BR112020019611A2 - Conjugados de anticorpo anti-antígeno de membrana específico da próstata (amep) humanizado e fármaco - Google Patents

Conjugados de anticorpo anti-antígeno de membrana específico da próstata (amep) humanizado e fármaco Download PDF

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Abstract

a invenção refere-se aos anticorpos humanizados anti-antígeno de membrana específico da próstata (anti-amep) e conjugados de anticorpo anti- amep-fármaco. a invenção também refere-se aos métodos e composições para usar os conjugados de anticorpo anti-amep-fármaco para inibir, prevenir ou tratar doenças ou cânceres relacionados a amep.

Description

“CONJUGADOS DE ANTICORPO ANTI-ANTÍGENO DE MEMBRANA ESPECÍFICO DA PRÓSTATA (AMEP) HUMANIZADO E FÁRMACO” REFERÊNCIA AO PEDIDO RELACIONADO
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. No 62/650.277, intitulado “Novel Anti-Prostate-Specific Membrane Antigen (PSMA) Antibody Drug Conjugates”, depositado em 29 de Março de 2018, o conteúdo do qual é integralmente incorporado neste relatório à título de referência.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi enviada em formato ASCII via EFS-Web e é, por meio deste relatório, integralmente incorporada à título de referência. A cópia de ASCII criada em 29 de Março de 2019 é denominada AMBX_0225_00PCT_ST25.txt e tem 37.015 bytes.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A divulgação da invenção refere-se a novos anticorpos para antígeno de membrana específico da próstata (anti-AMEP) e conjugados de anticorpo- fármaco. Mais particularmente, a divulgação da invenção refere-se a métodos e composições para usar conjugados de anticorpo anti-AMEP-fármaco na inibição, prevenção ou tratamento de doenças ou cânceres relacionados a AMEP.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[004] O câncer de próstata é a malignidade não relacionada à pele mais comumente diagnosticada em homens em países desenvolvidos. Estima-se que um em cada seis homens será diagnosticado com câncer de próstata. O diagnóstico de câncer de próstata melhorou após o uso de marcadores séricos, tais como o antígeno específico da próstata (PSA). Além disso, antígenos associados ao tumor da próstata oferecem alvos para o imageamento, diagnóstico e terapias alvejadas do tumor. O antígeno de membrana específico da próstata (AMEP), um marcador associado ao tumor da próstata, é tal alvo. AMEP é, significantemente,
superexpressado no câncer de próstata independente de andrógeno. A superexpressão de AMEP está associada ao alto grau do tumor, um alto risco de progressão e recorrência da doença (Perner et al., Human Pathology, 2007). A alta expressão de AMEP foi associada ao prognóstico clínico negativo e sobrevida significantemente mais curta. A expressão de AMEP é observada tanto no sítio primário da doença quanto nos sítios metastáticos, tais como, osso e linfonodos (Olson e Israel, Frontiers in Bioscience, 2014).
[005] Embora várias terapias alvejadas tenham sido buscadas ao longo dos anos, aquelas envolvendo radioterapias foram as que mais avançaram para o desenvolvimento clínico, pois demonstraram eficácia e tolerabilidade aceitável. Outro desenvolvimento clínico das formas de realização que envolvem liberação alvejada de agentes citotóxicos não radioativos teve sucesso limitado.
[006] Dadas as propriedades físicas de AMEP e seu padrão de expressão em relação à progressão do câncer de próstata, AMEP é um excelente alvo no desenvolvimento de conjugados de anticorpo-fármaco. Os conjugados de anticorpo- fármaco (CAFs) são uma classe potente de constructos terapêuticos que permitem a liberação alvejada de agentes citotóxicos às células alvo, tais como células cancerosas. Por causa da função de alvejamento, estes compostos mostram um índice terapêutico muito maior em comparação aos mesmos agentes sistemicamente liberados. CAFs foram desenvolvidos como anticorpos intactos ou fragmentos de anticorpos, tais como scFvs. O anticorpo ou fragmento é ligado a uma ou mais cópias do fármaco por intermédio de um ligante que é estável sob condições fisiológicas, mas que pode ser clivado uma vez dentro da célula alvo. Até o momento, apenas alguns CAFs foram aprovados para uso terapêutico, incluindo gemtuzumabe ozogamicina para AML (subsequentemente, retirado do mercado), brentuximabe vedotina para ALCL e linfoma de Hodgkin e trastuzumabe entansina para câncer de mama metastático HER2-positivo (Verma et al., N Engl J Med 367:
1783 a 91, 2012; Brass et al., Clin Cancer Res 7:1490 a 96, 2001; Francisco et al., Blood 102:1458 a 65, 2003). Vários CAFs que alvejam vários agentes estão em experimentos clínicos. Entretanto, os CAFs que alvejam AMEP enfrentam desafios, devido à falta de índice terapêutico e toxicidade.
[007] Assim, há uma necessidade quanto a produtos terapêuticos melhores ou aperfeiçoado que alvejam o antígeno AMEP e cânceres relacionados. Para superar esta deficiência na técnica, a presente divulgação da invenção fornece novos anticorpos anti-AMEP, variantes e conjugados de composições de anticorpo- fármaco neste relatório.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[008] A presente divulgação da invenção fornece anticorpos anti-AMEP, variantes de anticorpos e composições de conjugados de anticorpo-fármaco. Em formas de realização adicionais, a divulgação da invenção fornece conjugados de anticorpo-fármaco (CAFs) compreendendo tais anticorpos anti-AMEP.
[009] A presente divulgação da invenção fornece anticorpos anti-AMEP, variantes de anticorpos e composição de anticorpos compreendendo a SEQ ID NOs: 1 a 17. Em algumas formas de realização, a divulgação da invenção fornece conjugados de anticorpo-fármaco (CAFs) compreendendo a SEQ ID NOs: 1 a 17.
[010] A presente divulgação da invenção fornece anticorpos anti-AMEP, variantes de anticorpos e composição de anticorpos consistindo da SEQ ID NOs: 1 a
17. Em algumas formas de realização, a divulgação da invenção fornece conjugados de anticorpo-fármaco (CAFs) consistindo da SEQ ID NOs: 1 a 17.
[011] A presente invenção fornece uma variante de anticorpo anti-antígeno de membrana específico da próstata (anti-AMEP) compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve em que a sequência de cadeia pesada é selecionada a partir do grupo da SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 14 ou 16 e a sequência de cadeia leve é selecionada a partir do grupo da SEQ ID NOs: 9, 11, 13, 15 ou 17. Em algumas formas de realização, a presente invenção fornece uma variante de anticorpo anti- antígeno de membrana específico da próstata (anti-AMEP) compreendendo uma sequência de cadeia pesada da SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 14 ou 16. Em algumas formas de realização, a presente invenção fornece uma variante de anticorpo anti- antígeno de membrana específico da próstata (anti-AMEP) compreendendo uma sequência de cadeia leve da SEQ ID NOs: 9, 11, 13, 15 ou 17.
[012] Em outras formas de realização, a presente invenção fornece uma variante de anticorpo anti-antígeno de membrana específico da próstata (anti-AMEP) consistindo de uma sequência de cadeia pesada da SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 14 ou
16. Em outras formas de realização, a presente invenção fornece uma variante de anticorpo anti-antígeno de membrana específico da próstata (anti-AMEP) consistindo de uma sequência de cadeia leve da SEQ ID NOs: 9, 11, 13, 15 ou 17.
[013] Em outra forma de realização, a variante de anticorpo anti-AMEP compreende uma cadeia pesada compreendendo uma região da sequência variável selecionada a partir do grupo da SEQ ID NOs: 1 ou 6. Ainda em outra forma de realização, a variante de anticorpo anti-AMEP compreende uma sequência de cadeia leve compreendendo uma região variável selecionada a partir do grupo da SEQ ID NOs: 2 a 5 ou 7. Ainda em uma outra forma de realização, a variante da cadeia pesada do anticorpo anti-AMEP consiste de uma sequência da região variável da SEQ ID NOs: 1 ou 6. Ainda em outra forma de realização, a variante da cadeia leve do anticorpo anti-AMEP consiste de uma região variável selecionada a partir do grupo da SEQ ID NOs: 2 a 5 ou 7.
[014] Em uma forma de realização adicional, a variante de anticorpo anti- AMEP compreende um aminoácido não natural incorporado na sequência de cadeia pesada ou leve do anticorpo. Em outra forma de realização da presente invenção, o anticorpo compreende uma variante de anticorpo anti-AMEP com um ou mais aminoácidos não naturalmente codificados substituídos em uma ou mais posições na cadeia pesada ou cadeia leve do anticorpo. Em algumas formas de realização, a cadeia pesada ou cadeia leve na variante do anticorpo anti-AMEP compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos não naturalmente codificados. Em outras formas de realização, a sequência de cadeia pesada ou cadeia leve na variante do anticorpo anti-AMEP compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos não naturalmente codificados em uma ou mais posições na cadeia pesada ou cadeia leve do anticorpo. Em uma forma de realização, a sequência de cadeia pesada do anticorpo anti-AMEP compreende um aminoácido não naturalmente codificado. Em outra forma de realização da presente invenção, a variante de anticorpo anti-AMEP compreende uma sequência de cadeia pesada ou cadeia leve, conforme apresentado na Tabela 4.
[015] Em formas de realização adicionais da presente invenção, o anticorpo é uma variante de anticorpo anti-AMEP compreendendo a sequência de cadeia leve a partir da SEQ ID NOs: 9, 11, 13, 15 ou 17 com um aminoácido não naturalmente codificado substituído em uma posição com alta acessibilidade à superfície e/ou um sítio que terá carga neutra para o anticorpo. Ainda em formas de realização adicionais da presente invenção, o anticorpo é uma variante de anticorpo anti-AMEP compreendendo a sequência de cadeia pesada a partir da SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 14 ou 16 com um aminoácido não naturalmente codificado substituído em uma posição com alta acessibilidade à superfície e/ou um sítio que terá carga neutra para o anticorpo.
[016] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um conjugado de anticorpo anti-AMEP-fármaco (CAF ou um CAF anti-AMEP) em que o anticorpo é um anti-AMEP compreendendo uma sequência de cadeia leve e pesada. Em formas de realização adicionais da presente invenção, o CAF anti-AMEP compreende a cadeia leve a partir da SEQ ID NOs: 9, 11, 13, 15 ou 17 e a cadeia pesada a partir da SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 14 ou 16. Em uma forma de realização da presente invenção, o CAF anti-AMEP compreende um ou mais aminoácidos não naturalmente codificados substituídos em uma ou mais posições na cadeia pesada ou cadeia leve do anticorpo.
[017] Em outra forma de realização, a presente invenção fornece um CAF anti-AMEP compreendendo uma cadeia pesada da SEQ. ID. NO: 8 e uma cadeia leve da SEQ. ID. NO: 9. Em outra forma de realização, a presente invenção fornece um CAF anti-AMEP compreendendo a SEQ ID NO: 12 e a SEQ ID NO: 13. Em outra forma de realização, a presente invenção fornece um CAF anti-AMEP compreendendo a SEQ ID NO: 14 e a SEQ ID NO: 15. Em outra forma de realização, a presente invenção fornece um CAF anti-AMEP compreendendo a SEQ ID NO: 16 e a SEQ ID NO: 17.
[018] Em algumas formas de realização, o anticorpo, variante ou composição da presente divulgação pode ser um anticorpo, variante ou composição que se liga a um receptor de AMEP. Em outras formas de realização da presente invenção, o anticorpo, variante ou composição pode ser um anticorpo, variante ou composição que se liga à superfície extracelular do receptor de AMEP. Em outra forma de realização da presente invenção, o anticorpo, variante ou composição divulgado pode ser um anticorpo, variante ou composição que se liga a um dímero de AMEP. Em algumas formas de realização, o anticorpo, variante ou composição da presente divulgação pode ser um anticorpo, variante ou composição que apresenta RDCs a partir de J591 enxertadas sobre a região estrutural da região variável. Em outras formas de realização, o anticorpo, variante ou composição da presente divulgação da invenção pode ser um anticorpo, variante ou composição que apresenta um aminoácido não naturalmente codificado. Em algumas formas de realização, o anticorpo, variante ou composição pode ser um anticorpo, variante ou composição que é descrito por mais do que uma das formas de realização em outra parte neste relatório da presente divulgação da invenção. Em algumas formas de realização, o anticorpo, variante de anticorpo ou composição de anticorpo divulgado neste relatório pode ser completamente humanizado. Em outras formas de realização, o anticorpo, variante de anticorpo ou composição de anticorpo divulgado neste relatório pode ser quimérico. Em algumas formas de realização da presente invenção, o anticorpo pode ser um anticorpo que é um anticorpo de comprimento total (regiões variáveis + Fc), Fab, biespecífico, dímeros de Fab, Fab-biespecífico, Fab-triespecífico, ligantes de células T biespecíficos, anticorpo de realvejamento de dupla afinidade, anticorpo biespecífico IgGl/IgG3, diacorpo, diacorpo biespecífico, scFv-Fc, minicorpo.
[019] Em outras formas de realização, o anticorpo anti-AMEP, variante de anticorpo ou composição de anticorpos incorpora um aminoácido não natural codificado compreendendo um grupo carbonila, um grupo amino-óxi, um grupo hidrazina, um grupo hidrazida, um grupo semicarbazida, um grupo azida ou um grupo alcino. Em uma forma de realização da invenção, o aminoácido não natural codificado compreende um grupo amino-óxi. Ainda em outras formas de realização, o aminoácido não naturalmente codificado é para-acetilfenilalanina, p- nitrofenilalanina, p-sulfotirosina, p-carboxifenilalanina, uma o-nitrofenilalanina, uma m-nitrofenilalanina, uma p-boronilfenilalanina, uma o-boronilfenilalanina, uma m- boronilfenilalanina, uma p-aminofenilalanina, uma o-aminofenilalanina, uma m- aminofenilalanina, uma p-acilfenilalanina, uma o-acilfenilalanina, uma m- acilfenilalanina, uma p-OMe fenilalanina, uma o-OMe fenilalanina, uma m-OMe fenilalanina, uma p-sulfofenilalanina, uma o-sulfofenilalanina, uma m- sulfofenilalanina, uma 5-nitro His, uma 3-nitro Tyr, uma 2-nitro Tyr, uma Leu nitro substituída, uma His nitro substituída, uma De nitro substituída, um Trp nitro substituído, um 2-nitro Trp, um 4-nitro Trp, um 5-nitro Trp, um 6-nitro Trp, um 7-nitro Trp, 3-aminotirosina, 2-aminotirosina, O-sulfotirosina, 2-sulfo-óxi-fenilalanina, 3-sulfo- óxi-fenilalanina, o-carboxifenilalanina, m-carboxifenilalanina, p-acetil-L-fenilalanina,
uma p-propargil-fenilalanina, O-metil-L-tirosina, uma L-3-(2-naftil)alanina, uma 3- metil-fenilalanina, uma O-4-alil-L-tirosina, uma 4-propil-L-tirosina, uma tri-O-acetil- GlcNAcβ-serina, uma L-Dopa, uma fenilalanina fluorada, uma isopropil-L- fenilalanina, uma p-azido-L-fenilalanina, uma p-acil-L-fenilalanina, uma p-benzoil-L- fenilalanina, uma L-fosfosserina, uma fosfonosserina, uma fosfonotirosina, uma p- iodo-fenilalanina, uma p-bromofenilalanina, uma p-amino-L-fenilalanina, uma isopropil-L- fenilalanina ou uma p-propargilóxi-fenilalanina. Em outra forma de realização da presente invenção, o aminoácido não natural é para-acetilfenilalanina.
[020] Em outras formas de realização da presente invenção, a variante de anticorpo anti-AMEP é um anticorpo monoclonal, anticorpo humanizado ou anticorpo quimérico. Em uma forma de realização, a variante de anticorpo anti-AMEP humanizado compreende uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir do grupo da SEQ ID NOs: 8, 10, 12, ou 14 e uma sequência de cadeia leve selecionada a partir do grupo da SEQ ID NOs: 9, 11, 13 ou 15. Em outra forma de realização, a variante de anticorpo anti-AMEP quimérico compreende uma sequência de cadeia pesada da SEQ ID NO: 16 e uma sequência de cadeia leve da SEQ ID NO: 17.
[021] Em outras formas de realização, a presente invenção fornece uma composição de um conjugado de anticorpo-fármaco compreendendo uma variante de anticorpo anti-AMEP covalentemente conjugada a uma toxina, carga útil de fármaco-ligante. Em uma forma de realização, a toxina, carga útil de fármaco-ligante compreende um agente citotóxico. Em uma forma de realização, o agente citotóxico é uma dolastatina, derivado de dolastatina ou análogo da mesma. Em outras formas de realização, a presente invenção fornece uma composição de um conjugado de anticorpo-fármaco compreendendo uma variante de anticorpo anti-AMEP covalentemente conjugada a um ligante-fármaco, em que a conjugação ocorre por intermédio de um aminoácido não naturalmente codificado no anticorpo. Em outras formas de realização, a presente invenção fornece uma composição de um conjugado de anticorpo-fármaco compreendendo uma variante de anticorpo anti- AMEP de qualquer uma entre a SEQ ID NOs: 1 a 17 covalentemente conjugada a uma ou mais dolastatinas, em que a conjugação ocorre por intermédio de um aminoácido não naturalmente codificado no anticorpo.
Em outra forma de realização da presente invenção, é fornecida uma composição de um conjugado de anticorpo- fármaco compreendendo uma variante de anticorpo anti-AMEP de qualquer uma entre a SEQ ID NOs: 8 a 17 covalentemente conjugada a uma ou mais dolastatinas, em que a conjugação ocorre por intermédio de um aminoácido não naturalmente codificado no anticorpo.
Em uma forma de realização da presente invenção, é fornecida uma composição de um conjugado de anticorpo-fármaco compreendendo uma variante de sequência de cadeia pesada do anticorpo anti-AMEP da SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 14 ou 16 covalentemente conjugada a uma ou mais dolastatinas, em que a conjugação ocorre por intermédio de um aminoácido não naturalmente codificado no anticorpo.
Em uma outra forma de realização da presente invenção, é fornecida uma composição de um conjugado de anticorpo-fármaco compreendendo uma variante da cadeia leve do anticorpo anti-AMEP da SEQ ID NOs: 9, 11, 13, 15 ou 17 covalentemente conjugada a uma ou mais dolastatinas, em que a conjugação ocorre por intermédio de um aminoácido não naturalmente codificado no anticorpo.
Em outra forma de realização, o anticorpo é covalentemente conjugado a pelo menos 2 dolastatinas.
Em uma forma de realização, a composição compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais derivados ou análogos de dolastatina.
Em uma forma de realização, a composição compreende um derivado de dolastatina ou é um análogo de dolastatina.
Em outra forma de realização, o derivado ou análogo de dolastatina é uma monometil auristatina, a monometil auristatina é monometil auristatina F (MMAF) ou monometil auristatina E (MMAE). Em outras formas de realização, uma ou mais dolastatinas são MMAF não clivável, MMAE não clivável, MMAF clivável, MMAE clivável, MMAF clivável curta ou MMAE clivável curta.
Em uma forma de realização adicional da invenção, o anticorpo é ligado a um ligante, um polímero ou molécula biologicamente ativa. Em algumas formas de realização, o ligante é polietilenoglicol (PEG). Em outras formas de realização, o ligante é um polietilenoglicol ramificado ou linear. Em formas de realização adicionais da presente invenção, as variantes anti-AMEP podem ser PEGiladas. Ainda em formas de realização adicionais da presente invenção, as variantes anti-AMEP podem ser PEGiladas no aminoácido não naturalmente codificado. O anticorpo anti-AMEP da presente invenção pode ser PEGilado com cerca de 5 kDa PEG, cerca de 10 kDa PEG, cerca de 20 kDa PEG, cerca de 30 kDa PEG, cerca de 40 kDa PEG ou mais. A molécula de polietilenoglicol pode apresentar um peso molecular entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 100 kDa. A molécula de polietilenoglicol pode apresentar um peso molecular entre 0,1 kDa e 50 kDa, 20 kDa e 40 kDa e qualquer valor entre 25 kDa e 35 kDa. A molécula de polietilenoglicol pode apresentar um peso molecular de cerca de 30 kDa. A molécula de polietilenoglicol pode ser uma molécula linear que apresenta um peso molecular entre 0,1 kDa e 50 kDa, 20 kDa e 40 kDa, e qualquer valor entre 25 kDa e 35 kDa. A molécula de polietilenoglicol pode ser uma molécula linear que apresenta um peso molecular de 30 kDa. A molécula de polietilenoglicol pode apresentar um grupo amino-óxi capaz de reagir com um grupo acetila em um aminoácido sintético. A molécula de polietilenoglicol pode ser um PEG linear ativado com amino-óxi de 30 kDa capaz de formar uma ligação oxima com a cadeia lateral de acetila de um aminoácido não naturalmente codificado, tal como, mas não limitado à para-acetilfenilalanina.
[022] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um conjugado de anticorpo-fármaco compreendendo um anticorpo anti-AMEP humanizado compreendendo uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14 ou 16 e uma sequência de cadeia leve selecionada a partir da SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15 conjugado a pelo menos um ligante-fármaco selecionado a partir das Tabelas 1 a 3, em que a conjugação ocorre por intermédio de um aminoácido não naturalmente codificado incorporado na sequência de cadeia pesada. Em algumas formas de realização, o ligante-fármaco compreende um agente citotóxico. O agente citotóxico é uma dolastatina, derivado de dolastatina ou análogo da mesma. Em uma forma de realização, a dolastatina, derivado ou análogo de dolastatina é uma monometil auristatina selecionada a partir de monometil auristatina F (MMAF) ou monometil auristatina E (MMAE). Em outra forma de realização, a monometil auristatina é MMAE ou MMAF clivável, MMAE ou MMAF não clivável, MMAE ou MMAF clivável curta.
[023] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para reduzir ou inibir crescimento ou progressão do tumor em um câncer ou célula cancerosa que expressa AMEP compreendendo contatar o câncer ou célula cancerosa que expressa AMEP com uma quantidade eficaz do conjugado de anticorpo-fármaco. O conjugado de anticorpo-fármaco compreendendo um anticorpo anti-AMEP humanizado compreendendo uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14 ou 16 e uma sequência de cadeia leve selecionada a partir da SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, conjugado a pelo menos um ligante-fármaco selecionado a partir das Tabelas 1 a 3, em que a conjugação ocorre por intermédio de um aminoácido não naturalmente codificado incorporado na sequência de cadeia pesada. Em outra forma de realização, a invenção fornece um método compreendendo adicionalmente contatar um câncer ou célula cancerosa que expressa AMEP com uma quantidade eficaz de um agente terapêutico. Em outra forma de realização, o agente terapêutico é um agente quimioterápico, agente hormonal, agente antitumoral, agente imunoestimulante, imunomodulador, corticosteroide ou combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, o agente hormonal é enzalutamide.
[024] Em outras formas de realização, os CAFs anti-AMEP da invenção podem ser administrados com um ou mais agentes imunoestimulantes para induzir ou acentuar uma resposta imune. Tais agentes imunoestimulantees incluem, mas não são limitados à IL-2, oligonucleotídeos imunoestimulantes (por exemplo, motivos CpG), interferons, fator de necrose tumoral alfa. Em outras formas de realização, os CAFs anti-AMEP da invenção podem ser administrados com um ou mais imunomoduladores, incluindo, mas não limitados às citocinas, quimiocinas, adjuvantes ou uma combinação dos mesmos.
[025] Em formas de realização adicionais, a presente invenção fornece um método para inibir o crescimento ou progressão do tumor em um indivíduo compreendendo fornecer ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado de anticorpo AMEP-fármaco da invenção. Ainda em uma forma de realização adicional, a presente invenção fornece um método para tratar um indivíduo com câncer de próstata compreendendo fornecer ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição da divulgação.
