WO2010070232A1 - Nouveaux cryptates de terres rares comportant un motif tetraazatriphenylene - Google Patents

Nouveaux cryptates de terres rares comportant un motif tetraazatriphenylene Download PDF

Info

Publication number
WO2010070232A1
WO2010070232A1 PCT/FR2009/052584 FR2009052584W WO2010070232A1 WO 2010070232 A1 WO2010070232 A1 WO 2010070232A1 FR 2009052584 W FR2009052584 W FR 2009052584W WO 2010070232 A1 WO2010070232 A1 WO 2010070232A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
groups
alk
compound according
chosen
group
Prior art date
Application number
PCT/FR2009/052584
Other languages
English (en)
Inventor
Laurent Lamarque
Hervé Bazin
Emilie Blanche
Original Assignee
Cis Bio International
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cis Bio International filed Critical Cis Bio International
Publication of WO2010070232A1 publication Critical patent/WO2010070232A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/22—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed systems contains four or more hetero rings

Definitions

  • lanthanide complexes as fluorescent compounds for the study of biological phenomena was developed in the 1990s (see for example the article by Mathis et al., Clin Chem 1995 Sep; 41 (9) : 1391-7). These lanthanide complexes have the property of being able to generate an intermolecular FRET, that is to say, a fluorescence resulting from resonance energy transfer between the two compounds, one energy acceptor and one donor energy (in English "Fluorescent Resonance Energy Transfer”) when they are near an energy accepting compound and they are excited at their maximum absorption wavelength.
  • FRET Fluorescent Resonance Energy Transfer
  • the FRET phenomenon is widely used in biology, particularly to study molecular interactions. It is based on the use of a fluorescent donor compound (for example a rare earth complex) and an optionally fluorescent acceptor compound, each of these compounds being coupled to a biological molecule. When a biological phenomenon brings about the approximation of these molecules, and the donor compound is excited, a transfer of energy takes place between the donor and the acceptor and will result in a variation of the luminescence emitted by the reaction medium.
  • Several companies market reagents to implement this approach to study biological processes; for example, the Applicant provides various reagents, including rare earth cryptates, for the study of particular biological phenomena (detection of enzymatic activity, dosage of second messengers, etc.).
  • the rare earth cryptates are macrobicycles comprising units whose energy of the tplet state is greater than that of complexed rare earth; in particular, these units may be nitrogen aromatic rings, substituted or unsubstituted. These rare earth cryptates are very stable in acidic or alkaline medium which facilitates the implementation of immunological assays whose antibodies have been labeled by these molecules.
  • t ⁇ sbipy ⁇ dine cryptates in particular exhibit a low molar absorption coefficient at 337 nm (4500 Mol-1 cm-1), the wavelength of the nitrogen laser used to excite the donor compound. energy or chromophore
  • Another limitation of t ⁇ sbipy ⁇ dine cryptates is the requirement to add to the measurement medium potassium fluoride, to avoid the extinction of fluorescence of the cryptate related to the presence of water molecules.
  • the tetraazatphenylene unit has been described as an antenna capable of collecting exciter energy and transferring it to the lanthanide cation, thus leading to sensitization of the luminescence of lanthanides.
  • Van der Toi et al. Thus studied a series of tetraazatriphenylen and emphasized their excellent properties as chromophores and their ability to form fairly stable complexes with europium and terbium ions in acetonitrile (E, B. Van der Toi et al., Chem Eur, J., 1998). , 4, 11, 2315-2323).
  • EP 1 019 401 claims these rare earth complexes, consisting of a tetraazatriphenylene derivative and a rare earth.
  • Bakker et al. have pointed out that the stability of the tetraazatriphenylene / rare earth complexes in aqueous medium is relatively low, compared to that observed in aprotic solvents, such as acetonitrile. To remedy this problem, the authors propose to graft carboxylate groups to the triphenylene backbone (B.H. Bakker et al., Chem Rev., 2000, 208, 3-16).
  • Bobba et al. were among the first to integrate the tetraazatriphenylene antenna into a motif capable of effectively coordinating rare earth ions, in this case a tetraazacyclododecane unit (Chem.Commun., 2002, 890-891, Org Biomol Chem, 2003). , 1, 1870-1872), and have shown that the complexes obtained can be intercalated in the DNA.
  • a light source which can be provided by a flash lamp or more generally a laser, preferably emitting in the near ultraviolet: nitrogen lasers and YAG lasers, both employed in commercially available fluorometers, emit light at 337 nm and 355 nm, respectively.
  • a laser preferably emitting in the near ultraviolet: nitrogen lasers and YAG lasers, both employed in commercially available fluorometers, emit light at 337 nm and 355 nm, respectively.
  • nitrogen lasers and YAG lasers both employed in commercially available fluorometers, emit light at 337 nm and 355 nm, respectively.
  • the use of such lasers nevertheless requires fluorophores capable of absorbing light at these wavelengths.
  • Alkyfguanine-DNA alkyltransferase and some of its mutants have emerged as tools of choice for protein labeling.
  • the enzyme SNAP-tag Juillerat et al,
  • BG 06-benzylguanine
  • the inventors have developed a new family of macropolycyclic compounds capable of forming fluorescent macropolycyclic complexes with rare earths.
  • the inventors have in particular developed fluorophores that are particularly suitable for excitation by lasers emitting in the near ultraviolet region, and also capable, when they are conjugated to benzylguanine, of not limiting their reactivity with the alkylguanine-DNA enzyme. alkyltransferase.
  • the present invention relates to macropolycyclic compounds having one or more units derived from the tetraazatriphenyl group (TATP), as well as pyridine or bipyridine units. It also relates to macropolycyclic complexes of rare earths or cryptates of rare earths.
  • TATP tetraazatriphenyl group
  • the macropolycyclic compounds of the invention form stable complexes with rare earths, in particular with terbium and europium, and their absorption spectra are more favorable to excitation at 337 nm than the rare earth cryptates of the art previous, in particular that the cryptates Eu-trisbipyridine.
  • these compounds are more resistant to fluorescence quenching due to water molecules than the cryptates of the prior art, in particular europium-trisbipyridine cryptates.
  • the subject of the invention is also the conjugates constituted by an organic or biological molecule coupled to a rare earth cryptate according to the invention.
  • the macropolycyclic compounds according to the invention are the compounds of formula (I)
  • a and B are chosen from the groups of formulas (II), (III), (IV):
  • R 2 » Rs. Rg are identical or different and are chosen from the following atoms or groups: H 1 -alk (Ci- ⁇ ), -CN, -3Ik (C 1 ) -COOH, -CONH-alk (Ci 4 ), -COOaIk (Cm), -LG, or R 1 and R 2 and / or R 8 and R 9 together with the carbon atoms to which they are attached form a saturated hydrocarbon ring with 5 or 6 members or a succinimide ring whose nitrogen carries an atom or group chosen from: H, -alk (Cm) or - LG:
  • R 11 are the same or different and are selected from the following atoms or groups: H, -LG or electron donor groups selected from the following groups or atoms: -NH 2 , -NHaIk (Cn,), -N [alk 1 (C 1. 6) alk 2 (C 1 6.)]> -OH, -OaIk (Cn), -alk (Cm), -CH- (alk (Ci - 6)) 2, -C (alk (Cm) 3 , -NHCOaIk (Cm), -S 8Ik (C 1-6 ), -SH, F, Cl 1 Br, I;
  • R 5 , R 6 and R 7 are identical or different and are chosen from the following atoms or groups:
  • H -LG the electron donor groups selected from: -COOH, -NH 2 , -NHaIk (C 1-6 ), -N [alk 1 (C 1 -6 ) alk 2 (C 1 -6 )], - OH, -OaIk (Cm), -alk (Cm), -CH- (alk (Cm)) 2 ,
  • L is a linker and G is a reactive group.
  • the compounds according to the invention may optionally comprise one or more groups
  • L representing a linker
  • G representing a reactive group whose function is to form a covalent bond with an organic or biological molecule that it is desired to label with the products according to 'invention.
  • the compounds according to the invention may comprise units derived from TATP, pyridine and bipyridine.
  • the compounds according to the invention can therefore have the formula one of the formulas (V) to (X):
  • a fifth family of particularly preferred compounds consists of the compounds of formula (VIII) in which or R 1 and R 2 and / or R 8 and R 9 together with the carbon atoms to which they are attached form a saturated hydrocarbon ring with 5 or 6 members.
  • the compounds that are particularly preferred are those in which R 1 , R 2 , R 8 and R 9 are hydrogen atoms or the pairs R 1 -R 2 and R 8 -R 9 form, with the carbon atoms to which they are bonded, a saturated ring with 5 or 6 atoms, and in which the groups R 3 , R 4 , R 10 and R 11 are chosen from the groups H, OH and Cl, and R 5 , R 6 and R 7 are -LG groups.
  • the compounds according to the invention may comprise a reactive group G for coupling the fluorescent rare-earth complex with a species that it is desired to make fluorescent, for example an organic molecule, a peptide or a protein.
  • the reactive group G may be carried indifferently by one or other of the substituents R 1 to R 11 , but will preferably be carried by one of the substituents R 5 , R 6 or R 7 when they are present, and this to facilitate the synthesis of the polymacrocycle.
  • the group -LG when the group -LG is present, at least one of the groups R 5 , R 6 or R 7 is a group - LG,
  • the reactive group G is an electrophilic or nucleophilic group that can form a covalent bond when brought into contact with a suitable nucleophilic or electrophilic group, respectively.
  • the conjugation reaction between a compound according to the invention comprising a reactive group and an organic molecule, a peptide or a protein bearing a functional group results in the formation of a covalent bond comprising one or more atoms of the reactive group.
  • the reactive group G is a group derived from one of the following compounds: an acrylamide, an activated amine (for example a cadaverine or an ethylenediamine), an activated ester, an aldehyde, an alkyl halide, a anhydride, aniline, azide, aziridine, carboxylic acid, diazoaleane, haloetetamide, halotriazine, such as monochlorotriazin dichlorotriazine, hydrazine (including hydrazides), imido ester, isocyanate, isothiocyanate , a maleimide, a sulfonyl halide, or a thiol, a ketone, an amine, an acid halide, a hydroxysuccinimidyl ester, an ester of hydroxysulfosuccinimidyl, azidonitrophenyl, azidophenyl, 3- (2
  • w is from 0 to 8 and v is 0 or 1
  • Ar is a saturated or unsaturated 5- or 6-membered heterocycle comprising 1 to 3 heteroatoms, optionally substituted by a halogen atom.
  • the reactive group G is a carboxylic acid, a succinimidyl ester, a haloacetamide, a hydrazine, an isothiocyanate, a maleimide group or an aliphatic amine.
  • reactive groups may be bound to the rare earth cryptate directly or via a linking arm L advantageously constituted by a divalent organic radical chosen from linear or branched C 1 -C 2 alkylene groups, optionally containing one or more double or triple bonds; C 5 -C 8 cycloalkylene groups and C 6 -C 14 arylene groups, said alkylene, cycloalkylene or arylene groups optionally containing one or more heteroatoms, such as oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus or one or more carbamoyl or carboxylamido groups, and said alkylene, cyalkylene or arylene groups being optionally substituted by C 1 -C 8 alkyl, aryl groups or C 6 -C 14 , sulfonate or oxo.
  • a linking arm L advantageously constituted by a divalent organic radical chosen from linear or branched C 1 -C 2 alkylene groups, optionally containing one or more double or triple bonds; C 5 -C 8
  • linking arms L may be chosen from the following divalent groups
  • n, m, p, r are integers from 1 to 16, preferably from 1 to 5.
  • the -LG groups consist of a reactive group G chosen from: a carboxylic acid, a succinimidyl ester, a haloacetamide, a hydrazine, an isothiocyanate, a maleimide group, an aliphatic amine, said group G being bound to cryptate directly or via an alkylene chain comprising 1 to 5 carbon atoms.
