JP2024502463A - 治療指数を改善するためのプラスミン耐性ペプチド - Google Patents

治療指数を改善するためのプラスミン耐性ペプチド Download PDF

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Abstract

本発明によれば、脳卒中を治療するための前述した活性薬剤Ｔａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃのバリアントが提供される。標的結合特性は、Ｃ末端にＬ－アミノ酸を含めることによって保持され、プラスミン耐性は、Ｄ－アミノ酸を含めることによって付与される。Ｄ－アミノ酸に関連する腎毒性は、Ｄ－アミノ酸を最小限の位置に含めること、及び／又はＤ－アミノ酸オキシダーゼの阻害剤と同時投与することによって軽減できる。得られた活性薬剤は、プラスミン消化による活性の顕著な低下なしに血栓溶解剤と同時に投与することを含むいくつかの利点を有する。得られた薬剤はまた、皮下、鼻腔内及び筋肉内などの静脈内注入の代替経路による投与、及び慢性疾患の治療のための複数回投与計画により適している。【選択図】図３４

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年７月１４日に出願された米国特許出願第６３／２２１，８７４号、２０２１年２月９日に出願された米国特許第６３／１４７，７１１号、及び２０２１年１月８日に出願された米国特許第６３／１３５，４９８号の優先権を主張し、それぞれの全体がすべての目的で参照により組み込まれる。
配列表
本出願は、２０２２年１月６日に作成されたファイル名が５７２７０３－ＳＱＬＩＳＴのテキストファイル（４２キロバイト）における配列を含み、それが参照によりここに組み込まれる。
Ｔａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃ(ＮＡ－１及びネリネチドとしても知られている）は、ＰＳＤ－９５を阻害することでＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸塩受容体（ＮＭＤＡＲ）及び神経型一酸化窒素合成酵素(ｎＮＯＳ）へのＰＳＤ－９５の結合を干渉し、脳虚血による興奮毒性を低下させる薬剤である。治療により、脳損傷及び神経変性疾患のモデルにおける梗塞サイズ及び機能障害が軽減される。Ｔａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃは、第ＩＩ相試験（ＷＯ２０１０１４４７２１；Ａａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８，８４６－８５０（２００２），Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．１１：９４２-９５０（２０１２））及び第ＩＩＩ相試験（Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ，Ｌａｎｃｅｔ３９５：８７８－８８７（２０２０））に成功した。
グリシンを除いて、すべての標準的なα－アミノ酸は、Ｌ－及びＤ－アミノ酸と呼ばれる他の互いに鏡像である２つの光学異性体のいずれかで存在することができる。タンパク質及びほとんどの天然ペプチドは、完全にＬ配置のアミノ酸で形成される。Ｄ－アミノ酸は、ごく少数の天然ペプチドで検出されている。これらのＤ－アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸が翻訳後修飾を受けるときに形成される。Ｄ－アミノ酸は自然界では希少であるため、一般に、少なくともＬ－アミノ酸と同程度でＬ－タンパク質によって認識されない。Ｄ－アミノ酸を単にＬに置き換えるだけでは、標的部位に対する側鎖の向きが変わるため、親分子の模倣物を作成するのに効果的ではない。Ｌ又はＤ－アミノ酸を置換し、アミノ酸の順序を逆にすると、親分子と同様の側鎖トポロジーが得られるが、左巻きヘリックスを採用する反転したアミドペプチド結合を有するのに対し、Ｌ－ペプチドは右巻きヘリックスを採用する。したがって、標的結合は依然として失われたり変更されたりする可能性がある。
２０２０年１月９日に出願された米国特許第６２／９５９，０９１号及び国際公開第２０２１１４０４８５号は、すべての目的のためにその全体が参照によりそれぞれ組み込まれる。
本発明は、活性薬剤を提供する。前記活性薬剤は、阻害剤ペプチドに結合した内在化ペプチド又はそのバリアントを含む。前記阻害剤ペプチドは、ＮＯＳ及び／又はＮＭＤＡＲ２ＢへのＰＳＤ－９５の結合を阻害する。前記内在化ペプチドは、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）を含むアミノ酸配列を有し、前記阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＥＳＤＶ（配列番号１４）を含む配列を有し、前記バリアントは、内在化ペプチド及び阻害剤ペプチドに合計最大５個までの置換又は欠失を有し、前記阻害剤ペプチドの少なくとも４個のＣ末端アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸であり、前記内在化ペプチドの全ての残基ではないが、少なくとも１つの残基は、Ｄ－アミノ酸である。
選択的に、前記内在化ペプチドのＣ末端が前記阻害剤ペプチドのＮ末端に結合されて融合ペプチドを形成する。選択的に、前記内在化ペプチドは、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）を含むアミノ酸配列を有し、前記阻害剤ペプチドは、ＩＥ［Ｓ／Ｔ］ＤＶ（配列番号４）を含む配列を有する。ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）の１－８、１－７、１－６、１－５、１－４、１－３又は１－２アミノ酸残基は、Ｄ－アミノ酸である。選択的に、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）の２－８、２－７、２－６、２－５、２－４、２－３残基は、Ｄ－アミノ酸である。選択的に、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）の３－８、３－７、３－６、３－５、３－４、４－８、４－７、４－６、４－５、５－８、５－７、５－６、６－８、６－７又は７－８個の残基は、Ｄ－アミノ酸である。選択的に、前記内在化ペプチドは、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１）を含み、その１－８、１－７、１－６、１－５、１－４、１－３又は１－２残基は、Ｄ－アミノ酸である。選択的に、前記内在化ペプチドの２－８、２－７、２－６、２－５、２－４又は２－３残基は、Ｄ－アミノ酸である。選択的に、前記内在化ペプチドの３－８、３－７、３－６、３－５、３－４、４－８、４－７、４－６、４－５、５－８、５－７、５－６、６－８、６－７又は７－８残基は、Ｄ－アミノ酸である。選択的に、前記内在化ペプチドは、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）を含み、その１－９、１－８、１－７、１－６、１－５、１－４、１－３、１－２残基は、Ｄ－アミノ酸である。選択的に、前記内在化ペプチドの２－９、２－８、２－７、２－６、２－５、２－４又は２－３残基は、Ｄ－アミノ酸である。選択的に、前記内在化ペプチドの３－９、３－８、３－７、３－６、３－５、３－４、４－９、４－８、４－７、４－６、４－５、５－９、５－８、５－７、５－６、６－９、６－８、６－７、７－９、７－８又は８－９残基は、Ｄ－アミノ酸である。選択的に、前記阻害剤ペプチドは、Ｃ末端に［Ｅ／Ｄ／Ｎ／Ｑ］－［Ｓ／Ｔ］－［Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｎ］－［Ｖ／Ｌ］（配列番号３）を含む。選択的に、前記阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＩ－Ｅ－［Ｓ／Ｔ］－Ｄ－Ｖ（配列番号４）を含む。選択的に、前記阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＩＥＳＤＶ（配列番号５）を含む。選択的に、前記阻害剤ペプチドの５個のＣ末端アミノ酸は、それぞれＬ－アミノ酸である。選択的に、前記阻害剤ペプチドは、ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号２）を含み、前記阻害剤ペプチドの各残基は、ＫがＬ又はＤ－アミノ酸であり得る以外、Ｌ－アミノ酸である。選択的に、前記内在化ペプチドは、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される１つ以上のアミノ酸によって互いに分離される少なくとも２つのＤ－アミノ酸を含む。選択的に、前記内在化ペプチドは、少なくとも３つのＤ－アミノ酸を含み、それぞれは、互いにＬ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される１つ以上のアミノ酸によって分離される。選択的に、少なくとも１つのＤ－アミノ酸は、Ｒ若しくはＫであるか、又はＲ若しくはＫ残基のすぐＣ末端側に位置する。選択的に、全てのＤ－アミノ酸は、Ｒ若しくはＫであるか、又はＲ若しくはＫ残基のすぐＣ末端側に位置する。選択的に、少なくとも１つのＤ－アミノ酸は、Ｒ若しくはＫではなく、かつＲ若しくはＫ残基のすぐＣ末端側に位置しない。選択的に、前記内在化ペプチドは、下記の配列の１つからなる又はそれを含むアミノ酸配列を有する。
ｙＧｒｋｋｒｒｑｒｒｒ（配列番号８８）
ＹＧｒｋｋｒｒＱｒｒｒ（配列番号８９）
ＹＧｒｋｋｒｒＱｒＲｒ（配列番号９０）
ＹＧｒＫＫＲｒＱｒＲｒ（配列番号９１）
ＹＧｒＫＫＲｒＱｒＲＲ（配列番号９２）
ＹＧｒＫＫＲｒＱＲｒＲ（配列番号９３）
ＹＧＲＫｋｒｒＱｒｒｒ（配列番号９４）
ＹＧＲＫｋＲｒＱｒｒＲＶ（配列番号９５）
ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒ（配列番号９６）
ｒｋｋｒｒｑｒｒｒ（配列番号９７）
ＲｋｋｒｒＱｒＲｒ（配列番号９８）
ＲｋｋｒｒＱｒｒＲ（配列番号９９）
ＲＫｋｒｒＱｒｒＲ（配列番号１００）
ｒＫＫＲｒＱｒＲｒ（配列番号１０１）
ＲＫｋＲｒＱｒｒＲ（配列番号１０２）
ｒＫＫＲｒＱｒＲＲ（配列番号１０３）
ｒＫＫＲｒＱＲＲＲ（配列番号１０４）
ｒＫＫＲＲＱｒＲＲ（配列番号１０５）
ＲＫＫＲｒＱｒＲＲ（配列番号１０６）
ＲＫＫＲＲＱｒＲＲ（配列番号１０７）
ｒＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１０８）
ＲＫＫＲｒＱＲＲＲ（配列番号１０９）
ここで、小文字は、Ｄ－アミノ酸、大文字は、Ｌ－アミノ酸を示す。
選択的に、上記の活性薬剤は、ＲｋｋｒｒＱｒＲｒＩＥＳＤＶ（配列番号１１０、ＮｏＮＯ４１１）、ＲＫｋＲｒＱｒｒＲＩＥＳＤＶ（配列番号１１１）若しくはｒＫＫＲｒＡｒＲＲＩＥＳＤＶ（配列番号１１２）からなるか、又はそれを含むアミノ酸配列を有する。
本発明によれば、阻害剤ペプチドに結合した内在化ペプチド又はそのバリアントを含む活性薬剤が提供される。前記阻害剤ペプチドは、ＮＯＳ及び／又はＮＭＤＡＲ２ＢへのＰＳＤ－９５の結合を阻害する。前記内在化ペプチドは、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）を含むアミノ酸配列を有する。前記阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＥＳＤＶ（配列番号１４）を含む配列を有し、前記バリアントは、前記内在化ペプチド及び阻害剤ペプチドに最大５個までの置換又は欠失を有し、前記阻害剤ペプチドの少なくとも４個のＣ末端アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸であり、前記内在化ペプチドの３－５残基は、Ｄ－アミノ酸である。選択的に、前記阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＩＥ［Ｓ／Ｔ］ＤＶ（配列番号４）を含み、ここで、ＩＥ［Ｓ／Ｔ］ＤＶ（配列番号４）は、Ｌ－アミノ酸である。選択的に、各Ｄ残基は、Ｋ若しくはＲ、又はＫ若しくはＲ残基のＣ末端である。選択的に、前記活性薬剤は、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される４つ以上の連続アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ又はＫから独立して選択される隣接アミノ酸を含む。選択的に、前記活性薬剤は、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される４つ以上の連続アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ又はＫから選択されるアミノ酸を含む。選択的に、前記活性薬剤は、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される５つ以上の連続アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ又はＫから独立して選択される隣接アミノ酸を含み、４つの前記連続アミノ酸のストレッチがある場合、前記ストレッチは、前記内在化ペプチドのＮ末端に位置する。選択的に、前記活性薬剤は、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される５つ以上の連続アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ又はＫから選択されるアミノ酸を含み、４つの前記連続アミノ酸のストレッチが存在する場合、前記ストレッチは、内在化ペプチドのＮ末端に位置する。選択的に、前記内在化ペプチドは、Ｎ末端から番号付けされて３位～５位の間にあるＤ残基、７位又は８位にあるＤ残基、及び９位～１１位の間にあるＤ残基の３つのＤ残基を有するＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する。選択的に、前記阻害剤ペプチドは、スペーサを介して前記内在化ペプチドに結合される。選択的に、前記スペーサは、ペプチドである。選択的に、前記スペーサは、２－４個の残基のペプチドである。選択的に、前記スペーサは、リジン又はアルギニン残基を欠く。選択的に、前記スペーサは、グリシン、アラニン、セリン及びロイシン（それぞれＬ型である）から独立して選択される１つ以上の残基を含む。選択的に、前記スペーサは、ＫＬＳＳ（配列番号１１３）であり、ここで、Ｋ及び／又はＬは、Ｄ型である。
本発明によれば、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号５８）を含むか若しくはそれを含むアミノ酸配列、又は前記配列に最大５個までの欠失又は付加を有するそのバリアント（５個のＣ末端アミノ酸以外の位置にある３－５アミノ酸は、Ｄ－アミノ酸である）を有する活性薬剤；或いは配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号５８）と少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であって、５個のＣ末端アミノ酸以外の位置にある３－５個のアミノ酸はＤ－アミノ酸であるアミノ酸配列を有する活性薬剤が提供される。選択的に、活性薬剤における隣接位置を占めるＤ－アミノ酸がない。選択的に、各Ｄ－アミノ酸と別のＤ－アミノ酸とは、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから選択される少なくとも２つのアミノ酸によって分離される。選択的に、各Ｄ－アミノ酸と別のＤ－アミノ酸とは、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される少なくとも３つのアミノ酸によって分離される。選択的に、前記活性薬剤は、４つのＤ－アミノ酸を含む。選択的に、前記活性薬剤は、３つのＤ－アミノ酸を含む。選択的に、前記活性薬剤は、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される４つ以上の連続アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ及びＫから独立して選択される２つの隣接アミノ酸を含む。選択的に、前記活性薬剤は、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される４つ以上の連続アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ又はＫから選択されるアミノ酸を含む。選択的に、前記活性薬剤は、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される５つ以上の連続アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ及びＫから独立して選択される２つの隣接アミノ酸を含み、４つの前記連続アミノ酸のストレッチが存在する場合、前記ストレッチは、前記活性薬剤のＮ末端に位置する。選択的に、前記活性薬剤は、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される５つ以上の連続アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ又はＫから選択されるアミノ酸を含み、４つの前記連続アミノ酸のストレッチが存在する場合、前記ストレッチは、前記内在化ペプチドのＮ末端に存在する。選択的に、前記活性薬剤は、３又は４個のＤ－アミノ酸を含み、第１のＤ－アミノ酸が３位～５位の間にあり、第２のＤ－アミノ酸が７位又は８位にあり、第３のＤ－アミノ酸が９位～１１位の間にあり、選択的に第４のＤ－アミノ酸が１２位又は１３位にある。選択的に、前記活性薬剤は、阻害剤ペプチドの少なくとも２コピーを含む。選択的に、前記阻害剤ペプチドの２コピーは、分岐リンカーを介して内在化ペプチドに結合される。選択的に、前記活性薬剤は、ＹＧｒＫＫＲｒＱｒＲＲｋＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号１１４）、ＹＧＲｋＫＲｒＱＲｒＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号１１５）又はＹＧｒＫＫＲｒＱｒＲＲＫｌＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号１１６）を含むか又はそれからなるアミノ酸配列を含む。
選択的に、前記活性薬剤は、ネリネチドと比較して向上したプラスミン耐性を有する。選択的に、前記活性薬剤は、ネリネチドと比較して向上した血漿半減期を有する。選択的に、前記活性薬剤は、ＰＳＤ－９５との結合についてネリネチドと競合する。選択的に、前記活性薬剤は、
配列ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号２）の阻害剤ペプチドに結合した配列ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒ（配列番号９６）の内在化ペプチドを含み、前記内在化ペプチドの各アミノ酸（グリシンを除き）がＤ－アミノ酸であり、前記阻害剤ペプチドの各アミノ酸がＬ－アミノ酸である活性薬剤；及び／又はｋｌｓｓＩＥＳＤＶ（配列番号１１７）（小文字がＤ－アミノ酸を示し、大文字がＬ－アミノ酸を示す）に結合した配列ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒ（配列番号９６）の内在化ペプチドを含み、前記内在化ペプチドの各アミノ酸（グリシンを除き）がＤ－アミノ酸である活性薬剤；及び／又はアミノ酸配列ｖｄｓｅｉｓｓｌｋｒｒｒｑｒｒｋｋｒｇｙ（配列番号１１８）（小文字がＤ－アミノ酸を示す）を有する活性薬剤；と比較して低下した腎毒性及び／又はより高い治療指数を示す。選択的に、前記活性薬剤は、ＰＳＤ－９５に対する結合親和性がネリネチドの２倍以内である。選択的に、前記活性薬剤は、ＮＭＤＡＲ２ＢへのＰＳＤ－９５の結合を阻害するＩＣ５０がＴａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃの２倍以内である。選択的に、前記活性薬剤は、（例えば、皮下投与の場合）ネリネチドよりも高い曲線下面積（ＡＵＣ）又はＣＭａｘを有する。
選択的に、前記活性薬剤は、塩化物塩である。
本発明によれば、ヒスチジン、トレハロース、及び選択的に安息香酸ナトリウムを有する活性薬剤の製剤がさらに提供される。本発明によれば、リン酸緩衝液及び選択的に安息香酸ナトリウムを有する活性薬剤の製剤がさらに提供される。
本発明によれば、活性薬剤及び抗炎症薬を含む共製剤がさらに提供される。選択的に、前記抗炎症薬は、肥満細胞脱顆粒阻害剤又は抗ヒスタミン薬である。
本発明によれば、活性薬剤及び血栓溶解剤を含む共製剤がさらに提供される。
本発明によれば、上記の活性薬剤及びＤ－アミノ酸オキシダーゼ及び阻害剤を含む共製剤がさらに提供される。選択的に、前記Ｄ－アミノ酸オキシダーゼの阻害剤は、リスペリドン、安息香酸ナトリウム又は５－クロロ－ベンゾ［ｄ］イソオキサゾール－３－オールである。
本発明によれば、脳卒中、脳虚血、ＣＮＳの外傷性損傷、脳震盪、再灌流傷害、くも膜下出血、痛み、不安、てんかん又は神経変性疾患から選択される病状に罹患しているか又は罹患するリスクがある対象を治療する方法であって、有効な投与計画の活性薬剤又は上記の製剤を前記対象に投与することを含む方法がさらに提供される。選択的に、前記方法は、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ活性の阻害剤を投与することをさらに含む。
本発明によれば、脳卒中に罹患しているか又は罹患するリスクがある対象の虚血性脳卒中を治療する方法であって、有効な投与計画の上記の活性薬剤又は製剤を前記対象に投与することを含み、前記に血栓溶解剤が共投与され、前記活性薬剤及び血栓溶解剤は、血栓溶解剤によって誘導される活性薬剤の切断が前記活性薬剤におけるＤ－アミノ酸の含有によって低減されるのに十分に短い投与間隔で投与される方法がさらに提供される。選択的に、前記方法は、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ活性の阻害剤を投与することをさらに含む。選択的に、前記血栓溶解剤は、前記活性薬剤が投与される前の６０、３０又は１５分間のウィンドウ以内で投与される。選択的に、前記活性薬剤及び血栓溶解剤は、同時に投与される。
本発明によれば、活性薬剤又は製剤を対象に送達する方法であって、前記活性薬剤を非静脈経路により投与することを含み、前記活性薬剤は、治療レベルで血漿に送達される方法がさらに提供される。選択的に、前記活性薬剤は、皮下投与される。選択的に、前記活性薬剤は、筋肉内投与される。選択的に、前記活性薬剤は、鼻腔内又は肺内投与される。選択的に、用量は、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇを超える。選択的に、前記用量は、１０ｍｇ／ｋｇ未満であり、前記活性薬剤は、肥満細胞脱顆粒阻害剤又は抗ヒスタミン剤の共投与なしで投与される。選択的に、前記用量は、１０ｍｇ／ｋｇを超え、前記活性薬剤は、肥満細胞脱顆粒阻害剤又は抗ヒスタミン剤と共に投与される。選択的に、前記対象は、脳卒中、脳虚血、ＣＮＳの外傷性損傷、脳震盪、再灌流傷害、痛み、不安、てんかん、くも膜下出血又は神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病又はパーキンソン病）から選択される病状に罹患しているか又は罹患するリスクがある。
本発明によれば、脳卒中、脳虚血、ＣＮＳの外傷性損傷、くも膜下出血、痛み、不安、てんかんから選択される病状に罹患しているか又は罹患するリスクがある対象を治療する方法がさらに提供される。この方法は、有効な投与計画の活性薬剤及びＤ－アミノ酸オキシダーゼ活性の阻害剤を前記対象に投与することを含む。前記活性薬剤は、阻害剤ペプチドに結合した内在化ペプチド又はそのバリアントを含み、前記阻害剤ペプチドは、ＮＯＳ及び／又はＮＭＤＡＲ２ＢへのＰＳＤ－９５の結合を阻害し、前記内在化ペプチドは、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）を含むアミノ酸配列を有し、前記阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＥＳＤＶ（配列番号１４）を含む配列を有し、前記バリアントは、前記内在化ペプチド及び阻害剤ペプチドに５個までの置換又は欠失を含み、前記阻害剤ペプチドの少なくとも４個のＣ末端アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸であり、前記内在化ペプチドの少なくとも１つの残基は、Ｄ－アミノ酸である。本発明によれば、脳卒中に罹患しているか又は罹患するリスクがある対象の虚血性脳卒中を治療する方法がさらに提供される。この方法は、有効な投与計画の活性薬剤及びＤ－アミノ酸オキシダーゼ活性の阻害剤を前記対象に投与することを含み、前記対象に血栓溶解剤が共投与される。前記活性薬剤は、阻害剤ペプチドに結合した内在化ペプチド又はそのバリアントを含み、前記阻害剤ペプチドは、ＮＯＳへのＰＳＤ－９５の結合を阻害し、前記内在化ペプチドは、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）を含むアミノ酸配列を有し、前記阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＥＳＤＶ（配列番号１４）を含む配列を有し、前記バリアントは、前記内在化ペプチド及び阻害剤ペプチドに５個までの置換又は欠失を含み、前記阻害剤ペプチドの少なくとも４個のＣ末端アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸であり、前記内在化ペプチドの少なくとも１つの残基は、Ｄ－アミノ酸である。前記活性薬剤及び血栓溶解剤は、血栓溶解剤によって誘導される活性薬剤の切断が前記活性薬剤におけるＤ－アミノ酸の含有によって低減されるのに十分に短い投与間隔で投与される。選択的に、このような方法において、前記活性薬剤は、阻害剤ペプチドに結合した内在化ペプチド又はそのバリアントを含み、前記阻害剤ペプチドは、ＮＯＳへのＰＳＤ－９５の結合を阻害し、前記内在化ペプチドは、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有し、前記阻害剤ペプチドは、ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号２）を含む配列を有し、前記バリアントは、前記内在化ペプチド及び阻害剤ペプチドに５個までの置換又は欠失があり、前記阻害剤ペプチドの少なくとも４個のＣ末端アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸であり、Ｒ及びＫ残基の全てを含むアミノ酸の連続セグメントは、Ｄ－アミノ酸である。
前記活性薬剤は、阻害剤ペプチドに結合した内在化ペプチド又はそのバリアントを含む。前記阻害剤ペプチドは、ＮＯＳ及び／又はＮＭＤＡＲ２ＢへのＰＳＤ－９５の結合を阻害する。前記内在化ペプチドは、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ(配列番号１）を含むアミノ酸配列を有し、前記阻害剤ペプチドは、ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ(配列番号２）を含む配列を有する。前記バリアントは、内在化ペプチド及び阻害剤ペプチドに、合計最大で５個までの置換若しくは欠失がある。阻害剤ペプチドの少なくとも４個のＣ末端アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸であり、Ｒ及びＫ残基を含むアミノ酸の連続セグメントは、Ｄ－アミノ酸である。選択的に、最もＣ末端のＲ又はＫ残基のすぐ隣のＣ末端の残基もD－残基である。選択的に、内在化ペプチドのＣ末端は、阻害剤ペプチドのＮ末端に結合して融合ペプチドを形成する。選択的に、阻害剤ペプチドは、Ｃ末端に［Ｅ／Ｄ／Ｎ／Ｑ］－［Ｓ／Ｔ］－［Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｎ］－［Ｖ／Ｌ］(配列番号３）を含む。選択的に、阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＩ－Ｅ－［Ｓ／Ｔ］－Ｄ－Ｖ(配列番号４）を含む。選択的に、阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＩＥＳＤＶ(配列番号５）を含む。
