DE69933788T2

DE69933788T2 - Radiokonjugation von internalizierungsantikörpern

Info

Publication number: DE69933788T2
Application number: DE69933788T
Authority: DE
Inventors: R. Michael Chapel Hill ZALUTSKY
Original assignee: Duke University
Current assignee: Duke University
Priority date: 1998-12-01
Filing date: 1999-11-30
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2019-12-01
Also published as: AU766458B2; AU2349900A; DE69933788D1; ES2274655T3; EP1135170A2; PT1135170E; US6426400B1; WO2000032240A3; WO2000032240A2; CA2353468C; DK1135170T3; EP1135170B1; WO2000032240B1; US6998106B1; CA2353468A1; ATE343401T1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Verfahrenstechnik der Radiokonjugation. Speziell bezieht sie sich auf die Verwendung von Internalisierungsantikörpern in der Radioimmuntherapie.
Hintergrund der Erfindung
Monoklonale Antikörper (mAbs) sind wegen ihrer Fähigkeit, mit molekularen Determinanten auf Krebszellen spezifisch zu reagieren, attraktive Vehikel zum Richten von Strahlung auf Tumore. Jedoch muss die erwartete Auswirkung markierter mAbs auf den klinischen Umgang mit Krebs noch erreicht werden; Verlust von Marker aus dem mAb in vivo und Aufnahme von Radioaktivität in normale Gewebe haben ihre klinische Anwendung verhindert. Iod-131 ist das in der klinischen Radioimmuntherapie am häufigsten verwendete Nuklid, aber sein Wert wurde durch Dehalogenisierung von mAbs, die mit herkömmlichen Verfahren markiert worden waren, in vivo beeinträchtigt.
Radioaktiv markierte mAbs könnten eine wichtige Rolle in der Diagnose und Therapie von Krebs spielen, wenn die zur Wechselwirkung zwischen mAb und Antigen gehörende molekulare Spezifität erfolgreich dazu ausgenutzt werden könnte, Radionuklide selektiv an Tumore abzugeben. Für viele Krebsarten stellt Radioimmuntherapie eine atraktive Alternative zur externen Strahlentherapie und zur systemisch verabreichten Chemotherapie, Therapieformen, die häufig wegen dosislimitierender Toxizitäten für normale Gewebe unwirksam sind, dar. Radioimmunszintigraphie ist nicht nur für die Feststellung von Läsionen anziehend, sondern auch als Mittel zum Festlegen, welche Patienten geeignete Kandidaten für eine Therapie mit markiertem mAb sind. Zahlreiche klinische Studien haben die Fähigkeit markierter mAbs bestätigt, in Krebsarten sowohl in Form von Primärtumoren als auch von Metastasen zu gelangen (Übersichtsarbeit in Britton und Granowska, 1996; Larson, 1995) und bei Patienten mit strahlensensitiven Tumoren wurden erhebliche therapeutische Reaktionen mit mAbs, die mit ¹³¹I markiert waren, er zielt (Press et al., 1995; Kaminski et al., 1996). Jedoch haben sich andere Tumore als weniger strahlensensibel herausgestellt, vermutlich aufgrund des niedrigen Spiegel an Radionuklid, der im Tumor zurückbehalten wird und der erheblichen Ansammlung von Radioaktivität in normalen Organen (Kairemo, 1996; Bast et al., 1997). Im Fachgebiet verbleibt ein Bedarf nach verbesserten Verfahren und Reagenzien, um sowohl therapeutische als auch diagnostische radioaktive Marker selektiv auf Tumorzellen zu richten.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, an radioaktive Substanzen konjugierte Liganden und Verfahren zu ihrer Verwendung beim Lokalisieren und Behandeln von Tumoren bereitzustellen. Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden von einer oder mehreren der unten beschriebenen Ausführungsformen erfüllt.
Eine Ausführungsform der Erfindung stellt eine Zusammensetzung zum internen Markieren einer Zelle bereit. Die Zusammensetzung umfasst einen Liganden, ein Oligopeptid und einen Marker. Der Ligand ist jede Gruppe, die spezifisch an ein Oberflächenantigen oder an einen Rezeptor der Zelle bindet und von der Zelle internalisiert wird. Der Ligand ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, einem Fragment eines Antikörpers und einem synthetischen Polypeptid. Das Oligopeptid umfasst wenigstens einen positiv geladenen Aminosäurerest und wenigstens einen D-Aminosäurerest. Das Oligopeptid umfasst nicht zwei oder mehr aufeinanderfolgende L-Aminosäurereste. Das Oligopeptid ist kovalent an den Liganden gebunden. Der Marker ist kovalent an das Oligopeptid gebunden.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zum Einbauen eines Markers in eine Zelle bereit. Das Verfahren umfasst den Schritt des In-Kontakt-Bringens der Zelle mit der im vorhergehenden Absatz beschriebenen Zusammensetzung, wobei der Marker von der Zelle internalisiert wird.
Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zum Lokalisieren von Tumorzellen in einem Säuger bereit. Das Verfahren umfasst die Schritte des Ein bringens einer diagnostisch wirksamen Menge der oben genannten Zusammensetzung in den Körper eines Säugers, der Tumorzellen umfasst, des Scannens des Körpers mit einem Szintillationsdetektor und des Erzeugens eines Bildes, das die Tumorzellen im Körper des Säugers darstellt.
Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung stellt die Verwendung der oben genannten Zusammensetzung in der Radiotherapie bereit, was den Schritt des Einbringens einer therapeutisch wirksamen Menge der oben genannten Zusammensetzung in den Körper eines Säugers, der einen Tumor umfasst, womit das Wachstum des Tumors verringert wird, umfasst.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt eine Verbindung zum Markieren eines Liganden, der an ein Zelloberflächenantigen bindet, bereit. Die Verbindung umfasst ein Molekül der Formel (I):
Die -NH-Gruppe stellt den Aminoterminus und die
stellt den Carboxylterminus des Moleküls dar. AA stellt eine Aminosäure dar und n ist eine Ganzzahl mit einem Wert von wenigstens 1 und von höchstens etwa 10, 15 oder 20. R₁ ist H oder eine Aminoschutzgruppe und R₂ ist H oder eine Carboxylschutzgruppe, unter der Voraussetzung, dass R₁ = R₂ = H eine nicht erfüllte Bedingung für dieses Molekül ist. Entweder R₁ oder R₂ ist H. Wenigstens ein Aminosäurerest ist positiv geladen und wenigstens ein Aminosäurerest ist eine D-Aminosäure. Das Molekül umfasst nicht zwei oder mehr aufeinanderfolgende L-Aminosäuren. Wenigstens eine Aminosäure ist zur Koppelung an einen Marker ausreichend. Das Molekül ist zur Koppelung an einen Liganden an lediglich einem seiner Enden, seinem Aminoterminus oder seinem Carboxylterminus, ausreichend.
Die Erfindung stattet somit das Fachgebiet mit neuen Hilfsmitteln zum Einbringen von markierten Liganden in eine Zelle aus.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Die 1A und 1B veranschaulichen, wie zwei bevorzugte Zusammensetzungen der Erfindung gebildet werden. In 1A wird das Oligopeptid auf der linken Seite (D-Lys-D-Arg-D-Arg-D-Arg, SEQ ID Nr:1) in der ersten Reaktion über die ε-Aminogruppe von D-Lys an eine chemische Gruppe (zum Beispiel 5-Iod-3-pyridincarboxylat), die einen Marker (zum Beispiel ¹³¹I) umfasst, gekoppelt. In der zweiten Reaktion wird der freie Carboxylterminus des markierten Oligopeptids an eine freie Aminogruppe auf einem monoklonalen Antikörper gekoppelt. In 1B werden zwei ähnliche Reaktionen ausgeführt, aber das Oligopeptid ist D-Tyr-D-Arg-D-Arg-D-Arg (SEQ ID Nr:2) und der Marker (zum Beispiel ¹³¹I) wird direkt an D-Tyr gekoppelt.
Die 2A und 2B zeigen intrazelluläre Aktivität beziehungsweise Aktivität des Überstandes der Zellkultur nach Inkubation von mAB L8A4, der unter Verwendung von SIPC (ausgefüllte Balken) oder SIB (umrandete Balken) markiert worden war, mit EGFRvIII positiven HC2 20 d2 Zellen.
3 zeigt die Bindung und Internalisierung von markiertem L8A4 der Maus an die Zelllinie U87MGΔEGFR, die den mutierten Rezeptor EGFRvIII exprimiert. Der markierte Antikörper wurde entweder mittels direkten Iodogen-Markierens unter Verwendung von ¹³¹I oder unter Verwendung eines Oligopeptids (α-N-Ac-D-Lys-D-Arg-D-Tyr-D-Arg-D-Arg, SEQ ID Nr:3), das an seinem D-Tyr-Rest mit¹²⁵I Iodogen-markiert und wie unter Beispiel 8 beschrieben an den Antikörper gekoppelt worden war, hergestellt.
4 zeigt den Zeitverlauf der Aufnahme von Radioiod durch einen Tumor, ausgedrückt als Prozentsatz der Ausgangsdosis pro Gramm Tumor. L8A4 von der Maus wurde mit ¹²⁵I unter Verwendung des Oligopeptid-Verfahrens und mit¹³¹I unter Verwendung direkten Iodogen-Markierens markiert. Der Versuch wurde in thymuslosen Mäusen, die subcutane, EGFRvIII exprimierende, U87MGΔEGFR Gliom-Xenotransplantate vom Menschen trugen, durchgeführt.
5 macht den Grad der Kumulation von Radioiod in der Schilddrüse unter den Bedingungen des in 3 dargestellten Versuchs deutlich. Kumulation in der Schilddrüse ist ein Indikator von Dehalogenisierung von Verbindungen, die Radioiod enthalten, in vitro.
6 stellt das Verhältnis der Aufnahme von Tumor zu Blut von Radioiod unter den Bedingungen des in 3 dargestellten Versuchs dar.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Es ist eine Entdeckung der vorliegenden Erfindung, dass die Konjugation von radioaktiven Markern an Liganden, die mittels positiv geladenen, gegen Proteolyse resistenten Oligopeptiden an Zelloberflächenantigene binden, die Wirksamkeit von Radioimmuntherapie verbessert. Selektive Lokalisation und Retention des radioaktiven Markers in einer Klasse von Zellen, auf die abgezielt wird, werden unter Verwendung solcher Oligopeptide gesteigert.
Ein Marker wird kovalent an ein Oligopeptid, das mindestens einen D-Aminosäurerest und mindestens einen positiv geladenen Aminosäurerest umfasst, gebunden. Der Marker kann direkt kovalent an das Oligopeptid gebunden sein oder er kann kovalent an eine chemische Gruppe, die wiederum kovalent an das Oligopeptid gebunden ist, gebunden sein. Das Oligopeptid ist kovalent an den Liganden gebunden.
Ein Ligand ist, wie der Begriff auf diese Erfindung angewandt wird, jedes Molekül, das spezifisch an ein Zelloberflächenantigen bindet. Ein Zelloberflächenantigen ist jegliches Antigen oder jeglicher Rezeptor auf einer Zelloberfläche, das oder der von der Zelle internalisiert wird. Liganden können von der Zelle im Lauf von Sekunden, Minuten, Stunden oder Tagen internalisiert werden. Bevorzugte Liganden der Erfindung werden schnell internalisiert, das heißt, dass der größte Teil des Liganden nach Minuten bis Stunden internalisiert ist. Ein Ligand wird als spezifisch bindend betrachtet, wenn er mit einer Affinitätskonstanten von 10⁶ M^–1 oder mehr, vorzugweise von 10⁸ M^–1 oder mehr bindet. Wenn das Zelloberflächenantigen ein Rezeptor ist, dann kann der Rezeptor entweder mit oder ohne einen gebundenen Liganden internalisiert werden. Ein Beispiel eines internalisierenden Rezeptors ist der Rezeptor für epidermalen Wachstumsfaktor (EGFR), der ein Zelloberflächenantigen, das durch den Vorgang der von einem Rezeptor vermittelten Endozytose internalisiert wird, ist. Antigene oder Rezeptoren, die von der Zelle internalisiert werden, können schließlich innerhalb von Endosomen oder Lysosomen lokalisiert werden.
