CA3127857A1 - Analogues de gtp fluorescents et utilisation - Google Patents
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- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
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Abstract
L'invention concerne des composés de formule (I), dans laquelle X, Y, L et Ln3+ sont tels que définis dans la description.
Description
Analogues de GTP fluorescents et utilisation Domaine de l'invention La présente invention a pour objet des analogues de GTP fluorescents utiles pour détecter, par des techniques de transfert d'énergie, des molécules susceptibles de moduler l'activation d'un récepteur couplé aux protéines G.
Etat de la technique Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG ou GPCR en anglais) sont une famille de récepteurs membranaires chez les mammifères et dans tout le règne animal. Les protéines G sont des protéines hétérotrimériques (3 sous unités : alpha, beta et gamma) qui sont activées par les RCPG. Au travers des RCPG, les protéines G ont un rôle de transduction d'un signal de l'extérieur de la cellule vers l'intérieur de la cellule (i.e.
réponse cellulaire à un stimulus externe). Leur mécanisme d'action communément décrit, est présenté dans la Figure 1 et résumé ci-après :
- dans son état inactif, de repos, la sous unité alpha de la protéine G est liée au nucléotide GDP (protéine G pleine liée au GDP);
- après activation du RCPG, ce dernier se lie à la sous unité alpha de la protéine G et enclenche un processus d'activation de la protéine G constitué de deux étapes :
1) la sortie du GDP de la protéine G pour donner une protéine G vide, et la formation d'un complexe RCPG / protéine-G-vide inactif, et
Etat de la technique Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG ou GPCR en anglais) sont une famille de récepteurs membranaires chez les mammifères et dans tout le règne animal. Les protéines G sont des protéines hétérotrimériques (3 sous unités : alpha, beta et gamma) qui sont activées par les RCPG. Au travers des RCPG, les protéines G ont un rôle de transduction d'un signal de l'extérieur de la cellule vers l'intérieur de la cellule (i.e.
réponse cellulaire à un stimulus externe). Leur mécanisme d'action communément décrit, est présenté dans la Figure 1 et résumé ci-après :
- dans son état inactif, de repos, la sous unité alpha de la protéine G est liée au nucléotide GDP (protéine G pleine liée au GDP);
- après activation du RCPG, ce dernier se lie à la sous unité alpha de la protéine G et enclenche un processus d'activation de la protéine G constitué de deux étapes :
1) la sortie du GDP de la protéine G pour donner une protéine G vide, et la formation d'un complexe RCPG / protéine-G-vide inactif, et
2) la fixation du GTP qui conduit à la formation d'une protéine G active, sous forme GTP
(protéine G pleine liée au GTP). Dans la première étape, la protéine G liée au récepteur est sous une forme appelée forme vide . Cet état est décrit dans la littérature comme étant transitoire puisqu'il est décrit que le nucléotide GTP se lie rapidement à la sous-unité alpha de la protéine G. Par ailleurs, les sous-unités beta/gamma de la protéine G
activée se dissocient de la sous-unité alpha;
- la sous-unité alpha de la protéine G pleine liée au GTP se fixe alors aux effecteurs pour les activer. Les effecteurs activent à leur tour des voies de signalisation entraînant une réponse cellulaire;
- le GTP est ensuite hydrolysé en GDP par la sous-unité alpha de la protéine G
et la sous unité alpha se réassocie aux sous-unités beta/gamma pour reformer la protéine G pleine liée au GDP (état inactif).
Il existe plusieurs sous-types de protéines G alpha présentant des profils de sélectivité
différents pour les différents effecteurs (Journal Molecular Biology, 2016, 428, 3850) et induisant ainsi l'activation de voies de signalisation préférentielles.
Les RCPG sont associés à de nombreuses fonctions physiologiques importantes et sont considérés comme l'une des cibles thérapeutiques privilégiées pour un grand nombre de pathologies. Ainsi, de nombreux tests de criblage in vitro ont été développés pour identifier des molécules capables de moduler les RCPG. Les tests mis au point exploitent différents mécanismes d'activation des protéines G et mettent en oeuvre des technologies variées (Zhang et al.; Tools for GPCR Drug Discovery; Acta Pharmacologica Sinica, 2012, 33, 372). On peut citer notamment les tests d'affinité qui utilisent des ligands radiomarqués pour mesurer l'affinité du ligand au RCPG, les tests de scintigraphie de proximité qui utilisent des billes de scintigraphie sur lesquelles des RCPG
ont été fixés ou les tests fonctionnels utilisant du GTP faiblement ou non hydrolysable comme le GTPyS
(GTP gamma-S). Ces tests sont néanmoins difficiles à mettre en oeuvre et nécessitent parfois des étapes de filtration sur membranes qui peut limiter leur utilisation comme tests de criblage à haut débit (HTS). D'autres tests ont été développés pour mettre en évidence l'activation des RCPG. Ces tests se basent notamment sur les techniques de transfert d'énergie (RET ¨ acronyme anglais de Resonance Energy Transfer ), comme le FRET
(acronyme anglais de Fluorescence Resonance Energy Transfer ) ¨ voir Clinical Chemistry, 1995, 41, 1391 ou le BRET (acronyme anglais de Bioluminescence Resonance Energy Transfer ) ¨ voir Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999, 96(1), 151. Ces deux techniques font appel à des notions de molécules capables de donner de l'énergie (on parle de donneurs) ou d'accepter de l'énergie (on parle d'accepteurs) ¨ voir Physical Chemistry Chemical Physics, 2007, 9, 5847. On peut citer par exemple les techniques de transfert d'énergie mettant en évidence l'interaction entre un RCPG et la protéine G en utilisant soit un donneur conjugué au RCPG et un accepteur conjugué à la protéine G (WO 2006/086883 et WO 2003/008435) soit un accepteur conjugué à la sous-unité alpha de la protéine G et un donneur conjugué à la sous-unité
beta et/ou gamma de la protéine G (Bunemann et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, 26, 16077). Ces techniques sont néanmoins contraignantes puisqu'elles nécessitent la préparation de protéines de fusion et elles ne permettent pas d'étudier les RCPG et les protéines G exprimées de façon endogène par les cellules (i.e.
non modifiées et non surexprimées). D'autre part, afin de discriminer les différents sous types de protéines G alpha pouvant être activées par le récepteur, ces techniques nécessitent la préparation d'échantillons membranaires multiples (une préparation spécifique pour chaque sous type de protéine G alpha). Les techniques de transfert d'énergie ont également été utilisées pour la mise au point de tests visant à
visualiser la modulation de la forme GTP (active) de la protéine G ou de la forme GDP
(inactive) de la protéine G. On peut citer par exemple les demandes WO 2006/035208 et US
(protéine G pleine liée au GTP). Dans la première étape, la protéine G liée au récepteur est sous une forme appelée forme vide . Cet état est décrit dans la littérature comme étant transitoire puisqu'il est décrit que le nucléotide GTP se lie rapidement à la sous-unité alpha de la protéine G. Par ailleurs, les sous-unités beta/gamma de la protéine G
activée se dissocient de la sous-unité alpha;
- la sous-unité alpha de la protéine G pleine liée au GTP se fixe alors aux effecteurs pour les activer. Les effecteurs activent à leur tour des voies de signalisation entraînant une réponse cellulaire;
- le GTP est ensuite hydrolysé en GDP par la sous-unité alpha de la protéine G
et la sous unité alpha se réassocie aux sous-unités beta/gamma pour reformer la protéine G pleine liée au GDP (état inactif).
Il existe plusieurs sous-types de protéines G alpha présentant des profils de sélectivité
différents pour les différents effecteurs (Journal Molecular Biology, 2016, 428, 3850) et induisant ainsi l'activation de voies de signalisation préférentielles.
Les RCPG sont associés à de nombreuses fonctions physiologiques importantes et sont considérés comme l'une des cibles thérapeutiques privilégiées pour un grand nombre de pathologies. Ainsi, de nombreux tests de criblage in vitro ont été développés pour identifier des molécules capables de moduler les RCPG. Les tests mis au point exploitent différents mécanismes d'activation des protéines G et mettent en oeuvre des technologies variées (Zhang et al.; Tools for GPCR Drug Discovery; Acta Pharmacologica Sinica, 2012, 33, 372). On peut citer notamment les tests d'affinité qui utilisent des ligands radiomarqués pour mesurer l'affinité du ligand au RCPG, les tests de scintigraphie de proximité qui utilisent des billes de scintigraphie sur lesquelles des RCPG
ont été fixés ou les tests fonctionnels utilisant du GTP faiblement ou non hydrolysable comme le GTPyS
(GTP gamma-S). Ces tests sont néanmoins difficiles à mettre en oeuvre et nécessitent parfois des étapes de filtration sur membranes qui peut limiter leur utilisation comme tests de criblage à haut débit (HTS). D'autres tests ont été développés pour mettre en évidence l'activation des RCPG. Ces tests se basent notamment sur les techniques de transfert d'énergie (RET ¨ acronyme anglais de Resonance Energy Transfer ), comme le FRET
(acronyme anglais de Fluorescence Resonance Energy Transfer ) ¨ voir Clinical Chemistry, 1995, 41, 1391 ou le BRET (acronyme anglais de Bioluminescence Resonance Energy Transfer ) ¨ voir Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999, 96(1), 151. Ces deux techniques font appel à des notions de molécules capables de donner de l'énergie (on parle de donneurs) ou d'accepter de l'énergie (on parle d'accepteurs) ¨ voir Physical Chemistry Chemical Physics, 2007, 9, 5847. On peut citer par exemple les techniques de transfert d'énergie mettant en évidence l'interaction entre un RCPG et la protéine G en utilisant soit un donneur conjugué au RCPG et un accepteur conjugué à la protéine G (WO 2006/086883 et WO 2003/008435) soit un accepteur conjugué à la sous-unité alpha de la protéine G et un donneur conjugué à la sous-unité
beta et/ou gamma de la protéine G (Bunemann et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, 26, 16077). Ces techniques sont néanmoins contraignantes puisqu'elles nécessitent la préparation de protéines de fusion et elles ne permettent pas d'étudier les RCPG et les protéines G exprimées de façon endogène par les cellules (i.e.
non modifiées et non surexprimées). D'autre part, afin de discriminer les différents sous types de protéines G alpha pouvant être activées par le récepteur, ces techniques nécessitent la préparation d'échantillons membranaires multiples (une préparation spécifique pour chaque sous type de protéine G alpha). Les techniques de transfert d'énergie ont également été utilisées pour la mise au point de tests visant à
visualiser la modulation de la forme GTP (active) de la protéine G ou de la forme GDP
(inactive) de la protéine G. On peut citer par exemple les demandes WO 2006/035208 et US
3 2007/0287162 dans lesquelles on met en oeuvre un analogue du GTP couplé à une molécule de type cyanine.
La demande WO 2009/068751 décrit une méthode dans laquelle un signal de transfert d'énergie est détecté à l'aide de dérivés d'ATP marqués ; ces dérivés ne peuvent toutefois pas se lier à la protéine G. Un analogue du GTP est décrit dans la revue Drug Discovery Today, 2002, 7(18), S150) comme susceptible d'être utilisé dans une technique de détection par fluorescence en temps résolu. Cet analogue est constitué d'un chélate d'europium couplé à l'atome de phosphate en position gamma du GTP via un atome d'azote. La structure du chélate d'europium n'est toutefois pas divulguée, pas plus que la méthode utilisée pour synthétiser l'analogue en question. Un autre analogue de GTP est décrit dans Analytical Chemistry, 2009, 81, 5033, qui résulte du couplage du gamma-[(8-aminooctypimido]guanosine-5'-triphosphate et de {2,2',2",2"-{[[2-(4-isothiocyanatophény1)-éthyl]imino]bis(méthylène)bis{4-{[4-(R-Dglucopyranoxy)phényl]
éthynyl}pyridine-6,2-diyl}bis-(méthylènenitrilo)}tétrakis(acétato)}europium(III) dont la synthèse a été décrite dans Analytical Chemistry, 2003, 75, 3193.
Il existe donc un réel besoin de disposer de composés capables de se lier à la protéine G
et pouvant de facto être utilisés dans une méthode de détection, par des techniques de transfert d'énergie, de molécules susceptibles de moduler l'activation d'un récepteur couplé aux protéines G.
Résumé de l'invention La présente invention a pour objet la mise à disposition de nouvelles molécules de GTP
ou de ses dérivés, couplées à des complexes de lanthanide et représentées par la formule générale (I) :
N =411*'<µ NH
e 0 0 0 N NH, Ln OH OH OH
HO OH
(I) dans laquelle :
X = 0, NH ou CH2 ;
Y = 0, NH ou CH2 ;
L est un groupe de liaison divalent ;
La demande WO 2009/068751 décrit une méthode dans laquelle un signal de transfert d'énergie est détecté à l'aide de dérivés d'ATP marqués ; ces dérivés ne peuvent toutefois pas se lier à la protéine G. Un analogue du GTP est décrit dans la revue Drug Discovery Today, 2002, 7(18), S150) comme susceptible d'être utilisé dans une technique de détection par fluorescence en temps résolu. Cet analogue est constitué d'un chélate d'europium couplé à l'atome de phosphate en position gamma du GTP via un atome d'azote. La structure du chélate d'europium n'est toutefois pas divulguée, pas plus que la méthode utilisée pour synthétiser l'analogue en question. Un autre analogue de GTP est décrit dans Analytical Chemistry, 2009, 81, 5033, qui résulte du couplage du gamma-[(8-aminooctypimido]guanosine-5'-triphosphate et de {2,2',2",2"-{[[2-(4-isothiocyanatophény1)-éthyl]imino]bis(méthylène)bis{4-{[4-(R-Dglucopyranoxy)phényl]
éthynyl}pyridine-6,2-diyl}bis-(méthylènenitrilo)}tétrakis(acétato)}europium(III) dont la synthèse a été décrite dans Analytical Chemistry, 2003, 75, 3193.