[026] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para tratar um indivíduo com uma célula cancerosa ou câncer que expressa AMEP compreendendo: administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um conjugado de anticorpo-fármaco para tratar o câncer ou célula cancerosa que expressa AMEP, em que o conjugado de anticorpo-fármaco compreende um anticorpo AMEP compreendendo uma sequência de cadeia pesada e cadeia leve divulgada neste relatório conjugado ao ligante-fármaco por intermédio de um aminoácido não naturalmente codificado incorporado no anticorpo; e em que o ligante-fármaco é selecionado a partir das Tabelas 1 a 3. Em outra forma de realização, um método para tratar um indivíduo com doença ou câncer relacionado a AMEP compreende fornecer ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de conjugado de anticorpo anti-AMEP-fármaco e um agente terapêutico. O agente terapêutico é um agente quimioterápico, agente hormonal, agente antitumoral, agente imunoestimulante, imunomodulador, corticosteroide ou combinação dos mesmos. O agente terapêutico pode ser fornecido antes, depois ou em combinação com um CAF anti-AMEP da invenção.
[027] Em outra forma de realização, a divulgação da invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma variante de anticorpo anti-AMEP e pelo menos um adjuvante, aglutinante, tampão, portador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Uma composição farmacêutica compreende o conjugado de anticorpo-fármaco da invenção e pelo menos um adjuvante, aglutinante, tampão, portador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica ainda compreende um agente terapêutico, Em uma forma de realização, a invenção fornece um medicamento para a fabricação e para tratar câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo.
[028] Em uma forma de realização adicional, a presente invenção fornece um ácido nucleico que codifica qualquer uma entre a SEQ ID NOs: 1 a 17. Em uma forma de realização, a invenção fornece um vetor compreendendo o ácido nucleico da SEQ ID NOs: 1 a 17.
[029] Deve ser entendido que os métodos e composições descritos neste relatório não são limitados à metodologia, protocolos, linhagens celulares, constructos e reagentes particulares descritos neste relatório e, como tal, podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste relatório é para o propósito de descrever apenas formas de realização particulares não se destina a limitar o escopo dos métodos e composições descritos neste relatório, que serão limitados apenas pelas reivindicações anexas.
[030] Conforme usado neste relatório e nas reivindicações anexas, as formas no singular “um”, “uma”, e “o”, “a” incluem a referência no plural, a menos que o contexto indique claramente de outro modo.
[031] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados neste relatório apresentam o mesmo significado, conforme comumente entendido por um técnico no assunto ao qual a invenção descrita neste relatório pertence. Vários métodos, materiais e semelhantes, similares ou equivalentes àqueles descritos neste relatório, podem ser usados na prática ou teste da invenção descrita neste relatório.
[032] Todas as publicações e patentes mencionadas neste relatório são integralmente incorporadas neste relatório à título de referência para o propósito de descrever e divulgar, por exemplo, a química, sínteses químicas, composições e outras metodologias que são descritas nas publicações, que podem ser usadas em relação à invenção presentemente descrita. As publicações debatidas neste relatório são fornecidas somente para sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido.
[033] Em formas de realização da presente divulgação são fornecidas novas sequências de aminoácidos anti-AMEP. O termo “aminoácido” refere-se aos aminoácidos de ocorrência natural ou não natural, assim como análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de maneira similar aos aminoácidos de ocorrência natural. Aminoácidos naturalmente codificados são os 20 aminoácidos comuns (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina) e pirolisina e selenocisteína. Análogos de aminoácidos referem-se aos compostos que apresentam a mesma estrutura química básica de um aminoácido de ocorrência natural, apenas por via de exemplo, um carbono α que é ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R funcional. Tais análogos podem apresentar grupos R modificados (por via de exemplo, norleucina) ou podem apresentar estruturas peptídicas modificadas, enquanto ainda retêm a mesma estrutura química básica de um aminoácido de ocorrência natural. Exemplos não limitantes de análogos de aminoácidos incluem homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio. Os aminoácidos podem ser referidos neste relatório por seu nome, seus três símbolos de letra comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Adicionalmente, os nucleotídeos podem ser referidos por seus códigos de letra única comumente aceitos.
[034] Um “grupo de modificação do terminal amino ou carbóxi” refere-se a qualquer molécula que pode ser ligada a um grupo amina terminal ou grupo carbóxi terminal, respectivamente. Por via de exemplo, tais grupos amina terminais ou grupos carbóxi terminais podem estar na extremidade de moléculas poliméricas, em que tais moléculas poliméricas incluem, mas não são limitadas aos polipeptídeos, polinucleotídeos e polissacarídeos. Os grupos de modificação terminal incluem, mas não são limitados a vários polímeros solúveis em água, peptídeos ou proteínas. Apenas por via de exemplo, grupos de modificação terminal incluem polietilenoglicol ou albumina sérica. Grupos de modificação terminal podem ser usados para modificar as características terapêuticas da molécula polimérica, incluindo, mas não limitadas ao aumento da meia-vida sérica de peptídeos, polipeptídeos ou proteínas.
[035] Em algumas formas de realização, a divulgação da invenção fornece novos anticorpos anti-AMEP e variantes de anticorpos. O termo “anticorpo” neste relatório refere-se a uma proteína que consiste de um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados por todos ou parte dos genes do anticorpo. Os genes de imunoglobulina incluem, mas não são limitados aos genes da região constante capa, lambda, alfa, gama (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), delta, epsilon e mu, assim como a miríade de genes da região variável da imunoglobulina. O anticorpo neste relatório também de destina a incluir anticorpos de comprimento total e fragmentos de anticorpos, e incluem anticorpos que existem naturalmente em qualquer organismo, variantes de anticorpos, anticorpos construídos e fragmentos de anticorpos. O anticorpo neste relatório também se destina a incluir anticorpo intacto, anticorpos monoclonais ou policlonais. O anticorpo neste relatório também abrange anticorpos multiespecíficos e/ou anticorpos biespecíficos. Os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos humanos. Os anticorpos humanos são usualmente feitos de duas cadeias leves e duas cadeias pesadas compreendendo regiões variáveis e regiões constantes. A região variável de cadeia leve compreende 3 RDCs identificadas neste relatório como RDCL1, RDCL2 e RDCL3 flanqueadas por regiões de estrutura. A região variável de cadeia pesada compreende 3 RDCs identificadas neste relatório como RDCH1, RDCH2 e RDCH3 flanqueadas por regiões de estrutura.
[036] O termo “fragmento de anticorpo” neste relatório refere-se a qualquer forma de um anticorpo, exceto a forma de comprimento total. Os fragmentos de anticorpos neste relatório incluem anticorpos que são componentes menores que existem dentro de anticorpos de comprimento total e dos anticorpos que foram construídos, tais como variantes de anticorpos. Os fragmentos de anticorpos incluem, mas não são limitados a Fv, Fc, Fab, e (Fab’)2, Fv de cadeia única (scFv), diacorpos, triacorpos, tetracorpos, anticorpos híbridos bifuncionais, RDC1, RDC2, RDC3, combinações de RDCs, regiões variáveis, regiões de estrutura, regiões constantes, cadeias pesadas, cadeias leves e regiões variáveis e moléculas de não anticorpo de andaime alternativas, anticorpos biespecíficos, e semelhantes (Maynard & Georgiou, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339 a 76, 2000; Hudson, Curr. Opin, Biotechnol. 9:395 a 402, 1998). Outra subestrutura funcional é um Fv de cadeia única (scFv), compreendido das regiões variáveis da cadeia pesada e leve da imunoglobulina, covalentemente conectadas por um ligante peptídico (Hu et al., Cancer Research, 56, 3055 a 3061, 1996). Estas proteínas pequenas (Mr 25.000) geralmente conservam especificidade e afinidade para o antígeno em um polipeptídeo único e podem fornecer um bloco de construção conveniente para moléculas maiores específicas do antígeno. A menos que especificamente observado de outro modo, declarações e reivindicações que utilizam o termo “anticorpo” ou “anticorpos” incluem especificamente “fragmento de anticorpo” e ”fragmentos de anticorpos”.
[037] Em formas de realização da presente invenção, novos conjugados de anticorpo anti-AMEP-fármaco (CAFs) são divulgados. O termo “conjugado de anticorpo-fármaco ou “CAF”, conforme usado neste relatório, refere-se a uma molécula de anticorpo ou fragmento da mesma, que é covalentemente ligada a uma ou mais moléculas biologicamente ativas. A molécula biologicamente ativa pode ser conjugada ao anticorpo através de um ligante, polímero ou outra ligação covalente. CAFs são uma classe potente de constructos terapêuticos que permitem a liberação alvejada de agentes citotóxicos às células alvo, tais como células cancerosas. Por causa da função de alvejamento, estes compostos mostram um índice terapêutico muito maior em comparação aos mesmos agentes sistemicamente liberados. CAFs foram desenvolvidos como anticorpos intactos ou fragmentos de anticorpos, tais como scFvs. O anticorpo ou fragmento é ligado a uma ou mais cópias do fármaco por intermédio de um ligante que é estável sob condições fisiológicas, mas que pode ser clivado uma vez dentro da célula alvo.
[038] O termo “fragmento de ligação ao antígeno”, conforme usado neste relatório, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que conserva a capacidade de se ligar a um antígeno. Foi mostrado que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos no termo “fragmento de ligação ao antígeno” de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo dos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab’)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região da dobradiça; (iii) um fragmento Fd consistindo dos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv consistindo dos domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., Nature 341 :544 a 546, 1989), que consiste de um domínio VH; (vi) uma região de determinante de complementaridade isolada (RDC), por exemplo, VH RDC3 compreendendo ou não sequência adicional (ligante, regiões de estrutura etc.) e (v) uma combinação de duas a seis RDCs isoladas compreendendo ou não sequência adicional (ligante, regiões de estrutura etc.). Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH sejam codificados por genes separados, os mesmos podem ser ligados, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que os mesmos sejam preparados como uma cadeia polipeptídica única em que o par das regiões VL e VH forma moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); veja por exemplo, Bird et al., Science 242:423 a 426, 1988); e (Huston et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 85:5879 a 5883, 1988). Tais anticorpos de cadeia única também são abrangidos no termo “fragmento de ligação ao antígeno” de um anticorpo.
Além disso, os fragmentos de ligação ao antígeno incluem proteínas de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação compreendendo (i) um polipeptídeo do domínio de ligação (tal como uma região variável de cadeia pesada, uma região variável de cadeia leve ou uma região variável de cadeia pesada fundida a uma região variável de cadeia leve por intermédio de um peptídeo ligante) que é fundido a um polipeptídeo de região da dobradiça da imunoglobulina, (ii) uma região constante CH2 de cadeia pesada da imunoglobulina fundida à região da dobradiça, e (iii) uma região constante CH3 de cadeia pesada da imunoglobulina fundida à região constante CH2. A região da dobradiça pode ser modificada pela substituição de um ou mais resíduos de cisteína por resíduos de serina para prevenir a dimerização.
Tais proteínas de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação são ainda divulgados no U.S. 2003/0118592 e U.S. 2003/0133939. Estes fragmentos de anticorpos são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas aos técnicos no assunto e os fragmentos são triados quanto à utilidade da mesma maneira que os anticorpos intactos.
[039] Um sítio de ligação ao antígeno típico é compreendido das regiões variáveis formadas pelo pareamento de uma imunoglobulina de cadeia leve e uma imunoglobulina de cadeia pesada. A estrutura das regiões variáveis do anticorpo é muito compatível e exibe estruturas muito similares. Estas regiões variáveis são tipicamente compreendidas de regiões de estrutura (RE) relativamente homólogas intercaladas com três regiões hipervariáveis denominadas Regiões Determinantes de Complementaridade (RDCs). A atividade de ligação global do fragmento de ligação ao antígeno é frequentemente ditada pela sequência das RDCs. As REs frequentemente desempenham um papel no posicionamento e alinhamento apropriados em três dimensões das RDCs para ligação ao antígeno ideal. De fato, pelo fato de que as sequências de RDC são responsáveis pela maioria das interações anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que mostram as propriedades de anticorpos de ocorrência natural específicos pela construção de vetores de expressão que incluem sequências de RDC a partir do anticorpo de ocorrência natural específico enxertado nas sequências de estrutura a partir de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (veja, por exemplo, Riechmann, L. et al., Nature 332:323 a 327, 1998; Jones, P. et al., Nature 321:522 a 525, 1986; e Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. USA 86:10029 a 10033, 1989). Tais sequências de estrutura podem ser obtidas a partir de bancos de dados de DNA públicos que incluem sequências de genes de anticorpos de linhagem germinativa. estas sequências de linhagem germinativa serão diferentes das sequências de genes de anticorpos maturas, pelo fato de que não incluirão genes variáveis completamente montados, que são formados pela união de V(D)J durante a maturação de células B. As sequências de genes de linhagem germinativa também serão diferentes das sequências de um anticorpo de repertório secundário de alta afinidade que contém mutações em todo o gene variável, mas tipicamente agrupado nas RDCs. Por exemplo, mutações somáticas são relativamente infrequentes na porção amino terminal da região de estrutura 1 e na porção carbóxi terminal da região de estrutura 4. Além disso, muitas mutações somáticas não alteram significantemente as propriedades de ligação do anticorpo. Por esta razão, não é necessário obter a sequência de DNA total de um anticorpo particular, de modo a recriar um anticorpo recombinante intacto que apresenta propriedades de ligação similares àquelas do anticorpo original. A sequência parcial de cadeia pesada e leve que abrange as regiões RDC é tipicamente suficiente para este propósito. A sequência parcial é usada para determinar qual linhagem germinativa variável e segmentos de gene de união contribuíram para os genes variáveis de anticorpos recombinados. A sequência de linhagem germinativa depois é usada para preencher as porções ausentes das regiões variáveis. As sequências líderes de cadeia pesada e leve são clivadas durante a maturação da proteína e não contribuem para as propriedades do anticorpo final. Para adicionar sequências ausentes, sequências de cDNA clonadas podem ser combinadas com oligonucleotídeos sintéticos por ligação ou amplificação por PCR. Alternativamente, a região variável total pode ser sintetizada para criar um clone de região variável totalmente sintético. Este processo apresenta certas vantagens, tais como eliminação ou inclusão de sítios de restrição particulares, ou otimização de códons particulares. Certamente, a totalidade ou porções da região de estrutura do anticorpo descrito neste relatório podem ser usadas em combinação com as RDCs, de modo a otimizar a afinidade, especificidade ou quaisquer outras propriedades desejadas do anticorpo.
[040] Em algumas formas de realização, a invenção refere-se a polímeros, tais como um polímero bifuncional. Um “polímero bifuncional”, também referido como um “ligante bifuncional”, refere-se a um polímero compreendendo dois grupos funcionais que são capazes de reagir especificamente com outras porções para formar ligações covalentes ou não covalentes. Tais porções podem incluir, mas não são limitadas aos grupos laterais em aminoácidos naturais ou não naturais ou peptídeos que contêm tais aminoácidos naturais ou não naturais. As outras porções que podem ser ligadas ao ligante bifuncional ou polímero bifuncional podem ser as mesmas porções ou porções diferentes. Apenas por via de exemplo, um ligante bifuncional pode apresentar um grupo funcional reativo com um grupo em um primeiro peptídeo e outro grupo funcional que é reativo com um grupo em um segundo peptídeo, formando um conjugado que inclui o primeiro peptídeo, o ligante bifuncional e o segundo peptídeo. Muitos procedimentos e moléculas ligantes para a ligação de vários compostos aos peptídeos são conhecidos. Veja, por exemplo, o Pedido de Patente Europeu No 0188256; Patente U.S. Nos 4.659.839; 4.414.148;
4.699.784; 4.680.338; e 4.569.789 incorporados integralmente neste relatório à título de referência. Um “polímero multifuncional” também referido como um “ligante multifuncional”, refere-se a um polímero compreendendo dois ou mais grupos funcionais que são capazes de reagir com outras porções. Tais porções podem incluir, mas não são limitadas aos grupos laterais em aminoácidos naturais ou não naturais ou peptídeos que contêm tais aminoácidos naturais ou não naturais, (incluindo, mas não limitados aos grupos laterais de aminoácidos) para formar ligações covalentes ou não covalentes. Um polímero bifuncional ou polímero multifuncional pode apresentar qualquer comprimento ou peso molecular desejado e pode ser selecionado para fornecer um espaçamento ou conformação desejado particular entre uma ou mais moléculas ligadas a um composto e moléculas às quais o mesmo se liga, ou ao composto.
[041] O termo “biodisponibilidade”, conforme usado neste relatório, refere-se à taxa e extensão em que uma substância ou sua porção ativa é liberada de uma forma de dosagem farmacêutica e se torna disponível no sítio de ação ou na circulação geral. Aumentos na biodisponibilidade referem-se ao aumento da taxa e extensão em que uma substância ou sua porção ativa é liberada de uma forma de dosagem farmacêutica e se torna disponível no sítio de ação ou na circulação geral. Por via de exemplo, um aumento na biodisponibilidade pode ser indicado como um aumento na concentração da substância ou sua porção ativa no sangue em comparação a outras substâncias ou porções ativas.
[042] O termo “molécula biologicamente ativa”, “porção biologicamente ativa” ou “agente biologicamente ativo”, quando usado neste relatório, significa qualquer substância que pode afetar quaisquer propriedades físicas ou bioquímicas de um sistema biológico, via, molécula ou interação relacionado a um organismo, incluindo, mas não limitado aos vírus, bactérias, bacteriófagos, transposon, príon, insetos, fungos, plantas, animais e seres humanos. Em particular, conforme usado neste relatório, moléculas biologicamente ativas incluem, mas não são limitadas a qualquer substância que se destina ao diagnóstico, cura, mitigação, tratamento ou prevenção de doença em seres humanos ou outros animais ou, de outro modo, acentuar o bem-estar físico ou mental de seres humanos ou animais. Exemplos de moléculas biologicamente ativas incluem, mas não são limitados aos peptídeos, proteínas, enzimas, fármacos de moléculas pequenas, fármacos duros, fármacos moles, pró-fármacos, carboidratos, átomos ou moléculas inorgânicos, corantes, lipídeos, nucleosídeos, radionuclídeos, oligonucleotídeos, toxinas, células, vírus, lipossomas, micropartículas e micelas. As classes de agentes biologicamente ativos que são adequados para o uso com os métodos e composições descritos neste relatório incluem, mas não são limitados aos fármacos, pró-fármacos, radionuclídeos, agentes de imageamento, polímeros, antibióticos, fungicidas, agentes antivirais, agentes anti-inflamatórios, agentes antitumorais, agentes cardiovasculares, agentes antiansiedade, hormônios, fatores de crescimento, agentes esteroidais e não esteroidais, toxinas derivadas de micróbios e semelhantes.
[043] “Modular a atividade biológica” significa aumentar ou diminuir a reatividade de um polipeptídeo, alterar a seletividade do polipeptídeo, acentuar ou diminuir a seletividade do substrato do polipeptídeo. A análise da atividade biológica modificada pode ser realizada por meio da comparação da atividade biológica do polipeptídeo não natural àquela do polipeptídeo natural.
[044] Em algumas formas de realização, a divulgação refere-se aos aminoácidos que foram biossinteticamente incorporados no anticorpo. O termo “biossinteticamente”, conforme usado neste relatório, refere-se a qualquer método que utiliza um sistema de tradução (celular ou não celular), incluindo o uso de pelo menos um entre os seguintes componentes: um polinucleotídeo, um códon, um tRNA e um ribossomo. Por via de exemplo, os aminoácidos não naturais podem ser “biossinteticamente incorporados” em polipeptídeos de aminoácidos não naturais usando os métodos e técnicas descritos neste relatório e bem conhecidos no ramo. Veja, por exemplo, o WO 2010/011735 e WO 2005/074650.
[045] O termo “variantes conservativamente modificadas” aplica-se às sequências de aminoácidos naturais e não naturais e de ácido nucleico naturais e não naturais, e combinações das mesmas. Com respeito às sequências de ácidos nucleicos particulares”, variantes conservativamente modificadas” referem-se àqueles ácidos nucleicos naturais e não naturais que codificam sequências de aminoácidos naturais e não naturais idênticas ou essencialmente idênticas ou, onde os ácidos nucleicos naturais e não naturais não codificam uma sequência de aminoácidos natural e não natural, para sequências essencialmente idênticas. Por via de exemplo, por causa da degeneração do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer proteína fornecida. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU codificam o aminoácido alanina. Assim, em cada posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um entre os códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado.
Tais variações de ácidos nucleicos são “variações silenciosas”, que são uma espécie de variações conservativamente modificadas.
Assim, por via de exemplo, cada sequência de ácidos nucleicos natural ou não natural neste relatório que codifica um polipeptídeo natural ou não natural também descreve cada possível variação silenciosa do ácido nucleico natural ou não natural.
Um técnico no assunto reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico natural ou não natural (exceto AUG, que é comumente o único códon para metionina, e TGG, que é comumente o único códon para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica.
Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucleico natural e não natural que codifica um polipeptídeo natural e não natural está implícita em cada sequência descrita.
Quanto às sequências de aminoácidos, substituições, deleções ou adições individuais de uma sequência de ácidos nucleicos, peptídeos, polipeptídeos ou proteínas que altera, adiciona ou deleta um aminoácido natural e não natural único ou uma pequena porcentagem de aminoácidos naturais e não naturais na sequência codificada é uma “variante conservativamente modificada” onde a alteração resulta na deleção de um aminoácido, adição de um aminoácido ou substituição de um aminoácido natural e não natural por um aminoácido quimicamente similar.
Tabelas de substituição conservativa que fornecem aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica.
As tabelas de substituição conservativa que fornecem aminoácidos funcionalmente similares são conhecidas aos técnicos no assunto.
Os oito grupos seguintes contêm aminoácidos que são substituições conservativas entre si: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e S) Cisteína (C), Metionina (M) (veja, por exemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2a edição, 1993). Tais variantes conservativamente modificadas são adicionais e não excluem variantes polimórficas, homólogos interespécies e alelos das composições descritas neste relatório.
[046] O termo “fármaco”, conforme usado neste relatório, refere-se a qualquer substância usada na prevenção, diagnóstico, alívio, tratamento ou cura de uma doença ou condição, tal como câncer, incluindo câncer de próstata.
[047] O termo “quantidade eficaz”, conforme usado neste relatório, refere-se a uma quantidade suficiente de um agente, composto ou composição que será administrado que, de certa forma, atenuará um ou mais entre os sintomas da doença ou condição que será tratada. O resultado pode ser redução e/ou alívio dos sinais, sintomas ou causas de uma doença ou qualquer outra alteração desejada de um sistema biológico. Por via de exemplo, um agente, composto ou composição que será administrado inclui, mas não é limitado a um polipeptídeo de aminoácido natural, polipeptídeo de aminoácido não natural, polipeptídeo de aminoácido natural modificado, polipeptídeo de aminoácido não natural modificado ou um anticorpo ou variante do mesmo. As composições contendo tais polipeptídeos de aminoácido natural, polipeptídeos de aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácidos naturais modificados, polipeptídeos de aminoácidos não naturais modificados ou um anticorpo ou variante dos mesmos podem ser administradas para tratamentos profiláticos, intensificadores e/ou terapêuticos. Uma quantidade “eficaz” apropriada em qualquer caso individual pode ser determinada usando técnicas, tais como um estudo de escalonamento de dose.
[048] Os termos “acentuar” ou “intensificar” significam aumentar ou prolongar um efeito desejado em potência ou duração. Por via de exemplo, “acentuar” o efeito de agentes terapêuticos refere-se à capacidade de aumentar ou prolongar, tanto na potência quanto na duração, o efeito de agentes terapêuticos durante o tratamento de uma doença, transtorno ou condição. Uma “quantidade eficaz acentuada”,
conforme usado neste relatório, refere-se a uma quantidade adequada para acentuar o efeito de um agente terapêutico no tratamento de uma doença, transtorno ou condição. Quando usadas em um paciente, quantidades eficazes para este uso dependerão da gravidade e curso da doença, transtorno ou condição, terapia prévia, do estado de saúde do paciente e resposta aos fármacos e do julgamento do médico.