Ein Ligand kann ein Antikörper, ein Fragment eines Antikörpers oder ein synthetisches Peptid, das spezifisch an ein Zelloberflächenantigen bindet, sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Ligand ein internalisierender Antikörper. Jeder Antikörper, der spezifisch an ein Zelloberflächenantigen bindet und von der Zelle internalisiert wird, ist ein internalisierender Antikörper. Der Antikörper kann ein Immunglobulin von jedem Typ sein, das heißt IgG, IgA, IgD, IgE oder IgM, und kann durch Immunisierung eines Säugers wie zum Beispiel einer Maus, einer Ratte, eines Kaninchens, einer Ziege, eines Schafes, eines Primaten, eines Menschen oder einer anderen geeigneten Art erhalten werden. Der Antikörper kann polyklonal sein, das heißt aus dem Serum (auch Antiserum genannt) eines Tieres, das mit einem Zelloberflächenantigen oder einem Fragment davon immunisiert worden ist, gewonnen sein. Der Antikörper kann auch monoklonal sein, das heißt durch Immunisierung eines Säugers unter Verwendung des Liganden der Zelloberfläche oder des Antigens oder eines Fragments davon, durch Fusion von Lymph- oder Milzzellen aus dem immunisierten Säuger mit einer Myelomzelllinie und durch Isolierung des speziellen Hybridomklons gebildet sein, wie es im Fachgebiet bekannt ist. Beispiele von internalisierenden monoklonalen Antikörpern, die zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind, schließen L8A4, Y10 und H10 (Reist et al., 1995) ein. Der Antikörper kann auch ein rekombinanter Antikörper sein, zum Beispiel ein chimärer oder artenübergreifender Antikörper, der mit Verfahren der Rekombination von DNA hergestellt wurde. Ein bevorzugter internalisierender Antikörper ist ein humanisierter Antikörper, der konstante Regionen aus Immunglobulin vom Menschen zusammen mit variablen Regionen der Maus umfasst und über eine Spezifität zum Binden an ein Zelloberflächenantigen verfügt (siehe zum Beispiel Reist et al., 1997). Wenn ein Fragment eines Antikörpers verwendet wird, sollte das Fragment imstande sein, spezifisch an ein Zelloberflächenantigen zu binden. Das Fragment kann zum Beispiel wenigstens einen Teil einer variablen Region einer leichten Kette eines Immunglobulins und wenigstens einen Teil einer variablen Region einer schweren Kette eines Immunglobulins umfassen. Ein Ligand kann auch ein synthetisches Polypeptid, das spezifisch an ein Zelloberflächenantigen bindet, sein. Zum Beispiel kann der Ligand ein synthetisches Polypeptid, das wenigstens einen Teil einer variablen Region einer leichten Kette eines Immunglobulins und wenigstens einen Teil einer variablen Region einer schweren Kette eines Immunglobulins umfasst, sein, wie im U.S. Patent 5.260.203 beschrieben oder wie anderweitig im Fachgebiet bekannt ist.
Das Oligopeptid umfasst wenigstens eine positiv geladene Aminosäure und wenigstens eine D-Aminosäure. Die positiv geladene Aminosäure kann entweder eine D-Aminosäure oder eine L-Aminosäure sein. Positiv geladene Aminosäuren, die im Oligopeptid verwendet werden, sind solche, die beim pH des extrazellulären Mediums (etwa 7,4) oder beim pH des intrazellulären Mediums (etwa 6,8-7,2) oder vorzugsweise beim pH des Inhalts im Lumen von Endosomen (etwa 5-6) oder Lysosomen (etwa 5) eine positive Nettoladung auf ihrer Seitenkette tragen. Beispiele von solchen positiv geladenen Aminosäuren sind Histidin, bevorzugter Lysin und am meisten bevorzugt Arginin. Aminosäuren, welche die D-Stereoisomerenkonfiguration haben, werden zur Verwendung im Oligopeptid bevorzugt, obwohl auch Aminosäuren mit der L-Konfiguration verwendet werden können. D-Aminosäuren machen das Oligopeptid widerstandsfähiger gegen lysosomale Proteasen (Ehrenreich und Cohn et al., 1969), womit sie die Retention des Markers in den Zellen, auf die abgezielt wird, verbessern und die Freisetzung des Markers und seine folgende Wiederaufnahme durch andere Zellen beschränken. Das Oligopeptid enthält nicht zwei oder mehr aufeinanderfolgende L-Aminosäuren. Wenn das Oligopeptid zwei oder mehr L-Aminosäuren umfasst, sind in einer bevorzugten Ausführungsform die L-Aminosäuren voneinander durch eine oder mehrere positiv geladene Aminosäuren getrennt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Oligopeptid mindestens einen D-Tyr-Rest. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Oligopeptid mindestens einen D-Lys-Rest.
Es kann jeder Marker, der die Zellen, welche die Zusammensetzung aufnehmen, dazu befähigt, mittels des Markers erfasst oder beeinflusst zu werden, verwendet werden.
Zum Beispiel kann ein Marker fluoreszierend oder radioaktiv sein, um die Erfassung einer Gruppe von Zellen, auf die abgezielt wird, zu ermöglichen. Ein fluoreszierender Marker oder eine fluoreszierende Kennzeichnung kann auch verwendet werden, wenn spezielle Zellen, auf die abgezielt wird, außerhalb des Körpers, das heißt ex vivo, nachgewiesen werden. Es kann jedes fluoreszierende Molekül, das zum Nachweis mittels Standardverfahren, einschließlich zum Beispiel Fluoreszenzspektroskopie und Fluoreszenzmikroskopie, geeignet ist, verwendet werden. Ein radioaktiver Marker oder eine radioaktive Kennzeichnung kann verwendet werden, wenn die Zellen innerhalb oder außerhalb des Körpers, das heißt in vivo oder ex vivo, nachgewiesen werden. Der Nachweis kann mittels radiologischer Standardverfahren, einschließlich zum Beispiel des Scannens des Körpers mit einem Szintillationsdetektor (Radioszintigraphie) und der Positronenemissionstomographie (PET) (siehe zum Beispiel Bradwell et al., 1985), geführt werden. Zur Verwendung in vivo sollte der Marker ein pharmakologisch annehmbarer Marker sein und sollte in entweder diagnostisch oder therapeutisch annehmbaren Mengen gegeben werden. Eine therapeutisch annehmbare Menge ist eine Menge, die, wenn sie in einer Dosis oder in mehreren Dosen gegeben wird, die gewünschte therapeutische Wirkung, zum Beispiel das Schrumpfen eines Tumors, mit einem Grad an Toxizität, der für eine klinische Behandlung annehmbar ist, hervorruft. Sowohl die Dosis einer bestimmten Zusammensetzung als auch der Weg der Verabreichung der Zusammensetzung können basierend auf bestimmten Eigenschaften der Zusammensetzung, auf dem Zustand, Alter und Gewicht des Patienten, auf der Progression der jeweiligen Erkrankung, die behandelt wird, und auf anderen wichtigen Faktoren festgelegt werden. Wenn die Zusammensetzung Antikörper enthält, liegen wirksame Dosen der Zusammensetzung im Bereich von etwa 5 μg bis etwa 50 μg/kg Körpergewicht des Patienten, etwa 50 μg bis etwa 5 mg/kg, etwa 100 μg bis etwa 500 μg/kg Körpergewicht des Patienten und etwa 200 bis etwa 250 μg/kg. Eine diagnostisch annehmbare Menge ist eine Menge, die einen Nachweis der Markers, wie es für die Diagnose erforderlich ist, mit einem Grad an Toxizität, der für eine Diagnose annehmbar ist, erlaubt. Radioaktive Marker, die zum Zweck des Nachweisens von Zellen, auf die abgezielt wird, vorgesehen sind, sollten vorzugsweise Strahlung, die von außerhalb des Körpers nachgewiesen werden kann, zum Beispiel Gammastrahlung, emittieren, wenn sie in diagnostisch annehmbaren Mengen gegeben werden. Solche radioaktiven Marker schließen die Radionuklide ¹⁸F, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I und ¹³¹I ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Radioaktive Marker, die dazu vorgesehen sind, das Wachstum eines Tumors zu verringern, sollten vorzugsweise Strahlung, die innerhalb der Tumorzelle absorbiert wird, so dass sie die Zelle zum Beispiel durch Stören der DNA der Zelle schädigt, emittieren. Vorzugsweise sollten solche radioaktiven Marker minimalen Schaden an benachbarten, gesunden Zellen verursachen. Zellzerstörende radioaktive Marker können zum Beispiel Alpha-, Beta- und/oder Gammastrahlung emittieren. Solche radioaktiven Marker schließen die Radionuklide ¹⁸F, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ⁷⁷Br,¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I und ²¹¹At ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Radioaktive Marker können durch jedes im Fachgebiet bekannte Mittel, einschließlich des Iodierens eines Tyrosinrestes (siehe zum Beispiel Fraker und Speck, 1978), der Ioddestannylierung (Zalutsky und Narula, 1987) und der Astatdestannylierung (siehe Beispiel I und Foulon et al., 1998), kovalent an des Oligopeptid gebunden werden.
Der Marker kann eine chemische Gruppe, die kovalent an das Oligopeptid gebunden ist, sein. Die chemische Gruppe hat die Struktur der Formel (II). Für die chemische Gruppe in Formel (II) kann X eine Aminogruppe, eine Carboxylgruppe oder (CH₂)_nSH darstellen, wobei n eine Ganzzahl von 0 bis 10 ist. Y kann C oder N darstellen und Z kann F, Br, I, At oder M(Alk)₃ darstellen, wobei M für Si, Sn oder Hg stehen kann und wobei Alk eine Alkylgruppe wie zum Beispiel Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl oder Hexyl darstellt. Die chemische Gruppe kann eine Carbonsäureverbindung, die an eine Aminogruppe des Oligopeptids gebunden ist, sein. Alternativ kann die chemische Gruppe eine Aminoverbindung, die an eine Carboxylgruppe des Oligopeptids gebunden ist, sein. Bevorzugte Carbonsäureverbindungen sind zum Beispiel 5-Iod-3-pyridincarboxylat, 3-Iodbenzoat, 3-(Tri-n-butylstannyl)benzoat, 5-(Tri-n-butylstannyl)-3-pyridincarboxylat oder 5-Astat-3-pyridincarboxylat. Die Pyridincarboxylatverbindungen werden bevorzugt, weil sie bei lysosomalem pH positiv geladen sind. D-Lys wird als Aminosäure für das Oligopeptid in dieser Zusammensetzung bevorzugt, weil die Carbonsäureverbindung über die ε-Aminogruppe von Lys verknüpft werden kann. Ein Radionuklid, zum Beispiel ¹⁸F, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ⁷⁷Br,¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I und ²¹¹At, kann mittels im Fachgebiet verfügbarer Verfahren in die Carbonsäureverbindung aufgenommen werden. Siehe Zalutsky und Narula (1987).
Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können zum internen Markieren einer Zelle verwendet werden. Ein Marker kann in eine Zelle oder eine Gruppe von Zellen eingebaut werden, indem die Zelle mit einer Zusammensetzung der Erfindung in Kontakt gebracht wird. Wie in den vorangehenden Abschnitten beschrieben umfasst eine Zusammensetzung der Verbindung einen Liganden, der kovalent an ein Oligopeptid, welches wiederum kovalent an einen Marker gebunden ist, gebunden ist. Die Zelle wird mit der oben beschriebenen Zusammensetzung so in Kontakt gebracht, dass der Marker von der Zelle internalisiert wird. Die Zelle kann im Körper eines Menschen oder Tieres lokalisiert werden oder sie kann aus dem Körper isoliert und ex vivo mit der Zusammensetzung in Kontakt gebracht werden. Die Zusammensetzung kann mit allen Mitteln, die mit den therapeutischen oder diagnostischen Erfordernissen des Verfahrens vereinbar sind, mit der Zelle in Kontakt gebracht werden. Zum Beispiel kann die Zusammensetzung über einen intravenösen, subcutanen, intramuskulären oder intraperitonealen Weg in einen Patienten oder in ein Tier injiziert oder infundiert werden. Zur Anwendung des Verfahrens in vitro kann die Zusammensetzung dem Medium, in dem die Zelle badet, zugegeben werden. Nach der Internalisierung des Markers können markierte Zellen unter Verwendung eines jeden der oben beschriebenen Verfahren nachgewiesen werden. In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit der Zusammensetzung bedeutet, dass die Zelle so oft oder so lange, wie es für den Zweck der Untersuchung, Diagnose oder Therapie erforderlich ist, in Kontakt gebracht wird. Zum Beispiel kann die Zelle in Intervallen von Minuten, Stunden, Tagen, Wochen, Monaten oder Jahren mit der Zusammensetzung in Kontakt gebracht werden.
Verbindungen, die zum Koppeln an einen Liganden, der spezifisch an ein Zelloberflächenantigen bindet, geeignet sind, können ein Molekül der Formel (I) umfassen:
Die -NH- Gruppe stellt den Aminoterminus und die
stellt den Carboxylterminus des Moleküls dar. AA stellt eine Aminosäure dar und n ist eine Ganzzahl mit einem Wert von wenigstens 1. R₁ ist H oder eine Aminoschutzgruppe und R₂ ist H oder eine Carboxylschutzgruppe, unter der Voraussetzung, dass R₁ = R₂ = H eine nicht erfüllte Bedingung für dieses Molekül ist. Entweder R₁ oder R₂ ist H. Wenigstens ein Aminosäurerest ist eine D-Aminosäure und wenigstens ein Aminosäurerest ist bei lysosomalem pH positiv geladen. Das Molekül umfasst nicht zwei oder mehr aufeinanderfolgende L-Aminosäuren. Wenn zwei oder mehr L-Aminosäuren verwendet werden, sind sie in einer bevorzugten Ausführungsform voneinander durch eine oder mehrere positiv geladene Aminosäuren getrennt. Die Struktur ist zur Koppelung an einen Liganden an lediglich einem seiner Enden, seinem Aminoterminus oder seinem Carboxylterminus, ausreichend.
Die Verbindungen können auf etliche Arten markiert werden. Erstens kann eine Aminosäure im Oligopeptid, zum Beispiel Tyrosin, direkt iodiert werden. Zweitens kann eine chemische Gruppe der Formel (II) an eine freie Amino- oder Carboxylgruppe eines Aminosäurerestes des Oligopeptids gekoppelt werden, zum Beispiel an die ε-Aminogruppe von D-Lys. Drittens kann eine chemische Gruppe der Formel (II) an den freien Amino- oder Carboxylterminus der Verbindung der Formel (I) gekoppelt werden. Es kann jedes im Fachgebiet bekannte Verfahren zum Markieren verwendet werden. Der Marker kann jeder der oben beschriebenen Marker sein. Zum Beispiel kann der Marker ein Radionuk lid, das aus der Gruppe ¹⁸F, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ⁷⁷Br,¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I und ²¹¹At auswählt ist, sein oder der Marker kann ein fluoreszierender Marker sein. Der Marker kann entweder vor oder nach dem Koppeln der chemischen Gruppe der Formel (II) an das Oligopeptid oder entweder vor oder nach dem Koppeln des Oligopeptids an den Liganden zugegeben werden.
Die Verbindungen können entweder an ihrem Amino- oder ihrem Carboxylterminus mit einem Liganden gekoppelt werden. Um so gekoppelt zu werden, müssen sie erst an dem Ende, welches auch immer nicht mit dem Liganden zur Reaktion gebracht werden wird, geschützt werden. Freie Amino- oder Carboxylgruppen können mit jeder geeigneten Schutzgruppe geschützt werden. Aminogruppen können durch Umsetzen zu einem Amid (siehe zum Beispiel J. March, 1977 auf S. 383) geschützt werden; die entsprechende Schutzgruppe würde dann zum Beispiel eine Alkylcarbonyl-, Arylcarbonyl- oder Aralkylcarbonylgruppe sein. Carboxylgruppen können durch Umsetzen zu einem Ester (siehe zum Beispiel J. March, 1977 auf S. 431) geschützt werden; die entsprechende Schutzgruppe würde dann zum Beispiel eine Alkyl-, Aryl-, Aralkyl- oder Alkenylgruppe sein. Blockierende Gruppen können mittels Standardverfahren im Fachgebiet hinzugefügt oder entfernt werden.
Internalisierung von mAbs
Viele der bekannten molekularen Ziele für markierte mAbs sind internalisierende Antigene und Rezeptoren. B-Zell-Lymphom- (Press et al., 1994; Hansen et al., 1996), T-Zell-Leukämie- (Geissler et al., 1991) und Neuroblastomzellen (Novak-Hofer et al., 1994) besitzen alle Antigene, die schnell internalisiert werden. Klinische Radioimmuntherapiestudien mit mAbs, die für diese Antigene spezifisch sind, sind in Arbeit. Es wurden internalisierende Rezeptoren verwendet, um mAbs auf Tumore zu richten. Diese schließen den Wildtyp-Rezeptor für epidermalen Wachstumsfaktor (EGFR; Gliome und Plattenepithelkarzinom; Brady et al., 1992; Baselga et al., 1994), das Onkogenprodukt p185 c-erbB-2 (Mamma- und Ovarialkarzinome; De Santes et al., 1992; Xu et al., 1997) und den Transferrinrezeptor (Gliome und andere Tumore; Laske et al., 1997) ein. Es wurde tatsächlich behauptet, dass Internalisierung mit nahezu jedem mAb, der an ein Zelloberflächenantigen bindet, auftreten kann (Mattes et al., 1994; Sharkey et al., 1997a).
Ein Vorteil der mAb-Internalisierung für die Radioimmuntherapie ist das Potenzial, die an den Zellkern abgegebene, absorbierte Strahlungsdosis zu erhöhen. Dosimetrieberechnungen weisen darauf hin, dass ein Verlagern des Ortes des Zerfalls von der Zellmembran in zytoplasmatische Vesikel sogar beim β-Strahler ¹³¹I, der eine sich über viele Zellen erstreckende Reichweite hat, die Dosis, die vom Zellkern aufgenommen wird, um den Faktor zwei steigern könnte (Daghighian et al., 1996). Andererseits besteht ein Nachteil der mAb-Internalisierung darin, dass dieser Vorgang den mAb zusätzlichen katabolen Prozessen, die zur Freisetzung von Radioaktivität aus Tumorzellen führen können, aussetzt.
EGFRvIII – ein tumorspezifisches Ziel
In einer Reihe von Krebsarten kommt Überexpression des Wildtyps des EGFR-Rezptors vor. EGFR liegt jedoch auch auf vielen normalen Geweben vor, was seinen Wert für das Zielen auf Tumore schmälert. Onkogene Transformation kann zusätzlich zum Bewirken von Überexpression auch zu Umorganisationen der Gene für EGFR führen, einschließlich einiger, die durch Deletionsmutationen in der extrazellulären Domäne des Rezeptors gekennzeichnet sind (Wong et al., 1992). Eine davon, EGFRvIII, hat eine Deletion von 801 Basenpaaren im Leseraster, was zur Entfernung der NH₂-terminalen Aminosäuren 6 bis 273 und zur Generierung eines neuen Glycinrestes an der Verbindungsstelle führt. Dies erzeugt einen mutierten Rezeptor von 145 kDa im Vergleich mit 170 kDa für den Wildtyp des EGFR (Humphrey et al., 1990). Über Expression von EGFRvIII wurde bei der Mehrzahl von Gliomen, Medulloblastomen, Mamma- und Ovarialkarzinomen und auch bei 16 % der kleinzelligen Lungenkarzinome (Garcia de Palazzo et al., 1993; Moscatello et al., 1995; Wikstrand et al., 1995) berichtet. EGFRvIII wurde auf normalen Gewebearten, einschließlich solchen, die den Wildtyp des EGFR exprimieren, nicht gefunden. Weil EGFRvIII nur in Zellen, die eine maligne Transformation durchmachen, exprimiert wird, scheint dieses Molekül wirklich tumorspezifisch und so von großem Wert für diagnostische und therapeutische Anwendungen zu sein. Quantitative Flusszytometrie von Biopsien aus Gliompatienten zeigte einen Durchschnitt von 3 × 10⁵ bis 7 × 10⁵ EGFRvIII-Rezeptoren pro Zelle (Wikstrand et al., 1997), ein Grad, der zum Ansteuern von Tumoren mehr als ausreichend sein sollte. Es wurden unter Verwendung eines 14-mer Peptids, das der Verbindungsstelle entspricht, als Immunogen Antikörper, die spezifisch für EGFRvIII sind, entwickelt (Humphrey et al., 1990; Wikstrand et al., 1995). Mehrere mAbs, einschließlich L8A4, Y10 und H10 haben zum Binden an EGFRvIII-positive HC2 20 d2 Zellen Affinitätskonstanten (K_A) von zwischen 1,3 × 10⁹ und 2,5 × 10⁹ M^–1 nach Radioiodierung (Reist et al., 1995).
Der gegen EGFRvIII gerichtete mAb L8A4 IgG1 von der Maus wurde unter Verwendung von Protokollen, welche die Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit einem synthetischen Peptid, das die eindeutige EGFRvIII-Sequenz darstellt, und auch mit EGFRvIII-positiven HC2 20 d2 Zellen einbeziehen, entwickelt (Wikstrand et al., 1995). Dieser mAb bildet spezifisch mit dem mutierten EGFRvIII von 145 kDa Immunkomplexe, nicht aber mit dem Wildtyp des EGFR von 170 kDa, und wird innerhalb von 5 Minuten nach der Bindung an den Rezeptor in Zellen, die EGFRvIII exprimieren, internalisiert (Reist et al., 1995). Die Affinitätskonstante für L8A4 von der Maus, der an das Neoepitop von EGFRvIII bindet, beträgt 2,0 ± 1,0 × 10⁹ M^–1, bestimmt mittels Oberflächen-Plasmonresonanz (Reist et al., 1997). Einzelketten-F_v-(scF_v) Konstrukte, die auf der variablen Region von L8A4 beruhen, können auch anstelle des gesamten Antikörpers L8A4 verwendet werden. Ein scF_v-Monomer wurde mit SIPC markiert und es wurde festgestellt, dass es eine K_A von 1,5 × 10⁸ M^–1 und einen immunreaktiven Anteil von 65-80 % hat. Es wurden multivalente Konstrukte erzeugt, indem man die Länge des Linkers zwischen den V_L- und den V_H-Domänen variierte; mit einem Linker von 5 Aminosäuren wurde ein Dimer mit einer K_A von 5,5 × 10⁹ M^–1, bestimmt mittels Oberflächen-Plasmonresonanz, geschaffen.
