DE69535094T2

DE69535094T2 - Proteinmarkierung mit radioaktivem phospor und gezielte radiotherapie

Info

Publication number: DE69535094T2
Application number: DE69535094T
Authority: DE
Inventors: Gary L. Morristown GRIFFITHS; Hans J. Mystic Island HANSEN; Habibe Matawan KARACAY
Original assignee: Immunomedics Inc
Current assignee: Immunomedics Inc
Priority date: 1994-10-05
Filing date: 1995-09-21
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2015-09-22
Also published as: EP0787138A1; ATE331728T1; US5976492A; CA2200855A1; IL115416A0; EP0787138A4; AU3677095A; EP0787138B1; DE69535094D1; US5728369A; IL115416A; JPH10509425A; CA2200855C; WO1996011208A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Phosphor-32- und Phosphor-33-markierte Proteine, die für die Radiotherapie geeignet sind. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zum stabilen Verknüpfen von ³²P- und ³³P-enthaltenden Molekülen mit Targeting Proteinen, derart, dass das Targeting Protein die Fähigkeit zum Binden an eine Zielzelle beibehält. Die Erfindung betrifft auch eine Therapie unter Verwendung der markierten Proteine.
Viele Radionuklide wurden bereits auf ihre Eignung in der Radiotherapie zur internen Verabreichung an Patienten untersucht. Einige Radionuklid-Verbindungen, die Isotope wie ¹³¹I enthalten, können systemisch verabreicht werden, wobei die Tatsache genutzt wird, dass diese Elemente auf Grund ihrer chemischen Eigenschaften zur Lokalisierung in bestimmten Geweben neigen. Andere Radionuklide, wie ¹⁹⁸Au und ¹⁰³Pd, werden lokal, beispielsweise an einer Tumorstelle, verabreicht. Die neueren Versuche haben sich allerdings auf Verfahren zur Verabreichung von Radionukliden an ein vorher ausgewähltes Gewebe durch Verknüpfen des Radionuklids mit einem Targeting Protein, in der Regel einem Antikörper, der sodann in diesem Gewebe lokalisiert wird, konzentriert.
Eine große Anzahl von Verfahren zur Verknüpfung von Radionukliden mit Antikörpern wurde bereits entwickelt. Die chemische Toxizität vieler Radionuklide bedeutet, dass oft komplexe Verfahren zur Stabilisierung der Bindung des Isotops an einen Antikörper angewandt werden müssen.
Beispielsweise muss zur Verwendung von ⁹⁰Y, das viele wünschenswerte radiochemische Eigenschaften aufweist, ein Chelat synthetisiert und kovalent an den Antikörper gebunden werden, um das Radioisotop stabil mit dem Antikörper zu verknüpfen.
Ein Isotop, das viele der gleichen wünschenswerten Merkmale wie ⁹⁰Y zeigt, dem allerdings hinsichtlich einer gezielten Radiotherapie bisher wenig Aufmerksamkeit zuteil wurde, ist ³²P. ³²P ist kostengünstig, wird nicht leicht ausgeschieden und ist darum zur Verwendung bei ambulanten Patientenverfahren geeignet. Zusätzlich emittiert ³²P nur β-Strahlung, die eine ausgezeichnete Tiefeneindringung von etwa 6 mm in das Gewebe aufweist. Im Gegensatz zu vielen anderen Radionukliden, die für die gezielte Radiotherapie in Betracht gezogen werden, ist es nicht von Natur aus toxisch und wird derzeit bei einigen nicht zielgerichteten Anwendungen klinisch verwendet, beispielsweise für die Behandlung von Eierstockkrebs und Polycythemia rubra vera.
Einem weiteren Phosphor-Radioisotop, ³³P, wurde noch weniger Aufmerksamkeit als ³²P zuteil. ³³P weist die gleichen chemischen Eigenschaften wie ³²P auf und besitzt ebenfalls wünschenswerte radiochemische Merkmale. Es ist mit hoher spezifischer Aktivität verfügbar und weist eine 25tägige Halbwertszeit mit einer β-Teilchenemissionsenergie von 0,25 MeV auf, ungefähr 15 % des Wertes der β-Emissionsenergie von ³²P.
Der Grund, warum radioaktiver Phosphor für gezielte radiotherapeutische Anwendungsmöglichkeiten relativ wenig Aufmerksamkeit erfahren hat bestand in der Schwierigkeit, es mit Targeting Proteinen zu verknüpfen. Die meisten der derzeit bekannten Verfahren sind nicht spezifisch und langsam und bauen das Radionuklid nicht wirksam in das Targeting Protein ein.
Ein sehr allgemeines Verfahren der Markierung von Proteinen mit ³²P besteht einfach in der Inkubation des Proteins mit α-³²P-markierten Nucleosidtriphosphaten. Schmidt et al., FEBS Lett., 194:305 (1986). Der Mechanismus für die Markierungsreaktion ist unbekannt. Das Verfahren ist langsam und ergibt nur einen schlechten Einbau der Markierung (weniger als 1 % der Proteinmoleküle sind markiert), und es ist somit zur therapeutischen Anwendung zu unwirksam.
Ein zweites allgemeines Verfahren der ³²P-Markierung besteht in der Inkubation von Proteinen mit [γ-³²P]ATP oder H₃ ³²PO₄ in Gegenwart von Chromionen. Hwang et al., Biochim. Biophys. Acta 882:331 (1986). Dieses Verfahren ist relativ schnell, ergibt allerdings ein unbekanntes Niveau des Markierungseinbaus und hinterlässt auch toxische, an die Proteine gebundene Chromionen, was therapeutisch unverträglich ist.
Ein drittes allgemeines Verfahren ist die Verwendung von ³²P-Diphenylphosphinothionchlorid als reaktive Markierungsverbindung. De Boer et al., Clin. Exp. Immunol. 3:865 (1968). Es wird angenommen, dass dieses Reagens mit den Lysinresten in Proteinen unspezifisch unter Bildung eines hoch stabilen Konjugats reagiert, dass allerdings auch ungefähr 50 % der Radioaktivität mit dem markierten Protein nichtkovalent assoziieren. Obwohl sich durch dieses Verfahren Proteine mit hoher spezifischer Aktivität markieren lassen, ist das markierende Mittel nur schlecht wasserlöslich, und um gute Markierungsausbeuten zu erreichen, müssen große Reagens-Überschüsse eingesetzt werden, wobei relativ große Mengen an gefährlichen radioaktiven Materialien verbraucht werden.
Ein weniger übliches Verfahren der ³²P-Markierung ist die Verwendung von Periodat-oxidiertem [α-³²P]ATP zur Affinitätsmarkierung von Proteinen, die eine ATP-Bindungsstelle enthalten. Clertant et al., J. Biol. Chem. 257:6300 (1982). Da viele Targeting Proteine, die von therapeutischem Interesse sind, insbesondere Antikörper, keine ATP-Bindungsstellen enthalten, ist dieses Verfahren darum von geringem allgemeinem Nutzen.
Ein neueres Verfahren, das zur Markierung von Antikörpern zur Radiotherapie beabsichtigt ist, umfasst die chemische Konjugation von Proteinkinase-Substratpeptiden an Antikörper, wie bei Foxwell et al., Brit. J. Cancer 57:489 (1988) und GB 2,186,579 beschrieben. Die UK-Patentanmeldung GB 2,262,528 offenbart verbesserte Verfahren zur Konjugation von Proteinkinase-Substratpeptiden mit Antikörpern. Die Konjugate werden anschließend durch Behandlung mit [γ-³²P]ATP in Gegenwart der katalytischen Untereinheit von cAMP-abhängiger Proteinkinase (Proteinkinase A, PKA), die ³²P-Phosphat auf einen Serinrest in dem Substratpeptid überträgt, markiert. Dieses Verfahren zeigte Unterschiede in der β-Phasen-Halbwertszeit zwischen dem ³²P-markierten Antikörper und einem entsprechenden ¹³¹I-markierten Antikörper und auch eine hohe ³²P-Aufnahme in den Knochen von Tieren, denen der markierte Antikörper injiziert wurde. Creighton et al., "The development of ³²P technology for radioimmunotherapy" in MONOCLONAL ANTIBODIES 2. APPLICATIONS IN CLINICAL ONCOLOGY, A.A. Epenetos, Hrsg. Chapman und Hall, (1993) S. 103–109. Die Ergebnisse zeigen die in vitro Instabilität der Markierung, vermutlich auf Grund der Wirkung von Proteinphosphatasen, die in eukariotischen Zellen ubiquitär sind.