[049] O termo “humanizado ou anticorpo quimérico” refere-se a uma molécula, geralmente preparada usando técnicas recombinantes, apresentando um sítio de ligação ao antígeno derivado de uma imunoglobulina a partir de uma espécie não humana, (por exemplo, murino) e a estrutura de imunoglobulina remanescente da molécula com base na estrutura e/ou sequência de uma imunoglobulina humana. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente pelo menos um, e, tipicamente, dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as resíduos/regiões de estrutura (RE) são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado, opcionalmente, também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. As formas humanizadas de anticorpos de roedores, essencialmente, compreenderão as mesmas sequências de RDC dos anticorpos de roedores parentais, embora certas substituições de aminoácidos possam ser incluídas para aumentar a afinidade, aumentar a estabilidade do anticorpo humanizado ou por outras razões. Entretanto, como as trocas de alça de RDC não resultam uniformemente em um anticorpo com as mesmas propriedades de ligação que o anticorpo de origem, alterações nos resíduos de estrutura (RE), resíduos envolvidos no suporte da alça de RDC, também podem ser introduzidas nos anticorpos humanizados para preservar a afinidade de ligação ao antígeno. O sítio de ligação ao antígeno pode compreender domínios variáveis completos fundidos em domínios constantes ou apenas as regiões determinantes de complementaridade (RDCs) enxertadas nas regiões de estrutura apropriadas nos domínios variáveis.
Os sítios de ligação ao antígeno podem ser do tipo selvagem ou modificados por uma ou mais substituições de aminoácidos.
Isto elimina a região constante como um imunógeno em seres humanos, mas a possibilidade de uma resposta imune à região variável estranha permanece (LoBuglio, A.
F. et al., “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response”, Proc.
Natl.
Acad Sci. (USA) 86:4220 a 4224, 1989). Outra abordagem se concentra não apenas em fornecer regiões constantes derivadas de seres humanos, mas modificar as regiões variáveis, de modo a remodelá-las o mais próximo possível da forma humana.
É conhecido que as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm três regiões determinantes de complementaridade (RDCs) que variam em resposta aos antígenos em questão e determinam a capacidade de ligação, flanqueadas por quatro regiões de estrutura (REs) que são relativamente conservadas em uma dada espécie e que fornecem putativamente um andaime para as RDCs.
Quando os anticorpos não humanos são preparados com respeito a um antígeno particular, as regiões variáveis podem ser “humanizadas” enxertando RDCs derivadas de anticorpos não humanos nas REs presentes nos anticorpos humanos que serão modificados.
A aplicação desta abordagem a vários anticorpos foi relatada por Kettleborough, C.
A. et al., “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR- Grafting: The Importante Of Framework Residues On Loop Conformation,” Protein Engineering 4:773 a 3783, 1991; Co, M.
S. et al., “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,” Proc.
Nati.
Acad.
Sci. (USA) 88:2869 a 2873,1991; Carter, P. et al., “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc.
Natl.
Acad.
Sci. (USA) 89:4285 a 4289,1992; and Co, M.
S. et al., “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,” 7. Immunol.
148:1149 a 1154,1992. Em algumas formas de realização, os anticorpos humanizados preservam todas as sequências de RDC (por exemplo, um anticorpo de camundongo humanizado que contém todas as seis RDCs a partir dos anticorpos de camundongo). Em outras formas de realização, os anticorpos humanizados apresentam uma ou mais RDCs (uma, duas, três, quatro, cinco, seis) que são alteradas com respeito ao anticorpo original, que também são denominadas uma ou mais RDCs “derivadas de” uma ou mais RDCs a partir do anticorpo original.
[050] O termo “idêntico”, conforme usado neste relatório, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas. Além disso, o termo “substancialmente idêntico”, conforme usado neste relatório, refere-se a duas ou mais sequências que apresentam uma porcentagem de unidades sequenciais que são as mesmas quando comparadas e alinhadas para máxima correspondência em uma janela de comparação, ou região designada medida usando algoritmos de comparação ou por alinhamento manual e inspeção visual. Apenas por via de exemplo, duas ou mais sequências podem ser “substancialmente idênticas” se as unidades sequenciais forem cerca de 60 % idênticas, cerca de 65 % idênticas, cerca de 70 % idênticas, cerca de 75 % idênticas, cerca de 80 % idênticas, cerca de 85 % idênticas, cerca de 90 % idênticas ou cerca de 95 % idênticas em uma região especificada. Tais porcentagens descrevem a “porcentagem de identidade” de duas ou mais sequências. A identidade de uma sequência pode existir em uma região que apresenta pelo menos cerca de 75 a 100 unidades sequenciais de comprimento, em uma região que apresenta cerca de 50 unidades sequenciais de comprimento ou, onde não especificada, em toda a sequência. Esta definição também refere-se ao complemento de uma sequência de teste. Apenas por via de exemplo, duas ou mais sequências de polipeptídeos são idênticas quando os resíduos de aminoácidos são os mesmos, enquanto duas ou mais sequências de polipeptídeos são “substancialmente idênticas” se os resíduos de aminoácidos foram cerca de 60 %
idênticos, cerca de 65 % idênticos, cerca de 70 % idênticos, cerca de 75 % idênticos, cerca de 80 % idênticos, cerca de 85 % idênticos, cerca de 90 % idênticos ou cerca de 95 % idênticos em uma região especificada. A identidade pode existir em uma região que apresenta pelo menos cerca de 75 a cerca de 100 aminoácidos de comprimento, em uma região que apresenta cerca de 50 aminoácidos de comprimento ou, onde não especificado, em toda a sequência de uma sequência de polipeptídeos. Além disso, apenas por via de exemplo, duas ou mais sequências de polinucleotídeos são idênticas quando os resíduos de ácidos nucleicos forem os mesmos, enquanto duas ou mais sequências de polinucleotídeos são “substancialmente idênticas” se os resíduos de ácidos nucleicos forem cerca de 60 % idênticos, cerca de 65 % idênticos, cerca de 70 % idênticos, cerca de 75 % idênticos, cerca de 80 % idênticos, cerca de 85 % idênticos, cerca de 90 % idênticos ou cerca de 95 % idênticos em uma região especificada. A identidade pode existir em uma região que apresenta pelo menos cerca de 75 a cerca de 100 ácidos nucleicos de comprimento, em uma região que apresenta cerca de 50 ácidos nucleicos de comprimento ou, onde não especificado, em toda a sequência de uma sequência de polinucleotídeos.
[051] O termo “imunogenicidade”, conforme usado neste relatório, refere-se a uma resposta do anticorpo à administração de um fármaco terapêutico. A imunogenicidade para polipeptídeos de aminoácidos não naturais terapêuticos pode ser obtida usando ensaios quantitativos e qualitativos para a detecção de anti- anticorpos de polipeptídeos de aminoácidos não naturais em fluidos biológicos. Tais ensaios incluem, mas não são limitados ao Radioimunoensaio (RIA), Ensaio imunossorvente ligado por enzimas (ELISA), imunoensaio luminescente (IEL) e imunoensaio fluorescente (IEF). A análise de imunogenicidade para polipeptídeos de aminoácidos não naturais terapêuticos envolve comparar a resposta do anticorpo após a administração de polipeptídeos de aminoácidos não naturais terapêuticos à resposta do anticorpo após a administração de polipeptídeos de aminoácidos naturais terapêuticos.
[052] O termo “isolado”, conforme usado neste relatório, refere-se à separação e remoção de um componente de interesse a partir de componentes de não interesse. Substâncias isoladas podem estra em um estado seco ou semisseco ou em solução, incluindo, mas não limitada a uma solução aquosa. O componente isolado pode estar em um estado homogêneo ou o componente isolado pode ser uma parte de uma composição farmacêutica que compreende portadores e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis adicionais. Pureza e homogeneidade podem ser determinadas usando técnicas de química analítica, incluindo, mas não limitadas à eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alto desempenho. Além disso, quando um componente de interesse é isolado e é a espécie predominante presente em uma preparação, o componente é descrito neste relatório como substancialmente purificado. O termo “purificado”, conforme usado neste relatório, pode se referir a um componente de interesse que é pelo menos 85 % puro, pelo menos 90 % puro, pelo menos 95 % puro, pelo menos 99 % ou de maior puro. Apenas por via de exemplo, os ácidos nucleicos ou proteínas são “isolados” quando tais ácidos nucleicos ou proteínas estão livres de pelo menos alguns entre os componentes celulares com os quais estão associados no estado natural, ou que o ácido nucleico ou proteína foi concentrado em um nível maior do que a concentração de sua produção in vivo ou in vitro. Além disso, por via de exemplo, um gene é isolado quando separado dos quadros abertos de leitura que flanqueiam o gene e codificam uma proteína, exceto o gene de interesse.
[053] O termo “ligação”, conforme usado neste relatório para se referir às ligações ou porção química formada a partir de uma reação química entre o grupo funcional de um ligante e outra molécula. Tais ligações podem incluir, mas não são limitadas às ligações covalentes e ligações não covalentes, enquanto tais porções químicas podem incluir, mas não são limitadas aos ésteres, carbonatos, ésteres de fosfato de iminas, hidrazonas, acetais, ortoésteres, ligações peptídicas e ligações oligonucleotídicas.
Ligações hidroliticamente estáveis significam que as ligações são substancialmente estáveis em água e não reagem com água em valores de pH úteis sob condições fisiológicas durante um período de tempo prolongado, talvez até indefinidamente.
Ligações hidroliticamente instáveis ou degradáveis significam que as ligações são degradáveis em água ou em soluções aquosas, incluindo, por exemplo, sangue.
Ligações enzimaticamente instáveis ou degradáveis significam que a ligação pode ser degradada por uma ou mais enzimas.
Apenas por via de exemplo, PEG e polímeros relacionados podem incluir ligações degradáveis na estrutura do polímero ou no grupo ligante entre a estrutura do polímero e um ou mais entre os grupos funcionais terminais da molécula polimérica.
Tais ligações degradáveis incluem, mas não são limitadas às ligações éster formadas pela reação de ácidos carboxílicos de PEG ou ácidos carboxílicos de PEG ativados com grupos álcool em um agente biologicamente ativo, em que tais grupos éster, em geral, hidrolisam sob condições fisiológicas para liberar o agente biologicamente ativo.
Outras ligações hidroliticamente degradáveis incluem, mas não são limitadas às ligações carbonato; ligações imina resultantes da reação de uma amina e um aldeído; ligações éster de fosfato formadas pela reação de um álcool com um grupo fosfato; ligações hidrazona que são produto de reação de uma hidrazida e um aldeído; ligações acetal que são o produto de reação de um aldeído e um álcool; ligações ortoéster que são o produto de reação de um formiato e um álcool; ligações peptídicas formadas por um grupo amina, incluindo, mas não limitadas a, em uma extremidade de um polímero, tal como PEG, e um grupo carboxila de um peptídeo; e ligações oligonucleotídicas formadas por um grupo fosforamidita, incluindo, mas não limitadas a, na extremidade de um polímero, e um grupo 5’ hidroxila de um oligonucleotídeo.
[054] O termo “metabólito”, conforme usado neste relatório, refere-se a um derivado de um composto, por via de exemplo, um polipeptídeo de aminoácido natural, um polipeptídeo de aminoácido não natural, um polipeptídeo de aminoácido natural modificado ou um polipeptídeo de aminoácido não natural modificado, que é formado quando o composto, por via de exemplo, polipeptídeo de aminoácido natural, polipeptídeo de aminoácido não natural, polipeptídeo de aminoácido natural modificado ou polipeptídeo de aminoácido não natural modificado, é metabolizado. O termo “metabólito farmaceuticamente ativo” ou “metabólito ativo” refere-se a um derivado biologicamente ativo de um composto, por via de exemplo, um polipeptídeo de aminoácido natural, um polipeptídeo de aminoácido não natural, um polipeptídeo de aminoácido natural modificado ou um polipeptídeo de aminoácido não natural modificado, que é formado quando tal composto, por via de exemplo, um polipeptídeo de aminoácido natural, polipeptídeo de aminoácido não natural, polipeptídeo de aminoácido natural modificado ou polipeptídeo de aminoácido não natural modificado, é metabolizado.
[055] O termo “metabolizado”, conforme usado neste relatório, refere-se à soma dos processos pelos quais uma substância particular é alterada por um organismo. Tais processos incluem, mas não são limitados às reações de hidrólise e reações catalisadas por enzimas. Outras informações sobre metabolismo podem ser obtidas a partir da Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a Edição, McGraw-Hill (1996). Apenas por via de exemplo, os metabólitos de polipeptídeos de aminoácido natural, polipeptídeos de aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácidos naturais modificados ou polipeptídeos de aminoácidos não naturais modificados podem ser identificados pela administração dos polipeptídeos de aminoácido natural, polipeptídeos de aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácidos naturais modificados ou polipeptídeos de aminoácidos não naturais modificados a um hospedeiro e análise das amostras de tecido a partir do hospedeiro ou por incubação de polipeptídeos de aminoácido natural, polipeptídeos de aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácidos naturais modificados ou polipeptídeos de aminoácidos não naturais modificados com células hepáticas in vitro e análise dos compostos resultantes.
[056] O termo “modificado”, conforme usado neste relatório, refere-se à presença de uma alteração em um aminoácido natural, um aminoácido não natural, um polipeptídeo de aminoácido natural ou um polipeptídeo de aminoácido não natural. Tais alterações ou modificações podem ser obtidas por modificações pós- síntese de aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácidos naturais ou polipeptídeos de aminoácidos não naturais, ou por cotradução, ou por modificação pós-tradução de aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácidos naturais ou polipeptídeos de aminoácidos não naturais.
[057] Um “aminoácido não natural” refere-se a um aminoácido que não é um dos 20 aminoácidos comuns ou pirolisina ou selenocisteína. Outros termos que podem ser usados como sinônimos do termo “aminoácido não natural” são “aminoácido não naturalmente codificado”, “aminoácido de ocorrência não natural” e versões variadamente hifenizadas e não hifenizadas dos mesmos. O termo “aminoácido não natural” inclui, mas não é limitado aos aminoácidos que ocorrem naturalmente por modificação de um aminoácido naturalmente codificado (incluindo, mas não limitado aos 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina e selenocisteína), mas não são por si só incorporados em uma cadeia polipeptídica crescente pelo complexo de tradução. Exemplos de aminoácidos de ocorrência natural que não são naturalmente codificados incluem, mas não são limitados a N-acetilglucosaminil-L- serina, N-acetilglucosaminil-L-treonina e O-fosfotirosina. Adicionalmente, o termo “aminoácido não natural” inclui, mas não é limitado aos aminoácidos que não ocorrem naturalmente e podem ser sinteticamente obtidos ou podem ser obtidos pela modificação de aminoácidos não naturais.
[058] O termo “ácido nucleico”, conforme usado neste relatório, refere-se a desoxirribonucleotídeos, desoxiribonucleosídeos, ribonucleosídeos ou ribonucleotídeos e polímeros dos mesmos na forma de fita única ou dupla. Apenas por via de exemplo, tais ácidos nucleicos e polímeros de ácidos nucleicos incluem, mas não são limitados a: (i) análogos de nucleotídeos naturais que apresentam propriedades de ligação similares a um ácido nucleico de referência e são metabolizados de uma maneira similar aos nucleotídeos de ocorrência natural; (ii) análogos de oligonucleotídeos incluindo, mas não são limitados a PNA (ácido peptidonucleico), análogos de DNA usados na tecnologia antissentido (fosforotioatos, fosforoamidatos e semelhantes); (iii) variantes conservativamente modificadas dos mesmos (incluindo, mas não limitadas às substituições de códons degenerados) e sequências complementares e sequência explicitamente indicada. Por via de exemplo, substituições de códons degenerados podem ser obtidas pela geração de sequências em que a terceira posição de um ou mais (ou todos) códons selecionados é substituída por resíduos com base mista e/ou desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605 a 2608, 1985; e Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91 a 98, 1994).
[059] O termo “farmaceuticamente aceitável”, conforme usado neste relatório, refere-se a um material, incluindo, mas não limitado a um sal, aglutinante, adjuvante, excipiente, portador ou diluente, que não anula a atividade biológica ou propriedades do composto, e é relativamente não tóxico, isto é, o material pode ser administrado a um indivíduo sem causar efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de uma maneira deletéria com qualquer um dos componentes da composição na qual está contido.
[060] Em algumas formas de realização, a invenção refere-se aos polímeros. O termo “polímero”, conforme usado neste relatório, refere-se a uma molécula composta de subunidades repetidas. Tais moléculas incluem, mas não são limitadas aos polipeptídeos, polinucleotídeos, polissacarídeos ou polialquilenoglicóis. Os polímeros da invenção podem ser poliéter polióis poliméricos lineares ou ramificados incluindo, mas não são limitados a polietilenoglicol, polipropilenoglicol, polibutileno glicol e derivados dos mesmos. Outras formas de realização exemplares são listadas, por exemplo, em catálogos de fornecedores comerciais, tais como catálogo da Shearwater Corporation’s “Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications” (2001). Apenas por via de exemplo, tais polímeros apresentam pesos moleculares médios entre cerca de 0,1 kDa a cerca de 100 kDa. Tais polímeros incluem, mas não são limitados a, entre cerca de 100 Da e cerca de 100.000 Da ou mais. O peso molecular do polímero pode estar entre cerca de 100 Da e cerca de
100.000 Da, incluindo mas não se limitando a cerca de 100.000 Da, cerca de 95.000 Da, cerca de 90.000 Da, cerca de 85.000 Da, cerca de 80.000 Da, cerca de 75.000 Da, cerca de 70.000 Da, cerca de 65.000 Da, cerca de 60.000 Da, cerca de 55.000 Da, cerca de 50.000 Da, cerca de 45.000 Da, cerca de 40.000 Da, cerca de 35.000 Da, cerca de 30.000 Da, cerca de 25.000 Da, cerca de 20.000 Da, cerca de 15.000 Da, cerca de 10.000 Da, cerca de 9.000 Da, cerca de 8.000 Da, cerca de 7.000 Da, cerca de 6.000 Da, cerca de 5.000 Da, cerca de 4.000 Da, cerca de 3.000 Da, cerca de 2.000 Da, cerca de 1.000 Da, cerca de 900 Da, cerca de 800 Da, cerca de 700 Da, cerca de 600 Da, cerca de 500 Da, 400 Da, cerca de 300 Da, cerca de 200 Da, e cerca de 100 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular do polímero está entre cerca de 100 Da e cerca de 50.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular do polímero está entre cerca de 100 Da e cerca de
40.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular do polímero está entre cerca de 1.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular do polímero está entre cerca de 2.000 a cerca de 50.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular do polímero está entre cerca de
5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular do polímero está entre cerca de 10.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas formas de realização, a molécula de polietilenoglicol é um polímero ramificado. O peso molecular do PEG de cadeia ramificada pode estar entre cerca de 1.000 Da e cerca de 100.000 Da, incluindo, mas não se limitando a cerca de 100.000 Da, cerca de 95.000 Da, cerca de 90.000 Da, cerca de 85.000 Da, cerca de 80.000 Da, cerca de 75.000 Da, cerca de 70.000 Da, cerca de 65.000 Da, cerca de 60.000 Da, cerca de 55.000 Da, cerca de 50.000 Da, cerca de 45.000 Da, cerca de 40.000 Da, cerca de 35.000 Da, cerca de 30.000 Da, cerca de 25.000 Da, cerca de 20.000 Da, cerca de 15.000 Da, cerca de 10.000 Da, cerca de 9.000 Da, cerca de 8.000 Da, cerca de
7.000 Da, cerca de 6.000 Da, cerca de 5.000 Da, cerca de 4.000 Da, cerca de 3.000 Da, cerca de 2.000 Da e cerca de 1.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular do PEG de cadeia ramificada está entre cerca de 1.000 Da e cerca de 50.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular do PEG de cadeia ramificada está entre cerca de 1.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular do PEG de cadeia ramificada está entre cerca de 5.000 Da e cerca de 40.000 Da. Em algumas formas de realização, o peso molecular do PEG de cadeia ramificada está entre cerca de 5.000 Da e cerca de
20.000 Da. Em outras formas de realização, o peso molecular do PEG de cadeia ramificada está entre cerca de 2.000 a cerca de 50.000 Da. O termo “PEGilando” ou “PEGilado” refere-se à ligação covalente do aminoácido sintético especificado a uma molécula de polietilenoglicol (PEG). O método pode compreender contatar um isolada polipeptídeo de CAFs α-AMEP compreendendo um aminoácido sintético com um polímero solúvel em água compreendendo uma porção que reage com o aminoácido sintético.
[061] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são permutavelmente usados neste relatório para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos.
Isto é, uma descrição dirigida a um polipeptídeo se aplica igualmente a uma descrição de um peptídeo e uma descrição de uma proteína e vice-versa. Os termos aplicam-se aos polímeros de aminoácidos de ocorrência natural, assim como polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos é um aminoácido não natural. Adicionalmente, tais “polipeptídeos”, “peptídeos” e “proteínas” incluem cadeias de aminoácidos de qualquer comprimento, incluindo proteínas de comprimento total, em que os resíduos de aminoácidos são ligados por ligações peptídicas covalentes.
[062] O termo “modificado pós-tradução” refere-se a qualquer modificação de um aminoácido natural ou não natural que ocorre depois que tal aminoácido foi traducionalmente incorporado em uma cadeia polipeptídica. Tais modificações incluem, mas não são limitadas a modificações in vivo cotraducionais, modificações in vitro cotraducionais (tais como em um sistema de tradução livre de células), modificações in vivo pós-traducionais e modificações in vitro pós-traducionais.
[063] Os termos “pró-fármaco” ou “pró-fármaco farmaceuticamente aceitável”, conforme usado neste relatório, referem-se a um agente que é convertido no fármaco precursor in vivo ou in vitro, que não anula a atividade biológica ou propriedades do fármaco e é relativamente não tóxico, isto é, o material pode ser administrado a um indivíduo sem causar efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de uma maneira deletéria com qualquer um dos componentes da composição na qual está contido. Pró-fármacos são, em geral, precursores de fármaco que, após administração a um indivíduo e absorção subsequente, são convertidos em uma espécie ativa ou mais ativa por intermédio de algum processo, tal como conversão por uma via metabólica. Alguns pró-fármacos apresentam um grupo químico presente no pró-fármaco que o torna menos ativo e/ou confere solubilidade ou alguma outra propriedade ao fármaco. Uma vez que o grupo químico for clivado e/ou modificado a partir do pró-fármaco, o fármaco ativo é gerado. Os pró-fármacos são convertidos em fármaco ativo dentro do corpo através de reações enzimáticas ou não enzimáticas. Os pró-fármacos podem fornecer propriedades fisicoquímicas aperfeiçoadas, tais como melhor solubilidade, características de liberação acentuadas, tais como alvejar especificamente uma célula, tecido, órgão ou ligante particular, e valor terapêutico aperfeiçoado do fármaco. Os benefícios de tais pró- fármacos incluem, mas não são limitados a: (i) facilidade de administração em comparação ao fármaco precursor; (ii) o pró-fármaco pode estar biodisponível por administração oral, ao passo que o precursor não está; e (iii) o pró-fármaco também pode apresentar solubilidade aperfeiçoada em composições farmacêuticas em comparação ao fármaco precursor. Um pró-fármaco inclui uma atividade farmacologicamente inativa ou reduzida, derivado de um fármaco ativo. Os pró- fármacos podem ser designados para modular a quantidade de um fármaco ou molécula biologicamente ativa que atinge um sítio de ação desejado através da manipulação das propriedades de um fármaco, tais como propriedades fisicoquímicas, biofarmacêuticas ou farmacocinéticas. Um exemplo, sem limitação, de um pró-fármaco, seria um polipeptídeo de aminoácido não natural que é administrado como um éster (o “pró-fármaco”) para facilitar a transmissão através de uma membrana celular onde a solubilidade em água é prejudicial para a mobilidade e que depois é metabolicamente hidrolisado em ácido carboxílico, a entidade ativa, uma vez dentro da célula onde a solubilidade em água é benéfica. Os pró-fármacos pode ser designados como derivados de fármacos reversíveis, para o uso como modificadores para acentuar o transporte de fármacos aos tecidos específicos do sítio.