Chimäre Antikörper
Wiederholte Dosen von Antikörpern von der Maus in Menschen, wie es für eine optimale therapeutische Wirksamkeit erforderlich ist, führen zur Entwicklung von Reaktionen in Form von Anti-Maus-Antikörpern beim Menschen (Tjandra et al., 1990), was allergische Reaktionen bewirken oder das Heranführen des Antikörpers von der Maus an den Tumor hemmen kann. Dieses Problem kann angegangen werden, indem man rekombinante Antikörper von Mensch und Maus (auch humanisierte Antikörper genannt), welche die für den Tumor spezifischen variablen Regionen aus der Maus, die mit einer konstanten Region eines Immunglobulins vom Menschen verknüpft sind, enthalten, herstellt. Es wurde eine chimäre, rekombinante Version von L8A4 (chL8A4), welche die Spezifität des Antikörpers L8A4 aus der Maus gegen EGFRvIII zusammen mit den konstanten Domänen von IgG₂ vom Menschen besitzt, hergestellt (Details der Herstellung von chL8A4 siehe Reist et al., 1997 und Literaturhinweise darin). IgG₂ vom Menschen hat eine niedrige Affinität für F_c-Rezeptoren; die Verwendung seiner konstanten Regionen minimiert somit unspezifische Aufnahme. Nach Markierung mit ¹²⁵I- oder ¹³¹I-SIPC waren die Eigenschaften von chL8A4 bezüglich der Aufnahme durch den Tumor denen von L8A4 aus der Maus ähnlich. Die Aufnahme durch normales Gewebe war jedoch bei 72-120 Stunden um das Zweifache erhöht (Reist et al., 1997), was auf einige Unterschiede beim Verarbeiten und bei der Aufnahme durch normales Gewebe im Vergleich mit dem Antikörper aus der Maus hinweist. Weitere Einzelheiten bezüglich der Herstellung chimärer Antikörper mittels Verfahren der Rekombination können in Hoogenboom et al., 1996, U.S. Patent 5.565.332 gefunden werden.
Katabolismus markierter mAbs
Eine Zahl von Gruppen hat gezeigt, dass der Katabolismus markierter mAbs und Fragmente ein komplexer Vorgang, der zur Schaffung multipler markierter Kataboliten führt, ist (Garg et al., 1995; Rogers et al., 1996; Wu et al., 1997). Bei radioiodierten mAbs stellt das Ausmaß der Dehalogenierung, die in vivo stattfindet, einen wichtigen Gesichtspunkt dar, ein Phänomen, von dem man annimmt, dass es von normalerweise am Schilddrüsenhormonstoffwechsel beteiligten Enzymen vermittelt ist. Die Leber, Niere, Schilddrüse und andere normale Gewebe besitzen mehrere Deiodinasen von unterschiedlicher Spezifität für Iodtyrosine und Iodthyronine (Leonard und Rosenbert, 1977; Visser et al., 1988; Boye und Laurberg, 1984). Die Tatsache, dass Deiodinasen von Schilddrüsenhormonen sowohl in normalem Gehirn vom Menschen (Campos-Barros et al., 1996) als auch in Hirntumoren (Mori et al., 1993) entdeckt wurden, hat möglicherweise eine Be deutung für die Behandlung von Tumoren des ZNS. Proteasen können beim Abbau von markierten mAbs auch eine Rolle spielen. Die Eigenschaften der konstanten Region des mAb können seine Widerstandsfähigkeit gegen Proteolyse und die Beschaffenheit der Kataboliten, die erzeugt werden, beeinflussen. Ein beschleunigter proteolytischer Abbau von mAbs könnte in Tumoren aufgrund der Aktivitäten von Proteasen, die an der metastatischen Invasion beteiligt sind, stattfinden (Liotta und Kohn, 1997). Zum Beispiel wird Cathepsin B in Gliomen vom Menschen zu Niveaus, die mit dem Malignitätsgrad zu korrelieren scheinen, exprimiert (Rempel et al., 1994; Mikkelsen et al., 1995; Sivaparvathi et al., 1995). Diese Protease hat eine breite Substratspezifität und es wurde gezeigt, dass sie Peptidbindungen in mAb-Konjugaten spaltet (Li und Meares, 1993).
Internalisierung von mAbs schafft vom Gesichtspunkt des Markierens aus ein weiteres Problem, weit sie üblicherweise dazu führt, dass der markierte mAb den zahlreichen Protasen, die in Lysosomen gefunden werden, ausgesetzt wird. Lysosomaler Abbau einer Vielfalt von mAbs, die unter Verwendung herkömmlicher Verfahren der Radioiodierung markiert wurden, wurde von der schnellen Freisetzung von Radioiod aus der Tumorzelle, in erster Linie als Iodtyrosin (Geissler et al., 1991, 1992; Novak-Hofer et al., 1995; Press et al., 1996; Reist et al., 1996), in vitro und von schlechter Retention von Radioaktivität in Tumor-Xenotransplantaten (van der Jagt et al., 1992; Reist et al., 1995; Sharkey et al., 1997a) in vivo gekennzeichnet. Die Entwicklung besserer Verfahren zum Markieren internalisierender mAbs erfordert eine Würdigung der markierten Metaboliten die im lysosomalen Kompartiment geschaffen wurden, und der Fähigkeit dieser markierten Moleküle, die lysosomale Membran zu überschreiten.
Nuklidauswahl
Viele aktuelle klinische Protokolle schließen die Verabreichung von mAbs, die mit ¹³¹I markiert sind, direkt in spontane zystische Gliome und in Höhlen, die durch chirurgische Entfernung von Gliomen geschaffen wurden, und über der intrathekalen Weg für neoplastische Meningitis ein (Brown et al., 1996; Bigner et al., 1995, 1998). Das Vorliegen einer Erkrankung mit minimalen Residuen macht diese Situationen für Radioimmuntherapie günstig (Sautter-Bihl et al., 1996), indem die Auswirkungen von Uneinheitlichkeiten bei Antigenexpression, Blutfluss, Permeabilität und interstitiellem Druck und auch bei der Schranke zur Bindungsstelle auf die Heterogenität der Dosis am Tumor minimiert werden (Jain, 1996; Zhu et al., 1997). Wegen ihrer kurzen Reichweite im Gewebe sollten die niederenergetischen β-Teilchen von ¹³¹I und die α-Teilchen von ²¹¹At gut zu therapeutischen Anwendungen, die mit kleinen Tumorherden, dünnen Schichten eines Tumors in einem Kompartiment und frei flottierenden Tumorzellen verbunden sind, passen. Obwohl höherenergetische β-Strahler wie zum Beispiel ⁹⁰Y für andere therapeutische Einsatzgebiete attraktiv sind, sollte ¹³¹I zum Behandeln von Mikrometastasen nützlicher sein, weil es einen höheren Anteil seiner Zerfallsenergie innerhalb des Tumors abgeben kann (O'Donoghue et al., 1995; O'Donoghue, 1996; Nahum, 1996).
Anfängliche diagnostische und therapeutische klinische Studien mit markierten mAbs wurden mit ¹³¹I vorgenommen. Seither wurden Verfahren zum Markieren von mAbs mit vielen anderen Nukliden entwickelt. Dennoch verwenden die meisten klinischen Studien zur Radioimmuntherapie noch ¹³¹I und es gibt eine starke rationale Begründung dafür, dies fortzusetzen. Obwohl seine γ-Strahlung von 364 keV nicht ideal für die Bildgebung ist, ermöglicht es ein direktes Überwachen der Pharmakokinetik einer Behandlungsdosis von mit ¹³¹I markiertem mAb, was wertvolle Informationen in Bezug auf patientenspezifische Dosimetrie zur Verfügung stellt (Brown et al., 1996). Weiterhin befinden sich bessere Verfahren zum bildlichen Darstellen von therapeutischen Spiegeln von ¹³¹I in Tumoren in der Entwicklung (Smith et al., 1997a, 1997b). Andere Radioiod-Nuklide sind für die Bildgebung besser geeignet. ¹²³I ist besonders für quantitative Verwendungszwecke ein attraktiveres Nuklid für die Bildgebung mittels SPECT (Buchegger et al., 1995). Nach intravenöser Verabreichung von mit ¹²³I markiertem 81C6 wurde eine Bildgebung mittels SPECT vorgenommen, um die Wirkung einer mAb Proteindosis auf die Verhältnisse von Tumor zu normalem Gewebe festzustellen (Schold et al., 1993). Iod-124 kann zum Kombinieren von Radioimmunszintigraphie mit PET verwendet werden (Arbit et al., 1995). Die Verfügbarkeit vieler Radioiodnuklide, die γ-Strahlen, die für einen Nachweis von außen geeignet sind, aussenden, ist nicht nur für klinische Anwendungen, sondern auch für vorklinische Studien von erheblichem Vorteil. Gepaarte Markierungsversuche unter Verwendung von mit ¹³¹I und ¹²⁵I markierten mAbs (siehe Beispiele 2-4) können verschiedene Verfahren der Markierung in denselben Tieren direkt vergleichen und da her Unterschiede in der Antigen-Expression, der Tumorgröße, der Hämodynamik und den Abbauraten, die zwischen Gruppen von Tieren vorkommen können, aus der Berechnung ausschließen.
Im Allgemeinen wurde angenommen, dass Astat-211 der am meisten versprechende α-Strahler für die Radioimmuntherapie ist. In den meisten Situationen ist seine Halbwertszeit von 7,2 Stunden passender zur Pharmakokinetik von mAbs und Fragmenten von mAbs als die alternativen α-Strahler ²¹²Bi (61 min) und ²¹³Bi (47 min). Jeder Zerfall von ²¹¹At generiert ein α-Teilchen von 5,87 bis 7,45 MeV ohne begleitende β-Strahlung. Eine zufällige Folge des Zerfallszweigs durch Elektroneneinfang von ²¹¹At ist das Aussenden von Polonium-K-Röntgenstrahlen mit 77-92 keV, die ausreichend Energie haben, um eine Gamma-Zählung und ein externes bildliches Darstellen von Verteilungen von ²¹¹At mittels planarer Verfahren und SPECT zu ermöglichen (Turkington et al., 1993; Johnson et al., 1995). Ein wesentliches Problem, das die klinische Erforschung von mit ²¹¹At markierten mAbs behindert hat, war die zuverlässige Verfügbarkeit ausreichender Aktivitätsmengen von ²¹¹At. Unter Verwendung neu entwickelter interner Zyklotron-Targets können jetzt mehr als 40 mCi/h ²¹¹At hergestellt werden (Larsen et al., 1996; Schwarz et al., 1998), was die Herstellung ausreichender Mengen von ²¹¹At, um klinische Studien mit mAbs, die mit ²¹¹At markiert sind, zu erlauben, ermöglicht. Die α-Teilchen von ²¹¹At haben im Gewebe eine Reichweite von 55-70 μm, eine Eigenschaft, die gut zur Behandlung von sich in Kompartimenten ausbreitenden Krebsarten einschließlich neoplastischer Meningitis, mikrometastatischer Krankheit und Tumoren im Kreislauf wie zum Beispiel Lymphomen passt.
