JP5784295B2 - 新規分岐状アミノ酸、新規分岐状アミノ酸と蛍光性アミノ酸の複合体 - Google Patents
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Description
1.以下の一般式(1)で示される化合物、その塩もしくはその溶媒和物である、分岐状アミノ酸またはその誘導体。
2.一般式(1)中、R6が一般式(2)により表される、前項1に記載の分岐状アミノ酸またはその誘導体。
3.一般式(1)中、R6が一般式(3)により表される、前項1に記載の分岐状アミノ酸またはその誘導体。
4.一般式(1)中、Raは水素原子および直鎖状の低級アルキル基から選択され、Rbは水素原子または保護基であり、R1、R2、R4は水素原子であり、R3およびR5は各々独立して、水素原子および直鎖状の低級アルキル基から選択される、前項1〜3のいずれか1に記載の分岐状アミノ酸またはその誘導体。
5.一般式(2)および一般式(3)中、Rc〜Rhは各々独立して、水素原子、直鎖状の低級アルキル基および保護基から選択され、R7 〜R 14 およびR 17 〜R20は、水素原子および直鎖状の低級アルキル基から選択され、R 15 およびR 16 は一緒になって=Oを形成する、前項1〜4のいずれか1に記載の分岐状アミノ酸またはその誘導体。
6.一般式(1)中、Raは水素原子であり、Rbは水素原子または保護基であり、R1〜R5は水素原子であり、
一般式(2)および一般式(3)中、Rc〜Rhは保護基であり、R7 〜R 14 およびR 17 〜R20は各々独立して、水素原子および直鎖状の低級アルキル基から選択され、R 15 およびR 16 は一緒になって=Oを形成する、前項1〜5のいずれか1に記載の分岐状アミノ酸またはその誘導体。
7.前項1〜6のいずれか1に記載の分岐状アミノ酸またはその誘導体を製造する方法。
8.前項1〜6のいずれか1に記載の分岐状アミノ酸またはその誘導体と、蛍光性アミノ酸とを含む複合体。
9.蛍光性アミノ酸のアミノ基側および/またはカルボキシル基側に、分岐状アミノ酸が位置している、前項8に記載の複合体。
10.ペプチドもしくはタンパク質を含む、前項8または9のいずれか1に記載の複合体。
11.ペプチドもしくはタンパク質のN末端側もしくはC末端側に、分岐状アミノ酸および蛍光性アミノ酸が位置している、前項10に記載の複合体。
12.ペプチドもしくはタンパク質が、分岐状アミノ酸および蛍光性アミノ酸と、リンカーを介して結合している、前項10または11に記載の複合体。
13.ペプチドもしくはタンパク質が、標的に対して指向性を有するものである、前項10〜12のいずれか1に記載の複合体。
14.ペプチド固相合成法を用いて、前項8〜13のいずれか1に記載の複合体を製造する方法。
15.前項8〜13のいずれか1に記載の複合体である、蛍光複合体。
16.前項15に記載の蛍光複合体を含む、診断用組成物。
また、本発明の分岐状アミノ酸と蛍光性アミノ酸との複合体は、ペプチド固相合成法を用いることにより作製可能であるため、複合体の精製にほとんど時間を要さず迅速に複合体を作製することができる。本発明の複合体では、分岐状アミノ酸が蛍光アミノ酸を取り囲んだような状態となっており、この分岐状アミノ酸の立体障害のため蛍光性アミノ酸が他の材料との接触(吸着)することを物理的に防ぐことが可能である。また本発明の複合体における蛍光性アミノ酸は多様な種類のものを使用可能であり、かつ本発明の複合体から発せられる蛍光は、通常の蛍光検出機器にて検出可能であるため、種々の用途に本発明の複合体を使用することができる。
本発明は、以下の一般式(1)で示される化合物、その塩もしくはその溶媒和物である、分岐状アミノ酸またはその誘導体(以下単に「分岐状アミノ酸」と称することもある)に関する。
さらに好ましくは、一般式(1)中、Raは水素原子および直鎖状の低級アルキル基から選択され、Rbは水素原子または保護基であり、R1、R2、R4は水素原子であり、R3、R5は各々独立して水素原子および直鎖状の低級アルキル基から選択される。
より好ましくは、一般式(1)中、Raは水素原子であり、Rbは保護基であり、R1〜R5は水素原子である。