選択的に、阻害剤ペプチドの５個のＣ末端アミノ酸は、それぞれＬ－アミノ酸である。選択的に、活性薬剤の他の各残基は、Ｄ－アミノ酸である。選択的に、活性薬剤は、ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋｌｓｓＩＥＳＤＶ（配列番号６）、ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋｓｓＩＥＳＤＶ（配列番号７）、ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋｓＩＥＳＤＶ（配列番号８）又はｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋＩＥＳＤＶ（配列番号９）のアミノ酸配列を有する。選択的に、活性薬剤は、ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋｌｓｓＩＥＳＤＶ（配列番号６）のアミノ酸配列を有し、ここで、小文字はＤ－アミノ酸、大文字はＬ－アミノ酸である（グリシンはキラル型を持たず、大文字又は小文字で表すことができるグリシンを除く）。
選択的に、前記活性薬剤は、血漿中の安定性がネリネチドよりも高い。選択的に、前記活性薬剤は、プラスミン耐性がネリネチドよりも高い。選択的に、前記活性薬剤は、ＰＳＤ－９５に対する結合親和性がネリネチドの２倍以内である。選択的に、前記活性薬剤は、ＮＭＤＡＲ２ＢへのＰＳＤ－９５の結合を阻害するＩＣ５０がネリネチドの２倍以内である。
選択的に、活性薬剤は、塩化物塩である。
本発明によれば、ヒスチジン及びトレハロースをさらに含む上記のいずれか１つの前記活性薬剤の製剤がさらに提供される。
本発明によれば、リン酸緩衝液をさらに含む上記のいずれか１つの活性薬剤の製剤がさらに提供される。
本発明によれば、上記のいずれか１つの活性薬剤と、抗炎症薬とを含む共製剤がさらに提供される。選択的に、前記抗炎症薬は、肥満細胞脱顆粒阻害剤又は抗ヒスタミン薬である。
本発明によれば、上記のいずれか１つの活性薬剤と、血栓溶解剤とを含む共製剤がさらに提供される。
本発明によれば、対象に有効な投与計画のいずれかの上記活性薬剤を投与することを含む、脳卒中、脳虚血、ＣＮＳの外傷性損傷、くも膜下出血、痛み、不安、てんかんから選択される症状に罹患しているか又は罹患するリスクがある対象を治療する方法がさらに提供される。
本発明によれば、脳卒中に罹患しているか又は罹患するリスクがある患者の虚血性脳卒中を治療する方法がさらに提供される。この方法は、前記対象に有効な投与計画の活性薬剤を投与することを含み、ここで、前記対象に血栓溶解剤を共投与する。前記活性薬剤は、阻害剤ペプチドに結合した内在化ペプチドを含み、前記阻害剤ペプチドは、ＮＯＳ及び／又はＮＭＤＡＲ２ＢへのＰＳＤ－９５を阻害する。阻害剤ペプチドの少なくとも４個のＣ末端アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸であり、活性薬剤の残りのアミノ酸の少なくとも１つは、Ｄ－アミノ酸である。活性薬剤及び血栓溶解剤は、血栓溶解剤によって誘導される活性薬剤の切断が少なくとも１つのＤ－アミノ酸の含有によって低減されるのに十分に短い投与間隔で投与される。選択的に、内在化ペプチドは、そのＮ末端で阻害剤ペプチドのＣ末端に結合されて融合タンパク質を形成する。選択的に、阻害剤ペプチドは、［Ｅ／Ｄ／Ｎ／Ｑ］－［Ｓ／Ｔ］－［Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｎ］－［Ｖ／Ｌ］（配列番号３）を最後の４つの残基として含む。選択的に、阻害剤ペプチドは、［Ｉ］－［Ｅ／Ｄ／Ｎ／Ｑ］－［Ｓ／Ｔ］－［Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｎ］－［Ｖ／Ｌ］（配列番号１０）をそれぞれＬ－アミノ酸である最後の５つの残基として含む。選択的に、内在化ペプチドは、ｔａｔペプチドである。選択的に、ｔａｔペプチド少なくとも８つの残基は、Ｄ－アミノ酸である。選択的に、ｔａｔペプチドのそれぞれの残基は、Ｄ－アミノ酸である。選択的に、内在化ペプチドは、Ｎ末端で阻害剤ペプチドとしてのＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号２）又はＫＬＳＳＩＥＴＤＶ（配列番号１２）に結合して融合タンパク質を形成するＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１）を含む。選択的に、活性薬剤は、Ｋ残基及びＲ残基のそれぞれを含むD－残基の連続セグメントを含む。選択的に、活性薬剤は、ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋｌｓｓＩＥＳＤＶ（配列番号６）を含み、小文字はＤ－アミノ酸（グリシン以外）を表し、大文字はＬ－アミノ酸を表す。選択的に、血栓溶解剤は、活性薬剤の６０分間、３０分間又は１５分間前のウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ）内で投与される。選択的に、活性薬剤及び血栓溶解剤は、同時に投与される。
本発明によれば、対象に活性薬剤を送達する方法がさらに提供される。この方法は、非静脈経路を介して上述した活性薬剤を投与することを含む。活性薬剤は、治療レベルで血漿に送達される。選択的に、活性薬剤は、皮下投与される。選択的に、活性薬剤は、筋肉内投与される。選択的に、活性薬剤は、鼻腔内又は肺内投与される。選択的に、用量は３ｍｇ／ｋｇを超える。選択的に、用量は１０ｍｇ／ｋｇを超える。選択的に、用量は２０ｍｇ／ｋｇを超える。選択的に、用量は１０ｍｇ／ｋｇ未満であり、バリアントは、肥満細胞脱顆粒阻害剤又は抗ヒスタミン薬の共投与がなしで投与される。選択的に、用量は１０ｍｇ／ｋｇを超え、バリアントは投与される。選択的に、前記対象は、脳卒中、脳虚血、ＣＮＳの外傷性損傷、痛み、不安、てんかん、くも膜下出血、アルツハイマー病及びパーキンソン病から選択される疾患に罹患しているか又は罹患するリスクがある。
本発明によれば、障害の治療に有用な薬剤に結合した内在化ペプチド又はそのバリアントを含むキメラ薬剤であって、前記内在化ペプチドは、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）を含むアミノ酸配列を有し、前記バリアントは、１、２又は３個までの置換又は欠失（同じアミノ酸のＬからＤへの置換は含まない）を有し、前記内在化ペプチドの３－５残基は、Ｄ－アミノ酸であるキメラ薬剤がさらに提供される。
ＮＡ－１上のプラスミン切断部位（配列番号５８）。
ｒｔ－ＰＡと同時に投与する場合、ラット血漿中のＮＡ－１含有量は顕著に減少する。
ｒｔ－ＰＡと同時に投与する場合、ヒト血漿中のＮＡ－１含有量は顕著に減少する。
ｒｔ－ＰＡ（５．４ｍｇ／ｋｇ）と同時に投与する場合、ＮＡ－１ Ｃｍａｘ及びＡＵＣは顕著に減少する。
Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＮＲ２Ｂ９ｃはＮＡ－１と比較して、ｒｔ－ＰＡの存在下でラット血漿中で優れた安定性を示す。
Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＮＲ２Ｂ９ｃは、ヒト血漿にｒｔ－ＰＡを注入する際にタンパク質分解に耐性を有する。
ＴＮＫと同時に投与する場合、ヒト血漿中のＮＡ－１含有量は減少するが、Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＮＲ２Ｂ９ｃ含有量は維持される。
ＴＮＫと同時に投与する場合、ラット血漿中のＮＡ－１含有量は減少するが、Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＮＲ２Ｂ９ｃ含有量は維持される。
Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＮＲ２Ｂ９ｃはＰＢＳ培地中でのプラスミン切断に耐性を有する。
結果として、Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＮＲ２Ｂ９ｃは、ラット脳ライセート内で形成されたＮＲ２Ｂ：ＰＳＤ９５複合体を解離する。
Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＮＲ２Ｂ９ｃ及びＤ－Ｔａｔ－Ｌ－ＩＥＳＤＶ（配列番号６）は、標的タンパク質ＰＳＤ９５－ＰＤＺ２に効果的に結合する。
結果として、ＮＡ－１及びＤ－Ｔａｔ－Ｌ－ＮＲ２Ｂ９ｃは、ＰＳＤ９５－ＰＤＺ２ドメインに対して高い結合親和性を有する。
皮下ＮＡ－１は、ＩＶ ＮＡ－１と類似した血漿曝露を達成した。
皮下ＮＡ－３（Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＩＥＳＤＶ 配列番号６）は、皮下ＮＡ－１と比較してより高い血漿濃度及びより多い血漿曝露を達成した。
図１５Ａ（表）及び図１５Ｂ（グラフ）は、皮下ＮＡ－３（Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＩＥＳＤＶ 配列番号６）がＳＱ ＮＡ－１と比較してよりも多い血漿曝露を達成したことを示す。
Ｄ－ＮＡ－１及びＮＡ－３（Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＩＥＳＤＶ 配列番号６）の肺内点滴注入は、肺内ＮＡ－１と比較してより高い血漿濃度及びより多い血漿曝露を達成した。
８．３ｍｇ／ｋｇ又は２．８ｍｇ／ｋｇの用量でＮＡ－３（Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＩＥＳＤＶ配列番号６）を皮下投与した後、ヒスタミン放出が顕著に減少した。
Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＮＲ２Ｂ９ｃ（７．６ｍｇ／ｋｇ）とロドキサミド（０．６ｍｇ／ｋｇ）の共製剤を静脈内投与した後、顕著なヒスタミン放出がなかった。
脳卒中発症の１時間後のＤ－Ｔａｔ－Ｌ－ＮＲ２Ｂ９ｃ及びロドキサミドの静脈内投与は、ｅＭＣＡｏモデル動物の梗塞体積及び半球腫脹を減少させた。
Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＮＲ２Ｂ９ｃ及びロドキサミドの投与は、脳卒中発症の２４時間後に神経学的転帰を改善した。
梗塞体積に対する皮下ＮＡ－３及びネリネチドの効果。
皮下投与後の１５分間時点でのネリネチド及びＮＡ－３の血漿濃度。
ネリネチドＩＶ注入と比較して、２５ｍｇ／ｋｇの皮下ＮＡ－３は、より高いＣｍａｘ及びＡＵＣをもたらした。
皮下投与後のＮＡ－３の薬物動態プロファイル。
ＮＨＰ ＮＡ－３薬物動態研究における実験動物の生理学的パラメータを示す。
図２６Ａ及び２６Ｂは、ＮＡ－３ ＳＱ（２５ ｍｇ／ｋｇ）投与後、（Ａ）ＢＵＮ 及びクレアチン及び（Ｂ）その他の腎機能バイオマーカーのレベルが上昇したことを示す。
用量の減量、Ｄ－アミノ酸含有量の減少、及びＤＡＡＯ阻害はすべてクレアチニンレベルを低下させることを示す。
用量の減少、Ｄ－アミノ酸含有量の減少、及びＤＡＡＯ阻害はすべてＢＵＮレベルを低下させることを示す。
少量のＤ－アミノ酸を含むＰＳＤ－９５阻害剤は、プラスミンに対する耐性を与える可能性がある。ＮｏＮＯ４１１：ＲｋｋｒｒＱｒＲｒＩＥＳＤＶ（配列番号１１０）、ＮｏＮＯ４１４：ＲＫｋＲｒＱｒｒＲＩＥＳＤＶ（配列番号１１１）、ＮｏＮＯ４１５：ｒＫＫＲｒＱｒＲＲＩＥＳＤＶ（配列番号１３４）。
図３０Ａ及び３０Ｂは、ネリネチドがラットｔＭＣＡｏモデルにおいて少なくとも０．２５～２５ｍｇ／ｋｇの用量範囲にわたって（Ａ）梗塞サイズの縮小、及び（Ｂ）神経学的欠損の軽減において有効であることを示す。
ネリネチド及びＰＳＤ－９５ドメイン２への結合に関してビオチン化ネリネチドと競合するＤ－アミノ酸を含むその他のペプチドを示す。
ネリネチドと比較して様々な用量のＮｏＮＯ４２をＩＶ投与したラットの血漿濃度を示す。
ネリネチドと比較して様々な用量のＮｏＮＯ４２で治療したラットの血圧と時間の関係を示す。
ネリネチドと比較して様々な用量のＮｏＮＯ４２で治療したラットの体重変化を示す。
定義
「医薬製剤」又は組成物は、活性薬剤が有効であり、その製剤を投与する対象にとって毒である追加の構成成分を含まない調製品である。
大文字の１文字のアミノ酸コードの使用は、文脈で別段の指示がない限り、Ｄ－又はＬ－アミノ酸のいずれかを指すことができる。小文字の１文字コードは、Ｄ－アミノ酸を示すために使用される。グリシンにはＤ型とＬ型がないため、大文字及び小文字で交換可能に表すことができる。ペプチドが定義された数のＤ－アミノ酸を含むと言われる場合、グリシンはこのようなＤ－アミノ酸の数に含まれない。ペプチドが連続したＬ－アミノ酸のストレッチを有すると言われる場合、そのストレッチはＤ－アミノ酸によって中断されないことを意味するが、特に明記しない限り、アミノ酸のストレッチにはグリシンが含まれる場合がある。このようなストレッチは、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択されるアミノ酸の連続ストレッチとも呼ばれる。
濃度又はｐＨ等の数値は、値を測定可能な精度を反映している許容範囲内で与えられる。文脈上別段の解釈を要する場合を除き、微小な値は、最も近い整数に丸められる。文脈上別段の解釈を要する場合を除き、値の範囲の説明は、任意の整数、又は、使用可能な範囲内のサブ範囲を意味する。
用語「疾患」及び「状態」は、対象の正常構造又は機能に関する任意の破壊又は停止を示すものとして同義的に用いられる。
明示の用量は、一般的な病院の設備で用量を計量することができる精度に固有の誤差を含むものとして理解すべきである。
「単離」又は「精製」との用語は、対象種（例えばペプチド）が、対象種を含有する天然源由来の試料などの、試料に存在する混入物質から精製されていることを意味する。対象種が、単離又は精製された場合、それは試料における主たる高分子（例えばポリペプチド）種であり（つまり、モル基準で、その組成物において他の個々の種のどれよりも多い）、好ましくは、対象種は、存在する全高分子種の少なくとも５０％（モル基準）を含む。一般に、単離された、精製された又は実質的に純粋な組成物は、組成物に存在する全高分子種の８０～９０％よりも多くを含む。より好ましくは、対象種は、組成物が本質的に単一の高分子種で構成される、本質的な均一度（つまり、従来の検出法で組成物中の混入種を検出することができない）にまで、精製される。単離された又は精製されたという用語は、単離された種との組み合わせで作用するように意図された他の成分の存在を、必ずしも排除するものではない。例えば、内在化ペプチドは、活性ペプチドに連結されるにもかかわらず、単離されていると記載される。
「ペプチド模倣体」は、天然アミノ酸で構成されるペプチドと実質的に同じ構造及び／又は機能特性を有する、合成の化学物質を指す。ペプチド模倣体は、完全に合成の非天然のアミノ酸アナログを包含することができ、又は、部分的に天然のペプチドアミノ酸と部分的に非天然のアミノ酸アナログとのキメラ分子であり得る。ペプチド模倣体は、また、天然アミノ酸の保存的置換を、その置換が模倣体の構造及び／又は阻害活性もしくは結合活性を実質的に変更することもない限り、いくらでも取り込むことができる。ポリペプチド模倣組成物は、一般に次の３つの構造群に由来する非天然の構造成分の、あらゆる組み合わせを含有することができる：ａ）天然のアミド結合（「ペプチド結合」）連結以外の残基連結群；ｂ）天然に存在するアミノ酸残基に代わる非天然残基；又は、ｃ）２次構造模倣を誘導する残基、つまり、例えば、ベータターン、ガンマターン、ベータシート、アルファへリックスコンホメーションなどの２次構造を誘導又は安定化する残基。活性ペプチド及び内在化ペプチドを含むキメラペプチドのペプチド模倣体において、活性部分及び内在化部分の一方又は両方は、ペプチド模倣体であり得る。
特異的結合」の用語は、２つの分子、例えばリガンド及び受容体、の間の結合であって、多くの他の様々な分子が存在するときでも、一方の分子（リガンド）が他方の特異的分子（受容体）に会合する能力、つまり、分子の異種混合物における１つの分子の他の分子に対する優先的結合を示す能力、によって特徴付けられる結合を指す。受容体へのリガンドの特異的結合は、また、検出可能に標識されたリガンドの受容体への結合が、過剰の非標識リガンドの存在下で低下すること（つまり、結合競合アッセイ）によっても証明される。
興奮毒性は、神経細胞と周囲の細胞が、ＮＭＤＡ受容体、例えば、ＮＭＤＡＲ２Ｂサブユニットを持つＮＭＤＡ受容体などの、興奮性神経伝達物質グルタメートの受容体の過剰活性化によって、損傷を受けて死ぬ病理過程である。
「対象」又は「患者」との用語には、ヒト、ならびに、哺乳動物などの獣医学動物及び前臨床試験で使用されるマウス又はラットなどの実験動物が含まれる。
ｔａｔペプチドは、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）からなる又はＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）を含むペプチドであって、その配列内で５つ以下の残基が削除、置換又は挿入され、連結したペプチド又は他の薬剤を細胞に取り込むことを促進する能力を維持しているペプチドを意味する。好ましくは、あらゆるアミノ酸変化は、保存的置換である。好ましくは、会合体におけるあらゆる置換、削除又は内部挿入は、好ましくは上記の配列のものに類似する、正味正電荷をペプチドに残す。このようなこれは、例えば、Ｒ又はＫ残基を置換しないことによって、又はＲ及びＫ残基の合計を同じに保持することによって達成することができる。ｔａｔペプチドのアミノ酸は、炎症反応を低減するために、ビオチン又は類似の分子によって誘導体化することができる。
薬理活性薬剤の共投与は、それらの薬剤の検出可能な量が血漿中に同時に存在するために、及び／又は、それらの薬剤が病状の同じエピソードに対する治療効果を奏する、もしくは、それらの薬剤が病状の同じエピソードに対して協働的又は相乗的に作用するために十分に近接した時間に、それらの薬剤が投与されることを意味する。例えば、抗炎症薬は、ｔａｔペプチドを含む薬剤と、両薬剤が内在化ペプチドによって誘導され得る抗炎症反応を抗炎症薬が抑止し得るだけ十分に近い時間に投与されるとき、協働的に作用する。
統計的に有意であるとは、ｐ値が＜０．０５、好ましくは＜０．０１、最も好ましくは＜０．００１でることを指す。
病状のエピソードとは、病状の兆候又は症状が存在する期間であって、その兆候及び／又は症状が存在しないもしくはより低い程度で存在する、より長い期間が隣接することによって、間歇的に存在する期間を意味する。
「ＮＭＤＡ受容体」又は「ＮＭＤＡＲ」の用語は、以下に記載する種々のサブユニット型を含むＮＭＤＡと相互作用することが知れられている、膜結合タンパクを指す。このような受容体は、ヒトのものであることも、ヒトのものでない（例えば、ラット、ウサギ、サル）こともあり得る。
治療指数は、動物実験ではＬＤ（致死量）５０／ＥＤ（有効量）５０、ヒトではＴＤ（毒性量）５０／ＥＤ（有効量）５０として慣例に従って使用される。
「含む」、「からなる」、及び「本質的に構成される」はそれぞれ慣例に従って使用される。従って、「含む」は追加の要素又はステップを排除するものではなく、「本質的に構成される」は発明の基本的かつ新規な特徴を指す。本明細書における物又は方法の機能への言及は、文脈上別段の要求がない限り、以下の代替案のいずれかを主張するためのサポートとして理解されるべきである：特定の機能を含む物又は方法、それからなる物又は方法、あるいは特定の機能から本質的に構成される物又は方法。
本明細書がネリネチドの配列中の番号付けされた位置（例えば、３番目のアミノ酸）又はネリネチドのｔａｔ内在化ペプチドに言及する場合、本明細書では、バリアントがネリネチド又はネリネチドの内在化ペプチドと最大限に整列する場合、ネリネチドのバリアント又はネリネチドの内在化ペプチドにおける対応する位置も開示すると理解されるべきである。
詳細な説明
Ｉ．概要
本発明によれば、脳卒中を治療するための前述した活性薬剤（Ｔａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃ）のバリアントが提供される。前記バリアントは、Ｃ末端にある４つ又は５つのアミノ酸がＬ－アミノ酸であり、残りのアミノ酸の１つ以上がＤ－アミノ酸である。Ｄ－アミノ酸を含むことにより、特にプラスミンによる薬剤のタンパク質分解が抑制される。プラスミンは、血漿中に自然に存在し、血栓溶解剤の投与によって誘導される。Ｄ－アミノ酸は、血漿や皮下組織などにおけるＴａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃが遭遇する他のプロテアーゼも阻害することができる。残りの分子の一部又は全部にＤ－アミノ酸の存在が有無にもかかわらず、Ｃ末端でのＬ－アミノ酸の保持は、Ｔａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃの結合及び阻害特性を保持するのに十分である。Ｄ－アミノ酸に関連する腎毒性は、Ｄ－アミノ酸を最小限の位置に含めること、及び／又はＤ－アミノ酸オキシダーゼの阻害剤と同時投与することによって軽減することができる。得られた活性薬剤は、半減期の延長及び共投与又は共製剤化された血栓溶解剤により誘導されるプラスミンに対する耐性を含むいくつかの利点を有する。得られた薬剤は、静脈内注入の代替経路（例えば、皮下、鼻腔内及び筋肉内投与）による投与にも適している。これは、この薬剤のより長い半減期がこれらの経路によって必要とされる血漿中の治療濃度に達するまでのより長い時間を補うことができるためである。このような経路による投与により、顕著なヒスタミンの放出がなくより高い用量で投与できるとともに、医療施設よりも現場での実施により適する。本発明の活性薬剤のより長い半減期により、当該薬剤は、複数回投与計画において長期間にわたって治療濃度を維持するのにより適する。このような投与計画は、脳卒中に起因する病理学的障害及び認知障害からの回復を促進し、初期障害を軽減するのに役立つ。複数回投与計画は、アルツハイマー病やパーキンソン病などの慢性疾患の治療にも役立つ。
ＩＩ．活性薬剤
本発明の活性薬剤は、ＰＳＤ－９５（例えばＳｔａｔｈａｋｉｓｍ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４４（１）：７１－８２（１９９７））に特異的に結合することでＮＭＤＡＲ２Ｂ（例えばＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ４０９９６１２）及び／又はＮＯＳ（例えば、ニューロン又はｎＮＯＳ Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｐ２９４７５）を含むＮＭＤＡ受容体２サブユニットへのＰＳＤ－９５の結合を阻害するペプチド阻害剤と、ペプチド阻害剤が細胞膜及び血液脳関門を通過することを促進する内在化ペプチドとを含む。好ましいペプチドは、ヒト対象において使用されるヒト形態のＰＳＤ－９５ ＮＭＤＡＲ ２Ｂ及びＮＯＳを阻害する。しかし、阻害は、タンパク質の種バリアントから示され得る。いくつかのペプチド阻害剤は、それらのＣ末端に［Ｅ／Ｄ／Ｎ／Ｑ］－［Ｓ／Ｔ］－［Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｎ］－［Ｖ／Ｌ］（配列番号３）を含むアミノ酸配列を有する。例示的なペプチドは、ＥＳＤＶ（配列番号１４）、ＥＳＥＶ（配列番号１５）、ＥＴＤＶ（配列番号１６）、ＥＴＡＶ（配列番号１７）、ＥＴＥＶ（配列番号１８）、ＤＴＤＶ（配列番号１９）及びＤＴＥＶ（配列番号２０）をＣ末端アミノ酸として含む。いくつかのペプチドは、それらのＣ末端に［Ｉ］－［Ｅ／Ｄ／Ｎ／Ｑ］－［Ｓ／Ｔ］－［Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｎ］－［Ｖ／Ｌ］（配列番号１０）を含むアミノ酸配列を有する。例示的なペプチドは、ＩＥＳＤＶ（配列番号５）、ＩＥＳＥＶ（配列番号２１）、ＩＥＴＤＶ（配列番号２２）、ＩＥＴＡＶ（配列番号２３）、ＩＥＴＥＶ（配列番号２４）、ＩＤＴＤＶ（配列番号２５）及びＩＤＴＥＶ（配列番号２６）をＣ末端アミノ酸として含む。いくつかの阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＸ１－［Ｔ／Ｓ］－Ｘ２Ｖ（配列番号２７）を含むアミノ酸配列を有する。ここで、［Ｔ／Ｓ］は、代替アミノ酸であり、Ｘ１は、Ｅ、Ｑ、Ａ、Ｄ又はそれらの類似体から選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｎ－Ｍｅ－Ａ、Ｎ－Ｍｅ－Ｑ、Ｎ－Ｍｅ－Ｄ、Ｎ－Ｍｅ－Ｎ及びそれらの類似体から選択される（Ｂａｃｈ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５１，６４５０－６４５９（２００８）；及びＷＯ２０１０／００４００３）。選択的に、前記ペプチドは、Ｐ３位置（Ｃ末端から３番目のアミノ酸、即ち、［Ｔ／Ｓ］が占める位置）でＮ－アルキル化される。このペプチドは、シクロヘキサン又は芳香族置換基によってＮ－アルキル化され、ペプチド又はペプチド類似体の置換基と末端アミノ基との間にスペーサ基をさらに含み得る。前記スペーサ基は、アルキル基であり、好ましくは、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基から選択される。芳香族置換基は、ナフタレン－２－イル部分、或いは１つ又は２つのハロゲン及び／又はアルキル基で置換された芳香環であり得る。いつかの阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＩＸ１－［Ｔ／Ｓ］－Ｘ２Ｖ（配列番号２８）を含むアミノ酸配列を有する。例示的な阻害剤ペプチドは、ＩＥＳＤＶ（配列番号５）、ＩＥＴＤＶ（配列番号２２）、ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号２）及びＫＬＳＳＩＥＴＤＶ（配列番号１２）の配列を有する。阻害剤ペプチドは、通常、３－２５個のアミノ酸（内在化ペプチドなし）を含み、５－１０個のアミノ酸、特に９個のアミノ酸（内在化ペプチドなし）のペプチド長が好ましい。