Il existe donc un réel besoin de disposer de composés capables de se lier à la protéine G
et pouvant de facto être utilisés dans une méthode de détection, par des techniques de transfert d'énergie, de molécules susceptibles de moduler l'activation d'un récepteur couplé aux protéines G.
Résumé de l'invention La présente invention a pour objet la mise à disposition de nouvelles molécules de GTP
ou de ses dérivés, couplées à des complexes de lanthanide et représentées par la formule générale (I) :
N =411*'<µ NH
e 0 0 0 N NH, Ln OH OH OH
HO OH
(I) dans laquelle :
X = 0, NH ou CH2 ;
Y = 0, NH ou CH2 ;
L est un groupe de liaison divalent ;
4 Ln3+ est un complexe de lanthanide portant éventuellement un groupe réactif G3 (tel que défini ci-après) ;
étant entendu que lorsque X représente NH et L-Y représente un groupe octylamino alors Ln3+ n'est pas le {2,2',2",2"-{[[2-(4-isothiocyanatophényI)-éthyl]imino]bis(méthylène)bis{4-{[4-(R-Dglucopyranoxy)phényl]éthynyl}pyridine-6,2-diyl}bis-(méthylènenitrilo)}-tétrakis(acétato)}-europium(III).
Brève description des dessins La figure 1 illustre le mécanisme d'action des protéines G.
La figure 2 illustre le format d'essai utilisé pour détecter la liaison des composés de l'invention à la protéine G.
La figure 3 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai.
La figure 4 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai.
La figure 5 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai.
La figure 6 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai.
La figure 7 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai.
La figure 8 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai.
La figure 9 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai.
La figure 10 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai.
Les figures 11A et 11B illustrent l'effet de la concentration en membranes et en composé
à tester sur la liaison dudit composé à la protéine Gai.
La figure 12 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai.
Description de l'invention Selon un aspect la présente invention concerne des composés de formule (I) :
NI,=,:t.-N
Ln OH OH OH
HO OH
(I) dans laquelle :
X = 0, NH ou CH2 ;
Y = 0, NH ou CH2 ;
L est un groupe de liaison divalent ;
Ln3+ est un complexe de lanthanide portant éventuellement un groupe réactif G3 (tel que défini ci-après) ;
étant entendu que lorsque X représente NH et L-Y représente un groupe octylamino alors Ln3+ n'est pas le {2,2',2",2"-{[[2-(4-isothiocyanatophényI)-éthyl]imino]bis(méthylène)bis{4-
étant entendu que lorsque X représente NH et L-Y représente un groupe octylamino alors Ln3+ n'est pas le {2,2',2",2"-{[[2-(4-isothiocyanatophényI)-éthyl]imino]bis(méthylène)bis{4-{[4-(R-Dglucopyranoxy)phényl]éthynyl}pyridine-6,2-diyl}bis-(méthylènenitrilo)}-tétrakis(acétato)}-europium(III).
Brève description des dessins La figure 1 illustre le mécanisme d'action des protéines G.
La figure 2 illustre le format d'essai utilisé pour détecter la liaison des composés de l'invention à la protéine G.
La figure 3 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai.
La figure 4 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai.
La figure 5 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai.
La figure 6 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai.
La figure 7 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai.
La figure 8 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai.
La figure 9 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai.
La figure 10 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai.
Les figures 11A et 11B illustrent l'effet de la concentration en membranes et en composé
à tester sur la liaison dudit composé à la protéine Gai.
La figure 12 illustre un test de liaison d'un composé de l'invention à la protéine Gai.
Description de l'invention Selon un aspect la présente invention concerne des composés de formule (I) :
NI,=,:t.-N
Ln OH OH OH
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(I) dans laquelle :
X = 0, NH ou CH2 ;
Y = 0, NH ou CH2 ;
L est un groupe de liaison divalent ;
Ln3+ est un complexe de lanthanide portant éventuellement un groupe réactif G3 (tel que défini ci-après) ;
étant entendu que lorsque X représente NH et L-Y représente un groupe octylamino alors Ln3+ n'est pas le {2,2',2",2"-{[[2-(4-isothiocyanatophényI)-éthyl]imino]bis(méthylène)bis{4-
5 {[4-(R-Dglucopyranoxy)phényl]éthynyl}pyridine-6,2-diyl}bis-(méthylènenitrilo)}-tétrakis(acétato)}europium(III).
On entend par complexe de lanthanide un chélate, un macrocycle, un cryptate ou toute espèce organique capable de complexer un atome de la famille des lanthanides, le lanthanide (Ln) étant choisi parmi : Eu, Sm, Tb, Gd, Dy, Nd, Er, de préférence le lanthanide est Tb, Sm ou Eu et de manière encore plus préférée Eu ou Tb.
Les familles des différents composés de formule (I) sont représentées par les formules (la) à (1g):
On entend par complexe de lanthanide un chélate, un macrocycle, un cryptate ou toute espèce organique capable de complexer un atome de la famille des lanthanides, le lanthanide (Ln) étant choisi parmi : Eu, Sm, Tb, Gd, Dy, Nd, Er, de préférence le lanthanide est Tb, Sm ou Eu et de manière encore plus préférée Eu ou Tb.
Les familles des différents composés de formule (I) sont représentées par les formules (la) à (1g):
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7 dans lesquelles L et Ln3+ ont les significations indiquées ci-dessus.
Une première famille de composés selon l'invention est constituée des composés de formules (la), (Id) et (If). Cette famille est dite famille GTP-gamma-O (car le groupe de liaison divalent est lié au phosphate en position gamma du GTP via un atome d'oxygène).
Une deuxième famille de composés selon l'invention est constituée des composés de formules (lb), (le) et (Ig). Cette famille est dite famille GTP-gamma-N (car le groupe de liaison divalent est lié au phosphate en position gamma du GTP via un atome d'azote).
Une troisième famille de composés selon l'invention est constituée des composés de formules (1c). Cette famille est dite famille GTP-gamma-C (car le groupe de liaison divalent est lié au phosphate en position gamma du GTP via un atome de carbone).
Dans un mode de réalisation X est O. Dans un autre mode de réalisation X est NH. Dans un autre mode de réalisation X est CH2.
Dans un mode de réalisation, le groupe de liaison divalent L est choisi parmi :
- une liaison directe;
- un groupe alkylène linéaire ou ramifié en C1-C20, de préférence en C1-C8, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons ;
- un groupe cycloalkylène en C5-C8; ou _ un groupe arylène en C6-C14;
lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par 1 à 5, de préférence 1 à 3, groupes alkyle en C1-C8, aryle en C8-C14, sulfonate ou oxo.
Le groupe de liaison divalent L est avantageusement choisi parmi les groupes suivants :
Une première famille de composés selon l'invention est constituée des composés de formules (la), (Id) et (If). Cette famille est dite famille GTP-gamma-O (car le groupe de liaison divalent est lié au phosphate en position gamma du GTP via un atome d'oxygène).
Une deuxième famille de composés selon l'invention est constituée des composés de formules (lb), (le) et (Ig). Cette famille est dite famille GTP-gamma-N (car le groupe de liaison divalent est lié au phosphate en position gamma du GTP via un atome d'azote).
Une troisième famille de composés selon l'invention est constituée des composés de formules (1c). Cette famille est dite famille GTP-gamma-C (car le groupe de liaison divalent est lié au phosphate en position gamma du GTP via un atome de carbone).
Dans un mode de réalisation X est O. Dans un autre mode de réalisation X est NH. Dans un autre mode de réalisation X est CH2.
Dans un mode de réalisation, le groupe de liaison divalent L est choisi parmi :
- une liaison directe;
- un groupe alkylène linéaire ou ramifié en C1-C20, de préférence en C1-C8, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons ;
- un groupe cycloalkylène en C5-C8; ou _ un groupe arylène en C6-C14;
lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par 1 à 5, de préférence 1 à 3, groupes alkyle en C1-C8, aryle en C8-C14, sulfonate ou oxo.
Le groupe de liaison divalent L est avantageusement choisi parmi les groupes suivants :
8 (C1-12)n¨O¨ (C1-12)ni-0¨ (C1-12) ;
(C1-12)n-0¨ (CH2)0 V-N II ¨ (CH2 (CI-12)q ¨ (CH2),1\1¨ (CH2)õ,, Il , (C1-12),- ;
¨ (CHAI (C1-12)M¨N S¨ (CH2) ¨ =
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____ H
N¨ (CH2)n¨NH ________ (CH2),I¨S (CI-12)p¨ ;
¨ (CH2)n 2 N (CH2)m ;
H
S¨ (CI-12)p¨ =
H H
¨ (CH2)n¨N¨ = ¨ (CI-12)n¨N¨ (C1-12) = ___ (CH2)n¨ ;
H II H
¨ (CH2)n __ N¨(C1-12) ; N¨(CH2)n¨
¨(CH2)n I Nii¨(CH2) _____________ -e
(C1-12)n-0¨ (CH2)0 V-N II ¨ (CH2 (CI-12)q ¨ (CH2),1\1¨ (CH2)õ,, Il , (C1-12),- ;
¨ (CHAI (C1-12)M¨N S¨ (CH2) ¨ =
P , O
(CH2)n¨N¨LI¨ (CH2)j,¨S .. (CI-12)p¨ ;
____ H
N¨ (CH2)n¨NH ________ (CH2),I¨S (CI-12)p¨ ;
¨ (CH2)n 2 N (CH2)m ;
H
S¨ (CI-12)p¨ =
H H
¨ (CH2)n¨N¨ = ¨ (CI-12)n¨N¨ (C1-12) = ___ (CH2)n¨ ;
H II H
¨ (CH2)n __ N¨(C1-12) ; N¨(CH2)n¨
¨(CH2)n I Nii¨(CH2) _____________ -e
9 PCT/FR2020/050149 dans lesquels n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4.
De manière particulièrement avantageuse, le groupe de liaison divalent L est choisi parmi une liaison directe, un groupe alkylène linéaire ou ramifié en Cl-08 ou un groupe de formule :
H u (CHA N ____________________________________ ;
Le groupe de liaison divalent L est de préférence choisi parmi :
le groupe ¨(CH2),- étant tout particulièrement préféré.
Selon un autre mode de réalisation, le groupe de liaison divalent L est un groupe de formule :
___________ N (01-12)n N _________________ (CH2)m S __ CH
dans laquelle m, n et p sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5.
Dans un mode de réalisation, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes ci-après :
gOl NH2 O s I il \
i N \
I I I
N N N
Eu3+
(N
Eu3+ N
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i N \
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N er-, 1 ......,...v2- -02C-....../11 -02c CO2- -02C CO2-H H H
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En fonction du pH, les groupes -S03H, -CO2H et -P0(OH)2 sont sous forme déprotonée ou pas. Ces groupes désignent donc également les groupes -S03-, -002- et -P0(OH)0-.
5 Avantageusement, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes Cl à 017, 024 à 032 et 036 à 044. De manière plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes Cl à 017 et 036 à 044. De manière encore plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes Cl à 017. De manière encore plus avantageuse, le complexe de lanthanide
De manière particulièrement avantageuse, le groupe de liaison divalent L est choisi parmi une liaison directe, un groupe alkylène linéaire ou ramifié en Cl-08 ou un groupe de formule :
H u (CHA N ____________________________________ ;
Le groupe de liaison divalent L est de préférence choisi parmi :
le groupe ¨(CH2),- étant tout particulièrement préféré.
Selon un autre mode de réalisation, le groupe de liaison divalent L est un groupe de formule :
___________ N (01-12)n N _________________ (CH2)m S __ CH
dans laquelle m, n et p sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5.
Dans un mode de réalisation, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes ci-après :
gOl NH2 O s I il \
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En fonction du pH, les groupes -S03H, -CO2H et -P0(OH)2 sont sous forme déprotonée ou pas. Ces groupes désignent donc également les groupes -S03-, -002- et -P0(OH)0-.
5 Avantageusement, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes Cl à 017, 024 à 032 et 036 à 044. De manière plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes Cl à 017 et 036 à 044. De manière encore plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes Cl à 017. De manière encore plus avantageuse, le complexe de lanthanide
10 Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes Cl à 04 et Cl 1 à 017. De manière encore plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes Cl à
04 et C11. De manière tout à fait avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+
est le complexe 02 ou le complexe 03.
Les complexes de lanthanide Cl à 090 sont décrits dans les publications ci-après. Ces complexes soit sont disponibles dans le commerce, soit peuvent être obtenus par les voies de synthèses décrites dans lesdites publications.
Cl : WO 03/076938 02 : EP-A-0 203 047 03-04 : WO 2008/025886 05: Spectrochimica Acta ; Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2001, 57(11), 2197.
06: Spectrochimica Acta ; Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2001, 57(11),2197.
07 : Analytical Biochemistry, 2000, 286(1), 17.
08 : WO 01/96877 09: Spectrochimica Acta ; Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2001, 57(11), 2197.
010 : WO 01/96877 Cl 1 : WO 2008/063721 012- C17 : WO 2017/098180.
018- C20 : WO 2013/011236 021-035 : WO 2014/111661 .. 036-044 : WO 2018/229408 045-047 : Organic & Biomolecular Chemistry, 2012, 10, 8509.