Es ist darum offensichtlich, dass neue Verfahren der ³²P- und ³³P-Markierung von Targeting Proteinen sehr wünschenswert sind. Insbesondere werden neue Verfahren, wobei die ³²P- oder ³³P-Markierung in vivo stabil ist und die die Bindungsfähigkeiten dieser Proteine nicht beeinträchtigen, benötigt.
Zusammenfassung der Erfindung
Darum besteht eine Aufgabe der Erfindung darin, Verfahren zum stabilen Markieren von Targeting Proteinen mit ³²P oder ³³P bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Targeting Proteine bereitzustellen, die mit ³²P oder ³³P stabil markiert und zur Radiotherapie geeignet sind.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von pharmazeutischen Zubereitungen, die ³²P- oder ³³P-markierte Proteine enthalten, zur Radiotherapie von Patienten, die an einem Tumor oder an einer infektiösen Läsion leiden.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Testsätzen zur stabilen Markierung von Targeting Proteinen mit ³²P oder ³³P.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Radiotherapieverfahrens für einen Patienten, der an einem Tumor oder einer infektiösen Läsion leidet, wobei ein Targeting Protein, das spezifisch an ein komplementäres Molekül oder eine Struktur, die von einem Tumor oder einer infektiösen Läsion produziert wird oder damit zusammenhängt, bindet und mit ³²P oder ³³P radioaktiv markiert ist, einem menschlichen Patienten, der an dem Tumor oder der infektiösen Läsion leidet, parenteral injiziert wird.
Bereitgestellt gemäß diesen Aufgaben werden ein radioaktiv markiertes Targeting Protein der Formel Q-(S)_m-L-NR'-P(O)(OH)Y-R, wobei P das ³²P- oder ³³P-Isotop ist, Q ein Protein ist, das in der Lage ist, spezifisch an eine komplementäre Zielmolekülspezies auf Grund einer Komplementaritäts-bestimmenden Region davon zu binden, L eine Linkergruppierung ist, Y Sauerstoff oder eine Einfachbindung zu R ist oder Y NR'' ist, R, R' und R'' gleich oder verschieden sind und jeweils eine gegebenenfalls substituierte geradkettige oder verzweigte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, oder heterozyklische Gruppe, die 1–20 Kohlenstoffatome enthält, oder Wasserstoff sind, und wobei m 1 oder 2 ist, oder ein physiologisch verträgliches Salz davon.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist Q ein monoklonaler Antikörper oder ein Antikörperfragment, und bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Thiolgruppe an Q durch Reduktion einer Disulfidbindung in der Hinge-Region dieses monoklonalen Antikörpers oder Antikörperfragments erzeugt.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist L -S-A-, wobei A eine gegebenenfalls substituierte gesättigte oder ungesättigte geradkettige oder verzweigte Alkylen-, Cycloalkylen-, Arylen- oder zweiwertige heterocyclische Gruppe ist, die 1–20 Kohlenstoffatome enthält. Bei wieder einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist L -CH₂-CO-BD-, wobei B O, NH ist oder B eine Einfachbindung mit C ist und D eine gegebenenfalls substituierte gesättigte oder ungesättigte geradkettige oder verzweigte Alkylen-, Cycloalkylen-, Arylen- oder zweiwertige heterocyclische Gruppe ist, die 1–20 Kohlenstoffatome enthält.
Bei wieder einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist L
Bei wieder einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist L
wobei E und F gleich oder verschieden sind und jeweils eine gegebenenfalls substituierte gesättigte oder ungesättigte geradkettige oder verzweigte Alkylen-, Cycloalkylen-, Arylen- oder zweiwertige heterocyclische Gruppe sind, die 1–20 Kohlenstoffatome enthält. Noch eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist diejenige, bei der E aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus
besteht, und F (CH₂)₂ ist.
Bei wieder einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist YR aus der Gruppe, bestehend aus 5'-O-Adenosin, 5'-O-Guanosin, 5'-O-Thymidin, 5'-O-Cytidin, 5'-O-Deoxyadenosin, 5'-O-Deoxyguanosin, 5'-O-Uridin, 5'-O-Deoxycytidin, 5-O-Inosit-1,4-bisphosphat und 5-O-Inosit-1,3,4-triphosphat ausgewählt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine pharmazeutische Zubereitung bereitgestellt, die eine wirksame Menge eines radioaktiv markierten Targeting Proteins, wie vorstehend beschrieben, in einem pharmazeutisch verträglichen sterilen Vehikel umfasst.
Gemäß wieder einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines radioaktiv markierten Targeting Proteins durch Zusammenbringen eines Proteins, das in der Lage ist, spezifisch an eine komplementäre Zielmolekülspezies auf Grund einer Komplementaritäts-bestimmenden Region davon zu binden, und das mindestens eine freie Thiolgruppe enthält, mit einem Komplex der Formel L'-NR'-P(O)(OH)Y-R, wobei P das ³²P- oder ³³P-Isotop ist, L' eine Linkergruppe ist, die eine Gruppe enthält, die in der Lage ist, spezifisch mit Thiolgruppen an dem Targeting Protein unter Bildung einer Disulfid- oder Thioetherverknüpfung zu reagieren, Y Sauerstoff oder eine Einfachbindung zu R ist oder Y NR'' ist und R, R' und R'' gleich oder verschieden sind und jeweils eine gegebenenfalls substituierte geradkettige oder verzweigte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, oder heterozyklische Gruppe, die 1–20 Kohlenstoffatome enthält, oder Wasserstoff sind, oder ein physiologisch verträgliches Salz davon, bereitgestellt.
Gemäß wieder einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit in einem Säuger bereitgestellt, das die Verabreichung an einen Säuger, der dessen bedarf, eines radioaktiv markierten Targeting Proteins, das ein radioaktiv markiertes Targeting Protein, wie vorstehend beschrieben, einschließt, umfasst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein Testsatz zur Herstellung eines radioaktiv markierten Targetinsproteins der Formel Q-(S)_m-L-NR'-P(O)(OH)Y-R, das bereits auf den Seiten 4–5 definiert wurde, bereitgestellt, umfassend in geeigneten Behältern (1) ein Präparat eines bifunktionellen Vernetzungsmoleküls, umfassend: eine funktionelle Gruppe oder Gruppe, die eine Gruppe umfasst, die in der Lage ist, spezifisch mit Thiolgruppen an einem Protein unter Bildung einer Disulfid- oder Thioetherverknüpfung zu reagieren, und eine primäre oder sekundäre Amingruppe; (2) ein Targeting Protein, das mindestens eine Thiolgruppe enthält; und (3) mindestens ein Reagens zur Bewirkung der Kopplung zwischen einem Phosphat, Phosphonat oder Phosphoramidat P-OH und der primären oder sekundären Amingruppe.
Ausführliche Beschreibung
Die vorliegende Erfindung stellt ein einfaches Verfahren zur Markierung von Targeting Proteinen mit ³²P oder ³³P bereit. Eine ³²P- oder ³³P-markierte Phosphatverbindung wird mit einem Linkermolekül gekoppelt, das mit reaktiven Gruppen an dem Targeting Protein konjugiert ist. Die Protein-Phosphor-Verknüpfung ist in vivo sowohl gegen chemischen als auch enzymatischen Abbau stabil. Die markierten Targeting Proteine binden spezifisch an erkrankte Zellen oder erkranktes Gewebe, die durch die Strahlung aus dem ³²P oder ³³P abgetötet werden. Die Erfindung umfasst auch pharmazeutische Zubereitungen, die eine wirksame Menge von mindestens einem der erfindungsgemäßen ³²P- oder ³³P-markierten Targeting Proteine in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen sterilen Vehikel, wie beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences; Drug Receptors Theory, 18. Ausgabe, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990) beschrieben, umfassen. Die Erfindung umfasst auch Testsätze zur Markierung von Targeting Proteinen, die in einer klinischen Umgebung zweckmäßig und leicht zu verwenden sind.