最も好ましくは、一般式(1)中、Raは水素原子であり、Rbは9−フルオレニルメトキシカルボニル基であり、R1〜R5は水素原子である。
さらに好ましくは、一般式(2)中、Rc、Rdは各々独立して、水素原子または保護基から選択され、R8は水素原子であり、R7、R9は各々独立して水素原子および直鎖状の低級アルキル基から選択される。
より好ましくは、一般式(2)中、Rc、Rdは各々独立して、水素原子または保護基から選択され、R7〜R9は水素原子である。
最も好ましくは、一般式(2)中、Rc、Rdは各々独立して、水素原子またはtert-ブチル基から選択され、R7〜R9は水素原子である。
さらに好ましくは、一般式(3)中、Re〜Rhは各々独立して、水素原子または保護基から選択され、R10、R11、R13 、R 17、R18、R20は水素原子であり、R12、R14 、R 19は各々独立して水素原子および直鎖状の低級アルキル基から選択され、R 15 およびR 16 は一緒になって=Oを形成する。
より好ましくは、一般式(3)中、Re〜Rhは各々独立して、水素原子または保護基から選択され、R10〜R 14 およびR 17 〜R18は水素原子であり、R 15 およびR 16 は一緒になって=Oを形成する。
最も好ましくは、一般式(3)中、Re〜Rhはtert-ブチル基であり、R10〜R 14 およびR 17 〜R18は水素原子であり、R 15 およびR 16 は一緒になって=Oを形成する。
本発明の分岐状アミノ酸は、いかなる製造方法により合成してもよいが、例えば天然アミノ酸であるグルタミン酸とアスパラギン酸の誘導体を原料として、ペプチド固相合成法の反応条件を適宜改変して反応させることにより合成することが可能である。例えば、グルタミン酸の主鎖のカルボキシル基を保護基で保護し、側鎖のカルボキシル基に、アスパラギン酸のアミノ基を結合させることにより、分岐状アミノ酸を合成することが可能である。具体的には、後述の実施例を参照することができる。
本発明は、本発明の分岐状アミノ酸またはその誘導体と、蛍光性アミノ酸とを含む複合体にも及ぶ。分岐状アミノ酸またはその誘導体と、蛍光性アミノ酸とを含む複合体とは、
少なくとも分岐状アミノ酸またはその誘導体と、蛍光性アミノ酸を複合体中に含むものであればよい。複合体中にて、分岐状アミノ酸またはその誘導体と蛍光性アミノ酸とは直接結合していてもよいし、直接結合していなくてもよい。本発明の複合体では、蛍光性アミノ酸のアミノ基側および/またはカルボキシル基側に、好ましくはアミノ基側とカルボキシル基側の両方に、分岐状アミノ酸が位置している。このような構造をとることにより、当該複合体では分岐状アミノ酸が蛍光性アミノ酸を取り囲む構造となる。本発明の複合体において分岐状アミノ酸は、蛍光性アミノ酸に対して、蛍光性アミノ酸の蛍光機能を損なわずに、蛍光性アミノ酸が他の材料と接触することを物理的に防ぐことが可能となるよう位置する必要があり、例えば隣接して位置することが好ましい。
本発明の複合体は、新規分岐状アミノ酸と蛍光性アミノ酸を用いて、公知のペプチド固相合成法により製造することが可能である。分岐状アミノ酸またはその誘導体はかさ高い構造であるにも関わらず、ペプチド固相合成法に使用できるため、本発明の複合体を簡便に製造することが可能である。具体的な製造方法は後述の実施例を参照することが可能である。
本発明の複合体は、蛍光性アミノ酸による非特異的吸着の低減した蛍光性を発揮する蛍光複合体であり、一般的な蛍光物質、蛍光団と同様の用途を有し得る。本発明の複合体は、例えば蛍光性アミノ酸によるゲルろ過材料のゲルなどに対する非特異的吸着性が低減したものである。本発明の複合体は、化合物や細胞等を標識化するための蛍光標識剤として使用することが可能である。さらに本発明の複合体におけるペプチドもしくはタンパク質が標的に対する指向性を有する場合は、標的に対する蛍光プローブとして使用することが可能である。蛍光標識物質や蛍光プローブとしての本発明の複合体は、in vitroもしくはin vivoにおけるアッセイ用もしくは検査用試薬として使用することができる。本発明の複合体と、用途に応じて生理食塩水等の溶液や他の添加剤を含む組成物を、診断用組成物として使用することも可能である。
