FR3092115A1 - analogues de GTP fluorescents et utilisation - Google Patents

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Abstract

Analogues de GTP fluorescents et utilisation L’invention concerne des composés de formule : (I) dans laquelle X, Y, L et Ln3+ sont tels que définis dans la description.

Description

analogues de GTP fluorescents et utilisation
Domaine de l’invention
La présente invention a pour objet des analogues de GTP fluorescents utiles pour détecter, par des techniques de transfert d’énergie, des molécules susceptibles de moduler l’activation d’un récepteur couplé aux protéines G.
Etat de la technique
Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG ou GPCR en anglais) sont une famille de récepteurs membranaires chez les mammifères et dans tout le règne animal. Les protéines G sont des protéines hétérotrimériques (3 sous unités : alpha, beta et gamma) qui sont activées par les RCPG. Au travers des RCPG, les protéines G ont un rôle de transduction d’un signal de l’extérieur de la cellule vers l’intérieur de la cellule (i.e. réponse cellulaire à un stimulus externe). Leur mécanisme d’action communément décrit, est présenté dans la Figure 1 et résumé ci-après :
- dans son état inactif, de repos, la sous unité alpha de la protéine G est liée au nucléotide GDP (protéine G pleine liée au GDP);
- après activation du RCPG, ce dernier se lie à la sous unité alpha de la protéine G et enclenche un processus d'activation de la protéine G constitué de deux étapes :
1) la sortie du GDP de la protéine G pour donner une protéine G vide, et la formation d'un complexe RCPG / protéine-G-vide inactif, et
2) la fixation du GTP qui conduit à la formation d'une protéine G active, sous forme GTP (protéine G pleine liée au GTP). Dans la première étape, la protéine G liée au récepteur est sous une forme appelée « forme vide ». Cet état est décrit dans la littérature comme étant transitoire puisqu’il est décrit que le nucléotide GTP se lie rapidement à la sous-unité alpha de la protéine G. Par ailleurs, les sous-unités beta/gamma de la protéine G activée se dissocient de la sous-unité alpha;
- la sous-unité alpha de la protéine G pleine liée au GTP se fixe alors aux effecteurs pour les activer. Les effecteurs activent à leur tour des voies de signalisation entraînant une réponse cellulaire;
- le GTP est ensuite hydrolysé en GDP par la sous-unité alpha de la protéine G et la sous unité alpha se réassocie aux sous-unités beta/gamma pour reformer la protéine G pleine liée au GDP (état inactif).
Il existe plusieurs sous-types de protéines G alpha présentant des profils de sélectivité différents pour les différents effecteurs (Journal Molecular Biology, 2016, 428, 3850) et induisant ainsi l’activation de voies de signalisation préférentielles.
Les RCPG sont associés à de nombreuses fonctions physiologiques importantes et sont considérés comme l'une des cibles thérapeutiques privilégiées pour un grand nombre de pathologies. Ainsi, de nombreux tests de criblagein vitroont été développés pour identifier des molécules capables de moduler les RCPG. Les tests mis au point exploitent différents mécanismes d’activation des protéines G et mettent en œuvre des technologies variées (Zhang et al.; Tools for GPCR Drug Discovery; Acta Pharmacologica Sinica, 2012, 33, 372). On peut citer notamment les tests d’affinité qui utilisent des ligands radiomarqués pour mesurer l’affinité du ligand au RCPG, les tests de scintigraphie de proximité qui utilisent des billes de scintigraphie sur lesquelles des RCPG ont été fixés ou les tests fonctionnels utilisant du GTP faiblement ou non hydrolysable comme le GTPγS (GTP gamma-S). Ces tests sont néanmoins difficiles à mettre en œuvre et nécessitent parfois des étapes de filtration sur membranes qui peut limiter leur utilisation comme tests de criblage à haut débit (HTS). D’autres tests ont été développés pour mettre en évidence l’activation des RCPG. Ces tests se basent notamment sur les techniques de transfert d’énergie (RET – acronyme anglais de « Resonance Energy Transfer »), comme le FRET (acronyme anglais de « Fluorescence Resonance Energy Transfer ») – voir Clinical Chemistry, 1995, 41, 1391 ou le BRET (acronyme anglais de « Bioluminescence Resonance Energy Transfer ») – voir Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999, 96(1), 151. Ces deux techniques font appel à des notions de molécules capables de donner de l’énergie (on parle de donneurs) ou d’accepter de l’énergie (on parle d’accepteurs) – voir Physical Chemistry Chemical Physics, 2007, 9, 5847. On peut citer par exemple les techniques de transfert d’énergie mettant en évidence l’interaction entre un RCPG et la protéine G en utilisant soit un donneur conjugué au RCPG et un accepteur conjugué à la protéine G (WO 2006/086883 et WO 2003/008435) soit un accepteur conjugué à la sous-unité alpha de la protéine G et un donneur conjugué à la sous-unité beta et/ou gamma de la protéine G (Bunemann et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, 26, 16077). Ces techniques sont néanmoins contraignantes puisqu’elles nécessitent la préparation de protéines de fusion et elles ne permettent pas d’étudier les RCPG et les protéines G exprimées de façon endogène par les cellules (i.e. non modifiées et non surexprimées). D’autre part, afin de discriminer les différents sous types de protéines G alpha pouvant être activées par le récepteur, ces techniques nécessitent la préparation d’échantillons membranaires multiples (une préparation spécifique pour chaque sous type de protéine G alpha). Les techniques de transfert d’énergie ont également été utilisées pour la mise au point de tests visant à visualiser la modulation de la forme GTP (active) de la protéine G ou de la forme GDP (inactive) de la protéine G. On peut citer par exemple les demandes WO 2006/035208 et US 2007/0287162 dans lesquelles on met en œuvre un analogue du GTP couplé à une molécule de type cyanine.