Die bei der Erfindung verwendeten Targeting Proteine binden bevorzugt an Zellen und Gewebe, die mit einem Krankheitszustand zusammenhängen und lindern durch Abtöten dieser Zellen oder Gewebe den Krankheitszustand. Dieses Binden erfolgt mit komplementären Molekülen und Strukturen, die mit der Oberfläche der erkrankten Zellen oder des erkrankten Gewebes assoziiert sind oder darauf exprimiert werden, die vorzugsweise nicht mit der Oberfläche von gesunden Zellen assoziiert sind oder darauf exprimiert werden. Typischer sind die komplementären Gruppierungen auf gesunden Zellen jedoch zu einem geringeren Ausmaß als im erkrankten Zustand festgestellt, vorhanden. Beispielsweise zeigen viele Tumore starke Zunahmen in der Expression des epidermalen Wachstumsfaktor (EGF)-Rezeptors im Vergleich zu normalem Gewebe. ³²P- oder ³³P-markierte Proteine, die auf den EGF-Rezeptor ausgerichtet sind, binden bevorzugt an solche Tumorzellen und führen zu einer hoch wirksamen Konzentration an ³²P oder ³³P und verursachen eine bevorzugte Zell-Abtötung an der Stelle des Tumors. Ein weiteres Beispiel ist das karzinoembryonale Antigen (CEA), das auf der Oberfläche von vielen Tumoren stark exprimiert wird. Ein ³²P- oder ³³P-markierter Antikörper oder ein Antikörperfragment, das an CEA bindet, verursacht eine bevorzugte Zell-Abtötung an der Tumorstelle.
Für die Zwecke der chemischen und enzymatischen Reaktivität verhalten sich ³²P- und ³³P-markierte Moleküle identisch. Es ist darum selbstverständlich, dass die Bezugnahme auf Markieren mit ³²P im Anschluss hieran auch das Markieren mit ³³P einschließt.
A. Verfahren zur Herstellung von ³²P-markierten Verbindungen, die zur Kopplung mit Targeting Proteinen geeignet sind
Die ³²P-markierten Verbindungen, die an die Targeting Proteine gekoppelt werden sollen, werden durch Verknüpfen einer Gruppierung, die spezifisch mit reaktiven Gruppen an einem Protein reagiert, über eine Phosphoramidat-Verknüpfung mit einem ³²P-Phosphatester hergestellt. Dies erfordert die Herstellung eines bifunktionellen Linkers, der sowohl eine nucleophile Amingruppe zur Ermöglichung der Bildung der Phosphoramidat-Verknüpfung als auch eine Gruppe, die zur Kopplung an das Protein in der Lage ist, enthält.
Der bifunktionelle Linker kann mit dem Protein durch aus der Technik bekannte Mittel gekoppelt werden. Beispielsweise kann ein Linker, der eine aktive Estergruppierung enthält, wie ein N-Hydroxysuccinimidester, zur Kopplung an Lysinreste in dem Protein über eine Amidverknüpfung verwendet werden. Bei einem weiteren Beispiel kann ein Linker, der einen nukleophilen Amin- oder Hydrazinrest enthält, mit Aldehydgruppen gekoppelt werden, die durch glykolytische Oxidation von Protein-Kohlehydratresten erzeugt werden. Siehe US-Patentanmeldung Nr. 08/162,912. Zusätzlich zu diesen direkten Kopplungsverfahren kann der Linker mittels eines intermediären Trägers, wie Aminodextran, indirekt mit dem Protein gekoppelt werden. Siehe beispielsweise US-Patentschrift Nr. 5,057,313. Bei diesen Ausführungsformen stellt die modifizierte Formel Q-NH-L-NR'-P(O)(OH)Y-R die Verknüpfung entweder über Lysin, Kohlehydrat oder einen intermediären Träger dar.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Linker mit freien Thiolresten in dem Protein ortsselektiv gekoppelt. Gruppierungen, die zur selektiven Kopplung an Thiolgruppen an Proteinen geeignet sind, sind aus der Technik gut bekannt. Beispiele umfassen Disulfid-Verbindungen, α-Halogencarbonyl- und α-Halogencarboxyl-Verbindungen und Maleimide. Wenn eine nukleophile Aminfunktion in dem gleichen Molekül wie eine α-Halogencarbonyl- oder -carboxylgruppe vorhanden ist, besteht die Möglichkeit, dass die Zyklisierung über eine intramolekulare Alkylierung des Amins erfolgt. Verfahren zur Verhinderung dieses Problems sind dem Fachmann gut bekannt, beispielsweise Herstellen von Molekülen, wobei die Amin- und α-Halogenfunktionen durch starre Gruppen, wie Arylgruppen oder Transalkene, die die unerwünschte Zyklisierung stereochemisch ungünstig machen, getrennt sind. Ein Beispiel für einen α-Halogencarboxyl-Linker, der für die Praxis der Erfindung geeignet ist, ist Succinimidyl-4-(iodacetylamido)benzoat (1).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die thiol-selektive Kopplungsgruppierung ein Maleimid. Maleimid-enthaltende Linker sind aus der Technik gut bekannt. Siehe beispielsweise Wong, "CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING" (CRC Press, Boca Raton, 1991) S. 152–164. Mehrere geeignete Maleimid-Verbindungen sind von der Fa. Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) im Handel erhältlich. Beispiele für diese Verbindungen sind SMCC (2), SMPB (3), MBS (4) und EMCS (5).
Die Maleimid-enthaltenden, aus der Technik bekannten Linker enthalten nicht die nukleophile Amingruppe, die bei der vorliegenden Erfindung erforderlich ist. Somit muss, wenn bekannte Linker verwendet werden sollen, die Aminfunktion eingeführt werden. Die meisten aus der Technik bekannten Linker, einschließlich der Verbindungen (1)–(5), enthalten eine Gruppe, typischerweise ein N-Hydroxysuccinimidester, die vorzugsweise mit einem Amin unter Bildung einer Amidfunktion reagiert. Die Reaktion des Linkers mit einer Diamin-Verbindung dient darum der Einführung der gewünschten Aminofunktion. Beispielsweise ergibt die Reaktion von SMCC mit Ethylendiamin die Verbindung (6), die eine Thiol-spezifische Maleimidgruppe und eine nukleophile Amingruppe enthält. Die Verwendung eines Diamin-Überschusses dient der Verhinderung der Bildung von vernetzten Maleimiden, die durch die Reaktion von zwei SMCC-Molekülen mit einer einzigen Diamingruppe gebildet werden. Diamine, die für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen Verbindungen, wobei die beiden Aminogruppen über eine geradkettige oder verzweigte Alkyl- oder Zykloalkylgruppe, die bis zu 20 Kohlenstoffe enthält, oder über eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe verknüpft sind.
Bei einer alternativen bevorzugten Ausführungsform kann der gewünschte bifunktionelle Linker durch Umsetzung eines einfach geschützten Diamins mit Maleinsäureanhydrid unter Bildung eines Maleimid und anschließende Entschützung des Amins synthetisiert werden. Diese Reaktion ist in Reaktionsschema I, nachstehend, erläutert. Die Aminschutzgruppe ist vorzugsweise eine Butoxycarbonyl (Boc)-Gruppe, die durch Behandlung mit Trifluoressigsäure entfernt wird. Das mono-Boc-geschützte Diamin wird vorzugsweise durch Umsetzung eines Überschusses eines Diamins mit Dibutyldicarbonat hergestellt. Die zur Kopplung mit bekannten Linkern, wie vorstehend beschrieben, geeigneten Diamine sind ebenfalls zur Verwendung in Reaktionsschema I geeignet. Schema I
Reaktionsschema I
Nach Herstellung des bifunktionellen Linkers muss er unter Bildung einer Verknüpfungsverbindung, die eine Phosphoramidatbindung enthält, mit einer reaktiven ³²P-Verbindung gekoppelt werden. Die Erfindung kann mit jeder P^III oder P^V Phosphorverbindung ausgeführt werden, die in der Lage ist, eine Phosphoramidatbindung zu bilden, die unter in vivo Bedingungen stabil ist und nur durch die käufliche Verfügbarkeit von ³²P- oder ³³P-markierten Materialien beschränkt ist. Käuflich verfügbare Radiophosphorverbindungen sind derzeit auf ³²P-markierte Nucleosid Mono-, Di-, und Triphosphate, Inositphosphate, Phosphorsäure und Natriumphosphat und ³³P-markierte Nukleosidtriphosphate und Phosphorsäure beschränkt, jedoch ist es die Absicht der Erfinder, dass die vorliegende Erfindung die Verwendung aller geeigneten neuen ³²P- oder ³³P-markierten Verbindungen einschließt, die verfügbar werden.