[064] O termo “quantidade profilaticamente eficaz”, conforme usado neste relatório, refere-se a uma quantidade de uma composição contendo pelo menos um polipeptídeo de aminoácido não natural ou pelo menos um polipeptídeo de aminoácido não natural modificado profilaticamente aplicado a um paciente que, de certa forma, atenuará um ou mais dos sintomas de uma doença, condição ou transtorno que será tratada. Em tais aplicações profiláticas, tais quantidades podem depender do estado de saúde, peso do paciente e semelhantes. O técnico no assunto pode determinar tais quantidades profilaticamente eficazes por experimentação de rotina, incluindo, mas não se limitando a um ensaio clínico de escalonamento de dose.
[065] O termo “célula hospedeira recombinante”, também referida como “célula hospedeira”, refere-se a uma célula que inclui um polinucleotídeo exógeno, em que os métodos usados para inserir o polinucleotídeo exógeno em uma célula incluem, mas não são limitados à absorção direta, transdução, cruzamento f ou outros métodos conhecidos na técnica para criar células hospedeiras recombinantes. Apenas por via de exemplo, tal polinucleotídeo exógeno pode ser um vetor não integrado, incluindo, mas não limitado a um plasmídeo, ou pode ser integrado no genoma do hospedeiro.
[066] O termo “indivíduo”, conforme usado neste relatório, refere-se a um animal que é o objeto do tratamento, observação ou experimento. Apenas por via de exemplo, um indivíduo pode ser, mas não é limitado a um mamífero, incluindo, mas não limitado a um ser humano.
[067] O termo “substancialmente purificado”, conforme usado neste relatório, refere-se a um componente de interesse que pode ser substancial ou essencialmente livre de outros componentes que normalmente acompanham ou interagem com o componente de interesse antes da purificação. Apenas por via de exemplo, um componente de interesse pode ser “substancialmente purificado” quando a preparação do componente de interesse contém menos do que cerca de 30 %, menos do que cerca de 25 %, menos do que cerca de 20 %, menos do que cerca de 15 %, menos do que cerca de 10 %, menos do que cerca de 5 %, menos do que cerca de 4 %, menos do que cerca de 3 %, menos do que cerca de 2 % ou menos do que cerca de 1 % (em peso seco) de componentes contaminantes.
Assim, um componente “substancialmente purificado” de interesse pode apresentar um nível de pureza de cerca de 70 %, cerca de 75 %, cerca de 80 %, cerca de 85 %, cerca de 90 %, cerca de 95 %, cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 %, cerca de 99 % ou maior.
Apenas por via de exemplo, um polipeptídeo de aminoácido natural ou um polipeptídeo de aminoácido não natural pode ser purificado a partir de uma célula nativa ou célula hospedeira, no caso de polipeptídeos de aminoácidos naturais ou polipeptídeos de aminoácidos não naturais recombinantemente produzidos.
Por via de exemplo, uma preparação de um polipeptídeo de aminoácido natural ou de um polipeptídeo de aminoácido não natural pode ser “substancialmente purificado” quando a preparação contém menos do que cerca de 30 %, menos do que cerca de 25 %, menos do que cerca de 20 %, menos do que cerca de 15 %, menos do que cerca de 10 %, menos do que cerca de 5 %, menos do que cerca de 4 %, menos do que cerca de 3 %, menos do que cerca de 2 % ou menos do que cerca de 1 % (em peso seco) de material contaminante.
Por via de exemplo, quando um polipeptídeo de aminoácido natural ou um polipeptídeo de aminoácido não natural é recombinantemente produzido por células hospedeiras, o polipeptídeo de aminoácido natural ou polipeptídeo de aminoácido não natural pode estar presente em cerca de 30 %, cerca de 25 %, cerca de 20 %, cerca de 15 %, cerca de 10 %, cerca de 5 %, cerca de 4 %, cerca de 3 %, cerca de 2 % ou cerca de 1 % ou menos do peso seco das células.
Por via de exemplo, quando um polipeptídeo de aminoácido natural ou um polipeptídeo de aminoácido não natural é recombinantemente produzido por células hospedeiras, o polipeptídeo de aminoácido natural ou polipeptídeo de aminoácido não natural pode estar presente no meio de cultura em cerca de 5 g/L, cerca de 4 g/L, cerca de 3 g/L, cerca de 2 g/L, cerca de 1 g/L, cerca de 750 mg/L, cerca de 500 mg/L, cerca de 250 mg/L, cerca de 100 mg/L, cerca de 50 mg/L, cerca de 10 mg/L ou cerca de 1 mg/L ou menos do peso seco das células. Por via de exemplo, polipeptídeos de aminoácidos naturais ou polipeptídeos de aminoácidos não naturais “substancialmente purificados” podem apresentar um nível de pureza de cerca de 30 %, cerca de 35 %, cerca de 40 %, cerca de 45 %, cerca de 50 %, cerca de 55 %, cerca de 60 %, cerca de 65 %, cerca de 70 %, cerca de 75 %, cerca de 80 %, cerca de 85 %, cerca de 90 %, cerca de 95 %, cerca de 99 % ou maior, conforme determinado por métodos apropriados, incluindo, mas não limitados à análise SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC e eletroforese capilar.
[068] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz”, conforme usado neste relatório, refere-se à quantidade de uma composição contendo pelo menos um polipeptídeo de aminoácido não natural e/ou pelo menos um polipeptídeo de aminoácido não natural modificado administrado a um paciente que já sofre de uma doença, condição ou transtorno, suficiente para curar ou pelo menos parcialmente parar, ou aliviar, em algum grau, um ou mais sintomas da doença, transtorno ou condição que será tratada. A eficácia de tais composições depende das condições, incluindo, mas não limitadas à gravidade e curso da doença, transtorno ou condição, terapia prévia, estado de saúde do paciente e resposta aos fármacos, e do julgamento do médico. Apenas por via de exemplo, quantidades terapeuticamente eficazes podem ser determinadas por experimentação de rotina, incluindo, mas não limitada a um ensaio clínico de escalonamento de dose.
[069] O termo “tóxico” ou “porção tóxica” ou “grupo tóxico” ou “citotóxico” ou “carga útil citotóxica” ou “carga útil”, conforme usado neste relatório, refere-se a um composto que pode causar danos, perturbações ou morte. Porções tóxicas incluem, mas não são limitadas à auristatina, agente de ligação ao sulco menor de DNA, agente alquilante de sulco menor de DNA, enediina, lexitropsina, duocarmicina, taxano, puromicina, dolastatina, maitansinoide, alcaloide da vinca, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB, auristatina E, paclitaxel, docetaxel, CC-1065, SN-38,
topotecano, morfolino-doxorrubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorrubicina, dolastatina-10, equinomicina, combretastatina, caliqueamicina, maitansina, DM-1, netropsina, podofilotoxina (por exemplo, etoposídeo, teniposídeo, etc.), bacatina e seus derivados, agentes antitubulina, criptofisina, combretastatina, vincristina, vinblastina, vindesina, vinorelbina, VP-16, camptotecina, epotilona A, epotilona B, nocodazol, colchicinas, colcemida, estramustina, cemadotina, discodermolida, maitansina, eleuterobina, mecloretamina, ciclofosfamida, melfalano, carmustina, lomustina, semustina, estreptozocina, clorozotocina, mostarda de uracil, clormetina, ifosfamida, clorambucil, pipobromano, trietilenomelamina, trietilenotiofosforamina, bussulfano, dacarbazina e temozolomida, itarabina, citosina arabinosídeo, fluorouracil, floxuridina, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina, pentostatina, 5 -fluorouracil, metotrexato, 10-propargil-5,8-dideazafolato, ácido 5,8-dideazatetra-hidrofólico, leucovorina, fosfato de fludarabina, pentostatina, gencitabina, Ara-C, desoxicoformicina, mitomicina-C, L-asparaginase, azatioprina, brequinar, antibióticos (por exemplo, antraciclina, gentamicina, cefalotina, vancomicina, telavancina, datomicina, azithromicina, eritromicina, rocitromicina, furazolidona, amoxicilina, ampicilina, carbenicilina, flucloxacilina, meticilina, penicilina, ciprofloxacino, moxifloxacino, ofloxacino, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina, estreptomicina, rifabutina, etambutol, rifaximina, etc.), fármacos antivirais (por exemplo, abacavir, aciclovir, ampligen, cidofovir, delavirdina, didanosina, efavirenz, entecavir, fosfonet, ganciclovir, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, inosina, lopinavir, metisazona, nexavir, nevirapina, oseltamivir, penciclovir, estavudina, trifluridina, truvada, valaciclovir, zanamivir, etc.), cloridreto de daunorrubicina, daunomicina, rubidomicina, cerubidina, idarrubicina, doxorrubicina, epirrubicina e derivados de morfolino, bisciclopeptídeos de fenoxizona (por exemplo, dactinomicina), glicopeptídeos básicos (por exemplo, bleomicina), glicosídeos de antraquinona (por exemplo, plicamicina, mitramicina), antracenodionas (por exemplo, mitoxantrona),
azirinopirrolo indoldionas (por exemplo, mitomicina), imunossupressores macrocíclicos (por exemplo, ciclosporina, FK-506, tacrolimo, prograf, rapamicina etc.), navelbeno, CPT-11, anastrazol, letrazol, capecitabina, reloxafina, ciclofosfamida, ifosamida, droloxafina, alocolchicina, Halicondrina B, colchicina, derivados de colchicina, maitansina, rizoxina, paclitaxel, derivados de paclitaxel, docetaxel, tiocolchicina, tritil cisterina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, cisplatina, carboplatina, hidroxiureia, N-metil-hidrazina, epidofilotoxina, procarbazina, mitoxantrona, leucovorina e tegafur”. Taxanos” incluem paclitaxel, assim como qualquer derivado de taxano ativo ou pro-fármaco.
[070] Os termos “tratar”, “tratando” ou “tratamento”, conforme usado neste relatório, incluem aliviar, prevenir, diminuir ou melhorar sintomas de uma doença ou condição, prevenir sintomas adicionais, melhorar ou prevenir as causas metabólicas subjacentes dos sintomas, inibir a doença ou condição, por exemplo, interromper o desenvolvimento da doença ou condição, aliviar a doença ou condição, causar regressão da doença ou condição, aliviar uma condição causada pela doença ou condição ou parar os sintomas da doença ou condição. Os termos “tratar”, “tratando” ou “tratamento”, incluem, mas não são limitados aos tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. O termo “tratar”, “tratando” ou “tratamento” pode se referir à diminuição, redução ou melhora de um ou mais sintomas associados ao câncer de próstata.
[071] Conforme usado neste relatório, o termo “polímero solúvel em água” refere-se a qualquer polímero que é solúvel em solventes aquosos. Tais polímeros solúveis em água incluem, mas não são limitados ao polietilenoglicol, polietilenoglicol propionaldeído, monoalcóxi C1-C10 ou derivados de arilóxi dos mesmos (descritos na Patente U.S. No 5.252.714, que é incorporada à título de referência neste relatório), monometóxi-polietilenoglicol, polivinilpirrolidona, álcool polivinílico, poliaminoácidos, anidrido maleico de diviniléter, N-(2-Hidroxipropil)- metacrilamida, dextrano, derivados de dextrano, incluindo sulfato de dextrano,
polipropilenoglicol, copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliol polioxietilado, heparina, fragmentos de heparina, polissacarídeos, oligossacarídeos, glicanos, celulose e derivados de celulose, incluindo, mas não limitados à metilcelulose e carboximetilcelulose, albumina sérica, amido e derivados de amido, polipeptídeos, polialquilenoglicol e derivados do mesmo, copolímeros de polialquileno glicóis e derivados dos mesmos, éteres polivinil etílicos e alfa-beta- poli[(2-hidroxietil)-DL-aspartamida, e semelhantes, ou misturas dos mesmos. Apenas por via de exemplo, a ligação de tais polímeros solúveis em água aos polipeptídeos de aminoácidos naturais ou polipeptídeos de aminoácidos não naturais pode resultar em alterações, incluindo, mas não limitadas à solubilidade em água aumentada, meia-vida sérica aumentada ou modulada, meia-vida terapêutica aumentada ou modulada em relação à forma não modificada, biodisponibilidade aumentada, atividade biológica modulada, tempo de circulação prolongado, imunogenicidade modulada, características de associação física moduladas, incluindo, mas não limitadas à agregação e formação de multímeros, ligação ao receptor alterada, ligação alterada a um ou mais pares de ligação e dimerização ou multimerização do receptor alterada. Além disso, tais polímeros solúveis em água podem ou não apresentar sua própria atividade biológica.
[072] Conforme usado neste relatório, o termo “meia-vida sérica modulada” refere-se às alterações positivas ou negativas na meia-vida circulante de uma molécula biologicamente ativa modificada em relação à sua forma não modificada. Por via de exemplo, as moléculas biologicamente ativas modificadas incluem, mas não são limitadas ao aminoácido natural, aminoácido não natural, polipeptídeo de aminoácido natural ou polipeptídeo de aminoácido não natural. Por via de exemplo, a meia-vida sérica é medida coletando amostras de sangue em vários pontos no tempo depois da administração da molécula biologicamente ativa ou molécula biologicamente ativa modificada e determinando a concentração de tal molécula em cada amostra. A correlação da concentração sérica com o tempo permite o cálculo da meia-vida sérica. Por via de exemplo, a meia-vida sérica modulada pode ser um aumento na meia-vida sérica, o que pode permitir um regime de dosagem aperfeiçoado ou evitar efeitos tóxicos. Tais aumentos no soro podem ser pelo menos cerca de duas vezes, pelo menos cerca de três vezes, pelo menos cerca de cinco vezes ou pelo menos cerca de dez vezes. Métodos para avaliar a meia-vida sérica são conhecidos na técnica e podem ser usados para avaliar a meia-vida sérica de anticorpos e conjugados de anticorpo-fármaco da presente invenção.
[073] O termo “meia-vida terapêutica modulada”, conforme usado neste relatório, refere-se à alteração positiva ou negativa na meia-vida da quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula biologicamente ativa modificada, em relação à sua forma não modificada. Por via de exemplo, as moléculas biologicamente ativas modificadas incluem, mas não são limitadas ao aminoácido natural, aminoácido não natural, polipeptídeo de aminoácido natural ou polipeptídeo de aminoácido não natural. Por via de exemplo, a meia-vida terapêutica é medida mensurando as propriedades farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas da molécula em vários pontos no tempo depois da administração. A meia-vida terapêutica aumentada pode permitir um regime de dosagem benéfico particular, uma dose total benéfica particular ou evitar um efeito indesejado. Por via de exemplo, a meia-vida terapêutica aumentada pode resultar da potência aumentada, ligação aumentada ou diminuída da molécula modificada a seu alvo, um aumento ou diminuição em outro parâmetro ou mecanismo de ação da molécula não modificada ou uma quebra aumentada ou diminuída das moléculas por enzimas, tais como, apenas por via de exemplo, proteases. Métodos para avaliar a meia-vida terapêutica são conhecidos na técnica e podem ser usados para avaliar a meia-vida terapêutica de anticorpos e conjugados de anticorpo-fármaco da presente invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[074] As novas características da invenção são apresentadas com particularidade nas reivindicações anexas. Uma melhor compreensão das características e vantagens da presente divulgação da invenção será obtida por referência à seguinte descrição detalhada que apresenta formas de realização ilustrativas, em que os princípios da invenção são utilizados e os desenhos anexos fornecidos.
[075] A Figura 1 representa os estudos farmacocinéticos conduzidos em camundongos com conjugados de anticorpo anti-AMEP-fármaco (CAF) usando uma MMAF não clivável, uma MMAF clivável curta, uma MMAF clivável e uma MMAE clivável curta. F1 representa a detecção do conjugado de anticorpo-fármaco no soro pelo anticorpo. F3 representa a detecção do conjugado de anticorpo-fármaco no soro pelo ligante-fármaco.
[076] A Figura 2 representa os estudos farmacocinéticos conduzidos em ratos com CAF anti-AMEP mostrando MMAF não clivável em várias concentrações.
[077] A Figura 3 representa a comparação farmacocinética do anticorpo anti- AMEP não conjugado (anticorpo nu) em comparação aos CAFs usando MMAF não clivável.
[078] As Figuras 4A a 4B representam uma resposta de dose única em modelo de próstata de xenoenxerto C4-2 sobre o crescimento do tumor (Figura 4A) e alteração do peso corpóreo (Figura 4B) usando CAF anti-AMEP MMAF não clivável em várias dosagens.
[079] As Figuras 5A a 5B representam uma resposta de dose única em modelo de próstata de xenoenxerto C4-2 sobre o crescimento do tumor (Figura 5A) e alteração do peso corpóreo (Figura 5B) usando CAF anti-AMEP MMAF clivável curta em várias dosagens.
[080] As Figuras 6A a 6B representam os estudos farmacocinéticos nos camundongos portadores de tumor e sem tumor (Figura 6A) e macacos cinomolgos
(Figura 6B) após a dose única de CAF anti-AMEP usando MMAF não clivável.
[081] As Figuras 7A a 7B representam uma resposta de dose repetida no modelo de próstata de xenoenxerto C4-2 sobre o crescimento do tumor (Figura 7A) e alteração do peso corpóreo (Figura 7B) usando CAF anti-AMEP MMAF não clivável e CAF anti-AMEP MMAF não clivável mais enzalutamida em várias dosagens.
[082] As Figuras 8A a 8B representam uma resposta de dose repetida no modelo de próstata PDX sobre o crescimento do tumor (Figura 8A) e alteração do peso corpóreo (Figura 8B) usando CAF anti-AMEP MMAF não clivável e CAF anti- AMEP MMAF não clivável mais enzalutamida em várias dosagens.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[083] Antes de descrever a presente invenção em detalhes, deve ser entendido que esta invenção não é limitada a metodologias particulares, composições ou sistemas biológicos que podem, certamente, ser variados. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste relatório é para o propósito de descrever as formas de realização particulares apenas não pretende ser limitante. Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas no singular “um”, “uma” e “o”, “a” incluem os referentes no plural, a menos que o conteúdo claramente indique de outro modo. Assim, por exemplo, referência a “uma célula” inclui uma combinação de duas ou mais células e semelhantes.
[084] Embora as formas de realização preferidas da presente invenção tenham sido mostradas e descritas neste relatório, será óbvio aos técnicos no assunto que tais formas de realização são fornecidas apenas por via de exemplo. Diversas variações, alterações e substituições ocorrerão agora aos técnicos no assunto sem divergir da invenção. Deve ser entendido que várias alternativas às formas de realização da invenção descritas neste relatório podem ser utilizadas na prática da invenção. Pretende-se que as seguintes reivindicações definam o escopo da invenção e que os métodos e estruturas no escopo destas reivindicações e seus equivalentes sejam, desse modo, abrangidos.
[085] A menos que de outro modo definido neste relatório ou abaixo no restante do relatório descritivo, todos os termos técnicos e científicos usados neste relatório apresentam o mesmo significado comumente entendido pelos técnicos no assunto ao qual a invenção pertence.
[086] Produtos terapêuticos com base em anticorpos surgiram como componentes importantes de terapias para um número crescente de malignidades humanas em tais campos como oncologia, doenças inflamatórias e infecciosas. Na maioria dos casos, a base da função terapêutica é o alto grau de especificidade e afinidade que o fármaco com base em anticorpo tem para seu antígeno alvo. Armar anticorpos monoclonais com fármacos, toxinas ou radionuclídeos ainda é outra estratégia pela qual os anticorpos monoclonais podem induzir um efeito terapêutico. Ao combinar a especificidade de alvejamento considerável de anticorpo com o poder de matar o tumor de moléculas efetoras tóxicas, imunoconjugados permitem a discriminação sensível entre tecido alvo e normal, desse modo, resultando em menos efeitos colaterais do que a maioria dos fármacos quimioterápicos convencionais. As toxinas utilizadas podem se conjugar, especificamente, de forma estável e irreversível, aos sítios únicos no anticorpo. Este processo único de conjugação permite o controle preciso da localização da toxina no anticorpo e, também, o número de toxinas conjugadas a cada anticorpo. Estas características são críticas para o controle das características biofísicas e toxicidades associadas aos CAFs. (Veja, por exemplo, Jackson et al., 2014, Tian et al., 2014).
[087] Conjugados de anticorpo anti-AMEP-fármaco fornecidos na presente divulgação incluem anticorpos monoclonais humanizados ou quiméricos e variantes que se ligam ao domínio extracelular do antígeno de membrana específico da próstata. O antígeno de membrana específico da próstata é uma proteína de membrana tipo II que é altamente expressada, por exemplo, em neoplasia intraepitelial prostática (NIP), cânceres de próstata primários e cânceres de próstata metastáticos. O anticorpo anti-AMEP divulgado neste relatório pode ser qualquer anticorpo anti-AMEP conhecido com pelo menos um aminoácido não naturalmente codificado.
[088] A presente invenção fornece anticorpos anti-AMEP e variantes dos mesmos que apresentam um aminoácido não naturalmente codificado que facilita a conjugação do anticorpo a um fármaco (por exemplo, um fármaco, molécula da toxina). Em uma forma de realização, o CAF compreende um anticorpo anti-AMEP conjugado a um fármaco em que a conjugação ocorre por intermédio de um aminoácido não naturalmente codificado no anticorpo. Em uma forma de realização, o CAF compreende um anticorpo anti-AMEP conjugado a um fármaco em que a conjugação ocorre por intermédio de um aminoácido não naturalmente codificado na cadeia pesada do anticorpo. Em uma forma de realização, o CAF compreende um anticorpo anti-AMEP conjugado a um fármaco em que a conjugação ocorre por intermédio de um aminoácido não naturalmente codificado na cadeia leve do anticorpo. Em uma forma de realização, o CAF compreende um anticorpo de comprimento total conjugado a um fármaco em que a conjugação ocorre por intermédio de um aminoácido não naturalmente codificado no anticorpo. Em uma forma de realização, o CAF compreende um anticorpo de comprimento total conjugado a um fármaco em que a conjugação ocorre por intermédio de um aminoácido não naturalmente codificado na cadeia pesada do anticorpo. Em uma forma de realização, o CAF compreende um anticorpo de comprimento total conjugado a um fármaco em que a conjugação ocorre por intermédio de um aminoácido não naturalmente codificado na cadeia leve do anticorpo.
[089] Em algumas formas de realização, o fármaco do CAF é um fármaco ou agente citotóxico. Em alguns aspectos da invenção, o fármaco citotóxico é selecionado a partir do grupo que consiste de uma auristatina, um agente de ligação ao sulco menor de DNA, um agente alquilante de sulco menor de DNA, uma enediina, uma lexitropsina, uma duocarmicina, um taxano, um puromicina, uma dolastatina, um maitansinoide e um alcaloide da vinca. Em alguns aspectos da invenção, o fármaco citotóxico é AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB, auristatina E, paclitaxel, docetaxel, CC-1065, SN-38, topotecano, morfolino-doxorrubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorrubicina, dolastatina-10, equinomicina, combretastatina, caliqueamicina, maitansina, DM-1 ou netropsina, mas não se limitando aos mesmos.