内在化ペプチドは、多くの細胞タンパク又はウイルスタンパクが膜を横断するのを可能にする、比較的短いペプチドの周知のクラスである。それらは細胞膜又は血液脳関門を通過する連結ペプチドの通過を促進することもできる。内在化ペプチドは、細胞膜形質導入ペプチド、タンパク質形質導入ドメイン、脳シャトル又は細胞透過性ペプチドとしても知られ、例えば５～３０個のアミノ酸を有し得る。このようなペプチドは、一般に、アルギニン残基及び／又はリジン残基の上記の通常の表記から、（一般のタンパクと比べて）正電荷を有し、このことが膜透過を促進すると信じられている。いくつかのこのようなペプチドは、少なくとも５，６，７又は８個のアルギニン残基及び／又はリジン残基を有する。例には、アンテナペディアタンパク（Ｂｏｎｆａｎｔｉ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７，１４４２－６（１９９７））（及びそのバリアント）、ヒト免疫不全ウイルスのｔａｔタンパク、タンパクＶＰ２２，ヘルペスシンプレックスウイルスタイプ１のＵＬ４９遺伝子の産生物、ペネトラチン、ＳｙｎＢ１及び３、トランスポータン（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）、アンフィパシック（Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ）、ｇｐ４１ＮＬＳ、ｐｏｌｙＡｒｇ、ならびに、リシン、アブリン、モデシン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、炭疽毒素、易熱性毒素、及び、緑膿菌外毒素Ａ（ＥＴＡ）などの、いくつかの植物及び細菌タンパク毒素が含まれる。他の例は、次の文献に記載されている（Ｔｅｍｓａｍａｎｉ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，９（２３）：１０１２－１０１９，２００４；Ｄｅ Ｃｏｕｐａｄｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，３９０：４０７－４１８，２００５；Ｓａａｌｉｋ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１５：１２４６－１２５３，２００４；Ｚｈａｏ，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２４（１）：１－１２，２００４；Ｄｅｓｈａｙｅｓ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６２：１８３９－４９，２００５）；Ｇａｏ，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１１，６，４８４-４９１，ＳＧ３（ＲＬＳＧＭＮＥＶＬＳＦＲＷＬ）（配列番号２９）），Ｓｔａｌｍａｎｓ ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１３，８（８）ｅ７１７５２，１－１１ ａｎｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ ｅｔ ａｌ．，ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ ６６，１８２－１９４（２０１４）；Ｃｏｐｏｌｏｖｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ，８，１９７２－９４（２０１４）；Ｌｕｋａｎｏｗｓｋｉ，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｊ．８，９１８－９３０（２０１３）；Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．８３，５０７－５２０（２０１４）；Ｓｔａｎｚｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｃｏｕｎｔｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ／ ４６，２９４４－２９５４（２０１３）；Ｏｌｌｅｒ－Ｓａｌｖｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４５：１０．１０３９／ｃ６ｃｓ０００７６ｂ（２０１６）； Ｂｅｈｚａｄ Ｊａｆａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１９）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，１６：６，５８３－６０５（２０１９）（すべて参照によって組み込まれる）。さらに別の戦略では、追加の方法又は組成物を使用して、ＰＳＤ－９５ 阻害剤などのカーゴ分子の脳への送達を強化する（Ｄｏｎｇ，Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ８（６）：１４８１-１４９３（２０１８）。
好ましい内在化ペプチドは、ＨＩＶウイルス由来のｔａｔである。先の研究で報告したｔａｔペプチドは、ＨＩＶｔａｔタンパクに見られる標準的アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）を含み、又はこの配列からなる。ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）及びＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１）も使用することができる。このようなｔａｔモチーフに隣接する追加の残基が（薬理活性薬剤の他に）存在する場合、その残基は、例えば、ｔａｔタンパク由来のこのセグメントに隣接する天然アミノ酸、もしくは、２つのペプチドドメインを結合するのに一般に使用される種類のスペーサ又はリンカーアミノ酸、例えば、ｇｌｙ（ｓｅｒ）４（配列番号３０）、ＴＧＥＫＰ（配列番号３１）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号３２）、もしくはＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号３３）（例えば、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１５６８２－１５６８６；Ｈｅｎｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１１，４０５－４１０）を参照）であり、又は、隣接残基なしでバリアントの取り込みをもたらす能力を大きく減じることのない他のあらゆるアミノ酸であり得る。好ましくは、活性ペプチド以外の隣接アミノ酸の数は、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）のどちら側においても１０を超えない。ただし、好ましくは、隣接アミノ酸は存在しない。ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）のＣ末端に隣接する追加のアミノ酸残基を含む１つの好適なｔａｔペプチド又は他の阻害剤ペプチドは、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ（配列番号３４）である。使用可能な他のｔａｔペプチドには、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ（配列番号３５）及びＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰ（配列番号３６）が含まれる。
Ｎ型カルシウムチャンネルに結合する能力が低い上記ｔａｔペプチドのバリアントは、国際特許出願公開公報第ＷＯ／２００８／１０９０１０号に記載されている。そのようなバリアントは、アミノ酸配列ＸＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３７）を含み、又はこのアミノ酸配列からなり、ここで、Ｘは、Ｙ以外のアミノ酸であり、或いはアミノ酸配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１）を含むか、又はこのアミノ酸配列からなり得る。例示的なｔａｔペプチドは、Ｎ末端のＹ残基がＦで置換されている。したがって、例示的なｔａｔペプチドは、ＦＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３）を含む、又はこの配列からなる。他の例示的な変異ｔａｔペプチドは、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）からなる。他の例示的なｔａｔペプチドは、ＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ又はＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧＹ（配列番号９のアミノ酸１～１０又は１～１１）を含み、又はこの配列からなる。Ｎ型カルシウムチャンネルを阻害することなく薬理活性薬剤の取り込みを促進する他のｔａｔ由来ペプチドには、次の表１Aに示したものが含まれる。
Ｘは、遊離アミノ末端、１つ以上のアミノ酸又は結合部分であり得る。
本発明の活性薬剤は、典型的には阻害剤ペプチドと、内在化ペプチドとを含む。前記阻害剤ペプチドが遊離Ｃ末端と、内在化ペプチドのＣ末端に結合したＮ末端とを有する。このような薬剤において、阻害剤ペプチドの少なくとも４つのＣ末端残基、好ましくは阻害剤ペプチドの５つのＣ末端残基はＬ－アミノ酸であり、阻害剤ペプチド及び内在化ペプチドにおける残りの残基の少なくとも１つはＤ－残基である。Ｄ－残基を含める位置は、Ｄ－残基が任意の塩基性残基（即ち、アルギニン又はリジン）の直後（即ち、Ｃ末端側）に現れるように選択することができる。プラスミンは、このような塩基性残基のＣ末端側のペプチド結合を切断することにより作用する。切断部位に隣接する部位、特に塩基性残基のＣ末端側にＤ－残基を含めることにより、ペプチド切断は減少するか又はなくされる。塩基性残基のＣ末端側にある残基の一部又は全部はＤ－残基であり得る。任意の塩基性残基もＤ－アミノ酸であり得る。
例として、図１は、Ｔａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃにおける実際及び潜在的なプラスミン切断部位の図を示す。７つの実際の部位（切断が検出された部位）及び２つの潜在的な部位（プラスミン切断が発生する可能性がある部位）がある。いくつかの活性薬剤は、内在化ペプチド及び阻害剤ペプチドの両方に少なくとも１つのＤ－アミノ酸を含む。いくつかの活性薬剤は、内在化ペプチドの各位置にＤ－アミノ酸を含む阻害剤ペプチドを有する。いくつかの活性薬剤は、Ｌ－アミノ酸である４つ又は５つのＣ末端残基以外の阻害剤ペプチドの各位置にＤ－アミノ酸を含む。いくつかの活性薬剤は、内在化ペプチドの各位置、及びＬ－アミノ酸である最後の４つ又は５個のＣ末端アミノ酸残基以外の阻害剤ペプチドの各位置に、Ｄ－アミノ酸を含む。
Ｔａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃは、ＮＡ－１又はネリネチドとしても知られており、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号５８）を有する。本発明の好ましい活性薬剤は、ＥＳＤＶ（配列番号１４）又はＩＥＳＤＶ（配列番号５）がＬ－アミノ酸であり、残りのアミノ酸の少なくとも１つがＤ－アミノ酸である上記配列のバリアントである。いくつかの活性薬剤において、少なくともＣ末端から８及び９番目の位置にあるＬ及び／又はＫ残基はＤ－残基である。いくつかの活性薬剤において、Ｎ末端から６番目、７番目、８番目、１０番目及び１１番目の位置を占めるＲ、Ｒ、Ｑ、Ｒ、Ｒ残基の少なくとも１つはＤ－残基である。いくつかの活性薬剤において、これらの残基は全てＤ－残基である。いくつかの活性薬剤において、残基４－８及び残基１０－１３はそれぞれＤ－アミノ酸である。いくつかの活性薬剤において、残基４－１３又は３－１３はそれぞれＤ－アミノ酸である。いくつかの活性薬剤において、内在化ペプチドの１１個の残基（キラル体を持たないグリシンを除く）は、それぞれＤ－アミノ酸である。いくつかの例示的な活性薬剤は、ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋｌｓｓＩＥＳＤＶ（配列番号６）（ＮＡ－３とも呼ばれる）、ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋｌｓｓｉＥＳＤＶ（配列番号５９）、ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋｌｓＳＩＥＳＤＶ（配列番号６０）、ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋｌＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号６１）、ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋｓｓＩＥＳＤＶ（配列番号７）、ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋｓＩＥＳＤＶ（配列番号８）又はｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋＩＥＳＤＶ（配列番号９）を含む。他の活性薬剤は、Ｃ末端から３番目の位置にあるＳがＴで置換された上記配列のバリアント（ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋｌｓｓＩＥＴＤＶ（配列番号６２）、ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋｌｓｓｉＥＴＤＶ（配列番号６３）、ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋｌｓＳＩＥＴＤＶ（配列番号６４）、ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋｓｓＩＥＴＤＶ（配列番号６５）、ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋｓＩＥＴＤＶ（配列番号６６）及びｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋＩＥＴＤＶ（配列番号６７））を含む。活性薬剤は、ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒＩＥＳＤＶ（配列番号６８）（Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ５ｃ）及びｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒＩＥＴＤＶ（配列番号６９）を含む。
本発明は、例えば、阻害剤ペプチドに結合して融合ペプチドを形成する内在化ペプチドと、阻害剤ペプチドとを含む活性薬剤、或いは内在化ペプチドと阻害剤ペプチドの全体に最大１、２、３、４若しくは５つの置換又は欠失を有する前記活性薬剤のバリアントをさらに含む。阻害剤ペプチドは、ＮＯＳ及び／又はＮＭＤＡＲ２ＢへのＰＳＤ－９５の結合を阻害する。内在化ペプチドは、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１）又はＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）を含むアミノ酸配列を有する。阻害剤ペプチドは、ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号２）を含む配列を有する。このような活性薬剤において、阻害剤ペプチドの少なくとも４つ又は５個のＣ末端アミノ酸はＬ－アミノ酸であり、全てのＲ残基及びＫ残基を含むアミノ酸の連続セグメント並びに最もＣ末端のＲ残基又はＫ残基のすぐ隣のＣ末端の残基はＤ－アミノ酸である。このように、配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号５８）を含むペプチドにおいて、１番目のＲからL－残基までの連続セグメントはＤ－アミノ酸である（キラル体を持たないグリシンを除く）。
許容される置換の一例は、阻害剤ペプチドのＣ末端にあるモチーフ［Ｅ／Ｄ／Ｎ／Ｑ］－［Ｓ／Ｔ］－［Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｎ］－［Ｖ／Ｌ］（配列番号３）によって提供される。例えば、Ｃ末端から３番目のアミノ酸は、Ｓ又はＴであり得る。好ましくは、阻害剤ペプチドの５個のＣ末端アミノ酸はそれぞれＬ－アミノ酸である。選択的に、活性薬剤ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋｌｓｓＩＥＳＤＶ（配列番号６）と同様に、他のアミノ酸はそれぞれＤ－アミノ酸である。ここで、小文字はＤ－アミノ酸、大文字はＬ－アミノ酸である（キラル体を持たないグリシンを除く）。
上記のネリネチドのバリアントにＤ-アミノ酸を含めることは、プラスミン耐性及び血漿半減期を増加させるのに有利であるが、Ｄ-アミノ酸はまた、腎毒性を引き起こし得ることが見出された。腎毒性の程度は、活性薬剤の用量、活性ペプチドのＤ－アミノ酸含量、及び毒性を軽減するためのＤ－アミノ酸オキシダーゼ阻害剤の使用に依存する。驚くべきことに、プラスミン耐性と血漿半減期の増加という利点のほとんど、場合によってはすべて（例えば、５０、７５、９０、９９％又は１００％）、上記の活性薬剤よりも少ない位置に Ｄ－アミノ酸を含めることによって達成でき、同じ用量で腎毒性が低下する（例えば、１０、２５、５０、７５又は９０％低下する）という追加の利点も得られることが見出された。言い換えれば、Ｄ－アミノ酸に関連する利点及び腎毒性は、Ｄ－アミノ酸の含有量と同じ相関を示さない。
本発明の実施に機構の理解は必要ないが、上記の結果は、Ｄ－アミノ酸が切断部位をまたぐ２つのアミノ酸のうちの１つである場合だけでなく、切断部位からより離れた場所、例えば、２、３又は４個のアミノ酸（切断部位のすぐ隣のアミノ酸を有する）離れている場合にもＤ－アミノ酸がプラスミン切断や場合によっては他のプロテアーゼに対する保護を提供することによって部分的に説明できる。さらに、Ｄ-アミノ酸による腎毒性は、ペプチド内のＤ-アミノ酸の数及びペプチドの用量に比例して増加するようである。結果として、最小限の数の Ｄ－アミノ酸を使用すると、重大な腎毒性を伴うことなく、完全にＤ－アミノ酸で作られたペプチドの安定性という利点のすべてではないにしても、ほとんどを得ることができる。
例えば、いくつかの活性薬剤は、内在化ペプチドの１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸（グリシンが存在する場合、それを含まない）のみをＤ－アミノ酸として有する。阻害剤ペプチドは、最初のＫ残基及び／又はＬ残基を除いてすべてのＬ残基で形成される。いくつかの活性薬剤は、内在化ペプチドにおける２－６、２－５、２－４、３－６、３－５又は４－５個のアミノ酸（グリシンが存在する場合、それを含まない）をＤ－アミノ酸として有し、内在化ペプチドにおける残りのアミノ酸及び阻害剤ペプチドにおける最初のＫ残基及び／又はＬ残基を除くアミノ酸をＬ－アミノ酸又はグリシンとして有する。いくつかの活性薬剤は、内在化ペプチドにおける２－６、２－５、２－４、３－６、３－５又は４－５個のアミノ酸（グリシンが存在する場合、それを含まない）をＤ－アミノ酸として有し、内在化ペプチドにおける残りのアミノ酸及び阻害剤ペプチドをＬ－アミノ酸又はグリシンとして有する。
プラスミン耐性及び血漿半減期は、活性薬剤における選択されたＬ－アミノ酸をＤ－アミノ酸に置換し、及び／又は活性薬剤の活性に必須ではないＬ－アミノ酸を削除することによって向上することができる。薬学的活性を大幅に損なうことなくネリネチドから削除できる例示的なアミノ酸は、内在化ペプチドＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）の最初の２つのアミノ酸Ｙ及びＧ、阻害剤ペプチドＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号２）のＮ末端から最初の４つ又は５つのアミノ酸を含む。したがって、いくつかの活性薬剤は、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）を含む内在化ペプチドに基づいている。内在化ペプチドの全てのアミノ酸ではないが、少なくとも１つはＤ－アミノ酸である。例えば、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）における１、２、３、４、５、６、７又は８個のアミノ酸は、Ｄ－アミノ酸であり得る。いくつかの活性薬剤において、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲの１－８、１－７、１－６、１－５、１－４、１－３又は１－２個のアミノ酸残基は、Ｄ－アミノ酸である。いくつかの活性薬剤において、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）の２－８、２－７、２－６、２－５、２－４、２－３個の残基は、Ｄ－アミノ酸である。いくつかの活性薬剤において、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）の３－８、３－７、３－６、３－５、３－４、４－８、４－７、４－６、４－５、５－８、５－７、５－６、６－８、６－７又は７－８個の残基は、Ｄ－アミノ酸である。
いくつかの活性薬剤は、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１）を含む内在化ペプチドに基づいている。いくつかの活性薬剤において、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１）の１、２、３、４、５、６、７又は８個の残基は、Ｄ－アミノ酸である（キラル型を持たないグリシンは、ペプチド内のＤアミノ酸のこのカウント又は同様のカウントではＤ残基としてカウントされない）。いくつかのこのような活性薬剤において、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１）の１－８、１－７、１－６、１－５、１－４、１－３又は１－２個の残基は、Ｄ－アミノ酸である。 いくつかのこのような活性薬剤において、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１）の２－８、２－７、２－６、２－５、２－４又は２－３個の残基は、Ｄ－アミノ酸である。いくつかのこのような活性薬剤において、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１）の３－８、３－７、３－６、３－５、３－４、４－８、４－７、４－６、４－５、５－８、５－７、５－６、６－８、６－７又は７－８個の残基は、Ｄ－アミノ酸である。
いくつかの活性薬剤は、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）を含む内在化ペプチドに基づいている。いくつかの活性薬剤において、内在化ペプチドにおける１－９、１－８、１－７、１－６、１－５、１－４、１－３、１－２個の残基は、Ｄ－アミノ酸である。いくつかのこのような活性薬剤において、内在化ペプチドにおける２－９、２－８、２－７、２－６、２－５、２－４又は２－３個の残基は、Ｄ－アミノ酸である。いくつかのこのような活性薬剤において、内在化ペプチドにおける３－９、３－８、３－７、３－６、３－５、３－４、４－９、４－８、４－７、４－６、４－５、５－９、５－８、５－７、５－６、６－９、６－８、６－７、７－９、７－８又は８－９個の残基は、Ｄ－アミノ酸である。いくつかのこのような活性薬剤において、内在化ペプチドにおける１、２、３、４、５、６、７、８又は９個の残基は、Ｄ－アミノ酸である。
前記内在化ペプチドに結合した阻害剤ペプチドは、式［Ｅ／Ｄ／Ｎ／Ｑ］－［Ｓ／Ｔ］－［Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｎ］－［Ｖ／Ｌ］（配列番号３）に基づいて４個のＣ末端アミノ酸を含む。好ましくは、前記阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＥＳＤＶ（配列番号１４）、ＩＥＳＤＶ（配列番号５）、ＥＴＤＶ（配列番号１６）又はＩＥＴＤＶ（配列番号２２）を含む。阻害剤ペプチドの４又は５個の末端Ｌ－アミノ酸、例えば、ＥＳＤＶ（配列番号１４）、ＩＥＳＤＶ（配列番号５）、ＥＴＤＶ（配列番号１６）又はＩＥＴＤＶ（配列番号２２）は、Ｌ－アミノ酸である。追加のアミノ酸が阻害剤ペプチドに存在する場合、それらは、典型的にＩＥ［Ｓ／Ｔ］ＤＶ（配列番号４）のＮ末端に結合したＫＬＳＳ（配列番号１１３）、ＫＬＳ、ＫＬ、Ｋ、Ｓ、ＳＳ又はＳＬである。阻害剤ペプチドのこのような追加のアミノ酸は、典型的にアミノ酸であるが、ＫがＬ又はＤ－アミノ酸であってもよい。ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号２）又はＫＬＳＳＩＥＴＤＶ（配列番号１２）は、阻害剤ペプチドの各残基がＬ－アミノ酸である（Ｋ及びＬが独立してＬ又はＤ－アミノ酸であり得ることを除く）例示的な阻害剤ペプチドである。いくつかの阻害剤ペプチドにおいて、Ｋ及びＬは、両方ともＬ－アミノ酸である。いくつかの阻害剤ペプチドにおいて、Ｋ及びＬは、両方ともＤ－アミノ酸である。いくつかの阻害剤ペプチドにおいて、ＫはＤ－アミノ酸であり、ＬはＬ－アミノ酸であり、又はその逆である。
他の置換、欠失、又は付加（Ｌ－アミノ酸のＤ－アミノ酸による置換に加えて）は、結合、阻害、プラスミン耐性及び血漿半減期を少なくとも実質的に保持し、以下でさらに議論する腎毒性を増加させることはなく、開示された配列に対して任意に行うことができる（例えば、最大１、２、３、４、又は５個の置換、欠失、又は付加）。例えば、いくつかのバリアントは、開示された配列に対して１、２、３、４又は５個の置換を含む。いくつかのバリアントは、開示された配列と比較して、１、２、３、４又は５個の置換及び欠失の組み合わせを含む。いくつかのバリアントは、開示された配列と比較して、１、２、３、４又は５個の置換、欠失、又は付加の組み合わせを含む。
上に開示した内在化ペプチドに存在するＤ残基は、互いに連続していてもよく、又は連続していなくてもよい。例えば、いくつかの内在化ペプチドにおいて、少なくとも２つのＤ－アミノ酸は、互いに１つ以上のＬ－アミノ酸又はグリシンによって分離される。いくつかの内在化ペプチドにおいて、少なくとも３つのＤ－アミノ酸は、互いに１つ以上のＬ－アミノ酸又はグリシンによって分離される。
いくつかの活性薬剤において、少なくとも１つ又は全てのＤ－アミノ酸で置換されたＬ－アミノ酸は、Ｋ及びＲであり、又はＫ若しくはＲ残基のすぐＣ末端側にある残基である。これらの残基はプラスミン切断の可能性のある部位に隣接するためである。いくつかの活性薬剤において、２つ以上の連続するＫ又はＲ残基のストレッチのすぐＣ末端にある残基は、Ｄ－アミノ酸で置換される。Ｋ、Ｒ以外の他のＬ残基、及びＣ末端のすぐ隣の残基もＤ残基で置換することができる。
いくつかの例示的な内在化ペプチドは、表１Ｂに示される配列を有する。
いくつかの例示的な活性薬剤は、ＲｋｋｒｒＱｒＲｒＩＥＳＤＶ（配列番号１１０、ＮｏＮＯ４１１）、ＲＫｋＲｒＱｒｒＲＩＥＳＤＶ（配列番号１１１）若しくはｒＫＫＲｒＡｒＲＲＩＥＳＤＶ（配列番号１１２）のいずれかを含むか、又はそれからなるアミノ酸配列を有する。
いくつかの好ましい活性薬剤は、ｋＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号１２２）、ＫｌＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号１２３）又はｋｌＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号７０）に結合した上記の内在化ペプチドのいずれかを有する。