048 : WO 2010/084090 049 : WO 2009/010580 050-051 : Chemical Communications, 2007, 3841 052 : WO 2006/120444 053 : European Journal of lnorganic Chemistry, 2010, 3961.
054: Bioconjugate Chemistry, 2009, 20(3), 625.
055: EP-A-0 770 610 056 : WO 2016/106241 057-058 : EP-A-0 770 610 059-060 : Analytical Chemistry, 2003, 75, 3193-3201 061 : Bioconjugate Chemistry, 1997, 8(2), 127 062 : WO 93/11433 063 : US5696240 .. 064a -081b : WO 2018/22932 082 : WO 2010/070232 083-085 : WO 2018/045385 C86a-b : Analyst, 2010, 135(1), 42 087-089 : Chemistry ¨ A European Journal, 2011, 17, 9164 090: Journal of the American Chemical Society, 2004, 126(15), 4888 La synthèse des composés de formule (I) est décrite plus en détail ci-après dans les schémas 1 à 19. Typiquement ces composés sont obtenus par des techniques de conjugaison de deux molécules organiques basées sur l'utilisation de groupes réactifs, techniques qui relèvent des connaissances générales de l'homme du métier et qui sont décrites par exemple dans Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, Academic Press, Second Edition 2008, p. 169-211. Pour obtenir les composés GTP-gamma-O, on fait tout d'abord réagir le GTP avec un composé de formule G2-L-G1, et le composé
intermédiaire ainsi formé est conjugué avec le complexe de lanthanide. Dans cette formule G2-I--G1 :
L est le groupe de liaison divalent tel que défini ci-dessus ;
Giest un groupe réactif électrophile capable de réagir avec la fonction OH du phosphate en position gamma du GTP ;
G2 est un groupe réactif capable de réagir avec un groupe réactif (G3) porté
par le complexe de lanthanide Ln3 .
La réaction de conjugaison entre le composé intermédiaire (comportant un groupe réactif G2) et le complexe de lanthanide (comportant un groupe réactif G3), entraîne la formation d'une liaison covalente comportant un ou plusieurs atomes du groupe réactif.
Dans un mode de réalisation, le groupe électrophile G1 est :
- soit un groupe OH activé par un réactif formant de façon intermédiaire une espèce réactive pouvant réagir avec la fonction hydroxyle du phosphate en position gamma, - soit un groupement réactif de type groupement partant, comme par exemple un chlorure aliphatique, un bromure aliphatique, un iodure aliphatique, un mésylate aliphatique, un tosylate aliphatique, un triflate aliphatique, etc.
Dans un mode de réalisation, les groupes réactifs G2 et G3 sont indépendamment l'un de l'autre choisi parmi l'un des groupes suivants : un acrylamide, une amine éventuellement activée (par exemple une cadavérine ou une éthylènediamine), un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, telle que la monochlorotriazine, la dichlorotriazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, un thiol, une cétone, un halogénure d'acide, un ester de succinimidyle, un ester d'hydroxysuccinimidyle, un ester d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un 3-(2-pyridyldithio)-propionamide, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et en particulier un groupe choisi parmi les groupes de formules :
o o (Il NH)-(CH2) NCS ( 11 NH)-(CH2)-NCO
V w y w ( 11 NH)-(CH2)-NH2 ( 11 NH-)-(CH2)-N3 y w y w ( 11 NH)-(CH2)-SH
( 11 NH-)-(CH2)-S-S-Ar y w y w ( 11 NH-)-(CH2)-NH-Ar ( 11 NH ) y w (CH2eN
y >i (M NH)-(CH2) = NCS ( 11 NH)7(CH2) NCO
y w w .0 >S03-( 11 NH)-(CH2) 4. N3 ( 11 NH)-(CH2) w 11 o-:
y w y )-------( 11 NH-)_(CH) w 11 O-N) ( 11 NH4-(CH2) __ =CH
y y w ------Cl N-(\
( 11 NH)-(CH2)-NH- \ N
y w N=( CI
dans lesquelles w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué
par un atome d'halogène.
G2 et G3 peuvent provenir de leur forme protégée par un groupe protecteur compatible.
De manière préférée, les groupes réactifs G2 et G3 sont indépendamment l'un de l'autre choisis parmi une amine (éventuellement protégée sous forme ¨NHBoc), un ester de succinimidyle, un ester d'hydroxysuccinimidyle un haloacétamide, une hydrazine, une halotriazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, ou un acide carboxylique (éventuellement protégé sous la forme d'un groupe ¨0O2Me, -0O2tBu). Dans ce dernier cas, l'acide devra être activé sous forme d'ester pour pouvoir réagir avec une espèce nucléophile.
Pour obtenir les composés GTP-gamma-N, on peut faire réagir le GTP directement avec un complexe de lanthanide lorsque ce dernier possède un groupe NH2. On peut également faire réagir le GTP avec un composé de formule 2HN-(CH2),-,-NH2 dans laquelle n est tel que défini ci-dessus et l'un des groupes amino est éventuellement protégé par un groupe protecteur, puis coupler le composé intermédiaire obtenu avec un complexe de lanthanide fonctionnalisé par un groupe réactif G3 tel que défini ci-dessus.
Les composés selon l'invention sont capables de se lier à la protéine G. Cette propriété
est mise en évidence par un immuno-essai basé sur un principe de FRET, en incubant une préparation membranaire comportant des RCPG et une protéine Ga en présence d'un couple de partenaires de FRET constitué d'un composé selon l'invention et d'un anticorps anti-protéine Ga marqué avec un fluorophore accepteur. L'incubation est effectuée en présence ou en absence d'un analogue de GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable, tel que du GTPyS. Lorsque les partenaires du couple de FRET
se lient sur la même protéine Ga, un signal de FRET apparait, démontrant par la même la liaison du composé de l'invention à la protéine Ga. Les composés de l'invention peuvent donc avantageusement être utilisés pour identifier, par la technique de FRET, des molécules susceptibles de moduler l'activation d'un récepteur couplé aux protéines G.
Synthèse Les synthèses des GTP couplés en position gamma à des complexes de lanthanide sont décrites dans les schémas 1 à 19.
Synthèse des composés de la famille GTP-gamma-O (GTPy0) Le composé 2, précurseur des composés de l'invention (complexe de lanthanide GTP) peut être synthétisé en suivant les protocoles connus de l'homme du métier. A
partir du GTP disponible commercialement, le groupe de liaison L1 est introduit en position gamma du GTP par substitution nucléophile entre le GTP et le groupe de liaison possédant un groupement partant (I, Br, mésyle, tosyle) en position alpha et un groupement amino protégé sur sa position oméga conduisant ainsi au composé 1.
Des exemples analogues de couplage sont disponibles lorsque P = CBz ou COCF3 (cf.
WO
2009/105077 ou WO 2009/091847). Le groupement protecteur est supprimé en utilisant les conditions de déprotection correspondantes aux groupements protecteurs (cf. WO
2009/014612). Le composé 2 est alors couplé de façon covalente via une liaison amide au complexe de lanthanide en utilisant les méthodes classiques connues de l'homme de l'art (schéma 1).
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Schéma 1 Une autre alternative pour coupler le complexe de lanthanide en position gamma du GTP
est l'utilisation de la click chemistry . Pour cela il faut dans un premier temps introduire 5 soit un groupement azido (schéma 2) ou un groupement acétylénique (schéma 3).
Comme précédemment, ces groupements sont introduits via une réaction de substitution nucléophile entre le groupe de liaison L2 ou L3 avec le GTP (schémas 2 et 3).
Des exemples de couplages entre un nucléotide et un groupe de liaison sont décrits par exemple par Hacker et al. (The Journal of Organic Chemistry, 2012, 77(22), 17450).
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C.4-# }=¨=
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eiveMee, ne e eek. e Schéma 3 A l'inverse, le groupement acétylénique peut être introduit dans une première étape sur le GTP conduisant aux composés de la série 6. Un exemple de couplage sur d'autres nucléotides est disponible dans la littérature (Journal of American Chemical Society, 2003, 125, 9588). Puis la réaction cycloaddition peut être mise en oeuvre avec un complexe de lanthanide fonctionnalisé sous forme azide pour conduire aux composés CLn3+-7a-d.
Synthèse des composés de la famille GTP-gamma-N
De la même façon que pour la famille GTP-gamma-O, les composés GTP-gamma-N
peuvent être préparés selon une stratégie analogue. Le complexe de lanthanide fonctionnalisé NH2 est condensé directement sur la molécule de GTP sans intercaler de linker (schéma 4).
gede.P.Te4.4..ç.tleet:
e 0 0 0 "\=tel s es.
g 4 O ==
OH O1 6,9 mci OHO e i OTP
Schéma 4 Les complexes de lanthanide peuvent être couplés en utilisant une molécule de GTP-gamma-N comportant déjà un groupe de liaison NH2 terminal 9a-e préalablement introduit.
ee:e..Skeetekese...treVieliengsseeteulkeme.
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0 0 0 ees NH: 3, , g. v=,. .
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o ci&Nen \ 0' '0'.
'\
(5H
CLE,OM0e, tee CLee+-10h, tek 3 CtreMet; ne 4 CLe-leet rte e (3...e4liret) net.- 7 Schéma 5 Pour éviter d'utiliser plusieurs équivalents de groupe de liaison di-amino, l'une des fonctions est protégée par exemple par un Cbz ou bien un groupement trifluoroacétate (000F3). Les groupements protecteurs sont ensuite éliminés (dans des conditions évitant l'hydrolyse par voie chimique du GTP) conduisant ainsi aux mêmes composés 9a-e sur lesquels sont couplés les complexes de lanthanide en utilisant les techniques classiques connues de l'homme de l'art (schéma 6).
mateetmeeema !.=.) = es H
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La série des GTP gamma-C est synthétisée par condensation du GDP (guanosine di-phosphate) avec les acides phosphoniques dont la position terminale peut être différemment substitués. Lorsque la position terminale est une fonction amine protégée (trifluoroacétamide 15a-f ou CBz, 16a-f), ces composés sont préparés en utilisant la méthode décrite dans la littérature (EP0959077 (TFA) ; WO 2012/150866 et The journal of Organic Chemistry, 1984, 49, 1158 (Cbz)). Les bromures d'alkyles N-phthalimides (12a-f), sont condensés sur le triéthylphosphite dans une première étape, suivie ensuite par un traitement à l'hydrazine pour déprotéger la fonction amine. Les phosphonates d'éthyle sont hydrolysés en présence d'acide bromhydrique pour conduire aux composés 14a-f. La fonction amine primaire est protégée soit par un CBz soit par un trifluoroacétamide afin d'éviter une réaction d'auto-condensation lors de la réaction de couplage avec le GDP. Cette séquence réactionnelle permet d'obtenir les composés intermédiaires 15a-f et 16a-f.
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Schéma 7 5 Au lieu d'introduire une fonction amine primaire masquée, il est également possible de disposer de GTP-gamma-C dont la partie terminale du linker est un motif acétylénique.
Cette fonction permet de réaliser une réaction de Click Chemistry entre le GTP-gamma-C acétylénique et un complexe de lanthanide portant une fonction azide disponible pour une réaction de couplage. Le schéma 8 décrit brièvement les différents 10 intermédiaires préparés selon les protocoles disponibles dans la littérature (Bioorganic Medicinal Chemistry, 2018, 26, 191 et Angewandte Chemie International Edition, 2011, 50, 10699). Les dérivés bromures d'alkyle acétylénique commerciaux sont condensés sur du triméthylsilyl phosphonite, puis hydrolysés pour conduire à la série 18a-f.
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2) H20 OH
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une fonction permettant la bioconjugaison. Dans cette approche, le groupement azido est introduit sur l'acide phosphonique en utilisant la séquence décrite dans le schéma 9. Les protocoles sont décrits dans la littérature, par exemple dans Chemistry, A European Journal, 2010, 16, 12718, Langmuir, 2010, 26, 10725, ou bien encore dans The Journal of Organic Chemistry, 2012, 77, 10450. Les dérivés dibromés réagissent avec le triéthylphosphonite pour donner les composés 20a-f. La fonction azido est ensuite introduite par une simple substitution nucléophile avec l'azoture de sodium. Les di-esters sont ensuite hydrolysés en présence de TMS-Br ce qui conduit aux dérivés 22a-f.
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teze cui-4,2eei,e ,7 Schéma 13 De la même façon que pour les GTP, l'analogue GPPNHP (commercial, CAS : 64564-0) peut être couplé avec des complexes de lanthanide en position gamma en utilisant les mêmes stratégies de synthèse. Pour les dérivés substitués en gamma 0, la synthèse est décrite par exemple dans le schéma 14. Pour les dérivés substitués en gamma N, les synthèses sont décrites dans les schémas 15 et 16. Ces couplages ont été
également exemplifiés dans la demande WO 2009/068751 qui utilise des analogues de l'ATP.
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04 et C11. De manière tout à fait avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+
est le complexe 02 ou le complexe 03.
Les complexes de lanthanide Cl à 090 sont décrits dans les publications ci-après. Ces complexes soit sont disponibles dans le commerce, soit peuvent être obtenus par les voies de synthèses décrites dans lesdites publications.
Cl : WO 03/076938 02 : EP-A-0 203 047 03-04 : WO 2008/025886 05: Spectrochimica Acta ; Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2001, 57(11), 2197.
06: Spectrochimica Acta ; Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2001, 57(11),2197.
07 : Analytical Biochemistry, 2000, 286(1), 17.
08 : WO 01/96877 09: Spectrochimica Acta ; Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2001, 57(11), 2197.
010 : WO 01/96877 Cl 1 : WO 2008/063721 012- C17 : WO 2017/098180.