  • a reactive group G chosen from: a carboxylic acid, a succinimidyl ester, a haloacetamide, a hydrazine, an isothiocyanate, a maleimide group, an aliphatic amine, said group G being bound to cryptate directly or via an alkylene chain comprising 1 to 5 carbon atoms.
  • the -LG group is a carboxylic acid bound to the cryptate directly or via an alkylene chain having 1 to 5 carbon atoms.
  • a preferred compound of the invention is represented by the following formula:
  • an organic molecule, a peptide or a protein that can be labeled with a compound according to the invention will therefore comprise a functional group with which the reactive group of the rare earth cryptate, possibly carried by a connecting arm.
  • the organic molecule, protein or peptide has one of the following functional groups: amine, amide, thiol, alcohol, aldehyde, ketone, hydrazine, hydroxylamine, secondary amine, halide, epoxide, ester (alkyl carboxylate), carboxylic acid, groups having double bonds or a combination of these functional groups.
  • Amino or thiol groups naturally present on proteins are often used to label these molecules.
  • the invention also relates to the macropolycyclic complexes (also known as cryptates) of rare earths consisting of a rare earth salt complexed with a macropolycyclic compound as described above, the rare earth being chosen from: Eu, Tb, Gd, Dy , Nd, Yb, Er.
  • the rare earth is Tb or Eu.
  • the rare earth complexes according to the invention comprising a reactive group are particularly suitable for labeling organic or biological molecules comprising a functional group capable of reacting with the reactive group to form a covalent bond.
  • the invention also relates to the use of rare earth complexes for the labeling of biological molecules.
  • the invention therefore also relates to the molecules labeled with a rare earth cryptate according to the invention.
  • All organic or biological molecules can be conjugated with a rare earth cryptate according to the invention if they have a functional group capable of reacting with the reactive group.
  • the conjugates according to the invention comprise a rare earth cryptate according to the invention and an organic molecule chosen from: an amino acid, a peptide, a protein, an antibody, a sugar, a carbohydrate chain, a nucleoside, a nucleotide, an oligonucleotide, an enzyme substrate, in particular a suicide enzyme substrate such as a benzylguanine.
  • the inventors have furthermore discovered that the reaction of benzylguanine with the alkylguanine-DNA alkyltransferase enzyme is much faster when the benzylguanine is conjugated with a rare earth cryptate according to the invention, in comparison with the reaction of this same enzyme with a benzylguanine coupled to another type of fluorophore.
  • Alk (Ci n ) denotes a linear or branched alkyl group having from 1 to n carbon atoms, such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, neopentyl or hexyl groups.
  • a molecule comprises 2 alkyl groups, the abbreviations 8Ik 1 (Ci n ) and 8Ik 2 (C 1 n ) are used,
  • Croptand a macropolycyclic compound of formula:
  • D, E, F are chromophores, generally carbon rings or aromatic heterocycles, optionally substituted.
  • Cryptands are described in patents EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 and EP 1 290 448.
  • Radio Earth Cryptate means a rare earth complex and a cryptand, the rare earth being linked to cryptand by coordination links. In the remainder of the description, the following nomenclature will be used: "Cryptate of ⁇ rare earth>
  • a europium cryptate whose chromophore E is a py ⁇ dine and the chromophores
  • E and F are bipyndines, will be called: Pyrium-bisbiPy ⁇ dine europium cryptate or
  • TTABTP 10,11, 12,13-tetrahydro-4,5,9,14-tetraaza-benzo [b] t ⁇ phenylene
  • MALDI TOF The MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight) technique is a coupling between the MALDI technique and the so-called flight time mass spectrometry
  • CHCA Matrix resin containing alpha cyano-4-hydroxy-amino acid groups
  • IDAA Matrix resin containing trans-3-indoleacrylic acid groups
  • FRB binding domain of the FRAP protein with the FKBP-rapamycin complex (in the English language “FKBP-rapamycin binding domain of FRAP”)
  • FRAP protein binding to the FKBP-rapamycin complex (in the English language, “FKBP-rapamycin binding protein")
  • FKBP protein binding protein FK506 (English language, “FK506 binding protein")
  • Neocuproin can be hexachlorinated in the presence of N-chlorosuccinimide and then the chlorinated compound thus obtained is treated under oxidizing conditions, thus leading to di-acid orthoquinone.
  • this compound is treated with a 1,2-diamine of formula NH 2 -CR 1 -CR 2 -NH 2 , the TATP unit is formed in the molecule.
  • the resulting diacid is not isolated directly but is esterified as a methyl di-ester which can be purified by chromatography. This diester is then reduced by the sodium borohydride leading to the desired diol.
  • this diol can be obtained by another route of synthesis but always from neocuproine.
  • this compound when this compound is treated with a bromine-nitric acid mixture, generated in situ via a mixture of potassium bromide, sulfuric acid and nitric acid, the corresponding orthoquinone is obtained.
  • 1, 2-diamine of formula NH 2 -CR 1 -CR 2 -NH 2 leads to the desired TATP motif corresponding to the base skeleton comprising the pyrazine ring.
  • the functionalization in position 2 and 2 ' is possible by oxidizing the methyl groups with selenium oxide in dioxane.
  • the reduction of the aldehyde functions to alcohol functions is easily carried out with sodium borohydride, thus leading to the diol.
  • the diol By treating the diol with phosphorus trichloride in chloroform, the corresponding dichloro compound is obtained.
  • the synthesis of the chromophore differs from that presented previously.
  • the 4 and 4 'positions of the starting phenanthroline must be activated.
  • the phenylene 1,2-diamine is condensed on ethyl acetoacetate according to the protocol described in the literature (T. W, Bell et al, J. Org Chem 1987, 52, 3847).
  • the bis-adduct obtained is separated from the mono-adduct by flash chromatography on a silica column.
  • the phenantroline unit is formed by heating at elevated temperature (240 ° C.) in the presence of phenyl ether (Ph 2 O).
  • the corresponding dichlorinated compound is obtained in good yield (89%) using POCI 3 .
  • the strategy used previously is applied to this molecule which allows to obtain a series of derivatives of the TATP pattern.
  • These chromophores are then used in the preparation of the products according to the invention. Preparation of derivatives of pyridine or bipyridine diamine;
  • Dibrominated pyridine is converted to the corresponding diamine by aminolysis by reacting the dibromo compound in a solution of dimethylformamide saturated with ammonia.
  • Another alternative to this strategy is to prepare the diazide and then reduce the intermediate compound to give the desired diamine. The same strategy is used for bipyridine.
  • the method called "2 + 1" is one of the most effective in a single step to obtain a bismacrocycle.
  • This method consists of reacting two dihalogen chromophores with a diamine chromophore.
  • the diagrams below represent the synthesis of a macropolycyclic compound of general formula (V) or (X) and corresponding cryptates.
  • Lithium cryptate is obtained by condensing two equivalents of TATP derivative dichloride with one equivalent of pyridine or bis-pyridine amine. After conventional extraction of the reaction mixture, the crude product is treated with europium chloride or terbium chloride resulting in the corresponding lanthanide cryptate. Cryptates are usually isolated in small amount (at the ⁇ mol scale) by preparative HPLC using a mixture of acetonitrile-water-trifluoroacetic acid as eluent.
  • Chromophore B X leaving group
  • Chromophore B X leaving group
  • a conjugate is carried out according to the protocol described below (example of labeling of a benzylguanine (BG) aminated with a Eu py-bisTHTABTP cryptate).
  • the cryptate having a carboxylic function is activated in the form of NHS ester (TBTU and diisopropylethylamine).
  • NHS ester TBTU and diisopropylethylamine
  • the amino benzylguanine reacts with this ester to yield the desired Cryptate-BG conjugate.
  • Diphenyl ether (50 ml) was introduced into a three-necked flask and heated to 200 ° C. under a stream of nitrogen.
  • the crude product containing the bis-adduct (1 g) was added and heated at 240 ° C. for 30 min, then the mixture was cooled to ambient temperature.
  • Petroleum ether (15 ml) was added and the solid was filtered, washed with ether (2 x 15 ml) and placed in a monocolumn flask containing acetone (15 ml). This mixture was heated to boiling for 15 minutes and the compound was filtered and dried to give a beige solid (130 mg, 30%). Mp 340 ° C (dec).
  • the dihydroxy compound obtained above (2.74 g, 11.4 mmol) was mixed with phosphorus oxychloride (90 ml) and heated at 80 ° C overnight. The mixture was then poured into a crushed ice-water mixture (200 g - 400 g). After 15 min, chloroform (100 ml) was added and the pH of the aqueous phase was adjusted to 13-14 using a concentrated solution of potassium hydroxide. The organic phase was separated and the aqueous phase was extracted with chloroform (2 x 100 ml). The organic phases were combined and dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.
  • neocuproine 2.0 g, 9.6 mmol
  • potassium bromide 11.4 g, 96 mmol
  • 96% sulfuric acid 30 g. ml
  • the mixture was stirred for 15 minutes and then nitric acid (14 ml) was added thereto.
  • the solution was then heated to
  • This compound thus obtained which is a chromophore derived from TATP and carrying aldehyde functions, is suitable for the manufacture of cryptate via the formation of Schiff bases.
  • the dichlorinated compound (20 mg, 45 ⁇ mol) made according to Example 2, the diamine (4.4 mg, 23 ⁇ mol) made according to Example 6 and lithium carbonate (34 mg, 453 ⁇ mol) were mixed in anhydrous acetonitrile (30 ml) and the mixture was heated at 90 ° C for 7 days.
  • the europium trichloride hexahydrate (10 mg, 27 ⁇ mol) was then added to the suspension obtained and the mixture was heated at 90 ° C. for an additional 24 hours.
  • the crude product was purified by preparative HPLC to yield the corresponding europium cryptate.
  • Example 9 Study of the reactivity of the conjugate of Example 7 with an AGT enzyme (SNAPtaq)
  • This example is intended to measure the reactivity of a benzylguanine-cryptate conjugate rare earth according to the invention with the enzyme SNAP-tag.
  • a SNAPtag-FKBP fusion protein was contacted with a benzylguanine-cryptate conjugate, and a FRB protein labeled with an energy acceptor fluorophore (DY647).
  • the reaction of the SNAPtag enzyme with its benzylguanine substrate will lead to the labeling of the SNAPtag-FKBP fusion protein by rare earth cryptate.
  • the proteins FRB and FKBP will interact, and thus cause the approximation of the rare earth cryptate and DY647 making possible the emission of a luminescent FRET signal.
  • the increase of the FRET signal is directly proportional to the percentage of labeled protein in the reaction medium.
  • the GST-SNAPtag-FKBP fusion protein was produced from plasmid pSET-26b according to the commercial kit protocol (SNAP express pSTE7-26b kit Covalys Biosciences AG
  • the FRB protein has been coupled by conventional conjugation techniques with DY647 (Dyomics)
  • Fluorescence readings were taken at 620 nm (Europium) or 520 nm (Terbium) and at 665 nm (DY647) on Analyst (BMG laboratory) in TR-FRET (time resolved FRET) configuration after excitation at 337 nm. The readings are performed before and after induction of the protein interaction.
  • Protein - protein induction between FRB / FKBP partners was achieved by adding 100 nM rapamycin.
  • d 665 (665 nm signal with GST-SNAPtag-FKBP protein) - (signal 665 without the GST-SNAPtag-FKBP protein).
  • the percentage of labeling was obtained by comparison with the incubation overnight (18 h) which corresponds to 100% of the labeled protein.
  • % marking ( ⁇ ' 665 at t measure / d665 18 h) x 100.
  • the Eu py-bisTHTABTP cryptate absorption spectrum was much more favorable than that of Eu TrisbiPy cryptate at Laser wavelength excitation (337 nm). This characteristic was particularly interesting for the use of the compounds according to the invention in systems requiring laser beam excitation, such as their use in assays based on the FRET phenomenon.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