いくつかの活性薬剤は、阻害剤ペプチドに結合した内在化ペプチド又はそのバリアントを含み、前記阻害剤ペプチドは、ＮＯＳ及び／又はＮＭＤＡＲ２ＢへのＰＳＤ－９５の結合を阻害し、前記内在化ペプチドは、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）を含むアミノ酸配列を有し、前記阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＥＳＤＶ（配列番号４）を含む配列を有する。前記バリアントは、内在化ペプチド及び阻害剤ペプチドに最大１、２、３、４又は５個の置換、付加、又は削除を有する（同じアミノ酸のＬからＤへの置換を含まない）。いくつかの活性薬剤は、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１）又はＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）を含む配列を有し、阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＥＳＤＶ（配列番号１４）を有し、そのバリアントは、内在化ペプチド及び阻害剤ペプチドに最大１、２、３、４又は５個の置換、付加、又は削除を有する（同じアミノ酸のＬからＤへの置換を含まない）。阻害剤ペプチドの少なくとも４個のＣ末端アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸である。内在化ペプチドの２－６、好ましくは３－５個の残基、例えば、３又は４個の残基（グリシンを除く）は、Ｄ－アミノ酸である。Ｃ末端アミノ酸は、好ましくはＩＥ［Ｓ／Ｔ］ＤＶ（配列番号４）であり、それらの全てはＬ－アミノ酸である。阻害剤ペプチドの付加位置又は内在化ペプチドと阻害剤ペプチドの間のスペーサペプチドは、Ｌ又はＤであり得る。いくつかのこのような薬剤において、各Ｄ残基は、Ｋ若しくはＲ又はＫ若しくはＲ残基のＣ末端に位置する。このような活性薬剤におけるＤ残基は、活性薬剤が遭遇する可能性のあるプラスミン及び他のプロテアーゼによる切断を低減する際に最大の効果が得られるように間隔をあけて配置されることが好ましい。いくつかのこのような活性薬剤は、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される４つ以上の連続アミノ酸のストレッチを含まない。前記ストレッチは、Ｒ及びＫから独立して選択される隣接アミノ酸（即ち、プラスミン切断部位）を含む。言い換えれば、あるＬ型Ｒ又はＫは、４つ以上のＬ－アミノ酸又はグリシンである連続アミノ酸のストレッチの一部として他のＬ型Ｒ又はＫに隣接して存在しない。いくつかの活性薬剤は、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される４つ以上の連続アミノ酸のストレッチを含まない。前記ストレッチは、Ｒ及び／又はＫを含む。言い換えれば、あるＬ型Ｒ又はＫは、４つ以上のＬ－アミノ酸又はグリシンである連続アミノ酸のストレッチの一部として存在しない。いくつかのこのような活性薬剤は、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される５つ以上の連続アミノ酸のストレッチを含まない。前記ストレッチは、Ｒ及びＫから独立して選択される隣接アミノ酸（即ち、プラスミン切断部位を含む）。言い換えれば、あるＬ型Ｒ又はＫは、５つ以上のＬ－アミノ酸又はグリシンである連続アミノ酸のストレッチとして他のＬ型Ｒ又はＫに隣接して存在しない。４つのこのような連続アミノ酸のストレッチが存在する場合、好ましくは、このようなストレッチは、１つだけ存在するとともに、内在化ペプチドのＮ末端に位置し（即ち、最初の４個の残基）、他の位置には、２つ又は３つ以下のこのような連続アミノ酸のストレッチがある。いくつかの活性薬剤は、Ｒ及び／又はＫを含むＬ－アミノ酸又はグリシンから選択される５つ以上の連続アミノ酸のストレッチを含まない。言い換えれば、Ｌ型Ｒ又はＫは、５つ以上のＬ－アミノ酸であるグリシン連続アミノ酸のストレッチの一部として存在しない。４つのこのような連続アミノ酸のストレッチが存在する場合、好ましくは、このようなストレッチは、１つだけ存在するとともに、内在化ペプチドのＮ末端に位置し（即ち、最初の４個の残基）、他の位置には、２つ又は３つ以下のこのような連続アミノ酸のストレッチがある。
したがって、例えば、いくつかの活性薬剤は、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）を有する内在化ペプチドに３つのＤ－残基（グリシンを除く）を有し、Ｎ末端から番号付けされて３－５位の間にあるＤ－アミノ酸、７位又は８位にあるＤ－アミノ酸、及び９位－１１位の間にあるＤ－アミノ酸を有する。いくつかの活性薬剤は、阻害剤ペプチドと内在化ペプチドの間にスペーサペプチドを有する。スペーサペプチドは、それ自体が阻害剤ペプチドがＰＳＤ－９５に結合するのに必要ではないが、内在化ペプチドがＰＳＤ－９５への阻害剤ペプチドの結合を増加できるように、阻害剤ペプチドと内在化ペプチドとの間の間隔を容易にするため、そう呼ばれる。スペーサは、通常２～４アミノ酸のペプチドであるが、同様の間隔を持つ任意の形式のリンカーであってもよい。いくつかのスペーサは、グリシン、アラニン、セリン又はロイシンアミノ酸から独立して選択される一部又は全てのアミノ酸を含む。このようなアミノ酸は、結合される分子間に柔軟性を与えるためにスペーサに含まれることがよくある。いくつかのスペーサにおいて、リジン及び／又はアルギニンは、プラスミン又は他の切断部位の導入を避けるために使用されない。前記スペーサは、ネリネチドのＩＥＳＤＶ（配列番号５）と内在化ペプチドとの間に存在するアミノ酸であるＫＬＳＳ（配列番号１１３）であってもよい。この場合、プラスミンや他のプロテアーゼによる切断を減らすために、Ｋ及び／又はＬをＤ型にすることができる。このような薬剤は、選択的に、分岐リンカーによって内在化ペプチドに結合した阻害剤ペプチドの２つ以上のコピーを含むことができる。
いくつかの活性薬剤は、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号５８）を含むか若しくはそれからなるアミノ酸配列、又はそのバリアントを有し、前記バリアントは、上記の配列に最大１、２、３、４又は５つの置換、削除又は付加（同じアミノ酸のＬ型からＤ型への置換を除く）を有し、５個のＣ末端アミノ酸以外の位置にある２－７、２－６、３－６又は好ましくは３－５個のアミノ酸（グリシンを除く）は、Ｄ－アミノ酸である。いくつかの活性薬剤は、配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号５８）と少なくとも７５、８０、８５、９０又は９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、５個のＣ末端アミノ酸以外の位置にある２－７、２－６、３－６、好ましくは３－５個のアミノ酸（グリシンを除く）は、Ｄ－アミノ酸である。本明細書において、同一性は、変異体配列を参照配列としてのＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号５８）と最大限に整列させ、一致するアミノ酸の数を参照のアミノ酸の総数で割ることによって決定される。同じタイプのＬ－アミノ酸とＤ－アミノ酸は、この目的に適合すると考えられる。参照と整列した配列の外側のバリアント内の隣接アミノ酸はスコア化されない。いくつかのこのような活性薬剤において、活性薬剤における隣接位置を占めるＤ－アミノ酸がない。いくつかのこのような活性薬剤において、各Ｄ－アミノ酸は、互いにＬ－アミノ酸及びグリシンから選択される少なくとも２つ又は少なくとも３つのアミノ酸によって分離される。いくつかの活性薬剤は、３、４又は５個のＤ－アミノ酸（グリシンはＤ－アミノ酸としてカウントされない）を含む。いくつかの活性薬剤は、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから選択される４つ以上の隣接アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ及びＫから独立して選択される２つの隣接アミノ酸（即ち、プラスミン切断部位）を含む。言い換えれば、あるＬ型Ｒ又はＫは、４つ以上のＬ－アミノ酸又はグリシン連続アミノ酸のストレッチの一部として別のＬ型Ｒ又はＫに隣接して存在しない。いくつかの活性薬剤は、Ｒ及び／又はＫを含む４つ以上のＬ－アミノ酸又はグリシンのストレッチを欠く。言い換えれば、あるＬ型Ｒ又はＫは、４つ以上のＬ－アミノ酸又はグリシンである連続アミノ酸のストレッチの位置として存在しない。ＮｏＮＯ４２は、４つ以上の上記のような連続アミノ酸ではなく、３つ（ＫＫＲ）の連続アミノ酸のストレッチを含む活性薬剤の例である。いくつかの活性薬剤は、Ｒ及びＫから独立して選択される２つの隣接アミノ酸（即ち、プラスミン切断部位）を含む５つ以上の連続したＬ－アミノ酸又はグリシンのストレッチを欠く。言い換えれば、あるＬ型Ｒ又はＫは、５つ以上のＬ－アミノ酸又はグリシンである連続アミノ酸のストレッチの一部として別のＬ型Ｒ又はＫに隣接して存在しない。４つのこのような連続アミノ酸のストレッチが存在する場合、好ましくは、このようなストレッチは、１つだけであるとともに、活性薬剤のＮ末端に位置し（即ち、最初の４個の残基）、他の位置には、２つ又は３つ以下のこのような連続アミノ酸のストレッチがある。ＮＡ－４１１．４は、このような活性薬剤の例であり、Ｎ末端に４つのこのような連続アミノ酸のストレッチ（ＹＧＲＫ配列番号１２４）があり、他の位置には、２つ以下のこのような連続アミノ酸のストレッチがない。いくつかの活性薬剤は、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される５つ以上の連続アミノ酸のストレッチを含まず、前記ストレッチは、Ｒ及び／又はＫを含む。言い換えれば、あるＬ型Ｒ又はＫは、５つ以上のＬ－アミノ酸又はグリシンである連続アミノ酸のストレッチの一部として別のＬ型Ｒ又はＫに隣接して存在しない。４つのこのような連続アミノ酸のストレッチが存在する場合、好ましくは、このようなストレッチは、１つだけであるとともに、活性薬剤のＮ末端に位置し（即ち、最初の４個の残基）、他の位置には、２つ又は３つ以下のこのような連続アミノ酸のストレッチがある。いくつかの活性薬剤は、３又は４個のＤ－アミノ酸（グリシンはＤ－アミノ酸としてカウントされない）を含み、第１のＤ－アミノ酸が３位－５位の間にあり、第２のＤ－アミノ酸が７位又は８位にあり、第３のＤ－アミノ酸が９位－１１位の間にあり、選択的に、第４のＤ－アミノ酸が１２位又は１３位にある。
好ましい活性薬剤は、ＹＧｒＫＫＲｒＱｒＲＲｋＬＳＳＩＥＳＤＶ（ＮＡ４．２，配列番号１１４）、ＹＧＲｋＫＲｒＱＲｒＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（ＮＡ４．４．３，配列番号１１５）又はＹＧｒＫＫＲｒＱｒＲＲＫｌＳＳＩＥＳＤＶ（ＮＡ４．４．２，配列番号１１６）を含むか、それからなるか、又は本質的にそれからなるアミノ酸配列を有し、ここで、Ｄ－アミノ酸は、小文字で示される。これらの薬剤は、３又は４個のＤ－アミノ酸を有し、ネリネチドと比較して血漿半減期及びプラスミン耐性が増加し、ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｒｋｌｓｓＩＥＳＤＶ（配列番号６）と比較して腎毒性が減少又は存在しないという有利なバランスを有する。他の好ましい活性薬剤は、実施例１０、表６に示すプラスミン耐性ペプチドである。
好ましい活性薬剤は、Ｔａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃ又は他の点では同一の全Ｌ－活性薬剤と比較して、ラット又はヒト血漿中での向上した安定性及び/又は血漿半減期を有する。安定性は実施例に記載のように測定することができる。好ましい活性薬剤は、Ｔａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃ又は他の点では同一の全Ｌ－活性薬剤と比較して向上したプラスミン耐性を有する。プラスミン耐性及び血漿半減期は実施例に記載のように測定することができる。いくつかの活性薬剤は、特に皮下投与後に、Tat-NR2B9c又はその他の点では同一の全てのL活性薬剤と比較して、曲線下面積及び/又はCMaxが増加した。活性薬剤は、好ましくはＴａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃ（全Ｌ）又は他の点では同一の全Ｌ－ペプチドと比較して１．５倍、２倍、３倍又は５倍以内でＰＳＤ－９５に結合するか、或いは実験誤差内で区別できない結合を有する。好ましい活性薬剤は、結合についてＴａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃ又はＰＳＤ－９５に結合するためのＰＤＺ結合ドメインを含むＮＭＤＡ受容体サブユニット２配列の最後の１５－２０個のアミノ酸を含むペプチドと少なくとも１０％、２５％又は５０％競合する（例えば、１０倍過剰の活性薬剤はＴａｔ-ＮＲ２Ｂ９ｃ結合を減少させる）。この競合は、活性薬剤がＴａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃと同じ又は重複する結合部位に結合することを示唆している。同じ又は重複する結合部位を有することは、ＰＳＤ－９５のアラニン変異導入によっても示され得る。残基の同一又は重複セットの変異導入が活性薬剤及びＴａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃの結合を減少させる場合、活性薬剤及びＴＡＴ－ＮＲ２Ｂ９ｃはＰＳＤ－９５上の同一又は重複する部位に結合する。いくつかの活性薬剤は、前記活性薬剤は、配列ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号２）の阻害剤ペプチドに結合した配列ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒ（配列番号９６）の内在化ペプチドを含み、前記内在化ペプチドの各アミノ酸がＤ－アミノ酸であり、前記阻害剤ペプチドの各アミノ酸がＬ－アミノ酸である活性薬剤；及び／又はｋｌｓｓＩＥＳＤＶ（配列番号１１７）（小文字がＤ－アミノ酸を示し、大文字がＬ－アミノ酸を示す）に結合した配列ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒ（配列番号９６）の内在化ペプチドを含み、前記内在化ペプチドの各アミノ酸がＤ－アミノ酸である活性薬剤；及び／又はアミノ酸配列ｖｄｓｅｉｓｓｌｋｒｒｒｑｒｒｋｋｒｇｙ（配列番号１１８）（小文字がＤ－アミノ酸を示す）を有する活性薬剤；と比較して低下した腎毒性及び／又はより高い治療指数を示す。腎毒性又は治療指数は、実施例又は本明細書に記載されるように測定することができる。半減期などの望ましい活性の増強、又は腎毒性などの望ましくない活性の減少とは、実験誤差を超えた増強又は減少、言い換えれば、９５％の確率で統計的に有意であることを指す。選択的に、増強は、少なくとも１０％、２５％、５０％、１００％、２００％、５００％又は１，０００％の向上を指し、減少は、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、９５又は９９％の低下を指す。
本発明の活性薬剤は、修飾アミノ酸残基（例えば、Ｎアルキル化された残基）を含むことができる。Ｎ末端アルキル修飾は、例えば、Ｎ－メチル、Ｎ－エチル、Ｎ－プロピル、Ｎ－ブチル、Ｎ－シクロヘキシルメチル、Ｎ－シクロヘキシルエチル、Ｎ－ベンジル、Ｎ－フェニルエチル、Ｎ－フェニルプロピル、Ｎ－（３、４－ジクロロフェニル）プロピル、Ｎ－（３，４－ジフルオロフェニル）プロピル、そして、Ｎ－（ナフタレン－２－イル）エチル）を挙げることができる。活性薬剤は、レトロペプチドを含んでもよい。レトロペプチドは、逆アミノ酸配列を有する。ペプチド模倣物は、アミノ酸の順序が逆であるレトロインベルソペプチドも含むため、元のＣ末端アミノ酸はＮ末端に現れ、Ｄ－アミノ酸はＬ－アミノ酸の代わりに使用される（例えば、ＲＩ－ＮＡ－１としても知られているアミノ酸ｖｄｓｅｉｓｓｌｋｒｒｒｑｒｒｋｋｒｇｙ（配列番号１１８））。
ペプチド、ペプチド模倣体又は他の薬剤の適当な薬理活性は、所望の場合、霊長類及び本出願に記載の臨床試験における試験に先立ち、前述の脳卒中のラットモデルを用いて、確認することができる。ペプチド又はペプチド模倣体は、ＰＳＤ－９５とＮＭＤＡＲ２Ｂとの相互作用を阻害する能力について、米国特許出願公開公報第ＵＳ２００５００５９５９７号に記載のアッセイを用いて、スクリーニングすることも可能であり、この公報は参照によって組み込まれる。有用なペプチドは、一般に、そのようなアッセイにおいて、５０μＭ，２５μＭ，１０μＭ，０．１μＭ又は０．０１μＭのＩＣ５０値を有している。好ましいペプチドは、一般に、０．００１～１μＭのＩＣ５０値を、より好ましくは、０．００１～０．０５，０．０５～０．５μＭ又は０．０５～０．１μＭのＩＣ５０値を有している。ペプチド又は他の薬剤が１つの相互作用、例えば、ＮＭＤＡＲ２ＢへのＰＳＤ－９５の相互作用、の結合を阻害するとして特徴付けられるとき、そのような表現は、ペプチド又は薬剤が、他の相互作用、例えば、ｎＮＯＳへのＰＳＤ－９５の結合、の相互作用をも阻害することを排除するものではない。
上述のようなペプチドは、随意的に、誘導体化（例えば、アセチル化、リン酸化、ミリストイル化、ゲラニル化、ペグ化及び／又はグリコシル化）して、阻害剤への結合親和性を高め、阻害剤の細胞膜を透過する能力を高め、又は安定性を高めることが可能である。具体的な例として、Ｃ末端から３番目の残基がＳ又はＴである阻害剤については、この残基は、そのペプチドを使用する前に、リン酸化することができる。
内在化ペプチドは、従来法によって阻害剤ペプチドに取り付けることができる。例えば、上記阻害剤ペプチドは、化学結合によって（例えば、結合又は接合薬剤を介して）内在化ペプチドに結合することができる。多数のかかる薬剤は、商業的に入手可能であり、Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ－Ｌｉｎｋｉｎｇ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）によって検討されている。架橋試薬のいくつか例として、Ｊ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）又はＮ，Ｎ'－（１，３－フェニレン）ビスマレイミド；Ｎ，Ｎ'－エチレンビス－（ヨードアセトアミド）又は６～１１個の炭素メチレンブリッジ（スルフヒドリル基に比較的特異的）を有する他のかかる試薬；そして、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン（それは、不可逆結合をアミノ基とチロシン基が不可逆結合を形成）が挙げられる。他の架橋試薬として、ｐ，ｐ'－ジフルオロ－ｍ，ｍ'－ジニトロジフェニルスルホン（アミノ基とフェノール基が不可逆架橋を形成）；ジメチルアジプイミド酸（アミノ基に特異的）；フェノール－１，４－ジスルホニルクロリド（主にアミノ基と反応）；ヘキサメチレンジイソシアナート又はジイソチオシアネート又はアゾフェニル－ｐ－ジイソシアナート（主にアミノ基と反応）；グルタルアルデヒド（いくつかの種々の側鎖と反応）及びジスジアゾベンジジン（ｄｉｓｄｉａｚｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）（主にチロシン及びヒスチジンと反応）が挙げられる。
リンカー（例えばポリエチレングリコールリンカー）は、阻害剤ペプチド、ペプチド又はペプチド模倣体の活性部分を二量化して、タンデムＰＤＺドメインを含有するタンパクに対する、その親和性及び選択性を向上させるのに使用することができる。Ｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４８：９６８５－９６８９及び国際特許出願公開公報第ＷＯ２０１０／００４００３号を参照。ＰＬモチーフ含有ペプチドは、好ましくは、２つの分子のＮ末端を結合して二量化され、Ｃ末端は自由のままとされる。Ｂａｃｈは、さらに、ＮＭＤＡＲ２ＢのＣ末端由来の五量体ペプチドＩＥＳＤＶ（配列番号５）が、ＰＳＤ－９５へのＮＭＤＡＲ２Ｂの結合の阻害に有効であることを報告している。ＩＥＴＤＶ（配列番号２２）もＩＥＳＤＶ（配列番号５）の代わりに使用することができる。選択的に、ＰＥＧの２～１０個のコピーは、直列に結合してリンカーとすることができる。選択的に、リンカーは、内在化ペプチドに結合するか、脂質化して細胞取り込みを強化することもできる。二量体阻害剤の例を以下に示す（ＩＥＴＤＶ，配列番号２２）（Ｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０９（２０１２）３３１７－３３２２）。

Ｒは、１つ以上のＤ-アミノ酸を含む本明細書に開示される内在化ペプチドのいずれかである。Ｎは、Ｏに置き換えることができる。本明細書に開示されているＰＳＤ－９５阻害剤のいずれもＩＥＴＤＶ（配列番号２２）、特にＩＥＳＤＶ（配列番号５）の代わりに使用することができ、任意の内在化ペプチド又は脂質化部分はｔａｔの代わりに使用することができる。示されている他のリンカーも使用できる。
内在化ペプチドは、阻害剤ペプチドに結合して融合ペプチドを形成することもでき、好ましくは内在化ペプチドのＣ末端で阻害剤ペプチドのＮ末端に結合され、阻害剤ペプチドのＣ末端は遊離末端となる。
ペプチドを内在化ペプチドに連結することに代えて、又は加えて、そのようなペプチドは脂質に連結して（脂質付加）、複合体の疎水性をペプチド単独よりも高め、これによって、連結ペプチドが細胞膜及び／又は脳関門を透過するのを促進することができる。脂質付加は、好ましくは、Ｎ末端アミノ酸において実施されるが、ＰＳＤ－９５とＮＭＤＡＲ２Ｂとの相互作用を阻害するペプチドの能力が、５０％を超えて低下しないことを条件に、内部アミノ酸においても実施することが可能である。好ましくは、脂質付加は、最もＣ末端の４個のアミノ酸の１つ以外のアミノ酸において実施される。脂質は、水よりもエーテルに溶け易い有機分子であり、脂肪酸、グリセリド及びステロイドを含む。脂質付加の好適な形態は、ミリストイル化、パルミトイル化、又は、ラウリル酸及びステアリン酸などの、好ましくは１０～２０炭素の鎖長を有する他の脂肪酸の付加のほか、ゲラニル化、ゲラニルゲラニル化及びイソプレニル化である。天然タンパクの翻訳後の変更で生じる種類の脂質付加が、好ましい。ペプチドのＮ末端アミノ酸のアルファアミノ基へのアミド結合の形成を介する、脂肪酸での脂質付加も好ましい。脂質付加は、予め脂質付加されたアミノ酸を含むペプチド合成により行うことができ、インビトロで酵素的に、又は、遺伝子組み換え発現によって、化学架橋によって、もしくはペプチドの化学的誘導体化によって、実施することができる。ミリストイル化によって変更されたアミノ酸及び他の脂質変更体は、市販されている。内在化ペプチドの代わりに脂質を使用することにより、プラスミン切断部位を提供するＫ及びＲ残基の数が減少する。いくつかの例示的な脂質付加分子には、好ましくはＮ末端に脂質付加を有するＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号２）、ｋｌＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号７０）、ｌＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号７１）、ＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号７２）、ＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号７３）、ＳＩＥＳＤＶ（配列番号７４）、ＩＥＳＤＶ（配列番号５）、ＫＬＳＳＩＥＴＤＶ（配列番号１２）、ｋｌＳＳＩＥＴＤＶ（配列番号７５）、ｌＳＳＩＥＴＤＶ（配列番号７６）、ＬＳＳＩＥＴＤＶ（配列番号７７）、ＳＳＩＥＴＤＶ（配列番号７８）、ＳＩＥＴＤＶ（配列番号７９）、ＩＥＴＤＶ（配列番号２２）が含まれる。
阻害剤ペプチド、選択的に内在化ペプチドに融合された阻害剤ペプチドは、固相合成又は遺伝子組み換え法によって合成することができる。ペプチド模倣体は、科学文献及び特許文献、例えば、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ Ｖｏｌｕｍｅｓ，Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ａｌ－Ｏｂｅｉｄｉ（１９９８）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：２０５－２２３；Ｈｒｕｂｙ（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：１１４－１１９；Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ（１９９７）Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．３：１７－２７；Ｏｓｔｒｅｓｈ（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：２２０－２３４、に記載されている様々な手順及び手法を用いて合成することができる。
ＩＩＩ．塩
上述のタイプのペプチドは、一般的に、固相合成によって作られる。固相合成では、トリフルオロアセテート（ＴＦＡ）を用いて保護基を除去するか樹脂からペプチドを除去するため、ペプチドは一般的に、トリフルオロ酢酸塩として最初は生産される。トリフルオロアセテートは、例えば、固体担体（例えばカラム）にペプチドを結合するステップと、カラムを洗浄して既存のカウンターイオンを取り除くステップと、新たなカウンターイオンを含む溶液でカラムを平衡化させるステップと、例えば、疎水性溶媒（例：アセトニトリル）をカラムに導入することによってペプチドを溶出させるステップによって、別のアニオンと置換することができる。アセテートへのトリフルオロアセテートの置換は、ペプチドを別の従来の固相合成法で溶出させる前に、最終工程としてアセテート洗浄で行なうことができる。トリフルオロアセテート又はアセテートをクロライドで置換することは、塩化アンモニウムで洗浄し、その次に溶出させることによって行なうことができる。疎水性担体の使用が好ましく、調製用逆相ＨＰＬＣは、特にイオン交換式が好ましい。トリフルオロアセテートは、クロライドで直接置換することもできるし、最初にアセテートで置換して、次に、アセテートをクロライドで置換することもできる。
トリフルオロアセテート、アセテート又はクロライドに関わらず、カウンターイオンは、Ｔａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃ及びそのＤバリアント、特にＮ末端アミノ基並びにアルギニン及びリジン残基のアミノ側鎖上の正に荷電する原子に結合する。本発明の実施に、Ｔａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃの塩及びそのＤバリアントにおけるアニオンに対するペプチドの正確な化学量を理解する必要はないが、最高約９つのカウンターイオン分子が塩の分子当たりに存在しているものと考えられる。
あるイオンによるそのカウンターイオンとの置換は効率的に生じるが、最終的なカウンターイオンの純度は１００％未満であってもよい。したがって、ＴＡＴ－ＮＲ２Ｂ９ｃ又はそのＤバリアントの塩化物塩に関する言及は、塩の調製品において、クロライドは、塩の凝集体に存在する全ての他のアニオンに対して、重量（又は、モル）当たりで主要なアニオンであることを意味する。言い換えると、クロライドは、塩に存在する全てのアニオンの５０重量又はモル％超、好ましくは７５重量又はモル％、９５重量又はモル％超、９９重量又はモル％超又は９９．９重量又はモル％超で構成されている。かかる塩又はこの塩から調製された製剤において、アセテート及びトリフルオロアセテート単独及び組み合わせは、重量又はモルで、塩又は製剤中のアニオンの５０％、２５％、５％、０．５％又は０．１未満で構成させている。
ＩＶ．製剤
活性薬剤は、液体製剤又は凍結乾燥製剤に製剤化することができる。液体製剤は、緩衝液、塩及び水を含み得る。好ましい緩衝液はリン酸ナトリウムである。好ましい塩は塩化ナトリウムである。安息香酸ナトリウムは、防腐剤とＤ－アミノ酸オキシダーゼの阻害剤（二重目的）として存在することができる。ｐＨは、例えばｐＨ７．０又は生理的レベルであり得る。