018- C20 : WO 2013/011236 021-035 : WO 2014/111661 .. 036-044 : WO 2018/229408 045-047 : Organic & Biomolecular Chemistry, 2012, 10, 8509.
048 : WO 2010/084090 049 : WO 2009/010580 050-051 : Chemical Communications, 2007, 3841 052 : WO 2006/120444 053 : European Journal of lnorganic Chemistry, 2010, 3961.
054: Bioconjugate Chemistry, 2009, 20(3), 625.
055: EP-A-0 770 610 056 : WO 2016/106241 057-058 : EP-A-0 770 610 059-060 : Analytical Chemistry, 2003, 75, 3193-3201 061 : Bioconjugate Chemistry, 1997, 8(2), 127 062 : WO 93/11433 063 : US5696240 .. 064a -081b : WO 2018/22932 082 : WO 2010/070232 083-085 : WO 2018/045385 C86a-b : Analyst, 2010, 135(1), 42 087-089 : Chemistry ¨ A European Journal, 2011, 17, 9164 090: Journal of the American Chemical Society, 2004, 126(15), 4888 La synthèse des composés de formule (I) est décrite plus en détail ci-après dans les schémas 1 à 19. Typiquement ces composés sont obtenus par des techniques de conjugaison de deux molécules organiques basées sur l'utilisation de groupes réactifs, techniques qui relèvent des connaissances générales de l'homme du métier et qui sont décrites par exemple dans Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, Academic Press, Second Edition 2008, p. 169-211. Pour obtenir les composés GTP-gamma-O, on fait tout d'abord réagir le GTP avec un composé de formule G2-L-G1, et le composé
intermédiaire ainsi formé est conjugué avec le complexe de lanthanide. Dans cette formule G2-I--G1 :
L est le groupe de liaison divalent tel que défini ci-dessus ;
Giest un groupe réactif électrophile capable de réagir avec la fonction OH du phosphate en position gamma du GTP ;
G2 est un groupe réactif capable de réagir avec un groupe réactif (G3) porté
par le complexe de lanthanide Ln3 .
La réaction de conjugaison entre le composé intermédiaire (comportant un groupe réactif G2) et le complexe de lanthanide (comportant un groupe réactif G3), entraîne la formation d'une liaison covalente comportant un ou plusieurs atomes du groupe réactif.
Dans un mode de réalisation, le groupe électrophile G1 est :
- soit un groupe OH activé par un réactif formant de façon intermédiaire une espèce réactive pouvant réagir avec la fonction hydroxyle du phosphate en position gamma, - soit un groupement réactif de type groupement partant, comme par exemple un chlorure aliphatique, un bromure aliphatique, un iodure aliphatique, un mésylate aliphatique, un tosylate aliphatique, un triflate aliphatique, etc.
Dans un mode de réalisation, les groupes réactifs G2 et G3 sont indépendamment l'un de l'autre choisi parmi l'un des groupes suivants : un acrylamide, une amine éventuellement activée (par exemple une cadavérine ou une éthylènediamine), un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, telle que la monochlorotriazine, la dichlorotriazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, un thiol, une cétone, un halogénure d'acide, un ester de succinimidyle, un ester d'hydroxysuccinimidyle, un ester d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un 3-(2-pyridyldithio)-propionamide, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et en particulier un groupe choisi parmi les groupes de formules :
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V w y w ( 11 NH)-(CH2)-NH2 ( 11 NH-)-(CH2)-N3 y w y w ( 11 NH)-(CH2)-SH
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y y w ------Cl N-(\
( 11 NH)-(CH2)-NH- \ N
y w N=( CI
dans lesquelles w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué
par un atome d'halogène.
G2 et G3 peuvent provenir de leur forme protégée par un groupe protecteur compatible.
De manière préférée, les groupes réactifs G2 et G3 sont indépendamment l'un de l'autre choisis parmi une amine (éventuellement protégée sous forme ¨NHBoc), un ester de succinimidyle, un ester d'hydroxysuccinimidyle un haloacétamide, une hydrazine, une halotriazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, ou un acide carboxylique (éventuellement protégé sous la forme d'un groupe ¨0O2Me, -0O2tBu). Dans ce dernier cas, l'acide devra être activé sous forme d'ester pour pouvoir réagir avec une espèce nucléophile.
Pour obtenir les composés GTP-gamma-N, on peut faire réagir le GTP directement avec un complexe de lanthanide lorsque ce dernier possède un groupe NH2. On peut également faire réagir le GTP avec un composé de formule 2HN-(CH2),-,-NH2 dans laquelle n est tel que défini ci-dessus et l'un des groupes amino est éventuellement protégé par un groupe protecteur, puis coupler le composé intermédiaire obtenu avec un complexe de lanthanide fonctionnalisé par un groupe réactif G3 tel que défini ci-dessus.
Les composés selon l'invention sont capables de se lier à la protéine G. Cette propriété
est mise en évidence par un immuno-essai basé sur un principe de FRET, en incubant une préparation membranaire comportant des RCPG et une protéine Ga en présence d'un couple de partenaires de FRET constitué d'un composé selon l'invention et d'un anticorps anti-protéine Ga marqué avec un fluorophore accepteur. L'incubation est effectuée en présence ou en absence d'un analogue de GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable, tel que du GTPyS. Lorsque les partenaires du couple de FRET
se lient sur la même protéine Ga, un signal de FRET apparait, démontrant par la même la liaison du composé de l'invention à la protéine Ga. Les composés de l'invention peuvent donc avantageusement être utilisés pour identifier, par la technique de FRET, des molécules susceptibles de moduler l'activation d'un récepteur couplé aux protéines G.
Synthèse Les synthèses des GTP couplés en position gamma à des complexes de lanthanide sont décrites dans les schémas 1 à 19.
Synthèse des composés de la famille GTP-gamma-O (GTPy0) Le composé 2, précurseur des composés de l'invention (complexe de lanthanide GTP) peut être synthétisé en suivant les protocoles connus de l'homme du métier. A
partir du GTP disponible commercialement, le groupe de liaison L1 est introduit en position gamma du GTP par substitution nucléophile entre le GTP et le groupe de liaison possédant un groupement partant (I, Br, mésyle, tosyle) en position alpha et un groupement amino protégé sur sa position oméga conduisant ainsi au composé 1.
Des exemples analogues de couplage sont disponibles lorsque P = CBz ou COCF3 (cf.
WO
2009/105077 ou WO 2009/091847). Le groupement protecteur est supprimé en utilisant les conditions de déprotection correspondantes aux groupements protecteurs (cf. WO
2009/014612). Le composé 2 est alors couplé de façon covalente via une liaison amide au complexe de lanthanide en utilisant les méthodes classiques connues de l'homme de l'art (schéma 1).
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Schéma 1 Une autre alternative pour coupler le complexe de lanthanide en position gamma du GTP
est l'utilisation de la click chemistry . Pour cela il faut dans un premier temps introduire 5 soit un groupement azido (schéma 2) ou un groupement acétylénique (schéma 3).
Comme précédemment, ces groupements sont introduits via une réaction de substitution nucléophile entre le groupe de liaison L2 ou L3 avec le GTP (schémas 2 et 3).
Des exemples de couplages entre un nucléotide et un groupe de liaison sont décrits par exemple par Hacker et al. (The Journal of Organic Chemistry, 2012, 77(22), 17450).
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eiveMee, ne e eek. e Schéma 3 A l'inverse, le groupement acétylénique peut être introduit dans une première étape sur le GTP conduisant aux composés de la série 6. Un exemple de couplage sur d'autres nucléotides est disponible dans la littérature (Journal of American Chemical Society, 2003, 125, 9588). Puis la réaction cycloaddition peut être mise en oeuvre avec un complexe de lanthanide fonctionnalisé sous forme azide pour conduire aux composés CLn3+-7a-d.
Synthèse des composés de la famille GTP-gamma-N
De la même façon que pour la famille GTP-gamma-O, les composés GTP-gamma-N
peuvent être préparés selon une stratégie analogue. Le complexe de lanthanide fonctionnalisé NH2 est condensé directement sur la molécule de GTP sans intercaler de linker (schéma 4).
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Schéma 4 Les complexes de lanthanide peuvent être couplés en utilisant une molécule de GTP-gamma-N comportant déjà un groupe de liaison NH2 terminal 9a-e préalablement introduit.
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La série des GTP gamma-C est synthétisée par condensation du GDP (guanosine di-phosphate) avec les acides phosphoniques dont la position terminale peut être différemment substitués. Lorsque la position terminale est une fonction amine protégée (trifluoroacétamide 15a-f ou CBz, 16a-f), ces composés sont préparés en utilisant la méthode décrite dans la littérature (EP0959077 (TFA) ; WO 2012/150866 et The journal of Organic Chemistry, 1984, 49, 1158 (Cbz)). Les bromures d'alkyles N-phthalimides (12a-f), sont condensés sur le triéthylphosphite dans une première étape, suivie ensuite par un traitement à l'hydrazine pour déprotéger la fonction amine. Les phosphonates d'éthyle sont hydrolysés en présence d'acide bromhydrique pour conduire aux composés 14a-f. La fonction amine primaire est protégée soit par un CBz soit par un trifluoroacétamide afin d'éviter une réaction d'auto-condensation lors de la réaction de couplage avec le GDP. Cette séquence réactionnelle permet d'obtenir les composés intermédiaires 15a-f et 16a-f.
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Schéma 7 5 Au lieu d'introduire une fonction amine primaire masquée, il est également possible de disposer de GTP-gamma-C dont la partie terminale du linker est un motif acétylénique.
Cette fonction permet de réaliser une réaction de Click Chemistry entre le GTP-gamma-C acétylénique et un complexe de lanthanide portant une fonction azide disponible pour une réaction de couplage. Le schéma 8 décrit brièvement les différents 10 intermédiaires préparés selon les protocoles disponibles dans la littérature (Bioorganic Medicinal Chemistry, 2018, 26, 191 et Angewandte Chemie International Edition, 2011, 50, 10699). Les dérivés bromures d'alkyle acétylénique commerciaux sont condensés sur du triméthylsilyl phosphonite, puis hydrolysés pour conduire à la série 18a-f.
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une fonction permettant la bioconjugaison. Dans cette approche, le groupement azido est introduit sur l'acide phosphonique en utilisant la séquence décrite dans le schéma 9. Les protocoles sont décrits dans la littérature, par exemple dans Chemistry, A European Journal, 2010, 16, 12718, Langmuir, 2010, 26, 10725, ou bien encore dans The Journal of Organic Chemistry, 2012, 77, 10450. Les dérivés dibromés réagissent avec le triéthylphosphonite pour donner les composés 20a-f. La fonction azido est ensuite introduite par une simple substitution nucléophile avec l'azoture de sodium. Les di-esters sont ensuite hydrolysés en présence de TMS-Br ce qui conduit aux dérivés 22a-f.
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également exemplifiés dans la demande WO 2009/068751 qui utilise des analogues de l'ATP.
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Schéma 16 5 De la même façon que pour les GTP, l'analogue GPPCH2P (commercial, CAS :
1 ou 10470-57-2 sous forme de sel de Na)) peut être couplé avec des complexes de lanthanide en position gamma en utilisant les mêmes stratégies de synthèse.
Pour les dérivés substitués en gamma 0, la synthèse est décrite par exemple dans le schéma 17.
Pour les dérivés substitués en gamma N, les synthèses sont décrites dans les schémas 10 18 et 19. Ces couplages ont été également exemplifiés dans la demande WO
2009/068751 qui utilise des analogues de l'ATP.
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GPPC.Hee -C Le-43 Schéma 19 L'invention est illustrée par les exemples ci-après, donnés à titre illustratif.
Abréviations utilisées BRET : Bioluminescence resonance Energy Transfer BSA : Albumine de sérum bovin DMSO : diméthylsulf oxyde EDC : N-(3-diméthylaminopropyh-n-ethylcarbodiimide éq : équivalent ESI + : ionisation par électronébulisation en mode positif.
FRET : Rirster resonance energy transfer (transfert d'énergie par resonance de type Rirster GDP : guanosine diphosphate GPCR (RCPG) : G protein-coupled receptors GTP : guanosine triphosphate GTPyS : guanosine 5'-[y-thio]triphosphate h : heure HEPES : acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthanesulfonique HPLC : chromatographie liquide à haute performance LC-MS : chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse LRMS : spectrométrie de masse à faible résolution MES : acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique MOPS : acide 3-morpholino-1-propanesulfonique NOS : isothiocyanate NHS : N-hydroxysuccinimide Py : pyridine RCPG : récepteurs couplés aux protéines G
TA : température ambiante TEA : triéthylamine TRIS : trishydroxyméthylaminométhane UPLC : chromatographie liquide à ultra haute performance UPLC-MS : chromatographie liquide à ultra haute performance couplée à la spectrométrie de masse UV: Ultraviolet Chromatographie Les chromatographies liquides à haute performance (HPLC) analytiques et préparatives ont été effectuées sur deux appareils :
HPLC Analytique : ThermoScientific, pompe quaternaire P4000, Détecteur UV 1000 à
lampe au deutérium (190-350 nm), colonne analytique Waters XBridge 018, 3,5 11m, 4,6 x 100 mm.
HPLC Préparative : Shimadzu, 2 pompes LC-8A, détecteur UV à barrette de diodes Varian ProStar, colonne préparative Waters XBridge prép. 018, 5 prn: 19 x 100 mm ou 50 x 150 mm.
Les chromatographies liquides à Ultra-haute performance (UPLC) analytiques ont été
réalisées sur un appareil Waters Acquity HClass avec comme détecteur soit un détecteur UV à barrette de diode de type PDA, soit un détecteur de masse simple quadripolaire de type SQD2. La sonde utilisée est un électro-spray en mode positif : tension de capillaire à
3,2 KV - tension de cône à 30 V.