L'invention a pour objet des composés macropolycycliques de formula (I): dans laquelle A et B sont choisis parmi les groupes TATP, bis-pyridine ou pyridine. L'invention concerne également les complexes macropolycycliques ou cryptates de terres rares formés avec les composés de formule (I) et des sels de terres rares. Application : marquage fluorescent de molécules organiques ou biologiques.

Description

NOUVEAUX CRYPTATES DE TERRES RARES COMPORTANT UN MOTIF TETRAAZATRIPHENYLENE
ETAT DE LA TECHNIQUE
L'utilisation de complexes de lanthanides en tant que composés fluorescents pour l'étude de phénomènes biologiques a été développée dans les années 1990 (voir par exemple l'article de Mathis et al., Clin. Chem. 1995 Sep; 41(9):1391-7). Ces complexes de lanthanides ont la propriété de pouvoir générer un FRET intermoléculaire, c'est-à-dire une fluorescence résultant d'un transfert d'énergie de résonance entre deux composés, l'un accepteur d'énergie et l'autre donneur d'énergie (en anglais « Fluorescent Résonance Energy Transfer ») lorsqu'ils sont à proximité d'un composé accepteur d'énergie et qu'ils sont excités à leur longueur d'onde maximale d'absorption.
Le phénomène de FRET est largement utilisé en biologie, notamment pour étudier des interactions moléculaires. Il est basé sur l'utilisation d'un composé donneur fluorescent (par exemple un complexe de terre rare) et d'un composé accepteur éventuellement fluorescent, chacun de ces composés étant couplé à une molécule biologique. Lorsqu'un phénomène biologique provoque le rapprochement de ces molécules, et que le composé donneur est excité, un transfert d'énergie a heu entre le donneur et l'accepteur et va résulter en une variation de la luminescence émise par le milieu réactionnel. Plusieurs sociétés commercialisent des réactifs permettant la mise en œuvre de cette approche pour étudier des processus biologiques ; par exemple la Demanderesse fournit différents réactifs, dont des cryptâtes de terres rares, pour l'étude de phénomènes biologiques particuliers (détection d'activité enzymatique, dosage de seconds messagers etc.).
Les cryptâtes de terres rares, décrits notamment dans les brevets EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113, EP 1 290 448, sont des macrobicycles comportant des motifs dont l'énergie de l'état tπplet est supérieure à celle de la terre rare complexée ; en particulier, ces motifs peuvent être des cycles aromatiques azotés, substitués ou non. Ces cryptâtes de terres rares sont très stables en milieu acide ou alcalin ce qui facilite la mise en œuvre des dosages immunologiques dont les anticorps ont été marqués par ces molécules De plus, leur durée de vie est suffisamment longue (de l'ordre de la milliseconde) pour pouvoir travailler en temps résolu Cependant les cryptâtes de tπsbipyπdine notamment présentent un coefficient d absorption molaire peu élevé à 337 nm (4500 Mol-1 cm-1), longueur d'onde du laser à azote utilisée pour exciter le composé donneur d'énergie ou chromophore Une autre limitation des cryptâtes de tπsbipyπdine est l'obligation d'ajouter au milieu de mesure du fluorure de potassium, pour éviter l'extinction de fluorescence du cryptate liée à la présence de molécules d'eau.
Le motif tetraazatπphenylène a ete décrit en tant qu'antenne capable de collecter l'énergie excitatrice et de la transférer sur le cation lanthanide, conduisant ainsi à une sensibilisation de la luminescence des lanthanides Van der Toi et al ont ainsi étudié une série de dérivés du tétraazatriphénytène et ont souligné leurs excellentes propriétés en tant que chromophores et leur capacité à former des complexes assez stables avec les ions europium et terbium dans l'acétonitrile (E, B. Van der Toi et al., Chem. Eur. J., 1998, 4, 11 , 2315-2323). Le brevet EP 1 019 401 revendique ces complexes de terres rares, constitués d'un dérivé de tétraazatriphénylène et d'une terre rare.
Bakker et al. ont souligné que la stabilité des complexes tétraazatriphénylène / terre rare en milieu aqueux est relativement faible, par rapport à celle observée dans des solvents aprotiques, tels que l'acétonitrile. Pour remédier à ce problème, les auteurs proposent de greffer des groupes carboxylates au squelette triphénylène (B. H. Bakker et al. Chem. Rev., 2000, 208, 3-16).
Bobba et al. ont été parmi les premiers à intégrer l'antenne tétraazatriphénylène à un motif capable de coordonner efficacement les ions de terres rares, en l'occurrence un motif tétraazacyclododécane (Chem. Commun., 2002, 890-891 , Org. Biomol. Chem, 2003, 1 , 1870-1872), et ont montré que les complexes obtenus peuvent s'intercaler dans l'ADN.
Des complexes de terres rares (chélates de terres rares) similaires, constitués d'une antenne de type tétraazatriphénylène et d'une région chélatante dérivée d'un squelette tétrazacyclododécane, ont été synthétisés et étudiés par Parker et al. En particulier cette équipe s'est intéressée à leur capacité à être adaptés à des applications d'imagerie cellulaire (R. A. Poole et al., Org. Biolmol. Chem. 5 (2007) 2055-2062 et R. A. Poole et al., Org. Biomol. Chem., 2005, 3, 1013-1024), ainsi qu'à l'effet d'agents réducteurs sur la luminescence de ces complexes (F. Kielar et al., Org. Biolmol. Chem. 5 (2007) 2975-2982 et R. A. Poole et al., Chem. Commun.(2006) 4084-4086). Un des problèmes posés par ces complexes de terres rares est leur relative instabilité lorsqu'ils sont en solution dans des milieux compatibles avec les milieux biologiques (tampon phosphate, tampon hepes).
Les études de phénomènes biologiques basées sur la technique de FRET nécessitent l'excitation des fluorophores par une source lumineuse, qui peut être fournie par une lampe flash ou plus généralement un laser, émettant de préférence dans le proche ultra-violet : les lasers à azote et les lasers YAG, tous deux employés dans les fluorimètres disponibles commercialement, émettent de la lumière à 337 nm et 355 nm, respectivement. L'utilisation de tels lasers nécessite néanmoins des fluorophores capables d'absorber la lumière à ces longueur d'onde.
L'enzyme Alkyfguanine-DNA alkyltransferase et certains de ses mutants sont apparus comme des outils de choix pour le marquage des protéines. En particulier, l'enzyme SNAP-tag (Juillerat et al,
Chemîstry & biology, Vol.10, 313-317 Avril 2003) commercialisée par la société NEB est un mutant de l'AGT humaine dont le substrat est l'06-benzylguanine (ci-après abrégée BG). Selon cette approche, il est possible de marquer une protéine par un fluorophore en mettant en contact ladite protéine fusionnée avec l'enzyme SNAPTAG, avec un conjugué BG-fluorophore. Il est bien sur souhaitable que la conjugaison de la benzylguanine avec un fluorophore perturbe le moins possible la réactivité de la benzylguanine avec l'enzyme.
Au regard de l'intérêt des complexes de terres rares en tant que composés fluorescents, les inventeurs ont développé une nouvelle famille de composés macropolycycliques capables de former avec des terres rares des complexes macropolycycliques fluorescents. Les inventeurs ont notamment développé des fluorophores particulèrement adaptés à une excitation par des lasers émettant dans le proche ultra-violet, et également capables, lorsqu'ils sont conjugués à la benzylguanine, de ne pas en limiter la réactivité avec l'enzyme alkylguanine-DNA alkyltransferase.
DESCRIPTION :
La présente invention a pour objet des composés macropolycycliques possédant un ou plusieurs motifs dérivés du groupe tétraazatriphényfène (TATP), ainsi que des motifs pyridine ou bipyridine. Elle a également pour objet des complexes macropolycycliques de terres rares ou cryptâtes de terres rares.
Les composés macropolycycliques de l'invention forment des complexes stables avec les terres rares, en particulier avec le terbium et l'europium et leurs spectres d'absorption sont plus favorables à une excitation à 337 nm que les cryptâtes de terres rares de l'art antérieur, en particulier que les cryptâtes Eu-trisbipyridine.
Enfin, ces composés sont plus résistants à l'extinction de fluorescence due aux molécules d'eau que les cryptâtes de l'art antérieur, en particulier les cryptâtes d'europium-trisbipyridine.
L'invention a aussi pour objet les conjugués constitués par une molécule organique ou biologique couplée à un cryptate de terre rare selon l'invention.
COMPOSES MACROPOLYCYCLIQUES
Les composés macropolycycliques selon l'invention sont les composés de formule (I)
dans laquelle :
Figure imgf000006_0001
A et B sont choisis parmi les groupes de formules (II), (III), (IV) :
Figure imgf000006_0002
(H) (III) (IV) „
dans lesquelles :
Ri. R2» Rs. Rg sont identiques ou différents et sont choisis parmi les atomes ou groupes suivants : H1 -alk(Ci-β), -CN, -3Ik(C1^)-COOH, -CONH-alk(Ci4), -COOaIk(Cm), -LG, ou encore R1 et R2 et/ou R8 et R9 forment ensemble, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons ou un cycle succinimide dont l'azote porte un atome ou groupe choisi parmi : H, -alk(Cm) ou - LG :
R3, R4, R10. R11 sont identiques ou différents et sont choisis parmi les atomes ou groupes suivants : H, -LG ou les groupes donneurs d'électrons choisis parmi les groupes ou atomes suivants : -NH2, -NHaIk(Cn,), -N[alk1(C1.6)alk2(C1.6)]> -OH, -OaIk(Cn,), -alk(Cm), -CH-(alk(Ci -6))2, -C(alk(Cm))3, -NHCOaIk(Cm), -S 8Ik(C1-6), -SH, F, Cl1 Br, I ;
R5, R6 et R7 sont identiques ou différents et sont choisis parmi les atomes ou groupes suivants :
H,
Figure imgf000007_0001
-LG, les groupements donneurs d'électrons choisi parmi : -COOH, -NH2, -NHaIk(C1-6), -N[alk1(C1.6)alk2(C1.6)], -OH, -OaIk(Cm), -alk(Cm), -CH-(alk(Cm))2,
-C(alk(Ci-β))3, -NHCOaIk(Cn,), -S 8Ik(C1-6), -SH, F, Cl, Br, I ;
L est un bras de liaison et G est un groupe réactif.
Les composés dans lesquels R3, R4, R10 et R11 sont choisis parmi les groupes H, OH et Cl sont des composés préférés.
Les composés selon l'invention peuvent optionnellement comprendre un ou plusieurs groupes
-LG, de préférence 1 ou 2 groupes -LG, L représentant un bras de liaison et G représentant un groupe réactif dont la fonction est de former une liaison covalente avec une molécule organique ou biologique que l'on souhaite marquer avec les produits selon l'invention.
Les composés selon l'invention peuvent comporter des motifs dérivés du TATP, de la pyridine et de la bipyridine. En particulier, les composés selon l'invention peuvent donc avoir pour formule l'une des formules (V) à (X) :
Figure imgf000008_0001
(V) (Vl) (VU)
Figure imgf000008_0002
(X) _
Bien que les groupes R1, R2, R3 et R4 puissent être différents, les composés dans lesquels
Figure imgf000009_0001
et R3=R4 sont préférés dans la mesure où leur synthèse est plus aisée car elle ne nécessite pas d'étapes de séparation des espèces mono- ou di-substituées.
De même et pour faciliter la synthèse, les composés dans lesquels
Figure imgf000009_0002
sont également préférés.
Enfin et pour les mêmes raisons, les composés dans lesquels R5=R6 sont aussi préférés.
On définit ci-après les différentes familles de composés préférés selon l'invention.
Une première famille de composés particulièrement préférés est constituée des composés de formule (I) dans laquelle, lorsqu'ils sont présents
Figure imgf000009_0003
Rs=Re1 Ou bien R1 et R2 et/ou R8 et R9 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons. Une sous-famille dans laquelle
Figure imgf000009_0004
ou bien Ri et R2 et R8 et Rg forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons, et R3=R4=R10=Rn, est encore plus préférée.
Une deuxième famille de composés particulièrement préférés est constituée des composés de formule (V) dans laquelle Ri=R2,
Figure imgf000009_0005