凍結乾燥製剤は、活性薬剤、緩衝剤、増量剤及び水を含む未凍結乾燥製剤から調製され得る。他の構成成分、例えば、凍結又は凍結乾燥保存剤、医薬的に許容可能なキャリア等が存在していても存在していなくてもよい。好ましい緩衝剤は、ヒスチジンである。安息香酸ナトリウムは、防腐剤とＤ－アミノ酸オキシダーゼの阻害剤（二重目的）として存在することができる。好ましい増量剤は、トレハロースである。トレハロースは、凍結又は凍結乾燥保存剤としての役割も果す。例示的な未凍結乾燥製剤は、活性薬剤、ヒスチジン（例えば、１０－１００ｍＭ、１５－１００ｍＭ、１５－８０ｍＭ、４０－６０ｍＭ又は１５－６０ｍＭ、例えば、２０ｍＭ又は選択的に５０ｍＭ、又は、２０－５０ｍＭ）及びトレハロース（５０－２００ｍＭ、好ましくは８０－１６０ｍＭ、１００－１４０ｍＭ、より好ましくは、１２０ｍＭ）を含む。ｐＨは、５．５～７．５、より好ましくは６－７、より好ましくは６．５である。活性薬剤の濃度は、２０－２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５０－１５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは７０－１２０ｍｇ／ｍｌ又は９０ｍｇ／ｍｌである。したがって、例示的な未凍結乾燥製剤は、２０ｍＭのヒスチジン、１２０ｍＭのトレハロース及び９０ｍｇ／ｍｌの活性薬剤の塩化物塩である。選択的に、ＵＳ１０，２０６，８７８にて説明しているように、製剤中の任意の残余アセテート又はトリフルオロアセテートを更に減らすために、アセチル化スカベンジャー（例えばリジン）を含めることができる。
凍結乾燥後、凍結乾燥製剤は、重量当たりの水分含量が低く、好ましくは約０％－５％水、より好ましくは２．５％未満である。凍結乾燥製剤は、フリーザー（例えば、－２０又は－７０℃）、冷蔵庫（０－４０℃）、又は、室温（２０－２５℃）で保存することができる。
活性薬剤は、水溶液、好ましくは注射用の水又は選択的に通常の生理食塩水（０．８－１．０％の生理食塩水及び好ましくは０．９％の生理食塩水）において再構成され得る。再構成品は、未凍結乾燥製剤と同一若しくは類似の量又はそれよりも多い量とすることができる。好ましくは、上記量は、再構成品のほうが再構成前のものよりも多い（例えば、３－６倍多い）。例えば、３－５ｍｌの未凍結乾燥量は、１０ｍＬ、１２ｍＬ、１３．５ｍｌ、１５ｍＬ若しくは２０ｍＬ又は特に１０－２０ｍＬの量として再構成することができる。再構成後、ヒスチジンの濃度は、好ましくは２－２０ｍＭ（例えば、２－７ｍＭ、４．０－６．５ｍＭ、４．５ｍＭ又は６ｍＭ）であり、トレハロースの濃度は、好ましくは１５－４５ｍＭ又は２０－４０ｍＭ又は２５－２７ｍＭ又は３５－３７ｍＭである。リジンの濃度は、好ましくは１００－３００ｍＭ（例えば、１５０－２５０ｍＭ、１５０－１７０ｍＭ又は２１０－２２０ｍＭ）である。活性薬剤は、好ましくは１０－３０ｍｇ／ｍｌ、例えば１５－３０、１８－２０、２０ｍｇ／ｍｌの活性薬剤又は２５－３０、２６－２８若しくは２７ｍｇ／ｍＬの活性薬剤の濃度である。再構成後の例示的な製剤は、４－５ｍＭのヒスチジン、２６－２７ｍＭのトレハロース、１５０－１７０ｍＭのリジン及び２０ｍｇ／ｍｌの活性薬剤（最も近い整数に丸めた濃度）を有する。再構成後の第二の例示的な製剤は、５－７ｍＭのヒスチジン、３５－３７ｍＭのトレハロース、２１０－２２０ｍＭのリジン及び２６－２８ｍｇ／ｍｌの活性薬剤（最も近い整数に丸めた濃度）を有する。再構成製剤は、例えば、通常の生理食塩水が入っている流体バッグに加えることによって投与前に更に希釈することができる。
ＩＶ．病状
活性薬剤は、様々な病状、特に神経病状及び特に興奮毒性によって部分的には媒介される病状を治療するのに有効である。かかる病状として、脳卒中、てんかん、低酸素症、くも膜下出血、脳震盪、脳卒中（例えば外傷性脳損傷及び脊髄損傷）と関連していないＣＮＳに対する外傷、他の脳虚血、再灌流傷害、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病及びパーキンソン病）が挙げられる。そのような病状には、網膜症、網膜虚血関連の他の眼障害、又は耳鳴りを含む目若しくは耳の障害又は疾患も含まれ得る。興奮毒性と関連していることが知られていない、本発明の活性薬剤によって治療可能な他の神経病状には、不安及び痛みが含まれる（神経障害性又は炎症性）。
脳卒中は、原因によらず、ＣＮＳにおける血流障害の結果の疾患である。原因となり得るものには、塞栓症、出血及び血栓症がある。血流の障害の結果として、いくつかのニューロン細胞が直ちに死ぬ。これらの細胞は、グルタメートを含むそれらの成分分子を放出し、これはＮＭＤＡ受容体を活性化し、ＮＭＤＡ受容体は、細胞内カルシウムレベル及び細胞内酵素レベルを上昇させて、さらなるニューロン細胞の死を招く（興奮毒性カスケード）。ＣＮＳ組織の死は、梗塞と呼ばれる。梗塞体積（つまり、脳において脳卒中の結果死んだニューロン細胞の体積）は、脳卒中に起因する病理学的損傷の程度の指標として使用することができる。症候性作用は、梗塞の体積及びそれが脳の何処に位置するかの、双方に依存する。ランキンストロークアウトカムスケール（Ｒａｎｋｉｎ，Ｓｃｏｔｔ Ｍｅｄ Ｊ；２：２００－１５（１９５７））及びバーセルインデックスなどの障害指数は、症候的損傷の測定に使用することができる。ランキンスケールは、以下のように、対象の全体的状態を直接評価することに基づいている。
０：完全に無症状。
１：症状にかかわらず重大な障害はない；通常の職務及び動作を行うことができる。
２：軽度の障害；従前のすべての動作を行うことはできないが、介助なしで自分の世話をすることができる。
３：中度の障害；いくらかの援助を必要とするが、介助なしで歩くことができる。
４：中度ないし重度の障害；介助なしでは歩くことができず、介助なしでは自分の身体の世話をすることができない。
５：重度の障害；寝たきりで、失禁を起こし、看護及び注意を常時必要とする。
バーセルインデックスは、日常生活の１０の基本的動作を行う対象の能力についての一連の質問に基づいており、結果は０～１００のスコアで表され、低いスコアは障害が重いことを示す（Ｍａｈｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｓｔａｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ １４：５６－６１（１９６５））。
代替の脳卒中重度／転帰は、ワールドワイドウェブｎｉｎｄｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｏｃｔｏｒｓ／ＮＩＨ 脳卒中 Ｓｃａｌｅ Ｂｏｏｋｌｅｔ．ｐｄｆにて入手可能な、ＮＩＨストロークスケールを用いて測定することができる。
このスケールは、対象の意識、運動、知覚及び言語機能のレベルの評価を含む、１１群の機能を行う対象の能力に基づいている。
虚血性脳卒中とは、より具体的には、脳への血流の妨害によって引き起こされる種類の脳卒中を指す。この種の妨害の基礎疾患は、血管壁を内張りする脂肪性沈着物の成長が、最も普通である。この疾患は、アテローム性動脈硬化と呼ばれる。これらの脂肪性沈着物は、２種類の妨害を引き起こし得る。脳血栓症とは、血管の詰まった部分に成長する血栓（血液塊）を指す。「脳塞栓」とは、一般に、循環系の他の場所、通常、心臓又は胸郭上部及び頸部の大動脈、で形成された血液塊を指す。次いで、血液塊の一部が抜け出して血流に入り、脳の血管を通って、最終的に、通り抜けるには小さすぎる血管に達する。塞栓の第２の重要な原因は、心房細動として知られる不規則な心拍である。これは、血液塊が心臓で形成され、遊離して脳に達する状況を生成する。虚血性脳卒中の原因となり得るさらなるものには、出血、血栓形成、動脈又は静脈の切開、心拍停止、出血を含むあらゆる原因のショック、及び、脳血管又は脳に達する血管の外科手術又は心臓手術などの医原生の原因が含まれる。虚血性脳卒中はすべての脳卒中の症例の、約８３％を占める。
一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）は、小脳卒中又は警告脳卒中である。ＴＩＡにおいては、虚血性脳卒中を示す状態が存在し、一般的な脳卒中の警告信号が現れる。ただし、妨害（血液塊）は、短時間生じて、通常の機構で自然に消える傾向にある。心臓手術を受ける対象は、一過性脳虚血発作の危険性が特に高い。
出血性脳卒中は、脳卒中症例の約１７％を占める。これは、弱くなった血管が破裂して周囲の脳に出血した結果で生じる。血液は鬱積し、周囲の脳組織を圧迫する。出血性脳卒中の２つの一般な種類は、脳内出血及びくも膜下出血である。出血性脳卒中は、弱くなった血管の破裂の結果である。弱くなった血管の破裂の原因となり得るものには、高い血圧が血管の破裂を引き起こす高血圧性出血、又は、弱くなった血管の他の根本原因、例えば、脳動脈瘤を含む破裂性脳血管奇形、動静脈奇形（ＡＶＭ）もしくは海綿状奇形など、が含まれる。出血性脳卒中は、梗塞部の血管を弱める虚血性脳卒中の出血性変化、又は、異常に弱い血管を包含するＣＮＳにおける原発性もしくは転移性の腫瘍からの出血によっても生じ得る。出血性脳卒中は、脳血管への直接の外科的損傷などの、医原生の原因からも生じ得る。動脈瘤は、血管の弱った領域の膨張である。放置すると、動脈瘤は弱くなり続け、最終的に破裂して脳に出血する。動静脈奇形（ＡＶＭ）は、異常に形成された血管の房である。海綿状奇形は、弱くなった静脈構造からの出血を引き起こし得る静脈異常である。これらの血管のいずれも、破裂して、脳への出血を引き起こし得る。出血性脳卒中は、物理的な外傷によっても発生する可能性がある。脳の一部分における出血性脳卒中は、出血性脳卒中で失われる血液の不足を通じて、他の部分に虚血性脳卒中をもたらし得る。
治療に適する１つの対象のクラスは、脳に供給している血管に関与する若しくは関与する可能性がある、そうでなければ脳若しくはＣＮＳに関与する若しくは関与する可能性がある外科手術処置を受けている対象である。いくつかの例では、心肺バイパス、頚動脈ステント術、脳又は大動脈弓の冠状動脈の診断的血管造影、脈管外科的処置及び神経外科的処置を受けている対象である。かかる対象の更なる例は、上記セクションＩＶにて述べている。脳動脈瘤対象が特に適している。かかる対象は、動脈瘤を留め血液を閉ざすこと、又は、小さいコイルを用いて若しくは動脈瘤が現れている血管にステントを導入して若しくはマイクロカテーテルを挿入して動脈瘤を遮断する血管内手術を実行することを含む様々な外科的処置によって治療することができる。血管内処置は、動脈瘤を留めることより侵襲性が低く、より良好な対象の転帰と関連しているが、この転帰は小さい梗塞の発生率がそれでも高い。かかる対象は、上述のＮＭＤＡＲ ２ＢとのＰＳＤ９５の相互作用の阻害剤及び、とりわけ、上記薬剤を用いて治療することができる。手術を実行することに対する投与のタイミングは、上記の通り、治験による可能性がある。
治療を受けやすい他のクラスの対象は、動脈瘤を伴う又は伴わないくも膜下出血を有する対象である。（ＵＳ６１／５７０，２６４参照）。他のクラスの対象は、ＥＳＣＡＰＥ－ＮＡ１ 試験など凝血塊を除去するための血管内血栓切除術に適した虚血性脳卒中の対象である（ＮＣＴ０２９３００１８）。薬物は、手術の前後に投与して凝塊を除去することができ、脳卒中自体と、上記の手順に関連する潜在的な医原性脳卒中の両方の結果を改善することが期待され得る。別の例は、画像診断基準を使用せずに脳卒中の可能性があると診断され、脳卒中発症後の数時間以内、好ましくは脳卒中発症後の最初の３時間以内、選択的に、最初の６、９又は１２時間以内に治療を受ける対象である（ＮＣＴ０２３１５４４３に類似）。
ＩＶ．有効な投与計画
活性薬剤は、治療する病状を患っている対象の病状の少なくとも一つの兆候又は症状の更なる悪化を治癒するか、低減させるか、又は阻害するのに有効な量、頻度及び投与経路にて投与されるように投与される。治療有効量（投与前）又は投与後の治療有効血漿濃度は、著しく本発明の薬剤で治療されない、病状を患っている対象（又は、動物モデル）のコントロール群の損傷と比較して、本発明の薬剤で治療される病状を患っている対象（又は、動物モデル）群において治療される病状又は状態の少なくとも一つの兆候又は症状の更なる悪化を治癒するか、低減させるか又は阻害するのに十分な活性薬剤の量又はレベルを意味する。上記量又はレベルは、個々に治療した対象が本発明の方法によって治療されていない比較対象のコントロール群における平均転帰より良好な転帰を達成する場合、治療的に有効であるとも考えられる。治療的に有効な投与計画には、本発明の目的を達成するのに必要な投与頻度及び経路で治療的に有効な量を投与することが含まれる。
脳卒中又は他の虚血性状態を患っている対象に関して、活性薬剤は、脳卒中又は他の虚血性状態の損傷の影響を低減させるのに有効な用量、頻度及び経路を含む投与計画にて投与される。治療を必要とする状態が脳卒中である場合、転帰は、梗塞体積又は障害指数によって決定することができ、個々に治療した対象がＲａｎｋｉｎスケールが２又は２未満及びより少ないもの及びＢａｒｔｈｅｌスケールが７５又は７５超の障害度を示す場合、又は、治療した対象群が比較未治療群よりも障害度のスコア分布が大幅に改善した（即ち、障害がより小さい）ことを示す場合、用量は治療的に有効であると考えられる（Ｌｅｅｓ ｅｔ ａｔ Ｌ， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００６；３５４：５８８－６００を参照）。単回用量の薬剤で、脳卒中の治療には充分であってもよい。
本発明は、病状のリスクがある対象における病状の予防のための方法及び製剤も提供する。通常、かかる対象は、コントロール群と比較して病状（例えば、病気、障害又は疾患）が進行する可能性が高い。コントロール群には、例えば、診断も受けておらず病状の家族歴もない母集団（例えば、年齢、性別、人種及び／又は民族がマッチした母集団）から選択される１又は複数の個人を含めることができる。対象は、病状と関連する「危険因子」がその対象と関連しているとことが見出された場合、障害のリスクがあると考えることができる。危険因子には、対象群に対する統計学的又は疫学的調査を通じた、所定の障害に伴う任意の活量、形質、事象又は特性を含めることができる。したがって、対象は、根底にある危険要因を同定する調査が具体的に対象を含まなかった場合であっても、障害のリスクがあるとして分類することができる。例えば、心臓手術を受けている対象は、心臓手術を受けた対象群とそれを受けなかった対象群と比較して一過性脳虚血発作の頻度が増加するため、一過性脳虚血発作のリスクにさらされている。
脳卒中に関する他の一般的な危険要因には、年齢、家族歴、性別、脳卒中、一過性脳乏血発作又は心臓発作の事前の発病率、高血圧、喫煙、糖尿病、頸動脈又は他の動脈疾患、心房細動、他の心臓病（例えば心臓病、心不全、拡張心筋症、心臓弁疾患及び／又は先天性心臓の欠陥）、高血液コレステロール及び飽和脂肪、トランス脂肪又はコレステロールが高い食事が含まれる。
予防において、活性薬剤は、病状のリスクがあるがまだ病状を患っていない対象に、病状の少なくとも一つの兆候又は症状の進行を防止、遅延又は阻害するのに十分な量、頻度及び経路で投与される。投与前の予防有効量又は投与後の血漿中濃度は、著しく本発明の活性薬剤で治療されていない病状のリスクがあるヒト対象（又は、動物モデル）のコントロール群と比較して、薬剤で治療した病状のリスクがあるヒト対象（又は、動物モデル）の群における病状の少なくとも一つの兆候又は症状を防止、阻害又は遅延させるのに十分な薬剤の量又はレベルを意味する。上記量又はレベルは、個々に治療した対象が本発明の方法によって治療されていない比較対象のコントロール群における平均転帰より良好な転帰を達成する場合、予防的に有効であるとも考えられる。予防的に有効な投与計画には、本発明の目的を達成するのに必要な投与頻度及び経路で予防的に有効な量を投与することが含まれる。脳卒中の差し迫ったリスクがある対象（例えば、心臓手術を受けている対象）における脳卒中の予防に関して、単回用量の薬剤で通常充分である。
薬剤に応じて、投与は、非経口、静脈内、肺内、経鼻、経口的、皮下、動脈内、脳内、髄腔内、腹膜内、局所、鼻腔内、筋肉内であってもよい。
従来、Ｔａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃは２．６ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注入によりヒトに投与されている。本発明の活性薬剤は、Ｔａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃと比較して、皮下、鼻腔内又は筋肉内などの非静脈経路により投与される場合、より高いＣＭａｘ及びＡＵＣを得ることができる。より長い半減期は、活性薬剤が血漿に到達するのに必要な追加の時間を補うためである。このような非静脈内経路による投与はまた、肥満細胞の脱顆粒による顕著な量のヒスタミン放出がなく、より高い用量で投与することを可能にする。例えば、約１０ｍｇ／ｋｇまでの用量は顕著なヒスタミンの放出がなく使用することができ、２５ｍｇ／ｋｇまでの用量では検出可能なヒスタミンが放出されるが、同じ用量の静脈内投与よりもはるかに少ない。
投与経路及びヒスタミン放出又はその下流効果を低減するために抗炎症薬と共投与されるか否かに応じて、様々な用量で投与することができる。静脈内投与の場合では、本発明の薬剤は、抗炎症薬と共投与されない場合、Ｔａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃと同様の用量（例えば、３ｍｇ／ｋｇ以下、０．１－３ｍｇ／ｋｇ、２－３ｍｇ／ｋｇ若しくは２．６ｍｇ／ｋｇ）で投与することができ、或いは抗炎症薬と共投与される場合、より高い用量（例えば、５つ以上、１０、１５、２０若しくは２５ｍｇ／ｋｇ）で投与することができる（少なくとも０．２５ｍｇ／ｋｇから２５ｍｇ／ｋｇの範囲での有効性を示す図３０Ａ及び図３０Ｂを参照）。皮下、鼻腔内、肺内又は筋肉内などの経路の場合では、抗炎症薬と共投与されない場合、用量は最大１０、１５又は２０ｍｇ／ｋｇになる可能であり、抗炎症薬と共投与される場合、用量は１０、１５、２０、２５又は５０ｍｇ／ｋｇを超える。より高い用量で抗炎症薬を投与する必要性は、より長期間にわたる活性薬剤の投与によって減少又は排除することができる（例えば、１分間未満、１～１０分間、及び１０分間を超える投与は、一定量のヒスタミン放出及び抗炎症薬の必要性が経時的に減少又は排除される代替的な投与計画を構成する）。
活性薬剤は、単回投与又は複数回投与計画として投与することができる。単回投与計画は、急性虚血性脳卒中などの急性病状の治療に使用して梗塞及び認知障害を軽減することができる。このような用量は、神経血管手術を受けている対象などの病状のタイミングが予測可能な場合、病状の発症前に投与することができ、或いは病状が発症した後のウィンドウ内（例えば、最大１、３、６又は１２時間後）で投与することができる。
複数回投与計画は、長期間（例えば、少なくとも１、３、５若しくは１０日、又は少なくとも、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月若しくは無期限）にわたって活性薬剤が血漿中で検出可能なレベルに維持されるように設計することができる。例えば、活性薬剤は、毎時間、１日２、３、４、６、又は１２回、毎日、隔日、毎週などに投与することができる。このような投与計画は、単回投与の場合のように、急性病状から初期障碍を軽減し、その後、まだ進行している病状からの回復を促進することができる。このような投与計画は、アルツハイマー病やパーキンソン病などの慢性疾患の治療にも使用することができる。活性薬剤は、放出制御製剤に組み込まれて複数回投与計画に使用されることがある。
活性薬剤は、制御製剤又はコーティングなど、身体からの急速な排出から化合物を保護する担体を用いて調製することができる。このような担体については、修飾、遅延、持続若しくは徐放又は胃貯留剤形としても知られており、例えば、Ｄｅｐｏｍｅｄ ＧＲTMシステムでは、薬剤は、胃の中で膨潤し、多くの薬剤の毎日の投与に十分な約 ８ 時間保持するポリマーによってカプセル化される。放出制御システムには、マイクロカプセル化送達システム、インプラント、生分解性及び生体適合性ポリマー（例えば、コラーゲン、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸）、マトリックス型放出制御デバイス、浸透圧型放出制御デバイス、多粒子放出制御デバイス、イオン交換樹脂、腸溶コーティング、多層コーティング、ミクロスフェア、ナノ粒子、リポソーム、及びそれらの組み合わせが含まれる。活性薬剤の粒子サイズを変えることにより、活性薬剤の放出速度を変更することもできる。修飾した放出の例として、例えば米国特許３，８４５，７７０、９１６，８９９、３，５３６，８０９、３，５９８，１２３、４，００８，７１９、５，６７４，５３３、５，０５９，５９５、５，５９１，７６７、５，１２０，５４８、５，０７３，５４３、５，６３９，４７６、５，３５４，５５６、５，６３９，４８０、５，７３３，５６６、５，７３９，１０８、５，８９１，４７４、５，９２２，３５６、５，９７２，８９１、５，９８０，９４５、５，９９３，８５５、６，０４５，８３０、６，０８７，３２４、６，１１３，９４３、６，１９７，３５０、６，２４８，３６３、６，２６４，９７０、６，２６７，９８１、６，３７６，４６１、６，４１９，９６１、６，５８９，５４８、６，６１３，３５８、お及び６，６９９，５００に記載のものが挙げられる。
Ｄ－アミノ酸を含む活性薬剤は腎毒性の影響を受けやすく、腎毒性は、薬剤におけるＤ－アミノ酸含有量と用量に応じて増加する。腎毒性は、活性薬剤及びＤ－アミノ酸オキシダーゼ阻害剤を同時投与することによって軽減することができる。このような阻害剤は、例えば統合失調症の治療のために以前に提案されている。このような阻害剤の多くの例が記載されている（例えば、Ｓａｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒ．Ｄｓ．１９：２４９９－５１１（２０１３）；Ｓｚｉｌａｇｙｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２４，２９０（２０１９）；Ｔｅｒｒｙ Ｌｏｒｅｎｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ Ｒｅｐ．３４，ｅ００１３３（２０１４）；Ｋａｔａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５６，１８９４-１９０７（２０１３）；Ｓａｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ １９，２４９９－２５１１（２０１３））。このような阻害剤の例は、リスペリドン、安息香酸ナトリウム又は５－クロロ－ベンゾ［ｄ］イソオキサゾール－３－オールを含む。このような阻害剤は、活性薬剤の前、後、又は同時に投与することができる。後者の場合、共製剤として又は別々に投与することができる。安息香酸ナトリウムは、医薬組成物の防腐剤としても使用されるので、共製剤において二重の目的を果たすことができる。
Ｖ．抗炎症薬との共投与
用量及び投与経路に応じて、本発明の活性薬剤は、肥満細胞の脱顆粒、並びにヒスタミンの放出及びその続発症を特徴とする炎症反応を誘導する可能性がある。例えば、ＩＶ投与では少なくとも ３ｍｇ／ｋｇの用量、他の経路では少なくとも１０ｍｇ／ｋｇの用量がヒスタミンの放出を引き起こす。
炎症反応の１つ又は複数の側面を阻害するための抗炎症薬は多くあり、容易に入手可能である。抗炎症薬の好ましいクラスは、肥満細胞脱顆粒阻害剤である。このクラスの化合物は、クロモリン（５，５'－（２－ヒドロキシプロパン－１，３－ジイル）ビス（オキシ）ビシ（４－オキシ－４Ｈ－クロメン－２－カルボン酸）（クロモグリケートとしても知られている）、２－カルボキシラートクロモン－５'－イル－２－ヒドロキシプロパン誘導体、例えば、ビス（アセトキシメチル）、クロモグリケート二ナトリウム、ネドクロミル（９－エチル－４，６－ジオキソ－１０－プロピル－６，９－ジヒドロ－４Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］キノリン－２，８－ジ－カルボン酸）、トラニラスト（２－｛［（２Ｅ）－３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロプ－２－エノイル］アミノ｝）、及びロドキサミド（２－［２－クロロ－５－シアノ－３－（オキサロアミノ）アニリノ］－２－オキソ酢酸）を含む。特定の化合物は、その化合物の薬学的に許容される塩を含む。クロモリンは、経鼻、経口、吸入、又は静脈内投与用の製剤として容易に入手可能である。本発明の実施はメカニズムの理解に依存しないが、これらの薬剤は、内在化ペプチドによって誘導される炎症反応の初期段階で作用するため、血圧の一時的な低下を含む続発症の発生を阻害するのに最も効果的であると考えられている。後述する他のクラスの抗炎症薬は、肥満細胞の脱顆粒に起因する１つ以上の下流イベントを阻害し、例えば、Ｈ１又はＨ２受容体へのヒスタミンを阻害するが、肥満細胞脱顆粒の全ての続発症を阻害することができないか、又はより高い用量若しくは併用が必要とされる。以下の表２は、本発明と併用可能ないくつかの肥満細胞脱顆粒阻害剤の名称、化学式及びＦＤＡ状態を示す。
抗炎症薬の別のクラスは、抗ヒスタミン化合物である。このような薬剤は、ヒスタミンとその受容体との相互作用を阻害することにより上記炎症の続発症を阻害する。多くの抗ヒスタミン薬は市販されており、一部はＯＴＣである。抗ヒスタミン薬の例として、アザタジン、アゼラスチン、バーフロリン、セチリジン、シプロヘプタジン、ドキサントロゾール、エトドロキシジン、フォルスコリン、ヒドロキシジン、ケトチフェン、オキサトミド、ピゾチフェン、プロキシクロミル、Ｎ，Ｎ'－置換ピペラジン又はテルフェナジンが挙げられる。抗ヒスタミン薬は、ＣＮＳ及び末梢受容体の抗ヒスタミンをブロックする能力が異なり、第 ２ 世代及び第 ３ 世代の抗ヒスタミン薬は末梢受容体に対して選択性を持っています。アクリバスチン、アステミゾール、セチリジン、ロラタジン、ミゾラスチン、レボセチリジン、デスロラタジン及びフェキソフェナジンは、第 ２ 世代及び第 ３ 世代の抗ヒスタミン薬の例である。抗ヒスタミン薬は、経口製剤及び局所製剤として広く入手可能である。使用可能な他のいくつかの抗ヒスタミン薬を以下の表３に示す。
炎症反応を阻害するのに有用な別のクラスの抗炎症薬は、コルチコステロイドである。これらの化合物は転写調節因子であって、肥満細胞の脱顆粒に起因するヒスタミンやその他の化合物の放出によって引き起こされる炎症症状の強力な阻害剤である。コルチコステロイドの例として、コルチゾン、ヒドロコルチゾン（Ｃｏｒｔｅｆ）、プレドニゾン（Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ，Ｍｅｔｉｃｏｒｔｅｎ，Ｏｒａｓｏｎｅ）、プレドニゾロン（Ｄｅｌｔａ－Ｃｏｒｔｅｆ，Ｐｅｄｉａｐｒｅｄ，Ｐｒｅｌｏｎｅ）、トリアムシノロン（Ａｒｉｓｔｏｃｏｒｔ，Ｋｅｎａｃｏｒｔ）、メチルプレドニゾロン（Ｍｅｄｒｏｌ）、デキサメタゾン（Ｄｅｃａｄｒｏｎ，Ｄｅｘｏｎｅ，Ｈｅｘａｄｒｏｌ）及びベタメタゾン（Ｃｅｌｅｓｔｏｎｅ）が挙げられる。コルチコステロイドは、経口、静脈内及び局所製剤として広く入手可能である。
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）も使用することができる。このような薬は、アスピリン化合物（アセチルサリチラート）、非アスピリンサリチレート、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナメート、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、フェニルブタゾン、スリンダク、トメチンを含む。しかし、このような薬の抗炎症効果は、抗ヒスタミン薬やコルチコステロイドよりも低い。アザチオプリン、シクロホスファミド、ロイケラン、シクロスポリンなどの強力な抗炎症薬も使用できるが、作用が遅く、及び／又は副作用を引き起こすため、望ましくない。Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）やＨｕｍｉｒａ（登録商標）などの生物学的抗炎症薬も使用できるが、同じ理由で望ましくない。
炎症反応を阻害する際に、異なるクラスの薬物と併用することができる。好ましい併用は、肥満細胞脱顆粒阻害剤と抗ヒスタミン剤である。