Geeignete Verfahren, die P^III-Verbindungen zur Bildung der Phosphoramidatbindung verwenden, sind aus der Technik gut bekannt. Beispielsweise wird die Phosphoramidatbindung mit dem bifunktionellen Linker durch oxidatives Koppeln des Linker-Amins mit einem Phosphittriester in Gegenwart von Iod (Jager et al., Biochem. 27:7237 (1988)) oder Tetrachlorkohlenstoff/Pyridin (Froehler et al., Nucl. Acids. Res. 14:3487 (1986); id. 16:4831 (1988)) gebildet. Die Verwendung von β-Cyanoethylphosphitestern gestattet die anschließende selektive Entschützung der Ester unter mild basischen Bedingungen, die die Maleimidgruppierung nicht beeinflussen.
Verfahren zur Kopplung von Aminen an Phosphate unter Bildung von Phosphoramidaten sind dem Fachmann gut bekannt. Alle bekannten Verfahren umfassen die vorübergehende Aktivierung der Phosphatgruppe durch Umwandlung von einer der Phosphatsauerstoffgruppen in eine Abgangsgruppe, die durch das Amin verdrängt wird. Die Kopplung kann unter Verwendung von Triphenylphosphin und Dipyridyldisulfid als Kopplungsmittel durchgeführt werden, währenddessen ein Phosphat-Sauerstoff durch die Bildung einer Bindung mit dem Phosphoratom des Triphenylphosphins aktiviert wird. Siehe beispielsweise Greene et al., Nucl. Acids Res. 2:1123 (1975). Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Kopplung unter Verwendung eines Carbodiimids als Kopplungsmittel durchgeführt. Siehe Moffat et al., J. Amer. Chem. Soc. 83:649 (1961); Bergstrom et al., Biochim et Biophys. Acta 1061:95 (1991); Ohtsuka et al., Nucl. Acids Res. 3:653 (1976). Das Carbodiimid ist vorzugsweise ein wasserlösliches Carbodiimid, wie 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC), das von der Fa. Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) erhältlich ist. Die Reaktion wird durch Mischen des ³²P-markierten Phosphats mit dem bifunktionellen Linker und Carbodiimid in einem stöchiometrischen Verhältnis in einem wässrigen Lösungsmittel durchgeführt. Nach 1–2 h (die Reaktionsdauer ist unkritisch) wird das Gemisch direkt zur Kopplung mit dem Targeting Protein eingesetzt. Die Wahl des Lösungsmittels ist unkritisch, allerdings müssen die Reaktanten in ihm löslich sein, es darf nicht in die Reaktion eingreifen und muss für den Protein-Verknüpfungsschritt mit Wasser mischbar sein. Bevorzugte Lösungsmittel umfassen DMF, DMSO und Butylalkohol. Die Reaktion von Adenosinmonophosphat mit der verknüpfenden Verbindung (6) ist in Reaktionsschema II gezeigt und dient der Erläuterung der Kopplungsreaktion. Die Nebenprodukte der Reaktion brauchen in diesem Stadium nicht entfernt zu werden, da sie während des schnellen Reinigungsschrittes nach dem Verknüpfen der radioaktiv-markierten Verbindung mit dem Targeting Protein entfernt werden. Schema II
Reaktionsschema II
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Phosphat aus ³²P-markiertem Adenosin-5'-monophosphat, Thymidin-5'-monophosphat, Guanosin-5'-monophosphat, Cytosin-5'-monophosphat, Uridin-5'-monophosphat, und Inosit-1-monophosphat ausgewählt, wovon alle von DuPont-NEN (Boston, MA), Amersham International (Airlington Heights, IL) oder ICN (Costa Mesa, CA) erhältlich sind.
Die Erfindung kann auch mit Phosphonaten durchgeführt werden, die in der Lage sind, stabile Amidophosphonat-Verbindungen zu bilden. Die vorstehend beschriebenen Verfahren zur Kopplung von Aminen mit Phosphatverbindungen können auch zur Herstellung von Amidophosphonaten verwendet werden.
B. Kopplung von ³²P-markierten Verbindungen mit dem Targeting Protein
Die erfindungsgemäßen Targeting Proteine umfassen jedes Protein, das mit Spezifität an Moleküle oder Gewebestrukturen bindet, die krankheitsbeteiligt sind. Beispiele für solche Targeting Proteine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: Antikörper und Antigen-bindende Fragmente von Antikörpern, Lymphokine, Cytokine und Peptidwachstumsfaktoren; und Lymphokin- oder Cytokin-Rezeptorantagonisten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Targeting Protein ein monoklonaler Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment eines monoklonalen Antikörpers.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Targeting Protein Thiolgruppen, die mit den ³²P-markierten, wie vorstehend beschrieben hergestellten Verbindungen reagieren können. Die Thiolgruppe kann als Cysteinrest vorhanden sein oder kann entweder über die Reduktion von Disulfid (Cystin)-Resten oder über die Thiolierung des Proteins eingebaut werden. Die Thiolierung von Proteinen wird leicht durch aus der Technik gut bekannte Verfahren erreicht. Beispielsweise können Lysinreste mit Traut's Reagens (2-Iminothiolan) unter Bildung freier Thiolreste an dem Protein reagieren. Alternativ kann das Protein durch die in der US-Patentanmeldung Nr. 08/253,772 beschriebenen Verfahren thioliert werden.
In vielen Fällen ist die Aminosäuresequenz des Proteins zugänglich, und es kann somit leicht eine Bestimmung vorgenommen werden, ob ein Cystein- oder Lysinrest oder eine Disulfidbindung zur Derivatisierung des Proteins durch Konjugation mit dem markierenden Mittel verwendet werden kann. In einigen Fällen müssen allerdings die Thiolierung, die Disulfidreduktion und die direkten Kopplungsreaktionen alle empirisch getestet werden, um den bestmöglichen Weg zu bestimmen. Das Ausmaß der Konjugation kann leicht durch Messen der pro Gewicht Protein gebundenen Radioaktivität nach dem Abtrennen des Proteins von dem Markierungsreagens über Größenausschlusshromatographie bestimmt werden.
Der häufigste Fall, wobei die Aminosäuresequenz des Targeting Proteins unbekannt ist, liegt dann vor, wenn das Targeting Protein ein monoklonaler Antikörper oder ein Antikörperfragment ist. In solchen Fällen allerdings tragen die Strukturmerkmale der Antikörper in der Praxis der Erfindung zu einem besonderen Vorteil bei. Antikörpermoleküle bestehen aus 2 identischen Kopien von schweren Ketten und leichten Ketten, die über Disulfidbindungen kovalent aneinander gebunden sind. Für eine allgemeine Diskussion siehe Schultz et al., "Proteins II: Structure-Function Relationship of Protein Families", in TEXTBOOK OF BIOCHEMISTRY WITH CLINICAL CORRELATIONS, 3. Ausg., T.M. Devlin (Hrsg.), Wiley & Sons, S. 92–134 (1992); Turner et al., "Antigen Receptor Molecules," in IMMUNOLOGY, 3. Ausg., Roitt et al., (Hrsg.), Mosby, S. 4.1–4.20 (1993). Die Carboxyl-terminale einer Hälfte der leichten Ketten und die Carboxyl-terminalen Dreiviertel der schweren Ketten sind in der Aminosäuresequenz unter den Antikörpern mit verschiedenen Antigen-Spezifitäten hoch konserviert und werden als "konstante Regionen" bezeichnet. Im Gegensatz dazu sind die restlichen Regionen der leichten und der schweren Ketten unter den Antikörpern mit verschiedenen Antigen-Spezifitäten hochvariabel. Bestimmte Regionen innerhalb dieser variablen Abschnitte bilden die Antigen-bindende Stelle, die zu der Topologie der Antigenstruktur komplementär ist.