et R10=R11 ou bien R1 et R2 et/ou R8 et R9 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons. La sous-famille de composés de formule (V) et dans laquelle R1=R2=R8=R9 ou bien R1 et R2 et R8 et R9 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons et R3=R4=R10=R11 est encore plus préférée.
Une troisième famille de composés particulièrement préférés est constituée des composés de formule (Vl) dans laquelle R1=R2 Ou bien R1 et R2 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons,
Figure imgf000009_0006
et
Une quatrième famille de composés particulièrement préférés est constituée des composés de formule (VII) dans laquelle R1=R2 ou bien R1 et R2 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons,
Figure imgf000009_0007
et
Une cinquième famille de composés particulièrement préférés est constituée des composés de formule (VIII) dans laquelle
Figure imgf000009_0008
ou bien R1 et R2 et/ou R8 et R9 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons. La sous-famille de formule (VIII) dans laquelle R1=R2=R8=R9 ou bien R1 et R2 et R8 et R9 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons et R3=R4=R10=R11 est encore plus préférée. Une sixième famille de composés particulièrement préférés est constituée des composés de formule (IX) dans laquelle R1=R2 ou bien R1 et R2 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons, et R3=R4.
Une septième famille de composés particulièrement préférés est constituée des composés de formule (X) dans laquelle
Figure imgf000010_0001
Rs=Re, ou bien Ri et R2 et/ou Re et R9 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons. La sous-famille de formule (X) dans laquelle
Figure imgf000010_0002
ou bien R1 et R2 et R8 et R9 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons et R3=R4=R1O=Rn est encore plus préférée.
Pour les familles ci-dessus, les composés particulièrement préférés sont ceux dans lesquels R1, R2, R8 et R9 sont des atomes d'hydrogène ou bien les couples R1-R2 et R8-R9 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle saturé à 5 ou 6 atomes, et dans lesquels les groupes R3, R4, R10 et R11 sont choisis parmi les groupes H, OH et Cl, et R5, R6 et R7 sont des groupes -LG.
Les composés selon l'invention peuvent comporter un groupe réactif G permettant de coupler le complexe de terre rare fluorescent avec une espèce que l'on souhaite rendre fluorescente, par exemple une molécule organique, un peptide ou une protéine.
Le groupe réactif G peut être porté indifféremment par l'un ou l'autre des substituants R1 à R11, mais sera de préférence porté par l'un des substituants R5, R6 ou R7 lorsqu'ils sont présents, et cela pour faciliter la synthèse du polymacrocycle. En d'autres termes, lorsque le groupe -LG est présent, au moins un des groupes R5, R6 ou R7 est un groupe - LG,
Typiquement, le groupe réactif G est un groupe électrophile ou nucléophile qui peut former une liaison covalente lorsqu'il est mis en présence d'un groupe nucléophile ou électrophile approprié, respectivement. La réaction de conjugaison entre un composé selon l'invention comportant un groupe réactif et une molécule organique, un peptide ou une protéine portant un groupe fonctionnel entraîne la formation d'une liaison covalente comportant un ou plusieurs atomes du groupe réactif.
De préférence, le groupe réactif G est un groupe dérivé d'un des composés ci-après : un acrylamide, une aminé activée (par exemple une cadavérine ou une éthylènediamine), un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoaleane, un haloaeétamide, une halotriazine, telle que la monochlorotriazîne» la dichlorotriazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imîdo ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, ou un thiol, une cétone, une aminé, un halogénure d'acide, un ester d'hydroxysuccinimidyle, un ester d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényle, un azidophényle, un 3-{2-pyridyi dithio)- propionamide, un glyoxal et en particulier les groupes de formule :
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0002
Figure imgf000011_0004
Figure imgf000011_0003
dans lesquels w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1 , et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons, saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène.
De manière préférée, le groupe réactif G est un acide carboxylique, un ester de succinimidyle, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe maléîmide, une aminé altpnatique.
Ces groupes réactifs peuvent être liés au cryptate de terre rare directement ou via un bras de liaison L constitué de manière avantageuse par un radical organique bivalent, choisi parmi les groupes alkylènes linéaires ou ramifiés en C1-C2Q, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons; les groupes cycloalkylène en C5-C8 et les groupes arylène en C6-C14, lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou earboxamido, et lesdits groupes alkylène, cyeloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle en CrC8, aryle en C6-C14, sulfonate ou oxo.
En particulier, les bras de liaison L peuvent être choisis parmi les groupes divalents suivants ;
D "(CH2V
O O
2) — (CH2)n— NH-C-(CH2)- C—
3) — (CH2)n— O-(CH2)m— 0-(CH2)
O O
II II
4) _(CH2)n— O-(CH2)m— O-(CH2)p— NH-C-(CH2)- C-
O
II
5) (CH2)n— NH-C-(CH2).
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000012_0002
Figure imgf000012_0003
Figure imgf000012_0004
10) -(CH2)n— NH-
O
11) — (CH2)n— NH-C-(CH2)-
12) -(CH2) - NH- (CH2)p
dans lesquels n, m, p, r sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5.
De manière préférée, les groupes -LG sont constitués d'un groupe réactif G choisi parmi : un acide carboxylique, un ester de succinimidyle, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, une aminé aliphatique, ledit groupe G étant lié au cryptate directement ou via une chaîne alkylène comprenant de 1 à 5 atomes de carbone.
De manière encore plus préférée, le groupe -LG est un acide carboxylique lié au cryptate directement ou via une chaîne alkylène comprenant de 1 à 5 atomes de carbone.
Un composé préféré de l'invention est représenté par la formule suivante :
Figure imgf000013_0001
Une molécule organique, un peptide ou une protéine susceptible d'être marquée par un composé selon l'invention comprendra donc un groupe fonctionnel avec lequel réagira le groupe réactif du cryptate de terre rare, porté éventuellement par un bras de liaison. Par exemple, Ia molécule organique, la protéine ou le peptide comporte un des groupes fonctionnels suivants : aminé, amide, thiol, alcool, aldéhyde, cétone, hydrazine, hydroxylamine, aminé secondaire, halogénure, époxyde, ester (carboxylate d'alkyle), acide carboxylique, des groupes comportant des doubles liaisons ou une combinaison de ces groupes fonctionnels. Les groupes aminé ou thiol présents naturellement sur les protéines sont souvent utilisés pour procéder au marquage de ces molécules.
COMPLEXES MACROPOLYCYCLIQUES (CRYPTATES) DE TERRES RARES
L'invention concerne également les complexes macropolycycliques (dits également cryptâtes) de terres rares constitués d'un sel de terre rare complexé par un composé macropolycyclique tel que décrit ci-dessus, la terre rare étant choisie parmi : Eu, Tb, Gd, Dy, Nd, Yb, Er. De préférence, la terre rare est Tb ou Eu.
Ces complexes sont préparés en mettant en contact les cryptands selon l'invention et un sel de terre rare. Ainsi la réaction entre 1 équivalent de cryptand et 1 ,2 équivalent de chlorure de lanthanide (europium ou terbium) dans Pacétonitrile à reflux pendant plusieurs heures conduit au cryptate correspondant.
CONJUGUES :
Les complexes de terres rares selon l'invention comportant un groupe réactif sont particulièrement adaptés au marquage de molécules organiques ou biologiques comportant un groupe fonctionnel susceptible de réagir avec le groupe réactif pour former une liaison covalente. Ainsi l'invention concerne aussi l'utilisation de complexes de terres rares pour le marquage de molécules biologiques.
L'invention concerne donc également les molécules marquées par un cryptate de terre rare selon l'invention. Toutes les molécules organiques ou biologiques peuvent être conjuguées avec un cryptate de terre rare selon l'invention si elles possèdent un groupe fonctionnel susceptible de réagir avec le groupe réactif. En particulier, les conjugués selon l'invention comportent un cryptate de terre rare selon l'invention et une molécule organique choisie parmi : un acide aminé, un peptide, une protéine, un anticorps, un sucre, une chaîne glucidique, un nucléoside, un nucléotide, un oligonucléotide, un substrat d'enzyme, en particulier un substrat d'enzyme suicide telle qu'une benzylguanine.
Les inventeurs ont par ailleurs découvert que la réaction de la benzylguanine avec l'enzyme alkylguanine-DNA alkyltransférase est beaucoup plus rapide lorsque la benzylguanine est conjuguée avec un cryptate de terre rare selon l'invention, en comparaison avec la réaction de cette même enzyme avec une benzylguanine couplée à un autre type de fluorophore. Définitions et abréviations :
« alk(Ci n) « : désigne un groupe alkyle linéaire ou ramifié comportant de 1 à n atomes de carbone, tels que les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, néopentyle ou hexyle. Lorsque une molécule comprend 2 groupes alkyles, les abréviations 8Ik1(Ci n) et 8Ik2(C1 n) sont utilisées,
« Cryptand » : désigne un composé macropolycyclique de formule :
Figure imgf000015_0001
dans laquelle D, E, F sont des chromophores, généralement des cycles carbonés ou des hétérocycles aromatiques, éventuellement substitués. Des cryptands sont décrits dans les brevets EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 et EP 1 290 448.
« Cryptate de terre rare » : désigne un complexe comportant une terre rare et un cryptand, la terre rare étant liée au cryptand par des liaisons de coordination. Dans la suite de la description, la nomenclature suivante sera utilisée : « Cryptate de <terre rare>
<chromophore D-chromophore E-chromophore F> ».
Par exemple, un cryptate d'europium, dont le chromophore E est une pyπdine et les chromophores
E et F sont des bipyndines, sera dénommé : Cryptate d'Europium Pyridine-bisbiPyπdine ou encore
Cryptate Eu Py-bisbiPy.
« TATP » : 1 ,4,8,9-tétraazatrιphénylène
« Py » : pyπdine
« THTABTP » : 10,11 ,12,13-tétrahydro-4,5,9,14-tétraaza-benzo[b]tπphénylène
« MS (El) » : Spectrométπe de Masse (Impact électronique) « HRMS (El) » - Spectrométπe de Masse Haute Résolution (Impact électronique)
« P F » • Point de fusion
« MALDI » Ionisation désorption sur matrice assistée par laser (Matrix Assisted Laser Desorption
Ionisation)
« MALDI TOF ». La technique MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation - Time Of Flight) est un couplage entre la technique MALDI et la spectrométne de masse dite à temps de vol
(TOF - ttme-of-flight mass spectrometry), en raison principalement de sa large plage de fonctionnement en masse. Ce nom est couramment utilisé pour désigner l'appareilllage en lui- même
« Matrice CHCA » résine contenant des groupes acide alpha cyano-4-hydroxycmnamique « Matrice IDAA » résine contenant des groupes acide trans-3-ιndoleacrylιque « FRB » : domaine de liaison de la protéine FRAP avec le complexe FKBP-rapamycine (en langue anglaise "FKBP-rapamycin binding domain of FRAP")
« FRAP » : protéine se liant au complexe FKBP-rapamycine (en langue anglaise, "FKBP- rapamycin binding protein") « FKBP » : protéine se liant à la protéine FK506 (en langue anglaise, "FK506 binding protein") « int.rel. » : Intensité relative.
SYNTHESE :
La préparation des composés macropolycycliques et des cryptâtes selon l'invention est décrite de manière schématique ci-après, et de manière plus détaillée dans la partie expérimentale.
Synthèse du chromophore TATP
