CN113490678A

CN113490678A - 荧光gtp类似物和用途

Info

Publication number: CN113490678A
Application number: CN202080018205.6A
Authority: CN
Inventors: 洛朗·拉马克; 埃马纽埃尔·布里埃; 托马斯·鲁克斯; 埃里克·特里奎特; 埃洛迪·杜普伊斯
Original assignee: Cisbio Bioassays SAS
Current assignee: Cisbio Bioassays SAS
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2020-01-30
Publication date: 2021-10-08
Also published as: FR3092115A1; EP3917941A1; JP2022523322A; FR3092115B1; US20220144860A1; CA3127857A1; WO2020157439A1

Abstract

本发明涉及式(I)的化合物：

其中X、Y、L和Ln³⁺如说明书中所定义。

Description

荧光GTP类似物和用途

技术领域

本发明涉及通过能量转移技术用于对下述分子进行检测的荧光GTP类似物，所述分子能够调节G蛋白偶联受体的活化。

背景技术

G蛋白-偶联受体(GPCR)是哺乳动物和整个动物界中的膜受体家族。G蛋白是通过GPCR来进行活化的异源三聚体蛋白(3个亚基：α、β和γ)。通过GPCR，G蛋白具有将信号从细胞外部转导到细胞内部的作用(即对外部刺激的细胞反应)。它们通常描述的作用机制如图1所示，总结如下：

-在其非活性、静止状态下，G蛋白的α亚基与核苷酸GDP结合(完全GDP-结合G蛋白，full GDP-bound G protein)；

-GPCR活化后，后者与G蛋白的α亚基结合并启动G蛋白的活化过程，该过程由两个阶段组成：

1)GDP脱离G蛋白，得到空G蛋白，形成无活性的GPCR/空G蛋白复合物，以及

2)GTP的结合导致形成活性G蛋白，呈GTP形式(完全GTP-结合G蛋白)。第一阶段，与受体结合的G蛋白处于称为“空态(empty form)”的形式。据描述，由于核苷酸GTP与G蛋白的α亚基快速结合，因此这种状态在文献中被描述为是短暂的。此外，活化的G蛋白的β/γ亚基与α亚基分离；

-然后，完全GTP-结合G蛋白的α亚基与效应物结合以将它们活化。效应物转而将信号通路活化，导致细胞反应；

-GTP随后通过G蛋白的α亚基水解以产生GDP，并且α亚基与β/γ亚基重新结合以重新形成完全GDP-结合G蛋白(非活性状态)。

存在多种Gα蛋白亚型，它们对不同的效应物表现出不同的选择性特征(Journalof Molecular Biology，2016，428，3850)，从而引起优先信号通路的活化。

GPCR与许多重要的生理功能相关，被认为是许多病理的首选治疗靶点之一。因此，已经开发了许多体外筛查测试，以便识别能够调节GPCR的分子。所开发的测试利用不同的机制来活化G蛋白并采用不同的技术(Zhang等；Tools for GPCR Drug Discovery；ActaPharmacologica Sinica，2012，33，372)。可以特别提及：亲和力测试，该测试使用放射性标记配体来测量配体对GPCR的亲和力；邻近闪烁扫描测试(proximity scintigraphy test)，该测试使用连接了GPCR的闪烁扫描珠；或功能测试，该测试使用弱的或不可水解的GTP，例如GTPγS(GTP-γ-S)。然而，这些测试难以执行，并且有时需要膜过滤阶段，这可能限制它们作为高通量筛选(HTS)测试的使用。已经开发了其它测试来证明GPCR的活化。这些测试特别基于能量转移技术(RET-共振能量转移)，例如FRET(荧光共振能量转移)-参见ClinicalChemistry，1995，41，1391-或BRET(生物发光共振能量转移)-参见Proceedings of theNational Academy of Sciences，1999，96(1)，151。这两种技术涉及能够提供能量的分子(称为供体)或接受能量的分子(称为受体)的概念-参见Physical Chemistry ChemicalPhysics，2007，9，5847。可以提及例如通过使用如下来证明GPCR和G蛋白之间的相互作用的能量转移技术：与GPCR缀合的供体以及与G蛋白缀合的受体(WO 2006/086883和WO 2003/008435)，或与G蛋白的α亚基缀合的受体以及与G蛋白的β和/或γ亚基缀合的供体(Bunemann等，Proceedings of the National Academy of Sciences，2003，26，16077)。然而，这些技术是限制性的，因为它们需要制备融合蛋白，并且它们不能研究细胞内源性表达的GPCR和G蛋白(即未修饰和未过表达)。另一方面，为了区分可被受体活化的Gα蛋白的不同亚型，这些技术需要制备多个膜样品(针对每个Gα蛋白亚型的特定制备物)。能量转移技术也已用于开发旨在对G蛋白的GTP(活性)形式或G蛋白的GDP(非活性)形式的调节进行可视化的测试。可以提及例如申请WO 2006/035208和US 2007/0287162，其中使用了与花青型分子偶联的GTP类似物。

申请WO 2009/068751描述了一种使用标记的ATP衍生物检测能量转移信号的方法；然而，这些衍生物不能与G蛋白结合。GTP类似物在期刊Drug Discovery Today，2002，7(18)，S150中有所描述，可用于时间分辨荧光检测技术。该类似物由铕螯合物组成，所述铕螯合物通过氮原子与GTPγ位的磷酸酯原子偶联。然而，铕螯合物的结构没有公开，也没有公开用于合成所讨论的类似物的方法。另一种GTP类似物在Analytical Chemistry，2009，81，5033中有所描述，其引起γ-[(8-氨基辛基)酰亚胺]鸟苷-5'-三磷酸盐/酯与{2,2',2”,2”'-{[[2-(4-异硫氰酸苯基)-乙基]亚氨基]双(亚甲基)双{4-{[4-(R-D-吡喃葡萄糖氧基)苯基]乙炔基}吡啶-6,2-二基}双(亚甲基次氮基)}四(乙酸)}铕(III)的偶联，其合成已在Analytical Chemistry，2003，75，3193中有所描述。