Die proteolytische Spaltung kann angewandt werden, um einen Antikörper in kleine funktionelle Einheiten zu fragmentieren. Beispielsweise spaltet die proteolytische Spaltung eines IgG-Moleküls mit Papain den Antikörper in das Hinge-Peptid jeweils der schweren Kette und erzeugt ein nicht Antigen-bindendes "Fc"-Fragment, das aus der C-terminalen Hälfte der schweren Ketten aufgebaut ist, und ein identischen Paar von Antigen-bindenden "Fab"-Fragmenten, die aus einem Amino-terminalen Abschnitt einer schweren Kette, der eine vollständige leichte Kette beigefügt ist, bestehen. Die Fab-Fragmente können das Antigen mit einer derjenigen des intakten Antikörpermoleküls entsprechenden Affinität binden.
Antikörper enthalten in der Hinge-Region mindestens 2 Disulfidbindungen, die die beiden schweren Ketten verknüpfen, sowie Disulfid-Bindungen, die die leichten und schweren Ketten miteinander verbinden. Die Hinge-Region-Disulfid-Bindungen sind im Allgemeinen für Disulfid-Reduktionsmittel zugänglicher und können normalerweise selektiv gespalten werden. Mit der Maßgabe, dass die Reduktion unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen durchgeführt wird, behalten die reduzierten Fragmente ihre Immunspezifität und Fähigkeit zum Binden an Antigen bei. Da zudem Sulfhydrylgruppen, die in der Hinge-Region eines Antikörpers oder eines Antikörperfragments erzeugt worden sind, von der Antigen-bindenden Stelle sterisch entfernt liegen, beeinträchtigt die Kopplung von Chelat-Bildnern mit diesen Gruppen nicht die Bindungsaktivität des Antikörpers. Die Reduktion eines Antikörpers oder F(ab')₂-Fragments mit bekannten Disulfidbindung-Reduktionsmitteln, beispielsweise Dithiothreitol, Cystein, Mercaptoethanol und dergleichen, ergibt, gemäß Analyse, nach kurzer Zeit, typischerweise weniger als 1 h, einschließlich Reinigung, einen Antikörper mit 1–10 freien Sulfhydrylgruppen. Es ist zu beachten, dass, wenn die reduzierenden Bedingungen zu drastisch sind oder das Reduktionsmittel zu lange mit den Fragmenten in Kontakt belassen wird, gegebenenfalls die normalerweise weniger reaktiven Disulfidbindungen, die die leichten und die schweren Ketten verknüpfen, reduziert werden, mit nachteiligen Auswirkungen auf die Bindungseigenschaften des Antikörpers. Die sorgfältig kontrollierte Reduktion von Antikörpern führt zu der bevorzugten Reduktion von Disulfidbindungen in der Hinge-Region des Antikörpers, und die resultierenden Cysteinreste können sodann für die erfindungsgemäße Konjugationsreaktion eingesetzt werden.
Wenn das Targeting Protein durch DNA-Rekombinationsmittel erzeugt werden kann, kann durch Mutagenese des Gens, das die Aminosäuresequenz des Proteins codiert, eine zur Konjugation geeignete Stelle eingebracht werden. Verfahren zur ortsgerichteten Mutagenese von Genen sind aus der Technik gut bekannt. Siehe beispielsweise Ausubel et al., (Hrsg.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons (1987), Kap. 15.7, und Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989). Typischerweise bringt die Mutation mindestens einen Cysteinrest in das Targeting Protein an einer Stelle beabstandet von der für die Targeting-Aktivität des Proteins erforderlichen Region ein. Werden mehrere Cysteinreste durch die vorstehend beschriebenen Verfahren gentechnisch in das Targeting Protein eingebracht, kann die Konjugation des Targeting Proteins mit einer Mehrzahl von ³²P-markierten Mitteln erreicht und somit die spezifische Aktivität (Radioaktivität/Mol Protein) des Proteins gesteigert werden. Alternativ kann das durch DNA-Rekombinationsmittel produzierte Protein ein IgG₃- oder IgG₃-artiges Gerüst aufweisen. Ein solches Gerüst mit mehreren Hinge-Region-Disulfidbindungen ist besonders reduktiven Verfahren zugänglich, um eine Vielzahl von freien Thiolgruppen zu erzeugen. Dies ist zur Abgabe der größtmöglichsten Dosis an Radioaktivität an eine erkrankte Zelle oder ein erkranktes Gewebe zweckmäßig.
Die Kopplungsreaktion wird durch Mischen des Markierungsmittels und des Targting Proteins in einem geeigneten Puffer und durch ein Ablaufenlassen der Reaktion bis zur Vollständigkeit durchgeführt. Zum Erreichen eines stöchiometrischen Markierens des Proteins kann das Markierungsmittel in einem ein- bis zweifachen Überschuss verwendet werden. Geeignete Puffer zur Durchführung der Kopplungsreaktion sind aus der Technik gut bekannt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Puffer eine Phosphat-gepufferte Salzlösung. Der Reaktionsablauf wird zweckmäßigerweise unter Verwendung einer HPLC-Größenausschlusssäule mit einem online Strahlungsdetektor überwacht. Die Radioaktivitätsverschiebung von dem Markierungsmittel auf das Protein zeigt die erfolgreiche Konjugation an. Das Protein kann auch auf die Gegenwart von restlichen nicht umgesetzten Thiolgruppen durch Umsetzung mit Ellman's Reagens getestet werden.
Wenn die Konjugation vollständig ist, wird das markierte Protein von dem Markierungsmittel-Überschuss durch Größenausschlusschromatographie, beispielsweise über ein Sephadex G-50-80-Harz in einer Spinsäule (Pharmacia, Piscataway, NJ), abgetrennt. Das Ausmaß der Markierung wird durch Bestimmen der spezifischen Radioaktivität des Proteins, d. h. der Radioaktivität pro mg Protein, und durch ihren Vergleich mit dem Wert, der auf der Basis der spezifischen Aktivität des Markierungsmittels, des Molekulargewichts des Proteins und der Anzahl der für die Konjugation verfügbaren Thiolgruppen berechnet wird, gemessen. Die chemische Reinheit des markierten Proteins kann unter Anwendung von Größenaussschluss-HPLC, beispielsweise einer BioSil 250-Säule (Biorad, Hercules, CA), unter Verwendung von UV-Detektion bestimmt werden. Die UV-Detektionsspur kann mit der Spur verglichen werden, die von einem online Radioaktivitätsdetektor während der gleichen Abtrennung hervorgerufen wird.
In sämtlichen Fällen darf die Konjugation des Proteins die Targeting-Aktivität des Proteins nicht nachteilig beeinflussen. In vielen Fällen wurden aus dem Targeting Protein mutierte Proteine mit voller Targeting Fähigkeit hergestellt, was diejenigen Regionen des Moleküls angibt, die für die Targeting Fähigkeit essentiell sind. Ob eine geeignete Konjugationsstelle in eine solche Region fällt oder ob es bekannt ist, dass die Disulfid-Reduktion ein Targeting Protein inaktiv macht, wird zur Steuerung dafür angewandt, welcher bestimmte Weg zur Konjugation anzuwenden ist.
Wenn das Targeting Protein ein Antikörper oder ein Antikörperfragment ist, das durch die vorstehend beschriebene Verfahrensweise reduziert wurde, sind die neu freigelegten Thiolgruppen von der Antigen-bindenden Stelle des Antikörpers räumlich entfernt, und darum kann vorausgesagt werden, dass die Konjugation mit den markierenden Mitteln die Bindungsaktivität des Antikörpers nicht nachteilig beeinflusst.