Le schéma général de la synthèse du chromophore TATP et de ses dérivés est décrit ci-dessous:
Figure imgf000016_0001
Néocuproïne
Figure imgf000016_0002
e
R1= R2 = H, cyclohexyl
Figure imgf000016_0003
Figure imgf000016_0004
1 Î3
Quelle que soit la méthode choisie, il est nécessaire d'utiliser la néocuproïne comme produit de départ. La néocuproïne peut être héxachlorόe en présence de N-chlorosuccinimide puis le composé chloré ainsi obtenu est traité dans des conditions oxydantes conduisant ainsi à l'orthoquinone di-acide. Lorsque ce composé est traité avec une 1 ,2-diamine de formule NH2-CR1-CR2-NH2, Ie motif TATP est formé dans la molécule. Le diacide résultant n'est pas isolé directement mais est estérifié sous forme de di-ester méthyϋque qui peut être purifié par chromatographie. Ce diester est ensuite réduit par le borohydrure de sodium conduisant au diol souhaité. Alternativement, ce diol peut être obtenu par une autre voie de synthèse mais toujours à partir de la néocuproïne. En effet lorsque ce composé est traité avec un mélange brome - acide nitrique, généré in situ via un mélange de bromure de potassium, d'acide sulfurique et d'acide nitrique, l'orthoquinone correspondante est obtenue. Le traitement de ce composé avec la 1 ,2-diamine de formule NH2-CR1-CR2-NH2 conduit au motif TATP souhaité correspondant au squelette de base comportant le cycle pyrazinique. Ensuite la fonctionnalisation en position 2 et 2' est possible en oxydant les groupes méthyle par de l'oxyde de sélénium dans le dioxane. La réduction des fonctions aldéhydes en fonctions alcools est effectuée facilement par du borohydrure de sodium conduisant ainsi au diol. En traitant le diol avec du trichlorure de phosphore dans le chloroforme, on obtient le composé dichloré correspondant.
Lorsque le motif TATP comporte des groupes R3 et R4 différents de l'hydrogène, la synthèse du chromophore diffère de celle présentée précédemment. En particulier, les positions 4 et 4' de la phénanthroline de départ doivent être activées. Ces produits de départ ne sont pas commerciaux, et peuvent être préparés comme indiqué sur le schéma suivant :
Figure imgf000018_0001
Ph2O
24O0C
Figure imgf000018_0002
Figure imgf000018_0003
La phénylène 1 ,2-cliamine est condensée sur l'acétoacétate d'éthyle selon le protocole décrit dans la littérature (T. W, Bell et al , J. Org. Chem. 1987, 52, 3847). Le bis-adduit obtenu est séparé du mono-adduit par chromatographie flash sur colonne de silice. La formation du motif phénantroline est effectuée en chauffant à température élevée (2400C), en présence de l'oxyde de phényle (Ph2O). Le composé dichloré correspondant est obtenu avec un bon rendement (89%) en utilisant le POCI3. Ensuite la stratégie utilisée précédemment est appliquée sur cette molécule ce qui permet d'obtenir une série de dérivés du motif TATP. Ces chromophores sont ensuite utilisés dans l'élaboration des produits selon l'invention. Préparation de dérivés de Ia pyridine ou de la bipyridine diamine ;
Figure imgf000019_0001
| DMF/ NH3 t
Figure imgf000019_0002
La pyridine dibromée est convertie en diamine correspondante par aminolyse en faisant réagir le composé dibromé dans une solution de diméthylformamide saturée en ammoniac. Une autre alternative à cette stratégie consiste à préparer le diazide puis à réduire le composé intermédiaire pour donner la diamine souhaitée. La même stratégie est utilisée pour la bipyridine.
Synthèse de composés macropoly cycliques et cryptâtes dont au moins deux des trois chromophores sont TATP :
Parmi les différentes méthodes de cyclisation pour former des composés macropolycycliques, la méthode appelée « 2+1 » est l'une des plus efficaces permettant en une seule étape d'obtenir un bismacrocycle. Cette méthode consiste à faire réagir deux chromophores dihalogénés avec un chromophore diamine. Les schémas ci-après représentent la synthèse d'un composé macropolycyclique de formule générale (V) ou (X) et des cryptâtes correspondants.
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000020_0002
Le cryptate de lithium est obtenu en condensant deux équivalents de dérivé TATP diehloré avec un équivalent de pyridine ou bien de bipyridine dîaminβ. Après extraction classique du mélange réactionnel, Ie produit brut est traité avec du chlorure d'europium ou du chlorure de terbium, ce qui conduit au cryptate de lanthanide correspondant. Les cryptâtes sont en général isolés en petite quantité (à l'échelle de la μmol) par HPLC préparative en utilisant un mélange d'acétonitrile-eau- acide trifluoroacétique comme éluant.
Synthèse des cryptâtes dont les 3 chromophores sont différents ;
D'autres méthodes également efficaces mais comportant un nombre supérieur d'étapes consistent à préparer un macrocycle sur lequel est condensé un chromophore portant deux groupements partants. Cette méthode permet l'obtention d'un cryptate comportant trois chromophores différents, ce qui n'est pas possible avec la méthode précédente « 2+1 ». On peut citer par exemple les méthodes suivantes :
- Préparation de macrocycles via des bases de Schiff utilisées par David E. Fenton (S. R. Collinson, D. E. Fenton, Coord. Chem. Rev. 1996, 148, 19) et
- Synthèse de macrocycles utilisant la méthode de Stetter et Marx, qui a été utilisée par Jean-Marie Lehn pour élaborer des macrocycles (H. Stetter, J. Marx, Ann. Chem., 1957, vol. 607, 59-66,; B. Dietrich, J. M. Lehn, J. P. Sauvage, Tetrahedron Lett. 1969, 2885-2888).
Les étapes essentielles de ces approches classiques sont résumées dans les schémas suivants :
Technique par amination réductrice via une base de Schiff
Chromophore C
H Chromophore C
[Red] Chromophore A
Chromophore B
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000021_0002
X= groupement partant
Technique par amidation (Stetter et Marx)
Chromophore C
Chromophore C
Chromophore A
Chromophore B
Figure imgf000021_0003
X= groupement partant
Synthèse de conjugués - Marquage de molécules organiques avec les composés selon l'invention
Les techniques de conjugaison de deux molécules organiques sont basées sur l'utilisation de groupes réactifs et relèvent des connaissances générales de l'homme du métier. Ces techniques classiques sont décrites par exemple dans Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, Académie Press, 1996, p. 137-166.
Typiquement la préparation d'un conjugué est réalisée selon le protocole décrit ci-dessous (exemple de marquage d'une benzylguanine (BG) aminée par un cryptate Eu Py-bisTHTABTP). Le cryptate possédant une fonction carboxylique est activé sous forme d'ester de NHS (TBTU et diisopropyléthylamine). La benzylguanine aminée réagit avec cet ester pour conduire au conjugué Cryptate-BG souhaité.
Figure imgf000022_0001
1
EXEMPLES
Exemple 1 : Synthèse du 7,10-Dichlorométhyl-1,4,8,9'tétraazatriphénylène
2,9-bls(trichlorométhyl)- 1, 10-phénanthroïine
Figure imgf000023_0001
Néocuproïπe
A une suspension de néocuproïne (5.2 g, 25 mmol) dans CCI4 (200 ml) ont été ajoutés en une seule portion la N-Chlorosuccinimide (20.06 g, 150 mmol) puis l'acide 3-chloroperbenzoïque (20 mg). La suspension blanche a été chauffée à reflux sans précaution particulière. Au cours du temps la suspension s'est coloré en jaune. L'avancement de la réaction a été suivi par CCM. Après 20 h dans ces conditions, la réaction était complète. La solution a été refroidie à température ambiante puis le solvant a été éliminé sous pression réduite, conduisant à un solide. A ce solide a été ajouté du dichlorométhane (150 ml) pour conduire à une suspension qui a été filtrée. Le solide a été écarté et le filtrat a été concentré sous pression réduite. Le résidu a été dilué dans de l'acétate d'éthyle (150 ml). Cette solution a été lavée avec une solution de saumure (3 x 50 ml), puis avec une solution de Na2CO3 à 10% dans l'eau (50 ml x1). La phase organique a été séchée sur MgSO4, filtrée puis concentrée sous pression réduite pour donner un solide. Ce produit a été purifié par chromatographie en utilisant un gradient d'éluant cyclohexane-Acétate d'éthyle (5/1 à 4/2). Les fractions de même Rf sont regroupées et concentrées sous pression réduite pour conduire au produit désiré (8,64 g, 83% Rdt). P.F. : 2250C. 1H RMN (300 MHz, CDCI3): δ 8.45 (d, J = 8,6 Hz, 2 H) ; 8,33 (d, J= 8,6 Hz, 2 H). MS (El) m/z 415 (M+H).
1, 10-Phénanthrolι"ne-5,6-d!one-2,9-dicarboxylate
Figure imgf000023_0002
Dans un ballon de 250 ml on a introduit de la 2.9-bis(trichlorométhyl)-1,10-phénanthroline (16 g, 16,86 mmol) et le bromure de potassium (10,03 g ; 84,33 mmol). Le mélange a été refroidi par un bain de glace, puis de l'acide sulfurique froid (60 ml) a été ajouté sans précautions particulières. Le mélange a été agité pendant 15 min à cette température puis l'acide nitrique à été ajouté goutte à goutte (30 ml). Le mélange a ensuite été chauffé à 85°C pendant 1h30. La formation de vapeur rousse a pu être observée (brome). Le mélange réactionnel a ensuite été versé dans un mélange glace/eau (1 1 , 400 ml) et le précipité jaune formé a été filtré, lavé avec 5 ml de dichlorométhane et séché sous pression réduite pendant 24 h Un solide jaune a été obtenu (4,45 g, 88%), correspondant au produit souhaité. P F • 202-208 0C (déc). 1H RMN (300 MHz, DMSO d6): δ 8.59 (d, J = 7,8 Hz, 2 H) , 8,27 (d, J = 8,1 Hz, 2 H) 13C RMN (75 MHz, DMSO cfe). δ 176,6 ; 165,5 ; 151 ,9 ; 151 ,5 ; 137,2 , 131 ,3 , 125,7. MS (El) m/z299 (M+H).
Pyrazino[2,3-f][1, 10]-phénanthroUne-7, 10-dicarboxylate de diméthyle.
Figure imgf000024_0001
Dans un ballon de 250 ml on a introduit (4,45 g ; 14,93 mmol) de dione et de l'éthanol absolu (180 ml). A cette solution on a ajouté goutte à goutte de l'éthylène diamine (1 ,19 ml ; 17,91 mmol) sous agitation magnétique. Un précipité gris s'est formé au cours de cette addition. Le mélange a ensuite été chauffé à reflux pendant 60 h. Après cette période, le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu dissous dans du méthanol (180 ml) puis de l'acide sulfuπque concentré (10 ml) a été ajouté. Le mélange a été chauffé à nouveau à reflux pendant 3h. Après cette période de l'eau (300 ml) a été additionnée au mélange dans lequel s'est formé un précipité qui a été filtré, lavé successivement avec de l'eau (100 ml) puis de l'éther diéthylique (50 ml). Le solide ainsi obtenu a été séché sous pression réduite puis purifié par chromatographie flash sur colonne de silice en utilisant un éluant (dichlorométhane-méthanol, 9:1). Un solide beige a été alors obtenu (1 ,5 g, 29%) correspondant au produit souhaité. P.F.: 300-3020C. 1H RMN (300 MHz, CDCI3): δ 9,67 (dd, J = 0,4 Hz ; 8,3 ; 2 H), 9.07 (s, 2 H), 8.65 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.15 (s, OMe, 6 H). 13C RMN (75 MHz, CDCI3): δ 166,2 ; 150,4 ; 146,8 ; 146,0 ; 141,0 ; 135,2 ; 130;0 ; 125,2 ; 53,6 , MS (El) m/z (int. rel ) 349 (M+H, 100), 366 (16).
7, 10-Dihydroxyméthyl- 1,4,8,9-tétraazatriphénylène
Figure imgf000024_0002
Dans un ballon de 250 ml, on a introduit le compose diester (518 mg , 1 ,49 mmol) et du méthanol (125 ml). Â cette suspension on a ajouté, par petites portions, du borohydrure de sodium (350 mg» 925 mmol) L'avancement de la reaction a été SUIVI par HPLC A ce mélange rόactionnel on a ajouté de l'eau (25 ml) puis le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le solide jaune pâle obtenu a été filtré et séché sous pression réduite pendant 24 h pour donner le produit souhaité (300 mg, 68%). 1H RMN (300 MHz, DMSO cfe): δ 9,48 (d, J = 8,3 Hz ; 2 H) ; 9,15 (s, 2 H) ; 8,07 (d, J = 8,5 Hz ; 2 H), 4,95 (s, 4 H). 13C RMN (75 MHz, DMSO cfe): δ 166,1 ; 146,3 ; 140,6 ; 134,4 ; 126,4 ; 122,3 ; 65,9 ; HRMS (El) Calculé pour C16H12N4O2 : 292,0960, trouvée : M, 292,0950; MS (El) m/z(int. rel.) 291 (M-H, 100), 292 (M+, 84), 262 (49), 244 (53).