La demande WO 2009/068751 décrit une méthode dans laquelle un signal de transfert d’énergie est détecté à l’aide de dérivés d’ATP marqués ; ces dérivés ne peuvent toutefois pas se lier à la protéine G. Un analogue du GTP est décrit dans la revue « Drug Discovery Today, 2002, 7(18), S150) » comme susceptible d’être utilisé dans une technique de détection par fluorescence en temps résolu. Cet analogue est constitué d’un chélate d’europium couplé à l’atome de phosphate en position gamma du GTPviaun atome d’azote. La structure du chélate d’europium n’est toutefois pas divulguée, pas plus que la méthode utilisée pour synthétiser l’analogue en question. Un autre analogue de GTP est décrit dans Analytical Chemistry, 2009, 81, 5033, qui résulte du couplage du gamma-[(8-aminooctyl)imido]guanosine-5′-triphosphate et de {2,2′,2′′,2′′′-{[[2-(4-isothiocyanatophényl)-éthyl]imino]bis(méthylène)bis{4-{[4-(R-Dglucopyranoxy)phényl] éthynyl}pyridine-6,2-diyl}bis-(méthylènenitrilo)}tétrakis(acétato)}europium(III) dont la synthèse a été décrite dans Analytical Chemistry, 2003, 75, 3193.
Il existe donc un réel besoin de disposer de composés capables de se lier à la protéine G et pouvantde factoêtre utilisés dans une méthode de détection, par des techniques de transfert d’énergie, de molécules susceptibles de moduler l’activation d’un récepteur couplé aux protéines G.
La présente invention a pour objet la mise à disposition de nouvelles molécules de GTP ou de ses dérivés, couplées à des complexes de lanthanide et représentées par la formule générale (I) :
(I)
dans laquelle :
X = O, NH ou CH2;
Y = O, NH ou CH2;
L est un groupe de liaison divalent ;
Ln3+est un complexe de lanthanide ;
étant entendu que lorsque X représente NH et L-Y représente un groupe octylamino alors Ln3+n’est pas le {2,2′,2′′,2′′′-{[[2-(4-isothiocyanatophényl)-éthyl]imino]bis(méthylène)bis{4-{[4-(R-Dglucopyranoxy)phényl]éthynyl}pyridine-6,2-diyl}bis-(méthylènenitrilo)}-tétrakis(acétato)}-europium(III).
La figure 1 illustre le mécanisme d’action des protéines G.
La figure 2 illustre le format d’essai utilisé pour détecter la liaison des composés de l’invention à la protéine G.
La figure 3 illustre un test de liaison d’un composé de l’invention à la protéine Gαi.
La figure 4 illustre un test de liaison d’un composé de l’invention à la protéine Gαi.
La figure 5 illustre un test de liaison d’un composé de l’invention à la protéine Gαi.
La figure 6 illustre un test de liaison d’un composé de l’invention à la protéine Gαi.
La figure 7 illustre un test de liaison d’un composé de l’invention à la protéine Gαi.
La figure 8 illustre un test de liaison d’un composé de l’invention à la protéine Gαi.
La figure 9 illustre un test de liaison d’un composé de l’invention à la protéine Gαi.
La figure 10 illustre un test de liaison d’un composé de l’invention à la protéine Gαi.
Les figures 11A et 11B illustrent l’effet de la concentration en membranes et en composé à tester sur la liaison dudit composé à la protéine Gαi.
Description de l’invention
Selon un aspect la présente invention concerne des composés de formule (I) :
(I)
dans laquelle :
X = O, NH ou CH2;
Y = O, NH ou CH2;
L est un groupe de liaison divalent ;
Ln3+est un complexe de lanthanide ;
étant entendu que lorsque X représente NH et L-Y représente un groupe octylamino alors Ln3+n’est pas le {2,2′,2′′,2′′′-{[[2-(4-isothiocyanatophényl)-éthyl]imino]bis(méthylène)bis{4-{[4-(R-Dglucopyranoxy)phényl]éthynyl}pyridine-6,2-diyl}bis-(méthylènenitrilo)}-tétrakis(acétato)}europium(III).
On entend par « complexe de lanthanide » un chélate, un macrocycle, un cryptate ou toute espèce organique capable de complexer un atome de la famille des lanthanides, le lanthanide (Ln) étant choisi parmi : Eu, Sm, Tb, Gd, Dy, Nd, Er, de préférence le lanthanide est Tb, Sm ou Eu et de manière encore plus préférée Eu ou Tb.
Les familles des différents composés de formule (I) sont représentées par les formules (Ia) à (Ig) :
dans lesquelles L et Ln3+ont les significations indiquées ci-dessus.
Une première famille de composés selon l’invention est constituée des composés de formules (Ia), (Id) et (If). Cette famille est dite famille GTP-gamma-O (car le groupe de liaison divalent est lié au phosphate en position gamma du GTPviaun atome d’oxygène). Une deuxième famille de composés selon l’invention est constituée des composés de formules (Ib), (Ie) et (Ig). Cette famille est dite famille GTP-gamma-N (car le groupe de liaison divalent est lié au phosphate en position gamma du GTPviaun atome d’azote). Une troisième famille de composés selon l’invention est constituée des composés de formules (Ic). Cette famille est dite famille GTP-gamma-C (car le groupe de liaison divalent est lié au phosphate en position gamma du GTPviaun atome de carbone).
Dans un mode de réalisation X est O. Dans un autre mode de réalisation X est NH. Dans un autre mode de réalisation X est CH2.
Dans un mode de réalisation, le groupe de liaison divalent L est choisi parmi :
- une liaison directe;
- un groupe alkylène linéaire ou ramifié en C1-C20, de préférence en C1-C8, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons ;
- un groupe cycloalkylène en C5-C8; ou
-un groupe arylène en C6-C14;
lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l’oxygène, l’azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par 1 à 5, de préférence 1 à 3, groupes alkyle en C1-C8, aryle en C6-C14, sulfonate ou oxo.
Le groupe de liaison divalent L est avantageusement choisi parmi les groupes suivants :
dans lesquels n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4.
De manière particulièrement avantageuse, le groupe de liaison divalent L est choisi parmi une liaison directe, un groupe alkylène linéaire ou ramifié en C1-C8ou un groupe de formule :
Le groupe de liaison divalent L est de préférence choisi parmi :
le groupe –(CH2)n- étant tout particulièrement préféré.
Dans un mode de réalisation, le complexe de lanthanide Ln3+est choisi parmi l’un des complexes ci-après :































En fonction du pH, les groupes -SO3H, -CO2H et -PO(OH)2sont sous forme déprotonée ou pas. Ces groupes désignent donc également les groupes -SO3 -, -CO2 -et -PO(OH)O-.