因此，确实需要能够与G蛋白结合的可用化合物，并且该化合物可实际上用在通过能量转移技术来检测下述分子的方法中，所述分子能够调节G蛋白偶联受体的活化。

发明内容

本发明的一个目的是提供新的GTP分子或其衍生物，其与镧系元素配合物偶联并由通式(I)表示：

其中：

X＝O、NH或CH₂；

Y＝O、NH或CH₂；

L是二价连接基团；

Ln³⁺是可以任选地带有反应性基团G₃的镧系元素配合物(定义如下)；

可以理解的是，当X代表NH且L-Y代表辛氨基基团时，Ln³⁺不是{2,2',2”,2”'-{[[2-(4-异硫氰酸苯基)-乙基]亚氨基]双(亚甲基)双{4-{[4-(R-D-吡喃葡萄糖氧基)苯基]乙炔基}吡啶-6,2-二基}双(亚甲基次氮基)}四(乙酸)}铕(III)({2,2′,2″,2″′-{[[2-(4-isothiocyanatophenyl)ethyl]imino]bis(methylene)bis{4-{[4-(R-D-glucopyranoxy)phenyl]ethynyl}pyridine-6,2-diyl}bis(methylenenitrilo)}tetrakis(acetato)}europium(III))。

附图说明

图1说明了G蛋白的作用机制。

图2说明了用于检测本发明化合物与G蛋白结合的分析形式。

图3说明了将本发明的化合物与Gαi蛋白结合的测试。

图4说明了将本发明的化合物与Gαi蛋白结合的测试。

图5说明了将本发明的化合物与Gαi蛋白结合的测试。

图6说明了将本发明的化合物与Gαi蛋白结合的测试。

图7说明了将本发明的化合物与Gαi蛋白结合的测试。

图8说明了将本发明的化合物与Gαi蛋白结合的测试。

图9说明了将本发明的化合物与Gαi蛋白结合的测试。

图10说明了将本发明的化合物与Gαi蛋白结合的测试。

图11A和图11B说明了膜和测试化合物的浓度对所述化合物与Gαi蛋白结合的影响。

图12说明了将本发明的化合物与Gαi蛋白结合的测试。

具体实施方式

根据一个方面，本发明涉及式(I)的化合物：

其中：

X＝O、NH或CH₂；

Y＝O、NH或CH₂；

L是二价连接基团；

Ln³⁺是镧系元素配合物，其可以任选地带有反应性基团G₃(定义如下)；

条件是，当X代表NH且L-Y代表辛氨基基团时，Ln³⁺不是{2,2',2”,2”'-{[[2-(4-异硫氰酸苯基)-乙基]亚氨基]双(亚甲基)双{4-{[4-(R-D-吡喃葡萄糖氧基)苯基]乙炔基}吡啶-6,2-二基}双(亚甲基次氮基)}四(乙酸)}铕(III)。

术语“镧系元素配合物”应理解为是指能够与镧系元素家族原子配合的螯合物、大环化合物、穴状化合物或任何有机实体，镧系元素(Ln)选自：Eu、Sm、Tb、Gd、Dy、Nd或Er；优选地，镧系元素是Tb、Sm或Eu，更优选地是Eu或Tb。

式(I)的各种化合物的家族由式(Ia)至式(Ig)表示：

其中，L和Ln³⁺具有上述含义。

根据本发明的第一家族的化合物由式(Ia)、式(Id)和式(If)的化合物组成。该家族称为GTP-γ-O家族(因为二价连接基团通过氧原子与GTP的γ位的磷酸酯键合)。根据本发明的第二家族的化合物由式(Ib)、式(Ie)和式(Ig)的化合物组成。该家族称为GTP-γ-N家族(因为二价连接基团通过氮原子与GTP的γ位的磷酸酯键合)。本发明的第三家族的化合物由式(Ic)化合物组成。该家族称为GTP-γ-C家族(因为二价连接基团通过碳原子与GTP的γ位的磷酸酯键合)。

在一个实施方式中，X是O。在另一个实施方式中，X是NH。在另一个实施方式中，X是CH₂。

在一个实施方式中，二价连接基团L选自：

-直接连接；

-直链或支链的C₁-C₂₀、优选C₁-C₈亚烷基基团，所述亚烷基基团任选地含有一个或多个双键或三键；

-C₅-C₈亚环烷基基团；或

-C₆-C₁₄亚芳基基团；

所述亚烷基、亚环烷基或亚芳基基团任选地含有一个或多个杂原子(例如氧、氮、硫或磷)、或一个或多个氨基甲酰基或酰胺基基团，并且所述亚烷基、亚环烷基或亚芳基基团任选地由1至5个、优选1至3个C₁-C₈烷基、C₆-C₁₄芳基、磺酸盐/酯(sulfonate)或氧代(oxo)基团取代。

二价连接基团L有利地选自以下基团：

其中，n、m、p和q是1至16、优选1至5的整数，e是1至6、优选1至4的整数。

在特别有利的方式中，二价连接基团L选自直接连接、直链或支链C₁-C₈亚烷基基团或下式的基团：

二价连接基团L优选选自：

-(CH₂)_n-；-(CH₂)_n-O-(CH₂)_m-O-(CH₂)_p-；

-(CH₂)_n-基团是非常特别优选的。

根据另一个实施方式，二价连接基团L是下式的基团：

其中，m、n和p是1至16、优选1至5的整数。

在一个实施方式中，镧系元素配合物Ln³⁺选自以下配合物中的一种：

取决于pH，-SO₃H、-CO₂H和-PO(OH)₂基团处于或未处于去质子形式。因此，这些基团也表示-SO₃ ^-、-CO₂ ^-和-PO(OH)O^-基团。

有利地，镧系元素配合物Ln³⁺选自配合物C1至C17、C24至C32和C36至C44中的一种。更有利地，镧系元素配合物Ln³⁺选自配合物C1至C17和C36至C44中的一种。进一步有利地，镧系元素配合物Ln³⁺选自配合物C1至C17中的一种。进一步有利地，镧系元素配合物Ln³⁺选自配合物C1至C4和C11至C17中的一种。进一步有利地，镧系元素配合物Ln³⁺选自配合物C1至C4和C11中的一种。完全有利地，镧系元素配合物Ln³⁺是配合物C2或配合物C3。

镧系元素配合物C1至C90描述于以下出版物中。这些配合物可商购获得或可通过所述出版物中描述的合成途径获得。

C1：WO 03/076938

C2：EP-A-0 203 047

C3-C4：WO 2008/025886

C5：Spectrochimica Acta；Part A，Molecular and BiomolecularSpectroscopy，2001，57(11)，2197.

