CN104072606A - 利用g蛋白偶联受体和相关组合物的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用G蛋白偶联受体和相关组合物的筛选方法，其提供了用于GPCR的筛选方法，其基于以下发现：当未结合于G蛋白时，受体激动剂对于GPCR(如甲状旁腺激素受体)的亲和力与其间激动剂有效的时间长度有关，而与它的药物动力学特性无关。本发明还提供了PTH和PTHrP来源的多肽。

Description

利用G蛋白偶联受体和相关组合物的筛选方法

本申请是申请日为2008年8月1日的题为“利用G蛋白偶联受体和相关组合物的筛选方法”的中国专利申请No.200880101180.5的分案申请

关于联邦政府资助研究的陈述

本发明是在美国政府支持下在由国家卫生研究所授予的资助号DK11794下作出的。政府对本发明具有一定权利。

背景技术

通常，本发明涉及一种具有长或短寿命活性(prolonged orshort-lived activity)的G蛋白偶联受体(GPCR)的激动剂(agonists)的筛选方法。更具体地说，本发明涉及甲状旁腺(PTH)激素或PTH相关蛋白(PTHrP)配体类似物，与PTH(1-34)相比，其对于PTH受体(PTHR)具有更长或更短寿命的活性。本发明还涉及利用本发明的方法鉴定的PTHR配体以及这样的配体在治疗疾病中的应用。

GPCR是较大组的膜受体，其响应于通过激动剂进行的激活作用来激活G蛋白，其本身接着引起至少一种信号级联的激活，如环AMP/蛋白激酶A级联。该较大组的受体存在于从细菌到人类的生物中，并且涉及，例如，激素、神经元、以及嗅觉信号转导。

甲状旁腺激素受体(PTHR)是PTH和PTH相关蛋白(PTHrP)的内源性受体，然而每种配体具有不同的生物学功能。PTH调节钙和磷酸盐稳态(体内稳态)并作为腺分泌的内分泌激素作用于骨和肾脏中的靶细胞。PTH还主要通过它对位于肾近端小管(PT)细胞中的钠依赖性磷酸盐转运蛋白(NaP_i-IIa和NaP_i-IIc)的作用来减少无机磷酸盐(P_i)的重吸收。PTHrP调节在发育组织中的细胞增殖和分化程序，以及被分泌并以旁分泌方式在组织原基中起作用(Kronenberg,H.M.Ann.N.Y.Acad.Sci.1068:1-13(2006))。

PTH和PTHrP在它们的氨基末端(残基1-14)信号区(signalingdomains)是最同源的(8个氨基酸同一性)，并且在它们的14-34个结合域呈现中等同源性(3个同一性)。通常推测，PTH和PTHrP的完全活性(残基1-34)部分经由基本相同的机制与PTHR相互作用(Caulfield et al.,Endocrinology127:83-87(1990)；Abou-Samra et al.,Endocrinology125:2215-2217(1989))。认为该机制包括两个主要成分(components)：配体的羧基末端结合域与受体的氨基末端胞外(N)域之间的相互作用，以及配体的氨基末端信号区(signaling domains)与受体的近膜(J)区之间的相互作用，其包含胞内环和7个跨膜螺旋(Hoare et al.,J.Biol.Chem276:7741-7753(2001)；Castro et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:16084-16089(2005)；Witelsberger et al.,Biochemistry45:2027-2034(2006)；Shimizu et al.,J.Biol.Chem.280:1797-1807(2005)；Gensure et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.328:666-678(2005))。然而，两种配体所使用的结合的确切机制不同的程度(如果有的话)仍有待确定。

在人类中，PTH(1-34)具有有力的骨合成代谢效应，并且诱导骨矿质密度(bone mineral density)和骨强度的显著增加。确实，现在重组人PTH(1-34)被认为是用于骨质疏松症的最有效的治疗方法之一(Tashjian and Gagel,J.Bone Miner.Res21:354-365(2006))。重要的是，必须以脉冲(搏动)方式(例如，每日一次皮下注射)来给予hPTH(1-34)，以便实现它的成骨效应(骨形成效应，bone-forming effects)。在更长期给予的情况下，与持续输液泵机制一样，PTH(1-34)会对骨施加净分解代谢效应，这是由于相对于由成骨细胞介导的成骨反应，由破骨细胞介导的骨吸收(骨再吸收)反应具有更大的激活作用。因此在骨中PTH受体暴露于PTH配体的持续时间是由所述配体实现的总的骨形成反应的关键决定因素，因而是其治疗骨质疏松症的效力的关键决定因素。

临床研究已表明，PTHrP(1-36)在人类中还可以增加骨矿质密度，并且可以达到与PTH(1-34)大约相同的程度，虽然需要更高的剂量(Horwitz et al.,J.Endocrinol.Metab.88:569-575(2003))。重要的是，甚至在这样的更高剂量下，PTHrP(1-36)也并不刺激有害的骨吸收和高血钙反应，而相同剂量的PTH(1-34)则预期会发生这种情况(Horwitz et al.,J.Endocrinol.Metab.88:569-575(2003)；Horwitz etal.,J.Bone Miner.Res.20:1792-1803(2005)；Horwitz et al.,Osteoporosis Int.17:225-230(2006))。两种肽的生物活性的差异并不仅是由于药物代谢动力学(pharamacokinetics)的差异。利用稳态输注法进行的两种肽的直接比较表明，就刺激1,25-(OH)₂维生素D3的肾合成而言，与PTH(1-34)相比，PTHrP(1-36)是显著更少有效的(Horwitz et al.,J.Bone.Mineral.Research.20:1792-1803(2005))。

除骨质疏松症以外，hPTH(1-34)还显示出可以有效治疗PTH缺乏的病症，即甲状旁腺功能减退。因而，PTH(1-34)显示为是骨化三醇治疗的安全和有效的备选方案并且能够保持正常的血清钙水平而没有在甲状旁腺功能减退患者中的高钙尿症(Winer et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.88:4214-4220(2003))。该肽必须被每日注射至少两次，并且作者认识到该疾病需要长效PTH(1-34)类似物(Winer et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.88:4214-4220(2003))。

因此，本技术领域需要这样的PTH或PTHrP类似物，与PTH(1-34)相比，其对PTH受体具有更长或更短效的作用。还需要这样的测定(分析)，其使得可以区分长效与短效的PTH肽。

发明内容

按照经典的GPCR理论，可以区分两种形式的G蛋白偶联受体：形式(RG)，其结合于G蛋白，以及形式(R)，其未结合于G蛋白。GPCR信号需要受体直接激活G蛋白，即，必须形成RG状态，并且通过激动剂配体(agonist ligand)的结合可以诱导这种RG形成。激动剂配体的结合可以诱导或稳定RG状态，并且相互地，RG状态可以稳定激动剂的高亲和结合。在结合GTP或非水解的GTP类似物(如GTPγS)以后，受体偶联G蛋白将从该受体解离，引起该受体回复到低亲和状态。现在认识到，一些GPCR如PTHR可以形成新的状态(R⁰)，其甚至在有GTPγS存在的情况下，由此甚至当G蛋白很可能未结合受体时也可以以高亲合力结合某些激动剂配体。通常，在细胞中GPCR处于RG、R、或R⁰状态的比例可以根据细胞类型和条件而变化。由于这些原因，先前关于评估配体与GPCR的结合的工作通常并不明确区分RG、R、或R⁰状态。本发明的发明人研究了PTH受体，一种示例性的GPCR，已发现，与以较低亲和力结合于R⁰的配体相比，以高亲和力结合于R⁰状态(除RG状态以外)的配体具有更长的活性半衰期，并且这种长期活性并不依赖于配体体内的生物利用度或药代动力学。因此，短期作用的激动剂对于受体的R⁰形式具有更低的亲和力。基于该发现，本发明提供了用于鉴定长效或短效GPCR激动剂的方法，以及利用本发明的方法鉴定的肽激动剂。

在第一方面，本发明提供了一种用于确定候选化合物是否是G蛋白偶联受体(GPCR)的长效激动剂的方法。该方法包括(a)使GPCR与该化合物接触，其中GPCR具有RG形式，(b)测量该化合物对于GPCR的RG形式的亲和力，(c)使GPCR与该化合物接触，其中GPCR具有R⁰形式，以及(d)测量该化合物对于GPCR的R⁰形式的亲和力，其中以下化合物被鉴定为GPCR的长效激动剂，所述化合物(i)具有的对于GPCR的RG形式的亲和力是对GPCR的内源性激动剂的亲和力的至少1％(例如，5％、10％、25％、30％、50％、60％、75％、90％、100％、125％、150％、200％、150％、300％、400％、500％、750％、或1000％)，以及(ii)与内源性激动剂相比，对于GPCR的R⁰形式具有更大的亲和力(例如，1％、5％、10％、25％、50％、100％、200％、500％、1000％、2000％、5000％、或10,000％)。该方法可以进一步包括以下步骤(e)将候选化合物给予动物，以及(f)测量动物对所述化合物的至少一种生理反应。受体可以是人类受体。GPCR可以是促胰液素家族受体(例如，PTH/PTHrP受体如人PTH/PTHrP受体)。当受体涉及钙稳态或转运时，测量步骤(b)或(f)可以通过测量细胞内或血钙水平来进行。对于任何GPCR，可以利用竞争性结合测定(结合分析)来进行亲和测量步骤(b)或步骤(d)。竞争性结合测定可以使用这样的配体，其对于GPCR的RG形式是特异性的或对于GPCR的R⁰形式是特异性的。可以利用延迟cAMP测定来进行测量步骤(b)(例如，如本文描述的)。可以利用非水解核苷酸类似物(例如，GTPγS)来富集GPCR的R⁰形式。可以利用显性负G蛋白来富集GPCR的RG形式。受体可以在细胞上或在膜中。候选化合物可以包括肽或可以来自化学库或天然产物库。

在另一个方面，本发明还涉及一种用于确定候选化合物是否是G蛋白偶联受体(GPCR)的短效激动剂的方法。该方法包括(a)使GPCR与该化合物接触，其中GPCR具有RG形式，(b)测量该化合物对GPCR的RG形式的亲和力，(c)使GPCR与该化合物接触，其中GPCR具有R⁰形式；以及(d)测量该化合物对GPCR的R⁰形式的亲和力，其中以下化合物被鉴定为GPCR的短效激动剂，所述化合物(i)具有的对于GPCR的RG形式的亲和力是对GPCR的内源性激动剂的亲和力的至少1％(例如，5％、10％、25％、30％、50％、60％、75％、90％、100％、125％、150％、200％、150％、300％、400％、500％、750％、或1000％)，以及(ii)与内源性激动剂相比，对于GPCR的R⁰形式具有更低亲和力(例如，99％、95％、90％、85％、75％、65％、55％、50％、40％、30％、25％、15％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、或0.0001％)。该受体可以是人类受体。该方法可以进一步包括以下步骤：(e)将候选化合物给予动物，以及(f)测量动物对该化合物的至少一种生理反应。GPCR可以是促胰液素家族受体(例如，PTH/PTHrP受体如人PTH/PTHrP受体)。当受体涉及钙稳态或转运时，可以通过测量细胞内钙水平来进行测量步骤(b)。对于任何GPCR，可以利用竞争性结合测定(例如，利用对于GPCR的RG形式是特异性的或对于其R⁰形式是特异性的配体)来进行测量步骤(b)或步骤(d)。可以利用延迟cAMP测定来进行测量步骤(b)。在某些实施方式中，可以利用非水解核苷酸类似物(例如，GTPγS)来富集GPCR的R⁰形式。可以利用显性负G蛋白来富集GPCR的RG形式。受体可以在细胞上或在膜中。候选化合物可以包括肽或可以来自化学库或天然产物库。

在另一个方面，本发明涉及一种对于PTH R⁰具有低亲和力(例如，以及对于RG具有高亲和力)的多肽。该多肽可以是短效激动剂或者可以是RG选择性性的。相对于野生型PTH或PTHrP序列，该多肽可以具有通过取代、缺失和/或添加一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个)氨基酸加以修饰的氨基酸序列。该多肽可以具有在位置5处的组氨酸或在位置20、23、24、或28处的丙氨酸。该多肽可以是Ala²³-PTH(1-34)、Ala²³-PTHrP(1-36)、His⁵-PTH(1-34)、His⁵-PTHrP(1-36)、或其片段。该多肽可以选自由在图26B的表中那些鉴定为RG选择性的任何多肽组成的组。该多肽可以被配制用于药物给予(例如，如本文中所描述的)或可以被纯化。