Avantageusement, le complexe de lanthanide Ln3+est choisi parmi l’un des complexes C1 à C17, C24 à C32 et C36 à C44. De manière plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+est choisi parmi l’un des complexes C1 à C17 et C36 à C44. De manière encore plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+est choisi parmi l’un des complexes C1 à C17. De manière encore plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+est choisi parmi l’un des complexes C1 à C4 et C11 à C17. De manière encore plus avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+est choisi parmi l’un des complexes C1 à C4 et C11. De manière tout à fait avantageuse, le complexe de lanthanide Ln3+est le complexe C2 ou le complexe C3.
Les complexes de lanthanide C1 à C90 sont décrits dans les publications ci-après. Ces complexes soit sont disponibles dans le commerce, soit peuvent être obtenus par les voies de synthèses décrites dans lesdites publications.
C1 : WO 03/076938
C2 : EP-A-0 203 047
C3-C4 : WO 2008/025886
C5 : Spectrochimica Acta ; Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2001, 57(11), 2197.
C6 : Spectrochimica Acta ; Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2001, 57(11), 2197.
C7 : Analytical Biochemistry, 2000, 286(1), 17.
C8 : WO 01/96877
C9 : Spectrochimica Acta ; Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2001, 57(11), 2197.
C10 : WO 01/96877
C11 : WO 2008/063721
C12- C17 : WO 2017/098180.
C18- C20 : WO 2013/011236
C21-C35 : WO 2014/111661
C36-C44 : WO 2018/229408
C45-C47 : Organic & Biomolecular Chemistry, 2012, 10, 8509.
C48 : WO 2010/084090
C49 : WO 2009/010580
C50-C51 : Chemical Communications, 2007, 3841
C52 : WO 2006/120444
C53 : European Journal of Inorganic Chemistry, 2010, 3961.
C54 : Bioconjugate Chemistry, 2009, 20(3), 625.
C55 : EP-A-0 770 610
C56 : WO 2016/106241
C57-C58 : EP-A-0 770 610
C59-C60 : Analytical Chemistry, 2003, 75, 3193–3201
C61 : Bioconjugate Chemistry, 1997, 8(2), 127
C62 : WO 93/11433
C63 : US5696240
C64a -C81b : WO 2018/22932
C82 : WO 2010/070232
C83-C85 : WO 2018/045385
C86a-b : Analyst, 2010, 135(1), 42
C87-C89 : Chemistry – A European Journal, 2011, 17, 9164
C90: Journal of the American Chemical Society, 2004, 126(15), 4888
La synthèse des composés de formule (I) est décrite plus en détail ci-après dans les schémas 1 à 19. Typiquement ces composés sont obtenus par des techniques de conjugaison de deux molécules organiques basées sur l’utilisation de groupes réactifs, techniques qui relèvent des connaissances générales de l’homme du métier et qui sont décrites par exemple dans Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, Academic Press, Second Edition 2008, p. 169-211. Pour obtenir les composés GTP-gamma-O, on fait tout d’abord réagir le GTP avec un composé de formule G2-L-G1, et le composé intermédiaire ainsi formé est conjugué avec le complexe de lanthanide. Dans cette formule G2-L-G1:
L est le groupe de liaison divalent tel que défini ci-dessus ;
G1est un groupe réactif électrophile capable de réagir avec la fonction OH du phosphate en position gamma du GTP ;
G2est un groupe réactif capable de réagir avec un groupe réactif (G3) porté par le complexe de lanthanide Ln3+.
La réaction de conjugaison entre le composé intermédiaire (comportant un groupe réactif G2) et le complexe de lanthanide (comportant un groupe réactif G3), entraîne la formation d’une liaison covalente comportant un ou plusieurs atomes du groupe réactif.
Dans un mode de réalisation, le groupe électrophile G1est :
- soit un groupe OH activé par un réactif formant de façon intermédiaire une espèce réactive pouvant réagir avec la fonction hydroxyle du phosphate en position gamma,
- soit un groupement réactif de type groupement partant, comme par exemple un chlorure aliphatique, un bromure aliphatique, un iodure aliphatique, un mésylate aliphatique, un tosylate aliphatique, un triflate aliphatique, etc.
Dans un mode de réalisation, les groupes réactifs G2et G3sont indépendamment l’un de l’autre choisi parmi l’un des groupes suivants : un acrylamide, une amine éventuellement activée (par exemple une cadavérine ou une éthylènediamine), un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d’alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, un haloacétamide, une halotriazine, telle que la monochlorotriazine, la dichlorotriazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, un thiol, une cétone, un halogénure d’acide, un ester de succinimidyle, un ester d’hydroxysuccinimidyle, un ester d’hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un 3-(2-pyridyldithio)-propionamide, un glyoxal, une triazine, un groupe acétylénique, et en particulier un groupe choisi parmi les groupes de formules :
dans lesquelles w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène.
G2et G3peuvent provenir de leur forme protégée par un groupe protecteur compatible.
De manière préférée, les groupes réactifs G2et G3sont indépendamment l’un de l’autre choisis parmi une amine (éventuellement protégée sous forme –NHBoc), un ester de succinimidyle, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, ou un acide carboxylique (éventuellement protégé sous la forme d’un groupe –CO2Me, -CO2tBu). Dans ce dernier cas, l’acide devra être activé sous forme d’ester pour pouvoir réagir avec une espèce nucléophile.
Les composés selon l’invention sont capables de se lier à la protéine G. Cette propriété est mise en évidence par un immuno-essai basé sur un principe de FRET, en incubant une préparation membranaire comportant des RCPG et une protéine Gα en présence d’un couple de partenaires de FRET constitué d’un composé selon l’invention et d’un anticorps anti-protéine Gα marqué avec un fluorophore accepteur. L’incubation est effectuée en présence ou en absence d’un analogue de GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable, tel que du GTPγS. Lorsque les partenaires du couple de FRET se lient sur la même protéine Gα, un signal de FRET apparait, démontrant par la même la liaison du composé de l’invention à la protéine Gα. Les composés de l’invention peuvent donc avantageusement être utilisés pour identifier, par la technique de FRET, des molécules susceptibles de moduler l’activation d’un récepteur couplé aux protéines G.