C6：Spectrochimica Acta；Part A，Molecular and BiomolecularSpectroscopy，2001，57(11)，2197.

C7：Analytical Biochemistry，2000，286(1)，17.

C8：WO 01/96877

C9：Spectrochimica Acta：Part A，Molecular and BiomolecularSpectroscopy，2001，57(11)，2197.

C10：WO 01/96877

C11：WO 2008/063721

C12-C17：WO 2017/098180.

C18-C20：WO 2013/011236

C21-C35：WO 2014/111661

C36-C44：WO 2018/229408

C45-C47：Organic&Biomolecular Chemistry，2012，10，8509.

C48：WO 2010/084090

C49：WO 2009/010580

C50-C51：Chemical Communications，2007，3841

C52：WO 2006/120444

C53：European Journal of Inorganic Chemistry，2010，3961.

C54：Bioconjugate Chemistry，2009，20(3)，625.

C55：EP-A-0 770 610

C56：WO 2016/106241

C57-C58：EP-A-0 770 610

C59-C60：Analytical Chemistry，2003，75，3193-3201

C61：Bioconjugate Chemistry，1997，8(2)，127

C62：WO 93/11433

C63：US5696240

C64a-C81b：WO 2018/22932

C82：WO 2010/070232

C83-C85：WO 2018/045385

C86a-b：Analyst，2010，135(1)，42

C87-C89：Chemistry-A European Journal，2011，17.9164

C90：Journal of the American Chemical Society，2004，126(15)，4888

式(I)的化合物的合成更详细地描述在下面的方案1至方案19中。通常，这些化合物是通过基于使用反应性基团的两个有机分子的缀合技术获得的，这些技术属于本领域技术人员的公知常识，并且被描述于例如Bioconjugate Techniques，G.T.Hermanson，Academic Press，第二版，2008，pp.169-211中。为了获得GTP-γ-O化合物，首先使GTP与式G₂-L-G₁的化合物反应，并将由此形成的中间体化合物与镧系元素配合物缀合。

在该式中，G₂-L-G₁：

L是如上定义的二价连接基团；

G₁是反应性亲电基团，其能够与GTP的γ位的磷酸酯的OH官能团反应；

G₂是反应性基团，其能够与镧系元素配合物Ln³⁺所携带的反应性基团(G₃)反应。

中间体化合物(包含反应性基团G₂)和镧系元素配合物(包含反应性基团G₃)之间的缀合反应使得形成共价键，所述共价键含有反应性基团的一个或多个原子。

在一个实施方式中，亲电基团G₁是：

-由反应物活化的OH基团，其以中间体的方式形成反应实体，该反应实体可以与γ位磷酸酯的羟基官能团反应，

-或离去基团类型的反应性基团，例如脂肪族氯化物、脂肪族溴化物、脂肪族碘化物、脂肪族甲磺酸酯、脂肪族甲苯磺酸酯、脂肪族三氟甲磺酸酯等。

在一个实施方式中，反应性基团G₂和G₃彼此独立地选自以下基团中的一种：丙烯酰胺、任选活化的胺(例如尸胺或乙二胺)、活化的酯、醛、卤代烷、酸酐、苯胺、叠氮化物、氮丙啶、羧酸、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪(如一氯三嗪或二氯三嗪)、肼(包括酰肼)、亚胺酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、磺酰卤化物、硫醇、酮、酰卤、琥珀酰亚胺酯、羟基琥珀酰亚胺酯、羟基磺基琥珀酰亚胺酯、叠氮硝基苯基、叠氮苯基、3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺、乙二醛、三嗪、炔基基团、特别是选自下式的基团：

其中，w的范围为0至8，v等于0或1，并且Ar是任选地由卤素原子取代的、包含1至3个杂原子的饱和或不饱和5-元或6-元杂环。

G₂和G₃可以源自它们的由相容的保护基团保护的形式。

优选地，反应性基团G₂和G₃彼此独立地选自胺(任选地以-NHBoc形式保护)、琥珀酰亚胺酯、羟基琥珀酰亚胺酯、卤代乙酰胺、肼、卤代三嗪、异硫氰酸酯、马来酰亚胺基团或羧酸(任选以-CO₂Me或-CO₂tBu基团的形式保护)。在后一种情况下，酸必须以酯的形式活化，以便能够与亲核实体反应。

为了获得GTP-γ-N化合物，当镧系元素配合物具有NH₂基团时，GTP可以直接与镧系元素配合物反应。GTP还可以与式₂HN-(CH₂)_n-NH₂的化合物反应，其中n如上所定义，并且氨基中的一个任选地由保护基团保护，然后得到的中间体化合物可以与由如上定义的反应性基团G₃官能化的镧系元素配合物偶联。

本发明的化合物能够结合G蛋白。通过在一对FRET配偶体(该FRET配偶体由根据本发明的化合物和标记有受体荧光团的抗Gα蛋白抗体组成)的存在下对包含GPCR和Gα蛋白的膜制备物进行孵育，通过基于FRET原理的免疫分析法，对这一性质进行了证明。在存在或不存在不可水解或可缓慢水解的GTP类似物(例如GTPγS)的情况下进行孵育。当FRET对的配偶体与相同的Gα蛋白结合时，会出现FRET信号，从而证明本发明的化合物与Gα蛋白的结合。因此，本发明的化合物可有利地用于通过FRET技术识别能够对G蛋白偶联受体的活化进行调节的分子。

合成

与镧系元素配合物在γ位偶联的GTP的合成描述在方案1至方案19中。

GTP-γ-O(GTPγO)家族化合物的合成

化合物2(其是本发明化合物(镧系元素配合物GTP)的前体)可以通过本领域技术人员已知的以下方案来合成。从可商购获得的GTP开始，通过GTP与连接基团(其在α位有离去基团(I、Br、甲磺酰基、甲苯磺酰基)且在其ω位有保护的氨基基团)之间的亲核取代，将连接基团“L1”引入GTP的γ位，从而得到化合物1。当P＝CBz或COCF₃(参见WO 2009/105077或WO 2009/091847)时，可获得类似的偶联实例。使用对应于保护基团的脱保护条件去除保护基团(参见WO 2009/014612)。然后，使用本领域技术人员已知的常规方法，使化合物2通过酰胺键与镧系元素配合物共价偶联(方案1)。