本发明还涉及一种用于在受治疗者中治疗骨质疏松症的方法，该方法包括以足以治疗骨质疏松症的量将前述方面的多肽、RG选择性多肽(例如，那些本文描述的多肽)、本文描述的作为长效激动剂的多肽、或本文描述的任何多肽、或其药用形式给予需要其的受治疗者。本发明还涉及一种用于在受治疗者中治疗骨折修复、骨软化、关节炎、血小板减少、甲状旁腺功能减退或高磷酸盐血症或增加干细胞转移(stem cell mobilization)的方法，该方法包括以足以治疗疾病或病症或增加干细胞转移的量将先前方面的多肽或本文描述的任何多肽、或其药用形式给予受治疗者。多肽或其药用形式可以皮下、静脉内、鼻内、经肺(transpulmonarily)、经皮、或口服给予。

在另一个方面，本发明涉及一种多肽(PTH类似物或PTH衍生物)，其结合PTH受体并且对于PTH受体R⁰形式具有高亲和力。相对于野生型PTH或PTHrP序列，该多肽可以具有通过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而修饰的氨基酸序列。该多肽还可以在位置19处具有精氨酸或在位置5处具有异亮氨酸。该多肽可以是Ala¹-Aib³[M]PTH(1-28)、Ala¹-Aib³[M]PTH(1-34)、或Ile⁵-PTHrP(1-36)。该多肽可以选自由图26B中的具有小于或等于2.9nM或7.9nM的IC₅₀的任何肽、以及I⁵-hPTHrP(1-36)(#1208)(基于图26B的数据)组成的组。该多肽可以被配制用于药物给予(例如，如本文描述的)或者可以被纯化。

本发明还涉及一种通过以足以治疗疾病或病症的量将先前方面的多肽、本文描述的R⁰选择性多肽、本文描述的作为长效激动剂的多肽、或本文描述的任何多肽、或其药用形式给予需要其的受治疗者而用于在该受治疗者中治疗选自由甲状旁腺功能减退、高磷酸盐血症、瘤样钙质沉着(瘤样钙化症，tumoral calcinosis)、以及骨质疏松症组成的组中的疾病或病症的方法。本发明还涉及一种用于治疗需要骨折修复，或患有骨软化、关节炎、血小板减少，或需要干细胞转移的受治疗者的方法受治疗者，所述方法包括以足以修复骨折、治疗疾病、或转移干细胞的量将先前方面的多肽或本文描述的任何多肽、或其药用形式给予所述受治疗者。该多肽或其药物组合物可以皮下、静脉内、鼻内、经肺、经皮、以及口服给予。

本发明还涉及一种PTH或PTHrP多肽，相对于野生型PTH或PTHrP序列，其具有通过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而修饰的氨基酸序列。该多肽可以具有在位置19处的精氨酸或在位置5处的异亮氨酸。该多肽可以选自由以下组成的组：

AVAEIQLMHQRGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAEI:M-PTH(1-11)/PTHrP(12-36)OH；

AVAEIQLMHQRAKWIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAEI:M-PTH(1-14)/PTHrP(15-36)OH；

AVAEIQLMHQRAKWLNSMRRRFFLHHLIAEIHTAEI:M-PTH(1-18)/PTHrP(19-36)OH；

SVSEHQLMHNLGKHIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAEI:[H⁵]-hPTH(1-14)/PTHrP(15-36)OH；

AVAEIQLMHQRAKWLNSMRRVEWLRKKLQDVHNF:[R¹⁹],M-hPTH(1-34)OH；

SVSEIQLMHNLGKHIQDLERRFFLHHLIAEIHTAEI:[E¹⁹]-hPTH(1-14)/PTHrP(15-36)OH；

AVAEIQLMHQRAKWIQDLERRFFLHHLIAEIHTAEI:[E¹⁹],M-hPTH(1-14)/PTHrP(15-36)OH；以及

AVAEIQLMHQRAKWLNSMERVEWLRKKLQDVHNF:[E¹⁹],M-hPTH(1-34)OH。该多肽可以具有在位置5处的组氨酸。该多肽可以由以下化学式之一来表示：Ala¹,Aib³[M]PTH(1-28)、Ala²³PTH、以及Ile⁵-PTHrP。该多肽可以选自由下述组成的组：

AVAEHQLMHQRAKWLNSMERVEWLRKKLQDVHNF:[H⁵,E¹⁹],M-PTH(1-34)；

AVAEHQLMHQRAKWIQDLERRFFLHHLIAEIHTAEI:[H⁵,E¹⁹],M-hPTH(1-14)/PTHrP(15-36)；

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEFLHHLIAEIHTAEI:hPTH(1-22)/PTHrP(23-36)；

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDIHTAEI:PTH(1-30)/PTHrP(31-36)；

AVAEIQLMHQRAKWLNSMERVEALRKKLQDVHNF:[A²³,E¹⁹],M-PTH(1-34)；以及

AVAEIQLMHQRAKWLNSMRRVEALRKKLQDVHNF[A²³],M-PTH(1-34)。该多肽可以用于任何治疗方法或任何组合物(例如，本文描述的药物组合物)中。

在另一个方面，本发明涉及一种这样的多肽，其中所述多肽包括具有以下化学式的氨基酸序列或包括基本上相同于由以下化学式限定的氨基酸序列的氨基酸序列：

X1-Val-X2-Glu-His-Gln-Lys-Met-His-X3-X4-X5-X6-X7，

其中：

X1是Ser、Ala、Gly、或α-螺旋稳定残基(稳定化残基，stabilizingresidue)(例如，Aib)；

X2是Ser、Ala、或α-螺旋稳定残基(例如，Aib)；

X3是Asn、Ala、Glu、Val、Asp、或Gln；

X4是Val、Ala、Trp、Ile、Met、Lys、Arg、Leu、或Har；

X5是Gly、His、Arg、Ala、或α-螺旋稳定残基(例如，Aib)；

X6是Lys、Gln、Leu、His、Trp、Ala、Arg、或α-螺旋稳定残基(例如，Aib)；以及

X7是Arg、Leu、Phe、Trp、His、或α-螺旋稳定残基(例如，Aib)；

或其包含氨基酸1-10、1-11、1-12、或1-13的片段，或其药用盐。α-螺旋稳定残基可以是，例如，非编码氨基酸如(2-氨基异丁酸)、ACPC(1-氨基环丙基羧酸)、DEG(二乙基甘氨酸)、或1-氨基环戊烷羧酸。在一些实施方式中，相对于对应的野生型PTH序列，氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、或8个取代。在一些实施方式中，多肽包括在X1处的Ala、Gly、或α-螺旋稳定残基(例如，Aib)；在X2处的Ala或α-螺旋稳定残基(例如，Aib)；在X3处的Ala、Glu、Val、Asp、或Gln；在X4处的Val、Ala、Trp、Ile、Met、Lys、Arg、或Har；在X5处的His、Arg、Ala、或α-螺旋稳定残基(例如，Aib)；在X6处的Gln、Leu、His、Trp、Ala、Arg、或α-螺旋稳定残基(例如，Aib)；在X7处的Arg、Leu、Phe、Trp、或α-螺旋稳定残基(例如，Aib)；或其组合。在任何这些实施方式中，该多肽可以具有长度少于100、50、36、34、30、25、或20(例如，10-14个氨基酸)的氨基酸序列。在一些实施方式中，该多肽的长度为21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、或10个氨基酸。该多肽可以是包括药用载体的组合物的一部分。

在另一个方面，本发明涉及一种这样的多肽，其包括以下化学式的氨基酸序列或包括基本上相同于由以下化学式限定的氨基酸序列的氨基酸序列：

X1-Val-X2-Glu-X3-Gln-Leu-Met-His-X4-X5-X6-X7-X8-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-X9-Val-Glu-X10-X11-Arg-Lys-Lys-X12，

其中：

X1是Ser、Ala、或α-螺旋稳定残基(例如，Aib)；

X2是Ser、Ala、或α-螺旋稳定残基(例如，Aib)；

X3是Ile或His；

X4是Asn、Glu、Val、Asp、或Gln；

X5是Val、Ala、Trp、Ile、Met、Lys、Arg、Leu、或Har；

X6是Gly、His、Arg、或Ala；

X7是Lys、Gln、Leu、His、Trp、Ala或Arg；

X8是Arg、Leu、Phe、Trp、His、或Ser；

X9是Arg或Ala；

X10是Trp、Ala或Phe；

X11是Leu或Ala；以及

X12是Leu或Ala；

并且其中氨基酸序列包括选自由位置X3处的His、位置X9处的Ala、位置X10处的Ala、位置X11处的Ala、以及位置X12处的Ala组成的组中的氨基酸中的至少一种；包括所述氨基酸序列的氨基酸1-24、1-25、1-26、或1-27的片段，或其药用盐。该多肽可以以低亲和力结合于PTH受体的R⁰形式(例如，以高亲和力结合于PTH受体的RG形式)。该多肽可以是RG选择性的或可以是受体的短效激动剂。相对于对应的野生型序列，该多肽可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个取代。在一些实施方式中，该多肽包括在X1处的Ala或α-螺旋稳定残基(例如，Aib)；在X2处的Ala或α-螺旋稳定残基(例如，Aib)；在X3处的His；在X4处的Glu、Val、Asp、或Gln；在X5处的Val、Ala、Trp、Ile、Met、Lys、Arg、或Har；在X6处的His、Arg、或Ala；在X7处的Gln、Leu、His、Trp、Ala、或Arg；在X8处的Arg、Leu、Phe、Trp、或Ser；在X9处的Ala；在X10处的Ala或Phe；在X11处的Ala；在处X12的Ala；或其组合。该多肽的长度可以少于100、75、60、50、40、36、34、33、32、31、30、29、或28个氨基酸。该多肽的长度可以是24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个氨基酸(例如，长度为24-28个氨基酸)。在一些实施方式中，X9、X10、X11、或X12中的至少一个(例如，2、3、或4个)是丙氨酸。

在另一个方面，本发明涉及一种这样的多肽，其包括以下化学式的氨基酸序列，或基本上相同于由以下化学式限定的氨基酸序列：

X1-Val-X2-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-X3-X4-X5-X6-X7-Leu-Asn-Ser-Met-Arg-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu，

其中：

X1是Ser、Ala、或Aib；

X2是Ser、Ala、或Aib；

X3是Asn、Glu、Val、Asp、或Gln；

X4是Val、Ala、Trp、Ile、Met、Lys、Arg、或Leu；

X5是Gly、His、Arg、或Ala；

X6是Lys、Gln、Leu、His、Trp、Ala、或Arg；以及

X7是Arg、Leu、Phe、Trp、His、或Ser，

或其包含所述氨基酸序列的氨基酸1-24、1-25、1-26、或1-27的片段，或其药用盐。该多肽可以是R⁰选择性的或可以是长效PTH激动剂。上述氨基酸序列可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个取代(例如，相对于野生型PTH序列，在上述任何位置)。在一些实施方式中，该多肽包括在X1处的Ala或Aib；在X2处的Ala或Aib；在X3处的Glu、Val、Asp、或Gln；在X4处的Val、Ala、Trp、Ile、Met、Lys、或Arg；在X5处的His、Arg、或Ala；在X6处的Gln、Leu、His、Trp、Ala、或Arg；在X7处的Arg、Leu、Phe、Trp、或Ser；或它们的组合。该多肽的长度可以少于100、75、60、50、40、36、34、33、32、31、30、29、或28个氨基酸。该多肽的长度可以是24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个氨基酸(例如，长度为24-28个氨基酸)。该多肽可以是在具有药用载体的组合物中。

在另一个方面，本发明涉及一种这样的多肽，其包括具有下式的氨基酸序列或基本上相同于由该式限定的多肽的氨基酸序列：

Ala-Val-Ser-Glu-His-Glu-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-X1-Arg-Arg-Arg-X2-Phe-Leu-X3-X4-Leu-Ile-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Glu-Ile