(1)有機化合物の保護基
Fmoc: 9-フルオレニルメトキシカルボニル基
tBu: tert-ブチル基
Ac: アセチル基
Bzl: ベンジル基
(2)有機試薬
TFA: トリフルオロ酢酸(trifluoroacetic acid)
TIPS: トリイソプロピルシラン(triisopropylsilane)
DIPEA: ジイソプロピルエチルアミン(diisopropylethylamine)
HATU: O-(7-アザベンゾトリアゾル-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)
Pd/C: パラジウム炭素(Palladium carbon)
(3)ペプチド固相合成に用いられる固相樹脂
Fmoc-NH-SAL-PEG-resin: N-α-9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Super Acid Labile polyethyleneglycol handle polystylene
(4)有機溶媒
DMF: N,N'-ジメチルホルムアミド(N,N'-dimethylformamide)
DMSO: ジメチルスルホキシド(dimethylsulfoxide)
(5)蛍光性アミノ酸または複合体内における蛍光性アミノ酸ユニット
Pyr: 3-(1-ピレニル)アラニン(3-(1-pyrenyl) alanine)
Bad: 3-(12-オキソ-5,12-ジヒドロ-ベンゾ[b]アクリジン-2-イル]アラニン(3-(12-oxo-5,12-dihydro-benzo[b]acridin-2-yl]alanine)
Moc: 3-(7-メトキシ-クマリン-4-イル)アラニン(3-(7-methoxy-coumarin-4-yl)alanine)
(6)緩衝溶液調製用試薬
HEPES: 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)
(7)その他
X1〜X8: Cys(システイン)を除く19種類の天然アミノ酸の当量混合物(なお、天然には20種類の天然アミノ酸が存在する。)
本発明の分岐状アミノ酸1および2を合成した。合成経路を図1に示す。
まず、原料であるFmoc-Glu-OBzlとH-Asp(OtBu)-OtBuとを脱水縮合することでFmoc-Glu{Asp(OtBu)-OtBu}-OBzlを得た(収率82%)。次に、得られた化合物を接触水素添加によりBzl基を脱保護することで分岐状アミノ酸1を得た(収率32%)。
分岐状アミノ酸2は、分岐状アミノ酸1の中間体であるFmoc-Glu{Asp(OtBu)-OtBu}-OBzlを原料として、まず、酸によりカルボン酸tert-ブチルエステルを脱保護し、カルボン酸を得た。次に、その化合物を、H-Asp(OtBu)-OtBuとの脱水縮合および接触水素添加により、分岐状アミノ酸2を得た(Fmoc-Glu-OBzlから考えて収率16%)。
分岐状アミノ酸と蛍光性アミノ酸との複合体を含むペプチドは、従来法であるFmocペプチド固相合成法によって作製した。
蛍光性アミノ酸のFmoc体である、Fmoc-Ala(Bad)-OH、Fmoc-Ala(Pyn)-OHは渡辺化学工業株式会社から、Fmoc-Lys(Moc)-OHはBachem社から購入した。Fmoc化された水溶性リンカーから成るアミノ酸はMerck社より購入した。蛍光性アミノ酸のFmoc体の化学構造を図4に示す。その他のペプチド合成に必要な試薬類はいずれも渡辺化学工業株式会社より購入した。Fmoc化された蛍光性アミノ酸および天然アミノ酸はいずれもL体である。
Ac-E-E-Pyr-E-E-G-G-NH2 (E-Pyr)
Ac-1-1-Pyr-1-1-G-G-NH2 (1-Pyr)
Ac-2-2-Pyr-2-2-G-G-NH2 (2-Pyr)
上記ペプチドにおいて、NH2はペプチドのC末端がアミド結合であることを示している。Pyrは9-ピレニルアラニンユニットであり、蛍光性アミノ酸である。
(1)分岐状アミノ酸と蛍光性アミノ酸との複合体を含むペプチドの合成