GTPγO系列(有保护基团)

方案1

在GTP的γ位偶联镧系元素配合物的另一替代方法是使用“点击化学”。为此，首先需要引入叠氮基团(方案2)或炔基基团(方案3)。如上所述，这些基团是通过连接基团L2或L3与GTP之间的亲核取代反应引入的(方案2和方案3)。例如Hacker等描述了核苷酸和连接基团之间偶联的实例(The Journal of Organic Chemistry，2012，77(22)，17450)。

GTPγO系列(叠氮选项)

方案2

GTPγO系列(炔选项)

方案3

相反地，炔基基团可以在第一阶段引入到GTP上，产生系列6的化合物。与其它核苷酸偶联的实例可在文献(Journal of the American Chemical Society，2003，125，9588)中获得。然后，可以用以叠氮化物形式官能化的镧系元素配合物进行环加成反应，以产生化合物CLn³⁺-7a-d。

GTP-γ-N家族化合物的合成

以与GTP-γ-O家族相同的方式，GTP-γ-N化合物可以根据类似的策略制备。将NH₂-官能化的镧系元素配合物直接缩合到GTP分子上，无需插入接头(方案4)。

直接GTPγN系列

方案4

可使用已经包含之前引入的末端NH₂连接基团的GTP-γ-N分子9a-e，对镧系元素配合物进行偶联。

引入二氨基接头的GTPγN系列

方案5

为了避免使用多个当量的二氨基连接基团，将官能团中的一个保护，例如由Cbz或三氟乙酸酯(COCF₃)基团进行保护。随后将保护基团去除(在避免GTP的化学水解的条件下进行)，从而产生相同的化合物9a-e，使用本领域技术人员已知的常规技术将镧系元素配合物偶联至该化合物(方案6)。

GTPγN系列(有保护基团)

方案6

GTP-γ-C家族化合物的合成

GTP-γ-C系列是通过GDP(二磷酸鸟苷)与膦酸的缩合而合成的，膦酸的末端位置可以用不同的方式取代。当末端位置是经保护的(三氟乙酰胺15a-f或CBz 16a-f)胺官能团时，使用文献(EP0959077(TFA)；WO 2012/150866和The Journal of Organic Chemistry，1984，49，1158(Cbz))中描述的方法制备这些化合物。在第一阶段，使N-邻苯二甲酰亚胺基烷基溴化物(12a-f)与亚磷酸三乙酯缩合，随后用肼处理以使胺官能团脱保护。膦酸乙酯在氢溴酸的存在下水解得到化合物14a-f。通过CBz或三氟乙酰胺对伯胺官能团进行保护，以防止在与GDP的偶联反应期间发生自缩合反应。该反应顺序可以得到中间体化合物15a-f和16a-f。

方案7

除了引入掩蔽的伯胺官能团之外，还可以使用可用的GTP-γ-C，其接头的末端部分是炔属单元。该官能团可以在炔属GTP-γ-C和带有可用于偶联反应的叠氮化物官能团的镧系元素配合物之间进行“点击化学”反应。方案8简要描述了根据文献(BioorganicMedicinal Chemistry，2018，26，191和Angewandte Chemie International Edition，2011，50，10699)中可用的方案制备的各种中间体。将商购的炔属烷基溴衍生物与三甲基硅基亚磷酸酯缩合，然后水解产生18a-f系列。

方案8

为了在GTP-γ-C化合物的接头上引入能够进行生物缀合的官能团，另一种选择是可能的。在该方法中，使用方案9中描述的顺序将叠氮基团引入到膦酸上。在文献例如Chemistry，A European Journal，2010，16，12718，Langmuir，2010，26，10725中，或者实际上还在The Journal of Organic Chemistry，2012，77，10450中，对该方案进行了描述。二溴化衍生物与亚磷酸三乙酯反应生成化合物20a-f。随后通过与叠氮化钠的简单亲核取代，引入叠氮官能团。随后在TMS-Br的存在下将二酯水解，产生衍生物22a-f。

方案9

化合物15a-f、16a-f、18a-f或22a-f与镧系元素配合物的偶联使用本领域技术人员已知的常规技术进行(方案10至方案13)。

方案10

方案11

方案12

方案13

以与GTP相同的方式，可以使用相同的合成策略，使类似物GPPNHP(商购，CAS：64564-03-0)在γ位与镧系元素配合物偶联。对于在γO处取代的衍生物，合成描述于例如方案14中。对于在γN处取代的衍生物，合成描述于方案15和方案16中。这些偶联也已在使用ATP类似物的申请WO 2009/068751中进行了举例说明。

GPPNHPγO系列(有保护基团)

方案14

GPPNHPγNH系列(有保护基团)

方案15

直接GPPNHPγN系列

方案16

以与GTP相同的方式，可以使用相同的合成策略，使GPPCH₂P类似物(商购，CAS：13912-93-1或10470-57-2，Na盐形式)在γ位与镧系元素配合物偶联。对于在γO处取代的衍生物，合成描述于例如方案17中。对于在γN处取代的衍生物，合成描述于方案18和方案19中。这些偶联也已在使用ATP类似物的申请WO 2009/068751中进行了举例说明。

GPPCH₂PγO系列(有保护基团)

方案17

GPPCH₂PγNH系列(有保护基团)

方案18

直接GPPCH₂PγN系列

方案19

本发明通过以下实施例来说明，所述实施例以说明的方式给出。

使用的缩写

BRET：生物发光共振能量转移

BSA：牛血清白蛋白

DMSO：二甲基亚砜

EDC：N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺

eq：当量

ESI+：正电喷雾电离模式

FRET：福斯特共振能量转移(

Resonance Energy Transfer)

GDP：二磷酸鸟苷

GPCR：G蛋白偶联受体

GTP：三磷酸鸟苷

GTPγS：5'-[γ-硫代]三磷酸鸟苷

h：小时

HEPES：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸

HPLC：高效液相色谱

LC-MS：与质谱联用的高效液相色谱

LRMS：低分辨率质谱

MES：2-(N-吗啉代)乙磺酸

MOPS：3-吗啉代-1-丙磺酸

NCS：异硫氰酸酯

NHS：N-羟基琥珀酰亚胺

Py：吡啶

GPCR：G蛋白偶联受体

AT：环境温度

TEA：三乙胺

TRIS：三羟甲基氨基甲烷

UPLC：超高效液相色谱

UPLC-MS：与质谱联用的超高效液相色谱

UV：紫外线

色谱

分析和制备型高效液相色谱(HPLC)程序在两个设备上进行：

分析型HPLC：ThermoScientific，P4000四元泵，具有氘灯(190-350nm)的UV 1000检测器，Waters XBridge C₁₈，3.5μm，4.6×100mm，分析柱。