内在化ペプチドに結合した薬理学的薬剤が抗炎症薬と共に投与される方法において、両者は、抗炎症薬が内在化ペプチドによって誘導される炎症反応を阻害できるように十分に短い投与間隔で投与される。抗炎症薬は、前記薬理学的薬剤の投与前、同時又は投与後に投与することができる。好ましい投与間隔は、抗炎症薬の薬物動態及び薬力学に部分的に依存する。抗炎症薬は、薬理学的薬剤が投与される時点で抗炎症薬が最大血清濃度に近くなるように、薬理学的薬剤の投与前に間隔を置いて投与することができる。典型的には、抗炎症薬は、薬理学的薬剤投与の６時間前から１時間後に投与される。例えば、抗炎症薬は、薬理学的薬剤投与の１時間前から３０分間後に投与され得る。好ましくは、抗炎症薬は、薬理学的薬剤投与の３０分間前から１５分間後に投与され、より好ましくは、薬理学的薬剤投与の１５分間前から薬理学的薬剤投与時に投与される。いくつかの方法において、抗炎症薬は、薬理学的薬剤が投与される前の１５、１０又は５分間内に投与される。いくつかの方法において、抗炎症薬は、薬理学的薬剤投与の１－１５、１－１０又は１－５分間前に投与される。
静脈内注入のように薬剤の投与が瞬間的でない場合、抗炎症薬と薬理学的薬剤は、それらの投与期間が同程度又は重複する場合、同時に投与されると見なされる。投与前の投与期間は、投与開始時から始まる。投与後の期間は、投与の終了時から始まる。抗炎症薬の投与に関する期間は、その投与の開始を指す。
抗炎症薬が内在化ペプチドに結合した薬理学的薬剤の炎症反応を阻害できると言われる場合において、このような反応が特定の対象に発生する可能性がある場合（このような反応が当該対象に発生することを必ずしも意味するものではない）、抗炎症薬が内在化ペプチドに結合した薬理学的薬剤によって誘導可能な炎症反応を阻害するのに十分に短い投与間隔で両者が投与されることを意味する。一部の対象は、対照臨床試験又は非臨床試験において、統計的に有意な数の対象で炎症反応に関連する内在化ペプチドに結合した薬剤の投与量で治療される。このような対象のかなりの割合が、必ずしも全てではないが、内在化ペプチドに結合した薬理学的薬剤に対して抗炎症反応を起こすと合理的に推測することができる。一部の対象では、内在化ペプチドに結合した薬剤に対する炎症反応の徴候又は症状が検出されるか又は検出可能である。
個々の対象の臨床治療において、通常、抗炎症薬の存在下と非存在下で、内在化ペプチドに結合した薬理学的薬剤からの炎症反応を比較することはできない。しかし、対照臨床試験又は前臨床試験において、同じ又は類似の共投与条件下で有意な阻害が見られる場合、抗炎症薬はペプチドによって誘導される炎症反応を阻害すると合理的に結論付けることができる。対象の結果（血圧、心拍数、蕁麻疹など）は、個々の対象に阻害が発生したかどうかの指標として臨床試験における対照群の典型的な結果と比較することもできる。通常、抗炎症薬は、薬理学的薬剤の投与後１時間以内のある時点で検出可能な血清濃度で存在する。多くの抗炎症薬の薬物動態は広く知られており、それに応じて抗炎症薬の投与の相対的なタイミングを調整することができる。抗炎症薬は、通常、末梢に投与され、即ち、血液脳関門によって脳から分離される。例えば、抗炎症薬は、論議されている薬剤に応じて、経口、経鼻、静脈内又は局所的に投与することができる。抗炎症薬が薬理学的薬剤と同時に投与される場合、両者は組み合わせた製剤として投与することができ、別々に投与することもできる。
いくつかの方法において、抗炎症薬は、少なくとも脳内で検出可能な薬理学的活性を発揮するのに十分な量で経口又は静脈内投与された場合、血液脳関門を通過しないものである。このような薬剤は、それ自体が脳内で検出可能な治療効果を発揮することなく、肥満細胞の脱顆粒及び末梢における活性薬剤の投与に起因するその続発症を阻害することができる。いくつかの方法において、抗炎症薬は、血液脳関門の透過性を高めるための共処理なしで投与されるか、血液脳関門を通過する能力を高めるために誘導体化若しくは製剤化される。しかし、他の方法において、抗炎症薬は、その性質、誘導体化、製剤化、又は投与経路により、脳に侵入するか又は脳内の炎症に影響を与えることによって、肥満細胞の脱顆粒及び／又は内在化ペプチドによる末梢におけるその続発症を抑制し、脳内の炎症を阻害するという二重の効果を発揮することができる。ＷＯ０４／０７１５３１（Ｓｔｒｂｉａｎら）には、肥満細胞脱顆粒阻害剤であるクロモグリケートのｉ．ｃ．ｖ．投与（非静脈内投与）は、動物モデルでの梗塞に対して直接な抑制作用を有することが報道されている。
いくつかの方法において、対象は、活性薬剤と共投与される前及び／又は後の日、週又は月内に活性薬剤と共投与される同じ抗炎症薬で治療されていない。いくつかの方法において、対象が反復投与計画（例えば、同じ量、投与経路、投与頻度、投与日のタイミング）で活性薬剤と共投与される同じ抗炎症薬で治療されている場合、抗炎症薬と活性薬剤の共投与は、量、投与経路、投与頻度及び投与日のタイミングのいずれか又はすべてにおいて反復投与計画と一致しない。いくつかの方法において、対象が本方法において活性薬剤と共投与される抗炎症薬の投与を必要とする炎症性疾患又は病状に罹患していることは知られていない。いくつかの方法において、対象は、肥満細胞脱顆粒阻害剤で治療可能な喘息又はアレルギー疾患に罹患していない。いくつかの方法において、抗炎症薬及び活性薬剤はそれぞれ疾患のエピソードごとに上記のように定義されたウィンドウ内で一度だけ投与される。エピソードは、症状が現れないか又は軽減される長い期間に隣接する、疾患の症状が現れる比較的短い期間である。
抗炎症薬は、抗炎症薬の非存在下で炎症反応が起こることが知られている条件下で、内在化ペプチドに対する炎症反応を阻害するのに有効な量、頻度及び経路の投与計画で投与される。抗炎症薬の結果として炎症の徴候又は症状が減少する場合、炎症反応は抑制される。炎症反応の症状には、発赤、蕁麻疹などの発疹、熱、腫れ、痛み、ヒリヒリ感、かゆみ、吐き気、発疹、口渇、しびれ、気道のうっ血などが含まれる。炎症反応は、血圧や心拍数などの徴候を測定することによって監視することもできる。あるいは、炎症反応は、肥満細胞の脱顆粒によって放出されるヒスタミン又は他の化合物の血漿濃度を測定することによって評価することができる。肥満細胞の脱顆粒によって放出されるヒスタミン又は他の化合物のレベルの上昇、血圧の低下、蕁麻疹などの皮膚の発疹、又は心拍数の低下は、大量細胞の脱顆粒の指標である。実際的には、上記抗炎症薬のほとんどの投与量、投与計画、及び投与経路は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ' Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ 及び／又は製造業者から入手することができ、このような抗炎症薬は、このような一般的なガイダンスと一致する本発明の方法に使用することができる。
ＶＩ．血栓溶解剤との共投与又は機械的再灌流
虚血を引き起こすプラーク及び血液塊（塞栓としても知られる）は、薬理的手段及び物理的手段の双方によって、溶解し、除去し、又は迂回することが可能である。プラーク及び血液塊の溶解及び除去ならびに結果として生じる血流の回復は、再灌流と呼ばれる。１つのクラスの薬剤は、血栓溶解により作用する。血栓溶解剤は、プラスミンの産生を促進することによって機能する。プラスミンは、架橋したフィブリンの網目（血液塊の骨格）を消去して、血液塊を可溶にし、他の酵素によるさらなるタンパク分解に付し、閉塞した血管の血流を回復させる。血栓溶解剤の例には、組織プラスミノーゲン活性化因子ｔ－ＰＡ、アルテプラーゼ（Ａｃｔｉｖａｓｅ）、レテプラーゼ（Ｒｅｔａｖａｓｅ）、テネクテプラーゼ（ＴＮＫａｓｅ）、アニストレプラーゼ（Ｅｍｉｎａｓｅ）、ストレプトキナーゼ（Ｋａｂｉｋｉｎａｓｅ，Ｓｔｒｅｐｔａｓｅ）、及び、ウロキナーゼ（Ａｂｂｏｋｉｎａｓｅ）が含まれる。
再灌流に使用することができる薬理学的薬剤の他のクラスは、血管拡張剤である。これらの薬理学的薬剤は、血管を弛緩させ拡げて、血液が閉塞の周囲を流れるようにすることで、作用する。血管拡張剤の種類のいくつかの例には、アルファ－アドレナリン受容体拮抗剤（アルファ－ブロッカー）、アンジオテンシン受容体ブロッカー（ＡＲＢ）、β２－アドレナリン受容体拮抗剤（β２－ブロッカー）、カルシウムチャンネルブロッカー（ＣＣＢ）、中枢作用性交感神経遮断剤、直接作用性血管拡張剤、エンドセリン受容体拮抗剤、神経節遮断剤、ニトロ拡張剤（ｎｉｔｒｏｄｉｌａｔｏｒ）、ホスホジエステラーゼ阻害剤、カリウムチャンネル開口剤、及び、レニン阻害剤が含まれる。
再灌流に使用することができる薬理学的薬剤の他のクラスは、エピネフリン、フェニレフリン、プソイドエフェドリン、ノルエピネフリン、ノルエフェドリン、テルブタリン、サルブタモール、及び、メチルエフェドリンなどの、昇圧剤（つまり、血圧を上昇させる薬剤）である。上昇した灌流圧は、障害物の周囲の血液の流れを増大させ得る。
再灌流のための機械的手段には、血管形成、カテーテル挿入、及び、動脈バイパス移植手術、ステント留置、塞栓除去、又は、動脈内膜切除が含まれる。これらの処置は、プラークの機械的除去によってプラークの流れを回復し、血管を開いたままに維持することにより、血液がプラークの周りを流れ、又はプラークを迂回し得る。
再灌流の他の方法には、血流を身体の他の領域から脳に転用する装置の使用が含まれる。１つの例は、大動脈を部分的に閉塞するカテーテルであり、例えば、ＣｏＡｘｉａ ＮｅｕｒｏＦｌｏ（商標）カテーテル装置であり、これは、最近、無作為化試験に付されており、脳卒中治療についてのＦＤＡの認可を受けるかも知れない。この装置は、虚血の発症後１４時間までの脳卒中を示す対象に使用されている。
Ｄ－アミノ酸を含む本発明の活性薬剤は、再灌流療法の任意の形態で、治療を受けやすい対象に投与することができる。しかし、本発明の活性薬剤は、活性薬剤に１つ以上のＤ－アミノ酸を含めることにより血栓溶解剤によって誘導されるプラスミンによる切断に対する活性薬剤の感受性が低下するため、血栓溶解剤との投与に特に有利である。したがって、１つ以上のＤ－アミノ酸を含む活性薬剤は、血栓溶解剤によって誘導される活性薬剤の切断をもたらす投与計画で血栓溶解剤と共投与することができる。例えば、血栓溶解剤は、活性薬剤が投与される前の６０分間、３０分間又は１５分間のウィンドウ以内に投与することができる。いくつかの方法において、活性薬剤は、血栓溶解剤と同時に投与することができる。活性薬剤と血栓溶解剤は、共製剤化されてもよいか、又は別々に投与されてもよい。いくつかの方法において、血栓溶解剤は、活性薬剤が投与される前に投与され、活性薬剤が投与されるときに血清中に検出可能なレベルで持続する。
前もって予測することができない虚血の治療については、活性薬剤は、虚血の発症後できるだけ又は実際的に速やかに、投与することができる。例えば、活性薬剤は、虚血の発症後０．５，１，２，３，４，５，６，９，１２又は２４時間以内に、投与することができる。前もって予測することが可能な虚血については、活性薬剤は、虚血の発症の前に、発症と同時に、又は発症の後に、投与することができる。例えば、手術に起因する虚血については、ＰＳＤ－９５阻害剤は、虚血が生じているか生じそうであるかにかかわらず定期的に、手術の開始前３０分から始まり手術後１，２，３，４，５，６，９，１２又は２４時間に終わる期間に、投与されることがある。活性薬剤は、重大な副作用がないので、脳卒中又は虚血の他の状態が疑われるときは、当技術分野において承認されている基準に従う診断がなされていなくても、投与することが可能である。例えば、活性薬剤は、脳卒中が起こった場所（例えば、対象の家庭）で、又は、対象を病院に搬送する救急車の中で、投与することができる。活性薬剤は、また、発症前の脳卒中又は虚血の他の状態の危険性があり、実際にその状態を生じるかも生じないかも知れない対象にも、安全に投与することができる。
活性薬剤の投与に続いて、又は、時には投与の前に、虚血の兆候及び／又は症状を呈する対象は、対象がＣＮＳにおけるもしくはそうでなければＣＮＳに影響する虚血を有するか否かを判断し、対象が出血を有するあるいは出血を疑われるか否かを判断するための、診断評価にさらに付され得る。脳卒中の症状を呈する対象において特に、その脳卒中が出血又は虚血のどちらの結果であるかを判断する試験では、出血が脳卒中の１７％を占める。診断試験は、ＣＡＴスキャン、ＭＲＩもしくはＰＥＴ画像スキャンなどの１つ以上の器官のスキャン、又は、脳卒中が起こっていることを示唆する生体標識についての血液検査を含み得る。Ｂ型神経成長因子、フォン・ヴィレブランド因子、マトリクスメタロプロテイナーゼ－９、及び、単球走化性タンパク－１（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９：１７３３－１７３９（２００３）を参照）を含む、脳卒中に関係するいくつかの生体標識が知られている。スキャンされる器官には、虚血の場所であると疑われるあらゆる器官（例えば、脳、心臓、四肢、脊椎、肺、腎臓、網膜）に加え、そうではなく、出血の源であると疑われる他のあらゆる器官、が含まれる。脳のスキャンが、虚血性脳卒中と出血性脳卒中を識別するための通常の処理である。診断評価は、また、対象の医療暦を取得又は考察し、他の試験を行うことも含み得る。次の因子のいずれかが、単独で又は組み合わせで、存在することは、再灌流療法が許容できない危険性をもたらすか否かの評価に使用することができる：対象の症状が、深刻でないか速やかに改善される；対象が、脳卒中の始まりに発作を有していた；対象が、過去３ヶ月以内に別の脳卒中又は重篤な脳外傷を有していた；対象が、最近１４日以内に大きな手術を受けた；対象が、頭蓋内出血の既知の病歴を有している；対象が、＞１８５ｍｍＨｇの持続的な収縮期血圧を有する；対象が、＞１１０ｍｍＨｇの持続的な拡張期血圧を有する；対象の血圧を下げるために、積極的治療が必要である；対象が、くも膜下出血を示唆する症状を有する；対象が、最近２１日以内に胃腸の又は尿路の出血を有していた；対象が、最近７日以内に非圧縮性部位に動脈穿刺を受けた；対象が、最近４８日以内にヘパリンを投与され、高いＰＴＴを有している；対象のプロトロンビン時間（ＰＴ）が＞１５秒である；対象の血小板数が、＜１００，０００μＬである；対象の血清グルコースが、＜５０ｍｇ／ｄＬ又は＞４００ｍｇ／ｄＬである；対象が、血友病患者であるか、他の凝固欠乏を有する。
さらなる診察調査は、承認されている基準に従って、又は、少なくともより大きな可能性で、調査の前に対象が虚血性疾患を有しているか、及び、対象が出血を有するか、出血の許容できない危険性を有しているか、又は、そうでなければ、別の面で副作用の許容できない危険性により再灌流療法を受けることから除外されるか、を決定する。ＣＮＳにおける又はそうでなければＣＮＳに影響する虚血性疾患の診断が確認される対象であって、副作用の許容できない危険性のない対象は、再灌流療法に付すことができる。再灌流療法は、あらゆる診断処理の完了後、できるだけ速やかに実施される。
活性薬剤での治療及び再灌流療法での治療の両者は、虚血による梗塞サイズ及び機能障害を低減する能力を個別に有する。組み合わせて使用するとき、梗塞サイズ及び／又は機能障害の低減は、好ましくは、組み合わせのためのものではない同等の投与計画の下で投与されるどちらかの薬剤のみの使用から生じる低減よりも大きい。より好ましくは、梗塞サイズ及び／又は機能障害の低減は、少なくとも、組み合わせを除く同等の投与計画の下で投与された単独の薬剤で達成される低減を加えたものであり、好ましくは加えたものを超える。いくつかの投与計画において、再灌流療法は、ＰＳＤ－９５阻害剤の共投与又は先行投与がなければ有効ではないときに、虚血の発症後の一時点（例えば、４．５時間超）で梗塞サイズ及び／又は機能障害を低減するのに有効である。換言すると、対象が活性薬剤及び再灌流療法を実施されるとき、再灌流療法は、好ましくは、少なくとも、活性薬剤なしでより早い時点で実施される場合と同様に、有効である。したがって、活性薬剤は、再灌流療法が効果を生じる前又は生じるときに、虚血の１つ以上の損傷作用を低減することによって、再灌流療法の効果を効果的に向上させる。活性薬剤は、したがって、再灌流の実施の遅れを、その遅れが、対象を病院又は他の医療施設に搬送する途中での、対象における彼又は彼女の初期症状の危険性を認識することの遅れ、あるいは、虚血の存在及び／もしくは出血の非存在又はその許容できない危険性を確証するための診断処理の実施の遅れの、どちらに由来するかにかかわらず、補償することができる。活性薬剤と再灌流療法との、相加的効果又は相乗的効果を含む統計的に有意な組み合わせ効果は、臨床試験において集団間で、又は、臨床前研究において動物モデルの集団間で、実証することができる。
Ｘ．Ｔａｔバリアントと他の薬剤との結合
上記のｔａｔバリアントは、任意の他の薬剤と結合して細胞膜及び／又は血液脳関門を介した薬剤の取り込みを促進することができる。治療法におけるｔａｔバリアント及び薬剤を含むか、又はそれらからなるキメラ薬剤の使用は、薬剤単独の使用と比較して、意図された部位でのバイオアベイラビリティを改善し、血漿半減期及び／又は治療指数を増加させ、及び／又は同じ用量でのＣＭａｘ及びＡＵＣなどの薬物動態値を改善する。ｔａｔバリアントは、細胞内標的を有する薬剤及び／又は活性を発揮するために血液脳関門を通過する必要がある神経活性薬剤に特に有用である。ｔａｔバリアントの結合に適した薬剤のすべてではないが、一部はペプチドである。ｔａｔ変異体の使用は、生物学的利用能が低く、用量が多く、又は半減期が短い既存の医薬品に特に有用である。
薬剤の選択、結合方法、及びそれらの使用に関するいくつかのガイダンスは、以前のｔａｔペプチドに関する科学文献及び特許文献によって提供されている（例えば、ＵＳ６，３１６，００３及びＵＳ５，８０４，６０４）。脳卒中及び関連疾患の治療のためのｔａｔバリアントに結合した阻害剤ペプチドを含むキメラペプチドに関する上記の説明は全て、別の薬剤に結合したｔａｔバリアントを含むキメラ薬剤に適用される。
本発明は、キメラ薬剤を含む。前記キメラ薬剤は、障害を治療するための薬剤に結合した内在化ペプチド又はそのバリアントを含む。前記内在化ペプチドは、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）を含むアミノ酸配列を有する。前記バリアントは、最大１、２又は３つの置換又は欠失（同じアミノ酸のＬからＤへの置換を含まない）を含む。前記内在化ペプチドの３－５残基は、Ｄ－アミノ酸である。いくつかのキメラ薬剤において、前記内在化ペプチドは、３－５残基がＤ－アミノ酸であるＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１）又はＹＧＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１２５）を含むアミノ酸配列を有する。いくつかのキメラ薬剤において、前記内在化ペプチドは、参照とするＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１）又はＹＧＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１２５）のいずれかと少なくとも７５、８０、８５又は９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのキメラ薬剤において、各Ｄ残基は、Ｋ若しくはＲ、又はＫ若しくはＲに対するＣ末端残基に位置する。いくつかの活性薬剤において、前記内在化ペプチドは、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される４つ以上の連続アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ又はＫから独立して選択される隣接アミノ酸を含む。いくつかの活性薬剤において、前記内在化ペプチドは、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される４つ以上の連続アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ又はＫから選択されるアミノ酸を含む。いくつかの活性薬剤において、前記内在化ペプチドは、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される５つ以上の連続アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ又はＫから独立して選択される隣接アミノ酸を含み、４つの前記連続アミノ酸のストレッチが存在する場合、このストレットは、内在化ペプチドのＮ末端に位置する。いくつかの活性薬剤において、前記内在化ペプチドは、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される５つ以上の連続アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ又はＫから選択されるアミノ酸を含み、４つの前記連続アミノ酸のストレッチが存在する場合、このストレットは、内在化ペプチドのＮ末端に位置する。いくつかの活性薬剤において、前記内在化ペプチドは、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有し、Ｎ末端から番号付けされて３位～５位の間にあるＤ残基、７位又は８位にあるＤ残基、及び９位～１１位の間にあるＤ残基の３つのＤ残基を有する。いくつかの活性薬剤において、前記薬剤は、スペーサを介して前記内在化ペプチドに結合される。
下表には、薬剤名（一部承認薬）、それらが治療に役立つ疾患（急性及び慢性）、薬物の投与経路（確立された範囲）、ｔａｔバリアントペプチドによってもたらされる膜を通過する輸送の改善によって部分的に克服され得る既存の薬剤の問題についてのコメントが示される。
薬剤に結合したｔａｔ変異体ペプチドを含むキメラ薬剤は、モルベースで薬剤単独と同じ用量又はそれより低い用量で使用することができ、薬剤単独と同じ経路で投与することができ、薬剤単独と同じ疾患の治療に投与することができる。開示されているペプチド：活性結合体の好ましい投与方法は、静脈内、動脈内、鼻腔内／吸入、筋肉内、腹腔内、舌下、直腸内、及び局所（真皮又は上皮細胞の近位の障害の場合）である。
本発明を、理解を明瞭にするために詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲内で、一定の変更をしてもよい。本出願で引用するすべての文献、受託番号、及び特許文献は、各々について個別にそうであると述べるのと全く同様に、それらの全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。異なる時点で、１つ以上の配列が受託番号に関連付けられている場合、その受託番号に関連する配列は、本出願の有効な出願日のものであることが意図されている。有効な出願日は、問題の受託番号を開示した最も早い優先出願の日である。文脈から他に明らかでない限り、本発明のあらゆる要素、実施形態、工程、機能又は特徴は、他との組み合わせで実施することが可能である。
実施例
実施例は、下記の名称及び配列を有するペプチドに関する。小文字はＤ－アミノ酸、大文字はＬ－アミノ酸を示す。
ＮＡ－１（ａｋａ Ｔａｔ－ＮＲ２Ｂ９ｃ又はネリネチド）：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号５８）
Ｄ－ＴＡＴ－Ｌ－２Ｂ９ｃ：ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号８０）
ＮＡ－３：ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋｌｓｓＩＥＳＤＶ（配列番号６）
Ｄ－ＮＡ－１：ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒｋｌｓｓｉｅｓｄｖ（配列番号８１）
１．ＮＡ－１におけるプラスミン切断部位
プラスミンは、ｔＰＡなどの血栓溶解剤によって誘導される血清プロテアーゼである。プラスミン切断部位は、Ｌ－アミノ酸からなるペプチドの塩基性アミノ酸残基のＣ末端側に現れる可能性がある。
ＮＡ－１をプラスミンで消化し、生成物を質量分析で分析した。以下の切断産物が検出された。
ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号５８）（全長ＮＡ－１，未消化）
ＲＲＱＲＲＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号８２）
ＲＱＲＲＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号８３）
ＱＲＲＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号８４）
ＲＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号８５）
ＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号８６）
ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号２）
ＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号８７）
これらの切断産物は、図１に示すように、ＮＡ－１が９つの潜在的な部位のうち７つで切断されることを示している。しかし、他の２つの部位での切断は、より低い程度で発生する可能性がある。
２．ラット又はヒト血漿中のｔＰＡと同時に投与されたＮＡ－１の分解
ラット又はヒト血漿を以下の濃度でＮＡ－１単独又はｔＰＡとの併用で処理した。
ＮＡ－１単独［６５ｕｇ／ｍＬ］（Ｎ＝４）
ＮＡ－１［６５ｕｇ／ｍＬ］＋ｒｔ－ＰＡ［２２．５ｕｇ／ｍＬ］（Ｎ＝４）
ＮＡ－１［６５ｕｇ／ｍＬ］＋ｒｔ－ＰＡ［６７．５ｕｇ／ｍＬ］（Ｎ＝４）
ＮＡ－１［６５ｕｇ／ｍＬ］＋ｒｔ－ＰＡ［１３５ｕｇ／ｍＬ］（Ｎ＝４）
サンプルは、６つの異なる時点で収集された。
図２及び図３はそれぞれ、ｔＰＡと共投与された場合は、ＮＡ－１の単独投与と比較して、ラット血漿（インビトロ）又はヒト血漿（インビトロ）でのＮＡ－１含有量が急激に減少したことを示す。図４は、ＮＡ－１及びｔＰＡをラットに投与した後、様々な時点で血漿を収集してＮＡ－１のレベルを確定した後のＣＭａｘ及びＡＵＣが同様に減少したことを示す。従って、インビトロ又はインビボでｔＰＡとＮＡ－１を一緒に投与した場合、ｔＰＡ はラット又はヒト血漿でＮＡ－１の切断を誘導する。ｔＰＡもＴＮＫも、リン酸緩衝生理食塩水だけでは ＮＡ－１を直接切断しない（データを示せず）。したがって、ＮＡ－１の切断は、動物血漿又は血液中でのプラスミノーゲンの活性化の結果である。
３．Ｄ－アミノ酸を含むペプチドの分解
図５では、インビトロでのラット血漿に単独又はｔＰＡと同時に投与されたＮＡ－１とＤ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ９Ｃ（Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＮＡ－１とも呼ばれる）。ｔＰＡで処理したＮＡ－１は、約１５分間以内にゼロに減少した一方、Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ９Ｃは、ｔＰＡと共投与された後、僅かな分解を示した。図６は、ラット血漿と類似のヒト血漿の結果を示す。このような分解は、ｔＰＡの用量に伴って増加した。
ｔＰＡの代わりにＴＮＫ－組織プラスミノーゲン活性化因子を用いて実験を繰り返した。ＴＮＫ－組織プラスミノーゲン活性化因子は、より長い半減期を有するｔＰＡの生物工学的バリアントである。ｔＰＡの代わりにＴＮＫを用いて同様の結果が得られた。ＮＡ－１はＴＮＫの共投与で急速な分解を示した一方、Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ９Ｃは安定していた（図７、図８）。
図９は、ＰＢＳ中のプラスミンによるＮＡ－１又はＤ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ９Ｃの処理についての類似の結果を示す。ＮＡ－１は急速に分解した一方、Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ９Ｃ はプラスミンの有無にかかわらず類似の安定性を示した。血漿を供給しないとｔＰＡはプラスミンを生成しないため、ＰＢＳ緩衝液（血漿なし）中のｔＰＡによる対照処理は、ＮＡ－１又はＤ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ９Ｃの分解を示さなかった。