分岐状アミノ酸による蛍光性アミノ酸とゲルろ過材との吸着を防止する効果を検討するため、図6に記載のペプチドを作製した(E-Pyr-X, 1-Pyr-X, E-Bad-X, 1-Bad-X, E-Moc-Xおよび1-Moc-X)。図6に記載のペプチドは、ランダムなペプチド8量体と、蛍光性アミノ酸、分岐状アミノ酸を結合させたものである。図6中、X1〜X8はいずれもシステインを除く19種類の天然アミノ酸の当量混合物である。ペプチドの合成は、実施例2と同様にペプチド固相合成法により行った。
1-Pyr-X, 1-Bad-Xおよび1-Moc-Xの混合物(それぞれの最終濃度は5 M(300pmol))について、室温で溶出バッファーを50 mM HEPES-NaOH (pH 7.4)として、SuperdexTM 75 prep grade(GEヘルスケアより購入)(カラム体積は0.7 cm (直径) * 20 cm (高さ))を用いて、ゲルろ過を行ない、各フラクションを得た。それぞれのフラクションについて、50%メタノールを含む50 mM HEPES-NaOH (pH 7.4)中で2次元蛍光スペクトルを測定した(日本分光社製 FP-6600)。混合物中のペプチド(蛍光性アミノ酸)のそれぞれの濃度を、各フラクションの2次元蛍光スペクトルの蛍光強度の最小自乗解析により求めた。なお、この解析の際、各々の蛍光性アミノ酸の2次元蛍光スペクトルをコンポーネントスペクトルとした。リファレンスとして、E-Pyr-X, E-Bad-XおよびE-Moc-Xの混合物も同様にゲルろ過を行ない、各フラクションのペプチド(蛍光性アミノ酸)の濃度を求めた。
また本発明の分岐状アミノ酸により蛍光アミノ酸の周囲を分岐鎖で取り囲むことができるため、蛍光性アミノ酸と他の材料との接触を防ぎ、蛍光性アミノ酸の非特異的吸着を防ぐことが可能となる。このようにして合成された分岐状アミノ酸と蛍光性アミノ酸の複合体の蛍光機能は、分岐状アミノ酸で取り囲まれていない蛍光性アミノ酸の蛍光機能と同等である。
本発明の複合体は、例えば生体内でのプローブとして用いることができる。蛍光性アミノ酸を生体内で使用する場合、生体材料などとの非特異的吸着は避けられないが、本発明の複合体を用いることにより非特異的吸着を防止することができる。また、本発明の複合体をプローブとして用いた材料と標的材料との結合物を精製する場合、精製するための担体であるゲルろ過材等との非特異的吸着が防止され、蛍光性アミノ酸自体を用いた場合と比較して収量の低下を防ぐことができると考えられる。
以上説明したとおり、本発明の複合体により、生体外もしくは生体内において標的となる物質、細胞等を検査、標識化、モニタリングすることが可能となり、疾患や病態の診断のみならず、医薬のスクリーニング等を有効に行うことができるようになると期待される。
Claims (8)
- 以下の一般式(1)で示される化合物、その塩もしくはその溶媒和物である、分岐状アミノ酸を含む、ペプチド固相合成法用の試薬。
- 一般式(1)中、R6が一般式(2)により表される分岐状アミノ酸を含む、請求項1に記載のペプチド固相合成法用の試薬。
- 一般式(1)中、R6が一般式(3)により表される分岐状アミノ酸を含む、請求項1に記載のペプチド固相合成法用の試薬。
- 一般式(1)中、R1、R2、R4は水素原子であり、R3およびR5は各々独立して、水素原子および直鎖状の低級アルキル基から選択される分岐状アミノ酸を含む、請求項1〜3のいずれか1に記載のペプチド固相合成法用の試薬。
- 一般式(2)および一般式(3)中、R7〜R14およびR17〜R20は水素原子である分岐状アミノ酸を含む、請求項1〜4のいずれか1に記載のペプチド固相合成法用の試薬。
- 請求項1〜5のいずれか1に記載の分岐状アミノ酸と、蛍光性アミノ酸とを含む複合体であるペプチド。
- 蛍光性アミノ酸と分岐状アミノ酸が直接結合している、請求項6に記載のペプチド。
- 請求項1〜5のいずれか1に記載のペプチド固相合成法用の試薬をペプチド固相合成法に用いて、前記分岐状アミノ酸と、蛍光性アミノ酸とを含む複合体であるペプチドを製造する方法。
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