其中：

X1是Leu、Ala、Ser、Met、Phe、或Glu；

X2是Phe、Ala、Ser、Leu、Asn、Trp、Glu、或Lys；

X3是His、Leu、Arg、Lys、Trp、Ile、或Phe；

X4是His、Ala、Ser、Asn、Lys、或Arg；

X5是Ala、Gly、Ser、Asn、Gln、Trp、Glu、或Lys；

X6是Glu、Gly、Ser、Leu、Asn、Asp、Lys、或Ala；

X7是Ile、Leu、Val、Lys、或Ala；

X8是His或Ala；

X9是Thr、Asn、或Ala；以及

X10是Ala或Phe，

或其包含所述氨基酸序列的氨基酸1-24、1-25、1-26、1-27、1-28、1-29、1-30、1-31、1-32、1-33、1-34、或1-35的片段，并且其中所述多肽包括至少一个氨基酸取代(与对应的野生型PTHrP序列或其片段相比)；或其药用盐。该多肽可以以低亲和力结合于PTH受体的R⁰形式(例如，以高亲和力结合于PTH受体的RG形式)。该多肽可以是RG选择性的或可以是PTH受体的短效激动剂。相对于对应的野生型PTHrP序列，该多肽可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个取代。在一些实施方式中，该多肽具有在X1处的Ala、Ser、Met、Phe、或Glu；在X2处的Ala、Ser、Leu、Asn、Trp、Glu、或Lys；在X3处的Leu、Arg、Lys、Trp、Ile、或Phe；在X4处的Ala、Ser、Asn、Lys、或Arg；在X5处的Gly、Ser、Asn、Gln、Trp、Glu、或Lys；在X6处的Gly、Ser、Leu、Asn、Asp、Lys、或Ala；在X7处的Leu、Val、Lys、或Ala；在X8处的Ala；在X9处的Asn或Ala；在X10处的Phe；或它们的组合。在特定实施方式中，该多肽具有在X1处的Ala或Glu、在X2处的Ala、在X3处的Leu、在X4处的Lys、或它们的组合。该多肽的长度可以少于100、75、60、50、40、36、34、33、32、31、30、29、或28个氨基酸。该多肽的长度可以是24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个氨基酸(例如，长度为28-36个氨基酸)。该多肽可以具有自由羟基或在其C端被酰胺化。该多肽可以包括选自表1的氨基酸序列，或基本上相同于这样的序列的序列。该多肽可以在具有药用载体的组合物中。

表1

在另一个方面，本发明涉及一种PTH或PTHrP多肽(例如，任何上述方面或本文描述的多肽)，其中N端被庞大的(bulky)残基(例如，Trp)取代。这样的多肽包括Trp¹-PTH(1-34)、Trp¹-M-PTH(1-34)、以及TRP¹-PTHrP(1-36)、或它们的片段，其包含所述序列的氨基酸1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19、1-20、1-21、1-22、1-23、1-24、1-25、1-26、1-27、1-28、1-29、1-30、1-31、1-32、1-33、1-34、或1-35。与缺少庞大的残基取代的多肽相比，该多肽在PTH受体处可以具有减少的(例如，至少1％、5％、10％、25％、50％、75％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％、99.95％、或99.99％)PLC信号活性。其它庞大的残基包括Phe、Tyr、以及对苯甲酰基苯丙氨酸(Bpa)。在一些实施方式中，该多肽包括在M或Mc修饰中陈述的任何一个(例如，2、3、4、5、6、或7个)突变，其中M表示[Ala^1,12,Aib³,Gln¹⁰,高精氨酸¹¹,Trp¹⁴,Arg¹⁹]，而Mc表示Ala^1,3,12,Gln¹⁰,Arg¹¹,Trp¹⁴,Arg¹⁹PTH序列、或它们的任何组合。杂合肽可以进一步包括在位置5处的取代(例如，在位置5处的组氨酸)。示例性的多肽包括Trp¹-PTH(1-28)和Trp¹-M-PTH(1-28)。

在本发明的另一个方面中，本发明涉及一种包括杂合PTH/PTHrP多肽的多肽，或一种包括基本上相同于杂合PTH/PTHrP多肽的氨基酸序列的多肽。该多肽可以由式PTH(1-X)/PTHrP(Y-36)来表示，其中X是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、或34并且Y＝X+1。在一些实施方式中，杂合多肽包含在M或Mc修饰中陈述的任何一个(例如，2、3、4、5、6、或7个)突变，其中M表示[Ala^1,12,Aib³,Gln¹⁰,高精氨酸¹¹,Trp¹⁴,Arg¹⁹]，而Mc表示Ala^1,3,12,Gln¹⁰,Arg¹¹,Trp¹⁴,Arg¹⁹PTH序列、或它们的任何组合。杂合肽可以进一步包括在位置5处的取代(例如，在位置5处的组氨酸)。

在上面描述的任何多肽中，该多肽可以是生物活性的，例如，具有的对于GPCR的RG形式的亲和力是对GPCR的内源性激动剂的亲和力的至少1％(例如，5％、10％、25％、30％、50％、60％、75％、90％、100％、125％、150％、200％、150％、300％、400％、500％、750％、或1000％)，并且与对照(例如，GPCR的内源性配体)相比，对R⁰形式具有更低的亲和力(例如，99％、95％、90％、85％、75％、65％、55％、50％、40％、30％、25％、15％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、或0.0001％)。在其它实施方式中，该多肽具有的对于GPCR的RG形式的亲和力是对GPCR的内源性激动剂的亲和力的至少1％(例如，5％、10％、25％、30％、50％、60％、75％、90％、100％、125％、150％、200％、150％、300％、400％、500％、750％、或1000％)，以及(ii)与内源性激动剂相比，对于GPCR的R⁰形式具有更大的亲和力(例如，1％、5％、10％、25％、50％、100％、200％、500％、1000％、2000％、5000％、或10,000％)，或被鉴定为GPCR的长效激动剂。在上述方面，该多肽可以是RG选择性的、R⁰选择性的、短效激动剂、或长效激动剂。在一些实施方式中，该多肽可以被修饰(例如，在N端被乙酰化、在C端被酰胺化、或包含本文描述的任何修饰)。

本发明还涉及一种核酸，其包括编码本文描述的多肽(例如，上述那些多肽)的序列。该核酸可以操作性地连接于启动子和/或载体的一部分。本发明还涉及一种包括载体的细胞(例如，原核细胞如细菌细胞或真核细胞如酵母或哺乳动物细胞，例如，人细胞)。本发明还涉及一种通过在诱导所述核酸表达的条件下生长上述细胞以及可选地纯化多肽来制备多肽的方法。

“GPCR”是指包括G蛋白偶联受体的任何多肽或其功能片段。期望地，GPCR与天然存在的GPCR具有至少70％、80％、90％、95％、99％、或100％的序列同一性。本文描述了示例性的GPCR。

GPCR的“RG形式”是指G蛋白-结合的受体构象。例如，可以通过GPCR的增加的G蛋白结合来诱导GPCR的RG形式。在本发明的测定中，当测量对于RG形式的亲和力时，至少1％、5％、10％、25％、50％、75％、90％、95％、或99％的受体具有RG形式。

GPCR的“R⁰形式”是指当GPCR未结合于G蛋白但能够结合受体的至少一些配体时所发生的受体构象。可以例如通过防止或减少G蛋白结合于GPCR来促进GPCR的R⁰形式(相对于RG)。在本发明的测定中，当测量对于R⁰形式的亲和力时，至少0.1％、1％、5％、10％、25％、50％、75％、90％、95％、或99％的受体可以具有R⁰形式。

“亲和力”是指化合物与目标受体(靶受体，target receptor)相互作用的能力。在本发明的测定和多肽中，可以通过结合(例如，竞争性结合测定或FRET)来直接测量亲和力，或通过活性测定(例如，cAMP信号或细胞内钙的变化)来间接测量亲和力。期望地，化合物对于受体具有至少10μmol、1μmol、500nmol、100nmol、50nmol、25nmol、10nmol、5nmol、1nmol、500pmol、200pmol、100pmol、50pmol、25pmol、0pmol、或1pmol的亲和力，如通过GPCR的RG形式或R⁰形式的EC₅₀所测得的。

“长效激动剂”是指这样的激动剂，与相同受体的内源性激动剂相比，其活性(例如，体内或体外测得的)具有至少5％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、500％、1000％、或5000％更长的半衰期。

“短效激动剂”是指这样的激动剂，与相同受体的内源性激动剂相比，其活性(例如，利用本文描述的测定体内或体外测得的)的半衰期小于95％、90％、75％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、或1％。

“RG选择性激动剂”是这样的激动剂，与对照激动剂(例如，内源性激动剂)相比，其呈现出与受体的RG形式的增加的结合(相对于受体的R⁰形式)。受体选择性可以表示为每种受体形式之间的结合常数的比率，例如，R⁰/RG比，其中该比率的增加表明更强地结合于RG形式。如图26A和图26B所示，PTH(1-34)的R⁰/RG比是67，并且在结合表达在COS-7细胞膜上的人PTH受体中相对更多的RG选择性PTHrP(1-36)是260。在该系统中，RG选择性激动剂可以具有至少100、150、200、250、300、400、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000、15,000、20,000、或50,000的R⁰/RG比。R⁰/RG比可以是对照激动剂的R⁰/RG比的至少1.5、2、3、4、5、10、15、25、50、75、或100倍。

“R⁰选择性激动剂”是这样的激动剂，与对照激动剂(例如，内源性激动剂)相比，其呈现出与受体的RG形式的减少的结合(相对于受体的R⁰形式)。受体选择性可以表示为每种受体形式之间的结合常数的比率，例如，R⁰/RG比，其中该比率的降低表明更强地结合于R⁰形式。如图26A和图26B所示，PTH(1-34)的R⁰/RG比是67，并且在结合表达在COS-7细胞膜上的人PTH受体中相对更多RG选择性PTHrP(1-36)是260。在该系统中，R⁰选择性激动剂可以具有小于60、50、40、30、25、20、25、10、5、2、1、0的R⁰/RG比。因此R⁰/RG比可以小于对照激动剂的R⁰/RG比的0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.08、0.05、0.03、0.01、0.008、0.005、0.003、或0.001倍。

GPCR的“内源性激动剂”是指由生物产生的化合物、或所述化合物的合成拟表型(synthetic phenocopy)，即具有与内源性激动剂相同的药理活性的化合物。例如，天然PTH肽是1-84，而PTHrP是约1-140个氨基酸；这些配体的拟表型(phenocopies)分别包括PTH(1-34)和PTHrP(1-36)。内源性激动剂涉及或调节GPCR的正常生理活性。某些GPCR具有多种内源性激动剂(例如，用于PTHR的内源性激动剂包括PTH和PTHrP)；对本发明来说，任何内源性激动剂可以用来确定候选化合物是短效或长效的。

“肽”或“多肽”是指至少4、6、10、25、50、100、150、200、500、或1000个氨基酸的氨基酸链。

多肽的“片段”是指长度至少为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、或35个氨基酸的序列的一部分。

“受治疗者”是指人或非人动物(例如，哺乳动物)。

“足以治疗的量”是指足以减少、预防、或消除与疾病或病症有关的至少一种症状的量。

“纯化的多肽”或“分离的多肽”是指已分离自其它成分(components)的多肽。通常，当多肽按重量计为至少30％，没有其它成分时，则多肽基本上是纯的。在一些实施方式中，所述多肽按重量计是至少50％、60％、75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％，没有其它其它成分。可以例如通过提取自天然来源；通过表达编码这样的多肽的重组多核苷酸；或通过化学合成所述多肽来获得纯化的多肽。可以通过任何适当的方法，例如，柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、或通过HPLC分析来测量纯度。

“生物活性”是指，在给予细胞或动物(例如，人或非人哺乳动物)以后，化合物或组合物(例如，本文描述的多肽)具有至少一种生物显著效应。PTH、PTHrP、以及其类似物的生物活性(例如，本文描述的那些)包括受体结合，cAMP或IP₃生产，蛋白激酶A、蛋白激酶C、磷脂酶C、磷脂酶D、以及磷脂酶A₂的激活，细胞内、血浆、或尿钙或磷酸盐水平的变化(例如，增加或减少)，以及体内或体外骨代谢或分解代谢的变化。与适当的对照(例如，野生型肽或其拟表型如PTH(1-34)或PTHrP(1-36))相比，本发明的生物活性肽(例如，本文描述的任何肽)，例如，可以呈现任何生物活性的增加(例如，至少5％、10％、25％、50％、100％、500％、1000％、10,000％)或任何生物活性的减少(例如，95％、90％、75％、50％、25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％、或0.001％)。