Synthèse
Les synthèses des GTP couplés en position gamma à des complexes de lanthanide sont décrites dans les schémas 1 à 19.
Synthèse des composés de la famille GTP- gamma- O ( GTPγ O )
Le composé2, précurseur des composés de l’invention (complexe de lanthanide GTP) peut être synthétisé en suivant les protocoles connus de l’homme du métier. A partir duGTPdisponible commercialement, le groupe de liaison «L 1 »est introduit en position gamma du GTP par substitution nucléophile entre le GTP et le groupe de liaison possédant un groupement partant (I, Br, mésyle, tosyle) en position alpha et un groupement amino protégé sur sa position oméga conduisant ainsi au composé1. Des exemples analogues de couplage sont disponibles lorsque P = CBz ou COCF3(cf. WO 2009/105077 ou WO 2009/091847). Le groupement protecteur est supprimé en utilisant les conditions de déprotection correspondantes aux groupements protecteurs (cf. WO 2009/014612). Le composé2est alors couplé de façon covalenteviaune liaison amide au complexe de lanthanide en utilisant les méthodes classiques connues de l’homme de l’art (schéma 1).
Schéma 1
Une autre alternative pour coupler le complexe de lanthanide en position gamma du GTP est l’utilisation de la « click chemistry ». Pour cela il faut dans un premier temps introduire soit un groupement azido (schéma 2) ou un groupement acétylénique (schéma 3). Comme précédemment, ces groupements sont introduitsviaune réaction de substitution nucléophile entre le groupe de liaison L2 ou L3 avec le GTP (schémas 2 et 3). Des exemples de couplages entre un nucléotide et un groupe de liaison sont décrits par exemple par Hacker et al. (The Journal of Organic Chemistry, 2012, 77(22), 17450).
Schéma 2
Schéma 3
A l’inverse, le groupement acétylénique peut être introduit dans une première étape sur le GTP conduisant aux composés de la série6. Un exemple de couplage sur d’autres nucléotides est disponible dans la littérature (Journal of American Chemical Society, 2003, 125, 9588). Puis la réaction cycloaddition peut être mise en œuvre avec un complexe de lanthanide fonctionnalisé sous forme azide pour conduire aux composésCLn 3+ -7a-d.
Synthèse des composés de la famille GTP-gamma-N
De la même façon que pour la famille GTP-gamma-O, les composés GTP-gamma-N peuvent être préparés selon une stratégie analogue. Le complexe de lanthanide fonctionnalisé NH2est condensé directement sur la molécule de GTP sans intercaler de linker (schéma 4).
Schéma 4
Les complexes de lanthanide peuvent être couplés en utilisant une molécule de GTP-gamma-N comportant déjà un groupe de liaison NH2terminal9 a-epréalablement introduit.
Schéma 5
Pour éviter d’utiliser plusieurs équivalents de groupe de liaison di-amino, l’une des fonctions est protégée par exemple par un Cbz ou bien un groupement trifluoroacétate (COCF3). Les groupements protecteurs sont ensuite éliminés (dans des conditions évitant l’hydrolyse par voie chimique du GTP) conduisant ainsi aux mêmes composés9a-esur lesquels sont couplés les complexes de lanthanide en utilisant les techniques classiques connues de l’homme de l’art (schéma 6).
Schéma 6
Synthèse des composés de la famille GTP-gamma-C
La série des GTP gamma-C est synthétisée par condensation du GDP (guanosine di-phosphate) avec les acides phosphoniques dont la position terminale peut être différemment substitués. Lorsque la position terminale est une fonction amine protégée (trifluoroacétamide15 a-fou CBz,16a-f), ces composés sont préparés en utilisant la méthode décrite dans la littérature (EP0959077 (TFA) ; WO 2012/150866 et The journal of Organic Chemistry, 1984, 49, 1158 (Cbz)). Les bromures d’alkyles N-phthalimides (12a-f), sont condensés sur le triéthylphosphite dans une première étape, suivie ensuite par un traitement à l’hydrazine pour déprotéger la fonction amine. Les phosphonates d’éthyle sont hydrolysés en présence d’acide bromhydrique pour conduire aux composés14a-f. La fonction amine primaire est protégée soit par un CBz soit par un trifluoroacétamide afin d’éviter une réaction d’auto-condensation lors de la réaction de couplage avec le GDP. Cette séquence réactionnelle permet d’obtenir les composés intermédiaires15a-fet16a-f.
Schéma 7
Au lieu d’introduire une fonction amine primaire masquée, il est également possible de disposer de GTP-gamma-C dont la partie terminale du linker est un motif acétylénique. Cette fonction permet de réaliser une réaction de « Click Chemistry » entre le GTP-gamma-C acétylénique et un complexe de lanthanide portant une fonction azide disponible pour une réaction de couplage. Le schéma 8 décrit brièvement les différents intermédiaires préparés selon les protocoles disponibles dans la littérature (Bioorganic Medicinal Chemistry, 2018, 26, 191 et Angewandte Chemie International Edition, 2011, 50, 10699). Les dérivés bromures d’alkyle acétylénique commerciaux sont condensés sur du triméthylsilyl phosphonite, puis hydrolysés pour conduire à la série18a-f.
Schéma 8
Une autre option est possible pour introduire sur le linker des GTP-gamma-C une fonction permettant la bioconjugaison. Dans cette approche, le groupement azido est introduit sur l’acide phosphonique en utilisant la séquence décrite dans le schéma 9. Les protocoles sont décrits dans la littérature, par exemple dans Chemistry, A European Journal, 2010, 16, 12718, Langmuir, 2010, 26, 10725, ou bien encore dans The Journal of Organic Chemistry, 2012, 77, 10450. Les dérivés dibromés réagissent avec le triéthylphosphonite pour donner les composés20a-f. La fonction azido est ensuite introduite par une simple substitution nucléophile avec l’azoture de sodium. Les di-esters sont ensuite hydrolysés en présence de TMS-Br ce qui conduit aux dérivés22a-f.
Schéma 9
Le couplage des composés15a-f,16a-f,18a-fou22a-favec les complexes de lanthanide est réalisé en utilisant les techniques classiques connues de l’homme de l’art (schémas 10 à 13).