[090] Em alguns aspectos da invenção, o fármaco citotóxico é um agente antitubulina. Em algumas formas de realização, o agente antitubulina é uma auristatina, um alcaloide da vinca, uma podofilotoxina, um taxano, um derivado de bacatina, um criptofisina, um maitansinoide, uma combretastatina ou uma dolastatina. Em outros aspectos da invenção, o agente antitubulina é AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB, auristatina E, vincristina, vinblastina, vindesina, vinorelbina, VP- 16, camptotecina, paclitaxel, docetaxel, epotilona A, epotilona B, nocodazol, colchicinas, colcemida, estramustina, cemadotina, discodenolídeo, maitansina, DM-1 ou eleuterobina, mas não se limitando aos mesmos.
[091] Em outros aspectos da invenção, o fármaco citotóxico do CAF é ganciclovir, etanercepte, ciclosporina, tacrolimo, rapamicina, ciclofosfamida, azatioprina, micofenolato de mofetila, metotrexato, cortisol, aldosterona, dexametasona, um inibidor de ciclo-oxigenase, um inibidor de 5-lipoxigenase ou um antagonista do receptor de leucotrieno.
[092] Em algumas formas de realização da invenção, o anticorpo do CAF compreende um anticorpo de comprimento total ou fragmento do mesmo que: (a) se liga a AMEP, e (b) é conjugado a um agente citotóxico ou a um agente imunossupressor, em que o conjugado de anticorpo-fármaco exerce: (a) um efeito citotóxico ou citostático sobre uma linhagem celular de câncer que expressa AMEP,
ou (b) um efeito citotóxico, citostático ou imunossupressor em uma célula imune que expressa AMEP, em que a conjugação ocorre em um aminoácido não naturalmente codificado no anticorpo.
[093] Em algumas formas de realização, o anticorpo, variante ou composição da presente divulgação pode ser um anticorpo, variante ou composição que se liga a um receptor de AMEP. Em outras formas de realização da presente invenção, o anticorpo, variante ou composição pode ser um anticorpo, variante ou composição que se liga à superfície extracelular do receptor de AMEP. Em outra forma de realização da presente invenção, o anticorpo, variante ou composição divulgado pode ser um anticorpo, variante ou composição que se liga a um dímero de AMEP. Em algumas formas de realização, o anticorpo, variante ou composição da presente divulgação pode ser um anticorpo, variante ou composição que apresenta RDCs a partir de J591 enxertadas sobre a região estrutural da região variável. Em outras formas de realização, o anticorpo, variante ou composição da presente divulgação da invenção pode ser um anticorpo, variante ou composição que apresenta um aminoácido não naturalmente codificado. Em algumas formas de realização, o anticorpo, variante ou composição pode ser um anticorpo, variante ou composição que é descrito por mais do que uma das formas de realização em outra parte neste relatório da presente divulgação da invenção. Em algumas formas de realização, o anticorpo, variante de anticorpo ou composição de anticorpos divulgado neste relatório pode ser completamente humanizado. Em outras formas de realização, o anticorpo, variante de anticorpo ou composição de anticorpos divulgado neste relatório pode ser quimérico. Em algumas formas de realização da presente invenção, o anticorpo pode ser um anticorpo que é anticorpo de comprimento total (regiões variável + Fc), Fab, biespecífico, dímeros de Fab, Fab-biespecífico, Fab- triespecífico, ligantes de células T biespecíficos, anticorpo de realvejamento de dupla afinidade, anticorpo biespecífico IgGl/IgG3, diacorpo, diacorpo biespecífico,
scFv-Fc, minicorpo.
[094] Métodos, composições e técnicas para criar e usar derivados ou análogos do ligante de dolastatina compreendendo pelo menos um carbonila, dicarbonila, oxima, hidroxilamina, aldeído, aldeído protegido, cetona, cetona protegida, tioéster, éster, dicarbonila, hidrazina, azida, amidina, imina, diamina, ceto- amina, ceto-alcino, alcino, cicloalcino ou eno-diona são bem conhecidos a um técnico no assunto (veja, por exemplo, o WO 2013/185117, integralmente incorporado neste relatório à título de referência). Métodos, composições e técnicas para criar e usar derivados ou análogos do ligante de dolastatina compreendendo pelo menos um aminoácido não natural ou aminoácido não natural modificado com uma oxima, amina aromática, heterociclo (por exemplo, indol, quinoxalina, fenazina, pirazol, triazol, etc.) também são bem conhecidos ao técnico no assunto e descritos, por exemplo, no WO 2013/185117, integralmente incorporado neste relatório à título de referência. Tais derivados de ligante de dolastatina compreendendo aminoácidos não naturais podem conter funcionalidade adicional, incluindo mas não limitados a um polímero; um polímero solúvel em água; um derivado de polietilenoglicol; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; e qualquer combinação dos mesmos. Observe que as várias funcionalidades anteriormente mencionadas não significam que os membros de uma funcionalidade não possam ser classificados como membros de outra funcionalidade. De fato, haverá sobreposição, dependendo das circunstâncias particulares. Apenas por via de exemplo, um polímero solúvel em água sobrepõe-se no escopo com um derivado de polietilenoglicol, entretanto, a sobreposição não é completa e, assim, as duas funcionalidades são citadas acima.
[095] É fornecido neste relatório, em algumas formas de realização, um derivado de ligante de grupo tóxico compreendendo um carbonila, dicarbonila, oxima, hidroxilamina, aldeído, aldeído protegido, cetona, cetona protegida, tioéster,
éster, dicarbonila, hidrazina, azida, amidina, imina, diamina, ceto-amina, ceto-alcino, alcino, cicloalcino ou eno-diona. Em algumas formas de realização, o derivado de grupo tóxico compreende qualquer um entre os ligantes divulgados neste relatório. Métodos, composições e técnicas para criar e usar derivados ou análogos de grupo tóxico compreendendo pelo menos um aminoácido não natural ou aminoácido não natural modificado com uma oxima, amina aromática, heterociclo (por exemplo, indol, quinoxalina, fenazina, pirazol, triazol, etc.) são descritos no WO 2013/185117 (integralmente incorporado neste relatório à título de referência). Em algumas formas de realização, tais derivados tóxicos compreendendo aminoácidos não naturais podem conter funcionalidade adicional, incluindo, mas não limitados a um polímero; um polímero solúvel em água; um derivado de polietilenoglicol; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; e qualquer combinação dos mesmos. Em formas de realização específicas, o grupo tóxico é um inibidor de tubulina. Em certas formas de realização específicas, o grupo tóxico é dolastatina ou auristatina. Em outras formas de realização específicas, o grupo tóxico é dolastatina ou derivado de auristatina. Observe que as várias funcionalidades anteriormente mencionadas não significam que os membros de uma funcionalidade não podem ser classificados como membros de outra funcionalidade. De fato, haverá sobreposição, dependendo das circunstâncias particulares. Apenas por via de exemplo, um polímero solúvel em água sobrepõe-se no escopo com um derivado de polietilenoglicol, entretanto, a sobreposição não é completa e, assim, as duas funcionalidades são citadas acima.
[096] Certas formas de realização da presente invenção descrevem as preparações de certas porções tóxicas com ligantes que reduzem a toxicidade da porção in vivo, enquanto a porção tóxica conserva atividade farmacológica. Em algumas formas de realização, a toxicidade do grupo tóxico ligado, quando administrado a um animal ou ser humano, é reduzida ou eliminada em comparação ao grupo tóxico livre ou derivados de grupo tóxico compreendendo ligações lábeis, conservando atividade farmacológica. Em algumas formas de realização, doses aumentadas do grupo tóxico ligado (por exemplo, derivados de ligante de dolastatina, derivados de dolastatina ligados ao aminoácido não natural) podem ser administradas aos animais ou seres humanos com maior segurança. Em certas formas de realização, os polipeptídeos de aminoácidos não naturais ligados a uma porção tóxica (por exemplo, derivado de dolastatina) fornecem estabilidade in vitro e in vivo. Em algumas formas de realização, os polipeptídeos de aminoácidos não naturais ligados a uma porção tóxica (por exemplo, inibidor de tubulina, derivado de dolastatina-10) são eficazes e menos tóxicos em comparação à porção tóxica livre (por exemplo, inibidor de tubulina, dolastatina-10).
METODOLOGIA E TÉCNICAS
[097] A presente divulgação abrange metodologias e tecnologias bem conhecidas na técnica. Estas incluem métodos convencionais de espectroscopia de massas, RMN, HPLC, proteína química, bioquímica, técnicas de DNA recombinante e farmacologia, dentro da habilidade da técnica. Os compostos da presente divulgação da invenção podem ser sintetizados usando vários processos ou esquemas utilizados na técnica. Veja, por exemplo, Dubowchik et al., Bioconjugate Chem. 13; 855 a 869, 2002; Doronina et al., Nature Biotechnology 21(7): 778 a 784, 2003; WO 2012/166560; WO 2013/185117, incorporados neste relatório à título de referência. Muitas metodologias e técnicas para síntese de compostos farmacêuticos, diagnósticos ou terapêuticos são bem conhecidas aos técnicos no assunto.
[098] A presente invenção, a menos que de outro modo indicado, também abrange técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), biologia celular, bioquímica e imunologia, todas dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura, tais como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (Sambrook et al. Eds., 2001); Oligonucleotide Synthesis: Methods And Applications (Methods in Molecular Biology), Herdewijn, P., Ed., Humana Press, Totowa, NJ; Oligonucleotide Synthesis (Gait, M. J., Ed., 1984); Methods In Molecular Biology, Humana Press, Totowa, NJ; Cell Biology: A Laboratory Notebook, Academic Press, New York, NY (Cellis, J. E., Ed., 1998); Animal Cell Culture (Freshney, R. I., Ed., 1987); Introduction To Cell And Tissue Culture Plenum Press, New York, NY, (Mather, J. P. and Roberts, P. E., Eds., 1998); Cell And Tissue Culture: Laboratory Procedures John Wiley and Sons, Hoboken, NJ, (Doyle, A. et al., Eds., 1993-8); Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.) New York, NY; Weir’s Handbook Of Experimental Immunology Wiley- Blackwell Publishers, New York, NY, (Herzenberg, L. A. et al. Eds., 1997); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, (Miller, J. M. et al. Eds., 1987); Current Protocols In Molecular Biology, Greene Pub. Associates, New York, NY, (Ausubel, F. M. et al., Eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, Birlçhauser, Boston, MA, (Mullis, K. et al., Eds., 1994); Current Protocols In Immunology, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ, (Coligan, J. E. et al., eds., 1991); Short Protocols In Molecular Biology, Hoboken, NJ, (John Wiley and Sons, 1999); Immunobiology 7 Garland Science, London, UK, (Janeway, C. A. et al., 2007); Antibodies. Stride Publications, Devoran, UK, (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach Oxford University Press, USA, New York, NY, (D. Catty., ed., 1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach Oxford University Press, USA, New York NY, (Shepherd, P. et al. Eds., 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (Harlow, E. et al. Eds., 1998); The Antibodies Harwood Academic Publishers, London, UK, (Zanetti, M. et al. Eds. 1995).
DERIVADOS DE LIGANTE DE DOLASTATINA
[099] Em formas de realização da presente divulgação da invenção, derivados ou análogos do ligante de dolastatina compreendendo pelo menos um aminoácido não natural ou aminoácido não natural modificado com um grupo carbonila, dicarbonila, oxima ou hidroxilamina podem ser utilizados.
Métodos para selecionar e projetar um derivado de ligante de dolastatina que será modificado usando os métodos, composições e técnicas são bem conhecidos no ramo, veja, por exemplo, o WO 2013/185117, integralmente incorporado neste relatório à título de referência.
O derivado de ligante de dolastatina pode ser projetado de novo, incluindo, apenas por via de exemplo, como parte de processo de triagem de alto rendimento (caso este em que diversos polipeptídeos podem ser projetados, sintetizados, caracterizados e/ou testados) ou com base nos interesses do pesquisador.
O novo derivado de ligante de dolastatina também pode ser projetado com base na estrutura de um polipeptídeo conhecido ou parcialmente caracterizado.
Os princípios para selecionar quais aminoácidos substituir e/ou modificar e a escolha de qual modificação utilizar são descritos no WO 2013/185117, por exemplo.
O derivado de ligante de dolastatina pode ser projetado para satisfazer as necessidades do experimentador ou usuário final.
Tais necessidades podem incluir, mas não são limitadas à manipulação da eficácia terapêutica do polipeptídeo, melhora do perfil de segurança do polipeptídeo, ajuste da farmacocinética, farmacologias e/ou farmacodinâmica do polipeptídeo, tais como, apenas por via de exemplo, aumento da solubilidade em água, biodisponibilidade, aumento da meia- vida sérica, aumento da meia-vida terapêutica, modulação da imunogenicidade, modulação da atividade biológica ou aumento do tempo de circulação.
Além disso, tais modificações incluem, apenas por via de exemplo, o fornecimento de funcionalidade adicional ao polipeptídeo, incorporação de um anticorpo e qualquer combinação das modificações anteriormente mencionadas.
Tais derivados de ligante de dolastatina podem ser modificados para conter um grupo oxima, carbonila,
dicarbonila ou hidroxilamina. O derivado de ligante de dolastatina pode conter pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou dez ou mais grupos carbonila ou dicarbonila, grupos oxima, grupos hidroxilamina ou formas protegidas dos mesmos. O derivado de ligante de dolastatina pode ser igual ou diferente, por exemplo, pode haver 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais sítios diferentes no derivado que compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais grupos reativos diferentes.
[0100] Por exemplo, derivados de dolastatina com ligantes contendo um grupo hidroxilamina (também chamado de aminóxi) permitem a reação com uma variedade de grupos eletrofílicos para formar conjugados, incluindo mas não limitados a, com PEG ou outros polímeros solúveis em água. Como hidrazinas, hidrazidas e semicarbazidas, a nucleofilicidade aumentada do grupo aminóxi permite que ele reaja de forma eficiente e seletiva com uma variedade de moléculas que contêm grupos carbonila ou dicarbonila, incluindo mas não limitados a, cetonas, aldeídos ou outro grupos funcionais com similares reatividades químicas. (Ver, por exemplo, Shao, J. e Tam, J., J. Am. Chem. Soc 117:3893 a 3899, 1995; H. Hang e C. Bertozzi, Acc. Chem. Res. 34(9): 727 a 736, 2001). Como resultado da reação com um grupo hidrazina é a hidrazona correspondente, uma oxima, entretanto, resulta geralmente da reação de um grupo aminóxi com um grupo contendo carbonila ou dicarbonila tal como, através de exemplo, cetonas, aldeídos ou outros grupos funcionais com similares reatividades químicas. Em algumas formas de realização, derivados de dolastatina com ligantes compreendendo uma azida, alcino ou cicloalcino permitem a ligação de moléculas através de reações de cicloadição (por exemplo, cicloadições 1,3-dipolares, cicloadição de azida-alcino Huisgen, etc., descritas na Patente U.S. No 7.807.619 integralmente incorporada à título de referência neste relatório na extensão em relação à reação).
[0101] Assim, em certas formas de realização descritas neste relatório são derivadas de dolastatina com ligantes compreendendo uma hidroxilamina, aldeído, aldeído protegido, cetona, cetona protegida, tioéster, éster, dicarbonila, hidrazina, amidina, imina, diamina, ceto-amina, ceto-alcino, e grupo hidroxilamina eno-diona, um grupo similar à hidroxilamina (que tem reatividade similar a um grupo hidroxilamina e é estruturalmente similar a um grupo hidroxilamina), um grupo hidroxilamina mascarado (que pode ser facilmente convertido em um grupo hidroxilamina), ou um grupo hidroxilamina protegido (que tem reatividade similar a um grupo hidroxilamina após a desproteção). Em algumas formas de realização, os derivados de dolastatina com ligantes compreendem azidas, alcinos ou cicloalcinos. Exemplos de tais derivados de ligante de dolastatina são incluídos em outra parte neste relatório e no WO 2013/185117 e WO 2005/074650 (cada um integralmente incorporado neste relatório à título de referência).
AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS
[0102] A seleção do local do aminoácido codificado não naturalmente foi fundamentada na exposição da superfície/acessibilidade do local dentro do anticorpo e locais de aminoácidos hidrofóbicos ou neutros foram selecionados para manter a carga no anticorpo. Os métodos para a introdução de aminoácidos não naturais inseridos em locais em uma proteína são descritos, por exemplo, em WO 2010/011735 e em WO 2005/074650. A presente invenção emprega tais metodologias e técnicas. Os aminoácidos não naturais usados nos métodos e composições descritos neste relatório, têm pelo menos uma das seguintes quatro propriedades: (1) pelo menos um grupo funcional na cadeia lateral do aminoácido não natural tem pelo menos uma característica e/ou atividade e/ou reatividade ortogonal à reatividade química dos 20 aminoácidos geneticamente codificados comuns (isto é, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina,
ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina), ou pelo menos ortogonal à reatividade química dos aminoácidos de ocorrência natural presentes no polipeptídeo que inclui o aminoácido não natural; (2) os aminoácidos não naturais introduzidos são substancialmente quimicamente inertes em relação aos 20 aminoácidos geneticamente codificados comuns; (3) o aminoácido não natural pode ser estavelmente incorporado em um polipeptídeo, preferivelmente com a estabilidade compatível com os aminoácidos de ocorrência natural ou sob condições fisiológicas típicas e ainda preferivelmente, tal incorporação pode ocorrer através de um sistema in vivo; e (4) o aminoácido não natural inclui um grupo funcional oxima ou um grupo funcional que pode ser transformado em um grupo oxima reagindo com um reagente, preferivelmente sob condições que não destroem as propriedades biológicas do polipeptídeo que incluem o aminoácido não natural (a menos que, certamente, tal destruição das propriedades biológicas seja o propósito da modificação/transformação), ou onde a transformação pode ocorrer sob condições aquosas em um pH entre cerca de 4 e cerca de 8, ou onde o sítio reativo no aminoácido não natural é um sítio eletrofílico.
Qualquer número de aminoácidos não naturais pode ser introduzido no polipeptídeo.
Os aminoácidos não naturais também podem incluir oximas mascaradas ou protegidas ou grupos mascarados ou protegidos que podem ser transformados em um grupo oxima depois da desproteção do grupo protegido ou desmascaramento do grupo mascarado.
Os aminoácidos não naturais também podem incluir grupos carbonila ou dicarbonila mascarados ou protegidos, que podem ser transformados em um grupo carbonila ou dicarbonila depois da desproteção do grupo protegido ou desmascaramento do grupo mascarado e, desse modo, estão disponíveis para reagir com hidroxilaminas ou oximas para formar grupos oxima.
Os aminoácidos não naturais com base em oxima podem ser sintetizados por métodos bem conhecidas na técnica, (ver, por exemplo, WO 2013/185117 e WO 2005/074650), incluindo: (a) reação de um aminoácido não natural contendo hidroxilamina com um reagente contendo carbonila ou dicarbonila; (b) reação de um aminoácido não natural contendo carbonila ou dicarbonila com um reagente contendo hidroxilamina; ou (c) reação de um aminoácido não natural contendo oxima com certos reagentes de carbonila ou dicarbonila.
[0103] Os aminoácidos não naturais que podem ser usados nos métodos e composições descritos neste relatório incluem, mas não são limitados a, aminoácidos compreendendo aminoácidos com novos grupos funcionais, aminoácidos que interagem covalentemente ou não covalentemente com outras moléculas, aminoácidos glicosilados, tais como uma serina substituída com açúcar, outros aminoácidos modificados com carboidratos, aminoácidos contendo ceto, aminoácidos contendo aldeído, aminoácidos compreendendo polietilenoglicol ou outro poliéteres, aminoácidos substituídos com átomos pesados, aminoácidos quimicamente cliváveis e/ou fotocliváveis, aminoácidos com cadeias laterais alongadas em comparação com aminoácidos naturais, incluindo mas não limitados a, poliéteres ou hidrocarbonetos de cadeia longa, incluindo mas não limitados a, maior do que cerca de 5 ou maior do que cerca de 10 carbonos, aminoácidos contendo açúcar ligados a carbono, aminoácidos redox-ativos, aminoácidos contendo amino tioácidos, e aminoácidos compreendendo uma ou mais porções tóxicas.
[0104] Em algumas formas de realização, aminoácidos não naturais compreendem uma porção de sacarídeo. Exemplos de tais aminoácidos incluem N- acetil-L-glucosaminil-L-serina, N-acetil-L-galactosaminil-L-serina, N-acetil-L- glucosaminil-L-treonina, N-acetil-L-glucosaminil-L-asparagina e O-manosaminil-L- serina. Exemplos de tais aminoácidos também incluem exemplos onde a ligação N- ou O- de ocorrência natural entre o aminoácido e o sacarídeo é substituída por uma ligação covalente não comumente encontrada na natureza - incluindo mas não limitada a, um alceno, uma oxima, um tioéter, uma amida e semelhantes. Exemplos de tais aminoácidos também incluem sacarídeos que não são comumente encontrados em proteínas de ocorrência natural, tais como 2-desóxi-glicose, 2- desoxigalactose e semelhantes.
[0105] As porções químicas incorporadas em polipeptídeos através da incorporação de aminoácidos não naturais em tais polipeptídeos oferecem uma variedade de vantagens e manipulações de polipeptídeos. Por exemplo, a reatividade única de um grupo funcional carbonila ou dicarbonila (incluindo um grupo funcional ceto ou aldeído) permite a modificação seletiva de proteínas com qualquer um de vários reagentes contendo hidrazina ou hidroxilamina in vivo e in vitro. Um aminoácido não natural de átomo pesado, por exemplo, pode ser útil para fasear dados de estrutura raios-X. A introdução específica do sítio de átomos pesados usando aminoácidos não naturais também fornece seletividade e flexibilidade na escolha de posições para átomos pesados. Aminoácidos não naturais fotorreativos (incluindo mas não limitados a, aminoácidos com benzofenona e arilazidas (incluindo mas não limitados a, cadeias laterais de fenilazida), por exemplo, permitem fotorreticulação eficiente in vivo e in vitro de polipeptídeos. Exemplos de aminoácidos não naturais fotorreativos incluem, mas não são limitados a, p-azido- fenilalanina e p-benzoil-fenilalanina. O polipeptídeo com os aminoácidos não naturais fotorreativos pode então ser reticulado à vontade por excitação do grupo fotorreativo fornecendo controle temporal. Em um exemplo não limitante, o grupo metila de um amino não natural pode ser substituído com um isotopicamente marcado, incluindo mas não limitado a, um grupo metila, como uma sonda de estrutura e dinâmica local, incluindo mas não limitado ao, uso de ressonância magnética nuclear e espectroscopia vibracional.
DERIVADOS DE DOLASTATINA LIGADOS A AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS
[0106] Em outras formas de realização da presente invenção descritas neste relatório são métodos, estratégias e técnicas para incorporar pelo menos um desses derivados de ligante de dolastatina em um aminoácido não natural. A presente invenção descrita neste relatório inclui métodos para produzir, purificar, caracterizar e usar derivados de ligante de dolastatina contendo pelo menos um desses aminoácidos não naturais. Também incluídas com este aspecto estão composições de métodos para produzir, purificar, caracterizar e usar oligonucleotídeos (incluindo DNA e RNA) que podem ser usados para produzir, pelo menos em parte, um derivado de ligante de dolastatina contendo pelo menos um aminoácido não natural. Também incluídas com este aspecto estão composições de métodos para produzir, purificar, caracterizar e usar células que podem expressar tais oligonucleotídeos que podem ser usados para produzir, pelo menos em parte, um derivado de ligante de dolastatina contendo pelo menos um aminoácido não natural.