Gradient A: Colonne Waters Xbridge 018,5 iim, 10 x 100 mm, A/ eau 25 mM
acétate de triéthylammonium pH 7 ¨ B/ acétonitrile - t = 0 à 5 min 1 % B - t = 10 min 10 %
B - 20 mL.min-là 260 nm.
Gradient B
Colonne Waters Xbridge C18, 5 iim, 4,6 x 100 mm, A/ eau 25 mM acétate de triéthylammonium pH 7 ¨ B/ acétonitrile - t = 0 à 2 min 2 % B - t = 19 min 40 % B. 1 mL.min-1.
Gradient C
Colonne Waters Xbridge C18, 3,5 lm, 4,6 x 100 mm ¨ A / eau 5 mM acétate d'ammonium pH 5 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B ¨ t = 1 min 2 % B - t = 15 min 40 % B ¨
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1 ou 10470-57-2 sous forme de sel de Na)) peut être couplé avec des complexes de lanthanide en position gamma en utilisant les mêmes stratégies de synthèse.
Pour les dérivés substitués en gamma 0, la synthèse est décrite par exemple dans le schéma 17.
Pour les dérivés substitués en gamma N, les synthèses sont décrites dans les schémas 10 18 et 19. Ces couplages ont été également exemplifiés dans la demande WO
2009/068751 qui utilise des analogues de l'ATP.
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Abréviations utilisées BRET : Bioluminescence resonance Energy Transfer BSA : Albumine de sérum bovin DMSO : diméthylsulf oxyde EDC : N-(3-diméthylaminopropyh-n-ethylcarbodiimide éq : équivalent ESI + : ionisation par électronébulisation en mode positif.
FRET : Rirster resonance energy transfer (transfert d'énergie par resonance de type Rirster GDP : guanosine diphosphate GPCR (RCPG) : G protein-coupled receptors GTP : guanosine triphosphate GTPyS : guanosine 5'-[y-thio]triphosphate h : heure HEPES : acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthanesulfonique HPLC : chromatographie liquide à haute performance LC-MS : chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse LRMS : spectrométrie de masse à faible résolution MES : acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique MOPS : acide 3-morpholino-1-propanesulfonique NOS : isothiocyanate NHS : N-hydroxysuccinimide Py : pyridine RCPG : récepteurs couplés aux protéines G
TA : température ambiante TEA : triéthylamine TRIS : trishydroxyméthylaminométhane UPLC : chromatographie liquide à ultra haute performance UPLC-MS : chromatographie liquide à ultra haute performance couplée à la spectrométrie de masse UV: Ultraviolet Chromatographie Les chromatographies liquides à haute performance (HPLC) analytiques et préparatives ont été effectuées sur deux appareils :
HPLC Analytique : ThermoScientific, pompe quaternaire P4000, Détecteur UV 1000 à
lampe au deutérium (190-350 nm), colonne analytique Waters XBridge 018, 3,5 11m, 4,6 x 100 mm.
HPLC Préparative : Shimadzu, 2 pompes LC-8A, détecteur UV à barrette de diodes Varian ProStar, colonne préparative Waters XBridge prép. 018, 5 prn: 19 x 100 mm ou 50 x 150 mm.
Les chromatographies liquides à Ultra-haute performance (UPLC) analytiques ont été
réalisées sur un appareil Waters Acquity HClass avec comme détecteur soit un détecteur UV à barrette de diode de type PDA, soit un détecteur de masse simple quadripolaire de type SQD2. La sonde utilisée est un électro-spray en mode positif : tension de capillaire à
3,2 KV - tension de cône à 30 V.
Gradient A: Colonne Waters Xbridge 018,5 iim, 10 x 100 mm, A/ eau 25 mM
acétate de triéthylammonium pH 7 ¨ B/ acétonitrile - t = 0 à 5 min 1 % B - t = 10 min 10 %
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Gradient B
Colonne Waters Xbridge C18, 5 iim, 4,6 x 100 mm, A/ eau 25 mM acétate de triéthylammonium pH 7 ¨ B/ acétonitrile - t = 0 à 2 min 2 % B - t = 19 min 40 % B. 1 mL.min-1.
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Colonne Waters Xbridge C18, 5 lm, 19 x 100 mm ¨ A / eau 5 mM acétate d'ammonium pH
6,6 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B ¨ t = 2,5 min 2 % B - t = 27 min 40 % B ¨
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280 et 320 nm.
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Colonne Waters Xbridge C18, 5 iim, 19 x 100 mm ¨ A / eau 25 mM acétate de triéthylammonium pH 7 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B ¨ t = 2 min 2 % B - t =
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Gradient F
Colonne Waters Acquity C18, 300 A, 1,7 iim, 2,1 x 50 mm ¨ A / eau 5 mM acétate d'ammonium pH 5 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B ¨ t = 0,2 min 2 % B - t = 5 min 40 % B ¨
0,6 mL.min-1 Gradient G
Colonne Waters XBridge C18, 300 A, 5 iim, 10 x 100 mm ¨ eau 25 mM acétate de triéthylammonium B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - B ¨ t = 19 min 20 % B - 5 mL.min-1 Gradient H
Colonne Waters Xbridge C18, 5 iim, 4,6 x 100 mm, A/ eau 25 mM acétate de triéthylammonium pH 7¨ B/ acétonitrile - t = 0 à 2 min 2 % B - t = 19 min 50 %
mL.min-1.
Gradient I
Colonne Waters Xbridge C18, 5 m, 10 x 100 mm ¨ A / eau 25 mM acétate de triéthylammonium pH 7 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B ¨ t = 2 min 2 % B - t =
27 min 50 %
B ¨ 3,5 mL.min-là 280 nm.
5 Gradient J
Colonne Waters XBridge C18, 5 lm, 19 x 100 mm ¨ eau 25 mM acétate de triéthylammonium B / acétonitrile t = 0 min 5 % B - B ¨ t = 17 min 45 % B - 20 mL.min-1 Gradient K
Colonne Waters XBridge C18, 300 Å, 5 m, 10 x 100 mm ¨ eau 25 mM acétate de 10 triéthylammonium B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - B ¨ t = 19 min 40 %
B - 5 mL.min-1 Préparation des composés Préparation 1 : GTP gamma-N-pentyl-NH2 (9c) ,=!1 s'e4 e \
ï
...) 0 0 e) O.
-sewg beje-e)J
?::eq MCeS a Z:eire=
Dans un ballon contenant le GTP (10 mg; 19,1 mol, 1 éq) en solution dans de l'eau (500 15 L), a été ajouté de l'EDC (40 mg; 210 mol, 11 éq) et une solution de cadavérine (58 mg, 573 mol, 30 éq) dans du MOPS à pH 8. Le mélange réactionnel a été agité
pendant une nuit à TA avant d'être purifié par HPLC préparative (Gradient A). Un solide blanc est obtenu correspondant au composé 9c (5 mg). (ESI+) : calculée C15H28N7013P3 [M+H], m/z = 608,10 trouvée 608,55.
20 Préparation 2 : GTP gamma-0-hexyl-C2 'Wkel`>ffl, e .
=== = U2222X22.2:eb0e8M "L.
J
*2;&i (1? ' ¨sfr ¨ ====,.
;:) 1 =
e=mseesetk*.e ez,eee em=ekeme-o emymee õe ye Aune solution de composé 2c (0,454 mg, 700 nmol) dans du tampon carbonate 100 mM
pH 9 (500 L) a été ajouté le complexe C2 fonctionnalisé sous sa forme NCS
(isothiocyanate) (473 g, 700 nmol) en solution dans du DMSO (200 L) en une seule fois. Le mélange a été agité à TA pendant une nuit. L'avancement de la réaction a été
suivi par HPLC (gradient B) et UPLC-MS (Gradient C), après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC semi-préparative (Gradient D) pour conduire au composé GTP gamma-0 hexyl-02 (125 g, 96 nmol, 14%) sous forme de poudre blanche LRMS (ESI+) : calculée pour C401-147EuN10022P3S-[M+3H]2 , m/z = 650,06 trouvée 650,32.
Préparation 3 : GTP gamma-0-hexyl-C3 >4., ,,e= w 0 ,.$00pk'02 .z.',01`,0.t.e C e `:' e '`''' \ :',ie .s.=': .
ssee'sffl . pl :5 >".:4 =
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\ \ e i ,,,e 1 Mesteeeee-0 hoee-exem eilei,,emeee hR<;444% ...k.
se, r 4 .,.......õ,,:õ.õ,....,,,,, 1:::....:,<:>..., --..-) =-=:' ...`?...X%;
A une solution de composé 2c (0,442 mg, 710 nmol) dans du tampon carbonate 100 mM
pH 9 (200 L) a été ajouté le complexe C3 fonctionnalisé sous sa forme dichlorotriazine (0,647 mg, 708 nmol) en solution dans du tampon carbonate 100 mM pH 9 (200 L) en une seule fois. Le mélange a été agité à 4 C pendait une nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (Gradient C), après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (Gradient E) pour conduire au composé GTP gamma-0-hexy1-03 (0,11 mg, 70 nmol, 10%) sous forme de poudre blanche LRMS (ESI+) : calculée pour C501-153CIEuN15022P3-[M+311]2 , m/z = 749,59 trouvée 750,29.
Préparation 4: GTP gamma-N-C2 N ---L.
e 'il r O ?.... -- --Ne NH
O
m ri 2: 2:2 t J
H OH OH
C> e III
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DC, ME$
GTP e.- ..- ::,,, =-4=,,, .. ,...N
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.....,N, txõ.$:
..,,N
0..."' ')L A, r s.
0¨o- ''o-o¨o C2 GTP-wentee-N42 Le complexe C2 (0,366 mg, 2 mol) a été solubilisé dans du tampon MES 500 mM
pH 5,5 (150 L) pour donner une solution jaune. Au mélange réactionnel a été ajouté
le GTP
(1,32 mg, 2,4 mol) puis le EDC (1,92 mg, 10 mol) en une seule fois. Le mélange a été
agité à TA pendant 40 h. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS
(Gradient F), après cette période la réaction était partielle et n'évoluait plus. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (Gradient G) pour conduire au GTP
gamma-N-02 (60 nmol, 3%) sous forme d'huile incolore LRMS (ESI+) : calculée pour C33H34N9021P3Eu- [My, m/z = 1137,6, trouvée 1138,2.
Préparation 5: GTP-gamma-N-C3 ......,, .....
,:tZ.,1 es j 7-Nit.. e e e ,...i... . HN OH OH
... ...:õ ....ç i:
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gõ) r ......,:!õ) Evc. ws , 1, -L, GYP
Igb: =2= r .s..
, '0.,<; s,õel ...-CO,k ..
c...-i: G TP -puyer;a.,N.43 Le complexe C3 (0,366 mg, 480 nmol) a été solubilisé dans du tampon MES 500 mM
pH
5,5 (150 L) pour donner une solution jaune. Au mélange réactionnel a été
ajouté le GTP
(0,317 mg, 576 nmol) puis le EDC (0,460 mg, 2,4 mol) en une seule fois. Le mélange a été agité à TA pendant 1 nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS
(Gradient F), après cette période la réaction était partielle et n'évoluait plus. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (Gradient G) pour conduire au GTP gamma-N-03 (45,6 nmol, 9,5%) sous forme d'huile incolore LRMS (ESI+) :
calculée pour 041 H431\111021 P3EU- [M+21-1]+, rrik = 1269,7, trouvée 1269.
Préparation 6: GTP-gamma-N-octyl-C2 T--11,-Ni H SH 9 9 9 N
Nel'NH2 H 9 9 9 N NNH2 H20, Et3N
pyrichne 'H
H2Nk-1."(N-PJHO-S¨H 9-P(s-HO-1 OH OH
C2-N=C=S
OH OH
C2-NCS I GTP-gamma-N octyl-C2 GTP-gamma-N octyl-NH2 9e N Eu3' N
r Le composé 9e (50,0 L, 500 nmol) a été solubilisé dans de l'eau (100 L). Au mélange réactionnel a été ajouté de la pyridine (300 L) et de la triéthylamine (6 L). Le mélange réactionnel a été ajouté dans un tube contenant le complexe C2 fonctionnalisé
sous sa .. forme NOS (isothiocyanate) (0,438 mg, 650 nmol) en une seule fois. Le mélange a été
agité à 24 C pendant 12 h. L'avancement de la réacton a été suivi par UPLC-MS
(Gradient F), après cette période la réaction était partielle. Le mélange réactionnel a été
directement purifié par HPLC préparative (Gradient G) pour conduire au GTP-gamma-N-octyl-02 (16,9 nmol, 3,4%) sous forme d'huile incolore LRMS (ESI+) : calculée pour C42H52N11021P3SEu- [M+311]2 , m/z = 663,5, trouvée 663,9.