Verfahren zum Markieren von mAbs mit Radioiod und ²¹¹At
Proteine, die unter Verwendung von direkten Vorgehensweisen zum Iodieren markiert wurden, sind häufig einem schnellen Verlust der Markierung in vivo unterzogen. Diese Verfahren erzeugen zuerst markiere Tyrosinreste, was dazu führt, dass diese Iodtyrosine von den Deiodinasen, die normalerweise am Metabolismus des Schilddrüsenhormons beteiligt sind, erkannt werden. Die chemischen Gruppen der Formel (II) können verwendet werden, um dieses Problem zu umgehen. Zum Beispiel kann das Reagens N-Succinimidyl-3-iodbenzoat (SIB) in hoher Ausbeute mittels Ioddestannylierung (Zalutsky und Narula, 1987) synthetisiert werden. SIB nutzt die schnelle Elimination von Kataboliten des Iodbenzoats aus dem Körper aus und vermindert weniger Aufnahme von Radioaktivität durch normale Gewebe im Vergleich mit Iod (Zalutsky und Narula, 1988). Die verwandte Gruppe N-Succinimidyl-3-[²¹¹At]astatbenzoat (SAB) kann in ähnlicher Weise hergestellt werden. Wenn Proteine unter Verwendung von Verfahren zur direkten elektrophilen Substitution mit ²¹¹At markiert werden, findet eine schnelle Dehalogenisierung auch unter in-vitro-Bedingungen statt (Aaij et al., 1975). Wenn SAB verwendet wurde, war es möglich, mAbs mit Beibehaltung ihrer Fähigkeit, einen Tumor zu lokalisieren, zu markieren (Zalutsky et al., 1989b).
SIB und SAB können dazu verwendet werden, einen Liganden wie zum Beispiel einen mAb direkt zu radiohalogenisieren. Während direkte Radiohalogenisierung unter Verwendung von SIP oder SAB Deiodierung vermindert, verhindert sie nicht den Verlust der Markierung aus Tumorzellen nach der Internalisierung des mAb (Reist et al., 1996). Die am weitestgehenden erforschte Strategie zum Markieren internalisierender mAbs versucht, die Widerstandsfähigkeit bestimmter Oligosaccharide gegen Abbau durch lysosomale Hydrolasen auszunutzen (Thorpe et al., 1993). Es wurde über vorklinische Evaluierungen mit mAbs, die unter Verwendung von Tyraminkonjugaten von Cellobiose (TCB) (Ali et al., 1990; Reist et al., 1995), Inulin (Thorpe et al., 1993) und Dilactitol (Stein et al., 1995, 1997) markiert wurden, berichtet. Im Vergleich mit anderen Verfahren des Iodierens steigerte die Verwendung dieser Konjugate zum Markieren von internalisierenden mAbs im Allgemeinen die Retention von Radioiod in Tumorzellen in vitro und in Tumor-Xenotransplantaten in vivo. Leider wurde die Übertragung dieser Verfahren zum Markieren in den klinischen Bereich durch eine Zahl von Problemen behindert, einschließlich Vernetzung und Aggregation von mAb, beeinträchtigter Immunreaktivität, herabgesetzter Spezifität beim Ansteuern des Tumors, niedriger Wirkungsgrade bei der Konjugation und spezifischer Aktivitäten und gesteigerter Retention in normalen Geweben wie zum Beispiel Leber, Milz, und Nieren (Pittman et al., 1983; Ali et al., 1990; Reist et al., 1995; Press et al., 1996; Stein et al., 1995, 1997).
Eine alternative Strategie zum Markieren internalisierender mAbs bezieht das Koppeln einer markierten prosthetischen Gruppe, die bei lysosomalem pH positiv geladen ist, an den mAb ein. Positiv geladene Moleküle wie zum Beispiel Neutralrot und Chloroquin werden in von Lysosomen eifrig angereichert (Holtzman, 1989). Wenn die markierten Kataboliten, die während des protolytischen Abbaus der mAbs geschaffen wurden, bei lysosomalem pH positiv geladen sind, sollten sie somit dann auch im Lysosom retiniert werden. Um diese Strategie anzuwenden wurden zwei positiv geladene Gruppen, Succinimidyl-iod-pyridin-carboxylat (SIPC) und Succinimidyl-astat-pyridin-carboxylat (SAPC), entwickelt (Gang et al., 1991, 1993). Die Verwendung von SIPC zum Markieren des mAb L8A4 führte im Vergleich mit anderen Verfahren zu wesentlich gesteigerter intrazellulärer Retention von Radioaktivität mit einer begleitenden Verringerung von Radioaktivität, die aus der Zelle freigesetzt wurde (siehe Beispiel 1). Dies bestätigte, dass ein positiv geladener Radiohalogen-Marker, der an einen geeigneten mAb gekoppelt ist, im Vergleich mit Markern, die nicht positiv geladen sind, eine überlegene Retention und Widerstandsfähigkeit gegen Abbau hat.
D-Aminosäure-Linker
Der proteolytische Abbau von Proteinen in Lysosomen führt zur schnellen Freisetzung der einzelnen L-Aminosäuren aus der Zelle (Reijngoud und Tager, 1977). Dies erklärt vermutlich die Freisetzung von Monoiodtyrosin aus Tumorzellen nach der Internalisierung von mAbs, die mittels herkömmlicher Verfahren markiert wurden (Geissler et al., 1991). D-Aminosäuren sind keine natürlichen Substrate für endogene Enzyme (Milton et al., 1992) einschließlicher derer, die in Lysosomen vorhanden sind (Ehrenreich und Cohn, 1969). Diese Erfindung verwendet eine oder mehrere D-Aminosäuren in einem aus einem Oligopeptid bestehenden Linker zwischen dem mAb und der markierten prosthetischen Gruppe, was das Zurückhalten von Radioaktivität innerhalb der Tumorzelle nach der Internalisierung von mAbs verbessert.
Die Untersuchungen von Ehrenreich und Cohn (1969) bieten eine gewisse Leitlinie in Bezug auf die Beschaffenheit des D-Aminosäurelinkers. Nach endozytotischer Aufnahme in Lysosomen wurden ein geladenes Dipeptid und ein neutrales Tripeptid zurück gehalten, hingegen 6 neutrale Dipeptide nicht. Daher sollte der Peptidlinker, um die Retention in Lysosomen zu maximieren, mehrere positiv geladene Aminosäuren, bevorzugt an positiv geladenes SIPC oder SAPC gekoppelt, enthalten.
Schemata zum Bereitstellen von zwei bevorzugten Ausführungsformen sind in den 1A und 1B gezeigt. In 1A wird das am N-Terminus geschützte Tetrapeptid α-N-Ac-D-Lys-D-Arg-D-Arg-D-Arg (SEQ ID Nr:1), das von einem Labor für individuelle Synthesen bezogen werden kann, durch Reaktion mit SIPC in Gegenwart von Triethylamin und DMF bei Anwendung der vorher beschriebenen Bedingungen markiert (Garg et al., 1996; Vaidyanathan und Zalutsky, 1997). Für diesen Zweck wurde Arginin ausgewählt, weil seine Seitenkette die am meisten basische (pKa = 13,2) der natürlich vorkommenden Aminosäuren ist. Das markierte Peptid wird dann unter Verwendung von wasserlöslichem 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC) und Sulfo-N-hydroxysuccinimid in 4-Morpholinoethansulfonsäure-Puffer (MES), pH 4,5-5, an den mAb gekoppelt (Staros et al., 1986; Gilles et al., 1990). Die endständige Aminogruppe kann in der geschützten Form belassen werden und sollte in vivo abgespalten werden.
Ein alternatives Verfahren schließt das Anhängen eines D-Tyr an den N-Terminus des Peptids und das direkte Markieren des Peptids unter Verwendung von Iodogen (1B) ein. In diesem Fall kann das N-terminal geschützte Peptid zum Beispiel aus α-N-Ac-D-Tyr-D-Arg-D-Arg-D-Arg (SEQ ID Nr:2) bestehen. Monoiod-D-Tyrosin ist gegenüber einer Deiodierung in vivo stabiler als sein L-Enantiomer (Kawai et al., 1990). Dies steht wahrscheinlich mit einer stereospezifischen Erkennung durch die Deiodinase in Beziehung (Dumas et al., 1973). Dennoch sind SIPC und SIB noch widerstandsfähiger gegen Deiodierung und machen so das Peptid mit D-Tyr trotz seiner möglichen Zweckmäßigkeit weniger nützlich.
Die obige Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung im Allgemeinen. Ein umfassenderes Verständnis kann unter Bezugnahme auf die folgenden speziellen Beispiele, die hier ausschließlich zu Zwecken der Veranschaulichung vorgelegt werden und nicht dazu vorgesehen sind, den Umfang der Erfindung einschränken, erlangt werden.
Beispiel 1
Markieren von mABs unter Verwendung von N-Succinimidyl-5-halogen-3-pyridincarboxylaten
Herstellung von SIPC. STPC wird in 3 Schritten aus 5-Bromnicotinsäure wie beschrieben (Garg et al., 1991) synthetisiert und wird als Vorstufe für die Herstellung von SIPC und SAPC verwendet. Obwohl veröffentlichte Verfahren zum Markieren von SIPC wirksam waren, sind sie mit relativ hohen Spiegeln einer Zinnvorstufe, einer Reaktionstemperatur von 60-65°C und einer HPLC-Reinigung verbunden. Diese Merkmale können für Zubereitungen mit einem höheren Aktivitätsspiegel nicht optimal sein, besonders für solche, die für klinische Verwendung vorgesehen sind. Wenn ein neues Verfahren eingesetzt wird, kann die Radioiodierung von SIPC bei Raumtemperatur mit einer Ausbeute von mehr 80 % und unter Verwendung von wesentlich weniger STPC bewerkstelligt werden. In diesem neuen Verfahren werden 10 μg STPC in 10 μl CHCl₃ in ein Glasfläschchen gegeben und 2 μl 1 N HCl, Natrium-[¹³¹I]Iodid und 20 μl N-Chlorsuccinimid (2 mg/ml in CHCl₃) werden zugegeben. Die Mischung wird gevortext und man lässt sie 30 Minuten lang reagieren. Nach Zugabe von 100 μl CHCl₃ wird [¹³¹I]SIPC mittels HPLC unter Verwendung einer Silica-Säule, die mit Hexan:Ethylacetat:AcOH (65:35:2) eluiert wird, gereinigt.
Herstellung von Astat-211. Astat-211 kann an einem Zyklotron durch Beschuss natürlicher Bismut-Metalltargets mit α-Teilchen von 28 MeV über die ²⁰⁹Bi(α,2n)²¹¹At-Reaktion hergestellt werden. Ein internes Targetsystem, das speziell für die Herstellung von ²¹¹At ausgelegt ist, wurde ausführlich in einer neuen Veröffentlichung beschrieben (Larsen et al., 1996). Die Konstruktionsmerkmale dieses Targets, welche die Herstellung großer Mengen von ²¹¹At ermöglicht haben, schließen eine gekrümmte Oberfläche des Targets, kleine Glanzwinkel und elektrisch isolierte Graphitüberwachungselemente für Vorder- und Hinterkante zur kontinuierlichen Strahlstromüberwachung ein. Es war möglich, hohe Zyklotronstrahlströme ohne übermäßige lokale Hitzeentwicklung, die zum Verlust von ²¹¹At aus dem Target führen würde, einzusetzen. Bei Verwendung dieses Targets lag die Effizienz der Produktion von ²¹¹At bei 1 mCi pro μAh, ein Niveau, das beträchtlich höher liegt als solche, die mit externen Targets erzielt werden. Es wurden routinemäßig Strahl ströme vom 75 μA oder mehr eingesetzt. Es kann ein Trockendestillationsverfahren verwendet werden, um ²¹¹At aus dem Target des Zyklotrons abzusondern und das ²¹¹At kann mit einer Ausbeute von > 50 % in kleinen Volumina von NaOH, CHCl₃ oder anderen Lösungsmitteln aufgefangen werden (Larsen et al., 1996). Bei Verwendung dieses Verfahrens kann ²¹¹At in Mengen, die ausreichen, um die klinische Verwendung von mit ²¹¹At markierten Radiopharmaka zu ermöglichen, hergestellt werden.