“基本相同的”是指这样的核酸或氨基酸序列，当例如利用以下描述的方法进行最优化序列对比时，其与第二核酸或氨基酸序列，例如，PTH或PTHrP序列或其片段，共享至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。“显著同一性(substantial identity)”可以用来指不同类型和长度的序列，如全长序列、表位或免疫原性肽、功能域、编码和/或调节序列、外显子、内含子、启动子、以及基因组序列。两个多肽或核酸序列之间的百分比同一性可以以本领域技术人员已知的各种方式来确定，例如，利用可公开获得的计算机软件如SmithWaterman Alignment(Smith et al.,J.Mol.Biol.147:195-7(1981))；“Best Fit”(Smith and Waterman,Advances in Applied Mathematics,482-489(1981))如结合到GeneMatcher Plus^TM,Schwarz and Dayhof(1979)Atlas of Protein Sequence and Structure,Dayhof,M.O.,Ed pp353-358；BLAST程序(Basic Local Alignment Search Tool；(Altschulet al.,J.Mol.Biol.215:403-10(1990)),BLAST-2,BLAST-P,BLAST-N,BLAST-X,WU-BLAST-2,ALIGN,ALIGN-2,CLUSTAL，或Megalign(DNASTAR)软件。此外，本领域技术人员可以确定用于测量序列对比的适当的参数，包括在待比较序列的长度上获得最大序列对比所需要的任何算法。通常，对于蛋白质，比较序列的长度将是至少6或8个氨基酸，优选9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、350、400、或500个氨基酸，或多达蛋白质的整个长度。对于核酸，比较序列的长度将通常是至少18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、125、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200、或至少1500个核苷酸或多达核酸分子的整个长度。应当明了，当比较DNA序列与RNA序列时，对于确定序列同一性来说，胸腺嘧啶核苷酸等效于尿嘧啶核苷酸。保守取代通常包括以下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。

“庞大的氨基酸”是指分子量大于100Da(例如，大于125、150、175、200、225、250、300、或400)的任何氨基酸。每种编码氨基酸的分子量如下。Ala：71.09，Arg：156.19，Asp：115.09，Asn：114.11，Cys：103.15，Glu：129.12，Gln：128.14，Gly：57.05，His：137.14，Ile：113.16，Leu：113.16，Lys：128.17，Met：131.19，Phe：147.18，Pro：97.12，Ser：87.08，Thr：101.11，Trp：186.12，Tyr：163.18，以及Val：99.14。

根据以下详细描述、附图、以及权利要求，本发明的其它特点和优点将是显而易见的。

附图说明

图1A-1C是示出了PTH和PTHrP类似物与人PTH受体(PTHR)的解离以及GTPγS的影响的图。将放射性配体¹²⁵I-[Nle^8,21,Tyr³⁴]rPTH(1-34)NH₂(图1A)、¹²⁵I-[Tyr³⁶]PTHrP(1-36)NH₂(图1B)以及¹²⁵I-[Ile⁵,Tyr³⁶]PTHrP(1-36)NH₂(图1C)预结合于在由HKRK-B7细胞制备的膜中的人PTHR90分钟；然后开始解离(t＝0)，其中通过添加过量的未标记类似物(5×10^-7M)，单独添加(实心圆)或连同GTPγS一起添加(5×10^-5M，空心圆(开圆))。在每个时间点，从反应管移走等分部分(aliquots)并立即利用96孔真空过滤板进行快速真空过滤以分离结合放射性与自由放射性。在预温育和解离阶段均在包含未标记配体(5×10^-7M)的管中确定非特异性结合。然后将在每个时间点的特异性结合的放射性(SB)表示为在t＝0时观测到的特异性结合的百分比。示出了来自四个(图1A)、五个(图1B)、或三个(图1C)实验的综合数据(aggregate data)。利用两相(图1A和图1B)或单相(图1C)指数衰减方程将曲线拟合于数据。

图2A和2B是示出了结合于人和大鼠PTHR的PTH和PTHrP类似物的GTPγS敏感性的图。在没有或存在不同浓度的GTPγS的情况下并在近平衡条件下，评估了结合于由HKRK-B7细胞(图2A)或ROS17/2.8细胞(图2B)制备的膜中的PTHR的放射性配体类似物。数据表示为在没有GTPγS存在的情况下的放射性特异性结合的(SB)的百分比。图2A中的数据是来自三个(PTH(1-34))或五个(PTHrP(1-36)类似物)实验的平均值(+s.e.m.)，而图2B中的数据来自六个实验，每个实验重复进行两次。研究的放射性配体是¹²⁵I-[Nle^8,21,Tyr³⁴]PTH(1-34)NH₂；[Tyr³⁶]PTHrP(1-36)NH₂；[Ile⁵,Tyr³⁶]PTHrP(1-36)NH₂以及[Aib^1,3,Nle⁸,Gln¹⁰,Har¹¹,Ala¹²,Trp¹⁴,Tyr¹⁵]hPTH(l-15)NH₂。

图3A-3D是示出了PTH和PTHrP类似物与hPTHR的G蛋白偶联和G蛋白未偶联构象的结合的图。通过竞争方法，利用由瞬时转染的COS-7细胞制备的膜评估了未标记PTH和PTHrP类似物与G蛋白偶联PTHR构象(RG)和G蛋白未偶联PTHR构象(R⁰)的结合。为了评估与RG的结合，用hPTHR和负显性Gαs亚单位(Gα^ND)共转染细胞；并且使用¹²⁵I-[Aib^1,3,M]PTH(1-15)NH₂作为示踪放射性配体。为了评估与R⁰的结合，仅用hPTHR来转染细胞，使用¹²⁵I-[Nle^8,21,Tyr³⁴]rPTH(1-34)NH₂作为示踪放射性配体，并且在有GTPγS存在的情况下进行结合反应。使用的未标记配体是[Nle^8,21,Tyr³⁴]rPTH(1-34)NH₂(图3A)；[Tyr³⁶]hPTHrP(1-36)NH₂(图3B)；[His⁵,Nle^8,21,Tyr³⁴]rPTH(1-34)NH₂(图3C)；以及[Ile⁵,Tyr³⁶]hPTHrP(1-36)NH₂(图3D)。尽管每种配体以相对较高亲和力结合于RG，但与PTH(1-34)和Ile⁵-PTHrP(1-36)相比，PTHrP(1-36)以及His⁵-PTH(1-34)以显著更低的亲和力结合于R⁰，因而呈现更强的RG选择性。数据是三至七个实验的平均值(+s.e.m.)，每个实验一式两份进行(还参见表5)。

图4A-4D是示出了在HEK-293细胞中结合于PTHR的配体的荧光共振能量转移(FRET)分析的曲线图。用PTHR构建物(PTHR-cam)(其包含在第三胞内环中的青色荧光蛋白(CFP)和在羧基末端尾部中的黄色荧光蛋白(YFP))稳定转染的HEK-293细胞用来评估配体结合于、以及解离自PTHR的动力学。借助于PTHR-cam，用紫外光(λ_exc＝436nm)激发CFP会产生分子内FRET至YFP，其可以观测为来自YFP(λ_emm＝535nm)的光发射的增加以及来自CFP(λ_emm＝480nm)的光发射的减少。这种FRET信号发生在基态受体中并在激动剂结合以后减少。在每个图中，迹线(trace)示出了在浇盖(倾注，superfused)有单独的缓冲液或包含PTH肽配体的缓冲液的细胞中随时间获得的荧光信号(F_YFP(535)/F_CFP(480)，针对通道溢出加以归一化)的比率(肽加入的时间由每个迹线上方的黑条表示)。使用的配体是hPTH(1-34)(图4A)；[Aib^1,3,Gln¹⁰,Har¹¹,Ala¹²,Trp¹⁴]rPTH(1-14)NH₂(图4B)；[Tyr³⁶]hPTHrP(1-36)NH₂(图4C)；以及[Ile⁵,Tyr³⁶]hPTHrP(I-36)NH₂(图4D)。由PTHrP(1-36)诱导的FRET信号的发生慢于由三种其它类似物诱导的FRET信号的发生。由PTH(1-14)和PTHrP(1-36)类似物诱导的信号在除去配体以后会衰减，而那些由PTH(1-34)和Ile⁵-PTHrP(1-36)类似物诱导的信号仍然是稳定的。数据来自单个实验，并且在至少三个其它实验中获得相同的结果。

图5A和图5B是示出了在稳定表达人PTHR的细胞中由PTH和PTHrP类似物诱导的cAMP信号反应的持续时间的曲线图。通过时间过程实验(time course experiments)评估了在HKRK-B7细胞中由PTHrP(1-36)或Ile⁵-PTHrP(1-36)(950,000hPTHR/细胞)诱导的cAMP反应的持续时间(图5A)。用单独的缓冲液(基底(basal))或包含配体(100nM)的缓冲液预处理细胞10分钟；在t＝0时，洗涤细胞，在缓冲液中温育指定时间(洗出期(wash-out phase))，用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)处理5分钟，然后评估细胞内cAMP。通过同时用肽和IBMX温育细胞并省略洗出期所评估的对于每种肽的最大响应对于PTHrP(1-36)和Ile⁵-PTHrP(1-36)分别是185116和198118pmol/孔。在没有配体存在的情况下，在用IBMX处理的细胞中cAMP水平是2.0±0.3pmol/孔。数据是三个实验的平均值(±s.e.m.)，每个实验一式两份进行。在这些实验中，还分析了PTH(1-34)并在每个时间点诱导反应，其不是不同于那些由PTHrP(1-36)诱导的反应。在单个时间点，在配体洗出后60分钟，在HKRK-B64细胞中(90,000hPTHR/细胞)类似地评估类似物(图5B)。对于每种肽，数据表示为在同时用所述配体和IBMX处理10分钟并省略洗出期的细胞中产生的最大cAMP反应的百分比(表示在侧图中)。数据是4个实验的平均值(±s.e.m)，每个实验一式三份进行。星号表示成对反应的统计分析：PTHrP(1-36)与Ile⁵-PTHrP(1-36)(图5A)，或通过括号表示(图5B)：*,P≤0.05；**,P≤0.003。

图6A-6D是示出了PTH和PTHrP类似物与hPTHR的G蛋白偶联和G蛋白未偶联构象的结合的曲线图。如上面针对图3A-3D所描述的，进行结合反应。使用的未标记配体是hPTH(1-34)NH₂(图6A)；[Aib^1,3,Nle⁸,Gln¹⁰,Har¹¹,Ala¹²,Trp¹⁴,Tyr¹⁵]rPTH(1-15)NH₂(图6B)；[His⁵]hPTH(1-34)NH₂(图6C)；hPTHrP(1-36)NH₂(图6D)。数据是3或5个实验的平均值(±s.e.m.)，每个实验一式两份进行(表6)。

图7A和图7B示出了类似物信号效力的剂量反应分析。在HKRK-B64细胞中评估了PTH和PTHrP配体刺激cAMP形成的能力(图7A)。在有IBMX存在的情况下，在室温下，用不同浓度的配体处理细胞30分钟。在用hPTHR瞬时转染的COS-7细胞中评估了配体刺激肌醇磷酸(IP)生产的能力(图7B)。在室温下，用不同浓度的配体处理细胞30分钟。使用的配体是[Nle^8,21,Tyr³⁴]rPTH(1-34)NH₂；[His⁵,Nle^8,21,Tyr³⁴]rPTH(1-34)NH₂；[Tyr³⁶]hPTHrP(1-36)NH₂以及[Ile⁵,Tyr³⁶]hPTHrP(1-36)NH₂。数据是4个(图7A)或5个(图7B)实验的平均值(±s.e.m.)，每个实验一式两份进行。EC₅₀和Emax值列在表6中并且在肽之间不是显著不同的，除H⁵-PTH(1-34)和PTH(1-34)类似物的cAMP EC₅₀值之外(P＝0.02)。

图8是示出了在大鼠细胞中的cAMP剂量反应的曲线图。用hPTH(1-28)NH₂；Ala^1,12,Aib³,Gln¹⁰,Har¹¹,Trp¹⁴,Arg¹⁹-hPTH(1-28)NH₂；hPTH(1-34)NH₂；或r(大鼠)PTH(1-34)NH₂处理大鼠成骨细胞。通过放射免疫测定来量化所得到的细胞内cAMP。EC50值列在图下方。通过非线性回归分析来获得曲线拟合。