４．Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＮＲ２Ｂ９ｃはＰＳＤ－９５：ＮＲ２Ｂ９ｃ複合体を破壊する。
Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを用いて３つの軟膜血管モデル(３ＰＶｏ）を構築した。脳卒中発症の１時間後に、プラセボ、ＮＡ－１又はＤ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ９Ｃをそれぞれ７．６ｍｇ／ｋｇでラットに投与した。脳卒中発症の２時間後に脳を採取した。分析のために皮質脳卒中領域を収集した。抗ＰＳＤ－９５又は抗ＮＭＤＡＲ２Ｂを用いて免疫沈降を行った。サンプル中のＰＳＤ－９５及びＮＭＤＡＲ２Ｂの量は、ウェスタンブロッティングによって分析された。ＰＳＤ－９５－ＮＭＤＡＲ２Ｂ 複合体形成の減少は、処理に対するプラセボの倍数減少によって評価された。図１０は、ＮＡ－１及びＤ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ９Ｃの両方が予め形成されたＮＭＤＡＲ２Ｂ：ＰＳＤ－９５複合体を解離することができ、インビボで効果的に作用することを示す。
５．ＰＳＤ－９５に対する結合親和性
競合ＥＬＩＳＡアッセイにより結合を評価した。プレートを５０ｍＭ重炭酸緩衝液中の１μｇ／ｍｌのＰＳＤ９５ＰＤＺ２でコーティングし、４℃で一晩静置した。プレートをＰＢＳＴ中の２％ ＢＳＡ（０．０５％）で室温で２時間ブロッキングした。その後、１５０ｎｇ／ｍｌ のビオチン化 ＮＡ－１ と様々な試験化合物（初期濃度１２０ｕｇ／ｍｌ、３倍希釈液）の混合物でプレートを４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳ－Ｔで適切に洗浄した後、プレートを（１：３０００）ＳＡ－ＨＲＰで３０分間インキュベートしました。ウェルを再度洗浄し、ＴＭＢ溶液で１０分間インキュベートした。反応を１００ｕｌのＨ２ＳＯ４で停止させた。Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１リーダーを用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。
図１２は、ビオチン化されたＮＡ－１、Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ９Ｃ及びＤ－Ｔａｔ－Ｌ－ＩＥＳＤＶ（配列番号６）がそれぞれＰＳＤ－９５ドメイン２に結合したことを示し、並びにＮＡ－１、Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ９Ｃ及びＤ－ＮＡ－１のＥＣ５０を示す。ＮＡ－１とＤ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ９ＣのＥＣ５０は、実験誤差の範囲内でほぼ同じである一方、Ｄ－ＮＡ－１のＥＣ５０ は約 １０ 倍低かった。この結果は、ＰＳＤ－９５への結合に最も関与するＮＡ－１の Ｃ 末端残基を Ｄ－アミノ酸に変換すると、結合親和性が低下するという証拠を提供する。Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ９Ｃ及びＤ－Ｔａｔ－Ｌ－ＩＥＳＤＶ（配列番号６）は、標的タンパク質ＰＳ９５ＰＤＺ２に用量依存的に結合する。両方の試験ペプチドは、ＩＣ５０値＜５μＭを達成する（図１１）。図１１は、ＩＣ５０が互いに２のファクター以内であったことを示し、これは実験の誤差範囲内でした。
６．薬物動態分析
ラットを仰臥位で麻酔（イソフルラン１．５％）し、０．５Ｌ／ｍｉｎＯ２で自発呼吸させた。採血のために左大腿動脈をカニューレ処理した。
ビヒクルの全容量中の安定した濃度で試験薬剤を調製した。１ｃｃシリンジに接続された１４Ｇ カテーテルによる挿管によって肺内点滴注入を行い、カテーテルを通して試験薬を送達する。１部位あたりの総量が２ｍｌを超えないように左脇腹の領域に、皮下（ＳＱ又はＳＣ）注射した。
化合物ＮＡ－１、Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＮＡ１、Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＩＥＳＤＶ（配列番号６）及びＤ－ＮＡ－１を試験した。各投与戦略について、３匹のラットで各用量を評価した。計画された用量レベル及び経路を以下の表５に示す。最初の実験では、２つの異なる投与経路（ＳＱとＰＩ）を評価し、８つの異なる時点（投与前及び投与後の７つの時点：１、２．５、５、１０、１５、３０、６０ｍｉｎ（２５０ｕｌ／サンプル））で血液サンプルを採取した。２４時間のＰＫ曲線実験では、１１個の時点（投与前、投与後の２．５、５、１０、１５、３０、６０ｍｉｎ、３ｈｒ、６ｈｒ、１２ｈｒ及び２４ｈｒ）で血液サンプルを採取した。
ＨＰＬＣ定量分析
血漿を血液から分離し、使用するまで－８０℃で保存した。各サンプルに１ＭのＨＣｌ（１０ｕｌ／１００ｕｌサンプル）を＞８０℃で加えて沈殿させ、遠心分離(１２，０００ｒｐｍ×１５ｍｉｎ）し、沈殿物を集めました。２５ｃｍのＣ－１８ＲＰ－ＨＰＬＣカラムを１０％アセトニトリルと０．１％ＴＦＡで４０℃で平衡化し、サンプルを注入し、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍで分析した。（１．５ｍＬ／ｍｉｎで３０分間；０．１％ＴＦＡ中の１０％から３５％アセトニトリルのグラジエント；２２０ｎｍで吸光度を検出）。ＨＰＬＣの標準曲線は、既知量の試験試薬が添加されたサンプルを用いて作成された。
図１３に示すように、皮下ＮＡ－１は同じ用量の静脈内ＮＡ－１よりもＣＭａｘがはるかに低く、ＡＵＣがやや低かく、半減期が長かった。筋肉内ＮＡ－１は、静脈内ＮＡよりもＣＭａｘが低く、ＡＵＣがやや高く、半減期が長かった。
図１４に示すように、皮下Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＩＥＳＤＶ（配列番号６）（ＮＡ－３）は、皮下ＮＡ－１と比較してＣｍａｘ及びＡＵＣ化合物を増加させた。皮下Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ９Ｃ及びＤ－ＮＡも皮下ＮＡ－１と比較してＣｍａｘ及びＡＵＣを増加させたが、Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＩＥＳＤＶ（配列番号６）と同程度ではなかった。図１５Ａ－Ｂに示すように、皮下Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＩＥＳＤＶ（配列番号６）のＣｍａｘ及びＡＵＣは、用量依存性であり、用量とともに直線的に増加する。
図１６に示すように、Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＩＥＳＤＶ（配列番号６）の肺内点滴注入は、ＮＡ－１又はＤ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ９Ｃと比較してより高いＣＭａｘをもたらした。
７．ヒスタミン放出に対するペプチドの効果
３つの異なる用量でＮＡ－３［ＳＱ］が投与されたラットから血漿サンプルを用いてヒスタミン放出に対するＤ－Ｔａｔ－Ｌ－ＩＥＳＤＶ（配列番号６）注射の効果を試験した。１１つの時点（投与前、投与後の２．５、５、１０、１５、３０、６０ｍｉｎ、３ｈｒ、６ｈｒ、１２ｈｒ及び２４ｈｒ）で血漿サンプルを収集した。市販されているヒスタミンＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ＥＬＩＳＡ－Ｈ１５３１－Ｋ０１， Ｅａｇｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてヒスタミンレベルを定量化した。プレートを血漿サンプル（５０μｌ／ウェル）でコーティングし、オービタルシェーカー上で中程度の頻度、室温で６０分間インキュベートした。次に、１００μｌの酵素コンジュゲートをウェルに加え、室温で２０分間インキュベートした。サンプルを再度洗浄し、ＴＭＢ溶液とともに室温で２５分間インキュベートした。反応を１００μｌのＨ２ＳＯ４で停止させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーにより４５０ｎｍで吸光度を測定した。
血液サンプルを注射前及び投与後０、１、２．５、５、１０、１５、３０、６０分間の時点で採取し、市販キットを用いたヒスタミンレベルの定量化に使用した。このサンプリング期間は、ラットサンプル（Ｎ＝３動物／群）にＩＶ注射した後にＮＡ－１で観察されたヒスタミン上昇の期間をカバーする。
図１７に示すように、Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＩＥＳＤＶ（配列番号６）の用量８．３ｍｇ／ｋｇ又は２．８ｍｇ／ｋｇでの皮下投与は、顕著なヒスタミン放出をもたらさなかった。７．６ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）でのＤ－Ｔａｔ－Ｌ－ＮＡ１は、顕著なヒスタミン放出をもたらした。２５ｍｇ／ｋｇ（ＳＱ）でのＤ－Ｔａｔ－Ｌ－ＩＥＳＤＶ（配列番号６）は、ヒスタミン放出をもたらしたが、７．６ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）よりもはるかに少なかった。７．６ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）でのＤ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ９Ｃで誘導されたヒスタミンは、ロドキサミドの共投与によって抑止された（図１８）。
したがって、Ｄ－アミノ酸を含む活性薬剤の皮下投与は、静脈内投与と比較してより高い用量でヒスタミン放出を減少させる。
８．塞栓ＭＣＡ閉塞モデルにおける神経保護剤としてのＤ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ９Ｃの有効性
動物をイソフルランで麻酔した（誘導用５％、手術用２％、維持用１．５％）。薬物投与、血圧モニタリング及び採血のために、大腿静脈及び動脈をＰＥ－５０チューブでカニューレ処理した。完全なモニタリング（脳血流、動脈血ガス、血漿グルコース、温度）は、手術前と手術中に行われた。すべての生理学的パラメータは正常範囲内に維持された。標準的なレーザードップラーモニター（ＰＦ５０１０ ＬＤＰＭ ユニットと ＰＦ５００１ メインユニット、Ｐｅｒｉｍｅｄ、Ｊaｒｆaｌｌａ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）に接続されたＰＲ４０７－１直針ＬＤＦプローブ（Ｐｅｒｉｍｅｄ、Ｊaｒｆaｌｌａ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、相対的な脳血流を連続的に測定した。中大脳動脈塞栓性脳卒中の場合、ＰＥ－１０ ５ｃｍチップを備えたＰＥ－５０チューブを、外頸動脈を介して内頸動脈から頭蓋底まで挿入し、事前に準備した単一の赤い血餅を手動で注入した。７分間後、総頸動脈（ＣＣＡ）のカテーテル及びクリップを外した。全手順及び注射の間、動物を麻酔状態に維持した。脳卒中発症の１時間後に治療薬剤を同時に投与した。神経保護剤は静脈内ボーラスにより注射され（＜３０秒）、血栓溶解剤は最初の１０％がボーラス注射により１分間以内で投与され、総用量の残りの９０％が１時間かけて注入された。投与終了後、加熱ランプ付きの清潔なケージに動物を回収した。脳卒中モデルの急性の性質のため、行動評価として神経学的スコアテスト（姿勢反射及び前肢配置テスト（グレード：０－１２））のみを実行した。ニューロスコア試験の直後（脳卒中発症の２４時間後）、動物を安楽死させた。脳を摘出し、厚さ１．５ｍｍの８枚のスライスを冠状に切り出し、染色のために３７℃の塩化２，３，５－トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）の２％溶液に入れた。切片をスキャンし、梗塞体積をＩｍａｇｅＪソフトウェアで測定した。脳腫脹も測定した。
この研究には以下のグループが含まれた。
偽（Sham）（手術なし）（Ｎ＝１０）
プラセボ（陰性対照）（Ｎ＝１２）
ＮＡ－１単独［７．６ｍｇ／ｋｇ］（陽性対照）（Ｎ＝１１）
Ｄ－ＴＡＴ－Ｌ－ＮＡ１Ｌｏｄｏ［７．６ｍｇ／ｋｇ］（Ｎ＝１２）
ｒｔ－ＰＡ単独［５．４ｍｇ／ｋｇ］（Ｎ＝１０）
ＮＡ－１［７．６ｍｇ／ｋｇ］＋ｒｔ－ＰＡ［５．４ｍｇ／ｋｇ］（陰性対照）（Ｎ＝１２）
Ｄ－ＴＡＴ－Ｌ－ＮＡ１Ｌｏｄｏ［７．６ｍｇ／ｋｇ］＋ｒｔ－ＰＡ［５．４ｍｇ／ｋｇ］（Ｎ＝１７）
図１９に示すように、ｔＰＡ処理がない場合、ロドキサミドとＮＡ－１又はＤ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ９Ｃとの併用は、いずれも梗塞体積と右半球の腫脹を顕著に減少させた。ｔＰＡが共投与された場合、Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＮＡ１とロドキサミドの併用のみが梗塞及び右半球の腫脹から顕著に保護した。この結果は、ｔＰＡに誘導されるＮＡ－１のタンパク質分解がその効果を低下させることにより説明され得る。Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－ＮＡ１は、D－残基を含めることによってこのようなタンパク質分解から保護されるため、依然として有効である。図２０は、神経学的転帰について同様の効果を示す。したがって、Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ９Ｃは、ｒｔ－ＰＡなどの血栓溶解剤と同時に投与された場合でも、血漿安定性の改善（１回拍出量の減少及び行動転帰の改善）を示す。
９．ＰＳＤ－９５阻害剤の皮下投与
Ｃ末端の５つのアミノ酸に加えてＤ－アミノ酸を含むＰＳＤ－９５阻害剤が脳卒中のモデルで効果的であるとともに皮下注射により投与され得ることを実証するために、一連の動物実験を行った。図２１は、脳卒中のラット３軟膜血管閉塞モデルにおけるネリネチド又はＮＡ－３の３つの用量レベル（２．６、７．６又は２５ｍｇ／ｋｇ）の皮下投与を比較する。脳卒中発症から６０分間後に、ボーラス注射により皮下投与して治療した。ＮＡ－３とネリネチドを２５ｍｇ／ｋｇの濃度で投与されたラットは、プラセボと比較して、梗塞体積の顕著な減少を示した。７．６ｍｇ／ｋｇでのＮＡ－３も梗塞体積を顕著に減少させたが、同じ濃度のネリネチドは梗塞体積の減少を達成できなかった。データは平均±ＳＤで表される（Ｎ＝１０／群）。アスタリスク（＊）は、プラセボと比較した場合の統計的有意性を表す（Ｔｕｋｅｙ'ｓ ｐｏｓｔ－ｈｏｃ ａｎａｌｙｓｉｓを含むＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０３３２、＊＊Ｐ＜０．００２１、＊＊＊Ｐ＜０．０００２及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。ＮＡ－３はこのモデルで効果的であり、Ｃ末端の５つのアミノ酸（ＩＥＳＤＶ、配列番号：５）以外のすべてのアミノ酸をＤ－アミノ酸に変更すると、脳卒中及びＰＳＤ－９５阻害に効果的であることを示している。さらに、安定性の向上は、皮下投与されたネリネチドよりも有効性の向上に寄与する可能性がある。ネリネチドの２５ｍｇ／ｋｇ用量とＮＡ－３の７．６ｍｇ／ｋｇ用量の間で同等の神経保護（梗塞体積の減少）が観察され、３倍低い用量のＮＡ－３も同様に有効であることを示唆している。
神経保護に必要な用量がはるかに少ないラットの脳卒中の一過性モデルとは異なり、脳卒中の３軟膜血管閉塞モデルにおける神経保護には、２μｇ／ｍＬ（又はモル当量）以上のネリネチドの血漿濃度が必要なようである。図２２は、前のモデル（図２１）の動物からの投与の１５分間後でのＮＡ－３及びネリネチドの血漿濃度を示す。血漿中濃度は約３時間上昇し続け、その後低下するが、脳卒中などの緊急兆候のために、血液と脳に急速に蓄積することが重要である。これは、本明細書に記載の構造を有するＰＳＤ－９５阻害剤の皮下投与が、迅速な時間枠で治療濃度を達成できることを示している。薬物動態サンプルを分析するために、１μＬの適切なストックを１００μＬ の血漿に添加することによりネリネチドの濃度が０、２．５、５、１０、１５、２０及び４０μｇ／ｍＬの校正標準サンプルを調製した。薬物動態サンプル分析用の ＮＡ－３ 標準曲線を作成するために、１μＬの適切なストックを１００μＬの血漿に添加することによりＮＡ－３の濃度が０、２．５、５、１０、１５、２０及び４０ｕｇ／ｍＬの校正標準サンプルを調製した。ネリネチド（２５ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝６））、ネリネチド（７．６ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝８））、ネリネチド（２．５ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝４））又はＮＡ－３（２５ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝７））、ＮＡ－３（７．６ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝９））ＮＡ－３（２．５ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝９））及びプラセボ（Ｎ＝８）を皮下投与した１５ｍｉｎ後に血液サンプルを収集した。データは平均±ＳＤで表される。図２２は、ネリネチド又はＮＡ－３の単回皮下投与後の治療用量とＣｍａｘの間の用量比例性を示す。ＮＡ－３は、同じ用量のネリネチドと比較して、より高い血漿中安定性及び投与した１５分間後のより高い濃度を示す。
血漿中濃度がヒトでの研究により知られた有効濃度（２．６ｍｇ／ｋｇの用量で約１０ｕｇ／ｍＬの血漿濃度）と同等又はそれ以上であることを確認するために、２５ｍｇ／ｋｇ又は７．６ｍｇ／ＫｇのＮＡ－３を非ヒト霊長類（カニクイザル）に皮下注射により投与し、血漿サンプルを異なる時点で試験した（図２３）。両方の濃度も、ヒトにおいて効果的であることが証明されたものよりも高く、２．６ｍｇ／ｋｇのＮＡ－１の静脈内投与量よりも高い血漿濃度を達成することができた（Ｈｉｌｌ，Ｌａｎｃｅｔ ２０２０）。図２４は、試験した注射レベルの薬物動態プロファイルを示す。すべての値は平均±ＳＤで表される。ネリネチド単独と比較した場合の統計的有意性は＊で表される（ｐｏｓｔ－ｈｏｃ ｔｕｒｋｅｙ'ｓ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎを含むｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０１）（Ｃｍａｘ：外挿された時間ゼロ値に基づく最大血漿濃度；ｔ１／２：終末期での半減期；ｔｍａｘ：Ｃｍａｘに到達するまでの時間；ＡＵＣ０－ｔ：０から最後の測定値までの濃度－時間曲線下面積；ＡＵＣ０－ｉｎｆ：０から無限大まで外挿した濃度－時間曲線下面積；Ｃｌ：総クリアランス）。データは、１群あたり３～４匹の動物の平均±ＳＤで表される。（－）は、ＡＵＣ０－ｉｎｆが２０％を超え、Ｒ２が０．９を下回っているため、報告されていないデータを表します。（－）は、ＡＵＣ０－ｉｎｆの外挿値が２０％を超え、Ｒ２が０．９未満であるため報告されていないデータを表す。
ＮＡ－３皮下投与後のＮＨＰ動物の生理学的パラメータを調べたところ、静脈内ネリネチドと比較して、重大な安全性の問題は確認されなかった（図２５）。ヒトでは３．７５ｍｇ／ｋｇを超えるＮＡ－１の用量、又はラット若しくはイヌでは７．６ｍｇ／ｋｇの静脈内投与で観察されたように、ＮＡ－１と比較して血圧の有意な低下は観察されないため、改善を示している。
次に、用量を制限する有害事象が存在するかどうかを評価するために、ＮＡ－３を投与したラットでＭＴＤ研究を実施した。ラットにおける２５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇの皮下用量は、クレアチニン及びＢＵＮ（血中尿素窒素）の用量依存的な増加を示し、腎臓に対する悪影響を示した（図２６Ａ、Ｂ）。これらの増加は、ＮＡ－３の２５ｍｇ／ｋｇ用量群では投与後１日目に観察され（左図）、７日目まで持続した。７．６ｍｇ／ｋｇ又は２．６ｍｇ／ｋｇのＮＡ－３の皮下用量では範囲外の値は観察されなかった。したがって、ＮＡ－３は脳卒中の治療に効果的に投与できるが、治療指数（最小有効量と観察されない最大の副作用レベルの差の尺度）は低い。治療薬にとって大きな治療指数を有することは有利である。
プラスミン耐性ＰＳＤ－９５阻害剤の治療指数を高めるために、腎毒性を特性評価し、大量のＤ－アミノ酸の投与による影響を確定した。治療範囲を広げるために、用量の減少、阻害剤中のＤ－アミノ酸の数の減少、及び高濃度での腎毒性と関連する活性を持つＤ－アミノ酸オキシダーゼの阻害剤の提供の３つの戦略が特定された。図２７及び２８は、１日前後の皮下用量を比較した、クレアチニン及びＢＵＮに関するこれらの治療戦略の結果を示す。第１の戦略では、第２及び第３のセットの前／後バーを比較することができる。ＮＡ－３の用量を２分の１に減らすと、２５ｍｇ／ｋｇのＮＡ－３によって誘導されるＮＡ－３クレアチニンのレベルが大幅に減少する。第２のＤ－アミノ酸の数を減らす場合、第１のセットのバー（２５ｍｇ／ｋｇＮＡ－３）と第４のセット（２５ｍｇ／ｋｇ Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ９ｃ）を比較することができる。同じ用量レベルで１１／２０の位置にＤ残基を含むペプチド阻害剤を投与した場合、１４／２０の位置にＤ－アミノ酸を含むＮＡ－３よりもはるかに少ないクレアチニンが観察される。この図は、Ｄ-アミノ酸オキシダーゼの阻害剤である安息香酸ナトリウムの添加も、２５ｍｇ／ｋｇＮＡ－３によって誘導されるクレアチニン及びＢＵＮレベルを低下させることを示す（第１の群と第２の群の前／後ペアを比較－２５ｍｇ／ｋｇ ＮＡ－３ ｖｓ ２５ｍｇ／ｋｇ ＮＡ－３＋ＳＢ）。したがって、ＰＳＤ－９５阻害剤の治療指数は、複数の戦略によって増強することができる。
Ｄ－Ｔａｔ－Ｌ－２Ｂ９ｃはプラスミンの存在下で安定であることが示されているので、１～１０個のＤ－アミノ酸を含むＴａｔ内在化ペプチドのバリアントを作製した。代表的な内在化ペプチドを上表に示し、図２９は、Ｌ型ネリネチドの最後の５アミノ酸及びｔａｔ質形質導入ドメインのＤ-アミノ酸含有バリアントを含む例示的なＰＳＤ-９５阻害剤のプラスミン耐性を示す。ネリネチド自体は、１０μｇ／ｍＬプラスミンの存在下で５分以内に分解されるが、他のバリアントは安定であり、４５分間内で分解が観察されない。これらのバリアントは、ネリネチドよりもプラスミン安定性が改善され、ＮＡ－３と比較して改善された治療指数を有する。
９．容量範囲
ネリネチド及びロドキサミドを、ｔＭＣＡｏの６０分間後にボーラス注射としてラットに静脈内投与した。図３０Ａは、ｔＭＣＡｏの２４時間後の半球梗塞体積の測定を示す。Ａのバーは平均±ＳＤを表し、すべての別個のデータ点がプロットされている。Ａのアスタリスクは、ビヒクル群と比較した場合、Ｐ＜０．０１を示す（多重比較検定のための一元配置分散分析事後テューキー補正）（Ｎ＝１２～１４匹の動物／群）。図３０Ｂは、ｔＭＣＡｏの２４時間後の神経学的スコアを示す。ビヒクル群と比較した場合、有意差はアスタリスクで示される（多重比較検定に対する事後ダン補正を用いたランク上の分散のクラスカル・ウォリス分析、＊Ｐ＜０．０１）。溶媒：ＰＢＳ単独。スクランブル：ＰＳＤ－９５に結合できないＡＤＡペプチド。０．２５ｍｇ／ｋｇという低用量でも、梗塞体積の有意な減少（Ｐ＝０．０１）と神経機能の改善が生じた。少なくとも２５ｍｇ／ｋｇまでの用量も有効であり、約１５ｍｇ／ｋｇでは最も高い有効性が得られた。観察された広い治療範囲は、ヒスタミン放出による潜在的な低血圧を回避するためにすべての溶液中に存在する肥満細胞脱顆粒阻害剤ロドキサミドではなく、ネリネチドによるものであった。
１０．ネリネチドバリアントのプラスミン安定性
以下のペプチドを合成し、プラスミン感受性について試験した。ＰＢＳ中の約６５μｇ／ｍｌのペプチドを３７℃で１０μｇ／ｍｌのプラスミンでチャレンジした。ネリネチドは、ＨＰＬＣによる評価では約５分間で完全に分解された。３０分間にわたって少なくとも８５％のインタクトペプチドを保持しているペプチドはプラスミン耐性として分類され、その他のペプチドはプラスミン感受性として分類された。ＮｏＮＯ４２、ＮＡ４．４．１、及びＮＡ４１１．４は３０分間後にほぼ１００％のインタクトペプチドを示し、ＮＡ４．４．３は８５％以上のインタクトペプチド保持を示した（下表６）。トリプトファンは潜在的な切断部位の３～４アミノ酸以内にある場合にプラスミン切断を阻害するという文献報告があるにもかかわらず、ネリネチドの８位でのＲからＷへの置換はネリネチドと比較してプラスミン感受性を改善しなかった。
１１．ＮｏＮＯ４２のさらなる試験
ＮｏＮＯ４２、ＮＡ５．１０、ＮＡ５．６、及びＮＡ５．１について、ＰＳＤ－９５ ＰＤＺドメイン２への結合に関してビオチン化ネリネチドと競合する能力について試験した。ＡＤＡは、ネリネチドと配列が似ているが、ＰＳＤ－９５ドメイン２に結合できない陰性対照ペプチドであった。陰性対照を除く各ペプチドは、図３１に示すように用量依存的にビオチン化ネリネチドと競合した。記号は重複の平均±ＳＤを示す。吸光度データは、Ａ４５０ｎｍ値からＡ６５０ｎｍを減算することによって正規化され、その後、吸光度データは重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）ウェルの各時点で平均化された。したがって、ＮｏＮＯ４２の内在化ペプチドへのＤ－アミノ酸の導入は、ＰＳＤ－９５ドメイン２への結合に影響を与えない。
静脈内投与したＣｍａｘについてＮｏＮＯ４２をネリネチドと比較した。ラットに、７．６ｍｇ／ｋｇ、５．７ｍｇ／ｋｇ、及び３．８ｍｇ／ｋｇの用量で１０分間のＩＶ注入を与えた。血漿サンプルを注射前及び投与の１０、１５、２０、３０、４５、６０分間後に採取した。各点は、群あたり３匹の動物の平均（±ＳＤ）を表す。ＮｏＮＯ４２のＣ－ｍａｘはネリネチドよりも高かった（図３２）。
ラットへの投与後の血圧降下（肥満細胞の脱顆粒に起因する）について、様々な用量のＮｏＮＯ４２をネリネチドと比較した。ペプチドを静脈内注入で１０分間投与した。ＮｏＮＯ４２（７．６ｍｇ／ｋｇ）で処理されたラットにおいて血圧の低下が観察された（Ｎ＝３）（図３３）。ＮｏＮＯ４２の用量を５．７ｍｇ／ｋｇに減らすと、ネリネチド７．６ｍｇ／ｋｇで見られたのと同様の血圧低下が起こる。これらの用量のＮＯＮＯ４２とネリネチドは、同じＣＭａｘをもたらす。したがって、ＮｏＮＯ４２の低血圧は、同等のＣＭａｘを発現する用量のネリネチドよりも悪くない。ＮｏＮＯ４２の用量をさらに３．８ｍｇ／ｋｇに減らすと、低血圧が大幅に防止される。対照：ネリネチドの注射（Ｎ＝３）。結果は、ベースライン値の％として表示される（平均±Ｓ．Ｄ．）。
表７に示すように、ラットに投与した後、ＮｏＮＯ４２をネリネチドと比較して、様々な腎臓バイオマーカー又は電解質不均衡に対する効果について試験した。ＮｏＮＯ４２には４つのＤ－アミノ酸が存在するにもかかわらず、有意差が観察されなかった。
ＮｏＮＯ４２は、ラットの体重増加に対する効果についてネリネチドとも比較された。有意差が見つからなかった（図３４）。正常な体重増加は、機能が正常であり、ＮｏＮＯ４２ の Ｄ－アミノ酸による毒性がないことを示す。

Claims (78)

  1. 阻害剤ペプチドに結合した内在化ペプチド又はそのバリアントを含む活性薬剤であって、
    前記阻害剤ペプチドは、ＮＯＳ及び／又はＮＭＤＡＲ２ＢへのＰＳＤ－９５の結合を阻害し、