Schéma 10
Schéma 11
Schéma 12
Schéma 13
De la même façon que pour les GTP, l’analogue GPPNHP (commercial, CAS : 64564-03-0) peut être couplé avec des complexes de lanthanide en position gamma en utilisant les mêmes stratégies de synthèse. Pour les dérivés substitués en gamma O, la synthèse est décrite par exemple dans le schéma 14. Pour les dérivés substitués en gamma N, les synthèses sont décrites dans les schémas 15 et 16. Ces couplages ont été également exemplifiés dans la demande WO 2009/068751 qui utilise des analogues de l’ATP.
Schéma 14
Schéma 15
Schéma 16
De la même façon que pour les GTP, l’analogue GPPCH2P (commercial, CAS : 13912-93-1 ou 10470-57-2 sous forme de sel de Na)) peut être couplé avec des complexes de lanthanide en position gamma en utilisant les mêmes stratégies de synthèse. Pour les dérivés substitués en gamma O, la synthèse est décrite par exemple dans le schéma 17. Pour les dérivés substitués en gamma N, les synthèses sont décrites dans les schémas 18 et 19. Ces couplages ont été également exemplifiés dans la demande WO 2009/068751 qui utilise des analogues de l’ATP.
Schéma 17
Schéma 18
Schéma 19
L’invention est illustrée par les exemples ci-après, donnés à titre illustratif.
Abréviations utilisées
BRET : Bioluminescence resonance Energy Transfer
BSA : Albumine de sérum bovin
DMSO : diméthylsulfoxyde
EDC : N-(3-diméthylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide
éq : équivalent
ESI + : ionisation par électronébulisation en mode positif.
FRET : Förster resonance energy transfer (transfert d’énergie par resonance de type Förster
GDP : guanosine diphosphate
GPCR (RCPG) : G protein-coupled receptors
GTP : guanosine triphosphate
GTPγS : guanosine 5’-[γ-thio]triphosphate
h : heure
HEPES : acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthanesulfonique
HPLC : chromatographie liquide à haute performance
LC-MS : chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse
LRMS : spectrométrie de masse à faible résolution
MES : acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique
MOPS : acide 3-morpholino-1-propanesulfonique
NCS : isothiocyanate
NHS : N-hydroxysuccinimide
Py : pyridine
RCPG : récepteurs couplés aux protéines G
TA : température ambiante
TEA : triéthylamine
TRIS : trishydroxyméthylaminométhane
UPLC : chromatographie liquide à ultra haute performance
UPLC-MS : chromatographie liquide à ultra haute performance couplée à la spectrométrie de masse
UV : Ultraviolet
Chromatographie
Les chromatographies liquides à haute performance (HPLC) analytiques et préparatives ont été effectuées sur deux appareils :
HPLC Analytique : ThermoScientific, pompe quaternaire P4000, Détecteur UV 1000 à lampe au deutérium (190-350 nm), colonne analytique Waters XBridge C18, 3,5 µm, 4,6 × 100 mm.
HPLC Préparative : Shimadzu, 2 pompes LC-8A, détecteur UV à barrette de diodes Varian ProStar, colonne préparative Waters XBridge prép. C18, 5 µm: 19 × 100 mm ou 50 × 150 mm.
Les chromatographies liquides à Ultra-haute performance (UPLC) analytiques ont été réalisées sur un appareil Waters Acquity HClass avec comme détecteur soit un détecteur UV à barrette de diode de type PDA, soit un détecteur de masse simple quadripolaire de type SQD2. La sonde utilisée est un électro-spray en mode positif : tension de capillaire à 3,2 KV - tension de cône à 30 V.
Gradient A: Colonne Waters Xbridge C18, 5 µm, 10 x 100 mm, A/ eau 25 mM acétate de triéthylammonium pH 7 – B/ acétonitrile - t = 0 à 5 min 1 % B - t = 10 min 10 %
B - 20 mL.min-1 à 260 nm.
Gradient B
Colonne Waters Xbridge C18, 5 µm, 4,6 x 100 mm, A/ eau 25 mM acétate de triéthylammonium pH 7 – B/ acétonitrile - t = 0 à 2 min 2 % B - t = 19 min 40 % B. 1 mL.min-1.
Gradient C
Colonne Waters Xbridge C18, 3,5 µm, 4,6 x 100 mm – A / eau 5 mM acétate d’ammonium pH 5 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B – t = 1 min 2 % B - t = 15 min 40 % B – 1 mL.min-1
Gradient D
Colonne Waters Xbridge C18, 5 µm, 19 x 100 mm – A / eau 5 mM acétate d’ammonium pH 6,6 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B – t = 2,5 min 2 % B - t = 27 min 40 % B – 12 mL.min-1à 280 et 320 nm.
Gradient E
Colonne Waters Xbridge C18, 5 µm, 19 x 100 mm – A / eau 25 mM acétate de triéthylammonium pH 7 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B – t = 2 min 2 % B - t = 20 min 50 % B – 20 mL.min-1 à 280 et 320 nm.
Gradient F
Colonne Waters Acquity C18, 300 Å, 1,7 µm, 2,1 x 50 mm – A / eau 5 mM acétate d’ammonium pH 5 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B – t = 0,2 min 2 % B - t = 5 min 40 % B – 0,6 mL.min-1
Gradient G
Colonne Waters XBridge C18, 300 Å, 5 µm, 10 x 100 mm – eau 25 mM acétate de triéthylammonium B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - B – t = 19 min 20 % B - 5 mL.min-1
Gradient H
Colonne Waters Xbridge C18, 5 µm, 4,6 x 100 mm, A/ eau 25 mM acétate de triéthylammonium pH 7 – B/ acétonitrile - t = 0 à 2 min 2 % B - t = 19 min 50 % B - 1 mL.min-1.
Gradient I
Colonne Waters Xbridge C18, 5 µm, 10 x 100 mm – A / eau 25 mM acétate de triéthylammonium pH 7 B / acétonitrile t = 0 min 2 % B – t = 2 min 2 % B - t = 27 min 50 % B – 3,5 mL.min-1 à 280 nm.