Préparation 7: GTP-gamma-N-octyl-C3 ,1 e=ii ,X....t , =:.z:
.e. =-i ,iz.A
â1 -seveez, .n.e.ex-so..,, C ; 0 eevy Isi:
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t,i s'>'=.,$n kYs'' .*: :t s ,L. ='"" \ s''''' C t.':= '==:.. ..t.:4;i -<:::=-e¨k>ie.*:,") = k s-==r CK 61 s.>:: ' ".~ e''''4 Q
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feevenmnt=el s'eh% eeeem eu< f li, (( s'ty- --%-= -i-s' t.,=. ,,; i c,i (.r..e :::g .,'=,:
Aune solution de composé 9e (0,545 mg, 840 nmol) dans du tampon carbonate 100 mM
pH 9 (500 L) a été ajouté le complexe C3 fonctionnalisé sous sa forme dichlorotriazine (400 g, 438 nmol) en solution dans de l'eau (200 L) en une seule fois. Le mélange a été
agité à 20 C pendant une nuit. L'avancement de la éaction a été suivi par HPLC
(Gradient H) et UPLC-MS (Gradient C). Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC semi-préparative (Gradient I) pour conduire au composé GTP gamma-N octyl 03 (7,6 g, 5 nmol, 1%) sous forme de poudre blanche LRMS (ESI+) : calculée pour C52H58CIEuN16021P3- [M+3H]2 , m/z =
763,11 trouvée 763,29.
Préparation 8: GTP-gamma-N-hexyl-C11 ,.. , =,').)-=:.
Iese\-:,i ki ,,L, le' \
'sl e.:,..., µ...ii '?. :..; ' i = '''' .. '<:' ti: :..;e::e 'µ.
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..................................* ..., ::=>i :, >i er%=5,ffle `"...ffl ,.3.N. .ese ...- i ,i, 6ree8ffl8.* 'i.k..,eie=ei% e ,..: i.: .,:
se ,.=;',4 i...4 ,..,.i,,k,.... _..:,.sek ,::.õ,e.4...,,, õ f., ' 'b 1.3.*,,,Mxil tiame4::-:e A une solution de composé 9d (0,62 mg, 1 mol) dans du tampon HEPES 50 mM pH 8 (900 L) a été ajouté le complexe C11 fonctionnalisé sous forme ester de NHS
(1,47 mg, 1 mol) en solution dans du DMSO anhydre (122 L) en une seule fois. Le mélange a été
agité à 24 C pendant 1 h. L'avancement de la réactbn a été suivi par UPLC-MS
(Gradient F), après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été
directement purifié par HPLC préparative (Gradient J) pour conduire au composé GTP-gamma-N-hexyl-C11 (0,52 mg, 258 nmol, 26%) sous forme de poudre blanche LRMS (ESI+) :
calculée pour C80H109N20027P3Tb3+ [M-H]2 , m/z = 1018,9, trouvée 1019,6, [M+2Na+-3H]2 , m/z = 1040,8, trouvée 1041,6.
Préparation 9: GTP-gamma-N-octyl-C11 s.õ 5.=
, s, =
e sL, _______________________________ Å
< en=ffle eyeklekem=ee ::; eiµ
= =
$z.t e%
. . . . . .
5 ee>sesep,- = seteel:
A une solution de composé 9e (0,32 mg, 500 nmol) dans du tampon HEPES 50 mM pH
(300 L) a été ajouté le complexe C11 fonctionnalisé sous forme ester de NHS
(0,76 mg, 500 nmol) en solution dans du DMSO anhydre (102 L) en une seule fois. Le mélangea été agité à 24 C pendant 1 h. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS
10 (Gradient F), après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été
directement purifié par HPLC préparative (Gradient K) pour conduire au composé
GTP-gamma N-octyl Cl 1 (0,22 mg, 105 nmol, 21%) sous forme de poudre blanche LRMS
(ESI+) : calculée pour C82H117N20027P3Tb3+ [M-2H], m/z = 2064,8, trouvée 2064,1.
Préparation 10: GTP-gamma-N-octyl-thiosuccinimidyl C2 C2,NINH
H
O
eNXILN e'NH2 S H
H
j O¨N Fc;HO L 0 L0-1 c4, 0 0 0 N NH 2 Iii0 H
OH OH
HN OH OH OH C2-thio succinimichrl-NHS
OH OH HEPES, DMSO r N 0-GTP-gamma-N octyl-N112 GTP-gamma-N octyl-thiosuccinimichrl C2 15 9e Le composé 9e (0,649 mg, 1 mol) en solution dans de l'eau (100 L) a été
dilué dans du tampon HEPES 50 mM pH 8 (757 L) pour donner une solution incolore. Au mélange réactionnel a été ajouté le complexe C2 fonctionnalisé sous sa forme NHS
(ester de N-20 hydroxysuccinimide) (750 L, 1 mol) en solution dans du DMSO anhydre (143 L) en une seule fois. La réaction a été agitée à 25 C perdant 1 h. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (Gradient B). Après cette période, la réaction n'était pas totale.
Malgré cela, le mélange réactionnel a été purifié 2 fois par HPLC préparative (Gradient E).
Les fractions correspondant au produit attendu ont été collectées puis concentrées sous pression réduite pour conduire au composé GTP-gamma-N-octyl-thiosuccinimidyl-(0,241 mol, 24%) sous forme d'une solution incolore. LRMS (ESI+) : calculée pour C51H68EuNi3024P3S2+ [M+H]+, m/z = 1555.8, trouvée 1555.8.
Tests de liaison Matériels - les préparations membranaires de cellules exprimant des RCPG et la protéine G-alpha-i (Gai) ont été achetées chez Perkin Elmer ou Euroscreen. Le tableau ci-dessous liste les fonds cellulaires et références des différents échantillons utilisés :
[Tableau 1]
Fond Fournisseur Référence cellulaire Delta Opioïde H EK293 Perkin Elmer 6110549400UA
Delta Opioïde CHO-K1 Euroscreen Service Dopamine D2S CHO-K1 Euroscreen Service - l'anticorps DSV36S a été généré par Cisbio Bioassays et est disponible auprès de Cisbio Bioassays sur demande (sous la référence DSV36S). L'anticorps a été
marqué
avec la sonde fluorescente d2 (accepteur rouge) compatible pour une détection TR-FRET. L'anticorps DSV36S se lie au niveau du switch II de la protéine Gai.
- les nucléotides GTP et GTPyS ont été achetés chez Sigma Aldrich (références catalogues respectives G8877 et G8634).
- les plaques 384 puits Low volume, blanches à fond blanc ont été achetées chez Greiner Bio One (référence Catalogue 784075).
- les analogues de GTP non hydrolysables / lentement hydrolysable marqués avec des fluorophores donneurs de type complexes de lanthanides ont été synthétisés à
Cisbio Bioassays.
Méthodes Préparation des réactifs Hormis autre mention spécifique, tous les réactifs ont été dilués dans du tampon Tris HCI
50 mM pH 7,4, MgCl2 10 mM, BSA 0,1%, NaCI 10 mM. Les membranes ont été
préparées 4X pour distribuer 1 ou 104/puits (quantité spécifiée dans la légende de chaque figure).
Le nucléotide GTPyS (condition signal non spécifique) a été préparé 6.67X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 100 M. L'anticorps anti Gai D5V365-d2 utilisé
pour la détection a été préparé 4X pour viser la concentration finale dans les puits de 10 nM. Les analogues GTP non hydrolysables / lentement hydrolysables marqués avec des sondes fluorescentes donneur (complexes de lanthanides) ont été préparés 4X
pour viser les concentrations finales dans les puits mentionnées dans les légendes de chaque figure.
Distribution des réactifs dans les plaques 384 puits :
- Membranes exprimant le RCPG et la protéine G : 5 L
.. - Tampon ou nucléotide GTPyS (pour la condition signal non spécifique) : 3 L
- Analogue GTP non hydrolysables / lentement hydrolysables ¨ donneur : 5 L
- Anticorps anti Gai -accepteur (DSV36S-d2) : 5 L
- Tampon : 2 L
Le signal non spécifique (bruit de fond de fluorescence) a été mesuré avec des puits contenant un excès de GTPyS (10 ou 100 M).
Lecture du signal HTRF
Les plaques ont été incubées à 21 C pendant 20 h Os le signal HTRF a été
mesuré sur le lecteur PHERAstar (BMG Labtech) avec la configuration suivante :
- Module : HTRF (Excitation 337 nm, Emission 665 nm et 620 nm) - Excitation : laser, 40 flashs ou lamp, 100 flashs - Fenêtre de lecture : délais : 60 s ¨ Intégration : 400 s Traitement du signal A partir des signaux bruts à 665 nm et 620 nm, le Ratio HTRF a été calculé
selon la formule suivante :
Ratio HTRF = [(Signal à 665nm) / (Signal à 620nm)] x 10 000 Format de l'essai La figure 2 illustre le format d'essai utilisé pour détecter la liaison des composés de formule (I) à la protéine G. Une préparation membranaire comportant des RCPG
et des protéines Gai est incubée en présence des composés à tester et d'un anticorps anti-protéine Ga marqué avec un fluorophore accepteur, en présence ou en absence d'un analogue de GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable (typiquement, du GTPyS).
Lorsque les deux partenaires de FRET (composé à tester et anticorps anti-protéine Ga) se lient sur la même protéine Ga, un signal de FRET apparait (partie gauche de la figure :
Signal Total ) et se démarque du signal non spécifique (bruit de fond correspondant à
la partie droite de la figure : Signal Non Spécifique ) qui comporte un fort excès de GTPyS non marqué (déplacement de l'analogue GTP fluorescent).
Exemple 1 ¨ Test de liaison de l'analogue GTPgN-C2 La capacité du couple GTPgN-02 (préparation 2) / anticorps anti- Gai D5V365-d2 à
générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (10 g par puits). Le GTPgN-02 a été
utilisé à une concentration finale de 6nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPyS (100 M). La différence de signal TR-FRET
(Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 16,6) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-02 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 3).
Exemple 2 ¨ Test de liaison de l'analogue GTPgN-C3 La capacité du couple GTPgN-03 (préparation 5)! anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à
générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules HEK293 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (1 g par puits). Le GTPgN-03 a été
utilisé à une concentration finale de 1nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPyS (100 M). La différence de signal TR-FRET
(Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 1,7) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-03 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Ga-accepteur (Figure 4).
Exemple 3¨ Test de liaison de l'analogue GTPgN-octyl-C2 La capacité du couple GTPgN-octyl-02 (préparation 6) / anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à
générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (10 g par puits). Le GTPgN-octyl-02 a été utilisé
à une concentration finale de 6nM dans les puits. Les membranes ont été
incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPyS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 12,4) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-octyl-02 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 5).
Exemple 4¨ Test de liaison de l'analogue GTPgN-octyl-C11 La capacité du couple GTPgN-octyl-C11 (préparation 9)! anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été
mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (10 g par puits). Le GTPgN-octyl-C11 a été
utilisé à une concentration finale de 6 nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPyS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 7,6) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-octyl-C11 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 6).
Exemple 5¨ Test de liaison de l'analogue GTPgN-octyl-C3 La capacité du couple GTPgN-octyl-03 (préparation 7)! anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à
générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules HEK293 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (1 g par puits). Le GTPgN-octyl-03 a été utilisé à
une concentration finale de 1 nM dans les puits. Les membranes ont été
incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPyS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 1,4) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-octyl-03 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 7).
Exemple 6¨ Test de liaison de l'analogue GTPg0-hexyl-C2 La capacité du couple GTPg0-hexyl-02 (préparation 2) / anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à
générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (10 g par puits). Le GTPg0-hexyl-02 a été utilisé
à une concentration finale de 6 nM dans les puits. Les membranes ont été
incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPyS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 7,1) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPg0-hexyl-02 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 8).
Exemple 7¨ Test de liaison de l'analogue GTPg0-hexyl-C3 La capacité du couple GTPg0-hexyl-03 (préparation 3)! anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à
générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules HEK293 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (1 g par puits). Le GTPg0-hexyl-03 a été utilisé
à une concentration finale de 1 nM dans les puits. Les membranes ont été
incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPyS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 1,3) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPg0-hexyl-03 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 9).
Exemple 8¨ Test de liaison de l'analogue GTPgN-octyl-C2 La capacité du couple GTPgN-octyl-02 (préparation 6) / anticorps anti-Gai DSV36S-d2 à
générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Dopamine D2S et la protéine Gai (10 g par puits). Le GTPgN-octyl-02 a été
utilisé à une concentration finale de 6 nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPyS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 3,8) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-octyl-02 est capable de se lier à la protéine Gai 5 et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 10).
Exemple 9 ¨ Effet de la concentration en membranes et en analogue GTP-lanthanide sur le test de liaison de l'analogue GTPgN-octyl-C2 La capacité du couple GTPgN-octyl-02 (préparation 6) / anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à
générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en 10 évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (1 ou 10 g / puits). Le GTPgN-octyl-02 a été
utilisé à une concentration finale de 2 ou 6 nM dans les puits. Les membranes ont été
incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPyS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total (S) / signal non spécifique (B)) observée 15 entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-octyl-02 est capable de se lier à
la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figures 11A et 11B). Par ailleurs, il ressort de la figure 11A qu'une augmentation de l'amplitude de signal (S/B) est observée en augmentant la quantité de membrane de 1 à
10 g par puits. Il ressort de la figure 11B qu'une augmentation de l'amplitude du signal 20 (S/B) est observée en augmentant la concentration de GTPgN-octyl-02 de 2 à 6 nM.
Exemple 10¨ Test de liaison de l'analogue GTPgN-octyl-thiosuccinimidyl C2 La capacité du couple GTPgN-octyl-thiosuccinimidyl 02 (préparation 10) /
anticorps anti-Gai D5V365-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules 25 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (10 g par puits).
Les réactifs ont été
dilués en tampon Tris HCI 50 mM pH 7,4, MgCl2 60 mM, BSA 0,1%, NaCI 150 mM. Le GTPgN-octyl-thiosuccinimidyl 02 a été utilisé à une concentration finale de 7,5 nM dans les puits. Les conjugués fluorescents ont été incubées en absence ou en présence de préparation membranaire. La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal 30 total/signal non spécifique = 2,8) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-octyl-thiosuccinimidyl 02 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 12).