图9A-9D是示出了在用PTH类似物处理的小鼠中的体内血浆cAMP水平的图。以10至1,000nmol肽/kg体重的剂量水平对野生型小鼠皮下注射载体(0.9％NaCl/0.05％吐温-20)、或包含PTH肽的载体，并在注射后的指定时间，从尾静脉抽出血液，然后通过放射免疫测定来量化在所得的血浆中cAMP的量。每条曲线对应于限定浓度的肽，如图例所指明的。以pmol/μl血浆对血浆cAMP浓度作图。数据表明，在50nmol/kg下，Ala^1,12,Aib³,Gln¹⁰,Har¹¹,Trp¹⁴,Arg¹⁹-hPTH(1-28)NH₂(Aib-50,图9A)和hPTH(1-34)NH₂((1-34)-50,图9B)可以产生血浆cAMP浓度的可比较的增加，而1,000nmol/kg的hPTH(1-28)NH₂需要达到相同的增加((1-28)-1000，图9C，以及图9D)。

图10A和图10B是示出了在用PTH类似物处理的小鼠中的体内血浆磷酸盐和血清离子化钙水平的曲线图。对野生型小鼠皮下注射载体(0.9％NaCl/0.05％吐温-20)、或包含Ala^1,12,Aib³,Gln¹⁰,Har¹¹,Trp¹⁴,Arg¹⁹-hPTH(1-28)NH₂或hPTH(1-34)NH₂的载体(剂量水平为50nmol/kg体重)，或hPTH(1-28)NH₂(剂量水平为1,000nmol/kg体重)，然后在指定的时间，确定血浆磷酸盐(图10A)和血清离子化钙(图10B)的浓度。利用Chiron Diagnostics Model634Ca⁺⁺/pH分析仪来确定血清离子化钙浓度。图A中的数据是一个实验的平均值(±s.e.m.)，其中对于每种注射条件使用6只小鼠(n＝6)；在三个其它实验中获得了类似结果。图B中的数据是两个实验的平均值(±s.e.m.)，对于每种注射条件，使用3只小鼠(n＝3)进行每个实验。

图11是示出了在负鼠(opossum)肾细胞中PTH(1-34)、PTHrP(1-36)以及长效PTH(1-28)类似物Ala^1,12,Aib³,Gln¹⁰,Har¹¹,Trp¹⁴,Arg¹⁹-hPTH(1-28)NH₂的磷酸盐摄取抑制的时间过程。对在每个时间点的数据作图，作为在细胞裂解液中³²P放射性的量的百分比，其中仅用载体处理细胞相同的时间；这些对照水平在5,864±338cpm(12h)至3,429±224cpm(0h)的范围内。数据是两个实验的平均值(±s.e.m.)，每个实验一式两份进行。

图12示出了在正常大鼠中PTHrP(1-36)和[I⁵]-PTHrP(1-36)的药物动力学分布(pharmacokinetic profile)。通过放射免疫测定(RIA)测量了肽的血浆浓度。在PTHrP(1-36)中的His⁵→Ile取代并没有显著改变药物动力学分布(pharmokinetic profile)。

图13A-13C是示出了在正常大鼠中PTHrP(1-36)和[I⁵]-PTHrP(1-36)的影响的一组图。图13A示出了在正常大鼠中PTHrP(1-36)和[I⁵]-PTHrP(1-36)的瞬时血钙作用(transient calcemicaction)。在PTHrP(1-36)中His⁵→Ile取代，其增加对于R⁰的亲和力9倍(参见插表(Table inset))，导致更长期的血钙效应(calcemiceffect)。图13B和图13C示出了在用每种这些配体治疗的细胞中延迟(60分钟；图13B)和最大(图13C)cAMP反应。

图14A-14C是示出了Mc-PTH(1-14)/PTHrP(15-36)(Mc＝Ala^1,3,12,Gln¹⁰,Arg¹¹,Trp¹⁴,Arg¹⁹)在TPTX大鼠中的长期血钙效应(图14A)以及在ROS17/2.8细胞中的长期cAMP信号(图14B和图14C)的图。图14B和14C示出了在用hPTH(1-34)或Mc-hPTH(1-14)/PTHrP(15-36)治疗的细胞中延迟(60分钟；图14B)和最大(图14C)cAMP反应。插表示出了体外测量的类似物对R⁰和RG受体构象的结合亲和力。

图15A和图15B是示出了在正常大鼠中修饰PTH/PTHrP杂交体的瞬时血钙作用的图。对于Mc-PTH(1-11)/PTHrP(15-36)和Mc-PTH(1-14)/PTHrP(15-36)观测到长期血钙效应。插表示出了体外测量的类似物对R⁰和RG受体构象的结合亲和力。

图16A-16C是示出了在正常大鼠中Mc-修饰PTH(1-34)类似物(具有或没有Ile⁵→His和Arg¹⁹→Glu取代)的血钙作用(图16A)以及在ROS17/2.8细胞中的延迟和最大cAMP反应(图16B和图16C)的图。插表示出了体外测量的类似物对R⁰和RG受体构象的结合亲和力。Ile⁵→His和Arg¹⁹→Glu取代减小了对于R⁰的亲和力，并且减少了体外cAMP信号的持续时间和体内血钙效应。

图17A-17C是示出了在正常大鼠中Mc-修饰PTH(1-34)/PTHrP(1-36)类似物(没有Ile⁵→His和Arg¹⁹→Glu取代)的瞬时血钙作用以及在ROS17/2.8细胞中的延迟cAMP和最大反应(图17B和图17C)的图。插表示出了体外测量的类似物对R⁰和RG受体构象的结合亲和力。Ile⁵→His和Arg¹⁹→Glu取代降低了对于R⁰的亲和力，并且减少了体外cAMP信号的持续时间和体内血钙效应。

图18A和18B是示出了在正常大鼠中(图18A)以及在ROS17/2.8细胞中(图18B)，E¹⁹,Mc-修饰PTH(1-34)类似物(具有或没有Trp²³→Ala取代)的血钙和cAMP作用的图。插表示出了体外测量的类似物对于R⁰和RG受体构象的结合亲和力。Trp²³→Ala取代降低了[E¹⁹,Mc]PTH(1-34)对R⁰的结合亲和力10倍，减少了细胞中cAMP信号的持续时间，并且减小了该肽的体内高血钙效应(hypercalcemic effect)。

图19A和图19B是示出了在表达人PTH1受体的细胞中天然PTH/PTHrP杂合类似物的cAMP信号的图。该类似物在急性剂量反应测定中显示出类似效力。

图20A和图20B是示出了具有人PTH1受体的Mc-修饰PTH/PTHrP杂合类似物的cAMP信号的图。该类似物在急性剂量反应测定中显示出类似效力。

图21A和图21B是示出了在ROS17/2.8细胞中hPTH(1-34)NH₂、hPTH(1-28)NH₂以及[A¹,Aib³,M]-PTH(1-28)NH₂([A^1,12,Aib³,Q¹⁰,高精氨酸¹¹,W¹⁴,R¹⁹]hPTH(1-28)NH₂)的急性(图21A)和延迟(图21B)cAMP分析的图。在图21A中，在有IBMX存在的情况下用肽温育细胞10分钟，并测量cAMP。EC₅₀值分别为0.32、7.6、以及0.33nM。在图21B中，用10^-7M的hPTH(1-34)、[A¹,Aib³,M]-PTH(1-28)、或10^-6M的hPTH(1-28)处理细胞10分钟，洗涤三次，在单独的缓冲液中温育指定时间，用IBMX处理最后5分钟，然后测量cAMP。图21B中的数据表示为对于每种配体观测到的最大响应的百分比，其是通过在有IBMX存在的情况下用配体温育细胞10分钟(没有配体洗出)而确定的。这些值分别为67±6、68±3、以及71±1pmol/孔。基底(载体)cAMP值是3.7±0.4pmol/孔。

图22A-22C是示出了利用用PTHR转染的COS-7细胞(图22A和图22C)，通过生物测定程序加以评估(用于读出活性)的注射到小鼠中的PTH配体的药代动力学分析(pharmacokinetic analysis)的图。用pCDNA1载体转染的COS-7细胞用作对照(图22B)。对小鼠注射载体、注射hPTH(1-34)(50nmol/kg)、hPTH(1-28)(1,000nmol/kg)、或[A¹,Aib³,M]-PTH(1-28)(50nmol/kg)，并在注射后的指定时间，从尾静脉收集血液，在有EDTA和蛋白酶抑制剂存在的情况下制备血浆，将血浆稀释50倍，然后将45μl的稀释样品施加于在96孔板中的COS细胞。然后，在15分钟温育以后，测量在COS细胞中的细胞内cAMP。每个迹线(tracing)表示来自6只相同处理小鼠的数据(平均值+SE)。

图23是示出了在小鼠中血液离子化钙的变化。示出的是在注射以后(连同图22A-22C的研究一起进行研究)用hPTH(1-34)(50nmol/kg)、hPTH(1-28)(1,000nmol/kg)、或[A¹,Aib³,M]-PTH(1-28)(50nmol/kg)治疗的小鼠中血液离子化钙(iCa⁺⁺)的变化。相对于注射前从每只小鼠抽出的血液中的iCa⁺⁺，对数据进行归一化。每条迹线示出了来自6只相同处理小鼠的数据(平均值+SE)。

图24A和图24B是示出了在用PTH配体长期处理以后在小鼠中骨形成和骨吸收标记的变化的图。示出的是在用hPTH(1-34)(50nmol/kg)、以及[A¹,Aib³,]M-PTH(1-28)(50nmol/kg)处理的小鼠中骨形成标记骨钙蛋白(图24A)和骨吸收标记、胶原I型C端片段(CTX)(图24B)的血清水平。利用Mouse Osteocalcin EIA试剂盒(Biomedical Technologies)和RatLaps CTX ELISA(NordicBioscience)试剂盒测量标记。每条迹线示出了来自6只相同处理小鼠的数据(平均值+SE)。

图25是示出了在HKRK-B7细胞中PTH/PTHrP杂合类似物对人PTH受体的cAMP信号效力的表格。

图26A是示出了PTH/PTHrP类似物与表达在COS-7细胞膜上的人PTH受体的R⁰和RG结合的竞争分析的表格。

图26B是示出了与图26A相同的通过R⁰结合值加以分类的数据的表格。

图27A-27D是示出了PTHrP(1-28)的丙氨酸扫描和类型取代的图。在肾小管LLCPK1-B64(图27A)和ROS17/2.8(图27B)细胞中，检查了在PTHrP(1-28)的15-28区中丙氨酸取代对cAMP活性的影响。在位置18、22、25以及26处的丙氨酸取代会增加在至少一种细胞类型中的活性。这些位置被进一步取代成各种类型的氨基酸，并在LLCPK1-B64细胞(图27C)或SaOS-2细胞(图27D)中分析cAMP活性。在室温下、在有IBMX存在的情况下用3×10^-9M的类似物处理细胞30分钟。相对于对亲代(天然)PTHrP(1-28)肽的反应，对于每种类似物的反应加以归一化。

图28A和图28B是示出了在PTHrP(1-28)脚手架中具有取代的肽的体外(图28A)和体内(图28B)cAMP活性。在SaOS细胞中代表性的修饰PTHrP(1-28)类似物的cAMP活性的剂量反应曲线示在(图28A)中。图28B示出了体内cAMP诱导，来自C57BL/6小鼠(3月龄，雄性)，其被静脉内注射有载体、PTHrP(1-36)、PTHrP(1-28)、A¹⁸,²²,L²⁵,K²⁶(AALK)-PTHrP(1-28)或E¹⁸,A²²,L²⁵,K²⁶(EALK)-PTHrP(1-28)(n＝3)。注射后10分钟，抽取血液，并通过RIA测量cAMP的血浆水平。

图29A和图29B是示出了在小鼠中R⁰和RG选择性PTH类似物对血浆cAMP和钙的影响的图。图29A和图29B示出了在小鼠(C57BL/6，雄性，3月龄)中的血浆cAMP浓度，其中上述小鼠被静脉内给予载体、rPTH(1-34)、M-PTH(1-34)(M＝A¹,Aib³,Q¹⁰,Har¹¹,A¹²,W¹⁴,R¹⁹)、或E¹⁸,A²²,L²⁵,K²⁶-(EALK)-PTHrP(1-30)(5nmol/kg；对于cAMP，n＝7，对于钙，n＝4)。图29B示出了在用相同肽处理的小鼠中的离子钙水平。在该钙实验中，在注射前以及在注射后的1、2、4以及6小时抽取血液，并利用Ca⁺⁺/pH分析仪测量离子化钙。