[0107] Assim, os derivados de ligante de dolastatina compreendendo pelo menos um aminoácido não natural ou o aminoácido não natural modificado com um grupo carbonila, dicarbonila, alcino, cicloalcino, azida, oxima ou hidroxilamina são fornecidos e descritos neste relatório. Em certas formas de realização, derivados de ligante de dolastatina com pelo menos um aminoácido não natural ou aminoácido não natural modificado com um carbonila, dicarbonila, alcino, cicloalcino, azida, oxima ou grupo hidroxilamina incluem pelo menos uma modificação pós-tradução em alguma posição no polipeptídeo. Em algumas formas de realização a modificação cotradução ou pós-tradução ocorre por intermédio da maquinaria celular (por exemplo, glicosilação, acetilação, acilação, modificação de lipídios, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação, modificação de ligação de glicolipídeo e semelhantes), em muitos casos, tais modificação cotraducionais ou pós-traducionais com base em maquinaria celular ocorrem nos sítios de aminoácidos de ocorrência natural no polipeptídeo, entretanto, em certas formas de realização, as modificações cotraducionais ou pós-traducionais com base em maquinaria celular ocorrem no sítio de aminoácido não natural no polipeptídeo.
[0108] Em outras formas de realização, a modificação pós-tradução não utiliza a maquinaria celular, mas a funcionalidade é fornecida pela ligação de uma molécula (um polímero; um polímero solúvel em água; um derivado de polietilenoglicol; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; e qualquer combinação dos mesmos) compreendendo um segundo grupo reativo para pelo menos um aminoácido não natural compreendendo um primeiro grupo reativo (incluindo mas não limitado ao, aminoácido não natural contendo um cetona, aldeído, acetal, hemiacetal, alcino, cicloalcino, azida, oxima, ou grupo hidroxilamina funcional) utilizando a metodologia química descrita neste relatório, ou outros adequados para os grupos reativos particulares. Em certas formas de realização, a modificação cotradução ou pós- tradução é feita in vivo em uma célula eucariótica ou em uma célula não eucariótica. Em certas formas de realização, a modificação pós-tradução é feita in vitro sem utilizar a maquinaria celular. Também incluídos com este aspecto estão os métodos para produzir, purificar, caracterizar e usar tais derivados de ligante de dolastatina contendo pelo menos um de tais aminoácidos não naturais modificados cotraducionalmente ou pós-traducionalmente.
[0109] Também incluídos dentro do escopo dos métodos, composições, estratégias e técnicas descritos neste relatório estão os reagentes capazes de reagir com uma derivado de ligante de dolastatina (contendo um grupo carbonila ou dicarbonila, grupo oxima, alcino, cicloalcino, azida, grupo hidroxilamina, ou formas protegidas ou mascaradas dos mesmos) que faz parte de um polipeptídeo de modo a produzir qualquer uma das modificação pós-tradução mencionadas anteriormente. Em certas formas de realização, o derivado de ligante de dolastatina modificado pós-
tradução resultante conterá pelo menos um grupo oxima; o derivado de ligante de dolastatina contendo oxima modificada resultante pode sofrer reações de modificação subsequentes. Também incluídos com este aspecto estão os métodos para produzir, purificar, caracterizar e usar tais reagentes que são capazes de quaisquer modificações pós-tradução de tal derivado de ligante de dolastatina.
[0110] Em certas formas de realização, o polipeptídeo ou derivado de dolastatina ligado ao aminoácido não natural inclui pelo menos uma modificação cotradução ou pós-tradução que é feita in vivo por uma célula hospedeira, onde a modificação pós-tradução não é normalmente feita por outro tipo de célula hospedeira. Em certas formas de realização, o polipeptídeo inclui pelo menos uma modificação cotradução ou pós-tradução que é feita in vivo por uma célula eucariótica, onde a modificação cotradução ou pós-tradução não é normalmente feita por uma célula não eucariótica. Exemplos de tais modificações cotradução ou pós-tradução incluem, mas não são limitadas a, glicosilação, acetilação, acilação, modificação de lipídeos, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação, modificação de ligação de glicolipídeo e semelhantes. Em uma forma de realização, a modificação cotradução ou pós-tradução compreende a ligação de um oligossacarídeo a uma asparagina por uma ligação GlcNAc-asparagina (incluindo mas não limitada a, onde o oligossacarídeo compreende (GlcNAc-Man)2-Man- GlcNAc-GlcNAc e semelhantes). Em outra forma de realização, a modificação cotradução ou pós-tradução compreende a ligação de um oligossacarídeo (incluindo mas não limitado a, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, etc.) a uma serina ou treonina por uma GalNAc-serina, uma GalNAc-treonina, uma GlcNAc-serina ou uma ligação de GlcNAc-treonina. Em certas formas de realização, uma proteína ou polipeptídeo pode compreender uma secreção ou sequência de localização, uma etiqueta de epítopo, uma etiqueta de FLAG, uma etiqueta de poli-histidina, uma fusão GST e/ou semelhantes. Também incluídos com este aspecto estão métodos para produzir,
purificar, caracterizar e usar tais polipeptídeos contendo pelo menos uma tal modificação cotradução ou pós-tradução. Em outras formas de realização, o polipeptídeo glicosilado de aminoácido não natural é produzido em uma forma não glicosilada. Tal forma não glicosilada de um aminoácido não natural glicosilado pode ser produzida por métodos que incluem grupos químicos ou remoção enzimática de grupos oligossacarídeos de um polipeptídeo de aminoácido não natural glicosilado isolado ou substancialmente purificado ou não purificado; produção do aminoácido não natural em um hospedeiro que não glicosila tal polipeptídeo de aminoácido não natural (tal hospedeiro incluindo, procariotos ou eucariotos manipulados ou mutados para não glicosilar tal polipeptídeo), a introdução de um inibidor de glicosilação no meio de cultura no qual tal polipeptídeo de aminoácido não natural está sendo produzido por um eucarioto que normalmente glicosilaria tal polipeptídeo, ou uma combinação de qualquer um desses métodos. Também são descritos neste relatório tais formas não glicosiladas de polipeptídeos de aminoácidos não naturais normalmente glicosilados (normalmente glicosilados significa um polipeptídeo que seria glicosilado quando produzido sob condições em que polipeptídeos de ocorrência natural são glicosilados). Certamente, tais formas não glicosiladas dos polipeptídeos de aminoácidos não naturais normalmente glicosilados (ou, de fato, qualquer polipeptídeo descrito neste relatório) podem estar em uma forma não purificada, uma forma substancialmente purificada ou em uma forma isolada.
DERIVADOS DE DOLASTATINA LIGADOS CONTENDO OXIMA
[0111] Os derivados de dolastatina ligados aos aminoácidos não naturais contendo uma grupo oxima permitem a reação com uma variedade de reagentes que contêm certos grupos carbonila ou dicarbonila reativos (incluindo mas não limitados a, cetonas, aldeídos ou outros grupos com similares reatividades) para formar novos aminoácidos não naturais compreendendo um novo grupo oxima. Tal reação de troca de oxima permite a funcionalização adicional de derivados ligados a dolastatina. Além disso, o derivado original ligado a dolastatina contendo um grupo oxima pode ser útil por si só, desde que a ligação oxima seja estável sob as condições necessárias para incorporar o aminoácido em um polipeptídeo (por exemplo, os métodos in vivo, in vitro e de síntese química descritos neste relatório e no WO 2013/185117 e no WO 2005/074650, cada um incorporado neste relatório à título de referência).
[0112] Assim, em certas formas de realização descritas neste relatório estão derivados ligados a dolastatina de aminoácidos não naturais com cadeias laterais compreendendo uma grupo oxima, um grupo similar à oxima (que tem reatividade similar a um grupo oxima e é estruturalmente similar a um grupo oxima), um grupo oxima mascarado (que pode ser facilmente convertido em um grupo oxima), ou um grupo oxima protegido (que tem reatividade similar a um grupo oxima após a desproteção).
[0113] Os métodos e composições para incorporação de um ou mais aminoácidos não naturais em um derivado de ligante de dolastatina são bem conhecidos na técnica, (veja, por exemplo, o WO 2013/185117 e o WO 2005/074650, cada um integralmente incorporado neste relatório à título de referência). Um ou mais aminoácidos não naturais podem ser incorporados em um ou mais posições particulares que não interrompem a atividade do derivado de ligante de dolastatina. Isto pode ser obtido fazendo substituições “conservativas”, incluindo mas não limitadas a, substituição de aminoácidos hidrofóbicos por aminoácidos hidrofóbico não naturais ou naturais, aminoácidos volumosos não naturais ou aminoácidos volumosos naturais, aminoácidos hidrofílicos não naturais ou aminoácidos hidrofílicos naturais) e/ou inserir o aminoácido não natural em uma localização que não é necessária para a atividade.
[0114] Uma variedade de abordagens bioquímicas e estruturais podem ser utilizadas para selecionar os sítios desejados para substituição com um aminoácido não natural dentro do derivado de ligante de dolastatina. Em algumas formas de realização, o aminoácido não natural é ligado ao terminal C do derivado de dolastatina. Em outras formas de realização, o aminoácido não natural é ligado ao terminal N do derivado de dolastatina. Qualquer posição do derivado de ligante de dolastatina é adequada para a seleção para incorporar um aminoácido não natural, e a seleção pode ser com base em um projeto racional ou por seleção aleatória para qualquer ou nenhum propósito particular desejado. A seleção dos sítios desejados pode ser com base na produção de um polipeptídeo de aminoácido não natural (que pode ser modificado adicionalmente ou permanecer inalterado) tendo qualquer propriedade ou atividade desejada, incluindo mas não limitada a moduladores de ligação ao receptor, moduladores de atividade do receptor, moduladores de ligação a parceiros ligantes, moduladores de atividade de parceiros de ligação, moduladores de conformação de parceiro de ligação, formação de dímero ou multímero, nenhuma mudança na atividade ou propriedade em comparação com a molécula nativa, ou manipulação de qualquer propriedade física ou química do polipeptídeo, tal como solubilidade, agregação ou estabilidade. Alternativamente, os sítios identificados como críticos para a atividade biológica também podem ser bons candidatos para substituição com um aminoácido não natural, novamente dependendo da atividade desejada procurada para o polipeptídeo. Outra alternativa seria simplesmente fazer substituições em série em cada posição na cadeia polipeptídica com um aminoácido não natural e observar o efeito nas atividades do polipeptídeo. Qualquer meio, técnica ou método para selecionar uma posição para substituição com um aminoácido não natural em qualquer polipeptídeo é adequado para o uso nos métodos, técnicas e composições descritos neste relatório.
[0115] A estrutura e atividade de mutantes de ocorrência natural de um polipeptídeo que contêm deleções também podem ser examinadas para determinar regiões da proteína que são pouco tolerantes à substituição por um aminoácido não natural. Uma vez que os resíduos que são provavelmente intolerantes à substituição por aminoácidos não naturais forem eliminados, o impacto das substituições propostas em cada uma das posições remanescentes pode ser examinado usando métodos incluindo, mas não limitados a, estrutura tridimensional do polipeptídeo relevante, e quaisquer ligantes associados ou proteínas de ligação. As estruturas cristalográficas e de RMN de raios-X de muitos polipeptídeos estão disponíveis no Banco de Dados de Proteínas (PDB, ver o site rcsb.org), um banco de dados centralizado contendo dados estruturais tridimensionais de grandes moléculas de proteínas e ácidos nucleicos, pode ser usado para identificar posições de aminoácidos que podem ser substituídas por aminoácidos não naturais. Além disso, os modelos podem ser feitos investigando a estrutura secundária e terciária de polipeptídeos, se os dados estruturais tridimensionais não estiverem disponíveis. Assim, a identidade das posições de aminoácidos que podem ser substituídas por aminoácidos não naturais pode ser facilmente obtida.
[0116] Os sítios exemplares de incorporação de um aminoácido não natural incluem, mas não são limitados a, àqueles que são excluídos de potenciais regiões de ligação ao receptor, ou regiões para ligação a proteínas de ligação ou ligantes podem ser completamente ou parcialmente expostas ao solvente, mínimas ou nenhuma interação de ligação de hidrogênio com resíduos próximos, podem ser minimamente expostos a resíduos reativos próximos, e/ou podem estar em regiões que são altamente flexíveis como prognosticado pela estrutura cristalina tridimensional de um polipeptídeo particular com seu receptor associado, ligante ou proteínas de ligação.
[0117] Uma grande variedade de aminoácidos não naturais pode ser substituída no lugar de, ou incorporada em, uma determinada posição em um polipeptídeo. Através do exemplo, um aminoácido não natural particular pode ser selecionado para incorporação com base em um exame da estrutura cristalina tridimensional de um polipeptídeo com seu ligante associado, receptor e/ou proteínas de ligação, uma preferência para substituições conservativas.
[0118] Em uma forma de realização, os métodos descritos neste relatório incluem a incorporação no derivado de ligante de dolastatina, onde o derivado de ligante de dolastatina compreende um primeiro grupo reativo; e o contato do derivado de ligante de dolastatina com uma molécula (incluindo mas não limitado a uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; e qualquer combinação dos mesmos) que compreende um segundo grupo reativo. Em certas formas de realização, o primeiro grupo reativo é uma porção de hidroxilamina e o segundo grupo reativo é uma porção de carbonila ou dicarbonila, em que uma ligação oxima é formada. Em certas formas de realização, o primeiro grupo reativo é uma porção de carbonila ou dicarbonila e o segundo grupo reativo é uma porção de hidroxilamina, em que uma ligação oxima é formada. Em certas formas de realização, o primeiro grupo reativo é uma porção carbonila ou dicarbonila e o segundo grupo reativo é uma porção oxima, em que uma reação de troca de oxima ocorre. Em certas formas de realização, o primeiro grupo reativo é uma porção oxima e o segundo grupo reativo é a porção carbonila ou dicarbonila, em que uma reação de troca de oxima ocorre.
[0119] Em alguns casos, a incorporação do derivado de ligante de dolastatina será combinada com outras adições, substituições ou deleções dentro do polipeptídeo para afetar outras características químicas, físicas, farmacológicas e/ou biológicas. Em alguns casos, as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a estabilidade (incluindo mas não limitada a, resistência à degradação proteolítica) do polipeptídeo ou aumentar a afinidade do polipeptídeo para seu receptor, ligante e/ou proteínas de ligação apropriados. Em alguns casos, as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a solubilidade (incluindo mas não limitada a, quando expresso em E. coli ou outras células hospedeiras) do polipeptídeo. Em algumas formas de realização, os sítios são selecionados para substituição com um aminoácido codificado naturalmente ou não natural além de outro sítio para incorporação de um aminoácido não natural para o propósito de aumentar a solubilidade do polipeptídeo após a expressão em E. coli, ou outras células hospedeiras recombinantes. Em algumas formas de realização, os polipeptídeos compreendem outra adição, substituição ou deleção que modula afinidade para o ligante associado, proteínas de ligação, e/ou receptor, modula (incluindo mas não limitado ao, aumento ou diminuição) a dimerização do receptor, estabiliza os dímeros do receptor, modula a meia-vida circulante, modula a liberação ou biodisponibilidade, facilita a purificação ou melhora ou altera uma via de administração particular. Similarmente, o polipeptídeo de aminoácido não natural pode compreender sequências de clivagem química ou enzimática, sequências de clivagem de protease, grupos reativos, domínios de ligação a anticorpos (incluindo mas não limitados a, FLAG ou poli-His) ou outras sequências com base em afinidade (incluindo mas não limitadas a, FLAG, poli-His, GST, etc.) ou moléculas ligadas (incluindo mas não limitadas a, biotina) que melhoram a detecção (incluindo mas não limitada a, GFP), purificação, transporte através de tecidos ou membranas celulares, liberação ou ativação de pró-fármaco, redução de tamanho ou outras características do polipeptídeo.
[0120] Em algumas formas de realização uma carga útil ou porção de toxina é utilizada nos conjugados de fármaco de anticorpo anti-PMSA da presente divulgação da invenção. Exemplos de cargas podem incluir em uma maneira não limitante: inibidores da replicação do DNA, inibidores da transcrição do DNA, inibidores da tradução do RNA, inibidores da divisão celular, inibidores da sinalização celular, inibidores da quinase, inibidores da tubulina polimerase, agentes despolimerizantes da tubulina, agentes de clivagem do DNA, agentes de ligação de DNA, inibidores de RNA, auristatinas, dolastatinas, MMAF, MMAE, MMAD, análogos de duocarmicina, análogos de pirrolobenzodiazepina (PBD), análogos de tubulisina, análogos de maitansina, análogos de amanitina, análogos de criptoficina, análogos de epotilona, análogos de camotecina, análogos de camotilona, análogos de camptotecina.
[0121] Em outras formas de realização da presente invenção são fornecidos ligantes de carga útil de fármacos. Os inibidores antitubulina foram escolhidos como a carga útil em combinação com ligantes cliváveis, cliváveis curtos e não cliváveis. De uma maneira exemplar, a combinação do ligante de carga útil da presente divulgação da invenção pode incluir, mas não é limitada aos, ligantes de carga útil cliváveis, cliváveis curtos e não cliváveis. Os ligantes de carga útil cliváveis podem incluir dipeptídeos cliváveis, (incluindo, mas não limitados a Val-Cti, Val-Ala, Val-Lys e Ala-Ala), ligação hidrazina, ligação dissulfeto ou ligação pirofosfato. Exemplo de ligantes de carga útil utilizados no conjugado de fármacos de anticorpo anti-AMEP da presente divulgação inclui MMAE não clivável, MMAF não clivável, Val-Citrulina- Acetil MMAF, Val-Citrulina-Acetil MMAF curto, ou Val-Citrulina-Acetil MMAE curto. Tanto MMAE quanto MMAF foram utilizados no estudo. Exemplos não limitantes de derivados de ligante de dolastatina incluem os seguintes: MMAF não clivável que apresenta a estrutura: MMAE não clivável que apresenta a estrutura: MMAF Clivável ou Val-Citrulina-Acetil (Val-Cit) que apresenta a estrutura:
MMAF clivável curta ou Val-Citrulina-Acetil (Val-Cit) curta que apresenta a estrutura: MMAE clivável curta ou Val-Citrulina-Acetil (Val-Cit) curta que apresenta a estrutura:
[0122] A Tabela 1 fornece compostos ligantes de fármacos que podem ser utilizados com o anticorpo anti-AMEP ou conjugados de fármaco de anticorpo da presente invenção. A síntese de tais ligantes de carga útil é bem conhecida pelo técnico no assunto. Ver, por exemplo, como incorporado neste relatório à título de referência, Dubowchik et al., Bioconjugate Chem. 13: 855 a 869, (2002); Doronina et al., Nature Biotechnology 21(7): 778 a 784, (2003); WO 2012/166560; WO 2013/185117. Tabela 1. Compostos de Fármaco-Ligante
Exemplo Estrutura
GERAÇÃO DE CAF ANTI-AMEP CONJUGADO COM LIGANTE DE ALVEJAMENTO DE AMEP
[0123] Em outras formas de realização da divulgação da invenção, ligantes direcionados são incluídos. Tais ligantes incluem aqueles que se ligam ao sítio ativo do receptor de AMEP, ligantes que são inibidores da atividade enzimática de glutamato carboxipeptidase do receptor de AMEP e ligantes usados para a imagem. A divulgação da invenção também inclui aqueles ligantes com faixa de afinidade de ligação sub-pico a sub-nano molar.
[0124] Os CAFs anti-AMEP conjugados com o ligantes de alvejamento de AMEP podem ser gerados como descrito neste relatório. Um método de geração envolve a conjugação sequencial em que o ligante de toxina é conjugado ao anticorpo pelo método de conjugação cisteína-maleimida seguido pela conjugação do ligante de alvejamento de AMEP em sítios específicos no anticorpo com base no método de ligação oxima proprietário. A conjugação de maleimida é realizada por redução das pontes dissulfeto entre as cadeias pesadas e leves do anticorpo, facilitada pela adição de agente redutores relevantes. As ligações dissulfeto do anticorpo podem ser reduzidas incubando uma mistura de reação formulada em pH variando de 6 a 7,4 consistindo em anticorpo e agente de redução 3 a 9 vezes molar superior. A mistura de reação pode ser incubada a 37 °C durante 2 h para obter um razão de fármaco:anticorpo de 3 a 4. O anticorpo conjugado com toxina é então trocado por tampão em uma mistura de reação com pH variando entre 4 e 5 contendo ligante de alvejamento de AMEP 10 vezes maior do que molar.
A reação anticorpo conjugado com a toxina com o ligante de alvejamento de AMEP pode ser realizada incubando até a temperatura ambiente com agitação suave durante 8 a 16 horas.
Usualmente, a quantidade de AMEP direcionado ao ligante para anticorpo varia entre 1,8 e 2 gerado por este método.
Os componentes não conjugados da mistura de reação são removidos passando por uma coluna de troca catiônica e o tampão trocado para um tampão de formulação proprietário que é isotônico com fluidos corporais de camundongo e humano.
Em um outro método, o ligante de alvejamento de AMEP e a toxina podem ser conjugados em sítios específicos no anticorpo em uma única etapa por química de conjugação com base em oxima.
Esta conjugação de etapa única pode ser facilitada projetando um ligante ramificado contendo tanto o ligante de alvejamento de AMEP quanto a toxina.
A conjugação de etapa única pode ser realizada por química de clique proprietária com base em oxima e ciclo-octina.
Os componentes não conjugados podem ser removidos da mistura de reação passando por uma coluna de purificação de troca catiônica.
O material purificado é então formulado em um tampão isotônico.
Em formas de realização exemplares, ligantes de alvejamento de AMEP, (L representa um ligante), incluem, mas não são limitados ao seguinte:
Ar; pode ser qualquer anel aromático de 5, 6 membros ou anéis aromáticos fundidos, tais como (mas não limitado a)
[0125] Em formas de realização exemplares, os ligantes AMEP da presente divulgação da invenção podem incluir aqueles compostos tendo um ligante de alvejamento do terminal N e uma porção ou parte de conjugação do terminal C. Em outros aspectos exemplares da presente invenção, os ligantes de alvejamento de AMEP podem incluir o seguinte (Tabela 2), mas não são limitados a tais: Tabela 2. Ligantes de alvejamento
Exemplo Estrutura
[0126] Em outras formas de realização exemplares, a presente divulgação da invenção inclui ligantes e ligantes de alvejamento de AMEP em que a ligação entre o ligante principal e o ligante pode ser, de uma maneira não limitante: e a ligação pode ser substituída por hidrogênio.
[0127] Em outros aspectos da presente invenção o ligante pode ser, de uma maneira não limitante, polietilenoglicol (PEG), alquila, alceno, alcino, amina, arila ou aminoácidos. A química, metodologia e técnicas para conectar ligantes são bem conhecidas na técnica.
[0128] Em outra forma de realização exemplar, a presente divulgação da invenção inclui ligantes de alvejamento de AMEP com toxinas (Tabela 3) incluindo, mas não limitados a: Tabela 3. Ligantes – Toxinas
Exemplo Estrutura
[0129] Em alguns aspectos da divulgação da invenção, o anticorpo anti- AMEP, variante ou conjugado de fármacos com aumento meia-vida sérica, solubilidade em água, biodisponibilidade, meia-vida terapêutica ou tempo de circulação, ou para modular a imunogenicidade, ou atividade biológica é desejado.
Um método para alcançar tais características desejadas da composição anti-AMEP divulgada neste relatório, é por ligação covalente do polímero polietilenoglicol, (PEG). Para maximizar as propriedades desejadas de polietilenoglicol, o peso molecular total e o estado de hidratação do polímero ou polímeros ligados à molécula biologicamente ativa devem ser suficientemente elevados para transmitir as características vantajosas tipicamente associadas a tal ligação de polímero, tais como solubilidade em água aumentada e meia-vida circulante, embora não tenha um impacto adverso na bioatividade da molécula à qual o polietilenoglicol está ligado.