Gradient J
Colonne Waters XBridge C18, 5 µm, 19 x 100 mm – eau 25 mM acétate de triéthylammonium B / acétonitrile t = 0 min 5 % B - B – t = 17 min 45 % B - 20 mL.min-1
Gradient K
Colonne Waters XBridge C18, 300 Å, 5 µm, 10 x 100 mm – eau 25 mM acétate de triéthylammonium B / acétonitrile t = 0 min 2 % B - B – t = 19 min 40 % B - 5 mL.min-1
Préparation des composés
Préparation 1 : GTP gamma-N-pentyl-NH2 (9c)
Dans un ballon contenant le GTP (10 mg ; 19,1 µmol, 1 éq) en solution dans de l’eau (500 µL), a été ajouté de l’EDC (40 mg ; 210 µmol, 11 éq) et une solution de cadavérine (58 mg, 573 µmol, 30 éq) dans du MOPS à pH 8. Le mélange réactionnel a été agité pendant une nuit à TA avant d’être purifié par HPLC préparative (Gradient A). Un solide blanc est obtenu correspondant au composé9c(5 mg). (ESI+) : calculée C15H28N7O13P3[M+H]+, m/z = 608,10 trouvée 608,55.
Préparation 2 : GTP gamma-O-hexyl-C2
A une solution de composé2c(0,454 mg, 700 nmol) dans du tampon carbonate 100 mM pH 9 (500 µL) a été ajouté le complexeC2fonctionnalisé sous sa forme NCS (isothiocyanate) (473 µg, 700 nmol) en solution dans du DMSO (200 µL) en une seule fois. Le mélange a été agité à TA pendant une nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC (gradient B) et UPLC-MS (Gradient C), après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC semi-préparative (Gradient D) pour conduire au composé GTP gamma-O hexyl-C2 (125 µg, 96 nmol, 14%) sous forme de poudre blanche LRMS (ESI+) : calculée pour C40H47EuN10O22P3S-[M+3H]2 +, m/z = 650,06 trouvée 650,32.
Préparation 3 : GTP gamma-O-hexyl-C3
A une solution de composé2c(0,442 mg, 710 nmol) dans du tampon carbonate 100 mM pH 9 (200 µL) a été ajouté le complexeC3fonctionnalisé sous sa forme dichlorotriazine (0,647 mg, 708 nmol) en solution dans du tampon carbonate 100 mM pH 9 (200 µL) en une seule fois. Le mélange a été agité à 4 °C pendant une nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (Gradient C), après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (Gradient E) pour conduire au composé GTP gamma-O-hexyl-C3 (0,11 mg, 70 nmol, 10%) sous forme de poudre blanche LRMS (ESI+) : calculée pour C50H53ClEuN15O22P3 -[M+3H]2 +, m/z = 749,59 trouvée 750,29.
Préparation 4: GTP gamma-N-C2
Le complexeC2(0,366 mg, 2 µmol) a été solubilisé dans du tampon MES 500 mM pH 5,5 (150 µL) pour donner une solution jaune. Au mélange réactionnel a été ajouté le GTP (1,32 mg, 2,4 µmol) puis le EDC (1,92 mg, 10 µmol) en une seule fois. Le mélange a été agité à TA pendant 40 h. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (Gradient F), après cette période la réaction était partielle et n'évoluait plus. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (Gradient G) pour conduire au GTP gamma-N-C2 (60 nmol, 3%) sous forme d'huile incolore LRMS (ESI+) : calculée pour C33H34N9O21P3Eu-[M]-, m/z = 1137,6, trouvée 1138,2.
Préparation 5: GTP-gamma-N-C3
Le complexeC3(0,366 mg, 480 nmol) a été solubilisé dans du tampon MES 500 mM pH 5,5 (150 µL) pour donner une solution jaune. Au mélange réactionnel a été ajouté leGTP(0,317 mg, 576 nmol) puis le EDC (0,460 mg, 2,4 µmol) en une seule fois. Le mélange a été agité à TA pendant 1 nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (Gradient F), après cette période la réaction était partielle et n'évoluait plus. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (Gradient G) pour conduire au GTP gamma-N-C3 (45,6 nmol, 9,5%) sous forme d'huile incolore LRMS (ESI+) : calculée pour C41H40N11O21P3Eu-[M+2H]+, m/z = 1269,7, trouvée 1269.
Préparation 6: GTP-gamma-N-octyl-C2
Le composé 9d(50,0 µL, 500 nmol) a été solubilisé dans de l'eau (100 µL). Au mélange réactionnel a été ajouté de la pyridine (300 µL) et de la triéthylamine (6 µL). Le mélange réactionnel a été ajouté dans un tube contenant le complexeC2fonctionnalisé sous sa forme NCS (isothiocyanate) (0,438 mg, 650 nmol) en une seule fois. Le mélange a été agité à 24°C pendant 12 h. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (Gradient F), après cette période la réaction était partielle. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (Gradient G) pour conduire au GTP-gamma-N-octyl-C2 (16,9 nmol, 3,4%) sous forme d'huile incolore LRMS (ESI+) : calculée pour C42H52N11O21P3SEu - [M+3H]2+, m/z = 663,5, trouvée 663,9.
Préparation 7: GTP-gamma-N-octyl-C3
A une solution de composé9 e(0,545 mg, 840 nmol) dans du tampon carbonate 100 mM pH 9 (500 µL) a été ajouté le complexeC3fonctionnalisé sous sa forme dichlorotriazine (400 µg, 438 nmol) en solution dans de l’eau (200 µL) en une seule fois. Le mélange a été agité à 20°C pendant une nuit. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC (Gradient H) et UPLC-MS (Gradient C). Après cette période, la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC semi-préparative (Gradient I) pour conduire au composé GTP gamma-N octyl C3 (7,6 µg, 5 nmol, 1%) sous forme de poudre blanche LRMS (ESI+) : calculée pour C52H58ClEuN16O21P3 -[M+3H]2 +, m/z = 763,11 trouvée 763,29.