图30A-30F是示出了在小鼠中PTH类似物对血浆骨标记的影响的图。每日对小鼠(C57BL/6，雄性，3月龄)静脉内注射载体、rPTH(1-34)、M-PTH(1-34)、或(EALK)-PTHrP(1-30)(5nmol/kg；n＝7组)14天。在第6天(分别为图30A、图30C、以及图30E)和第13天(分别为图30B、图30D、以及图30F)，通过ELISA评估了血液中骨转换(bone turnover)(PINP、CTX以及骨钙蛋白)的标记。

图31是一组示出了在小鼠中两周每日R⁰和RG配体处理对小梁和皮质骨结构的影响的图像。每日用载体、rPTH(1-34)、M-PTH(1-34)、或E¹⁸,A²²,L²⁵,K²⁶(EALK)PTHrP(1-30)(5nmol/kg；n＝7组)处理(i.v.)小鼠(C57BL/6，雄性，3月龄)14天，并通过μCT对股骨进行分析。

图32A和图32B是示出了在MC3T3-E1细胞中在EALK-PTHrP(1-31)的29-31区(图32A)和EALK-PTHrP(1-34)的29-33区(图32B)中的氨基酸取代对cAMP活性的诱导的影响的图。

图33是示出了在TPTX大鼠中从时间零至24小时PTH(1-34)和M-PTH(1-14)/PTHrP(15-36)(SP-PTH)的血钙作用的图。

图34是示出了在TPTX大鼠中在单次注射SP-PTH或PTH(1-34)以后0-6小时的尿钙的图。

图35是示出了在TPTX大鼠中PTH(1-34)和SP-PTH的低磷酸盐血症作用(hypophosphatemic action)的图。

图36是示出了在TPTX大鼠中在单次注射SP-PTH或PTH(1-34)以后0-6小时的尿磷的图。

图37是示出了Mc-PTH(1-34)、[A^1,3,A²³,Q¹⁰,R¹¹]-hPTH(1-34)、[A^1,3,A²³]-hPTH(1-34)、以及[A¹⁸,A²²,L²⁵,K²⁶]-PTHrP(1-28)的cAMP信号效力的剂量反应分析的图。为了比较，还示出了hPTH(1-34)和PTHrP(1-36)。评估了在HKRK-B7细胞中这些肽在人PTH1受体上刺激cAMP形成的能力。这些PTH类似物显示可与hPTH(1-34)比较的cAMP信号。

具体实施方式

我们已发现了下述之间的相关性：(i)当未偶联于G蛋白(R⁰状态)时，GPCR配体结合GPCR的能力，以及(ii)配体激活受体的时间长度。特别地，与PTH或PTHrP相比，配体体外与示例性的GPCR，PTH/PTHrP受体(PTHR)，未偶联于G蛋白(R⁰形式)相互作用的增强能力与其施加体内更长期活性的能力密切相关。反过来也是如此，即，对于GPCR的G蛋白偶联形式(RG形式)具有选择性的配体，与天然配体相比，具有活性的更短持续时间。该发现提供了用于确定化合物对于GPCR是否具有长效或短效体内活性的新方式的基础。在该基础上，利用本文描述的方法，可以鉴定具有治疗上期望性能的配体(例如，长效或短效配体)。本文描述了具有长效或短效活性的示例性配体。

取决于待治疗的疾病，长效或短效疗法是期望的。利用注射在人类中的PTHrP(1-36)的最近研究表明，骨矿质密度增加至与PTH(1-34)(用于骨质疏松症的标准疗法)大约相同的程度，但没有诱导骨吸收反应，而对于等效剂量的PTH(1-34)将预期是如此(Horwitz et al.,J.Endocrinol.Metab.88:569-575(2003))。来自该小组的相关研究表明，差异不可能仅基于药代动力学，因为急性安全性研究表明，可以以几乎20倍高于PTH(1-34)的正常剂量的剂量给予PTHrP(1-36)，而没有产生高血钙效应(Horwitz et al.,OsteoporosisInt.17:225-230(2006))。虽然PTHrP(1-36)和PTH(1-34)均呈现与PTHR的RG形式的类似的受体结合，但我们的发现，即PTHrP较少有力地结合于PTHR的R⁰形式并相应地呈现较少长期的体内活性(与PTH相比)，可以解释该差异。因此，我们认为，PTHR的RG选择性配体(即，具有相对较低R⁰亲和力)将证明可用于治疗骨质疏松症。

在其他情况下，更长效配体可以是期望的。例如，与PTH(1-34)相比，在刺激肾生产1,25,(OH)₂维生素D方面，PTHrP是较少有效的(Horwitz et al.,J.Bone Mineral.Res.20:1792-1803(2005))，这表明，PTH(1-34)可以更有效地治疗其中期望长效PTHR信号的疾病。这样的疾病包括由在钙敏感受体中激活突变所引起的某些形式的甲状旁腺功能减退。目前，治疗这种疾病需要每日两次注射PTH(1-34)(Winer et al.,J.Clin.Endocrinol.Metab.88:4214-4220(2003))。通过利用本发明的筛选方法，使得可以鉴定更长效的PTHR配体，其可以证明高度有利于治疗这样的疾病并且可以允许较少频繁地给予药物。

与PTHrP相比，PTH(1-34)，借助于其稳定结合于R⁰的更大能力，能够在目标骨(target bone)和肾脏细胞中诱导累积性更大的信号反应，于是这种R⁰选择性差异导致生物反应的趋异(divergence)，如在成骨细胞中诱导与刺激破骨细胞性骨吸收(osteoclastic bone resorption)有关的因子(RANK配体)，以及在肾近端小管细胞中刺激1-α-羟化酶mRNA合成。根据这些考虑因素，特别高选择性结合于RG(相对于R⁰)PTHR构象的配体可以高度有效地刺激骨形成反应，因而可用于治疗骨质疏松症。

因此，两种配体优先稳定不同的受体构象。在GPCR领域，目前存在许多关于用于给定受体的结构变化配体对于不同的受体构象呈现改变的选择性并因而产生不同的生物效应的能力的讨论(Kenakin,T.Sci STKE342:pe29(2006))。本文进行的动力学与平衡结合测定的结果表明，尽管PTH(1-34)和PTHrP(1-36)以类似亲和力结合于G蛋白偶联PTHR构象，RG，但与PTHrP(1-36)相比，PTH(1-34)呈现出更大的能力来结合于G蛋白未偶联构象，R⁰，其被定义为受体构象，该受体构象具有在存在GTPγS(5,14)的情况下以高亲和力结合配体的能力。

本文提供的延迟cAMP测定说明了，对于不同的PTHR构象的改变的选择性可以导致在表达PTHR的细胞中改变的信号反应。因此，在表达PTHR的细胞中，PTH(1-34)和Ile⁵-PTHrP(1-36)诱导更长时期的、以及累积性更大的cAMP信号反应。PTH(1-34)和Ile⁵-PTHrP(1-36)(其还具有比PTHrP(1-36)更大的稳定R⁰的能力)可以诱导更长时期的信号反应，这是由于LR⁰复合物最终偶联于异三聚体G蛋白(LR⁰-LRG)以及相应信号级联的激活。稳定的LR⁰结合的另一个潜在的机制性后果是，它可以允许多次(催化)G蛋白激活，借此在G蛋白偶联、激活以及释放的连续循环以后保存LR⁰复合物(Rodbel,M.Adv.Enzyme Regul,37:427-435(1997)；Heckand Hofmann,J.Biol.Chem.276:10000-10009(2001))。

当在常规剂量反应，在单时间点细胞中进行的cAMP和肌醇磷酸刺激反应，评估配体时，几乎没有检测到效力差异，借助上述效力PTH(1-34)和PTHrP(1-36)配体刺激cAMP和肌醇磷酸反应(图7)。这些结果与两种配体经由相同或类似机制与PTHR相互作用的观点一致。因此时间延迟的cAMP测定鉴定先前未意识到的两种配体的第二信使信号特性的差异，明显的作为累计信号输出随时间的差异。虽然已知激动剂激活的PTHR会经受脱敏过程，该脱敏过程涉及受体磷酸化、β-抑制蛋白补充、以及受体内在化(Biselo,A.et al.,(2002)；Tawfeek et al.,Mol.Endocrinol.(2002)；Castro et al.,Endocrinology143:3854-3865(2002)；Chauvin et al.,Mol.Endocrinol.16:2720-2732(2002))，但并不预期这样的过程将对具有R⁰构象的受体起作用，因为按照定义这些过程是功能无效的，至少就G蛋白偶联而论。然而，不能排除这样的可能性，即在图5的我们的延迟cAMP测定中观察到的效应在一定程度上涉及配体对这样的受体脱敏机制的不同影响。

通常，稳定的LR⁰结合能力可以在表达低水平关联(同源)异三聚体G蛋白(相对于目标受体)的靶细胞中促进或增加配体的信号潜力。它还可以促进偶联于“第二”G蛋白，与第一G蛋白相比，该“第二”G蛋白很可能对于配体-受体复合物具有更低的亲和力。对于PTHR，这可以涉及偶联于Gα_q/11、Gα_i/o、或Gα_12/13，其每一种已显示出响应于PTH(1-34)被PTHR激活。虽然PTHrP具有至少某些结合R⁰(图3A-3D)和激活延迟的cAMP信号(图5A和图5B)的能力，但该结合小于PTH(1-34)的结合。确实，形成稳定LR⁰复合物的某些能力可以是B类GPCR的内在属性，因为其中的许多种，包括用于降钙素的受体(Hilton et al.,J.Endocrinol.166:213-226(2002))、促肾上腺皮质素释放激素(corticortropin-releasinghormone)(Hoare et al.,Peptides24:1881-1897(2003))以及胰高血糖素(Post et al.,J.Biol.Chem.267:25776-25785(1992))已显示出在有非水解鸟嘌呤核苷酸类似物存在的情况下可以与它们的关联肽配体形成稳定的复合物。

本文描述的发现还可以涉及这样的机制，借此PTH和PTHrP在正常生理机能中发挥作用。PTH，作为一种内分泌激素，作用于远离它的分泌部位(甲状旁腺)的靶细胞(在骨和肾脏中)。在血清中PTH的浓度，虽然当Ca⁺⁺水平波动时会轻微地变化，但通常在低皮摩尔范围内，远低于PTH结合于其受体的亲和力。PTH稳定地结合于受体(甚至在未偶联的R⁰构象中)的能力可以是一种进化适应，其有助于确保对甚至配体浓度的最小增加的反应。相反，PTHrP，作为一种旁分泌因子，作用于相同组织内的细胞(其中它被产生)(例如，发展长骨的生长板软骨细胞)。在这样的组织中PTHrP的浓度还未被直接量化，但它们似乎形成穿过正分化细胞的区域的梯度并且在生产部位附近较高(Chen et al.,J.Bone Miner.Res.21:113-123(2006))。可能的是，作为适应于其在控制分化事件(其发生在这些细胞中)中的作用，PTHrP演化成仅瞬时结合于受体，使得诱导相对较短寿命的、并且更容易定时的信号反应。

G蛋白偶联受体

本发明可以使用任何G蛋白偶联受体。长效和短效配体可以如本文描述的加以测定并鉴定有用的治疗候选物。数百种这样的受体在本领域是已知的；参见，例如，Fredriksson et al.,Mol.Pharmacol.63:1256-1272,2003，其以引用方式结合于本文。基于序列同源性和功能，该参考文献已表征了人GPCR。人GPCR可以分为5类：促胰液素(胰泌素)、视紫红质、谷氨酸盐(或酯)、frizzled/Tas2、以及黏附素(adhesion)。可替换地，受体可以按照它们的配体加以分类，例如，肽激素或小分子(例如，生物胺)。其它分类方案包括A-F分类，其中A类表示与视紫红质和肾上腺素能受体有关的受体，B类是与降钙素和甲状旁腺激素受体有关的受体，C类是与代谢性受体有关的受体，以及D-F类表示在真菌和古细菌中发现的受体。