    前記内在化ペプチドは、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）を含むアミノ酸配列を有し、前記阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＥＳＤＶ（配列番号１４）を含む配列を有し、前記バリアントは、前記内在化ペプチド及び阻害剤ペプチドの配列に合計最大５個までの置換又は欠失があり、前記阻害剤ペプチドの少なくとも４個のＣ末端アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸であり、前記内在化ペプチドの３～５個の残基は、Ｄ－アミノ酸である、活性薬剤。
  2. 前記阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＩＥ［Ｓ／Ｔ］ＤＶ（配列番号４）を含み、前記ＩＥ［Ｓ／Ｔ］ＤＶ（配列番号４）は、Ｌ－アミノ酸である、請求項１に記載の活性薬剤。
  3. 各Ｄ残基は、Ｋ若しくはＲにあるか、又はＫ若しくはＲ残基のＣ末端にある、請求項１又は２に記載の活性薬剤。
  4. Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される４つ以上の連続アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ又はＫから独立して選択される隣接アミノ酸を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  5. Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される４つ以上の連続アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ又はＫから選択されるアミノ酸を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  6. Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される５つ以上の連続アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ又はＫから独立して選択される隣接アミノ酸を含み、４つの前記連続アミノ酸のストレッチが存在する場合、前記ストレッチは、前記内在化ペプチドのＮ末端に位置する、請求項１から５のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  7. Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される５つ以上の連続アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ又はＫから選択されるアミノ酸を含み、４つの前記連続アミノ酸のストレッチが存在する場合、前記ストレッチは、前記内在化ペプチドのＮ末端に位置する、請求項１から６のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  8. 前記内在化ペプチドは、Ｎ末端から番号付けされて３位～５位の間にあるＤ残基、７位又は８位にあるＤ残基、及び９位～１１位の間にあるＤ残基の３つのＤ残基を有するＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する、請求項１から７のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  9. 前記阻害剤ペプチドは、スペーサを介して前記内在化ペプチドに結合される、請求項１から８のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  10. 前記スペーサは、選択的に２－４個の残基のペプチドである、請求項９に記載の活性薬剤。
  11. 前記スペーサは、リジン又はアルギニン残基を欠く、請求項９又は１０に記載の活性薬剤。
  12. 前記スペーサは、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－セリン及びＬ－ロイシンから独立して選択される１以上の残基を含み、選択的に、前記スペーサは、ＫＬＳＳ（配列番号１１３）であり、ここで、Ｋ又は／及びＬは、Ｄ型である、請求項９から１１のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  13. 前記阻害剤ペプチドの少なくとも２コピーを含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  14. 前記阻害剤ペプチドの２コピーは、分岐リンカーを介して前記内在化ペプチドに結合される、請求項１３に記載の活性薬剤。
  15. 前記内在化ペプチドは、
    ＹＧｒＫＫＲｒＱｒＲｒ（配列番号９１）、
    ＹＧｒＫＫＲｒＱｒＲＲ（配列番号９２）、
    ＹＧｒＫＫＲｒＱＲｒＲ（配列番号９３）、
    ＹＧＲＫｋＲｒＱｒｒＲＶ（配列番号９５）、
    ＲＫｋｒｒＱｒｒＲ（配列番号１００）、
    ｒＫＫＲｒＱｒＲｒ（配列番号１０１）、
    ＲＫｋＲｒＱｒｒＲ（配列番号１０２）、若しくは
    ｒＫＫＲｒＱｒＲＲ（配列番号１０３）
    のうちの１つからなるか、又はそれを含むアミノ酸配列を有し、
    ここで、小文字は、Ｄ－アミノ酸を示し、大文字は、Ｌ－アミノ酸を示す、請求項１から１４のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  16. ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号５８）からなるか又はそれを含むアミノ酸配列、或いは前記アミノ酸配列のバリアントを有し、前記バリアントは、前記アミノ酸配列に５個までの置換、欠失又は付加を有し、５個のＣ末端アミノ酸以外の位置にある３－５個のアミノ酸は、Ｄ－アミノ酸である、活性薬剤。
  17. 配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号５８）少なくとも７５、８０、８５、９０又は９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、５個のＣ末端アミノ酸以外の位置にある３－５個のアミノ酸は、Ｄ－アミノ酸である、活性薬剤。
  18. 前記活性薬剤において、隣接位置を占めるＤ－アミノ酸がない、請求項１６又は１７に記載の活性薬剤。
  19. 各前記Ｄ－アミノ酸と別のＤ－アミノ酸とは、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される少なくとも２つのアミノ酸によって分離される、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  20. 各前記Ｄ－アミノ酸と別のＤ－アミノ酸とは、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される少なくとも３つのアミノ酸によって分離される、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  21. ４つのＤ－アミノ酸を含む、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  22. ３つのＤ－アミノ酸を含む、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  23. Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される４つ以上の連続アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ及びＫから独立して選択される２つの隣接アミノ酸を含む、請求項１６から２２のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  24. Ｌ－アミノ酸及びグリシンから選択される４つ以上の連続アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ又はＫから選択されるアミノ酸を含む、請求項１６から２２のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  25. Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される５つ以上の連続アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ及びＫから独立して選択される２つの隣接アミノ酸を含み、４つの前記連続アミノ酸のストレッチが存在する場合、前記ストレッチは、前記活性薬剤のＮ末端に位置する、請求項１６から２２のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  26. Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される５つ以上の連続アミノ酸のストレッチを欠き、前記ストレッチは、Ｒ又はＫから選択されるアミノ酸を含み、４つの前記連続アミノ酸のストレッチが存在する場合、前記内在化ペプチドのＮ末端に位置する、請求項１６から２２のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  27. ３位～５位の間にあるＤ－アミノ酸、７位又は８位にあるＤ－アミノ酸、９位～１１位の間にあるＤ－アミノ酸、及び選択的に１２位又は１３位にあるＤ－アミノ酸の３又は４個のＤ－アミノ酸を含む、請求項１６から２６のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  28. アミノ酸配列は、アミノ酸配列：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号５８）に対して、ＤからＬへの置換を除いてゼロの置換、欠失又は付加を有する、請求項１６から２７のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  29. ＹＧｒＫＫＲｒＱｒＲＲｋＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号１１４）、ＹＧＲｋＫＲｒＱＲｒＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号１１５）、ＹＧｒＫＫＲｒＱｒＲＲＫｌＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号１１６）、ＲＫｋＲｒＱｒｒＲＩＥＳＤＶ（配列番号１１１）、若しくはｒＫＫＲｒＡｒＲＲＩＥＳＤＶ（配列番号１１２）からなるか、又はそれを含むアミノ酸配列を有する、請求項１から２８のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  30. 阻害剤ペプチドに結合した内在化ペプチド又はそのバリアントを含む活性薬剤であって、
    前記阻害剤ペプチドは、ＮＯＳ及び／又はＮＭＤＡＲ２ＢへのＰＳＤ－９５の結合を阻害し、前記内在化ペプチドは、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）を含むアミノ酸配列を有し、前記阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＥＳＤＶ（配列番号１４）を含む配列を有し、前記バリアントは、内在化ペプチド及び阻害剤ペプチドに合計最大５個までの置換又は欠失を有し、前記阻害剤ペプチドの少なくとも４個のＣ末端アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸であり、前記内在化ペプチドの残基の全てではないが、少なくとも１つはＤ－アミノ酸である、活性薬剤。
  31. 前記内在化ペプチドのＣ末端は、前記阻害剤ペプチドのＮ末端に結合されて融合ペプチドを形成する、請求項３０に記載の活性薬剤。
  32. 前記内在化ペプチドは、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）を含むアミノ酸配列を有し、前記阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＩＥ［Ｓ／Ｔ］ＤＶ（配列番号４）を含む配列を有し、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）の１－８、１－７、１－６、１－５、１－４、１－３又は１－２個のアミノ酸残基は、Ｄ－アミノ酸である、請求項３０又は３１に記載の活性薬剤。
  33. ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）の２－８、２－７、２－６、２－５、２－４、２－３個の残基は、Ｄ－アミノ酸である、請求項３２に記載の活性薬剤。
  34. ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）の３－８、３－７、３－６、３－５、３－４、４－８、４－７、４－６、４－５、５－８、５－７、５－６、６－８、６－７又は７－８個の残基は、Ｄ－アミノ酸である、請求項３２に記載の活性薬剤。
  35. 前記内在化ペプチドは、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１）を含み、ここで、１－８、１－７、１－６、１－５、１－４、１－３又は１－２個の残基は、Ｄ－アミノ酸である、請求項３０又は３１に記載の活性薬剤。
  36. 前記内在化ペプチドの２－８、２－７、２－６、２－５、２－４又は２－３個の残基は、Ｄ－アミノ酸である、請求項３５に記載の活性薬剤。
  37. 前記内在化ペプチドの３－８、３－７、３－６、３－５、３－４、４－８、４－７、４－６、４－５、５－８、５－７、５－６、６－８、６－７又は７－８個の残基は、Ｄ－アミノ酸である、請求項３５に記載の活性薬剤。
  38. 前記内在化ペプチドは、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）を含み、ここで、１－９、１－８、１－７、１－６、１－５、１－４、１－３、１－２個の残基は、Ｄ－アミノ酸である、請求項３１又は３２に記載の活性薬剤。
  39. 前記内在化ペプチドの２－９、２－８、２－７、２－６、２－５、２－４又は２－３個の残基は、Ｄ－アミノ酸である、請求項３８に記載の活性薬剤。
  40. 前記内在化ペプチドの３－９、３－８、３－７、３－６、３－５、３－４、４－９、４－８、４－７、４－６、４－５、５－９、５－８、５－７、５－６、６－９、６－８、６－７、７－９、７－８又は８－９個の残基は、Ｄ－アミノ酸である、請求項３８に記載の活性薬剤。
  41. 前記阻害剤ペプチドは、Ｃ末端に［Ｅ／Ｄ／Ｎ／Ｑ］－［Ｓ／Ｔ］－［Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｎ］－［Ｖ／Ｌ］（配列番号３）を含む、請求項３１から４０のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  42. 前記阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＩ－Ｅ－［Ｓ／Ｔ］－Ｄ－Ｖ（配列番号４）を含む、請求項３１から４１のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  43. 前記阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＩＥＳＤＶ（配列番号５）を含む、請求項３１から４２のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  44. 前記阻害剤ペプチドの前記５個のＣ末端アミノ酸は、それぞれＬ－アミノ酸である、請求項３１から４２のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  45. 前記阻害剤ペプチドは、ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号２）を含み、前記阻害剤ペプチドの各残基は、ＫがＬ又はＤ－アミノ酸であり得る以外、Ｌ－アミノ酸である、請求項３１から４３のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  46. 前記内在化ペプチドは、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される１つ以上のアミノ酸によって互いに分離される少なくとも２つのＤ－アミノ酸を含む、請求項３１から４５のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  47. 前記内在化ペプチドは、Ｌ－アミノ酸及びグリシンから独立して選択される１つ以上のアミノ酸によって互いに分離される少なくとも３つのＤ－アミノ酸を含む、請求項３１から４６のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  48. 前記少なくとも１つのＤ－アミノ酸は、Ｒ若しくはＫであるか、又はＲ若しくはＫ残基のすぐＣ末端側にある、請求項３１から４７のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  49. 全てのＤ－アミノ酸は、Ｒ若しくはＫであるか、又はＲ若しくはＫ残基のすぐＣ末端側にある、請求項３１から４８のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  50. 少なくとも１つのＤ－アミノ酸は、Ｒ又はＫではなく、Ｒ又はＫ残基のすぐＣ末端側にもない、請求項３１から４８のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  51. ネリネチドと比較して向上したプラスミン耐性及び／又は向上した血漿半減期を有する、請求項１から５０のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  52. ＰＳＤ－９５への結合についてネリネチドと競合する、請求項１から５１のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  53. 配列ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号２）の阻害剤ペプチドに結合した配列ｙｇｒｋｋｒｒｑｒｒｒ（配列番号９６）の内在化ペプチドを含み、前記内在化ペプチドの各アミノ酸がＤ－アミノ酸であり、前記阻害剤ペプチドの各アミノ酸がＬ－アミノ酸である活性薬剤；及び／又は
    ｋｌｓｓＩＥＳＤＶ（配列番号１１７）（小文字がＤ－アミノ酸を示し、大文字がＬ－アミノ酸を示す）に結合した内在化ペプチド；及び／又は
    アミノ酸配列ｖｄｓｅｉｓｓｌｋｒｒｒｑｒｒｋｋｒｇｙ（配列番号１１８）（小文字がＤ－アミノ酸を示す）を有する活性薬剤；
    と比較して低下した腎毒性及び／又はより高い治療指数を示す、請求項１から５２のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  54. ＰＳＤ－９５に対する結合親和性がネリネチドの２倍以内であり、及び／又は
    ＮＭＤＡＲ２ＢへのＰＳＤ－９５の結合を阻害するＩＣ５０がネリネチドの２倍以内である、請求項１から５３のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  55. ＡＵＣ又はＣＭａｘがネリネチドよりも高く、選択的に、前記ＡＵＣ又はＣＭａｘは、皮下投与の場合のものである、請求項１から５４のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  56. 塩化物塩である、請求項１から５５のいずれか１項に記載の活性薬剤。
  57. ヒスチジン、トレハロース、及び選択的に安息香酸ナトリウムをさらに含む、請求項１から５６のいずれか１項に記載の活性薬剤の製剤。
  58. リン酸緩衝液、及び選択的に安息香酸ナトリウムをさらに含む、請求項１から５６のいずれか１項に記載の活性薬剤の製剤。
  59. 請求項１から５６のいずれか１項に記載の活性薬剤の製剤、抗炎症薬、及び選択的に肥満細胞脱顆粒阻害剤又は抗ヒスタミン薬を含む、共製剤。
  60. 請求項１から５６のいずれか１項に記載の活性薬剤の製剤及び血栓溶解剤を含む、共製剤。
  61. 請求項１から５６のいずれか１項に記載の活性薬剤の製剤、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼの阻害剤、選択的にリスペリドン、安息香酸ナトリウム又は５－クロロ－ベンゾ［ｄ］イソオキサゾール－３－オールを含む、共製剤。
  62. 脳卒中、脳虚血、ＣＮＳの外傷性損傷、再灌流傷害、くも膜下出血、脳震盪、痛み、不安、てんかん、又は神経変性疾患から選択される病状に罹患しているか又は罹患するリスクがある対象を治療する方法であって、
    有効な投与計画の請求項１から５６のいずれか１項に記載の活性薬剤又は請求項５７から６１のいずれか１項に記載の製剤を投与することを含む、方法。
  63. 前記病状は、脳卒中である、請求項６２に記載の方法。
  64. 選択的に血栓溶解剤の投与、機械的再灌流又は血管内血栓切除術により前記対象に再灌流を実施することを含む、請求項６２又は６３に記載の方法。
  65. Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ活性阻害剤を投与することをさらに含む、請求項６２から６４のいずれか１項に記載の方法。
  66. 脳卒中に罹患しているか又は罹患するリスクがある対象の虚血性脳卒中を治療する方法であって、
    有効な投与計画の請求項１から５６のいずれか１項に記載の活性薬剤又は請求項５７から６１のいずれか１項に記載の製剤を投与することを含み、前記対象に血栓溶解剤を共投与し、
    前記活性薬剤及び血栓溶解剤は、血栓溶解剤によって誘導される活性薬剤の切断が前記活性薬剤におけるＤ－アミノ酸の含有によって低減されるのに十分に短い投与間隔で投与される、方法。
  67. Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ活性の阻害剤を投与することをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記血栓溶解剤は、活性薬剤が投与される前の６０、３０若しくは１５分間のウィンドウ以内で投与されるか、又は前記活性薬剤及び血栓溶解剤は、同時に投与される、請求項６６又は６７に記載の方法。
  69. 対象に活性薬剤を送達する方法であって、
    請求項１から５６のいずれか１項に記載の活性薬剤、又は請求項５７から６１のいずれか１項に記載の製剤を非静脈経路により投与することを含み、
    前記活性薬剤は、治療レベルで血漿に送達される、方法。
  70. 前記活性薬剤は、皮下、筋肉内、鼻内又は肺内投与される、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記用量は、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、又は２０ｍｇ／ｋｇより高い、請求項６９又は７０に記載の方法。
  72. 前記用量は、１０ｍｇ／ｋｇ未満であり、前記活性薬剤は、肥満細胞脱顆粒阻害剤又は抗ヒスタミン剤の共投与なしで投与される請求項６９又は７０に記載の方法。
  73. 前記用量は、１０ｍｇ／ｋｇを超え、前記活性薬剤は、肥満細胞脱顆粒阻害剤又は抗ヒスタミン剤と共に投与される、請求項６９又は７０に記載の方法。
  74. 前記対象は、脳卒中、脳震盪、再灌流傷害、脳虚血、ＣＮＳの外傷性損傷、痛み、不安、てんかん、くも膜下出血、又はアルツハイマー病若しくはパーキンソン病を含む神経変性疾患から選択される症状に罹患しているか又は罹患するリスクがある、請求項６９から７３のいずれか１項に記載の方法。
  75. 脳卒中、脳虚血、ＣＮＳの外傷性損傷、くも膜下出血、痛み、不安、てんかんから選択される症状に罹患しているか又は罹患するリスクがある対象を治療する方法であって、
    有効な投与計画の活性薬剤及びＤ－アミノ酸オキシダーゼ活性の阻害剤を前記対象に投与することを含み、
    前記活性薬剤は、阻害剤ペプチドに結合した内在化ペプチド又はそのバリアントを含み、前記阻害剤ペプチドは、ＮＯＳへのＰＳＤ－９５の結合を阻害し、前記内在化ペプチドは、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）を含むアミノ酸配列を有し、前記阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＥＳＤＶ（配列番号１４）を含む配列を有し、前記バリアントは、前記内在化ペプチド及び阻害剤ペプチドに５個までの置換又は欠失を含み、前記阻害剤ペプチドの少なくとも４個のＣ末端アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸であり、前記内在化ペプチドの少なくとも１つの残基は、Ｄ－アミノ酸である、方法。
  76. 脳卒中に罹患しているか又は罹患するリスクがある対象の虚血性脳卒中を治療する方法であって、
    有効な投与計画の活性薬剤及びＤ－アミノ酸オキシダーゼ活性の阻害剤を前記対象に投与することを含み、前記対象に血栓溶解剤を共投与し、
    前記活性薬剤は、阻害剤ペプチドに結合した内在化ペプチド又はそのバリアントを含み、前記阻害剤ペプチドは、ＮＯＳ及び／又はＮＭＤＡＲ２ＢへのＰＳＤ－９５の結合を阻害し、前記内在化ペプチドは、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）を含むアミノ酸配列を有し、前記阻害剤ペプチドは、Ｃ末端にＥＳＤＶ（配列番号１４）を含む配列を有し、前記バリアントは、前記内在化ペプチド及び阻害剤ペプチドに５個までの置換又は欠失を含み、前記阻害剤ペプチドの少なくとも４個のＣ末端アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸であり、前記内在化ペプチドの少なくとも１つの残基は、Ｄ－アミノ酸であり、前記活性薬剤及び血栓溶解剤は、血栓溶解剤によって誘導される活性薬剤の切断が前記活性薬剤におけるＤ－アミノ酸の含有によって低減されるのに十分に短い投与間隔で投与される、方法。
  77. 前記活性薬剤は、阻害剤ペプチドに結合した内在化ペプチド又はそのバリアントを含み、前記阻害剤ペプチドは、ＮＯＳ及び／又はＮＭＤＡＲ２ＢへのＰＳＤ－９５の結合を阻害し、前記内在化ペプチドは、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有し、前記阻害剤ペプチドは、ＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号２）を含む配列を有し、前記バリアントは、前記内在化ペプチド及び阻害剤ペプチドに５個までの置換又は欠失があり、前記阻害剤ペプチドの少なくとも４個のＣ末端アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸であり、Ｒ及びＫ残基の全てを含むアミノ酸の連続セグメントは、Ｄ－アミノ酸である、請求項７５又は７６に記載の方法。
  78. 障害の治療に有用な薬剤に結合した内在化ペプチド又はそのバリアントを含むキメラ薬剤であって、
    前記内在化ペプチドは、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）を含むアミノ酸配列を有し、前記バリアントは、１、２又は３個までの置換又は欠失（同じアミノ酸のＬからＤへの置換は含まない）を有し、前記内在化ペプチドの３－５個の残基は、Ｄ－アミノ酸である、キメラ薬剤。
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