[0130] Os derivados de polietilenoglicol são frequentemente ligados a moléculas biologicamente ativas através de funcionalidades química reativas, tais como resíduos de aminoácidos, o terminal N, e/ou porções de carboidrato. W099/67291 divulga um processo para conjugar uma proteína com polietilenoglicol, em que pelo menos um resíduo de aminoácido na proteína é substituído com um aminoácido sintético e a proteína é colocada em contato com polietilenoglicol sob condições suficientes para obter a conjugação com a proteína.
[0131] As proteínas e outras moléculas frequentemente têm um número limitado de sítios reativos disponíveis para ligação do polímero. Os sítios mais adequados para a modificação através da ligação do polímero podem desempenhar um papel significante na ligação ao receptor, e os tais sítios podem ser necessário para a retenção da atividade biológica da molécula, tornando-os, portanto, inadequados para a ligação do polímero. Como resultado, a ligação indiscriminada de cadeias de polímero a tais sítios reativos em uma molécula biologicamente ativa frequentemente leva a uma redução significante ou mesmo à perda total da atividade biológica da molécula modificado por polímero, a ligação de polietilenoglicol pode ser direcionada para uma posição particular dentro de uma proteína tal que a porção polietilenoglicol não interfere com a função daquela proteína. Um método para direcionar a ligação do polietilenoglicol é introduzir um aminoácido sintético na sequência da proteína. A maquinaria biossintética de proteínas do procarioto Escherichia coli (E. coli) pode ser alterada de modo a incorporar aminoácido sintéticos de forma eficiente e com alta fidelidade em proteínas em resposta ao códon âmbar, UAG. Ver, por exemplo, J. W. Chin et al., J.
Amer Chem. Soc. 124: 9026 a 9027, 2002; J. W. Chin, & P. G. Schultz, ChemBio Chem 3(11): 1135 a 1137, 2002; J. W. Chin, et al., PNAS USA 99: 11020 a 11024, 2002; e, L. Wang, & P. G. Schultz, Chem. Comm., 1: 1 a 11, 2002. Um método similar pode ser realizado com o eucarioto, Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) (por exemplo, J. Chin et al., Science 301: 964 a 7, 2003). Usando este método, um aminoácido codificado não naturalmente pode ser incorporado no anticorpo anti-AMEP, variante ou conjugado de fármacos da presente invenção, fornecendo um sítio de ligação para o polietilenoglicol. Ver, por exemplo W02010/011735 e W02005/074650.
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[0132] Em outros aspectos da presente invenção, as variantes do anticorpo AMEP ou conjugados de fármacos de anticorpo AMEP compreendem adicionalmente uma composição ou formulação farmacêutica. Tal composição farmacêutica pode utilizar vários excipientes, estabilizadores, tampões e outros componentes farmaceuticamente aceitáveis para administração a animais. Ver, por exemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19a ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Identificando composições ou formulações adequadas para estabilidade, administração a um sujeito, e a atividade varia com cada composto como vários componentes, (por exemplo, purificação, estabilização de componentes), precisam ser considerados. Os sais adequados para inclusão na composição ou formulação podem incluir, mas não limitados a, cloreto de sódio, cloreto de potássio ou cloreto de cálcio. Agentes tamponantes e/ou estabilizadores, tais como acetato de sódio podem ser usados. Os tampões adequados podem incluir tampão fosfato-citrato, tampão fosfato, tampão citrato, L-histidina, cloridreto de L-arginina, tampão bicarbonato, tampão succinato, tampão citrato e tampão TRIS, sozinhos ou em combinação. Os tensoativos também podem ser utilizados, incluindo polissorbatos (por exemplo, polissorbato 80), sulfato de dodecila (SDS),
lecitina sozinhos ou em combinação.
[0133] Em alguns aspectos da presente invenção, a composição ou formulação farmacêutica pode ser uma composição aquosa ou na forma de um uma composição líquida reconstituída ou como um pó. A composição ou formulação pode apresentar uma faixa de pH de cerca de 4,0 a cerca de 7,0 ou de cerca de 4,5 a cerca de 6,5 quando a formulação está em uma forma líquida. Entretanto, o pH pode ser ajustado para fornecer a estabilidade e administração aceitáveis pelo técnico no assunto.
[0134] A composição pode ainda ser armazenada em um frasco ou cartucho, um dispositivo de liberação, de caneta, uma seringa, tubo de administração intravenoso ou uma bolsa de administração intravenosa, mas não é limitada a tal. Em outras formas de realização, uma composição farmacêutica da invenção pode ser administrada como uma dose única ou seguida por um ou mais minutos, dias ou semanas de dose subsequente depois da primeira dose. Além disso, outras administrações podem ser consideradas como conforme necessário para tratar, reduzir ou prevenir um câncer, incluindo câncer de próstata.
[0135] Em alguns casos, os anticorpos, variantes ou composições de ADC anti-AMEP da presente divulgação da invenção podem ser usados em combinação com uma terapia ou tratamento adicional incluindo mas não limitado a cirurgia, radiação, criocirurgia, termoterapia, tratamento hormonal, quimioterapia, vacinas e outras imunoterapias. Em algumas formas de realização, tal tratamento adicional pode incluir um agente terapêutico, tal como agente quimioterápico, agente hormonal, agente antitumoral, agente imunoestimulante, imunomodulador, corticosteroide ou combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, o agente hormonal é enzalutamida.
[0136] Em outras formas de realização, os CAFs anti-AMEP da invenção podem ser administrados com um ou mais agentes imunoestimulantes para induzir ou acentuar uma resposta imune. Os agentes imunoestimulantes que podem estimular braços específicos do sistema imune, tais como células assassinas naturais (NK) que medeiam a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Tais agentes imunoestimulantes incluem, mas não são limitados a, IL-2, oligonucleotídeos imunoestimulantes (por exemplo, motivos CpG), a-interferon, g- interferon, fator de necrose tumoral alfa (TNFa). Em outras formas de realização, os ADCS anti-AMEP da invenção podem ser administrados com um ou mais imunomoduladores incluindo, mas não limitados a, citocinas, quimiocinas (incluindo, mas não são limitados a, SLC5 ELC, MIR3a, MIR3b, IP-IO, MIG e combinações da mesma). Outros agentes terapêuticos podem ser uma vacina que imuniza um sujeito contra AMEP. Tais vacinas, em algumas formas de realização, incluem antígenos, tais como dímero de AMEP, com, opcionalmente, um ou mais adjuvantes para induzir ou acentuar uma resposta imune. Adjuvantes de muitos tipos são bem conhecidos na técnica.
[0137] O agente quimioterápico ou qualquer agente envolvido no tratamento, redução ou prevenção de uma doença, condição ou câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo também pode ser administrado em combinação com um CAF anti-AMEP da divulgação da invenção. Agentes quimioterápicos podem incluir, mas não são limitados a erlotinibe (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), bortezomibe (VELCADE®, Millennium Pharm.), falvestrante (FASLODEX®, AstraZeneca), sutent (SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA®, Novartis), mesilato de imatinibe (GLEEVEC®, Novartis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), oxaliplatina (Eloxatin®, Sanofi), 5-FTJ (5-fluorouracil), leucovorina, Rapamicina (Sirolimo, RAPAMUNE®, Wyeth), lapatinibe (TYKERB®, GSK572016, GlaxoSmithKline), lonafarnibe (SCH 66336), sorafenibe (BAY43-9006, Bayer Labs.) e gefitinibe (IRESSA®, AstraZeneca), AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), agentes alquilantes, tais como tiotepa e CYTOXAN® ciclosfosfamida; sulfonatos de alquila, tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; antifolato antineoplásico, tal como pemetrexede (ALIMTA®, Eli Lilly), aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente, bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente, criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio, tais como clorambucil, clomafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridreto do óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosoureias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos, tais como os antibióticos de enediina, caliqueamicina, caliqueamicina gama1I e caliqueamicina omegaI1; dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, tais como clodronato; uma esperamicina; assim como cromóforo de neocarzinostatin e cromóforos de antibiótico de cromoproteína enediina relacionados, aclacinomisinas, actinomicina, antramicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5- oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN® doxorrubicina (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epimbicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodombicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabólitos, tais como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina,
metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6- mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiandrógenos (por exemplo, enzalutamida) ou terapia de privação de andrógenos; antiadrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforçador de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansinoides, tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamnol; nitraerina; pentostatina; fenameto; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; complexo polissacarídico PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxana; rizoxina; sizofuran; espirogermânio; ácido dezuazônico; triaziquona; 2,2’,2’’-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente, toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosídeo (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por exemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ livre de Cremophor, albumina, formulação de nanopartículas de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.), e doxetaxel TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucil; gencitabina GEMZAR®; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina, tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE® vinorelbina; novantrona; teniposídeo; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tais como ácido retinoico; capecitabina; e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um entre os anteriores.
[0138] O termo “cerca de” será entendido pelos técnicos no assunto e variará até certo ponto, dependendo do contexto em que é usado.
EXEMPLOS
[0139] Deve ser entendido que os exemplos e formas de realização descritos neste relatório são apenas para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridas aos técnicos no assunto e devem ser incluídas no espírito e âmbito deste pedido e escopo das reivindicações anexas. Exemplo 1: Transfecção Transitória. A cultura de CHO-S foi semeada em 0,75 x 106/mL aproximadamente 16 horas pré-transfecção em meio FreeStyle CHO. As células foram transfectadas no dia seguinte quando a contagem celular atingiu 1,4 a 1,6 x 106/mL. Na contagem de células alvo, estoque de para-acetilfenilalanina (pAF) 400 mM foi adicionado a uma concentração de cultura final de 1,4 mM.
[0140] Complexo de polietilenimina/DNA (PEI/DNA) foi preparado, conforme descrito: DNA (1,42 ug/1 x 106 células) foi dissolvido em meio RPMI (5 % (v/v) do volume de cultura total), mistura de DNA/RPMI foi incubada na temperatura ambiente durante 2 minutos, estoque PEI (1 mg/mL) foi adicionado à solução de DNA em uma razão de 3:1 (PEI/DNA (ug/ug)) e a mistura incubada na temperatura ambiente durante 5 min.
[0141] A mistura foi suavemente adicionada à cultura celular e agitada. Os frascos foram transferidos para uma incubadora a 32 °C. No dia 6 pós-transfecção, uma análise western blot foi realizada. No dia 7 pós-transfecção, o sobrenadante foi coletado. Exemplo 2: Humanização do Anticorpo - Camundongo Parental J591 (Liu et al., Cancer Research, 57, 3629 a 36354, 1997) O anticorpo foi humanizado selecionando estruturas humanas com base na identidade de sequência com a sequência de estrutura de camundongo. As RDCs de cadeia leve e cadeia pesada a partir do anticorpo de camundongo foram enxertadas nas estruturas humanas, respectivamente, e analisadas quanto à ligação ao antígeno AMEP. Variantes humanizadas foram geradas pareando quatro estruturas de cadeia pesada humana com seis estruturas de cadeia leve. As variantes foram transitoriamente expressadas em células HEK293 e os sobrenadantes foram testados quanto à ligação ao antígeno AMEP expressado em células LnCap por FACS. A Tabela 4 descreve uma sequência da região variável de cadeia pesada selecionada e 4 sequências da região variável de cadeia leve usadas para estudos adicionais. A análise de ligação mostrou quatro variantes de comprimento total humanizadas, mostradas como variante anti-AMEP humanizada 1, 2, 3 e 4 (Tabela 4), afinidade de ligação comparável retida como a quimera, (Tabela 4), exibindo afinidade de ligação na faixa nanomolar. Conforme divulgado na Tabela 4, a variante anti-AMEP humanizada 1 compreende a sequência de cadeia pesada da SEQ. ID No: 8 e a sequência de cadeia leve da SEQ. ID No: 9; a variante anti-AMEP humanizada 2 compreende a sequência de cadeia pesada da SEQ. ID No: 10 e a sequência de cadeia leve da SEQ. ID No: 11; a variante anti-AMEP humanizada 3 compreende a sequência de cadeia pesada da SEQ. ID No: 12 e a sequência de cadeia leve da SEQ. ID No: 13; e a variante anti-AMEP humanizada 4 compreende a sequência de cadeia pesada da SEQ. ID No: 14 e a sequência de cadeia leve da SEQ. ID No: 15. Tabela 4. Sequências de Aminoácidos de Variantes de Anticorpos Anti-
AMEP
Sequências de anticorpos anti-AMEP humanizados e quiméricos Sequência de Região Variável de Cadeia Pesada Humanizada
Sequência de Região Variável de Cadeia Leve Humanizada
Sequência de Região Variável de Cadeia Pesada Quimérica
Sequência de Região Variável de Cadeia Leve Quimérica
Variante anti-AMEP humanizada 1 (comprimento total)
Cadeia Pesada
Cadeia Leve
Variante anti-AMEP humanizada 2 (comprimento total)
Cadeia Pesada
Cadeia Leve
Variante anti-AMEP humanizada 3 (comprimento total)
Cadeia Pesada
Cadeia Leve
Variante anti-AMEP humanizada 4 (comprimento total)
Cadeia Pesada
Cadeia Leve
Variante de anticorpo anti-AMEP quimérica (comprimento total)
Cadeia Pesada
Cadeia Leve Exemplo 3: Expressão Recombinante de Anticorpos Anti-AMEP - Anticorpos anti-AMEP humanizados principais foram selecionados e recombinantemente expressados em células CHO por transfecção transitória, (descrita no Exemplo 1) e método de agrupamento em massa estável para examinar a expressão da sequência humanizada. Nas abordagens de transfecção transitória e agrupamento em massa estável, a tecnologia proprietária foi construída no vetor de expressão e células hospedeiras CHO, respectivamente (veja, por exemplo, o WO 2018/223108). O aminoácido não natural para-acetilfenilalanina (pAF) foi incorporado na posição A 114, (esquema de numeração de Kabat, (veja, Kabat et al., Publicação NIH No 369 a 847, 1993); posição indicada na Tabela 4 por A), no anticorpo AMEP, que é o primeiro resíduo de aminoácido da região constante da cadeia pesada. Exemplo 4: Produção de Conjugados de Anticorpo-Fármaco (CAFs) – Os anticorpos podem ser purificados usando métodos com base em cromatografia, bem conhecidos do técnico no assunto, que envolvem captura por afinidade da Proteína A e polimento de troca catiônica. O anticorpo coletado no meio de cultura celular é capturado em uma coluna de afinidade de proteína A e eluído sob condições ácidas. A preparação do anticorpo é titulada ao pH 5 e polida passando através de uma coluna de troca catiônica. Usando pós-troca catiônica, o anticorpo pode ser trocado por tampão no tampão de conjugação.
[0142] Na presente invenção, o anticorpo anti-AMEP humanizado foi conjugado a uma toxina, (MMAE ou MMAF), por intermédio de um pequeno ligante hidrofílico. O fármaco-ligante de carga útil se conjuga covalentemente com o pAF na cadeia pesada anti-AMEP resultando na formação de CAFs anti-AMEP. O anticorpo
AMEP é conjugado com o fármaco-ligante de carga útil incubando a 28 °C na presença de hidrazida acética 135 mM, agindo como um catalisador. Anticorpos não conjugados, fármaco-ligante de carga útil não conjugado, agregados e impurezas foram removidos passando a mistura de reação através de uma coluna de cromatografia troca catiônica antes da troca do CAF anti-AMEP no tampão de formulação (Histidina 50 mM, cloreto de sódio 150 mM, Trealose 2,5 % pH 6). O conjugado de anticorpo-fármaco foi eluído a partir da coluna sob um gradiente de sal gerando um pico monodisperso.
[0143] A caracterização analítica do pico monodisperso a partir da cromatografia de troca catiônica mostra que a principal espécie é CAF anti-AMEP com razão fármaco para anticorpo (RFA) variando entre 1,8 e 2 foi observada dentro de 8 horas. avaliações de controle de qualidade realizadas em anticorpos e CAFs da invenção mostram que todas as preparações geradas por esta estratégia resultaram em materiais de qualidade superior contendo < 3 % de agregado e < 5 EU/mg de nível de endotoxina.
[0144] Quinze (15) CAFs anti-AMEP foram gerados com duas variantes humanizadas principais e anticorpos quiméricos utilizando os 5 ligantes de carga útil- MMAE não clivável, MMAF não clivável, MMAF clivável, MMAF clivável curta e MMAE clivável curta, divulgadas neste relatório. Os CAFs anti-AMEP gerados com as variantes humanizadas 1 e 2, divulgadas na Tabela 4, foram selecionados para estudos adicionais nos exemplos seguintes. Exemplo 5: Estudos de Potência In Vitro – A potência in vitro de CAFs anti- AMEP é determinada usando uma linhagem celular representativa de câncer de próstata resistente à castração metastático (mCRPC), C4-2. A cultura celular foi incubada com conjugados de anticorpo-fármaco durante 96 horas a 37 °C. A viabilidade celular foi analisada usando Cell Titer Glo® (Promega, USA). A atividade antiproliferativa foi representada pela potência, IC50, a concentração na qual 50 % da atividade máxima foi obtida e morte celular, e Emax, o nível máximo de inibição de crescimento. A Tabela 5 resume a morte celular e potência in vitro dos CAFs anti- AMEP. Tabela 5. Atividade de Morte Celular In Vitro em Linhagens Celulares C4-2 Variante 1 do Variante 2 do Anticorpo Anti-AMEP Carga Ligante útil IC50 Morte IC50 Morte IC50 Morte celular MMAE Não clivável (PEG3) 11,3 64,5 12,5 67 10,2 62,5 MMAF Não clivável (PEG3) 0,543 80,5 0,503 81 0,295 89,5 Clivável MMAF 0,066 91 0,051 91 0,047 89,5 (Val-Citrulina- Clivável curta MMAF (Valina- 0,064 92 0,053 91 0,049 94,5 Citrulina- Clivável curta MMAE (Valina- 0,542 81,5 0,52 81,5 0,425 82,5 Acetil)
[0145] Ensaio de atividade de morte celular sugere que a combinação carga útil-ligante é crítica para o desenvolvimento de conjugados de anticorpo-fármaco potentes. Os conjugados de anticorpo-fármaco potentes exibiram potência subnanomolar com >75 % de morte celular. Os conjugados de anticorpo-fármaco com cargas úteis de MMAF revelaram morte celular e potência maiores do que os conjugados de anticorpo-fármaco com cargas úteis de MMAE. O estudo de morte celular in vitro sugere que os CAFs anti-AMEP com carga útil de MMAF exibiram uma ordem de magnitude maior de potência do que os CAFs anti-AMEP com cargas úteis de MMAE.
[0146] Este estudo também demonstrou que a atividade do conjugado de anticorpo-fármaco também foi influenciada pelo tipo de ligante.
Os conjugados de anticorpo-fármaco com ligantes cliváveis exibiram morte celular e potência maiores em comparação aos conjugados de anticorpo-fármaco com ligante não clivável para o mesmo tipo de carga útil.
Conforme representado na Tabela 5, o estudo de morte celular in vitro mostrou que os CAFs anti-AMEP com carga útil de MMAE ou MMAF exibiram uma ordem de magnitude de maior potência para ligantes cliváveis do que para ligantes não cliváveis.
Isto sugere que os CAFs anti-AMEP potentes podem ser gerados por combinação apropriada de cargas úteis citotóxicas com ligantes.
A combinação da carga útil de MMAE com ligante não clivável revelou potência e morte deficientes.
Além disso, a morte de células alvo pelos CAFs de anticorpo anti- AMEP é realizada pela liberação alvejada de agentes citotóxicos pelo anticorpo anti- AMEP.
A liberação alvejada de agentes citotóxicos é facilitada pela ligação do componente de anticorpo anti-AMEP do conjugado de anticorpo-fármaco ao receptor ou antígeno, AMEP, expressado sobre a superfície celular, que é internalizada na célula pelo receptor.
Estudos com linhagens celulares de câncer de próstata que não expressam AMEP, tais como PC-3, sugerem que CAFs anti-AMEP potentes não exercem qualquer atividade de morte celular.
Linhagens celulares PC-3 incubadas com CAFs anti-AMEP potentes durante 96 horas não foram mortas.
Isto sugere que os CAFs anti-AMEP inventados são específicos para o alvo.
Não foi observado efeito de morte dos conjugados de anticorpo-fármaco.
A falta de efeito de morte dos conjugados de anticorpo-fármaco inventados foi crítica para eliminar toxicidades fora do alvo não específicas, devido ao componente da toxina, que é frequentemente observado em conjugados de anticorpo-fármaco contendo MMAE como as cargas úteis citotóxicas.
Além disso, a atividade específica do alvo dos CAFs anti-AMEP inventados tornam estes CAFs valiosos para tratar câncer de próstata metastático.
A observação a partir destes estudos sugere que qualquer lesão cancerosa além do tecido canceroso primário da próstata que expressa AMEP pode ser tratada com os
CAFs anti-AMEP inventados.
[0147] Além disso, a atividade de morte celular do CAFs anti-AMEP é dependente do número de receptores expressados sobre a superfície celular. Linhagens celulares de câncer de próstata com números de cópias do receptor >60000 podem ser eficazmente mortas por CAFs anti-AMEP da invenção. Por exemplo, o estudo de morte celular in vitro realizado com CAFs anti-AMEP contendo carga útil de MMAF com ligante não clivável mostrou a morte de linhagens celulares com números de cópias do receptor >60000, Tabela 6, por imuno-histoquímica (IHC) e análise de imunofluorescência indireta quantitativa (QiFi). Tabela 6. Expressão de AMEP e Atividade de Citotoxicidade In Vitro de CAF anti-AMEP Em Linhagens Celulares de Câncer de Próstata Humano Linhagem Tipo do Número de Superfície 1050 Emax Escore da IHC Celular PCa Tumor Celular de AMEP (QiFi) (nM) (%) de AMEP C4-2 Próstata 84378 (± 24440) 1,498 86 3‡ MDA-PCa-2B Próstata 67771 (± 7636) 0,436 62 3†† VCap Próstata 13470 (+ 4278) Nenhuma 1†† 22Rv1 Próstata 8572 (±2123) Nenhuma 1‡ PC-3 Próstata 890 (± 727) Nenhuma Negativo ‡ - Determinado a partir de blocos de xenoenxerto de tumor in vivo; † - Não determinado devido ao crescimento deficiente †† - Determinado a partir de pelotas celulares
[0148] A dependência da atividade de morte celular dos CAFs anti-AMEP inventados sobre os números de cópias do receptor de AMEP é indicativa de benefício terapêutico para tratar câncer de próstata. Números de cópias do receptor de AMEP são usualmente altos no tecido canceroso da próstata em comparação à expressão de AMEP em tecidos sem câncer. Esta expressão diferencial no número de cópias do receptor de AMEP entre o tecido canceroso da próstata e tecidos normais pode facilitar a redução e/ou eliminação de toxicidade relacionada ao tecido não prostático relacionado ao alvo.
Esta análise sugere que os CAFs anti-AMEP podem exibir baixa atividade nos tecidos que expressam baixos números de copias do receptor de AMEP do que no tecido canceroso da próstata com alto número de cópias do receptor de AMEP.
Consequentemente, a toxicidade de fundo do conjugado de anticorpo-fármaco pode ser significantemente diminuída.
Exemplo 6: Perfil Farmacocinético (PF) com a Carga Útil do Fármaco- Ligante - A estabilidade sistêmica dos CAFs anti-AMEP neste relatório pode ser avaliada pela realização de estudos farmacocinéticos em camundongos e ratos onde os conjugados de anticorpo-fármaco são administrados como um bolo intravenoso (i.v). avaliação farmacocinética sugere que a estabilidade do conjugado de anticorpo-fármaco intacto depende da estabilidade do ligante.
Estudos realizados em camundongos em dose única de 1 mg/kg sugerem que os CAFs anti-AMEP com carga útil de MMAF ligados por ligante não clivável ou clivável curto (Val-Citrulina- Acetil) permanecem intactos durante todo o estudo.