利用Fredriksson分类，促胰液素受体具有4个主要亚组：CRHR/CALCRL、PTHR、GLPRs/GCGR/GIPR以及包括促胰液素和4种其它受体的亚组。促胰液素受体包括PTHR、以及降钙素受体(CALCR)、促肾上腺皮质素释放激素受体(CRHR)、胰高血糖素受体(GCGR)、肠抑胃肽受体(gastric inhibitory polypeptide receptor)(GIPR)、胰高血糖素样肽受体(GLPR)、生长激素释放激素受体(GHRHR)、垂体腺苷酰(基)环化酶激活蛋白(PACAP)、促胰液素受体(SCTR)、以及血管活性肠肽受体(VIPR)。

粘附受体(adhesion receptors)的特点在于(feature)GPCR样跨膜-跨越区，该区与一个或多个功能域融合在一起，其中功能域在N端具有粘附样基序，如EGF样重复单位、粘蛋白样区、以及保守的半胱氨酸富集基序。该家族的成员包括CELSR(EGF LAG七通G型受体)、大脑特异性血管生成抑制受体(BAI)、钙非依赖α蛛毒素(lectomedin)受体(LEC)以及包含(EMR)的EGF样组件。其它受体包括CD97抗原受体(CD97)以及EGF-TMVII-蜘蛛毒素亲和蛋白-相关(latrophilin-related)(ETL)。这些受体还包括HE6(TMVIILN2)和GPR56(TMVIIXN1或TMVIILN4)以及最近发现的一组受体，与GPR56和HE6有关，称作GPR97和GPR110至GPR116。

谷氨酸盐受体由8种代谢型谷氨酸盐受体(GRM)，两种GABA受体(例如，GAB-AbR1，其具有两种剪接变异体，a和b，以及GAB-AbR2)，单钙敏感受体(CASR)，以及被认为是味觉受体(TAS1)的5种受体组成。

其它GPCR包括阿片样受体、毒蕈碱性(muscarinic)受体、多巴胺受体、肾上腺素能受体、cAMP受体、视蛋白受体、血管紧张素受体、血清素受体、促甲状腺素受体、促性腺素受体、K物质受体、P物质受体和R物质受体、褪黑激素(melanocortin)受体、代谢型谷氨酸盐受体。

最大组是视紫红质受体家族，其包括至少701种人受体，其中241种是非嗅受体。该组中的受体包括各种乙酰胆碱(毒蕈碱性)受体、肾上腺素能受体、多巴胺受体、组胺受体、血清素受体、以及章鱼胺受体；肽受体，例如，血管紧张素受体、铃蟾肽受体、舒缓激肽受体、内皮素受体、白介素8受体、趋化因子受体、褪黑激素受体、神经肽Y受体、神经降压肽(neurotensin)受体、阿片样受体、促生长素抑制素受体、速激肽受体、凝血酶受体、加压素受体、甘丙肽(galanin)受体、蛋白酶激活受体、增食因子(orexin)受体、以及趋化激素/趋化因子受体；蛋白质激素受体，例如，FSH受体、黄体生成素(促黄体素，lutropin)-绒毛膜促性腺激素受体、以及促甲状腺素受体；视紫红质受体；嗅受体；前列腺素类受体；核苷酸样受体，包括腺苷和嘌呤受体；大麻受体；血小板活化因子受体；促性腺素释放激素受体；褪黑激素受体、溶鞘脂(lysosphingolipid)和LPA(EDG)受体、以及各种孤儿受体。

候选化合物

在本发明的筛选方法中可以使用任何类型或来源的化合物。例如，天然存在的化学物质(例如，来自化学库)、肽、修饰肽激素、抗体、纳米体(nanobodies)、嵌合肽、以及内源性配体(例如，肽配体)的片段均可以用于本发明。涉及随机筛选的方式，如化合物的天然文库、或设计的配体(例如，基于PTH序列的配体)，可以用于本发明的筛选方法中。在一些实施方式中，相对于GPCR或GPRC的配体结合片段，利用本领域已知的方法可以产生抗体或纳米体。

修饰受体激动剂

用于鉴定新受体激动剂的一种策略是修饰现有的激动剂。可以通过点突变、截短、插入、以及嵌合肽的产生来修饰肽激素。利用PTH受体，例如，许多修饰PTH和PTHrP序列在本领域是已知的。可以以重组或合成方式来制备肽，如本领域已知的。参见，例如，美国专利第7,057,012、7,022,815、6,417,333、6,495,662号，其以引用方式结合于本文，其描述了各种PTH序列、以及本文描述的任何PTH序列。这些序列可以包括嵌合肽。在一个具体实施例中，可以将任何激动剂融合于抗体或抗体片段(如Fc片段)以产生候选治疗药物(therapeutic)。

抗体和纳米体(nanobodies)

结合GPCR的抗体或纳米体还可以用于本发明的方法中并且可以相对于GPCR或其片段(例如，GPCR的配体结合部分)来产生，其中利用本领域已知的任何方法。在一个实施例中，利用纯化蛋白，可以在新西兰白兔中产生针对GPCR或其片段的IgG。初次免疫方案(initial immunization protocol)包括最初肌内注射10-20μg纯化蛋白，接着在21天以后加强免疫。如果检测不到或检测到很少抗体，则可以使用另外的加强(boost)和/或添加佐剂。可以通过ELISA来量化抗体，其类似于(Siber et al.,J.Infect.Dis.152:954-964,1985；Warren et al.,J.Infect.Dis.163:1256-1266,1991)中所描述的。IgG可以纯化自兔抗血清，例如，通过在50％硫酸铵中进行沉淀，接着在G蛋白琼脂糖凝胶4B(Pharmacia)上进行亲和层析。可以利用杂交瘤技术来产生GPCR的单克隆抗体。可以通过对产生纳米体的动物(例如，骆驼或美洲驼)进行免疫来产生纳米体，然后可以利用标准技术对其加以纯化。如本文描述的对这些抗体或纳米体进行筛选，以获得产生长期或短期效应的激动性分子(agonistic molecules)。

测试化合物和提取物

通常，按照本领域已知的方法，从天然产物或合成(或半合成)提取物的较大文库或化学品文库鉴定能够结合GPCR(例如，PTHR)的化合物。药物发现和开发领域的技术人员将明了，测试提取物或化合物的确切来源对于本发明的筛选程序来说并不是关键的。因此，实质上，利用本文描述的方法可以筛选任何数目的化学提取物或化合物。这样的提取物或化合物的实例包括但不限于基于植物、真菌、原核或动物的提取物、发酵液体培养基、和合成化合物、以及现有化合物的修饰。还可以获得许多方法来随机或定向合成(例如，半合成或全合成)任何数目的化合物，其包括但不限于基于糖、脂质、肽、以及多核苷酸的化合物。可商业上获得合成化合物库。可替换地，可商业上获得具有细菌、真菌、植物、以及动物提取物的形式的天然化合物库。此外，如果需要的话，按照本领域已知的方法，可以产生天然和合成产生的库，例如，通过标准提取和分馏方法(fractionation methods)。另外，如果需要的话，利用标准的化学、物理、或生化方法，可以容易地修饰任何库或化合物。

此外，药物发现和开发领域的技术人员容易明了，应尽可能采用这样的方法，其用于去重复(dereplication)(例如，分类去重复、生物去重复、以及化学去重复、或它们的任何组合)或消除已知在治疗代谢紊乱中具有活性的物质的复制或重复。

当发现粗提取物结合RG状态的GPCR时，或当受体处于其R⁰状态时，与内源性配体相比，呈现改变的结合(例如，更高亲和力或更低亲和力)时，则需要进一步分馏阳性前导提取物(leadextract)以分离负责观测到的效应的化学成分。因此，提取、分馏、以及纯化过程的目的是表征和鉴定粗提取物中的化学实体，该化学实体具有可以用于治疗代谢紊乱(例如，糖尿病和肥胖症)的活性。分馏和纯化这样的异质提取物的方法在领域是已知的。如果需要的话，按照本领域已知的方法，可以对可用于本发明的筛选方法的药剂的化合物加以化学修饰。

这样的测试化合物包括天然存在的化合物或合成化合物(包括小分子)以及氨基酸或核酸适体(aptamer)。任何这些化合物可以包括合成或修饰的氨基酸或核酸。

使受体与候选化合物接触

在本发明的筛选方法中，使候选化合物与GPCR接触。受体可以存在于细胞上(例如，在生物中)、或存在于膜标本(membranepreparation)中。可替换地，可以以功能形式来分离受体(Shimadaet al.,J.Biol.Chem.277:31,774-31780,2002)。

在本发明的方法中可以使用这样的细胞，其自然表达感兴趣的GPCR(例如，PTHR)或重组表达受体。可替换地或另外，细胞可以被转染(例如，利用本领域已知的任何方法)以表达编码GPCR的重组基因。还可以例如从Millipore(ChemiScreen^TM细胞系)商业上获得表达特定GPCR的细胞。

在其它实施方式中，受体存在于膜标本(例如，无细胞)中，其包含感兴趣的GPCR。这样的标本(preparation)可商业上获得；参见，例如，可获自Millipore的ChemiSCREEN^TM受体标本。还可以利用本领域已知的方法来制备膜标本(参见，例如，Mills et al.,J.Biol.Chem.263:13-16,1988)。

如果采用经纯化的受体成分，则体外使候选化合物与受体或受体复合物接触。

测定读数(assay readout)-测量配体结合或活性

在本发明的方法中可以使用用于分析配体结合或配体活性的任何方法；特定读数并不是关键的。在一些实施方式中，结合于GPCR的配体通过用非标记化合物替换放射性标记配体并在用非标记化合物进行处理前后测量细胞或膜标本的放射性而测量。通常，该方式涉及温育膜和放射性配体以便于复合物形成。可以通过添加过量的未标记化合物来引发解离阶段。在添加前(t＝0)，以及在其后的连续时间点，可以抽出等分部分并立即通过真空过滤加以处理。在预温育和解离阶段，在包含未标记化合物的平行反应管中确定非特异性结合。在每个时间点的特异性结合的放射性可以计算为在t＝0时的放射性特异性地结合的百分比。这样的解离方法非常适合于大规模筛选(例如，候选化合物库)。

如在以下实施例1中描述的，其它方法如FRET也可以用来测量结合于受体的配体。在一种应用中，将两个荧光分子共轭(conjugated)于受体，使得配体结合导致受体的构象变化，其可以通过FRET信号的变化加以检测。FRET便于配体结合的实时测量，因而可用于本发明的测定。

其它读数包括cAMP活性的测量结果，其包括本文描述的延迟cAMP活性测定，该测定间接测量化合物与受体的RG形式的结合。可以利用放射免疫测定来测量细胞内cAMP水平，例如，如Shimizuet al.(J.Biol.Chem.276:49003-49012(2001))所描述的。简单地说，这种方法包括用候选化合物处理，用0.5ml的结合缓冲液(50mM Tris-HCl、100mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl₂、5％热灭活马血清、0.5％胎牛血清，用HCl调节至pH7.7)冲洗，以及用200μl的cAMP测定缓冲液(Dulbecco改良的Eagle培养基，其包含2mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1mg/ml牛血清白蛋白、35mMHepes-NaOH，pH7.4)和100μl的结合缓冲液(包含不同量的候选化合物)(最终容积＝300μl)加以处理。然后可以在室温下温育30-60分钟以后除去培养基。然后可以冻结细胞，用0.5ml的50mMHCl溶解，并再冷冻(在-80℃下)。可以通过放射免疫测定来确定稀释裂解液的cAMP含量。可以利用非线性回归来计算EC₅₀响应值。

影响GPCR活性的任何适宜的生理变化可以用来评估测试化合物对GPCR活性的影响。当利用完整细胞或动物来确定功能结果时，还可以测量各种效应如递质释放，激素释放，已知和未表征遗传标记(例如，northern印迹)的转录的变化，细胞代谢的变化如细胞生长或pH变化，以及细胞内第二信使如Ca⁺⁺、IP₃、或cAMP的变化。

在一种实施方式中，可以利用免疫测定来测量细胞内cAMP的变化。在Offermanns and Simon,J.Biol.Chem.270:15175-15180(1995)中描述的方法可以用来确定cAMP的水平。还可以使用用于测量cAMP的测定试剂盒，如在美国专利第4,115,538号中所描述的，将其以引用方式结合于本文。可以使用的其它测定包括体内测量血清/尿钙、磷酸盐、以及骨周转(bone-turnover)的标记(例如，脱氧胶原吡啶交联(deoxypridonoline crosslinks))的变化，在尿中血清相互变化的减少。