In sämtlichen Fällen ist es bevorzugt, dass bei der Konjugation die Retention der Bindungaktivität des Targeting Proteins empirisch bestätigt wird. Dies erfolgt durch Messen der Bindungsaktivität des Proteins vor und nach der Konjugation und durch Vergleich der Ergebnisse. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung gibt die postkonjugative Bindungsaktivität von 70 % oder mehr der präkonjugativen Aktivität eine annehmbare Bindungsretention an. Verfahren zum quantitativen Messen der Bindungsaktivität von Targeting Proteinen sind aus der Technik gut bekannt. Wenn beispielsweise das Targeting Protein ein Wachstumsfaktor ist, können Standardzellkulturtests der Wachtumsfaktoraktivität angewandt werden. Wenn das Targeting Protein ein rekombinanter Antikörper ist, können aus der Technik gut bekannte Verfahren zum Messen der Antikörperaffinität angewandt werden, wie ein quantitativer ELISA-Test.
Einfache Testsätze zur Targeting-Protein-Markierung, um das bereits auf den Seiten 4–5 definierte radioaktiv markierte Targeting Protein der Formel Q-(S)m-L-NR'-P(O)(OH)Y-R zu erhalten, können zur leichteren Durchführung der Erfindung in einer klinischen Einrichtung oder in einer Forschungseinrichtung ohne das Erfordernis einer hoch komplizierten Laborausrüstung hergestellt werden. Das Targeting Protein wird in einem zur Kopplung geeigneten Format, wie vorstehend beschrieben, wie durch Thiolierung oder Disulfid-Reduktion, sofern notwendig, hergestellt. Das Markierungsprotein wird vorzugsweise in gefrorener oder lyophylisierten Form in einem Röhrchen bereitgestellt, dessen Inhalt unter Vakuum oder unter einer Inertatmosphäre gehalten wird, um sicherzustellen, dass die freien Thiolgruppen nicht oxidiert werden. Das Röhrchen ist vorzugsweise mit einem luftdichten Septumverschluss oder mit anderen Mitteln verschlossen, durch die Lösungen durch Injektion steril oder halbsteril zugesetzt werden können. In einigen Fällen kann ein Tangeting Protein, welches Disulfidbindungen enthält, in unreduzierter Form zusammen mit Reduktionsmittel und einem einfachen Protokoll zur Durchführung der Reduktion und Reinigung, wie vorstehend beschrieben, bereitgestellt werden. In solchen Fällen werden Reinigungsmaterialien, wie Größenausschluss-Spinsäulen, wie Sephadex G-50-80-Spinsäulen (Pharmacia), zusammen mit dem Testsatz bereitgestellt.
Der Testsatz enthält auch den bifunktionellen Linker in einer zur ³²P- oder ³³P-Markierung gebrauchsfertigen Form. Beispielsweise wird das Mittel in dem Röhrchen aus einem geeigneten Puffer zur Rekonstitution mit der ³²P- oder ³³P-Phosphatvenbindung in wässriger Lösung lyophylisiert. Obwohl das Röhrchen auch vorzugsweise das Vernetzungsmittel zur Kopplung des Phosphats mit dem bifunktionellen Linker enthält, kann ein getrenntes Röhrchen vorgesehen sein, um das Vernetzungsmittel zu enthalten. Der Vernetzer wird dem bifunktionellen Linker im trockenen Zustand zugesetzt, und darum tritt keine Reaktion ein, bis die Inhalte des Röhrchens mit der wässrigen Lösung des Phosphats rekonstituiert werden. Der Testsatz kann auch ein Röhrchen eines ³²P- oder ³³P-markierten Phosphats, das zur Durchführung der Reaktion geeignet ist, enthalten. Allerdings ist es auf Grund der kurzen Halbwertszeiten von ³²P und ³³P bevorzugt, dass das radioaktive Material frisch von kommerziellen Lieferanten, kurz bevor es verwendet wird, bezogen wird. Kommerzielle Lieferanten für zur Durchführung der Erfindung geeignete ³²P- und ³³P-Verbindungen sind aus der Technik gut bekannt und umfassen DuPont-NEN (Boston, MA), Amersham International (Arlington Heights, IL) und ICN Biomedicals (Costa Mesa, CA).
Die markierte Phosphatverbindung wird dem Röhrchen, das den bifunktionellen Linker und den Vernetzer enthält, zugesetzt, und nach einer vorgeschriebenen Zeit (vorher unter Anwendung der hier beschriebenen Verfahren bestimmt) werden die Inhalte des Röhrchens dem Röhrchen, das das Protein enthält, zugesetzt. Nach dem Mischen wird eine bestimmte Zeitdauer verstreichen lassen, und das markierte Protein wird über die vorgesehene Größenausschlusssäule gereinigt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Spinsäule verwendet und wird mit einem physiologisch verträglichen Puffer, wie Phosphat-gepufferte Salzlösung, eluiert, so dass das Eluat direkt zur Verabreichung an den Patienten verwendet werden kann.
C. Stabilität und Bioverteilung des markierten Antikörpers
Die Stabilität des radioaktiv markierten Proteinkonjugats kann unter den physiologischen Bedingungen, unter denen es verwendet wird, durch Inkubation des Proteins in Humanserum bei 37 °C bestimmt werden. Die Inkubation wird vorzugsweise in einer Atmosphäre durchgeführt, die 5 % CO₂ enthält, um den physiologischen pH aufrecht zu erhalten. In regelmäßigen Zeitabständen werden Proben entnommen und durch Polyacrylamidgelelektrophorese und Größenausschlusschromatographie analysiert, und die Mengen an proteingebundener und nichtproteingebundener Radioaktivität werden quantitativ bestimmt.
Die Biodistribution des markierten Proteins in vivo kann durch Experimente an Nagern unter Anwendung von aus der Technik gut bekannten Verfahren bestimmt werden. Beispielsweise wird Mäusen das Protein injiziert, und eine zuvor festgelegte Anzahl der Mäuse wird nach festgelegten Zeiträumen zur Untersuchung getötet. Knochen wird durch Dissektion isoliert und in einem Ethanol/Salpetersäure-Gemisch solubilisiert. Gewebe wird unter Verwendung eines Gewebesolubilisierungsmittels (wie das TS-1, erhältlich von Research Products International (Mount Prospect, IL)), solubilisiert. Die Radioaktivität in der Knochen- und Gewebefraktion wird verglichen, um festzustellen, welcher Anteil an ³²P vom Knochen, vermutlich durch einen nicht spezifischen Mechanismus nach dem Abbau des Konjugats, aufgenommen wurde.
Bei einem anderen Beispiel wird das markierte Protein Mäusen injiziert, die xenotransplantierte menschliche Tumore tragen, die das Antigen exprimieren, das von dem Targeting Protein erkannt wird. Nach verschiedenen Zeitintervallen werden die Mäuse getötet und seziert, und das Verhältnis der in dem Tumor und in dem anderen Gewebe festgestellten Radioaktivität wird gemessen.
D. Verabreichung des ³²P-markierten Targeting Proteins
Im Allgemeinen variiert die Dosis des verabreichten ³²P-markierten Proteins abhängig von solchen Faktoren, wie Alter, Gewicht, Größe, Geschlecht, allgemeinem medizinischen Zustand und bisheriger medizinischer Historie des Patienten. Typischerweise ist die Versorgung des Empfängers mit einer Dosis an markiertem Protein, die im Bereich von etwa 1 pg/kg bis 10 mg/kg (Menge des Mittels/Körpergewicht des Patienten) liegt, erwünscht, obwohl auch eine niedrigere oder höhere Dosis verabreicht werden kann.
Für therapeutische Anwendungen werden normalerweise etwa 1–50 mg ³²P-markiertes Protein täglich für die Dauer von mehreren Tagen verabreicht.
