langes SEPHADEXTM G-50-Gelfiltrationssäule (ein Polysacchariddextran, verkauft durch Pharmacia) eingespritzt und mit Wasser eluiert, wobei Fraktionen mit 10 Tropfen in einem Fraktionssammler gesammelt wurden. Die Menge an Aktivität in jeder Fraktion wurde unter Anwendung eines NaI-Well- Scintillationszählers bestimmt.
Der Hauptteil der Radioaktivität wurde in einer frühen Fraktion eluiert und entsprach proteingebundenem Sm-153. Ein kleinerer Prozentsatz der Radioaktivität eluierte langsamer und entsprach einem kleineren Molekül, zum Beispiel Sm-153-Citrat.
Ein Volumen von 100 ul des radiomarkierten Proteins (Fraktion Nr. 7) wurde in die Gelenkhaut des linken Kniegelenks eines narkotisierten Kaninchens injiziert. Ein NaI-gamma-Detektor wurde oberhalb des Kniegelenks, in das injiziert wurde, angebracht, und die Sm-153-gamma- Aktivität, die in der Gelenkhaut verblieben war, wurde über eine Zeitspanne von 1,6 Stunden in Anzahl pro Minute bestimmt. Dieses Verfahren wurde mittels einer Injektion in die Gelenkhaut des rechten Knies desselben Kaninchens wiederholt.
Die Ergebnisse wiesen auf fast kein Austreten von Radioaktivität aus der Gelenkhaut hin. Nach Korrekturen um den Zerfall wurde durch Auftragen der Aktivität als eine Funktion der Zeit eine Kurve erhalten. Es wurde angenommen, daß die Kurve eine gerade Linie sei, und berechnete Steigungen von -0,08 und -0,26 Zählern je 30 Sekunden, wobei eine Methode der kleinsten Quadrate verwendet wurde, wurden für das linke, bzw. das rechte Knie erhalten.

Beispiel 2: Radiomarkiertes Ferritin, hergestellt durch Zugabe mittels eines bifunktionellen Chelatbildners

In ein Fläschchen wurde 1 ml einer SmCl&sub3;-Lösung (3 · 10&supmin;&sup4; M, in 0,1 N HCl) vorgelegt. Dazu wurden 2 ul der Tracer-Sm-153-Lösung (3 · 10&supmin;&sup4; M Sm in 0,1 N HCl) und 10 ul α-Aminophenyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecan- 1,4,7,10-tetraessigsäure (14.9 mg/ml) gegeben. Der pH wurde mit NaOH auf 15 eingestellt und die Mischung 30 Minuten auf 100ºC erhitzt. Freies Metall wurde aus der Lösung entfernt, indem sie durch ein Ionenaustauschharz geleitet wurde. Der Prozentanteil an Metall in dem Komplex der gereinigten Lösung wurde durch Ionenaustauschchromatographie zu 98 24 bestimmt. Zu 150 ul dieser sich ergebenden Metallkomplexlösung wurden 2 ul Thiophosgen und 150 ul CHCl&sub3; gegeben. Die Lösung wurde 30 Minuten geschüttelt und dann mit Ether extrahiert, um das CHCl&sub3; zu entfernen. Es wurde Ionenaustauschchromatographie verwendet, um zu bestimmen, daß der Prozentanteil an Sm in dem sich ergebenden Isothiocyanatkomplex 98% betrug.
Ein Volumen von 50 ul Ferritin, das gebundenes Eisen enthält (1000 mg/ml, MW 900.000) wurde in ein Fläschchen vorgelegt, und 150 ul HEPES-Puffer (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]) wurden zugegeben (pH bei 7,4). Der pH wurde mit NaOH auf 8 eingestellt, und 100 ul des bifunktionellen Isothiocyanato-Sm-153-Komplexes wurden zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht stehengelassen. Um die radiomarkierte Proteinfraktion zu isolieren, wurde Gelpermeationschromatographie wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet.
Die Injektion der sich ergebenden radiomarkierten Proteinzusammensetzung in die Gelenkhaut eines Knies eines Kaninchens wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Daten wurden wie für Beispiel 1 beschrieben aufgezeichnet und berechnet, und es wurde eine Steigung von -0,03 Zählern je 30 Sekunden erhalten, was wiederum ein geringes bis kein Austreten dieser Formulierung aus der Gelenkhaut des Kaninchens anzeigte.

Beispiel A: Vergleich von radiomarkierten Zusammensetzungen zur Verwendung in der Strahlungssynovektomie