制备型HPLC：Shimadzu、2个LC-8A泵，Varian ProStar二极管阵列UV检测器、Waters XBridge prep.C₁₈，5μm：19×100mm或50×150mm，制备柱。

分析型超高效液相色谱(UPLC)程序在Waters Acquity HClass设备上进行，检测器为PDA型二极管阵列UV检测器或SQD2型单四极杆质量检测器。使用的探针是正电模式的电喷雾：毛细管电压为3.2kV-锥电压为30V。

梯度A Waters Xbridge C₁₈，5μm，10×100mm，柱，A/水25mM三乙基乙酸铵pH 7-B/乙腈–t＝0至5min 1％B-t＝10min 10％

B-20ml.min^-1，在260nm处。

梯度B

Waters Xbridge C₁₈，5μm，4.6×100mm柱，A/水25mM三乙基乙酸铵pH 7-B/乙腈–t＝0至2min 2％B–t＝19min 40％B-1ml.min^-1。

梯度C

Waters Xbridge C₁₈，3.5μm，4.6×100mm，柱–A/水5mM乙酸铵pH 5-B/乙腈t＝0min2％B–t＝1min 2％B-t＝15min 40％B–1ml.min^-1。

梯度D

Waters Xbridge C₁₈，5μm，19×100mm，柱–A/水5mM乙酸铵pH 6.6-B/乙腈t＝0min2％B–t＝2.5min 2％B–t＝27min 40％B–12ml.min^-1，在280nm和320nm处。

梯度E

Waters Xbridge C₁₈，5μm，19×100mm，柱-A/水25mM三乙基乙酸铵pH 7-B/乙腈t＝0min 2％B–t＝2min 2％B–t＝20min 50％B–20ml.min^-1，在280nm和320nm处。

梯度F

Waters Acquity C₁₈，

1.7μm，2.1×50mm，柱-A/水5mM乙酸铵pH 5-B/乙腈t＝0min 2％B–t＝0.2min 2％B–t＝5min 40％B-0.6ml.min^-1。

梯度G

Waters Xbridge C₁₈，

5μm，10×100mm，柱-A/水25mM三乙基乙酸铵-B/乙腈t＝0min 2％B–t＝19min 20％B-5ml.min^-1。

梯度H

Waters Xbridge C₁₈，5μm，4.6×100mm，柱，A/水25mM三乙基乙酸铵pH 7-B/乙腈-t＝0至2min 2％B–t＝19min 50％B–1ml.min^-1。

梯度I

Waters Xbridge C₁₈，5μm，10×100mm，柱-A/水25mM三乙基乙酸铵pH 7-B/乙腈t＝0min 2％B–t＝2min 2％B–t＝27min 50％B-3.5ml.min^-1，在280nm处。

梯度J

Waters Xbridge C₁₈，5μm，19×100mm，柱–A/水25mM三乙基乙酸铵–B/乙腈t＝0min5％B-t＝17min 45％B–20ml.min^-1。

梯度K

Waters Xbridge C₁₈，

5μm，10×100mm，柱–水25mM三乙基乙酸铵-B/乙腈t＝0min 2％B–t＝19min 40％B-5ml.min^-1。

化合物的制备

制备1：GTPγ-N-戊基-NH₂(9c)

将EDC(40mg；210μmol，11eq)和pH 8的处于MOPS中的尸胺(58mg，573μmol，30eq)的溶液添加到含有GTP(10mg；19.1μmol，1eq)水溶液(500μL)的圆底烧瓶中。反应混合物在AT下搅拌过夜，然后通过制备型HPLC(梯度A)纯化。得到对应于化合物9c的白色固体(5mg)。(ESI+)：计算C₁₅H₂₈N₇O₁₃P₃[M+H]⁺，m/z＝608.10，实测608.55。

制备2：GTPγ-O-己基-C2

将在DMSO(200μL)溶液中以其NCS(异硫氰酸酯)形式(473μg，700nmol)官能化的配合物C2一次性加入到化合物2c(0.454mg，700nmol)在100mM碳酸盐缓冲液(pH9，500μL)的溶液中。混合物在AT下搅拌过夜。反应的进程通过HPLC(梯度B)和UPLC-MS(梯度C)监测；在这段时间后，反应完成。通过半制备型HPLC(梯度D)直接纯化反应混合物以得到白色粉末形式的化合物GTPγ-O己基-C2(125μg，96nmol，14％)。LRMS(ESI+)：计算C₄₀H₄₇EuN₁₀O₂₂P₃S^-[M+3H]²⁺，m/z＝650.06，实测650.32。

制备3：GTPγ-O-己基-C3

将在100mM碳酸盐缓冲液(pH9，200μL)中以其二氯三嗪形式(0.647mg，708nmol)官能化的配合物C3一次性加入到化合物2c(0.442mg，710nmol)在100mM碳酸盐缓冲液(pH9，200μL)的溶液中。混合物在4℃下搅拌过夜。反应的进程通过UPLC-MS(梯度C)监测；在这段时间后，反应完成。通过制备型HPLC(梯度E)直接纯化反应混合物以得到白色粉末形式的化合物GTPγ-O-己基-C3(0.11mg，70nmol，10％)。LRMS(ESI+)：计算C₅₀H₅₃ClEuN₁₅O₂₂P₃ ^-[M+3H]²⁺，m/z＝749.59，实测750.29。

制备4：GTPγ-N-C2

将配合物C2(0.366mg，2μmol)溶解在500mM MES缓冲液(pH5.5，150μL)中，得到黄色溶液。将GTP(1.32mg，2.4μmol)以及随后的EDC(1.92mg，10μmol)一次性加入到反应混合物中。混合物在AT下搅拌40h。反应的进程通过UPLC-MS(梯度F)监测；在这段时间后，反应是部分的，不再进行。反应混合物通过制备型HPLC(梯度G)直接纯化以得到无色油状物形式的GTPγ-N-C2(60nmol，3％)。LRMS(ESI+)：计算C₃₃H₃₄N₉O₂₁P₃Eu^-[M]^-，m/z＝1137.6，实测1138.2。