280 et 320 nm.
Gradient E
Colonne Waters Xbridge C18, 5 iim, 19 x 100 mm ¨ A / eau 25 mM acétate de triéthylammonium pH 7 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B ¨ t = 2 min 2 % B - t =
20 min 50 %
B ¨ 20 mL.min-là 280 et 320 nm.
Gradient F
Colonne Waters Acquity C18, 300 A, 1,7 iim, 2,1 x 50 mm ¨ A / eau 5 mM acétate d'ammonium pH 5 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B ¨ t = 0,2 min 2 % B - t = 5 min 40 % B ¨
0,6 mL.min-1 Gradient G
Colonne Waters XBridge C18, 300 A, 5 iim, 10 x 100 mm ¨ eau 25 mM acétate de triéthylammonium B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - B ¨ t = 19 min 20 % B - 5 mL.min-1 Gradient H
Colonne Waters Xbridge C18, 5 iim, 4,6 x 100 mm, A/ eau 25 mM acétate de triéthylammonium pH 7¨ B/ acétonitrile - t = 0 à 2 min 2 % B - t = 19 min 50 %
mL.min-1.
Gradient I
Colonne Waters Xbridge C18, 5 m, 10 x 100 mm ¨ A / eau 25 mM acétate de triéthylammonium pH 7 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B ¨ t = 2 min 2 % B - t =
27 min 50 %
B ¨ 3,5 mL.min-là 280 nm.
5 Gradient J
Colonne Waters XBridge C18, 5 lm, 19 x 100 mm ¨ eau 25 mM acétate de triéthylammonium B / acétonitrile t = 0 min 5 % B - B ¨ t = 17 min 45 % B - 20 mL.min-1 Gradient K
Colonne Waters XBridge C18, 300 Å, 5 m, 10 x 100 mm ¨ eau 25 mM acétate de 10 triéthylammonium B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - B ¨ t = 19 min 40 %
B - 5 mL.min-1 Préparation des composés Préparation 1 : GTP gamma-N-pentyl-NH2 (9c) ,=!1 s'e4 e \
ï
...) 0 0 e) O.
-sewg beje-e)J
?::eq MCeS a Z:eire=
Dans un ballon contenant le GTP (10 mg; 19,1 mol, 1 éq) en solution dans de l'eau (500 15 L), a été ajouté de l'EDC (40 mg; 210 mol, 11 éq) et une solution de cadavérine (58 mg, 573 mol, 30 éq) dans du MOPS à pH 8. Le mélange réactionnel a été agité
pendant une nuit à TA avant d'être purifié par HPLC préparative (Gradient A). Un solide blanc est obtenu correspondant au composé 9c (5 mg). (ESI+) : calculée C15H28N7013P3 [M+H], m/z = 608,10 trouvée 608,55.
20 Préparation 2 : GTP gamma-0-hexyl-C2 'Wkel`>ffl, e .
=== = U2222X22.2:eb0e8M "L.
J
*2;&i (1? ' ¨sfr ¨ ====,.
;:) 1 =
e=mseesetk*.e ez,eee em=ekeme-o emymee õe ye Aune solution de composé 2c (0,454 mg, 700 nmol) dans du tampon carbonate 100 mM
pH 9 (500 L) a été ajouté le complexe C2 fonctionnalisé sous sa forme NCS
(isothiocyanate) (473 g, 700 nmol) en solution dans du DMSO (200 L) en une seule fois. Le mélange a été agité à TA pendant une nuit. L'avancement de la réaction a été
suivi par HPLC (gradient B) et UPLC-MS (Gradient C), après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC semi-préparative (Gradient D) pour conduire au composé GTP gamma-0 hexyl-02 (125 g, 96 nmol, 14%) sous forme de poudre blanche LRMS (ESI+) : calculée pour C401-147EuN10022P3S-[M+3H]2 , m/z = 650,06 trouvée 650,32.
Préparation 3 : GTP gamma-0-hexyl-C3 >4., ,,e= w 0 ,.$00pk'02 .z.',01`,0.t.e C e `:' e '`''' \ :',ie .s.=': .
ssee'sffl . pl :5 >".:4 =
4 J ,e j.....,) se ,..,1 , eõ......,,J,.>.....,r).,.... õ - ,...= . ,: - 1õ0., ,... .,..,....õ ______ ,,.... , e >,:28 ,ek. k'>8 ^Sts,,,,,,, .......
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\ \ e i ,,,e 1 Mesteeeee-0 hoee-exem eilei,,emeee hR<;444% ...k.
se, r 4 .,.......õ,,:õ.õ,....,,,,, 1:::....:,<:>..., --..-) =-=:' ...`?...X%;
A une solution de composé 2c (0,442 mg, 710 nmol) dans du tampon carbonate 100 mM
pH 9 (200 L) a été ajouté le complexe C3 fonctionnalisé sous sa forme dichlorotriazine (0,647 mg, 708 nmol) en solution dans du tampon carbonate 100 mM pH 9 (200 L) en une seule fois. Le mélange a été agité à 4 C pendait une nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (Gradient C), après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (Gradient E) pour conduire au composé GTP gamma-0-hexy1-03 (0,11 mg, 70 nmol, 10%) sous forme de poudre blanche LRMS (ESI+) : calculée pour C501-153CIEuN15022P3-[M+311]2 , m/z = 749,59 trouvée 750,29.
Préparation 4: GTP gamma-N-C2 N ---L.
e 'il r O ?.... -- --Ne NH
O
m ri 2: 2:2 t J
H OH OH
C> e III
...4...
DC, ME$
GTP e.- ..- ::,,, =-4=,,, .. ,...N
qe A, ee'.=
.....,N, txõ.$:
..,,N
0..."' ')L A, r s.
0¨o- ''o-o¨o C2 GTP-wentee-N42 Le complexe C2 (0,366 mg, 2 mol) a été solubilisé dans du tampon MES 500 mM
pH 5,5 (150 L) pour donner une solution jaune. Au mélange réactionnel a été ajouté
le GTP
(1,32 mg, 2,4 mol) puis le EDC (1,92 mg, 10 mol) en une seule fois. Le mélange a été
agité à TA pendant 40 h. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS
(Gradient F), après cette période la réaction était partielle et n'évoluait plus. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (Gradient G) pour conduire au GTP
gamma-N-02 (60 nmol, 3%) sous forme d'huile incolore LRMS (ESI+) : calculée pour C33H34N9021P3Eu- [My, m/z = 1137,6, trouvée 1138,2.
Préparation 5: GTP-gamma-N-C3 ......,, .....
,:tZ.,1 es j 7-Nit.. e e e ,...i... . HN OH OH
... ...:õ ....ç i:
..õ
gõ) r ......,:!õ) Evc. ws , 1, -L, GYP
Igb: =2= r .s..
, '0.,<; s,õel ...-CO,k ..
c...-i: G TP -puyer;a.,N.43 Le complexe C3 (0,366 mg, 480 nmol) a été solubilisé dans du tampon MES 500 mM
pH
5,5 (150 L) pour donner une solution jaune. Au mélange réactionnel a été
ajouté le GTP
(0,317 mg, 576 nmol) puis le EDC (0,460 mg, 2,4 mol) en une seule fois. Le mélange a été agité à TA pendant 1 nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS
(Gradient F), après cette période la réaction était partielle et n'évoluait plus. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (Gradient G) pour conduire au GTP gamma-N-03 (45,6 nmol, 9,5%) sous forme d'huile incolore LRMS (ESI+) :
calculée pour 041 H431\111021 P3EU- [M+21-1]+, rrik = 1269,7, trouvée 1269.
Préparation 6: GTP-gamma-N-octyl-C2 T--11,-Ni H SH 9 9 9 N
Nel'NH2 H 9 9 9 N NNH2 H20, Et3N
pyrichne 'H
H2Nk-1."(N-PJHO-S¨H 9-P(s-HO-1 OH OH
C2-N=C=S
OH OH
C2-NCS I GTP-gamma-N octyl-C2 GTP-gamma-N octyl-NH2 9e N Eu3' N
r Le composé 9e (50,0 L, 500 nmol) a été solubilisé dans de l'eau (100 L). Au mélange réactionnel a été ajouté de la pyridine (300 L) et de la triéthylamine (6 L). Le mélange réactionnel a été ajouté dans un tube contenant le complexe C2 fonctionnalisé
sous sa .. forme NOS (isothiocyanate) (0,438 mg, 650 nmol) en une seule fois. Le mélange a été
agité à 24 C pendant 12 h. L'avancement de la réacton a été suivi par UPLC-MS
(Gradient F), après cette période la réaction était partielle. Le mélange réactionnel a été
directement purifié par HPLC préparative (Gradient G) pour conduire au GTP-gamma-N-octyl-02 (16,9 nmol, 3,4%) sous forme d'huile incolore LRMS (ESI+) : calculée pour C42H52N11021P3SEu- [M+311]2 , m/z = 663,5, trouvée 663,9.
Préparation 7: GTP-gamma-N-octyl-C3 ,1 e=ii ,X....t , =:.z:
.e. =-i ,iz.A
â1 -seveez, .n.e.ex-so..,, C ; 0 eevy Isi:
e:===( , M % k'. \ e,3 ':::====e :se 2. ,,,k>.=>' ,=====
t,i s'>'=.,$n kYs'' .*: :t s ,L. ='"" \ s''''' C t.':= '==:.. ..t.:4;i -<:::=-e¨k>ie.*:,") = k s-==r CK 61 s.>:: ' ".~ e''''4 Q
t:..i is.
feevenmnt=el s'eh% eeeem eu< f li, (( s'ty- --%-= -i-s' t.,=. ,,; i c,i (.r..e :::g .,'=,:
Aune solution de composé 9e (0,545 mg, 840 nmol) dans du tampon carbonate 100 mM
pH 9 (500 L) a été ajouté le complexe C3 fonctionnalisé sous sa forme dichlorotriazine (400 g, 438 nmol) en solution dans de l'eau (200 L) en une seule fois. Le mélange a été
agité à 20 C pendant une nuit. L'avancement de la éaction a été suivi par HPLC
(Gradient H) et UPLC-MS (Gradient C). Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC semi-préparative (Gradient I) pour conduire au composé GTP gamma-N octyl 03 (7,6 g, 5 nmol, 1%) sous forme de poudre blanche LRMS (ESI+) : calculée pour C52H58CIEuN16021P3- [M+3H]2 , m/z =
763,11 trouvée 763,29.
Préparation 8: GTP-gamma-N-hexyl-C11 ,.. , =,').)-=:.
Iese\-:,i ki ,,L, le' \
'sl e.:,..., µ...ii '?. :..; ' i = '''' .. '<:' ti: :..;e::e 'µ.
=="' 0 s..- 1 ti...... 4;
..................................* ..., ::=>i :, >i er%=5,ffle `"...ffl ,.3.N. .ese ...- i ,i, 6ree8ffl8.* 'i.k..,eie=ei% e ,..: i.: .,:
se ,.=;',4 i...4 ,..,.i,,k,.... _..:,.sek ,::.õ,e.4...,,, õ f., ' 'b 1.3.*,,,Mxil tiame4::-:e A une solution de composé 9d (0,62 mg, 1 mol) dans du tampon HEPES 50 mM pH 8 (900 L) a été ajouté le complexe C11 fonctionnalisé sous forme ester de NHS
(1,47 mg, 1 mol) en solution dans du DMSO anhydre (122 L) en une seule fois. Le mélange a été
agité à 24 C pendant 1 h. L'avancement de la réactbn a été suivi par UPLC-MS
(Gradient F), après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été
directement purifié par HPLC préparative (Gradient J) pour conduire au composé GTP-gamma-N-hexyl-C11 (0,52 mg, 258 nmol, 26%) sous forme de poudre blanche LRMS (ESI+) :
calculée pour C80H109N20027P3Tb3+ [M-H]2 , m/z = 1018,9, trouvée 1019,6, [M+2Na+-3H]2 , m/z = 1040,8, trouvée 1041,6.
Préparation 9: GTP-gamma-N-octyl-C11 s.õ 5.=
, s, =
e sL, _______________________________ Å
< en=ffle eyeklekem=ee ::; eiµ
= =
$z.t e%
. . . . . .
5 ee>sesep,- = seteel:
A une solution de composé 9e (0,32 mg, 500 nmol) dans du tampon HEPES 50 mM pH
(300 L) a été ajouté le complexe C11 fonctionnalisé sous forme ester de NHS
(0,76 mg, 500 nmol) en solution dans du DMSO anhydre (102 L) en une seule fois. Le mélangea été agité à 24 C pendant 1 h. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS
10 (Gradient F), après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été
directement purifié par HPLC préparative (Gradient K) pour conduire au composé
GTP-gamma N-octyl Cl 1 (0,22 mg, 105 nmol, 21%) sous forme de poudre blanche LRMS
(ESI+) : calculée pour C82H117N20027P3Tb3+ [M-2H], m/z = 2064,8, trouvée 2064,1.
Préparation 10: GTP-gamma-N-octyl-thiosuccinimidyl C2 C2,NINH
H
O
eNXILN e'NH2 S H
H
j O¨N Fc;HO L 0 L0-1 c4, 0 0 0 N NH 2 Iii0 H
OH OH
HN OH OH OH C2-thio succinimichrl-NHS
OH OH HEPES, DMSO r N 0-GTP-gamma-N octyl-N112 GTP-gamma-N octyl-thiosuccinimichrl C2 15 9e Le composé 9e (0,649 mg, 1 mol) en solution dans de l'eau (100 L) a été
dilué dans du tampon HEPES 50 mM pH 8 (757 L) pour donner une solution incolore. Au mélange réactionnel a été ajouté le complexe C2 fonctionnalisé sous sa forme NHS
(ester de N-20 hydroxysuccinimide) (750 L, 1 mol) en solution dans du DMSO anhydre (143 L) en une seule fois. La réaction a été agitée à 25 C perdant 1 h. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (Gradient B). Après cette période, la réaction n'était pas totale.