Préparation 8: GTP-gamma-N-hexyl-C11
A une solution de composé9 d(0,62 mg, 1 µmol) dans du tampon HEPES 50 mM pH 8 (900 µL) a été ajouté le complexeC11fonctionnalisé sous forme ester de NHS (1,47 mg, 1 µmol) en solution dans du DMSO anhydre (122 µL) en une seule fois. Le mélange a été agité à 24°C pendant 1 h. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (Gradient F), après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (Gradient J) pour conduire au composé GTP-gamma-N-hexyl-C11 (0,52 mg, 258 nmol, 26%) sous forme de poudre blanche LRMS (ESI+) : calculée pour C80H109N20O27P3Tb3+[M-H]2+, m/z = 1018,9, trouvée 1019,6, [M+2Na+-3H]2+, m/z = 1040,8, trouvée 1041,6.
Préparation 9: GTP-gamma-N-octyl-C11
A une solution de composé9 e(0,32 mg, 500 nmol) dans du tampon HEPES 50 mM pH 8 (300 µL) a été ajouté le complexeC11fonctionnalisé sous forme ester de NHS (0,76 mg, 500 nmol) en solution dans du DMSO anhydre (102 µL) en une seule fois. Le mélange a été agité à 24°C pendant 1 h. L'avancement de la réaction a été suivi par UPLC-MS (Gradient F), après cette période la réaction était totale. Le mélange réactionnel a été directement purifié par HPLC préparative (Gradient K) pour conduire au composé GTP-gamma N-octyl C11 (0,22 mg, 105 nmol, 21%) sous forme de poudre blanche LRMS (ESI+) : calculée pour C82H117N20O27P3Tb3+[M-2H]+, m/z = 2064,8, trouvée 2064,1.
Tests de liaison
Matériels
- les préparations membranaires de cellules exprimant des RCPG et la protéine G-alpha-i (Gαi) ont été achetées chez Perkin Elmer ou Euroscreen. Le tableau ci-dessous liste les fonds cellulaires et références des différents échantillons utilisés :
Fond cellulaire Fournisseur Référence
Delta Opioïde HEK293 Perkin Elmer 6110549400UA
Delta Opioïde CHO-K1 Euroscreen Service
Dopamine D2S CHO-K1 Euroscreen Service
- l’anticorps DSV36S a été généré par Cisbio Bioassays et est disponible auprès de Cisbio Bioassays sur demande (sous la référence DSV36S). L’anticorps a été marqué avec la sonde fluorescente d2 (accepteur rouge) compatible pour une détection TR-FRET. L’anticorps DSV36S se lie au niveau du switch II de la protéine Gαi.
- les nucléotides GTP et GTPγS ont été achetés chez Sigma Aldrich (références catalogues respectives G8877 et G8634).
- les plaques 384 puits Low volume, blanches à fond blanc ont été achetées chez Greiner Bio One (référence Catalogue 784075).
- les analogues de GTP non hydrolysables / lentement hydrolysable marqués avec des fluorophores donneurs de type complexes de lanthanides ont été synthétisés à Cisbio Bioassays.
Méthodes
Préparation des réactifs
Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon Tris HCl 50 mM pH 7,4, MgCl210 mM, BSA 0,1%, NaCl 10 mM. Les membranes ont été préparées 4X pour distribuer 1 ou 10µg/puits (quantité spécifiée dans la légende de chaque figure). Le nucléotide GTPγS (condition signal non spécifique) a été préparé 6.67X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 100 µM. L’anticorps anti Gαi DSV36S-d2 utilisé pour la détection a été préparé 4X pour viser la concentration finale dans les puits de 10 nM. Les analogues GTP non hydrolysables / lentement hydrolysables marqués avec des sondes fluorescentes donneur (complexes de lanthanides) ont été préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les puits mentionnées dans les légendes de chaque figure.
Distribution des réact ifs dans les plaques 384 puits :
- Membranes exprimant le RCPG et la protéine G : 5 µL
- Tampon ou nucléotide GTPγS (pour la condition signal non spécifique) : 3 µL
- Analogue GTP non hydrolysables / lentement hydrolysables – donneur : 5 µL
- Anticorps anti Gαi -accepteur (DSV36S-d2) : 5 µL
- Tampon : 2 µL
Le signal non spécifique (bruit de fond de fluorescence) a été mesuré avec des puits contenant un excès de GTPγS (10 ou 100 µM).
Lecture du signal HTRF
Les plaques ont été incubées à 21°C pendant 20 h puis le signal HTRF a été mesuré sur le lecteur PHERAstar (BMG Labtech) avec la configuration suivante :
- Module : HTRF (Excitation 337 nm, Emission 665 nm et 620 nm)
- Excitation : laser, 40 flashs ou lamp, 100 flashs
- Fenêtre de lecture : délais : 60 µs – Intégration : 400 µs
Traitement du signal
A partir des signaux bruts à 665 nm et 620 nm, le Ratio HTRF a été calculé selon la formule suivante :
Ratio HTRF = [(Signal à 665nm) / (Signal à 620nm)] x 10 000
Format de l’essai
La figure 2 illustre le format d’essai utilisé pour détecter la liaison des composés de formule (I) à la protéine G. Une préparation membranaire comportant des RCPG et des protéines Gαi est incubée en présence des composés à tester et d’un anticorps anti-protéine Gα marqué avec un fluorophore accepteur, en présence ou en absence d’un analogue de GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable (typiquement, du GTPγS). Lorsque les deux partenaires de FRET (composé à tester et anticorps anti-protéine Gα) se lient sur la même protéine Gα, un signal de FRET apparait (partie gauche de la figure : « Signal Total ») et se démarque du signal non spécifique (bruit de fond correspondant à la partie droite de la figure : « Signal Non Spécifique ») qui comporte un fort excès de GTPγS non marqué (déplacement de l’analogue GTP fluorescent).
Exemple 1 – Test de liaison de l’analogue GTPgN-C2
La capacité du couple GTPgN-C2 (préparation 2) / anticorps anti- Gαi DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gαi (10 µg par puits). Le GTPgN-C2 a été utilisé à une concentration finale de 6nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPγS (100µM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 16,6) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgN-C2 est capable de se lier à la protéine Gαi et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gαi-accepteur (Figure 3).
Exemple 2 – Test de liaison de l’analogue GTPgN-C3
La capacité du couple GTPgN-C3 (préparation 5) / anticorps anti- Gαi DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules HEK293 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gαi (1 µg par puits). Le GTPgN-C3 a été utilisé à une concentration finale de 1nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPγS (100 µM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 1,7) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgN-C3 est capable de se lier à la protéine Gαi et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gα-accepteur (Figure 4).