制备5：GTP-γ-N-C3

将配合物C3(0.366mg，480nmol)溶解在500mM MES缓冲液(pH5.5，150μL)中，得到黄色溶液。将GTP(0.317mg，576nmol)以及随后的EDC(0.460mg，2.4μmol)一次性加入到反应混合物中。混合物在AT下搅拌过夜。反应的进程通过UPLC-MS(梯度F)监测；在这段时间后，反应是部分的，不再进行。反应混合物通过制备型HPLC(梯度G)直接纯化以得到无色油状物形式的GTPγ-N-C3(45.6nmol，9.5％)。LRMS(ESI+)：计算C₄₁H₄₀N₁₁O₂₁P₃Eu^-[M+2H]⁺，m/z＝1269.7，实测1269。

制备6：GTP-γ-N-辛基-C2

将化合物9e(50.0μL，500nmol)溶解在水(100μL)中。将吡啶(300μL)和三乙胺(6μL)加入到反应混合物中。将反应混合物一次性加入到含有以其NCS(异硫氰酸酯)形式(0.438mg，650nmol)官能化的配合物C2的管中。混合物在24℃下搅拌12h。反应的进程通过UPLC-MS(梯度F)监测；在这段时间之后，反应是部分的。反应混合物通过制备型HPLC(梯度G)直接纯化以得到无色油状物形式的GTP-γ-N-辛基-C2(16.9nmol，3.4％)。LRMS(ESI+)：计算C₄₂H₅₂N₁₁O₂₁P₃SEu^-[M+3H]²⁺，m/z＝663.5，实测663.9。

制备7：GTP-γ-N-辛基-C3

将在水(200μL)溶液中以其二氯三嗪形式(400μg，438nmol)官能化的配合物C3一次性加入到化合物9e(0.545mg，840nmol)的在100mM碳酸盐缓冲液(pH9，500μL)中的溶液中。混合物在20℃下搅拌过夜。反应的进程通过HPLC(梯度H)和UPLC-MS(梯度C)监测。在这段时间后，反应完成。反应混合物通过半制备型HPLC(梯度I)直接纯化以得到白色粉末形式的化合物GTPγ-N辛基-C3(7.6μg，5nmol，1％)。LRMS(ESI+)：计算C₅₂H₅₈ClEuN₁₆O₂₁P₃ ^-[M+3H]²⁺，m/z＝763.11，实测763.29。

制备8：GTP-γ-N-己基-C11

将在无水DMSO(122μL)溶液中的以NHS酯形式(1.47mg，1μmol)官能化的配合物C11一次性加入到化合物9d(0.62mg，1μmol)的在50mM HEPES缓冲液(pH8，900μL)中的溶液中。混合物在24℃下搅拌1h。反应的进程通过UPLC-MS(梯度F)监测；在这段时间后，反应完成。反应混合物通过制备型HPLC(梯度J)直接纯化以得到白色粉末形式的化合物GTP-γ-N-己基-C11(0.52mg，258nmol，26％)。LRMS(ESI+)：计算C₈₀H₁₀₉N₂₀O₂₇P₃Tb³⁺[M-H]²⁺，m/z＝1018.9，实测1019.6，[M+2Na⁺-3H]²⁺，m/z＝1040.8，实测1041.6。

制备9：GTP-γ-N-辛基-C11

将在无水DMSO(102μL)溶液中的以NHS酯形式(0.76mg，500nmol)官能化的配合物C11一次性加入到化合物9e(0.32mg，500nmol)在50mM HEPES缓冲液(pH8，300μL)中的溶液中。混合物在24℃下搅拌1h。反应的进程通过UPLC-MS(梯度F)监测；在这段时间后，反应完成。反应混合物通过制备型HPLC(梯度K)直接纯化以得到白色粉末形式的化合物GTP-γ-N-辛基-C11(0.22mg，105nmol，21％)。LRMS(ESI+)：计算C₈₂H₁₁₇N₂₀O₂₇P₃Tb³⁺[M-2H]⁺，m/z＝2064.8，实测2064.1。

制备10：GTP-γ-N-辛基-硫代琥珀酰亚胺-C2

将化合物9e(0.649mg，1μmol)的水(100μL)溶液稀释到50mM HEPES缓冲液(pH8，757μL)中，得到无色溶液。将以其NHS形式(N-羟基琥珀酰亚胺酯)(750μL，1μmol)官能化的配合物C2的无水DMSO(143μL)溶液一次性加入到反应混合物中。反应在25℃下搅拌1h。反应的进程通过UPLC-MS(梯度B)监测。在这段时间之后，反应没有完成。尽管如此，反应混合物仍通过制备型HPLC(梯度E)纯化两次。收集对应于预期产物的级分，然后在减压下浓缩以得到无色溶液形式的化合物GTP-γ-N-辛基-硫代琥珀酰亚胺-C2(0.241μmol，24％)。LRMS(ESI+)：计算C₅₁H₆₈EuN₁₃O₂₄P₃S₂ ⁺[M+H]⁺，m/z＝1555.8，实测1555.8。

结合测试

材料

-表达GPCR和G-α-i蛋白(Gαi)的细胞的膜制备物购自Perkin Elmer或Euroscreen。下表列出了所用的不同样品的细胞背景和参考：

[表1]

	细胞背景	提供者	参考
				Delta Opioid	HEK293	Perkin Elmer	6110549400UA
Delta Opioid	CHO-K1	Euroscreen	Service
				Dopamine D2S	CHO-K1	Euroscreen	Service

-DSV36S抗体由Cisbio Bioassays生成，可应要求从Cisbio Bioassays获得(参考DSV36S)。用与TR-FRET检测相容的荧光探针d2(红色受体)标记抗体。DSV36S抗体在Gαi蛋白的开关II处结合。