7,10-Dichlorométhyl-1,4f8,9-tétmazatriphénylène
Figure imgf000025_0001
A une suspension de diol (250 mg ; 0,85 mmol), dans du chloroforme (150 ml) on a ajouté du trichlorure de phosphore (936 mg ; 6,8 mmol). Le mélange a été chauffé à 600C pendant 6 h. La réaction a été ensuite refroidie à température ambiante puis le mélange a été versé avec précaution dans une solution saturée de bicarbonate de sodium (100 ml). La phase organique a été séparée et la phase aqueuse a été extraite avec du dichlorométhane (2 x 100 ml). Les phases organiques sont réunies, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le composé brut obtenu a été purifié par chromatographie sur colonne de silice en utilisant le dichlorométhane comme éluant. On a ainsi obtenu le composé souhaité pur (92 mg, 33%). 1H RMN (300 MHz, CDCI3): δ 9,59 ( d, J = 8,4 Hz ; 2 H) ; 9,00 (s, 2 H) ; 8,10 (d, J= 8,1 Hz ; 2 H) ; 5,14 (s, 4 H). 13C RMN (100 MHz, CDCI3): δ 159,7 (C), 144,8 (CH), 140,3 (C), 134,7 (CH), 126..7 (C), 123,5 (CH), 47,2 (CH2). HRMS (El) Calculé pour C16H10CI2N4 329,0283 ; trouvée 329,0297; MS (El) m/z (int. rel.) 328 (M-H, 100), 330 (M+H, 73), 293 (M+HCI, 53). Le chromophore ainsi obtenu, dérivé du TATP dichloré convient pour la synthèse de cryptâtes par la méthode dite « 2+1 ».
Exemple 2 : Synthèse du 3,6-Dlchlorométhyl-10,11,12,13-tétrahydro-4,5,9,14-tétraaza- benzoTbltriphénylène
10, 11, 12, 13-tétrahydro-4,5,9, 14-tétraaza-benzo[b]triphénylène-3,6-dicarboxylate de diméthyte
Figure imgf000026_0001
A une suspension d'acide 1 ,10-phénanthroIine-5,6-dιone-2,9-dιcarboxylιque dans du méthano! absolu (200 ml) on a ajouté goutte à goutte de la 1,2-diamιnocycIohexane (3,07 ml, 25,2 mmol). Un précipité gris a été observé dans le mélange. Celui-ci a été chauffé à 65°C pendant 2Oh et refroidi jusqu'à la température ambiante. De l'acide sulfuπque (3 ml) concentré a été additionné à ce mélange qui a été ensuite chauffé pendant 3h. A cette solution a été additionnée de l'eau (200 ml) conduisant ainsi à un précipité. Le méthanol a été éliminé sous pression réduite et la phase aqueuse restante a été extraite par du dichlorométhane (3 x 75 ml). Les phases organiques ont été réunies et séchées sur sulfate de magnésium. Le résidu a été purifié par chromatographie flash sur colonne de silice en utilisant un gradient de solvant dichlorométhane-méthanol 100-0 à 97-3 pour donner le composé souhaité (2,33 g, 34%) P.F.: 3020C (déc). 1H RMN (300 MHz, CDCI3): δ 9,62 (d, J = 8,4 Hz, 2 H) ; 8,58 (d, J = 8,4 Hz ; 2 H) ; 4,15 (s, OMe, 6 H) ; 3,27 (s e, 4 H) ; 2,11 (s e, 4 H). 13C RMN (75 MHz, CDCI3): δ 165,9 (C) ; 155,3 (C) ; 149,2 (C) ; 137,7 (C) ; 134,3 (CH) ; 129,8 (C) ; 124,5 (CH) ; 80,2 (C) ; 53,1 (Me) ; 32,8 (CH2) ; 22,6 (CH2) ; HRMS (El) Calculée pour C22Hi8N4O4: 402,1328, trouvée 402,1332; MS (Cl) m/z (mt rel.) 403 (M+H, 55), 405 (28), 315 (19).
3,6-Dîhydroxyméthyl-10, 11, 12, 13-tétrahydro-4, S, 9, 14-tétraaza-benzo[b]triphénylène
Figure imgf000026_0002
A une suspension de 10,11 ,12,13-tétrahydro-4,5,9I14-tétraaza-benzo[/jJtπphenylène-3,6- dicarboxylate de diméthyle (1,37 g, 327 mmol) dans du méthanol (300 ml) on a ajouté du borohydrure de sodium (834 mg ; 22,32 mmol) par petites portions (70 mg) toutes les 30 min. L'avancement de Ia réaction a été suivi par HPLC. De l'eau (50 ml) a été ajoutée à ce mélange et le méthanol a été éliminé sous pression réduite. Le solide jaune pâle formé a été filtré et séché pour donner le diol attendu (834 mg, 73%).1H RMN (300 MHz, DMSO αfe): δ 9,34 ( d, J = 8,4 Hz, 2 H) ; 8,02 (d, J = 8,7 Hz, 2 H) ; 5,74 (m, 2 H, OH) ; 4,92 (m, 4 H) ; 3,18 (s e, 4 H) ; 2,04 (s e, 4 H). 13C RMN (75 MHz, DMSO d6): δ 164,9 (C) ; 154,4 (C) ; 146,2 (C) ; 137,5 (C) ; 133,6 (CH) ; 126,0 (C) ; 121 ,7 (CH) ; 65,6 (CH2) ; 33,1 (CH2) ; 23,0 (CH2). HRMS (El) Calculée pour C20H18N4O2: 346,1430, trouvée : 346,1412; MS (El) m/z (int. rel.) 345 (M-H, 100), 346 (M+,89), 316 (58), 317 (45).
3,6-Dlchlorométhyl-W, 11, 12, 13-tétrahydro-4,5,9, 14-tétraaza-benzo[b]triphénylène (THTABTP)
Figure imgf000027_0001
A une suspension de 3,6-dihydroxyméthyl-10,11 ,12,13-tétrahydro-4,5,9,14-tétraaza- benzo[6]triphénylène (600 mg ; 1 ,73 g) dans du chloroforme (300 ml) on a ajouté du trichlorure de phosphore (1.2 ml ; 13,86 mmol). Le mélange a été chauffé à 600C pendant 6h, puis refroidi à température ambiante et versé prudemment dans une solution saturée de NaHCO3 (200 ml). La phase organique a été séparée et la phase aqueuse a été extraite avec du dichlorométhane (2 x 100 ml). Les phases organiques ont été réunies, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie flash sur colonne de silice en utilisant un gradient de solvant dichlorométhane- méthanol (100-0 à 98-2) pour donner le composé désiré (508 mg, 77%). 1H RMN (300 MHz, CDCI3): δ 9,51 (d, J = 8,4 Hz, 2 H) ; 8,04 (d, J = 8,1 Hz, 2 H) ; 5,13 (s, 4 H) ; 3,24 (m, 4 H) ; 2,10 (m, 4 H). 13C RMN (100 MHz, CDCI3): δ 158,7 (C) ; 154,3 (C) ; 137,4 (C) ; 134,3 (CH) ; 126,8 (C) ; 123,1 (CH) ; 80,7 (C) ; 47,2 (CH2) ; 32,8 (CH2) ; 22,7 (CH2). HRMS (El) Calculée pour C20H17CI2N4: 382,0752, trouvée : 382,0746.; MS (El) m/z (int. rel.) 382 (100), 384 (68), 347 (45, M-HCI). Le chromophore ainsi obetenu, qui est un dérivé dichloré du TATP convient pour la synthèse de cryptâtes par la méthode dite « 2+1 ». Exemple 3 : Synthèse du 1.8-dichloro-3,6-Dlméthyl-10,11,12,13-tétrahvdro-4,5,9,14-tétraaza- benzofbltriphénylène
3,3'-(1,2-phénylènebis(azanediyl))dibut-2-ènoate de diéthyle
Figure imgf000028_0001
Di-adduit Mono-adduit
Un mélange de phénylène-1 ,2-diamine (32,40 g ; 0,3 mol) et d'acétoacétate d'éthyle (84,59 g ; 0,65 mol) ont été placés dans un grand cristallisoir et conservés sous pression réduite (20 mm de Hg) en présence de pentoxyde de phosphore pendant 2 semaines. Le mélange réactionnel a été utilisé dans l'étape suivante sans purification. Cependant un échantillon analytique a été purifié par chromatographie flash sur colonne de silice avec un éluant cyclohexane-acétate d'éthyle (1-9). Cette première chromatographie a permis d'enrichir une fraction en produit désiré. Une deuxième chromatographie flash sur colonne de silice en utilisant un éluant cyclohexane-acétate d'éthyle (15-85) a permis d'obtenir un produit pur sous forme d'une huile incolore. 1H RMN (300 MHz, CDCI3): δ 10,10 (s, 2 H, NH) ; 7,14 (s, 4 H, ArH), 4,75 (s, 2 H) ; 4,12 (q, J = 7,2 Hz, 4 H) ; 1 ,91 (s, 6 H) ; 1 ,25 (t, J = 7,2 ; 6 H); 13C RMN (75 MHz, CDCI3): δ 170,0 (C) ; 158,4 (C) ; 134,6 (C) ; 126,4 (CH) ; 125,6 (CH) ; 87,6 (CH) ; 58,2 (CH2) ; 19,9 (CH3) ; 14,5 (CH3). HRMS (El) Calculée pour Ci8H25N2O4: 333,1814, trouvée 333,1814; MS (El) m/z (int. rel.) 333 (75, M+H), 332 (36, M), 245 (100, M-2EtOH). Le sous-produit principal qui a été isolé correspond au monoadduit sous forme solide incolore. P. F. 63-64°C. 1H RMN (300 MHz, CDCI3): δ 9,75 (s e, 1 H, NH) ; 7,08 (t, J = 7,8 ; 1 H, ArH) ; 6.99 (d, J = 7,8 ; 1 H, ArH) ; 6,73 (m, 2 H, ArH) ; 4,73 (s, 1 H) ; 4,16 (q, J = 6,9 Hz, 2 H) ; 3.83 (s e, 2 H, NH2) ; 1 ,81 (s, 3 H) ; 1 ,30 (t, J = 6,9, 3 H); 13C RMN (75 MHz, CDCI3): δ 170,6 (C) ; 161 ,5 (C) ; 158,5 (C) ; 143,5 (C) ; 128,6 (CH) ; 128,0 (CH) ; 118,3 (CH) ; 115,6 (CH) ; 85,1 (CH) ; 58,7 (CH2) ; 19,7 (CH3) ; 14.6 (CH3).
2,9-Dfméthyl-1,10-phénanthroline-4,7-diol
Figure imgf000028_0002
Du diphénytéther (50 ml) a été introduit dans un ballon tricol et chauffé à 2000C sous un courant d'azote. Le produit brut contenant le bis-adduit (1 g) a été additionné et chauffé à 2400C pendant 30 min, puis le mélange a été refroidi à température ambiante. De l'όther de pétrole (15 ml) a été additionné et le solide a été filtré, lavé avec de l'éther (2 x 15 ml) et introduit dans un ballon monocol contenant de l'acétone (15 ml). Ce mélange a été chauffé à ébullition pendant 15 min et le composé a été filtré et séché pour donner un solide beige (130 mg, 30%). P.F. 340°C (déc).
4, 7-Dlchloro-9-diméthyl- 1, 10-phénanthroline
Figure imgf000029_0001
Le composé dihydroxylé obtenu précédemment (2,74 g ; 11 ,4 mmol) a été mélangé à de l'oxychlorure de phosphore (90 ml) et chauffé à 80°C pendant une nuit. Le mélange a ensuite été versé dans un mélange glace pilée-eau (200 g - 400 g). Après 15 min, du chloroforme (100 ml) a été ajouté et le pH de la phase aqueuse a été ajusté à 13-14 en utilisant une solution concentrée d'hydroxyde de potassium. La phase organique a été séparée et la phase aqueuse a été extraite avec du chloroforme (2 x 100 ml). Les phases organiques ont été réunies et séchées sur sulfate de magnésium, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie flash en utilisant un éluant dichlorométhane-méthanol (98-2) pour donner un solide incolore (2,74 g ; 89%). P.F. 202 0C (déc). 1H RMN (300 MHz, CDCI3): δ 8,25 (s, 2 H); 7,63 (s, 2 H); 2,93 (s, 6 H); 13C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 158,9 (C), 145,4 (C); 141,8 (C); 124,0 (C); 123,1 (CH); 121 ,1 (CH); 24,8 (CH3).
4, 7-Dichloro-2,9-dîméthyl- 1, 10-phénanthroline-5,6-dione
Figure imgf000029_0002
A un mélange du composé dichlorό obtenu précédemment (500 mg ; 1 ,85 mmol) et de bromure de potassium (2,19 g ; 18,5 mmol) dans un ballon de 25 ml ont été ajoutés lentement sous agitation, de l'acide sulfurique (4 ml) puis de l'acide nitrique (2 ml). Le mélange a été chauffé à 800C pendant
3h et versé très lentement dans une solution contenant de l'eau (60 ml) et du NaHCO3 (14 g). La phase aqueuse a été extraite avec du chloroforme (3 x 50 ml). Les phases organiques ont été réunies, sêchées sur sulfate de magnésium, filtrées et concentrées sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie flash sur colonne de silice en utilisant un solvant dichlorométhane-méthanol (98-2) pour donner la dione souhaitée (213 rng, 26%). H RMN (300 MHz, CDCI3): δ 7,36 (s, 2 H); 2,72 (s, 6 H); 13C RMN (75 MHz, CDCI3): δ 178,5 (CO); 166,0 (C); 154,0 (C); 146,5 (C); 128,0 (C); 124,6 (CH); 25,4 (CH3).
1,8-dichloro-3,6-Diméthyl-10, 11, 12, 13-tétrahydro-4,5,9, 14-tétraaza-benzo[b]triphénylène
Figure imgf000030_0001
 une solution de la dione obtenue précédemment (120 mg ; 0,39 mmol) dans du méthanol anhydre (6 ml) a été additionné de la 1 ,2-diaminocyclohexane (56 μl ; 0,47 mmol) et le mélange a été chauffé sous agitation à 65°C pendant 2Oh. Le solvant a été évaporé et le résidu purifié par chromatographie flash sur colonne de silice avec un éluant dichlorométhane-méthanol (98-2) pour donner le produit souhaité. Calculée pour C20H16CI2N4 : 382,07, trouvée M+1 =382,97.
Exemple 4 : 3,6-Dicarboxaldehvde-10,11.12,13-tétrahvdro-4,5,9,14-tétraaza- benzoTbltriphénylène
2,9-Diméthyl- 1, 10-phénanthroline-5,6-dione
Figure imgf000030_0002
Dans un ballon bicol de 100 ml on a introduit de la néocuproïne (2,0 g ; 9,6 mmol) et du bromure de potassium (11 ,4 g ; 96 mmol), puis de l'acide sulfurique à 96% (30 ml). Le mélange a été agité pendant 15 min puis de l'acide nitrique (14 ml) y a été ajouté. La solution a ensuite été chauffée à
800C pendant 3h. Le mélange a été refroidi à température ambiante et versé avec prudence dans une solution aqueuse (400 ml) contenant du bicarbonate de sodium (100 g). La phase aqueuse a été extraite avec du chloroforme (2 x 250 ml). Les phases organiques ont été réunies, lavées avec une solution saturée de saumure (200 ml) et séchées par du sulfate de magnésium. La suspension a été filtrée puis concentrée sous pression réduite pour conduire à un résidu qui a été purifié par chromatographie flash sur gel de silice en utilisant un éluant dichlorométhane-méthanol (9:1) conduisant ainsi au composé désiré. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8,37 (d, J = 8,1 Hz, 2 H) ; 7,41 (d, J = 8,1 Hz, 2 H) ; 2,85 (s, 6 H); MS (El) m/z 238 (M+1 , 100).