Malgré cela, le mélange réactionnel a été purifié 2 fois par HPLC préparative (Gradient E).
Les fractions correspondant au produit attendu ont été collectées puis concentrées sous pression réduite pour conduire au composé GTP-gamma-N-octyl-thiosuccinimidyl-(0,241 mol, 24%) sous forme d'une solution incolore. LRMS (ESI+) : calculée pour C51H68EuNi3024P3S2+ [M+H]+, m/z = 1555.8, trouvée 1555.8.
Tests de liaison Matériels - les préparations membranaires de cellules exprimant des RCPG et la protéine G-alpha-i (Gai) ont été achetées chez Perkin Elmer ou Euroscreen. Le tableau ci-dessous liste les fonds cellulaires et références des différents échantillons utilisés :
[Tableau 1]
Fond Fournisseur Référence cellulaire Delta Opioïde H EK293 Perkin Elmer 6110549400UA
Delta Opioïde CHO-K1 Euroscreen Service Dopamine D2S CHO-K1 Euroscreen Service - l'anticorps DSV36S a été généré par Cisbio Bioassays et est disponible auprès de Cisbio Bioassays sur demande (sous la référence DSV36S). L'anticorps a été
marqué
avec la sonde fluorescente d2 (accepteur rouge) compatible pour une détection TR-FRET. L'anticorps DSV36S se lie au niveau du switch II de la protéine Gai.
- les nucléotides GTP et GTPyS ont été achetés chez Sigma Aldrich (références catalogues respectives G8877 et G8634).
- les plaques 384 puits Low volume, blanches à fond blanc ont été achetées chez Greiner Bio One (référence Catalogue 784075).
- les analogues de GTP non hydrolysables / lentement hydrolysable marqués avec des fluorophores donneurs de type complexes de lanthanides ont été synthétisés à
Cisbio Bioassays.
Méthodes Préparation des réactifs Hormis autre mention spécifique, tous les réactifs ont été dilués dans du tampon Tris HCI
50 mM pH 7,4, MgCl2 10 mM, BSA 0,1%, NaCI 10 mM. Les membranes ont été
préparées 4X pour distribuer 1 ou 104/puits (quantité spécifiée dans la légende de chaque figure).
Le nucléotide GTPyS (condition signal non spécifique) a été préparé 6.67X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 100 M. L'anticorps anti Gai D5V365-d2 utilisé
pour la détection a été préparé 4X pour viser la concentration finale dans les puits de 10 nM. Les analogues GTP non hydrolysables / lentement hydrolysables marqués avec des sondes fluorescentes donneur (complexes de lanthanides) ont été préparés 4X
pour viser les concentrations finales dans les puits mentionnées dans les légendes de chaque figure.
Distribution des réactifs dans les plaques 384 puits :
- Membranes exprimant le RCPG et la protéine G : 5 L
.. - Tampon ou nucléotide GTPyS (pour la condition signal non spécifique) : 3 L
- Analogue GTP non hydrolysables / lentement hydrolysables ¨ donneur : 5 L
- Anticorps anti Gai -accepteur (DSV36S-d2) : 5 L
- Tampon : 2 L
Le signal non spécifique (bruit de fond de fluorescence) a été mesuré avec des puits contenant un excès de GTPyS (10 ou 100 M).
Lecture du signal HTRF
Les plaques ont été incubées à 21 C pendant 20 h Os le signal HTRF a été
mesuré sur le lecteur PHERAstar (BMG Labtech) avec la configuration suivante :
- Module : HTRF (Excitation 337 nm, Emission 665 nm et 620 nm) - Excitation : laser, 40 flashs ou lamp, 100 flashs - Fenêtre de lecture : délais : 60 s ¨ Intégration : 400 s Traitement du signal A partir des signaux bruts à 665 nm et 620 nm, le Ratio HTRF a été calculé
selon la formule suivante :
Ratio HTRF = [(Signal à 665nm) / (Signal à 620nm)] x 10 000 Format de l'essai La figure 2 illustre le format d'essai utilisé pour détecter la liaison des composés de formule (I) à la protéine G. Une préparation membranaire comportant des RCPG
et des protéines Gai est incubée en présence des composés à tester et d'un anticorps anti-protéine Ga marqué avec un fluorophore accepteur, en présence ou en absence d'un analogue de GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable (typiquement, du GTPyS).
Lorsque les deux partenaires de FRET (composé à tester et anticorps anti-protéine Ga) se lient sur la même protéine Ga, un signal de FRET apparait (partie gauche de la figure :
Signal Total ) et se démarque du signal non spécifique (bruit de fond correspondant à
la partie droite de la figure : Signal Non Spécifique ) qui comporte un fort excès de GTPyS non marqué (déplacement de l'analogue GTP fluorescent).
Exemple 1 ¨ Test de liaison de l'analogue GTPgN-C2 La capacité du couple GTPgN-02 (préparation 2) / anticorps anti- Gai D5V365-d2 à
générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (10 g par puits). Le GTPgN-02 a été
utilisé à une concentration finale de 6nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPyS (100 M). La différence de signal TR-FRET
(Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 16,6) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-02 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 3).
Exemple 2 ¨ Test de liaison de l'analogue GTPgN-C3 La capacité du couple GTPgN-03 (préparation 5)! anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à
générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules HEK293 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (1 g par puits). Le GTPgN-03 a été
utilisé à une concentration finale de 1nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPyS (100 M). La différence de signal TR-FRET
(Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 1,7) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-03 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Ga-accepteur (Figure 4).
Exemple 3¨ Test de liaison de l'analogue GTPgN-octyl-C2 La capacité du couple GTPgN-octyl-02 (préparation 6) / anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à
générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (10 g par puits). Le GTPgN-octyl-02 a été utilisé
à une concentration finale de 6nM dans les puits. Les membranes ont été
incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPyS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 12,4) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-octyl-02 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 5).
Exemple 4¨ Test de liaison de l'analogue GTPgN-octyl-C11 La capacité du couple GTPgN-octyl-C11 (préparation 9)! anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été
mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (10 g par puits). Le GTPgN-octyl-C11 a été
utilisé à une concentration finale de 6 nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPyS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 7,6) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-octyl-C11 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 6).
Exemple 5¨ Test de liaison de l'analogue GTPgN-octyl-C3 La capacité du couple GTPgN-octyl-03 (préparation 7)! anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à
générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules HEK293 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (1 g par puits). Le GTPgN-octyl-03 a été utilisé à
une concentration finale de 1 nM dans les puits. Les membranes ont été
incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPyS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 1,4) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-octyl-03 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 7).
Exemple 6¨ Test de liaison de l'analogue GTPg0-hexyl-C2 La capacité du couple GTPg0-hexyl-02 (préparation 2) / anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à
générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (10 g par puits). Le GTPg0-hexyl-02 a été utilisé
à une concentration finale de 6 nM dans les puits. Les membranes ont été
incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPyS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 7,1) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPg0-hexyl-02 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 8).
Exemple 7¨ Test de liaison de l'analogue GTPg0-hexyl-C3 La capacité du couple GTPg0-hexyl-03 (préparation 3)! anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à
générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules HEK293 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (1 g par puits). Le GTPg0-hexyl-03 a été utilisé
à une concentration finale de 1 nM dans les puits. Les membranes ont été
incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPyS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 1,3) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPg0-hexyl-03 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 9).
Exemple 8¨ Test de liaison de l'analogue GTPgN-octyl-C2 La capacité du couple GTPgN-octyl-02 (préparation 6) / anticorps anti-Gai DSV36S-d2 à
générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Dopamine D2S et la protéine Gai (10 g par puits). Le GTPgN-octyl-02 a été
utilisé à une concentration finale de 6 nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPyS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 3,8) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-octyl-02 est capable de se lier à la protéine Gai 5 et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 10).
Exemple 9 ¨ Effet de la concentration en membranes et en analogue GTP-lanthanide sur le test de liaison de l'analogue GTPgN-octyl-C2 La capacité du couple GTPgN-octyl-02 (préparation 6) / anticorps anti- Gai DSV36S-d2 à
générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en 10 évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (1 ou 10 g / puits). Le GTPgN-octyl-02 a été
utilisé à une concentration finale de 2 ou 6 nM dans les puits. Les membranes ont été
incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPyS (100 M). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total (S) / signal non spécifique (B)) observée 15 entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-octyl-02 est capable de se lier à
la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figures 11A et 11B). Par ailleurs, il ressort de la figure 11A qu'une augmentation de l'amplitude de signal (S/B) est observée en augmentant la quantité de membrane de 1 à
10 g par puits. Il ressort de la figure 11B qu'une augmentation de l'amplitude du signal 20 (S/B) est observée en augmentant la concentration de GTPgN-octyl-02 de 2 à 6 nM.
Exemple 10¨ Test de liaison de l'analogue GTPgN-octyl-thiosuccinimidyl C2 La capacité du couple GTPgN-octyl-thiosuccinimidyl 02 (préparation 10) /
anticorps anti-Gai D5V365-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules 25 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gai (10 g par puits).
Les réactifs ont été
dilués en tampon Tris HCI 50 mM pH 7,4, MgCl2 60 mM, BSA 0,1%, NaCI 150 mM. Le GTPgN-octyl-thiosuccinimidyl 02 a été utilisé à une concentration finale de 7,5 nM dans les puits. Les conjugués fluorescents ont été incubées en absence ou en présence de préparation membranaire. La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal 30 total/signal non spécifique = 2,8) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-octyl-thiosuccinimidyl 02 est capable de se lier à la protéine Gai et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gai-accepteur (Figure 12).
Claims (12)
1. Composé de formule (l) :
dans laquelle :
X = 0, NH ou CH2 ;
Y = 0, NH ou CH2 ;
L est un groupe de liaison divalent ;
Ln3+ est un complexe de lanthanide portant éventuellement un groupe réactif G3 ;
étant entendu que lorsque X représente NH et L-Y représente un groupe octylamino alors Ln3+ n'est pas le {2,2',2",2"-{[[2-(4-isothiocyanatophényI)-éthyl]imino]bis(méthylène)bis{4-{[4-(R-Dglucopyranoxy)phényl]éthynyl}pyridine-6,2-diyl}bis-(méthylènenitrilo)}-tétrakis(acétato)}europium(Ill).
dans laquelle :
X = 0, NH ou CH2 ;
Y = 0, NH ou CH2 ;
L est un groupe de liaison divalent ;
Ln3+ est un complexe de lanthanide portant éventuellement un groupe réactif G3 ;
étant entendu que lorsque X représente NH et L-Y représente un groupe octylamino alors Ln3+ n'est pas le {2,2',2",2"-{[[2-(4-isothiocyanatophényI)-éthyl]imino]bis(méthylène)bis{4-{[4-(R-Dglucopyranoxy)phényl]éthynyl}pyridine-6,2-diyl}bis-(méthylènenitrilo)}-tétrakis(acétato)}europium(Ill).
2. Composé selon la revendication 1, dans lequel Y = O.
3. Composé selon la revendication 1, dans lequel Y = NH.
4. Composé selon la revendication 1, dans lequel Y = CH2.
5. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel L
est choisi parmi :
- une liaison directe ;
- un groupe alkylène linéaire ou ramifié en C1-C20, de préférence en C1-C8, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons ;
- un groupe cycloalkylène en C5-C8 ; ou - un groupe arylène en C8-014 ;
lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par 1 à 5, de préférence 1 à 3, groupes alkyle en 01-08, aryle en 06-014, sulfonate ou oxo.
est choisi parmi :
- une liaison directe ;
- un groupe alkylène linéaire ou ramifié en C1-C20, de préférence en C1-C8, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons ;
- un groupe cycloalkylène en C5-C8 ; ou - un groupe arylène en C8-014 ;
lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par 1 à 5, de préférence 1 à 3, groupes alkyle en 01-08, aryle en 06-014, sulfonate ou oxo.
6.
Composé selon la revendication 5, dans lequel L est choisi parmi l'un des groupes suivants :
dans lesquels n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4.
Composé selon la revendication 5, dans lequel L est choisi parmi l'un des groupes suivants :
dans lesquels n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4.
7. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel Ln3+ est choisi parmi l'un quelconque des complexes Cl à C90.
8. Composé selon la revendication 7, dans lequel Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes Cl à C17, C24 à C32 et C36 à C44.
9. Composé selon la revendication 8, dans lequel Ln3+ est choisi parmi l'un des complexes Cl à C4 et C11.
10. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le groupe G3 est un groupe de formule :
où w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué
par un atome d'halogène.
où w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué
par un atome d'halogène.
11. Composé selon la revendication 1, qui est choisi parmi le GTP gamma-O-hexyl-C2, le GTP gamma-0-hexyl-C3, le GTP gamma-N-C2, le GTP-gamma-N-C3, le GTP-gamma-N-octyl-C2, le GTP-gamma-N-octyl-C3, le GTP-gamma-N-hexyl-C11, le GTP-gamma-N-octyl-C11 et le GTP-gamma-N-octyl-thiosuccinimidyl C2.
12. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à
11 pour identifier des molécules susceptibles de moduler l'activation d'un récepteur couplé aux protéines G.
11 pour identifier des molécules susceptibles de moduler l'activation d'un récepteur couplé aux protéines G.
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