-GTP和GTPγS核苷酸购自Sigma Aldrich(各自的目录参考G8877和G8634)。

-白色背景的384孔小体积白板购自Greiner Bio One(目录参考784075)。

-在Cisbio Bioassays合成了用镧系元素配合物类型的供体荧光团标记的不可水解/可缓慢水解的GTP类似物。

方法

试剂的制备

除了其它具体提及之外，将所有试剂均稀释在50mM Tris HCl pH 7.4、10mMMgCl₂、0.1％BSA、10mM NaCl缓冲液中。将膜制备为4X，以分配1μg/孔或10μg/孔(在每个图的图例中指定的量)。将GTPγS核苷酸(非特异性信号条件)制备为6.67X，以在孔中获得100μM的最终浓度。将用于检测的抗-Gαi抗体DSV36S-d2制备为4X，以在孔中达到10nM的最终浓度。将用荧光供体探针(镧系元素配合物)标记的不可水解/可缓慢水解的GTP类似物制备为4X，以在孔中达到每个图的图例中提及的最终浓度。

384孔板中试剂的分布：

-表达GPCR和G蛋白的膜：5μL

-GTPγS缓冲液或核苷酸(用于非特异性信号条件)：3μL

-不可水解/可缓慢水解的GTP类似物-供体：5μL

-抗Gαi抗体-受体(DSV36S-d2)：5μL

-缓冲液：2μL

用含有过量GTPγS(10μM或100μM)的孔对非特异性信号(背景荧光噪声)进行测量。

读取HTRF信号

将板在21℃下孵育20h，然后在具有以下配置的PHERAstar读数器(BMG Labtech)上测量HTRF信号：

-模块：HTRF(激发337nm，发射665nm和620nm)

-激发：激光，40次闪光或灯，100次闪光

-读取窗口：延迟：60μs-集成：400μs

信号处理

根据665nm和620nm处的原始信号，由以下公式计算HTRF比：

HTRF比＝[(665nm处的信号)/(620nm处的信号)]×10000

测试形式

图2说明了用于检测式(I)的化合物与G蛋白结合的测试形式。在测试化合物和标记有受体荧光团的抗Gα蛋白抗体的存在下，在不可水解或可缓慢水解的GTP类似物(典型地，GTPγS)的存在或不存在下，对含有GPCR和Gαi蛋白的膜制备物进行孵育。当两个FRET配偶体(测试化合物和抗Gα蛋白抗体)与相同的Gα蛋白结合时，会出现FRET信号(图中左部：“总信号”)，并与包含大量过量的未标记的GTPγS(荧光GTP类似物的置换)的非特异性信号(对应于图的右部的背景噪声：“非特异性信号”)区分开来。

实施例1-GTPgN-C2类似物结合测试

使用表达Delta Opioid GPCR和Gαi蛋白的CHO-K1细胞的膜制备物(每孔10μg)证明了GTPgN-C2(制备物2)/抗Gαi抗体DSV36S-d2对通过与G蛋白结合而产生特异性的TR-FRET信号的能力。在孔中以6nM的最终浓度使用GTPgN-C2。在不存在或存在大量过量GTPγS(100μM)的情况下，对膜进行孵育。这两个条件之间观察到的在TR-FRET信号上的差异(HTRF比，总信号/非特异性信号＝16.6)显示，GTPgN-C2类似物能够与Gαi蛋白结合并与抗Gαi抗体-受体产生TR-FRET信号(图3)。

实施例2-GTPgN-C3类似物结合测试

使用表达Delta Opioid GPCR和Gαi蛋白的HEK293细胞的膜制备物(每孔1μg)证明了GTPgN-C3(制备物5)/抗Gαi抗体DSV36S-d2对通过与G蛋白结合而产生特异性的TR-FRET信号的能力。在孔中以1nM的最终浓度使用GTPgN-C3。在不存在或存在大量过量GTPγS(100μM)的情况下，对膜进行孵育。这两个条件之间观察到的在TR-FRET信号上的差异(HTRF比，总信号/非特异性信号＝1.7)显示，GTPgN-C3类似物能够与Gαi蛋白结合并与抗Gαi抗体-受体产生TR-FRET信号(图4)。

实施例3-GTPgN-辛基-C2类似物结合测试

使用表达Delta Opioid GPCR和Gαi蛋白的CHO-K1细胞的膜制备物(每孔10μg)证明了GTPgN-辛基-C2(制备物6)/抗Gαi抗体DSV36S-d2对通过与G蛋白结合而产生特异性的TR-FRET信号的能力。在孔中以6nM的最终浓度使用GTPgN-辛基-C2。在不存在或存在大量过量GTPγS(100μM)的情况下，对膜进行孵育。这两个条件之间观察到的在TR-FRET信号上的差异(HTRF比，总信号/非特异性信号＝12.4)显示，GTPgN-辛基-C2类似物能够与Gαi蛋白结合并与抗Gαi抗体-受体产生TR-FRET信号(图5)。

实施例4-GTPgN-辛基-C11类似物结合测试

使用表达Delta Opioid GPCR和Gαi蛋白的CHO-K1细胞的膜制备物(每孔10μg)证明了GTPgN-辛基-C11(制备物9)/抗Gαi抗体DSV36S-d2对通过与G蛋白结合而产生特异性的TR-FRET信号的能力。在孔中以6nM的最终浓度使用GTPgN-辛基-C11。在不存在或存在大量过量GTPγS(100μM)的情况下，对膜进行孵育。这两个条件之间观察到的在TR-FRET信号上的差异(HTRF比，总信号/非特异性信号＝7.6)显示，GTPgN-辛基-C11类似物能够与Gαi蛋白结合并与抗Gαi抗体-受体产生TR-FRET信号(图6)。

实施例5-GTPgN-辛基-C3类似物结合测试

使用表达Delta Opioid GPCR和Gαi蛋白的HEK293细胞的膜制备物(每孔1μg)证明了GTPgN-辛基-C3(制备物7)/抗Gαi抗体DSV36S-d2对通过与G蛋白结合而产生特异性的TR-FRET信号的能力。在孔中以1nM的最终浓度使用GTPgN-辛基-C3。在不存在或存在大量过量GTPγS(100μM)的情况下，对膜进行孵育。这两个条件之间观察到的在TR-FRET信号上的差异(HTRF比，总信号/非特异性信号＝1.4)显示，GTPgN-辛基-C3类似物能够与Gαi蛋白结合并与抗Gαi抗体-受体产生TR-FRET信号(图7)。