3,6-Dlméthyl-10, 11, 12, 13-tétrahydro-4,5,9, 14-tétraaza-benzo[b]triphénylène
Figure imgf000031_0001
A une solution de 2,9-diméthyl-1 ,10-phénanthroline-5,6-dione (4,9 g ; 23,3 mmol) dans du méthanol (300 ml) on a ajouté du 1 ,2-diaminocyclohexane (3,26 ml ; 26,8 mmol) et le mélange a été chauffé à 65°C pendant 2Oh puis refroidi à température ambiante. Le solvant a été éliminé sous pression réduite et le résidu a été purifié par chromatographie flash sur colonne de silice avec un éluant dichlorométhane-méthanol (98-2). Le solide isolé a été recristallisé dans de Péthanol pour donner des cristaux incolores (1 ,260 g ; 20%). P.F.: 321 0C (dec). 1H RMN (300 MHz, CDCI3): δ
9,33 (d, J = 8,4 Hz, 2H) ; 7,59 (d, J= 8,4 Hz, 2 H) ; 3,21 (m, 4 H) ; 2,96 (s, 6 H) ; 2,07 (m, 4H). 13C RMN (75 MHz ; CDCI3): δ 160,8 (C) ; 153,1 (C) ; 146,3 (C) ; 133,0 (CH) ; 125,7 (C) ; 124,9 (C) ; 123,9 (CH) ; 32,7 (CH2) ; 25,8 (CH2) ; 22,8 (Me). HRMS (El) Calculée pour C20H18N4: 394,1531 , trouvée : 314,1526; MS (El) m/z (int. rel.) 314 (100), 315 (25, M+H).
3,6-Dicarboxaldéhyde-10, 11, 12, 13-tétrahydro-4,5,9, 14-tétraaza-benzo[b]triphénylène
Figure imgf000031_0002
A une solution de 3,6-diméthyl-10,11 ,12,13-tétrahydro-4,5,9,14-tétraaza-benzo[d]triphénylène
(200 mg ; 0,64 mmol) dans du dioxane (100 ml) a été additionné de l'oxyde de sélénium (246 mg, 2.22 mmol). La solution a été chauffée à 1000C pendant 4h et sa couleur initialement jaune pâle est devenue progressivement rosé puis une suspension verdâtre et finalement une suspension noire. Le mélange a été refroidi puis filtré sur Celite et le filtrat a été concentré sous pression réduite pour conduire à un solide rosé pâle correspondant au dîaldéhyde (177 mg, 81%). P.F, 247°
(déc). 1H RMN (300 MHz, CDCI3): δ 10,45 (s, 2 H, CHO) ; 9,50 (d, J= 8,4 Hz, 2 H) ; 8,32 (d, J= 8,1 Hz, 2 H) ; 3,20 (s e, 4 H, CH2) ; 2,08 (s e, 4 H, CH2). 13C RMN (75 MHz, CDCI3): δ 193,2 (CHO) ; 155,9 (C) ; 153,3 (C) ; 146,3 (C) ; 137,7 (C) ; 134,7 (CH) ; 130,6 (C) ; 121 ,1 (CH) ; 32,9 (CH2) ; 22,5 (CH2). HRMS (EI) Calculée pour C20H14N4O2: 342,1117, trouvée : 342,1128; MS (Ei) m/z (int. rel.) 314 (55, M-2O), 342 (43), 286 (20, M-2CHO),
Ce composé ainsi obtenu qui est un chromophore dérivé du TATP et porteur de fonctions aldéhydes convient pour la fabrication de cryptate via la formation de bases de Schiff.
3,6-DlhydroxyméthyMO, 11, 12, 13-tétrahydro-4,5,9, 14-tétraaza-benzo[b]triphénylène
Figure imgf000032_0001
A une solution de S.Θ-Dicarboxaldéhyde-IO.I I .^IS-tétrahydro^δ.θ.M-tétraaza- benzo[b]triphénylène (50 mg, 0,14 mmol) dans du méthanol (12 ml) on a ajouté du borohydrure de sodium (60 mg, 1,60 mmol) par petite portion sur une période de 30 min. L'avancement de la réaction a été suivi par HPLC. Après 2 h, le mélange réactionnel a été filtré puis de l'eau a été ajoutée (5 ml). Le méthanol a ensuite été éliminé sous pression réduite. Le solide jaune pâle a été filtré et séché sous pression réduite pendant 24 h conduisant ainsi au diol souhaité (29,5 mg, 58%). %).1H RMN (300 MHz, DMSO ofe): δ 9,34 ( d, J = 8,4 Hz, 2 H) ; 8,02 (d, J = 8,7 Hz, 2 H) ; 5,74 (m, 2 H, OH) ; 4,92 (m, 4 H) ; 3,18 (s e, 4 H) ; 2,04 (s e, 4 H). 13C RMN (75 MHz, DMSO cfe): δ 164,9 (C) ; 154,4 (C) ; 146,2 (C) ; 137,5 (C) ; 133,6 (CH) ; 126,0 (C) ; 121 ,7 (CH) ; 65,6 (CH2) ; 33,1 (CH2) ; 23,0 (CH2). HRMS (El) Calculée pour C20Hi8N4O2: 346,1430, trouvée : 346,1412; MS (El) m/z (int. rel.) 345 (M-H, 100), 346 (M+,89), 316 (58), 317 (45).
Exemple s : Préparation d'un dérivé de pyrldlne dt-aminée, utilisable pour la synthèse de cryptâtes par la méthode dite « 2+1 » :
2,6-Diamm" ométhyl-4~carboxyméthaxy-pyridι"ne
Figure imgf000032_0002
H2 1
A une solution de 3,6-dibromométhyl pyridine-4-méthoxycarbonyIe (500 mg ; 1 ,55 mmo!) dans du diméthylformamide (35 ml) on a ajouté de l'azoture de sodium (210 mg ; 3,25 mmol) et le mélange a été agité à température ambiante pendant une nuit. La solution obtenue a été filtrée et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans du dichlorométhane (30 ml). Les sels insolubles ont été filtrés et lavés avec du dichlorométhane. Le solvant a été éliminé sous pression réduite puis on a ajouté du méthanol (30 ml) et du Pd/C 10%. La suspension noire obtenue a été hydrogénée sous 1 atmosphère d'hydrogène pendant une nuit. Le mélange a été ensuite filtré sur Celite et concentré sous pression réduite. Le résidu a été purifié par chromatographie sur alumine en éluant avec un mélange dichlorométhane-méthanol-ammoniaque (90-9-1) pour donner un solide blanc (193,3 mg, 66%). P.F.: 62°C. 1H RMN (300 MHz, CDCI3): δ 7,68 (s, 2 H); 4,01 (s, 2 H); 3,92 (s, 3 H, OMe); 1 ,78 (s e, 4 H1 NH2). 13C RMN (75 MHz, CDCI3): δ 165,8 (C); 162,6 (C); 138,4 (C); 118,4 (CH); 52,5 (OMe); 47,6 (CH2). HRMS (El) Calculée pour C9H13N3O2: 195,1008, trouvée 195,1012; MS (El) m/z(int. rel.) 195 (25), 178 (100).
Example 6 : Préparation d'un Cryptate d'Europium Py-bisTHTABTP portant un groupe réactif aminé par la méthode dite « 2+1 »
Figure imgf000033_0001
Le composé dichloré (20 mg, 45 μmol) fabriqué selon l'exemple 2, la diamine (4,4 mg ; 23 μmol) fabriquée selon l'exemple 6 et du carbonate de lithium (34 mg, 453 μmol) ont été mélangés dans de l'acétonîtrile anhydre (30 ml) et le mélange a été chauffé à 90°C pendant 7 j. On a ensuite ajouté à la suspension obtenue, du trichlorure d'europium hexahydraté (10 mg, 27 μmol) et le mélange a été chauffé à 900C pendant 24h supplémentaires. Le produit brut a été purifié par HPLC préparatîve pour conduire au cryptate d'europium correspondant. ESI IT-MS: (trouvée M+2TFA=1194), MALDI TOF (Trouvée M=965); MALDI (Matrix IDAA, trouvée M=965) Exemple 7 : Préparation d'un Cryptate de Terbîum Py-bisTHTABTP portant un groupe réactif arnlne par la méthode dite « 2+1 »
Figure imgf000034_0001
Le composé dichloré fabriqué selon l'exemple 2, (36 mg, 82 μmol), la diamine (8.9 mg, 45 μmol) fabriquée selon l'exemple 6 et le carbonate de lithium (68 mg, 906 μmol) ont été ajoutés dans de Pacétonitπle anhydre (60 ml). Le mélange a été chauffé à 9O0C pendant 10 j. Après cette période 2/3 du mélange a été transféré dans un ballon de 50 ml et à cette solution on a ajouté du chlorure de terbîum hexahydraté (11 ,3 mg ; 30,2 μmol). Le mélange a été chauffé pendant 24h. Le produit brut a été purifié par HPLC préparative pour conduire à un solide (7 mg). MALDI (matπx CHCA, M=189) 1162 (M+Matrιx-2H).
Le solide précédent a été dissous dans du méthanol anhydre (6 ml) et de Péthylène diamine (0.2 ml) à 00C. Le mélange a été réchauffé à température ambiante sur une période de 1h puis a été purifié par HPLC préparative pour conduire au composé souhaité. MALDI (matπx CHCAM=I 89) (trouvée- M+matrιx-2H=1189).
Exemple 8 : Préparation d'un conjugué Cryptate dΕuropium Py-bisTHTABTP avec une Benzylquanine
Figure imgf000035_0001
Dans un tube Eppendorf de 1 ,5 ml ont été introduits 200 μl de solution à 10 mmol.r1 dans du diméthylsulfoxyde anhydre (2 μmol) de 6-(4-(aminométhyl)benzyloxy)-9H-purin-2-amine, 200 μl de solution à 10 mmol.r1 dans du diméthylsulfoxyde anhydre (2 μmol) de cryptate dΕuropium Py-bisTHTABTP-COOH, 0,7 mg (2,2 μmol) de O-(Benzotriazol-1-yl)-Λ/,Λ/,A/',/V-tétraméthyluronium tétrafluoroborate (TBTU) et 4 μl de diisopropyléthylamine (DIPEA).
Le mélange a été agité pendant 2h. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck
Lichrospher RP 18 5 μm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique.
Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 μm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique.
Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. Un solide blanc a été obtenu (611 nmol par mesure de densité optique, 30%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : [M+TFA4] 1316,5.
Exemple 9 : Etude de la réactlvité du conjugué de l'exemple 7 aveo une enzyme AGT (SNAPtaq)
Cet exemple a pour objet de mesurer la réactivité d'un conjugué benzylguanine-cryptate de terre rare selon l'invention avec l'enzyme SNAP-tag. Pour cela, une protéine de fusion SNAPtag-FKBP a été mise en contact avec un conjugué benzylguanine-cryptate, et une protéine FRB marquée avec un fluorophore accepteur d'énergie (DY647).
La réaction de l'enzyme SNAPtag avec son substrat benzylguanine va conduire au marquage de Ia protéine de fusion SNAPtag-FKBP par le cryptate de terre rare. En présence de rapamycine, les protéines FRB et FKBP vont interagir, et ainsi provoquer le rapprochement du cryptate de terre rare et du DY647 rendant possible l'émission d'un signal luminescent de FRET. Dans la mesure où l'enzyme SNAPtag ne peut réagir qu'avec un seul substrat benzylguanine, l'augmentation du signal de FRET est directement proportionnelle au pourcentage de protéine marquée dans le milieu réactionnel.
Matériel utilisé :
Conjugué Benzylguanine-Cryptate d'Europium Py-bisTHTABTP
Conjugué Benzylguanine-Cryptate de Terbium Py-bisTHTABTP Conjugué Benzylguanine-Cryptate d'Europium tris-biPy (Cis bio international)
La protéine de fusion GST-SNAPtag-FKBP a été produite à partir du plasmide pSET-26b selon le protocole du kit commercial (SNAP express pSTE7-26b kit Covalys Biosciences AG
Witterswil/Switzerland).
La protéine FRB a été couplée par des techniques classiques de conjugaison avec le DY647 (Dyomics)
Mode opératoire
2 nmoles de protéine recombinante FRB, préalablement marquée avec un accepteur (DY647) , ont été co-incubées à température ambiante avec 2 nmoles de protéine recombinante GST-SnapTag®-FKBP et des concentrations croissantes de conjugué Benzylguanine-Cryptate d'Europium Py-bisTHTABTP , de conjugué Benzylguanine-Cryptate de Terbium Py-bisTHTABTP ou de conjugué Benzylguanine-Cryptate d'Europium tris-biPy.
Les lectures de fluorescences ont été effectuées à 620 nm (Europium) ou 520 nm (Terbium) et à 665 nm (DY647) sur Analyst (BMG laboratory) en configuration TR-FRET (FRET en temps résolu) après une excitation à 337 nm. Les lectures sont réalisées avant et après induction de l'interaction protéique.
L'induction protéine - protéine entre les partenaires FRB/FKBP a été obtenue par ajout de 100 nM de rapamycine.
Ce modèle in vitro permet d'établir des cinétiques de marquage enzymatique en fonction de l'excès de substrat engagé dans la réaction.
Les résultats sont indiqués soit en d665 soit en % de marquage suivant les formules suivantes : ^
d 665 = (signal 665 nm avec la protéine GST-SNAPtag-FKBP) - (signal 665 sans la protéine GST-SNÂPtag-FKBP).
Le pourcentage de marquage a été obtenu par comparaison à l'incubation pendant une nuit (18 h) qui correspond à 100 % de la protéine marquée.
% marquage = (α'665 à t mesure / d665 18 h)x 100 .
Résultats :
Les résultats sont présentés sur la figure 1. La réactivité des conjugués benzylguanine-cryptate selon l'invention (Eu Py-bisTHTABTP et Tb
Py-bisTHTABTP ) a été fortement améliorée par rapport à celle du composé de référence (Eu-
TBP).
Après 1h d'incubation un excès de substrat (facteur 12,5) permet d'atteindre la saturation de marquage avec les BG -TATP alors que cette saturation n'a été pas atteinte avec un excès de substrat de référence (facteur 50).
Exemple 10 : Comparaison des spectres UV d'un cryptate Eu-TBP et d'un cryptate Eu Pv- bisTHTABTP
Les spectres d'absorption des cryptâtes Eu-TBP et Eu Py-bisTHTABTP ont été mesurés et sont présentés sur la figure 2 (Abs, TBP et Abs, TATP respectivement).
Le spectre d'absorption du cryptate Eu Py-bisTHTABTP a été beaucoup plus favorable que celui du cryptate Eu TrisbiPy à une excitation à la longueur d'onde du Laser (337 nm) Cette caractéristique a été particulièrement intéressante pour l'utilisation des composés selon l'invention dans des systèmes nécessitant une excitation par rayon laser, telles que leur utilisation dans des dosages basés sur le phénomène de FRET.