Herstellung von SAPC. Dieses Verfahren wurde in einer neuen Veröffentlichung (Foulon et al., 1998) beschrieben. 20 μl 0,01 N NaOH werden in ein Gefäß, das die ²¹¹At-Aktivität enthält (1 mCi in 50 μl CHCl₃), gegeben und die organische Schicht wird nach sanftem Vortexen unter einem Stickstoffstrom verdampft. Die Aktivität wird in ein zweites Gefäß überführt und der pH-Wert der Lösung wird auf < 5 eingestellt, indem Ethansäure:Chloroform 5:95 zugegeben wird. N-Chlorsuccinimid (10 μl, 13,3 mg/ml in CHCl₃) und STPC (500 μg in 10 μl CHCl₃) werden zugegeben und man lässt die Reaktion 5 Minuten lang bei 65°C ablaufen. SAPC wird mittels HPLC unter Verwendung des gleichen Aufbaus, der für SIPC beschrieben wurde, gereinigt. Die Ausbeuten für SAPC waren unterschiedlich. Wesentliche Faktoren zum Optimieren schließen Spiegel des Zinnvorläufers, Reaktionszeit und Temperatur, Oxidationsmittel und Lösungsmittel ein. Die letzte Variable scheint besonders wichtig zu sein; SAPC wurde mit einer Ausbeute von 70 % gewonnen, wenn das Markieren in einer Mischung von Dichlormethan und THF vorgenommen wurde.
Koppeln von SIPC und SAPC an mAbs. Das organische Lösungsmittel wird aus den HPLC-Fraktionen, die SIPC oder SAPC enthalten, verdampft und der Rest wird in ein kleines Glasgefäß überführt und mit einem Stickstoffstrom zur Trockne eingedampft. Der mAb in Boratpuffer mit einem pH-Wert von 8,5 wird zugegeben und die Mischung wird auf einem Drehschüttler 15 Minuten lang inkubiert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 0,3 ml 0,2 M Glycin abgebrochen. Der markierte mAb wird unter Verwendung einer 1 × 10 cm Sephadex G-25-Säule gereinigt. Bei Konzentrationen des mAb von 3 mg/ml werden routinemäßig Wirkungsgrade der Koppelung von 70 % erreicht.
Beispiel 2
Bewertung des mAB nach dem Markieren
HPLC. Eine Teilprobe des markierten mAb wird mittels Größenausschluss-HPLC auf einer TSK3000-Säule untersucht, um den Prozentsatz der Radioaktivität, der in Form von Aggregaten, monomerem IgG und von Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht vorliegt, zu bestimmen.
Immunreaktive Fraktion. Für mAbs gegen EGFRvIII werden Homogenate von EGFRvIII-positivem Tumor-Xenotransplantat (U87MGΔEGFR oder HC2 20 d2) und von EGFRvIII-negativem Gehirn der Ratte bei –135°C aufbewahrt, bis sie gebraucht werden. Etwa 5 ng des markierten mAb werden in dreifacher Ausführung über Nacht bei 4°C mit 100, 300 und 500 mg von jedem Homogenat inkubiert und dann dreimal mit eiskaltem 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Immunreaktive Fraktionen werden nach dem Verfahren von Lindmo er al. (1984) berechnet.
Affinitätskonstante. Die Auswertung nach Scatchard wird eingesetzt, um sowohl die Bindungsaffinität von mAbs nach dem Markieren als auch die durchschnittliche Zahl der Rezeptoren je Zelle zu messen. Mindestens 10 fortlaufende Verdünnungen von markiertem mAb (10 ng/ml bis 10 μg/ml) werden in vierfacher Ausfertigung bei 4°C über Nacht mit 1 × 10⁶ EGFRvIII exprimierenden U87MGΔEGFR-Zellen oder mit Rezeptor-negativen NIH 3T3 Kontrollzellen inkubiert. Die Zellen werden pelletiert, dreimal mit 1 % BSA/PBS gewaschen und an Zellen gebundene Aktivität wird in einem automatisierten Gammazähler gezählt. Die Daten werden unter Verwendung des Programms RADLIG (Biosoft, Ferguson, MO) für die Bindung von Radioliganden analysiert.
Internalisierung und zelluläre Weiterverarbeitung. Radiomarkierte mAbs werden mit U87MGΔEGFR-Zellen bei Antikörperüberschuss (3 mg/10⁶ Zellen) eine Stunde lang bei 4°C inkubiert und nicht gebundener mAb wird mittels Waschen mit 1 % BSA/PBS entfernt. Die Temperatur wird auf 37°C eingestellt und nach 0, 1, 2, 4, 8 und 20 Stunden werden Teilproben zur Untersuchung entnommen. Die Zellen werden pelletiert und der Kulturüberstand wird zum Zählen aufbewahrt. Die Zellen werden zweimal mit Zincoption-Medium (pH 2) gewaschen; um die an die Oberfläche gebundene Aktivität zu bestimmen. An Protein gebundene Aktivität im Kulturüberstand wird mittels Fällen mit 12,5 % TCA oder bei Experimenten, die mit ²¹¹At verbunden sind, mit Methanol bestimmt. In Zellen internalisierte, auf der Zelloberfläche befindliche, im Überstand an Protein gebundene und im Überstand nicht an Protein gebundene Aktivitäten werden als Funktion der Zeit aufgetragen (Reist et al., 1995). 25 mM Chloroquin kann in das Inkubationsmedium einbezogen werden, um die Wirkung des Hemmens der lysosomalen Funktion auf die zelluläre Weiterverarbeitung markierter mAbs gegen EGFRvIII zu untersuchen (Press et al., 1990).
Beispiel 3
Bewertung der Zytotoxizität in vitro
Die Zytotoxizität von internalisierten mAbs, die mit β- oder α-Strahlern markiert sind, kann in vitro bewertet werden. Dosimetrieberechnungen deuten darauf hin, dass die Zytotoxizität von Auger-Elektronen, α-Teilchen und β-Teilchen, die von intrazellulären Zerfallsstellen emittiert werden, höher ist als die für solche, die auf der Zellmembran vorkommen, und experimentelle Daten, die in vitro mit einem mit ¹²⁵I markierten mAb gewonnen wurden, stimmen mit dieser Vorhersage überein (Goddu et al., 1994; Daghighian et al., 1996). Die Zytotoxizität von markierten mAbs und anderen Verbindungen für Tumorzellen wurde unter Einzelzellbedingungen (Strickland et al., 1994), als Mikrokolonien (Larsen et al., 1998) und in Sphäroiden (Hauck et al., 1998) untersucht.
Die Proliferationskapazität von EGFRvIII-positiven Zellen kann unter Verwendung eines Klonogenitätstests zur limitierenden Verdünnung bestimmt werden. Unter Verwendung dieses Testansatzes wurde die Zytotoxizität von m-[²¹¹At]Astatbenzylguanidin auf einen Anteil überlebender Zellen von 10^–5 veranschlagt (Strickland et al., 1994). Die bevorzugte Zelllinie ist U87MGΔEGFR, weil sie derzeit die wichtigste Linie, die zur Herstellung von EGFRvIII-positiven Xenotransplantaten in vivo verwendet wird, ist. Es können jedoch auch andere EGFRvIII exprimierende Zelllinien wie zum Beispiel HC2 20 d2, NR6M und D1105 untersucht werden, weil sie sich im Hinblick auf die Geschwindigkeit und das Ausmaß, womit sie mAbs gegen EGFRvIII internalisieren, unterscheiden (Reist et al., 1997). Bei dieser Untersuchung werden Zellen im exponentiellen Wachstum mechanisch gewonnen, in einem Hämozytometer gezählt und 30 Minuten lang bei 37°C mit unterschiedlichen Aktivitätskonzentrationen von markiertem mAb auf einem Drehschüttler inkubiert. Es wird eine Zelldichte von etwa 1 × 10⁶ Zellen/ml eingesetzt, um ein unspezifisches Abtöten aufgrund ungebundener Aktivität im Medium zu minimieren. Als unspezifische Kontrolle werden Inkubationen, bei denen mindestens ein 100facher Überschuss von unmarkiertem mAb zu den Zellen gegeben wurde, durchgeführt. Nach der Inkubation werden die Zellen 10 Minuten lang bei 100 g zentrifugiert und der Überstand wird abgesaugt. Das Pellet aus Zellen wird resuspendiert, der Waschvorgang wird wiederholt und die Zellen werden in einer Konzentration von 10⁶ Zellen/ml in Zinc-optionminimal-essential-Medium, das mit 15 % fetalem Kälberserum angereichert ist, resuspendiert. Die Zellen werden dann durch 9 fünffache fortlaufende Verdünnungen geschleust, was zu endgültigen Zellkonzentrationen von 10⁵ bis 0,256 pro Vertiefung ausplattierter Zellen führt. Es werden insgesamt sechs Vertiefungen zur Replikation für jede Zellkonzentration auf niedrig verdampfenden, mit Zellkultur behandelten Polystyren 96-Loch-Platten angefertigt. Nach einer 12-tägigen Inkubation bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator werden die Vertiefungen jeder Platte basierend auf dem Vorliegen oder der Abwesenheit von mindestens einer Klonkolonie mit 30 oder mehr Zellen entweder als wachstumspositiv oder als wachstumsnegativ gezählt. Der Mittelwert der Dosis-Wirkungs-Funktion für jede Therapie und die geschätzte Zahl klonbildender Einheiten pro ml werden unter Verwendung einer Spearmanschen Schätzung berechnet (Johnson und Brown, 1961). Die klonbildende Reaktion einer jeden Behandlungsgruppe wird dann, ausgedrückt als Prozentsatz von zwei unbehandelten Kontrollen, gegen die mittlere Aktivität, die pro ml hinzukommt, aufgetragen. Parallel dazu wird die Aufnahme und die Retention von Radioaktivität durch die Zellen, auf die abgezielt wird, sowohl auf der Zelloberfläche als auch in intrazellulären Kompartimenten gemessen, um eine Berechnung der Dosimetrie zu ermöglichen und um die mögliche Wirkung der Internalisierung auf die Zytotoxizität zu untersuchen. Die Stellen der intrazellulären Lokalisation werden mittels Immunfluoreszenzmikroskopie dokumentiert (Reist et al., 1995).
Beispiel 4
Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit in Xenotransplantatmodellen
Vor dem Beginn von Therapiestudien an tumortragenden Tieren werden die maximal tolerierte Dosis (MTD) und die LD₁₀ (Dosis, die für 10 % der Tiere tödlich ist) bestimmt. Normale, thymuslose Mäuse oder Ratten erhalten entweder Salzlösung oder markierten mAb in halblogarithmischen Steigerungsraten und werden dann auf Gewichtsverlust, neurologische Symptome oder Tod verfolgt. Das durchschnittliche Gewicht wird täglich überwacht und die Tiere werden innerhalb von 12 Stunden nach dem Tod einer Autopsie unterzogen, um nach histologischen Anhaltspunkten für eine Toxizität auf normale Organe zu suchen. Radiotherapieuntersuchungen an tumortragenden Tieren werden bei 80 % der MTD vorgenommen.