Die Verabreichung von markierten Proteinen an einen Patienten kann intravenös, intraarteriell, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intrapleural, intrathekal durch Perfusion über einen regionalen Katheter oder durch direkte intraläsionale Injektion erfolgen. Bei Verabreichung des Proteins durch Injektion kann die Verabreichung die kontinuierliche Infusion sein, oder es können ein oder mehrere Boli sein.
Die erfindungsgemäßen markierten Proteine können nach bekannten Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch geeignete Zubereitungen herzustellen, wobei Immunkonjugate in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert werden. Es wird gesagt, dass eine Zubereitung ein "pharmazeutisch verträglicher Träger" ist, wenn ihre Verabreichung von einem Empfänger-Patienten vertragen werden kann. Sterile Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) ist ein Beispiel für einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Weitere geeignete Träger sind den Fachleuten gut bekannt. Siehe beispielsweise REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18. Ausg. (1990).
Für therapeutische die Zwecke werden ein ³²P-markiertes Protein und ein pharmazeutisch verträglicher Träger an einen Patienten in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Es wird gesagt, dass eine Kombination eines ³²P-markierten Proteins und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers in einer "therapeutisch wirksamen Menge" verabreicht wird, wenn die verabreichte Menge physiologisch signifikant ist. Ein Mittel ist physiologisch signifikant, wenn seine Gegenwart zu einer nachweisbaren Veränderung in der Physiologie eines Empfängerpatienten führt. Ein zielgerichtetes therapeutisches Mittel ist therapeutisch wirksam, wenn es einen höheren Anteil der verabreichten Dosis an das beabsichtigte Ziel abgibt als bei systemischer Verabreichung des entsprechenden nicht zielgerichteten Mittels am Ziel aufgenommen wird.
Um therapeutisch wirksam zu sein, könnte es der Verabreichung des markierten Proteins und des Trägers in Kombination mit anderen therapeutischen Mitteln oder als Teil eines breiteren Behandlungsregimes bedürfen. Ärzte sind derzeit der Meinung, dass die Wirksamkeit von zielgerichteten Therapeutika bei kombinationstherapeutischer Verwendung oft stark erhöht werden kann. Beispielsweise hat sich gezeigt, dass die hoch dosierte Radioimmuntherapie für B-Zellen-Lymphome, die bei alleiniger Verwendung schwere hämatologische Toxizität hervorruft, bei Verwendung in Kombination mit einer autologen Knochenmark-Reinfusion hoch wirksam ist. Press et al., "Treatment of Relapsed B Cell Lymphomas with High Dose Radioimmunotherapy and Bone Marrow Transplantation" in CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, Goldenberg, Hrsg. (CRC Press, Boca Raton, 1995) Kap. 17. Bei einem anderen Beispiel wird eine fünffach verstärkte Tumoraufnahme eines radioaktiv markierten Antikörpers festgestellt, wenn der Tumor zuvor bestrahlt wird. Leichner et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 14:1033 (1987). Die Mechanismen, die sich für die Verbesserung der klinischen Wirksamkeit der Radioimmuntherapie als potentiell erwiesen haben, sind auch bei DeNardo et al., "Overview of Obstacles and Opportunities for Radioimmunotherapy of Cancer" in CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, Goldenberg, Hrsg. (CRC Press, Boca Raton, 1995) Kap. 11 erläutert. Anstrengungen zur Entwicklung solcher Kombinationsprotokolle sowie zur Untersuchung von Dosis-einschränkenden Nebenwirkungen und zur Potenzierung und Ausweitung von Zielrichtung, Aufnahme und günstigen Nebenwirkungen werden nun in vielen Laboratorien und Krankenhäusern durchgeführt, und von ihnen wird eine weitere Verbesserung der Brauchbarkeit von zielgerichteten therapeutischen Mitteln erwartet.
Zusätzliche pharmazeutische Verfahren können zur Kontrolle der Wirkungsdauer des markierten Proteins bei einer therapeutischen Anwendung eingesetzt werden. Kontrolliert freisetzende Zubereitungen können durch die Verwendung von Polymeren zur Komplexierung oder Adsorption eines Proteins hergestellt werden. Beispielsweise umfassen biokompatible Polymere Poly(ethylen-covinylacetat)-Matrices und Polyanhydrid-Copolymer-Matrices eines Stearinsäuredimers und von Sebacinsäure. Sherwood et al., Bio/Technology 10:1446–1449 (1992). Die Freisetzungsgeschwindigkeit eines ³²P-markierten Proteins aus einer solchen Matrix hängt von dem Molekulargewicht des Proteins, der Menge des Proteins innerhalb der Matrix und der Größe der dispergierten Teilchen ab. Saltzman et al., Biophysical. J. 55: 163–171 (1989); und Sherwood et al., supra. Weitere feste Dosierungsformen sind in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18. Ausg. (1990) beschrieben.
Nach der allgemeinen Beschreibung der Erfindung wird diese nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele leichter verstanden.
BEISPIEL 1
Synthese von 1-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-4-(2-aminoethylacetamid) (MCAA) (6)
Sulfo-SMCC (1 Äquivalent) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) wird in Natriumacetatpuffer (pH 7) gelöst, und Ethylendiamindihydrochlorid (5 Äq.) wird zugesetzt. Die Umsetzung wird durch TLC aufgezeichnet und mit Fluorescamin sichtbar gemacht. Wenn die Umsetzung vollständig ist, wird das Reaktionsgemisch direkt auf eine C₁₈-Umkehrphasen-HPLC-Säule aufgetragen und mit einem Gradient von Acetonitril in Triethanolamin/Wasser, pH 7, eluiert. Überschüssiges Ethylendiamin eluiert an der Lösungsmittelfront, gefolgt von dem gewünschten Produkt. Eine kleine Menge von doppelt gekoppeltem Material, das durch Kondensation von einem Molekül Ethylendiamin mit 2 Molekülen Sulfo-SMCC gebildet wird, eluiert zuletzt. Das gewünschte Material wird durch ¹H-NMR und IR-Spektroskopie, Massenspektrometrie und Elementaranalyse charakterisiert.
BEISPIEL 2
Kondensation von MCAA mit ³²P-markiertem Adenosinmonophosphat (AMP) unter Bildung von ³²P-AMP-MCAA (7)
MCAA (1 Äq.) und ³²P-AMP (1 Äq.) werden in wässrigem Butanol gemischt, und EDC (1 Äq.) wird zugesetzt. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur ablaufen gelassen und durch Umkehrphasen-HPLC über eine C₁₈-Säule aufgezeichnet. Wenn die Ausgangsmaterialien verschwunden sind, wird das Reaktionsgemisch unter Verwendung einer präparativen Umkehrphasen-C₁₈-Säule unter Elution mit einem Gradienten von Acetonitril in Natriumphosphatpuffer, pH 7, gereinigt.
BEISPIEL 3
Kopplung von ³²P-AMP-MCAA an den monoklonalen anti-CEA-MN14-Antikörper
MN14 ist ein IgG, das das karzinoembryonale Antigen (CEA) spezifisch erkennt. MN14 wird durch Zugabe von 2-Mercaptoethanol bei pH 8,7 10 min bei 4 °C reduziert, um 2 freie Thiolgruppen in der Hinge-Region des Antikörpers zu erzeugen. Das reduzierte MN14 wird in Natriumphosphatpuffer (pH6) gelöst, und ³²P-AMP-MCAA (0,5 Äq.) wird zugesetzt. Der Reaktionsverlauf wird durch Größenausschlusschromato graphie über eine BioSil 250-Säule (Biorad, Hercules, CA) unter Verwendung eines in-line Strahlungsdetektors aufgezeichnet.
BEISPIEL 4
Messung der Immunreaktivität von ³²P-markiertem MN14
Der wie vorstehend in Beispiel 3 hergestellte konjugierte Antikörper wird auf eine mit Affigel (Biorad, Hercules, CA) kovalent verknüpfte CEA-Säule (Calbiochem, La Jolla, CA) aufgebracht. Die Säule wird mit PBS eluiert, und die Radioaktivität, die aus der Säule eluiert, wird gemessen und mit der Menge an Radioaktivität verglichen, die auf die Säule aufgebracht wurde. ¹³¹I-markiertes MN14, welches bekanntlich die gleiche Immunreaktivität wie natives MN14 zeigt, wird ebenfalls auf die Säule aufgebracht, und derselbe Vergleich wird vorgenommen. Der Vergleich der Verhältnisse von gebunden/nicht gebunden für beide markierte Antikörper liefert ein Maß für die Wirkung der Kopplung des ³²P-Markierungsmittels auf die Immunreaktivität von MN14.