Claims

REVENDICATIONS :
1. Composé macropolycyclique de formule (I) :
Figure imgf000038_0001
dans laquelle :
A et B sont choisis parmi les groupes de formule (II), (III), (IV) :
Figure imgf000038_0002
Ri, R2. Re. Rg sont identiques ou différents et sont choisis parmi les atomes ou groupes suivants : H, -alk(d-β), -CN, -8Ik(C14KXX)H, -CONH-alk(Ci-β), -COO-alk(Ci-β), -LG, ou encore R1 et R2 et/ou R8 et R9 forment ensemble, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons ou un cycle succinimide dont l'azote porte un atome ou groupe choisi parmi : H, -alk(Ci-e) ou- LG ;
R31 R4. R101 R11 sont identiques ou différents et sont choisis parmi les atomes ou groupes suivants : H, -LG ou un groupe donneur d'électrons choisi parmi les groupes ou atomes suivants : -NH2, -NHaJk(Ci-S),
Figure imgf000038_0003
-OH, -O-alk(d-β), -8Ik(Cm), -CH-(alk(C1-6))2, -C(alk(Ci.β))3, -NHCO-alk(Ci-β), -S alk(Cm), -SH, F, Cl, Br, I ;
R5, R6 et R7 sont identiques ou différents et sont choisis parmi les atomes ou groupes suivants : H,, -COO-alk(C1.6)! -LG, un groupe donneur d'électrons choisi parmi : -COOH, -NH2, -NHaIk(C14), -N[aIk,(C14)aJk2(Cn»)], -OH1 -OaJk(C14), -alk(Ci4), -CHKaIk(C14))2l -C(alk(C14))3, -NHCOaIk(Ci4), -S alk(C14), -SH, F, C!, Br1 1 ;
G représente un groupe réactif dont la fonction est de former une liaison covalente avec une molécule organique ou biologique et L représente un bras de liaison.
2. Composé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que
Figure imgf000039_0001
R3=R4,
Figure imgf000039_0002
Rio≈Rn, R5=R6 ou bien R1 et R2 et/ou R8 et R9 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons.
3. Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que
Figure imgf000039_0003
ou bien R1 et R2 et R8 et R9 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons et R3=R4=R10=Rn
4. Composé selon la revendication 1 à 3, caractérisé en ce que R1, R2, R8 et Rg sont des atomes d'hydrogène ou bien R1 et R2 et R8 et R9 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons, en ce que les groupes R3, R4, R10 et R11 sont choisis parmi les groupes H, OH et Cl, et en ce que R5, R6 et R7 sont des groupes -LG.
5. Composé selon la revendication 1 de formule (V)
Figure imgf000039_0004
dans laquelle
R-if R2, R3, R4. R7. Re, R9, R10 et R11 sont tels que définis à la revendication 1. oo
38
6. Composé selon la revendication 5, caractérisé en ce que
Figure imgf000040_0001
R3=R4, et R10=Rn ou bien R1 et R2 et/ou Re et Rg forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons,
7. Composé selon la revendication 6, caractérisé en ce que R1=R2=R8=R9 ou bien R1 et R2 et
R8 et R9 forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons et R3=R4=R10=R11.
8. Composé selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que R1, R2, R8 et R9 sont des atomes d'hydrogène ou bien R1 et R2 et R8 et Rg forment, avec les atomes de carbone auxquels ils sont liés, un cycle hydrocarboné saturé à 5 ou 6 chaînons, en ce que les groupes R3, R4, R10 et R11 sont choisis parmi les groupes H, OH et Cl, et en ce que R7 est un groupe -LG.
9. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le bras de liaison L est une liaison covalente ou un radical organique bivalent choisi parmi : les groupes alkylène linéaires ou ramifiés en C1-C20, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons; les groupes cycloalkylène en C5-C8 et les groupes arylène en C6-C14, lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle en C1-C8, aryle en C6-C14, sulfonate ou oxo.
10. Composé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le bras de liaison L est choisi parmi les groupes divalents suivants :
1) — (CH2)n
Figure imgf000040_0002
3) — (CH2)n— O-(CH2)m— O-(CH2)p—
O O
4) ™(CH2)n— O-(CH2)m— O-(CH2)p~NH-C-(CH2)n— C-
O
5) — (CH2Jn-NH-C-(CH2)-
Figure imgf000041_0001
10) -(CH2),- NH-
O
H) (CH2Jn-NH-C-(CH2)-
12) — (CH2)- NH- (CH2)p
dans lesquels n, m, p, r sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5.
11. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le groupe réactif G est choisi parmi les groupes suivants : un acrylamide, une aminé activée, un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, une haloacόtamide, une halotriazine, telle que la monochlorotriazine, la dîchlorotriazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimîde, un halogénure de sulfonyle, ou un thiol, une cétone, une aminé, un halogénure d'acide, un ester d'hydroxysuecinimidyle, un ester d'hydroxysulfosuccinimidyle, un azidonitrophényl, un azidophényl, une 3-(2-pyridyl dithio)- propionamide, glyoxal et en particulier les groupes de formule :
Figure imgf000042_0001
Figure imgf000042_0002
Figure imgf000042_0004
Figure imgf000042_0003
où w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1 , et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons, saturé ou insaturé, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène.
12. Composé selon la revendication 11 , caractérisé en ce que G est un groupe réactif choisi parmi les groupes suivants : un acide carboxylique, une aminé, un succînimidyl ester d'acide carboxylique, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un groupe maléimide, une aminé aliphatique.
13. Composé selon les revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le groupe -LG est constitué d'un groupement réactif G choisi parmi : un acide carboxylique, un ester de succinimidyle, un haloacétamide, une hydrazine, un isothîocyanate, un groupe maléimide, une aminé aliphatique, et d'un bras de liaison L choisi parmi : une liaison simple, une chaîne alkylène comprenant de 1 à 5 atomes de carbone.
14. Composé selon Ia revendication 13 caractérisé en ce que le groupe -LG est constitué d'un groupe réactif G qui est un acide carboxylique et en ce que Ie bras de liaison L est choisi parmi : une liaison simple, une chaîne alkylène comprenant de 1 à 5 atomes de carbone.
15. Composé selon la revendication 14 de formule :
Figure imgf000043_0001
16. Complexe de terre rare comprenant un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 et un lanthanide.
17. Complexe de terre rare selon la revendication 16, caractérisé en ce que le lanthanide est choisi parmi : l'europium et le terbium.
18. Conjugué comprenant une molécule organique liée de manière covalente à un complexe de terre rare selon l'une des revendications 16 ou 17. 4
19. Conjugué selon la revendication 18 de formule
Figure imgf000044_0001
PCT/FR2009/052584 2008-12-19 2009-12-17 Nouveaux cryptates de terres rares comportant un motif tetraazatriphenylene WO2010070232A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0858884A FR2940286B1 (fr) 2008-12-19 2008-12-19 Nouveaux cryptates de terres rares comportant un motif tetraazatriphenylene
FR0858884 2008-12-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010070232A1 true WO2010070232A1 (fr) 2010-06-24

Family

ID=40795032

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2009/052584 WO2010070232A1 (fr) 2008-12-19 2009-12-17 Nouveaux cryptates de terres rares comportant un motif tetraazatriphenylene

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2940286B1 (fr)
WO (1) WO2010070232A1 (fr)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3092115A1 (fr) 2019-01-30 2020-07-31 Cisbio Bioassays analogues de GTP fluorescents et utilisation
CN112300164A (zh) * 2020-11-04 2021-02-02 济南国科医工科技发展有限公司 稀土钐穴醚荧光配合物及其制备方法
WO2021119537A1 (fr) * 2019-12-11 2021-06-17 Fog Pharmaceuticals, Inc. Technologies utiles pour évaluer la perméabilité
CN114315828A (zh) * 2021-12-29 2022-04-12 华能新能源股份有限公司 一种可溶液加工的电子传输层修饰材料及其制备方法和应用
CN114349752A (zh) * 2022-01-24 2022-04-15 华能新能源股份有限公司 一种可溶液加工的电子传输层修饰材料及其制备方法和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0180492A1 (fr) 1984-09-26 1986-05-07 Cis Bio International Complexes macropolycycliques de terres rares-et application à titre de marqueurs fluorescents
EP0321353A1 (fr) 1987-12-18 1989-06-21 Cis Bio International Cryptates de terres rares, procédés d'obtention, intermédiaires de synthèse et application à titre de marqueurs fluorescents
EP0601113A1 (fr) 1991-08-30 1994-06-15 Cis Bio Int Complexes macrocycliques de terres rares et leur utilisation pour reduire les interferences dans un dosage par fluorescence.
EP1019401A1 (fr) 1997-04-25 2000-07-19 Akzo Nobel N.V. Complexe comprenant un ion metallique du groupe des terres rares et une fraction complexante
EP1290448A2 (fr) 2000-06-15 2003-03-12 Cis Bio International Cryptates de metal des terres rares a l'extinction de fluorescence reduite
WO2006039505A2 (fr) * 2004-09-30 2006-04-13 Molecular Devices Corporation Complexes de lanthanides luminescents

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0180492A1 (fr) 1984-09-26 1986-05-07 Cis Bio International Complexes macropolycycliques de terres rares-et application à titre de marqueurs fluorescents
EP0321353A1 (fr) 1987-12-18 1989-06-21 Cis Bio International Cryptates de terres rares, procédés d'obtention, intermédiaires de synthèse et application à titre de marqueurs fluorescents
EP0601113A1 (fr) 1991-08-30 1994-06-15 Cis Bio Int Complexes macrocycliques de terres rares et leur utilisation pour reduire les interferences dans un dosage par fluorescence.
EP1019401A1 (fr) 1997-04-25 2000-07-19 Akzo Nobel N.V. Complexe comprenant un ion metallique du groupe des terres rares et une fraction complexante
EP1290448A2 (fr) 2000-06-15 2003-03-12 Cis Bio International Cryptates de metal des terres rares a l'extinction de fluorescence reduite
WO2006039505A2 (fr) * 2004-09-30 2006-04-13 Molecular Devices Corporation Complexes de lanthanides luminescents

Non-Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B. DIETRICH; J. M. LEHN; J. P. SAUVAGE, TETRAHEDRON LETT., 1969, pages 2885 - 2888
B. H. BAKKER ET AL., CHEM. REV., vol. 208, 2000, pages 3 - 16
CHEM.COMMUN., 2002, pages 890 - 891
E. B. VAN DER TOI ET AL., CHEM. EUR. J., vol. 4, no. 11, 1998, pages 2315 - 2323
F. KIELAR ET AL., ORG. BIOLMOL. CHEM., vol. 5, 2007, pages 2975 - 2982
G.T. HERMANSON: "Bioconjugate Techniques", 1996, ACADEMIC PRESS, pages: 137 - 166
H. STETTER; J. MARX, ANN. CHEM., vol. 607, 1957, pages 59 - 66
JUILLERAT ET AL., CHEMISTRY & BIOLOGY, vol. 1 0, April 2003 (2003-04-01), pages 313 - 317
MATHIS ET AL., CLIN. CHEM., vol. 41, no. 9, September 1995 (1995-09-01), pages 1391 - 7
ORG. BIOMOL. CHEM, vol. 1, no. 18, 2003, pages 70 - 1872
R. A. POOLE ET AL., CHEM. COMMUN., 2006, pages 4084 - 4086
R. A. POOLE ET AL., ORG. BIOLMOL. CHEM., vol. 5, 2007, pages 2055 - 2062
R. A. POOLE ET AL., ORG. BIOMOL. CHEM., vol. 3, 2005, pages 1013 - 1024
S. R. COLLINSON; D. E. FENTON, COORD. CHEM. REV., vol. 148, 1996, pages 19
T. W. BELL ET AL., J. ORG. CHEM., vol. 52, 1987, pages 3847
VAN DER TOL, E.B. ET AL.: "Tetraazatriphenylenes as Extremely Efficient Antenna Chromophores for Luminescent Lanthanide Ions", CHEMISTRY - A EUROPEAN JOURNAL, vol. 4, no. 11, 1998, pages 2315 - 2323, XP002535183, ISSN: 0947-6539 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3092115A1 (fr) 2019-01-30 2020-07-31 Cisbio Bioassays analogues de GTP fluorescents et utilisation
WO2020157439A1 (fr) 2019-01-30 2020-08-06 Cisbio Bioassays Analogues de gtp fluorescents et utilisation
WO2021119537A1 (fr) * 2019-12-11 2021-06-17 Fog Pharmaceuticals, Inc. Technologies utiles pour évaluer la perméabilité
CN112300164A (zh) * 2020-11-04 2021-02-02 济南国科医工科技发展有限公司 稀土钐穴醚荧光配合物及其制备方法
CN114315828A (zh) * 2021-12-29 2022-04-12 华能新能源股份有限公司 一种可溶液加工的电子传输层修饰材料及其制备方法和应用
CN114315828B (zh) * 2021-12-29 2023-09-22 华能新能源股份有限公司 一种可溶液加工的电子传输层修饰材料及其制备方法和应用
CN114349752A (zh) * 2022-01-24 2022-04-15 华能新能源股份有限公司 一种可溶液加工的电子传输层修饰材料及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
FR2940286A1 (fr) 2010-06-25
FR2940286B1 (fr) 2011-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2734518B1 (fr) Agents complexants et complexes de lanthanide correspondants
US9714260B2 (en) Asymmetrical Si rhodamine and rhodol synthesis
EP2331510B1 (fr) Substrats d&#39; o6-alkylguanine-adn alkyltransferase (agt) et leur utilisation dans des methodes de marquage
US8178669B2 (en) Fluorescent probe for peroxynitrite
EP1674579A1 (fr) Sonde fluorescente
EP0321353A1 (fr) Cryptates de terres rares, procédés d&#39;obtention, intermédiaires de synthèse et application à titre de marqueurs fluorescents
FR2810406A1 (fr) Nouveaux cryptates de terre rare peu sensibles a l&#39;extinction de fluorescence
WO2010070232A1 (fr) Nouveaux cryptates de terres rares comportant un motif tetraazatriphenylene
Esteves et al. Synthesis and evaluation of benzothiazolyl and benzimidazolyl asparagines as amino acid based selective fluorimetric chemosensors for Cu2+
WO2004005917A1 (fr) Sonde fluorescente
FR2921062A1 (fr) Composes utiles comme ligands et notamment comme chromophores organiques de complexation des lanthanides et leurs applications
EP3638659B1 (fr) Nouveaux agents mono et di-antennes complexants hydrosolubles et complexes de lanthanide correspondants
US9170266B2 (en) Fluorescent probe
US9250232B2 (en) Fluorescent probe
KR102131302B1 (ko) 화합물, 상기 화합물을 포함하는 형광 프로브 조성물, 상기 형광 프로브 조성물을 이용한 수은 이온 검출방법
EP3386974B1 (fr) Agents complexants hydrosolubles a base de triazapyridonophane et complexes de lanthanide fluorescents correspondants
JP5360609B2 (ja) 低酸素環境測定用試薬
US11787946B2 (en) Deuterated fluorophores
US9133220B2 (en) Boron-containing 5-arylidene-3,5-dihydro-4H-imidazol-4-ones
Nacheva et al. Fluorescent properties and resonance energy transfer of 3, 4-bis (2, 4-difluorophenyl)-maleimide
Folliet Towards the development of a visible light-enabled histidine-selective protein modification strategy using diazo sulfonium-based probes
WO2019008118A1 (fr) Complexes de terbium et de dysprosium avec antenne optimisée, utiles comme marqueurs luminescents

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09805722

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 09805722

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1