Subcutane Xenotransplantate. Diese Untersuchungen werden unter Anwendung früher beschriebener Protokolle (Schuster et al., 1991) vorgenommen. Mäuse mit progressiv wachsenden, subcutanen U87MGΔEGFR-Xenotransplantaten werden nach dem Zufallsprinzip in Gruppen von 10 Tieren aufgeteilt, wenn die Tumore 150-200 mm³ erreicht haben. Gruppen von 10 Tieren erhalten entweder Salzlösung, unmarkierten L8A4 oder zwei Aktivitätsmengen von markiertem L8A4 und P3X63Ag8 unspezifischem Kontroll-mAb. Die Reaktion wird im Hinblick auf Wachstumsverzögerung und Tumorregression bewertet. Wachstumsverzögerung ist als der Unterschied in Tagen zwischen den Zeitpunkten, an denen die Behandlungs- und Kontrollgruppen 1000, 2000, 3000, 4000 und 5000 mm³ erreichen, definiert. Tumorregression ist als zwei aufeinanderfolgende Messungen eines Volumens, das geringer ist als das Volumens des Tumors am Tag der Behandlung, definiert. Statistische Signifikanz wird unter Verwendung des Wilcoxon Rangsummentests bestimmt. Für Berechnungen der absorbierten Strahlendosis werden Gewebsverteilungen in Parallelgruppen von 5 Tieren, die therapeutische Dosen von markierten mAbs erhalten, gemessen. Diese Untersuchungen sind erforderlich, weil Verteilungsuntersuchungen des Niveaus der Spuren des mAb die vom Tumor aufgenommene Strahlendosis aufgrund eines schnellen Wachstums des Xenotransplantats unterbewerten können (Lee et al., 1988). Auf den Ergebnissen von Versuchen mit Einzeldo sen aufbauend können Therapiepläne mit mehreren Dosen wie beschrieben untersucht werden (Colapinto et al., 1990).
Intrakranielle Xenotransplantate. Das folgende Protokoll ist dem, über das früher berichtet wurde (Colapinto et al., 1990), ähnlich. Am Tag vor der Behandlung werden die Tiere nach ihrem Körpergewicht randomisiert und es werden pro Behandlungsgruppe 10 Mäuse verwendet. Fünf zusätzliche Mäuse werden am Tag der Behandlung getötet, um das Vorliegen von Tumoren zu bestätigen und um das durchschnittliche Tumorvolumen, das zu Beginn der Behandlung vorliegt, zu bestimmen. Die Versuche werden begonnen, wenn die Tumorgröße 15-20 mm³ beträgt. Die Tiere werden in Einzelkäfigen in einem bleiummantelten Raum gehalten und zweimal täglich auf Überleben überprüft. Beim Tod werden die Tiere untersucht, um das Vorliegen eines intrakraniellen Tumors zu bestätigen. Eine therapeutische Reaktion wird als Überlebensverlängerung unter Verwendung des Product-Limit-Schätzers von Kaplan und Meier (1958) berechnet.
Neoplastische Meningitis. Diese Untersuchungen können in einem Modell der neoplastischen Meningitis in thymuslosen Ratten in ähnlicher Weise wie solche, die in einer früheren Veröffentlichung (Zalutsky et al., 1994) beschrieben wurden, vorgenommen werden. Weiblichen, thymuslosen BIG:NIMR-rnu[SPF]-Ratten mit einem Gewicht von 200-250 mg werden subarachnoidale Katheter eingesetzt (Fuchs et al., 1990). Die Tiere werden mit Ketamin/Xylazin anästhesiert und in einen stereotaktischen Rahmen eingespannt. Es wird eine sagittale Mittellinieninzision von Inion zur Bogenplatte von C1 geführt, die atlanto-occipitale Membran wird dargestellt und die äußere Membran und die darunter liegende cistema magna dura werden unter Vergrößerung unter Verwendung eines Operationsmikroskops eröffnet. Ein PE-10-Katheter wird in den Subarachnoidalraum eingeführt und entlang der Hinterseite des Rückenmarks bis in die Lendenregion geführt. Nachdem der Katheter mit zahnärztlichem Epoxy an seinem Platz fixiert ist, wird er durch die Haut lateral des Schnittes ausgeführt und die Wunde wird verschlossen. Man lässt die Tiere sich erholen und nur diejenigen, die eine normale motorische und sensorische Funktion zeigen, werden verwendet. Neoplastische Meningitis wird ausgelöst, indem 5 × 10⁶ U87MGΔEGFR-Zellen in 40 μl durch den Katheter mit einer Hamilton-Spritze injiziert werden und die Therapiestudien werden 5-8 Tage später begonnen.
Gruppen von 10 Tieren erhalten entweder abgestufte Dosierungen von markierten Antikörpern oder Kontrollen. Eine therapeutische Reaktion wird als Überlebensverlängerung unter Verwendung des Product-Limit-Schätzers von Kaplan und Meier (1958) berechnet. Nach dem Tod werden die Wirbelsäule und der Schädel unversehrt entfernt und für die Histologie wie beschrieben (Zalutsky et al., 1994) weiterverarbeitet.
Beispiel 5
Quantitative Autoradiographie und Strahlungsdosimetrie
Quantitative Autoradiographie (QAR). QAR wird verwendet, um die regionale Verteilung von Radioaktivität innerhalb des Tumors und in benachbartem normalen Gewebe abzuschätzen. Wir haben QAR eingesetzt, um die Heterogenität der Abgabe von 81 C6 von der Maus in intrakraniellen und subcutanen D-54 MG Xenotransplantaten (Blasberg et al., 1987) zu untersuchen, und auch, um die Wirkungen von im Tumor lokalisierter Hyperthermie auf die Homogenität der Ablagerung von mAb in subcutanen Xenotransplantaten zu erforschen (Zalutsky et al., 1996). QAR wird in der Einzelmarkierungsausführung an Tieren, die entweder mit ¹²⁵I oder mit ²¹¹At markierten mAb erhalten, vorgenommen. Zu Zeitintervallen, die auf Untersuchungen der Verteilung im Gewebe beruhend ausgewählt sind, werden die Tiere getötet und die Tumore werden in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Tumore werden auf Planchettes in M-1 mounting Medium installiert und Schnitte von 20 μm werden schrittweise auf einem Kryomikrotom bei –20°C geschnitten. Die Schnitte werden auf Glasträger aufgebracht, auf einem Wärmegerät für Träger bei 65°C getrocknet und für einen Expositionszeitraum, der dem Aktivitätsgrad in Schnitt entspricht, in Filmkassetten eingebracht. Nach der Entwicklung des Films werden die Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und es wird ein Digitalbild zum Abgleich mit dem Autoradiographiebild angefertigt. Die Aktivitätskonzentration in den autoradiographierten Bereichen wird mittels Vergleich mit Standards, die bereitgestellt werden, indem bekannte Mengen von ¹²⁵I oder ²¹¹At zu Homogenat von Gehirn von Ratten, das gefroren und identisch wie die Tumorproben behandelt wird, gegeben werden, quantifiziert. Die Bildanalyse kann unter Verwendung eines Amersham RAS R-1000 Systems und des „in situ grain image analysis"-Programms, das von Loats Associates bezogen wurde, vorgenommen werden. Abhängig von der benötigten räum lichen Auflösung kann die Bildanalyse auch unter Verwendung eines Storm 860 Phosphoimagers durchgeführt werden.
Berechnungen der absorbierten Strahlendosis. Es kann ein modifizierter MIRD-Ansatz, bei dem eine gleichförmige Verteilung der Radioaktivität im Tumor angenommen wird, verwendet werden. Wie in einer neueren Übersicht über Dosimetrie von β-Teilchen bei experimentellen Tumoren vorgeschlagen wurde (Leichner und Kwok, 1993), sollte die Wirkung des absorbierten Anteils von β-Teilchen besonders bei kleinen Tumoren und heterogener Quellenverteilung innerhalb des Tumors, die mittels QAR bestimmt werden kann, in Betracht gezogen werden. Berechnungen für mit ²¹¹At markierte mAbs können wie beschrieben (Zalutsky et al., 1997) vorgenommen werden. Jedoch erfordert eine realistische Beurteilung der absorbierten Strahlendosis von ²¹¹At wegen der stochastischen Fluktuation der Dosis in kleinen Zielvolumina Berechnungen auf mikrodosimetrischem Niveau (Humm et al., 1993). Es wurde kürzlich ein Verfahren zum Berechnen der Dosimetrie von ²¹¹At in geringem Umfang unter Verwendung der Sehnenlängenverteilungen, die aus digitalisierten histologischen Bildern gewonnen werden, beschrieben (Akabani und Zalutsky, 1997).
Beispiel 6
Internalisierung und Retention von mAb L8A4, der unter Verwendung von SIPC mit ¹²⁵I oder ¹³¹I markiert ist
SIPC wurde mittels Ioddestannylierung von STPC unter Einsatz von N-Chlorsuccinimid als Oxidationsmittel mit ¹²⁵I oder ¹³¹I markiert (Garg et al., 1991). Nach einer 5-minütigen Reaktion bei 60-65°C und einer HPLC-Reinigung erhielt man das Produkt in einer Ausbeute von 60-80 %. Der Wirkungsgrad für das Markieren des mAb L8A4 mittels Reaktion mit SIPC betrug 52-71 % (Reist et al., 1996), Werte, die annährend das Doppelte von denen, die für die Konjugation von TCB an diesen mAb erhalten werden, betragen (Reist et al., 1995). Für L8A4, der unter Verwendung von SIPC markiert worden war, wurde mittels Größenausschluss-HPLC kein Nachweis einer Proteinaggregation beobachtet, während in den meisten der TCB-Zubereitungen 10-20% des Radioiods in Form von Aggregaten vorlagen. Die immunreaktiven Fraktionen von L8A4, der unter Verwendung von SIPC markiert worden war, waren höher als diejenigen, die man erhielt, wenn dieser mAb unter Verwendung von entweder Iodogen oder TCB markiert wurde. Es wurden Untersuchungen in vitro durchgeführt, um die Internalisierung und die zelluläre Weiterverarbeitung von L8A4, der unter Verwendung von Iodogen, SIPC und SIB (ein Reagens, das ähnlich wie SIPC die Deiodierung des mAb minimiert, aber im Unterschied zu SIPC nicht positiv geladen ist) markiert worden war, zu vergleichen. Die Verwendung von SIPC zum Markieren von L8A4 führte im Vergleich mit anderen Verfahren zu einer erheblich gesteigerten intrazellulären Retention von Radioaktivität mit einem begleitenden Rückgang der Zählimpulse im Überstand. Zum Beispiel wies nach einer Inkubation von 4 Stunden bei 37°C das intrazelluläre Kompartiment 24,0 ± 0,9 % der Aktivität für den mAb, der unter Verwendung von SIPC markiert worden war, auf, im Vergleich mit 13,2 ± 0,5 % mit SIB, während 12,2 ± 0,3 % (SIPC) und 36,1 ± 1,6 % (SIB) der Aktivität im Zellkulturüberstand gefunden wurden (2). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die verbesserte zelluläre Retention für mAb, der unter Verwendung von SIPC markiert wurde, nicht mit verminderter Deiodierung in Verbindung steht.