实施例6-GTPgO-己基-C2类似物结合测试

使用表达Delta Opioid GPCR和Gαi蛋白的CHO-K1细胞的膜制备物(每孔10μg)证明了GTPgO-己基-C2(制备物2)/抗Gαi抗体DSV36S-d2对通过与G蛋白结合而产生特异性的TR-FRET信号的能力。在孔中以6nM的最终浓度使用GTPgO-己基-C2。在不存在或存在大量过量GTPγS(100μM)的情况下，对膜进行孵育。这两个条件之间观察到的在TR-FRET信号上的差异(HTRF比，总信号/非特异性信号＝7.1)显示，GTPgO-己基-C2类似物能够与Gαi蛋白结合并与抗Gαi抗体-受体产生TR-FRET信号(图8)。

实施例7-GTPgO-己基-C3类似物结合测试

使用表达Delta Opioid GPCR和Gαi蛋白的HEK293细胞的膜制备物(每孔1μg)证明了GTPgO-己基-C3(制备物3)/抗Gαi抗体DSV36S-d2对通过与G蛋白结合而产生特异性的TR-FRET信号的能力。在孔中以1nM的最终浓度使用GTPgO-己基-C3。在不存在或存在大量过量GTPγS(100μM)的情况下，对膜进行孵育。这两个条件之间观察到的在TR-FRET信号上的差异(HTRF比，总信号/非特异性信号＝1.3)显示，GTPgO-己基-C3类似物能够与Gαi蛋白结合并与抗Gαi抗体-受体产生TR-FRET信号(图9)。

实施例8-GTPgN-辛基-C2类似物结合测试

使用表达Dopamine D2S GPCR和Gαi蛋白的CHO-K1细胞的膜制备物(每孔10μg)证明了GTPgN-辛基-C2(制备物6)/抗Gαi抗体DSV36S-d2对通过与G蛋白结合而产生特异性的TR-FRET信号的能力。在孔中以6nM的最终浓度使用GTPgN-辛基-C2。在不存在或存在大量过量GTPγS(100μM)的情况下，对膜进行孵育。这两个条件之间观察到的在TR-FRET信号的差异(HTRF比，总信号/非特异性信号＝3.8)显示，GTPgN-辛基-C2类似物能够与Gαi蛋白结合并与抗Gαi抗体-受体产生TR-FRET信号(图10)。

实施例9-膜和GTP类似物-镧系元素的浓度对GTPgN-辛基-C2类似物结合测试的影响

使用表达Delta Opioid GPCR和Gαi蛋白的CHO-K1细胞的膜制备物(1μg/孔或10μg/孔)证明了GTPgN-辛基-C2(制备物6)/抗Gαi抗体DSV36S-d2对通过与G蛋白结合而产生特异性的TR-FRET信号的能力。在孔中以2nM或6nM的最终浓度使用GTPgN-辛基-C2。在不存在或存在大量过量GTPγS(100μM)的情况下，对膜进行孵育。这两个条件之间观察到的在TR-FRET信号上的差异(HTRF比，总信号(S)/非特异性信号(N))显示，GTPgN-辛基-C2类似物能够与Gαi蛋白结合并与抗Gαi抗体-受体产生TR-FRET信号(图11A和图11B)。此外，从图11A中可以看出，通过将膜的量从每孔1μg增加到10μg，观察到了信号幅度(S/N)的增加。从图11B中可以看出，通过将GTPgN-辛基-C2的浓度从2nM增加到6nM，观察到了信号幅度(S/N)的增加。

实施例10-GTPgN-辛基-硫代琥珀酰亚胺-C2类似物结合测试

使用表达Delta Opioid GPCR和Gαi蛋白的CHO-K1细胞的膜制备物(每孔10μg)证明了GTPgN-辛基-硫代琥珀酰亚胺-C2(制备物10)/抗Gαi抗体DSV36S-d2对通过与G蛋白结合而产生特异性的TR-FRET信号的能力。试剂在pH 7.4的50mM Tris HCl缓冲液、60mMMgCl₂、0.1％BSA、150mM NaCl中稀释。在孔中以7.5nM的最终浓度使用GTPgN-辛基-硫代琥珀酰亚胺-C2。在不存在或存在膜制备物的情况下，对荧光缀合物进行孵育。这两个条件之间观察到的在TR-FRET信号上的差异(HTRF比，总信号/非特异性信号＝2.8)显示，GTPgN-辛基-硫代琥珀酰亚胺-C2类似物能够与Gαi蛋白结合并与抗Gαi抗体-受体产生TR-FRET信号(图12)。

Claims

1.式(I)的化合物：

其中：

X＝O、NH或CH₂；

Y＝O、NH或CH₂；

L是二价连接基团；

Ln³⁺是可以任选地带有反应性基团G₃的镧系元素配合物；

2.如权利要求1所述的化合物，其中，Y＝O。

3.如权利要求1所述的化合物，其中，Y＝NH。

4.如权利要求1所述的化合物，其中，Y＝CH₂。

5.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，L选自：

-直接连接；

-C₅-C₈亚环烷基基团；或

-C₆-C₁₄亚芳基基团；

所述亚烷基、亚环烷基或亚芳基基团任选地含有一个或多个杂原子(例如氧、氮、硫或磷)、或一个或多个氨基甲酰基或酰胺基基团，并且所述亚烷基、亚环烷基或亚芳基基团任选地由1至5个、优选1至3个C₁-C₈烷基、C₆-C₁₄芳基、磺酸盐/酯或氧代基团取代。

6.如权利要求5所述的化合物，其中，L选自如下基团中的一个：

-(CH₂)_n-；

7.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，Ln³⁺选自配合物C1至C90中的任一个。

8.如权利要求7所述的化合物，其中，Ln³⁺选自配合物C1至C17、C24至C32和C36至C44中的一个。

9.如权利要求8所述的化合物，其中，Ln³⁺选自配合物C1至C4和C11中的一个。

10.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，所述基团G₃是下式的基团：

11.如权利要求1所述的化合物，所述化合物选自GTP-γ-O-己基-C2、GTP-γ-O-己基-C3、GTP-γ-N-C2、GTP-γ-N-C3、GTP-γ-N-辛基-C2、GTP-γ-N-辛基-C3、GTP-γ-N-己基-C11、GTP-γ-N-辛基-C11和GTP-γ-N-辛基-硫代琥珀酰亚胺-C2。

12.权利要求1-11中任一项所述的化合物用于识别下述分子的用途，所述分子能够调节G蛋白偶联受体的活化。