A meia-vida dos CAFs anti- AMEP intactos com carga útil de MMAF ligados por ligante não clivável ou clivável curto é de 10 dias, Figura 1, (2 painéis superiores). A estabilidade sistêmica do ligante clivável curto é independente da carga útil.
O ligante no CAF anti-AMEP com carga útil de MMAE ligado por ligante clivável curto também permanece intacto durante todo o estudo com a meia-vida do conjugado de anticorpo-fármaco intacto sendo de até 10 dias, Figura 1, (painel direito inferior). Entretanto, ao contrário, o ligante no CAF anti-AMEP com carga útil de MMAF ligado por ligante clivável (Val- Citrulina-PEG1) é clivado precocemente diminuindo a meia-vida do conjugado de anticorpo-fármaco intacto em aproximadamente 4 dias, Figura 1, (painel esquerdo inferior). F1 representa a detecção do conjugado de anticorpo-fármaco no soro pelo anticorpo, F3 representa a detecção do conjugado de anticorpo-fármaco no soro pela toxina-ligante de carga útil.
[0149] A estabilidade sistêmica de CAF anti-AMEP com MMAF não clivável também foi avaliada em ratos em doses de 1 mg/kg e 5 mg/kg. O estudo revelou que o conjugado de anticorpo-fármaco é estável, com o ligante e o agente citotóxico remanescente intactos durante todo o estudo, Figura 2.
[0150] Os estudos foram realizados em ratos para comparar o perfil farmacocinético dos CAFs anti-AMEP com MMAF não clivável e o anticorpo anti- AMEP, (denotado como anticorpo nu), sem agente citotóxico. A avaliação do perfil farmacocinético sugere que a depuração de CAF anti-AMEP com MMAF não clivável é similar ao anticorpo anti-AMEP, Figura 3. Este sugere que a estabilidade inerente do anticorpo não é afetada por conjugação com base em p-acetilfenilalanina específica do sítio e carregamento do fármaco.
[0151] A estabilidade do conjugado de anticorpo-fármaco é essencial na diminuição da toxicidade, devido ao agente citotóxico. A prevenção da clivagem do agente citotóxico a partir do conjugado de anticorpo-fármaco durante a circulação sistêmica é um forma crítica de reduzir a toxicidade. Os CAFs anti-AMEP divulgado com ligantes não cliváveis e cliváveis curtos são significantemente estáveis na circulação sistêmica com o agente citotóxico remanescente ligado ao anticorpo. Isto é significante, uma vez que a maioria dos conjugados de anticorpo-fármaco é instável com a carga útil de fármaco caindo a partir do ligante e/ou do sítio of conjugação e, desse modo, resultando em toxicidade relacionada ao não alvo significante, devido ao agente citotóxico. A aplicação terapêutica do conjugado de anticorpo-fármaco é correntemente restrita, devido a tal toxicidade. A maioria dos conjugados de anticorpo-fármaco nos experimentos clínicos revelou as toxicidades limitantes de dose que podem ser atribuídas ao agente citotóxico. Devido às tais toxicidades, a aplicação terapêutica do conjugado de anticorpo-fármaco foi limitada e, até o momento, quatro conjugados de anticorpo-fármaco foram aprovados para aplicações terapêuticas. O tratamento de câncer de próstata com conjugados de anticorpo-fármaco que alvejam AMEP provou ser um desafio no campo até o momento, devido às toxicidades graves e falta de índice terapêutico. Os dados farmacocinéticos sugerem que os CAFs anti-AMEP inventados podem superar as limitações de toxicidade não específica, devido ao agente citotóxico, evitando a clivagem da carga útil de fármaco a partir do ligante e/ou sítio de conjugação por combinação única da conjugação química estável com um ligante estável. A conjugação química estável utilizada na geração dos novos CAFs anti-AMEP da invenção pode ser obtida pela formação de uma ligação cetoxima entre um aminoácido não natural, por exemplo p-acetilfenilalanina, incorporada no anticorpo em localizações específicas e o fármaco-ligante de carga útil derivatizado com um grupo hidroxilamina. Exemplo 7: Estudos de Eficácia In Vivo – A eficácia antitumor dos CAFs anti- AMEP, com MMAF não clivável e clivável curta, foi testada no modelo de xenoenxerto de tumor em camundongos enxertados com linhagem celular de câncer de próstata. Linhagem celular relevante de câncer de próstata (mCRPC) resistente à castração metastático, C4-2, foi obtida a partir de ATCC e expandida in vitro seguindo as instruções da ATCC. Xenoenxertos de carcinoma humano C4-2 foram cultivados em camundongos machos imunocomprometidos com células subcutaneamente implantadas. Os camundongos foram pesados e medidos quanto ao volume do tumor usando um paquímetro eletrônico. O volume do tumor individual foi calculado como comprimento x largura x largura/2. Os camundongos com tumores vascularizados (determinados pela aparência) com um volume médio de 500 mm3 foram randomizados em grupos de tratamento e foram intravenosamente dosados por peso corpóreo do indivíduo. CAFs anti-AMEP foram administrados em 0,1, 1, 5 e 10 mg/kg.
[0152] Estudos sugerem que CAFs anti-AMEP com MMAF não clivável e clivável curta foram eficazes na prevenção do crescimento do tumor. Em 5 mg/kg e 10 mg/kg, CAFs anti-AMEP foram eficazes na inibição do crescimento do tumor durante 37 dias pós-dosagem. Em 1 mg/kg, CAFs anti-AMEP foram eficazes na estase do tumor até que o novo crescimento foi observado depois de 35 dias pós- dosagem. Na dosagem de 0,1 mg/kg, nenhuma diferenciação significante a partir dos controles foi observada. A análise do peso corpóreo mostrou que os animais tratados também ganharam peso como camundongos normais e saudáveis, não implicando em toxicidade evidente associada aos CAFs anti-AMEP. As Figuras 4A e 4B representam os resultados do volume do tumor e do peso corpóreo representativo de CAFs anti-AMEP da invenção compreendendo MMAF não clivável. As Figuras 5A e 5B representam resultados do volume do tumor e peso corpóreo representativos de CAFs anti-AMEP da invenção compreendendo MMAF clivável curta. Exemplo 8: Estudos Farmacocinéticos com MMAF não Clivável. A farmacocinética (FC) foram avaliada em camundongos portadores de tumor e sem tumor após dose única de CAF anti-AMEP usando um MMAF não clivável. Os camundongos foram injetados via injeção intravenosa em bolo com 1 mg/kg ou 5 mg/kg do CAF MMAF não clivável. O soro foi coletado e analisado quanto à presença do CAF MMAF não clivável. Nos dois níveis de dose avaliados, 1 mg/kg e 5 mg/kg, perfis FC similares foram observados para concentrações de CAF anti- AMEP em camundongos portadores de tumor e sem tumor (Figura 6A).
[0153] A Farmacocinética (FC) também foi avaliada em macacos cinomolgos após administração de dose única de CAF anti-AMEP usando um MMAF não clivável em várias concentrações de 1,17 mg/kg, 3,86 mg/kg, 9,36 mg/kg, 11,7 mg/kg, 23,3 mg/kg e 35,0 mg/kg (Figura 6B). Os CAFs anti-AMEP foram administrados como uma infusão intravenosa, (a via de administração pretendida na clínica), 15 a 20 minutos. Após a dosagem, as amostras foram coletadas durante 28 dias.
Bioanálise para CAF anti-AMEP intacto foi realizada usando um método qualificado Meso Scale Discovery.
Perfis FC sobrepostos foram observados para CAF intacto e anticorpo total confirmando que CAFs anti-AMEP da presente invenção são extremamente estáveis na circulação sistêmica.
Um aumento não linear na exposição foi observado em doses menores, (1,17 mg/kg a 3,86 mg/kg), o que pode ser atribuído à eliminação mediada pelo alvo possível.
Outro aumento na dose resultou em um aumento relativamente linear nas exposições com aumento na dose.
A depuração foi lenta, variando de 0,118 mL/h/kg a 0,304 mL/h/kg e o volume de distribuição foi pequeno, variando de 44,2 mL/kg a 58,2 mL/kg.
A meia-vida resultante foi longa, variando de 129 horas a 346 horas, com uma tendência geral para aumento na meia-vida com aumento na dose.
Deve ser observado que a estabilidade extrema de CAF anti-AMEP na circulação sistêmica minimiza a toxicidade fora do alvo relacionada à liberação de carga útil livre a partir do CAF, promovendo uma meia-vida longa, desse modo, permitindo um regime de dosagem compatível com paciente de uma vez a cada 3 ou 4 semanas.
Exemplo 9: Terapia de Combinação de CAF Anti-AMEP - Os CAFs anti- AMEP da presente invenção podem ser usados em combinação com qualquer agente envolvido no tratamento, redução, melhora ou prevenção de câncer de próstata em um indivíduo em necessidade dos mesmos, incluindo, mas não limitados à terapia hormonal ou quimioterapia.
Por exemplo, a terapia hormonal com enzalutamida demonstrou, in vitro, aumentar a expressão da expressão de AMEP na superfície celular em aproximadamente 3 vezes (Murga et al., Prostate 15;75(3):242 a 54, 2015). Adicionalmente, camundongos portadores de tumores de próstata PDX humanos tratados com enzalutamida mostraram inibição aumentada do crescimento do tumor quando combinados com um CAF AMEP com a carga útil de auristatina, MMAE (DiPippo et al., Prostate 15;76(3):325 a 34, 2016). Com base no aumento na expressão de AMEP observado na técnica, os inventores estudaram o efeito in vivo da terapia de combinação usando os CAFs anti-AMEP inventados com a carga útil de MMAF e enzalutamida.
[0154] A eficácia antitumor dos CAFs anti-AMEP da invenção em combinação com a terapia hormonal com enzalutamida foi testada em modelos de xenoenxerto de tumor em camundongos enxertados com linhagem celular de câncer de próstata. A linhagem celular relevante de câncer de próstata resistente à castração metastático (mCRPC), C4-2, foi obtida a partir da ATCC e expandida in vitro após as instruções da ATCC. Xenoenxertos de carcinoma humano C4-2 foram cultivados em camundongos machos imunocomprometidos com células subcutaneamente implantadas. Um segundo modelo usando camundongos machos imunocomprometidos portadores de tumores de próstata TM00298 de xenoenxerto derivado do paciente (PDX) (Jackson Laboratories, CA) também foi estudado.
[0155] Os camundongos foram pesados e medidos quanto ao volume do tumor usando um paquímetro eletrônico. O volume do tumor individual foi calculado como comprimento x largura x largura/2. Os camundongos com tumores vascularizados (determinados pela aparência) com um volume médio de 500 mm3 foram randomizados em grupos de tratamento e foram intravenosamente dosados por peso corpóreo do indivíduo. Os CAFs anti-AMEP foram intravenosamente administrados em 0,5, 1, e 3 mg/kg semanalmente durante 4 semanas no modelo C4-2 e em 1 e 3 mg/kg semanalmente durante 4 semanas no modelo PDX. Nos dois modelos de próstata, enzalutamida foi oralmente administrada diariamente em 10 mg/kg, durante 28 dias. Nos dois modelos de próstata, um grupo de camundongos foi administrado uma terapia de combinação de CAF anti-AMEP 1 mg/kg mais enzalutamida 10 mg/kg, Figuras 7 e 8. Para o modelo PDX, os camundongos também foram administrados uma terapia de combinação de CAF anti-AMEP 3 mg/kg mais enzalutamida 10 mg/kg, Figura 8.
[0156] CAFs anti-AMEP em 3 mg/kg e 1 mg/kg mostraram que a inibição do tumor é responsiva à dose em um modelo resistente à enzalutamida. A inibição completa foi obtida em 3 mg/kg com ICT de 80 % (porcentagem de inibição de crescimento do tumor). Resposta parcial foi observada em 1 mg/kg com ICT de 37 %. A análise do peso corpóreo sugeriu que os animais tratados também ganharam peso como camundongos normais e saudáveis, não implicando em toxicidade evidente associada aos CAFs anti-AMEP. As Figuras 7A e 8A representam os resultados do volume do tumor e peso corpóreo (Figuras 7B e 8B) representativos de CAFs anti-AMEP da invenção compreendendo MMAF não clivável.
[0157] Este estudo demonstrou a eficácia aperfeiçoada com CAFs anti- AMEP da presente invenção em combinação com enzalutamida. Enzalutamida, como um agente único, aumentou o nível de AMEP de superfície celular em células de câncer de próstata. A combinação de CAFs anti-AMEP com enzalutamida mostrou maior % de ICT do que a monoterapia. Estes estudos sugerem que CAFs anti-AMEP com MMAF não clivável e clivável curta foram eficazes na prevenção do crescimento do tumor com efeito sinérgico na presença de enzalutamida. Exemplo 10: Ensaio Clínico Humano da Segurança e/ou Eficácia do Conjugado de Anticorpo Anti-AMEP-Fármaco (CAF) para Terapia contra Câncer de Próstata Objetivo: Compare a segurança e farmacocinética da composição administrada compreendendo CAF anti-AMEP da presente invenção. Projeto do Estudo: Este estudo foi um estudo de escalonamento de dose de Fase I, de centro único ou múltiplo, aberto, randomizado, seguido por um estudo de Fase II em pacientes com câncer de próstata. Os pacientes não deveriam ter tido exposição ao derivado de AMEP antes da entrada no estudo. Os pacientes não deveriam ter recebido tratamento para o câncer dentro de 2 semanas do início do experimento. Os tratamentos incluem o uso de quimioterapia, fatores de crescimento hematopoieticos e terapia biológica, tal como anticorpos monoclonais. Os pacientes deveriam ter se recuperado de todas as toxicidades (grau 0 ou 1) associadas ao tratamento anterior.
Todos os indivíduos foram avaliados quanto à segurança e todas as coletas de sangue para análise farmacocinética foram coletadas, conforme programado.
Todos os estudos foram realizados com aprovação do comitê de ética e consentimento do paciente.
Fase I: Os pacientes receberam CAF anti-AMEP intravenosamente em uma vez a cada ciclo de dosagem de 3 semanas.
As doses de CAF anti-AMEP podem ser mantidas ou modificadas quanto à toxicidade com base em avaliações, conforme esboçado abaixo.
O tratamento se repetiu a cada 3 semanas na ausência de toxicidade inaceitável.
Coortes de 3 a 6 pacientes receberam doses crescentes de CAF anti-AMEP até a dose máxima tolerada (DMT) para que CAF anti-AMEP fosse determinado.
A DMT foi definida como a dose anterior àquela na qual 2 de 3 ou 2 de 6 pacientes experienciaram a toxicidade limitante de dose.
As toxicidades limitantes de dose foram determinadas, de acordo com as definições e padrões estabelecidos pela National Cancer Institute (NCI) Common Terminology for Adverse Events (CTCAE) Versão 3.0 (9 de Agosto de 2006). Fase II: Os pacientes receberam CAF anti-AMEP como na fase I na DMT determinada na fase I.
O tratamento se repetiu a cada 3 semanas para vários ciclos na ausência de progressão da doença ou toxicidade inaceitável.
Depois da conclusão do curso de terapia do estudo, os pacientes que apresentaram uma resposta complete ou parcial receberam doses adicionais.
Os pacientes que mantiveram doença estável durante mais do que 2 meses depois da conclusão de 6 cursos de terapia do estudo receberam um adicional de 6 cursos no momento de progressão da doença, contanto que atendessem ao critérios de elegibilidade originais.
Amostra de Sangue.
Sangue em série foi coletado por punção direta da veia antes e depois da administração de CAF anti-AMEP.
Amostras de sangue venoso (5 mL) para determinação de concentrações séricas foram obtidas em cerca de 10 minutos antes da dosagem e aproximadamente nos seguintes tempos depois da dosagem: 0,5 e 4 horas, dias 1, 2, 4, 7, 14 e 21. Cada amostra sérica foi dividida em duas alíquotas.
Todas as amostras séricas foram armazenadas a -20 °C.
As amostras séricas foram enviadas em gelo seco.
Farmacocinética: Os pacientes foram submetidos à coleta de amostra de plasma/soro para a avaliação farmacocinética antes do início do tratamento e depois da administração do fármaco em estudo em 0,5 e 4 horas, dias 1, 2, 4, 7, 14 e 21. Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados por métodos independentes do modelo usando a última versão do software Phoenix WinNonlin.
Os seguintes parâmetros farmacocinéticos foram determinados: concentração sérica de pico (Cmax); tempo para concentração sérica de pico (Tmax); área sob a curva concentração-tempo (CCT) a partir do tempo zero até o último tempo da amostra de sangue (CCT ast) calculado com o uso da regra trapezoidal linear; e meia-vida de eliminação terminal (t1/2), computada a partir da constante de taxa de eliminação.
A constante de taxa de eliminação foi estimada por regressão linear de pontos de dados consecutivos na região linear terminal do gráfico de concentração-tempo log- linear.
A média, desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV) dos parâmetros farmacocinéticos foram calculados para cada tratamento.
A razão das médias do parâmetro (formulação preservada/formulação não preservada) foi calculada.
Resposta do paciente à terapia de combinação: A resposta do paciente foi avaliada via imageamento com raios X, tomografia computadorizada e IRM e o imageamento foi realizado antes do início do estudo e no final do primeiro ciclo, com imageamento adicional realizado a cada quatro semanas ou no final de ciclos subsequentes.
As formas de realização do imageamento foram escolhidas com base no tipo de câncer e viabilidade/disponibilidade e a mesma modalidade de imageamento foi utilizada para tipos de câncer similares, assim como ao longo do curso de estudo de cada paciente.
As taxas de resposta foram determinadas usando os critérios RECIST. (Therasse et al., J.
Natl.
Cancer Inst. 92(3):205 a 16, 2000; na worldwide web em http://ctep.cancer.gov/forms/TherasseRECISTJNCI.pdf). Os pacientes também foram submetidos à biópsia do câncer/tumor para avaliar as alterações no fenótipo celular progenitor de câncer e crescimento clonogênico por citometria de fluxo, Western blotting e IHC, e para alterações na citogenética por FISH.
Depois da conclusão do tratamento do estudo, os pacientes foram acompanhados periodicamente durante 4 semanas.

Claims (24)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo anti-antígeno de membrana específico da próstata (anti-AMEP), CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir da SEQ ID NO: 8, 10, 12 ou 14 e a sequência de cadeia leve selecionada a partir da SEQ ID NO: 9, 11, 13 ou 15.
2. Anticorpo anti-AMEP, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a cadeia pesada compreende uma sequência da região variável selecionada a partir da SEQ ID NO: 1 e a cadeia leve compreende uma sequência da região variável selecionada a partir do grupo da SEQ ID NO: 2, 3, 4 ou 5.
3. Anticorpo anti-AMEP, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de cadeia pesada compreende um aminoácido não naturalmente codificado.
4. Anticorpo anti-AMEP, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido não naturalmente codificado compreende um grupo carbonila, um grupo amino-óxi, um grupo hidrazina, um grupo hidrazida, um grupo semicarbazida, um grupo azida ou um grupo alcino.
5. Anticorpo anti-AMEP, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido não naturalmente codificado é para-acetilfenilalanina, p-nitrofenilalanina, p-sulfotirosina, p-carboxifenilalanina, o- nitrofenilalanina, m-nitrofenilalanina, p-boronilfenilalanina, o-boronilfenilalanina, m- boronilfenilalanina, p-aminofenilalanina, o-aminofenilalanina, m-aminofenilalanina, p- acilfenilalanina, o-acilfenilalanina, m-acilfenilalanina, p-OMe fenilalanina, o-OMe fenilalanina, m-OMe fenilalanina, p-sulfofenilalanina, o-sulfofenilalanina, m- sulfofenilalanina, 5-nitro His, 3-nitro Tyr, 2-nitro Tyr, Leu nitro substituída, His nitro substituída, De nitro substituída, Trp nitro substituído, 2-nitro Trp, 4-nitro Trp, 5-nitro Trp, 6-nitro Trp, 7-nitro Trp, 3-aminotirosina, 2-aminotirosina, O-sulfotirosina, 2-sulfo-
óxi-fenilalanina, 3-sulfo-óxi-fenilalanina, o-carboxifenilalanina, m-carboxifenilalanina, p-acetil-L-fenilalanina, p-propargil-fenilalanina, O-metila-L-tirosina, L-3-(2- naftil)alanina, 3-metil-fenilalanina, O-4-alil-L-tirosina, 4-propil-L-tirosina, tri-O-acetil- GlcNAcp-serina, L-Dopa, fenilalanina fluorada, isopropil-L-fenilalanina, p-azido-L- fenilalanina, p-acil-L-fenilalanina, p-benzoil-L-fenilalanina, L-fosfosserina, fosfonosserina, fosfonotirosina, p-iodo-fenilalanina, p-bromofenilalanina, p-amino-L- fenilalanina, isopropil-L-fenilalanina ou p-propargilóxi-fenilalanina.
6. Anticorpo anti-AMEP, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido não naturalmente codificado é para-acetilfenilalanina.
7. Conjugado de anticorpo-fármaco, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um anticorpo anti-AMEP humanizado compreendendo uma sequência de cadeia pesada e cadeia leve, de acordo com a reivindicação 1, conjugado a pelo menos um fármaco-ligante selecionado a partir das Tabelas 1 a 3, em que a conjugação ocorre por intermédio de um aminoácido não naturalmente codificado incorporado na sequência de cadeia pesada.
8. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante-fármaco é um agente citotóxico.
9. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente citotóxico é uma dolastatina, derivado de dolastatina ou análogo da mesma.
10. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a dolastatina, derivado ou análogo de dolastatina é uma monometil auristatina selecionada a partir de monometil auristatina F (MMAF) ou monometil auristatina E (MMAE).
11. Conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a monometil auristatina é MMAE ou MMAF clivável, MMAE ou MMAF não clivável, MMAE ou MMAF clivável curta.
12. Método para reduzir ou inibir o crescimento ou progressão do tumor em um câncer ou célula cancerosa que expressa AMEP, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende contatar o câncer ou célula cancerosa que expressa AMEP com uma quantidade eficaz do conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 7.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente contatar o câncer ou célula cancerosa que expressa AMEP com uma quantidade eficaz de um agente terapêutico.
14. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente é um agente quimioterápico, agente hormonal, agente antitumoral, agente imunoestimulante, imunomodulador, corticosteroide ou combinação dos mesmos.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente hormonal é enzalutamida.
16. Método para tratar um indivíduo com um câncer ou célula cancerosa que expressa AMEP, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um conjugado de anticorpo-fármaco para tratar o câncer ou célula cancerosa que expressa AMEP, em que o conjugado de anticorpo- fármaco compreende um anticorpo AMEP compreendendo uma sequência de cadeia pesada e cadeia leve, de acordo com a reivindicação 1, conjugado ao ligante- fármaco por intermédio de um aminoácido não naturalmente codificado incorporado no anticorpo; e em que o ligante-fármaco é selecionado a partir das Tabelas 1 a 3.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, para tratar um indivíduo com doença ou câncer relacionado a AMEP, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende fornecer ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de conjugado de anticorpo anti-AMEP-fármaco e um agente terapêutico.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente terapêutico é um agente quimioterápico, agente hormonal, agente antitumoral, agente imunoestimulante, imunomodulador, corticosteroide ou combinação dos mesmos.
19. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o conjugado de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 7, e pelo menos um adjuvante, aglutinante, tampão, portador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende adicionalmente um agente quimioterápico, agente hormonal, agente antitumoral, agente imunoestimulante, imunomodulador, corticosteroide ou combinação dos mesmos.
21. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADA pelo fato de que é para o uso como um medicamento para tratar câncer em um indivíduo.
22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato de que é para o uso como um medicamento para tratar câncer em um indivíduo.
23. Ácido nucleico, CARACTERIZADO pelo fato de que codifica qualquer uma entre a SEQ ID. NO 1 a 17.
24. Vetor, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 23.
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