Beispiel 7
Internalisierung, Retention und Gewebsverteilung von L8A4, der unter Verwendung von SAPC mit ²¹¹At markiert ist
N-Succinimidyl-5-[²¹¹At]astat-3-pyridincarboxylat (SAPC) wurde aus STPC unter Einsatz von N-Chlorsuccinimid als Oxidationsmittel synthetisiert. Der Wirkungsgrad für das Markieren von L8A4 mit SAPC war mit dem, der mit SIPC beobachtet worden war, identisch. Für mit ²¹¹At markierten L8A4 betrugen die immunreaktiven Fraktionen 69-89 und die Affinität (K_A) zum Binden an die Zelllinie U87MGΔEGFR betrug (9,7 ± 1,3) × 10⁸ M^–1. Die Untersuchungen der Internalisierung und des Verarbeitens wurden wie für radioiodierte mAbs beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass an Protein gebundene Aktivität für ²¹¹At unter Einsatz von Methanol anstelle der TCA-Fällung gemessen wurde, weil wir feststellten, dass 98 % des freien [²¹¹At]Astatids im TCA-Test gefällt wurden. Es wurden an frühen Zeitpunkten vergleichbare Niveaus intrazellulärer Zählimpulse für ²¹¹At- und für ¹³¹I-markierten L8A4 beobachtet, aber es lagen höhere Niveaus von methanollöslicher Aktivität für ²¹¹At im Zellkulturüberstand vor, was auf eine schnellere Freisetzung von Kataboliten, die mit ²¹¹At markiert sind, hindeutet. Die Verteilung von mit ²¹¹At und mit ¹³¹I markiertem L8A4 wurde in thymuslosen Mäusen, die subcutane U87MGΔEGFR-Xenotransplantate trugen, bewertet. Beide Nuklide erhielten über die 6- bis 24-stündige Experimentalperiode konstante Spiegel im Tumor aufrecht, wobei für ²¹¹At eine leicht höhere Aufnahme beobachtet wurde (²¹¹At: 21,6 ± 2,7 % ID/g; ¹³¹I: 18,7 ± 2,4 % ID/g bei 12 Stunden). Die Spiegel von ²¹¹At waren in Milz, Lungen und Magen, Gewebearten, die bekanntermaßen [²¹¹At]Astatid anreichern (Garg et al., 1990), etwas höher als ¹³¹I.
Beispiel 8
Bindung und Internalisierung von mit einem positiv geladenen D-Aminosäurelinker markierten mAbs in vitro
Es wurde in vitro ein Test mit gepaarten Markern vorgenommen, um die Internalisierung und die zelluläre Weiterverarbeitung von mAb L8A4, der unter Verwendung von Iodogen mit ¹³¹I und unter Einsatz des Oligopeptid-Linker-Verfahrens dieser Erfindung mit ¹²⁵I markiert war, zu vergleichen. Der monoklonale Antikörper L8A4 wurde unter Verwendung des Oligopeptid-Linkers wie folgt markiert. Das Peptid α-N-Ac-D-Lys-D-Arg-D-Tyr-D-Arg-D-Arg (KRYRR) wurde von einem Labor für individuelle Synthesen bezogen und unter Einsatz des Iodogen-Verfahrens mit ¹²⁵I markiert. Es wurde Umkehrphasen-HPLC eingesetzt, um mit ¹²⁵I markiertes KRYRR mit einer Ausbeute von > 97 % zu isolieren und das markierte Peptid wurde durch Reaktionen mit Sulfo-SMCC bei Raumtemperatur 30 Minuten lang aktiviert. Gegen EGFRvIII gerichteter mAB L8A4 von der Maus wurde einer Reaktion mit 2-Iminothiolan unterzogen, um freie Thiolgruppen zu erzeugen, und dann einer Reaktion mit aktiviertem, mit ¹²⁵I markierten Peptid-L8A4 unterzogen. Das Konjugat wurde über eine Sephadex G-25-PD10-Säule isoliert. Die Ausbeute beträgt etwa 35 %.
Es wurde die EGFRvIII exprimierende Zelllinie U87MGΔEGFR verwendet und die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Internalisierte und gesamte an Zellen gebundene Zählimpulse waren zu den drei untersuchten Zeitpunkten mit dem Oligopeptid-Markierungsverfahren erheblicher höher; die Unterschiede zwischen den beiden Markie rungsverfahren nahmen mit der Zeit zu. Zum Beispiel war nach einer Inkubation von 24 Stunden bei 37°C der Prozentsatz der Aktivität, die als internalisierte Zählimpulse zurückgehalten wurde, mit dem Oligopeptid nahezu viermal höher (Iodogen: 5,0 ± 1,2 %; Oligopeptid: 18,8 ± 5,4 %). Gleichermaßen war zu diesem Zeitpunkt die gesamte, an Zellen gebundene (internalisiert + Zelloberfläche) Aktivität für mit ¹²⁵I markierten Oligopeptid-L8A4 5,3-mal höher (Iodogen: 11,1 ± 1,0 %; Peptid: 58,3 ± 12,4 %). Im Vergleich wurde, wenn das von Govindan et al. (1998) und von Stein et al. (1998) verwendete Peptid dazu eingesetzt wurde, einen internalisierenden mAb zu markieren, eine im Vergleich mit direkt markiertem mAb zwei- bis dreifache Steigerung der an Zellen gebundenen Aktivität beobachtet.
Beispiel 9
Aufnahme von mit einem positiv geladenen D-Aminosäurelinker markierten mAbs in Tumor
Die Gewebsverteilungen von L8A4 von der Maus, die unter Einsatz des Oligopeptidverfahrens mit ¹²⁵I und unter Verwendung von Iodogen mit ¹³¹I markiert worden waren, wurden in thymuslosen Mäusen, die subcutane, EGFRvIII exprimierende, U87MGΔEGFR-Xenotransplantate von einem Gliom vom Menschen trugen, direkt verglichen. Der monoklonale Antikörper L8A4 wurde wie in Beispiel 8 beschrieben markiert. Die Aufnahme der beiden markierten mAbs in den Tumor ist in 4 gezeigt. Zu allen Zeitpunkten wurden erheblich höhere Spiegel im Tumor beobachtet. Das Peptid-Markierungsverfahren steigerte die Retention der Aktivität von Radioiod im Tumor um 194 ± 38 % bei 12 Stunden, 296 ± 47 % bei 24 Stunden, 468 ± 91 % bei 36 Stunden, 542 ± 68 % bei 48 Stunden und 547 ± 69 % bei 72 Stunden. Im Vergleich steigerte das von Govindan et al. (1998) und von Stein et al. (1998) beschriebene Peptid die Aufnahme in den Tumor nur um 170 % bei 24 Stunden und 270 % bei 72 Stunden. Darüber hinaus war der Vorteil bei der Abgabe in den Tumor, der mit dem Oligopeptid-Verfahren erreicht wurde, beträchtlich größer als derjenige, der in früheren Untersuchungen mit dem Markieren von L8A4 von der Maus unter Einsatz von anderen Verfahren (TCB und SIPC), die zur Radioiodierung von internalisierenden mAbs entwickelt wurden, beobachtet wurde (Reist et al., 1995, 1996, 1997).
Beispiel 10
Aufnahme von Radioaktivität, die von mit einem positiv geladenen D-Aminosäurelinker markierten mAbs freigesetzt wird, in die Schilddrüse
Kumulation in der Schilddrüse wird im Allgemeinen als Indikator der Dehalogenierung von radioiodierten Verbindungen in vitro verwendet. Wie in 5 gezeigt, betrugen die Spiegel in der Schilddrüse für L8A4, der unter Einsatz des Oligopeptid-Verfahrens dieser Erfindung (wie in Beispiel 8 beschrieben) markiert worden war, bei 12, 24, 36, 48 beziehungsweise 72 Stunden 52 ± 9 %, 29 ± 5 %, 17 ± 1 %, 11 ± 1 % und 11 ± 2 % von denen für mAb, der unter Verwendung von Iodogen markiert worden war.
Beispiel 11
Verhältnis der Aufnahme von Radioaktivität in Tumor zu Blut aus mit einem positiv geladenen D-Aminosäurelinker markierten mAbs
Mit früheren Verfahren zum Markieren waren die Verhältnisse der Aufnahme in Tumor zu Blut niemals größer als 1 mit L8A4 von der Maus, der unter Verwendung von Iodogen markiert worden war (Reist et al., 1995). Im Gegensatz dazu stiegen die Verhältnisse von Tumor zu Blut für mAb, der unter Einsatz des Oligopeptid-Verfahrens dieser Erfindung (wie in Beispiel 8 beschrieben) markiert worden war, von 1,8 ± 0,6 bei 12 Stunden auf 7,2 ± 1,0 bei 72 Stunden an (6). Diese Verhältnisse waren erheblich höher als diejenigen, die mit anderen Verfahren zum Markieren, die zur Verwendung mit internalisierenden mAbs entwickelt worden waren, erreicht wurden (Reist et al., 1995, 1996, 1997).
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Claims

Zusammensetzung zum internen Markieren einer Zelle, umfassend: einen Liganden, der spezifisch an EGFRvIII bindet und von der Zelle internalisiert wird, wobei der Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, einem Fragment eines Antikörpers und einem synthetischen Polypeptid; ein Oligopeptid, das wenigstens einen positiv geladenen Aminosäurerest und wenigstens einen D-Aminosäurerest umfasst, wobei das Oligopeptid nicht zwei oder mehr aufeinanderfolgende L-Aminosäuren umfasst, wobei das Oligopeptid kovalent an den Liganden gebunden ist; und einen Marker, der kovalent an das Oligopeptid gebunden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die L-Aminosäuren, wenn das Oligopeptid zwei oder mehr L-Aminosäuren umfasst, durch ein oder mehr positiv geladene Aminosäuren voneinander getrennt sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Marker eine Gruppe der Formel (II) ist:
wobei X eine Funktion ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Amino-, Carboxyl- oder Sulfhydrylfunktion; wobei Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C und N; und wobei Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus F, Br, I, At und M(Alk)₃; wobei M ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Si, Sn und Hg; wobei Alk ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl und Hexyl.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei der Marker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 5-Iod-3-pyridincarboxylat, 3-Iodbenzoat, 3-(Tri-n-butylstannylbenzoat, 5-(Tri-n-butylstannyl-3-pyridincarboxylat und 5-Astat-3-pyridincarboxylat, 3-Iodanilin, 4-Iodanilin, 3-Astatanilin, 4-Astatanilin, 3-Tributylstannylanilin und 4-Tributylstannylanilin.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Ligand ein monoklonaler Antikörper ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Ligand ein chimärer rekombinanter Antikörper ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Ligand ein humanisierter Antikörper ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Ligand selektiv an eine Tumorzelle bindet.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Oligopeptid D-Tyr umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das Oligopeptid zusätzlich D-Arg umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das Oligopeptid zusätzlich wenigstens drei D-Arg-Reste umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Oligopeptid D-Lys umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei das Oligopeptid zusätzlich D-Arg umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei das Oligopeptid zusätzlich wenigstens drei D-Arg-Reste umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Marker ein Radionuklid umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei der Marker ein Radionuklid umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das Radionuklid ein Alpha-, Beta- oder Gammastrahler ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das Radionuklid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ¹⁸F, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ⁷⁷Br, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I und ²¹¹At.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Marker fluoreszierend ist.
In vitro-Verfahren zum Einbauen eines Markers in eine Zelle, umfassend den Schritt: In-Kontakt-Bringen der Zelle mit der Zusammensetzung nach Anspruch 1, wodurch der Marker in der Zelle internalisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Marker fluoreszierend ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Marker radioaktiv ist.
Verfahren nach Anspruch 20, ferner umfassend den Schritt des Nachweisens des Markers.
Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 16 bei der Herstellung eines Medikaments zum Lokalisieren von Tumorzellen in einem Säuger und zum Einbringen in den Körper eines Säugers, der Tumorzellen enthält; wobei der Körper mit einem Szintillationsdetektor gescannt werden kann, um ein Bild zu erzeugen, das die Tumorzellen im Körper des Säugers darstellt.
Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 16 bei der Herstellung eines Medikaments zur Radiotherapie.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei das Medikament zur Tumorbehandlung ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Oligopeptid wenigstens zwei positiv geladene Aminosäurereste umfasst.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Zusammensetzung ein Oligopeptid umfasst, das wenigstens zwei positiv geladene Aminosäurereste umfasst.
Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19 und 27 zur therapeutischen Verwendung.