Ferritin wurde unter Verwendung von NaI-131 und 1,3,4,6-Tetrachlor-3α, 6α-Diphenylglycouril (TDPG), einem Mediator zur Proteiniodierung, verkauft unter der Handelsmarke "IODOGEN" durch Pierce Chemical Company, iodiert. Eine Menge von 1,4 mg TDPG wurde in ein Polypropylenröhrchen vorgelegt, und 1,4 ml Chloroform wurden zugegeben. Aliquote von 50 ul (20 ug) wurden in 1-Gramm-Glasfläschchen vorgelegt und unverschlossen gelassen, bis die Röhrchen trocken waren. Das hergestellte TDPG wurde eingefroren aufbewahrt, bis es verwendet wurde. Ein Volumen von 50 ul Ferritin (100 mg/ml, MW 900.000) wurde in ein Fläschchen vorgelegt, und 100 ml eines 0,2 M Phosphatpuffers (pH von 7,2) wurden zugegeben. Diese Mischung wurde dann in ein vorbereitetes TDPG-Röhrchen gegeben, und 200 ul NaI-131 (959 uCi) (35,48 · 10&supmin;³ GBq) wurden zugegeben. Nach 10- minütigem Stehenlassen wurde die iodierte Lösung durch eine PD-10-Säule (G-25 Gelpermeation) laufenlassen und mit 0,01 M Natriumphosphatpuffer eluiert. Die proteingebundene Fraktion (3,5 bis 4,5 ml) wurde gesammelt.
Ein Kaninchen wurde mit der gesammelten proteingebundenen Zusammensetzung injiziert, und die Daten wurde auf dieselbe Weise wie für Beispiel 1 beschrieben erhalten und berechnet. Die berechnete Steigung für das Zurückhalten betrug -20,7 Zähler je 30 Sekunden, was auf einen wesentlichen Verlust der iodierten Radioaktivität aus der Gelenkhaut hinwies.
Das oben beschriebene Verfahren wurde wiederholt, um das Antikörperprotein B-72.3 (ungefähres MW 150.000) (D. Colcher et al. Cancer Research, 48, 4597-5603, 1988) zu iodieren. Das iodierte Protein wurde in die Ge lenkhaut eines Kaninchens injiziert und die Aktivität bestimmt und wie für Beispiel 1 beschrieben berechnet. Eine berechnete Steigung von - 4,2 Zählern je 30 Sekunden wurde festgestellt. Wenn NaI-131 allein in die Gelenkhaut des anderen Beins injiziert wurde, wurde eine berechnete Steigung von -155,1 festgestellt.
Diese Daten weisen darauf hin, daß das hochmolekulare Protein Ferritin, wenn es mit einem bifunktionellen Chelat (Beispiel 2) oder mit natürlicher Metalladsorption (Beispiel 1) radiomarkiert ist, in der Gelenkhaut des Kaninchens verglichen mit iodiertem Ferritin oder iodiertem Antikörperprotein (B-72.3) eine längere Zeitspanne verblieb, wobei die iodierten Proteine wenigstens eine 16-fach höhere Rate des Austretens aus der Injektionsstelle zeigten.
Andere Ausführungsformen der Erfindung werden Fachleuten aus der Betrachtung der vorangestellten Beispiele ersichtlich. Die vorangestellten Beispiele sollen nur als beispielhaft betrachtet werden, wobei der Umfang der Erfindung durch die folgenden Ansprüche angezeigt wird.

Claims

1. Verwendung eines metallbindenden Proteins und eines therapeutischen Radionuklids, das fähig ist, an das Protein zu binden, wobei das Radionuklid ein beta-Strahler mit einer Halbwertzeit von 2 Stunden bis 7 Tage ist und das Protein ein Molekulargewicht von mehr als 50.000 aufweist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von rheumatischer Arthritis.

2. Verwendung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Protein Ferritin, Transferrin, Hämoglobin, Ceruloplasmin oder Hämozyanin ist.

3. Verwendung wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beansprucht, wobei das Radionuklid Ho-166, Sm-153, Re-186, Y-90, La-140, Gd-159, Yb-175, Rh-105, Lu-177, In-115m, Dy-165, Re-188 oder Sc-47 ist.

4. Verwendung wie in einem der vorstehenden Ansprüche beansprucht, wobei das Medikament eine Dosierwirkung von zwischen 5 Grays und 1.500 Grays hat.

5. Verwendung wie in einem der vorstehenden Ansprüche beansprucht, wobei das Medikament weiterhin einen bifunktionellen Chelatbildner enthält, der fähig ist, sowohl mit dem Protein als auch dem therapeutischen Radionuklid ein Chelat zu bilden.

6. Verwendung wie in Anspruch 5 beansprucht, wobei der bifunktionelle Chelatbildner eine Polyaminocarboxylat- oder Polyaminophosphonat- Chelatbildnergruppe enthält.

7. Kit zur Behandlung von rheumatischer Arthritis, der in einem ersten Teil ein metall bindendes Protein und in einem zwei ten Teil ein Radionuklid enthält, wobei das Radionuklid ein beta-Strahler mit einer Halbwertzeit von 2 Stunden bis 7 Tage ist und das Protein ein Molekulargewicht von mehr als 50.000 aufweist.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein therapeutisches Radionuklid, das Ho-166, Sm-153, Re-186, Y-90, La-140, Gd-159, Yb-175, Rh-105, Lu-177, In-115m, Dy-165, Re-188 oder Sc-47 ist, zusammen mit einem metallbindenden Protein enthält, das fähig ist, an das Radionuklid zu binden, und das Protein ein Molekulargewicht von mehr als 50.000 aufweist.

9. Zusammensetzung wie in Anspruch 8 beansprucht, worin das Protein Ferritin, Transferrin, Hämoglobin, Ceruloplasmin oder Hämozyanin ist.

10. Zusammensetzung wie in Anspruch 8 oder Anspruch 9 beansprucht mit einer Dosierwirkung von 5 Grays und 1.500 Grays.

11. Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 8 bis 10 beansprucht zur Behandlung von rheumatischer Arthritis durch Synovektomie.