BEISPIEL 5
Messung der Biodistribution von ³²P-markiertem MN14
Der konjugierte Antikörper wird in einer Konzentration von 10 mg/kg Körpergewicht in 35 BALB/C-Mäuse injiziert. 5 Tiere werden zu jedem Zeitpunkt von 2 h, 4 h, 1, 2, 3, 7 und 14 Tagen getötet. Zu jedem Zeitpunkt werden die Mäuse zur Entfernung sämtlichen Knochengewebes seziert, welches in Ethanol/Salpetersäure solubilisiert wird. Nichtknochengewebe wird in TS-1 (Research Products International) solubilisiert. Beide solubilisierten Proben werden zu Scintillationsfluid zugesetzt, und die Radioaktivität wird unter Verwendung eines Scintillationszählers gemessen. Die Knochen- und die Nichtknochen-Radioaktivität werden zu jedem Zeitpunkt verglichen. Zunehmende Mengen an im Knochen festgestellter Radioaktivität geben einen verstärkten Abbau des Konjugats an.
BEISPIEL 6
Messung der Gewebespezifität von ³²P-markiertem MN14
60 weiblichen, athymischen, aus der Kreuzung entfernter Verwandter gezüchteten Nacktmäuse, (Harlan, Indianapolis, IN) werden menschliche LS-174T-Tumorzellen injiziert. Nach Entwicklung der Tumore in den Mäusen wird ³²P-markiertes Antikörperkonjugat in einen Pool von 30 Mäusen injiziert, und ¹³¹I-markiertes MN14 (hergestellt durch das Chloramin-T-Verfahren) wird in die anderen 30 Mäuse injiziert, beides in Dosen von 10 mg/kg Körpergewicht. 5 Tiere aus jedem Pool werden jeweils zum Zeitpunkt von 4 h, 1, 2, 3, 7 und 14 Tagen getötet, und die Tumore durch Dissektion entfernt. Der Tumor und das Nichttumorgewebe werden gewogen und solubilisiert, und das Verhältnis von Radioaktivität, das in jeder Fraktion gefunden wird, durch β-Zählung (für ³²P-Markierung) und durch γ-Zählung (für ¹³¹I-Markierung) bestimmt. Die Iodmarkierung von MN14 weist bekanntlich keine nennenswerte Wirkung auf die Immunreaktivität von MN14 auf, und darum kann die Wirkung der ³²P-Markierung auf das MN14-Tumortargeting durch Vergleich der Tumor/Nichttumorverhältnisse, die mit jeder Markierungsmethode festgestellt werden, bestimmt werden.

Claims

Radioaktiv markiertes Targeting Protein, umfassend einen Komplex der Formel Q-(S)m-L-NR'-P(O)(OH)Y-R, wobei P das ³²P- oder das ³³P-Isotop ist, Q ein Protein ist, das in der Lage ist, spezifisch an eine komplementäre Zielmolekülspezies aufgrund einer Komplementaritätsbestimmenden Region davon zu binden, L eine Linkergruppe ist, Y Sauerstoff oder eine Einfachbindung zu R ist, oder Y NR'' ist, R, R' und R'' gleich oder verschieden sind und jedes eine gegebenenfalls substituierte geradkettige oder verzweigte Alkyl-, Cycloalkyl-, Arylgruppe oder heterocyclische Gruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, oder Wasserstoff ist, und m 1 oder 2 ist, oder ein physiologisch verträgliches Salz davon.
Radioaktiv markiertes Targeting Protein nach Anspruch 1, wobei Q ein monoklonaler Antikörper oder ein Antikörperfragment ist.
Radioaktiv markiertes Targeting Protein nach Anspruch 2, wobei die Thiolgruppe an Q durch Reduktion einer Disulfidbindung in der Hinge Region des monoklonalen Antikörpers oder des Antikörperfragments erzeugt wird.
Radioaktiv markiertes Targeting Protein nach Anspruch 1, wobei L -S-A- ist, wobei A eine gegebenenfalls substituierte gesättigte oder ungesättigte geradkettige oder verzweigte Alkylen-, Cycloalkylen-, Arylengruppe oder zweiwertige heterocyclische Gruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, ist.
Radioaktiv markiertes Targeting Protein nach Anspruch 1, wobei L -CH₂-CO-BD- ist, wobei B O, NH oder B eine Einfachbindung zu C ist, und wobei D eine gegebenenfalls substituierte gesättigte oder ungesättigte geradkettige oder verzweigte Alkylen-, Cycloalkylen-, Arylengruppe oder zweiwertige heterocyclische Gruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, ist.
Radioaktiv markiertes Targeting Protein nach Anspruch 1, wobei L
ist.
Radioaktiv markiertes Targeting Protein nach Anspruch 1, wobei L
ist, wobei E und F gleich oder verschieden sind und jedes eine gegebenenfalls substituierte gesättigte oder ungesättigte geradkettige oder verzweigte Alkylen-, Cycloalkylen-, Arylengruppe oder zweiwertige heterocyclische Gruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, ist.
Radioaktiv markiertes Targeting Protein nach Anspruch 7, wobei E aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus
und F (CH₂)₂ ist.
Radioaktiv markiertes Targeting Protein nach Anspruch 1, wobei YR aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus 5'-O-Adenosin, 5'-O-Guanosin, 5'-O-Thymidin, 5'-O-Cytidin, 5'-O-Deoxyadnosin, 5'-O-Deoxyguanosin, 5'-O-Uridin, 5'-O-Deoxycytidin, 5-O-Inosit-1,4-bisphosphat und 5-O-Inosit-1,3,4-trisphosphat.
Pharmazeutische Zubereitung, die eine wirksame Menge einer Zusammensetzung nach Anspruch 1 in einem pharmazeutisch verträglichen sterilen Vehikel umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines radioaktiv markierten Targeting Proteins, umfassend das Zusammenbringen eines Proteins, das in der Lage ist, spezifisch an eine komplementäre Zielmolekülspezies auf Grund einer Komplementaritäts-bestimmenden Region davon zu binden, und das mindestens eine freie Thiolgruppe enthält, mit einem Komplex der Formel L'-NR'-P(O)(OH)Y-R, wobei P das ³²P- oder ³³P-Isotop ist, L' eine Linkergruppe ist, die eine Gruppe umfasst, die in der Lage ist, mit den Thiolgruppen an dem Targeting Protein spezifisch unter Bildung einer Disulfid- oder Thioetherverknüpfung zu reagieren, Y Sauerstoff oder eine Einfachbindung zu R ist oder Y NR'' ist, und R, R' und R'' gleich oder verschieden sind und jedes eine gegebenenfalls substituierte geradkettige oder verzweigte Alkyl-, Cycloalkyl-, Arylgruppe oder heterocyclische Gruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, oder Wasserstoff ist, oder eines physiologisch verträglichen Salzes davon.
Radioaktiv markiertes Targeting Protein nach Anspruch 1 zur Verwendung als Medikament.
Kit zur Herstellung eines radioaktiv markierten Targeting Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend in geeigneten Behältnissen, (1) eine Präparation eines bifunktionellen Linkers, umfassend: eine Gruppierung, die eine Gruppe umfasst, die in der Lage ist, spezifisch mit Thiolgruppen an einem Protein unter Bildung einer Disulfid- oder Thioetherverknüpfung zu reagieren, und eine primäre oder sekundäre Amingruppe; (2) ein Targeting Protein, das mindestens eine Thiolgruppe enthält; und (3) mindestens ein Vernetzungsmittel zur Herbeiführung der Kupplung zwischen einem Phosphat, Phosphonat oder Phosphoramidat P-OH, das ein ³²P- oder ³²P-Isotop enthält, und der primären und sekundären Amingruppe.