Exemple 3 – Test de liaison de l’analogue GTPgN-octyl-C2
La capacité du couple GTPgN-octyl-C2 (préparation 6) / anticorps anti- Gαi DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gαi (10 µg par puits). Le GTPgN-octyl-C2 a été utilisé à une concentration finale de 6nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPγS (100 µM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 12,4) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgN-octyl-C2 est capable de se lier à la protéine Gαi et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gαi-accepteur (Figure 5).
Exemple 4 – Test de liaison de l’analogue GTPgN-octyl-C11
La capacité du couple GTPgN-octyl-C11 (préparation 9) / anticorps anti- Gαi DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gαi (10 µg par puits). Le GTPgN-octyl-C11 a été utilisé à une concentration finale de 6nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPγS (100 µM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 7,6) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgN-octyl-C11 est capable de se lier à la protéine Gαi et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gαi-accepteur (Figure 6).
Exemple 5 – Test de liaison de l’analogue GTPgN-octyl-C3
La capacité du couple GTPgN-octyl-C3 (préparation 7) / anticorps anti- Gαi DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules HEK293 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gαi (1 µg par puits). Le GTPgN-octyl-C3 a été utilisé à une concentration finale de 1 nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPγS (100 µM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 1,4) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgN-octyl-C3 est capable de se lier à la protéine Gαi et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gαi-accepteur (Figure 7).
Exemple 6 – Test de liaison de l’analogue GTPgO-hexyl-C2
La capacité du couple GTPgO-hexyl-C2 (préparation 2) / anticorps anti- Gαi DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gαi (10 µg par puits). Le GTPgO-hexyl-C2 a été utilisé à une concentration finale de 6 nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPγS (100 µM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 7,1) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgO-hexyl-C2 est capable de se lier à la protéine Gαi et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gαi-accepteur (Figure 8).
Exemple 7 – Test de liaison de l’analogue GTPgO-hexyl-C3
La capacité du couple GTPgO-hexyl-C3 (préparation 3) / anticorps anti- Gαi DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules HEK293 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gαi (1 µg par puits). Le GTPgO-hexyl-C3 a été utilisé à une concentration finale de 1 nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPγS (100 µM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 1,3) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgO-hexyl-C3 est capable de se lier à la protéine Gαi et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gαi-accepteur (Figure 9).
Exemple 8 – Test de liaison de l’analogue GTPgN-octyl-C2
La capacité du couple GTPgN-octyl-C2 (préparation 6) / anticorps anti-Gαi DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Dopamine D2S et la protéine Gαi (10 µg par puits). Le GTPgN-octyl-C2 a été utilisé à une concentration finale de 6 nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPγS (100 µM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total/signal non spécifique = 3,8) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgN-octyl-C2 est capable de se lier à la protéine Gαi et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gαi-accepteur (Figure 10).
Exemple 9 – Effet de la concentration en membranes et en analogue GTP-lanthanide sur le test de liaison de l’analogue GTPgN-octyl-C2
La capacité du couple GTPgN-octyl-C2 (préparation 6) / anticorps anti- Gαi DSV36S-d2 à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine Gαi (1 ou 10 µg / puits). Le GTPgN-octyl-C2 a été utilisé à une concentration finale de 2 ou 6 nM dans les puits. Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d’un fort excès de GTPγS (100 µM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF signal total (S) / signal non spécifique (B)) observée entre ces deux conditions montre que l’analogue GTPgN-octyl-C2 est capable de se lier à la protéine Gαi et générer un signal TR-FRET avec un anticorps anti Gαi-accepteur (Figures 11A et 11B). Par ailleurs, il ressort de la figure 11A qu’une augmentation de l’amplitude de signal (S/B) est observée en augmentant la quantité de membrane de 1 à 10 µg par puits. Il ressort de la figure 11B qu’une augmentation de l’amplitude du signal (S/B) est observée en augmentant la concentration de GTPgN-octyl-C2 de 2 à 6 nM.

Claims (9)

  1. Composé de formule (I) :
    (I)
    dans laquelle :
    X = O, NH ou CH2;
    Y = O, NH ou CH2;
    L est un groupe de liaison divalent ;
    Ln3+est un complexe de lanthanide ;
    étant entendu que lorsque X représente NH et L-Y représente un groupe octylamino alors Ln3+n’est pas le {2,2′,2′′,2′′′-{[[2-(4-isothiocyanatophényl)-éthyl]imino]bis(méthylène)bis{4-{[4-(R-Dglucopyranoxy)phényl]éthynyl}pyridine-6,2-diyl}bis-(méthylènenitrilo)}-tétrakis(acétato)}europium(III).
  2. Composé selon la revendication 1, dans lequel Y = O.
  3. Composé selon la revendication 1, dans lequel Y = NH.
  4. Composé selon la revendication 1, dans lequel Y = CH2.
  5. Composé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel L est choisi parmi :
    - une liaison directe ;
    - un groupe alkylène linéaire ou ramifié en C1-C20, de préférence en C1-C8, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons ;
    - un groupe cycloalkylène en C5-C8; ou
    - un groupe arylène en C6-C14;
    lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l’oxygène, l’azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par 1 à 5, de préférence 1 à 3, groupes alkyle en C1-C8, aryle en C6-C14, sulfonate ou oxo.
  6. Composé selon la revendication 5, dans lequel L est choisi parmi l’un des groupes suivants :



    dans lesquels n, m, p, q sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5 et e est un nombre entier allant de 1 à 6, de préférence de 1 à 4.
  7. Composé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel Ln3+est choisi parmi :


































































  8. Composé selon la revendication 7, dans lequel Ln3+est choisi parmi l’un des complexes C1 à C17, C24 à C32 et C36 à C44.
  9. Utilisation d’un composé selon l’une quelconque des revendications 1à 8 pour identifier des molécules susceptibles de moduler l’activation d’un récepteur couplé aux protéines G.
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