测量R⁰或RG结合

本发明的方法涉及测量候选化合物与GPCR(例如，PTHR)的RG或R⁰形式的结合。因此，可以区分化合物对于受体的每种形式的亲和力之间的测定读数。一种可能的方式是使用其中有利于一种受体构象的系统或条件。例如，通过GPCR强制解离自它的G蛋白、或利用缺乏G蛋白的系统，可以有利于R⁰。可以实现GPCR解离自G蛋白的一种方式是通过用防止G蛋白结合于它的GPCR的化合物加以处理。这样的化合物包括核苷酸类似物如非水解的核苷酸类似物(包括GTPγS)。GTPγS结合G蛋白，但因为它不能水解该化合物，所以G蛋白本身不能本身反向循环至GPCR。因此，通过在添加候选化合物以前使细胞或细胞膜与GTPγS接触，可以产生其中高度有利于GPCR的R⁰状态的系统。

为了稳定GPCR的RG形式，可以使用显性负G蛋白。这些蛋白以稳定方式结合GPCR，因而富集RG构象。

用来调节R⁰与RG之间的比率的其它方式包括利用来自动物的细胞，其中一种或多种G蛋白的表达已被负调节或消除。基因敲除技术在本领域是众所周知的并且可以用来靶向特定的G蛋白(参见，例如，Dean et al.,Mol.Endocrinol.20:931-943(2006))。在其它实施方式中，RNAi技术(例如，将siRNA给予细胞)可以用来“击倒(降低)”G蛋白的表达，从而有利于受体的R⁰状态。可替换地，可以通过过度表达适当的G蛋白或细胞中的G蛋白来有利于RG形式。

用于测量化合物结合R⁰或RG状态的能力的第二种方式涉及替换已知对特定状态具有选择性的配体。在PTH受体的情况下，先前的工作已表明，¹²⁵I-[Aib^1,3,M]PTH(1-15)对于RG状态是选择性的。通过测量这样的配体的候选化合物的配体替换，可以特异性地测量化合物与该状态的结合，即使受体在测定中以RG和R⁰状态存在。

在本发明的方法中鉴定的化合物通常结合于受体的RG形式，其中对于长效或短效激动剂具有至少5％(例如，至少10％、20％、50％、100％、500％、1000％、10,000％)的内源性受体的活性。例如，人PTH以约0.13nmol的EC50结合人PTHR。因此期望的化合物通常以这种亲和力的至少10％结合hPTHR，即，至少1.3nmolEC50。

利用本发明的方法鉴定的配体

利用本文描述的筛选方法，我们已鉴定了各种配体，用于示例性的GPCR，PTH受体，其表示任何类型的肽的不同组合(PTH/PTHrP杂合体)，其选择是基于它们对短效配体或长效配体的相对R⁰/RG选择性(图26A和图26B)。基于我们的筛选测定的结果，然后我们测试了这些肽的体外和体内活性，以说明在确定配体的生物活性中R⁰/RG选择性的重要性的概念。

鉴定的肽说明了，对于PTH受体和其它GPCR来说，R⁰/RG选择性确定了体内生物作用。这些肽包括5种不同的类型。第一类的典型代表是Ile⁵-PTHrP，一种类似物，其将PTHrP转化成具有高R⁰选择性和长期作用的形式。第二类包括具有高R⁰/RG选择性的杂合肽，其由与PTHrP(12-36)结合的MPTH(1-11)或与PTHrP(15-36)结合的MPTH(1-14)组成。这些肽具有很长时间的体内生物活性。第三类是[His⁵,Arg¹⁹]PTH，其显示更短期的生物活性，这是由于其降低的R⁰亲和力。第四类化合物的典型代表是Ala¹,Aib³-M-PTH(1-28)，其具有有力的R⁰激活活性、以及引人注目的活性，以促进尿磷酸盐排泄，一种在治疗与高磷酸盐保留有关的疾病中期望的性能。第五类的典型代表是Ala²³-PTH，其具有更低的R⁰亲和力，因而更期望用于治疗骨质疏松症。

对于PTH受体配体，我们已鉴定了具有各种R⁰和RG结合亲和力和不同R⁰/RG选择性的配体。按照R⁰亲和力加以分类的示例性的肽示在图26B中。对于受体的R⁰形式的亲和力可以是至少2000、1000、750、500、250、150、100、90、75、50、40、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2.5、2、1.5、1、0.5、0.2、0.1、或0.05nmol。对于受体的RG形式的亲和力可以是至少100、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2.5、2、1.75、1.5、0.125、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.075、0.05、0.025nmol。R⁰/RG的选择性可以是(其中更高的值表示更大的RG选择性)至少0.5、1、2、3、4、5、8、10、15、20、25、30、40、50、60、75、100、150、200、250、400、500、750、1000、1250、1500、2000、2500、或5000。本发明的配体可以具有本文描述的任何RG或R⁰亲和力、或它们的任何组合。

RG和R⁰选择性配体

利用本文描述的筛选方法，我们已开发了新的RG选择性和R⁰选择性配体。在一个实施例中，我们使用了PTHrP(1-28)作为起点，因为与PTH相比，PTHrP以更大的选择性结合于RG受体构象。表2总结了特定类似物的体外活性；另外的类似物示于表3中。在以下实施例3中描述了关于这些类似物的更详细的信息。这些类似物，A(E)18、A22、(L25)、K26-PTHrP(1-28)或(1-30)，通常呈现对于cAMP产生的增强的效力，以及与PTHrP(1-36)相比以相对高选择性结合于RG构象(表2)。

表2.代表性PTHrP类似物的体外活性

另外的肽和这样的肽的结合/活性数据示于下面的表3中。

表3:PTHrP类似物的结合/活性

我们还生产了肽A²⁰,Mc-PTH(1-34)OH、F²³,Mc-PTH(1-34)OH、[A¹,A³,A²³,Q¹⁰,R¹¹]-PTH(1-34)OH、[A¹,A³,A²³]-PTH(1-34)OH、以及E¹⁸,A²²,L²⁵,K²⁶-PTHrP(1-30)。这些肽与人PTH1受体的R⁰和RG结合示于以下表4中。

表4.示例性肽的RG和R⁰结合

Mc＝A1,3,12,Q10,R11,W14,R19

多肽修饰

本文描述的任何多肽可以包含一个或多个修饰如N端或C端修饰。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇(phosphotidylinositol)的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚定形成、羟基化、碘化、甲基化、十四烷酰化、氧化、蛋白水解处理、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒基化(selenoylation)、硫酸盐化、转移RNA介导添加氨基酸到蛋白质如精氨酰化(aiginylation)、以及遍在蛋白化。参见，例如，Proteins-Structure and Molecular Properties,2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York,1993and Wold,F.,Posttranslational Protein Modifications:Perspectives and Prospects,pgs.1-12in Posttranslational Covalent Modification of Proteins,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York,1983；Seifter et al,MethodsEnzymol182:626646(1990)and Rattan et al,Ann NY Acad Sci663Α&62(1992)。

本发明的任何多肽可以进一步包括异源序列(融合的蛋白伙伴(伙伴，partner))，因而形成融合蛋白。融合蛋白可以包括融合的蛋白伙伴如纯化或检测标记，例如，可以直接或间接检测的蛋白质(如绿色荧光蛋白、血凝素、或碱性磷酸酶)，DNA结合域(例如，GAL4或LexA)，基因激活域(例如，GAL4或VP16)，纯化标记，或分泌信号肽(例如，前胰蛋白酶(preprotyrypsin)信号序列)。在其它实施方式中，融合的蛋白伙伴可以是标记，如c-myc、聚组氨酸、或FLAG。每种融合的蛋白伙伴可以包含一个或多个域，例如，前胰蛋白酶(preprotrypsin)信号序列和FLAG标记。在其它情况下，融合的蛋白伙伴是Fc蛋白(例如，小鼠Fc或人Fc)。

治疗疾病的方法

可以用本文描述的任何肽来治疗与PTH功能不良、或钙或磷酸盐失衡有关的任何疾病，其中上述肽包括图26A和图26B中的那些肽、表1中的那些肽、或利用本发明的方法鉴定的那些肽。这些肽可以用来治疗骨质疏松症、骨折修复、骨软化、关节炎、血小板减少、甲状旁腺功能减退或高磷酸盐血症，或可以用来在受治疗者中增加干细胞转移。在本发明的治疗方法中可以使用任何给予方式(例如，口服、静脉内、肌内、眼、局部、皮肤、皮下、以及直肠)。医师将确定对于待治疗患者的适当的剂量，其将部分取决于患者的尺寸、疾病或病症的严重性、以及待治疗的特定疾病或病症。

药物组合物的剂型(formulation)

本文描述的(例如，PTH-衍生肽)或利用本发明的方法鉴定的任何化合物的给予可以通过任何适宜方式进行，该方式导致可以治疗受治疗者的病情的化合物浓度。化合物可以以任何适当的量包含在任何适宜的载体物质中，并且通常以按组合物总重量的重量计为1-95％的量存在。可以以剂型形式提供组合物。其中剂型适合于口服、肠外(例如，静脉内或肌内)、直肠、皮肤、鼻、阴道、吸入、皮肤贴剂)、眼、或颅内给予途径。因此，组合物可以具有例如以下形式：片剂、安瓿剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶(包括水凝胶)、糊剂、软膏剂、乳膏剂、硬膏剂、兽用顿服药、渗透递送装置、栓剂、灌肠剂、可注射物、植入物、喷雾剂、或气雾剂。可以按照传统医药实践来配制药物组合物(参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20thedition,2000,ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia，以及Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,1988-1999,Marcel Dekker,New York)。

可以配制药物组合物以在给予以后立即或在给予以后的任何预定时间或时期释放活性化合物。后者类型的组合物通常称作控释剂型(formulations)，其包括(i)在体内并在较长时期内产生基本上恒定浓度的本发明的药剂的剂型；(ii)在体内并在较长时期内在预定滞后时间以后产生基本上恒定浓度的本发明的药剂的剂型；(iii)在预定时期维持药剂作用的剂型，其中通过保持体内相对恒定、有效水平的药剂并伴随最小化与药剂的血浆水平的波动有关的不期望的副作用(锯齿动力学模式)。(iv)使药剂的作用局部化的剂型，例如，相邻于或在患病组织或器官中空间布置控释组合物；(v)实现方便剂量给药的剂型，例如，每周给予组合物一次或每两周一次；以及(vi)标靶药剂作用的剂型，其中通过利用载体或化学衍生物来将化合物递送到特定靶细胞类型。对于在胃肠道具有窄吸收窗或相对较短生物半衰期的化合物来说，特别优选以控释剂型的形式来给予化合物。

可以致力于许多策略中的任一种以便获得控释，其中释放率大于所考虑化合物的代谢率。在一个实施例中，控释通过适当选择各种配制参数和组分，包括，例如，各种类型的控释组合物和涂层来获得。因此，用适当的赋形剂将化合物配制成药物组合物，在给予以后，其以受控方式释放化合物。实例包括单或多单位片剂或胶囊剂组合物、油溶液、混悬剂、乳剂、微胶囊、分子复合物、微球、纳米颗粒、贴剂、以及脂质体。

肠外组合物

可以以剂型、配方(制剂，formulations)形式，通过注射、输注、或植入(皮下、静脉内、肌内、腹腔内等)肠外给予，或借助于适宜的递送装置或植入物(包含常规、非毒性药用载体和佐剂)来给予包含本文描述的或利用本发明的方法鉴定的化合物的组合物。这样的组合物的配方和制剂(preparation)是药物剂型(pharmaceutical formulation)领域的技术人员众所周知的。

用于肠外应用的组合物可以以单位剂型(例如，在单剂量安瓿中)提供，或提供在包含多个剂量的小瓶中，并且其中可以添加适宜的防腐剂(参见下文)。组合物可以具有以下形式：溶液、悬浮液、乳浊液、输注装置、或用于植入的递送装置，或它可以作为干粉提供以在使用前用水或另一种适宜载体加以重组。除了活性剂以外，组合物还可以包括适宜的肠外用载体和/或赋形剂。可以将活性剂加入用于控释的微球、微胶囊、纳米颗粒、脂质体等中。此外，组合物可以包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂、渗透性(张性)调节剂、和/或分散剂。

如上所述，根据本发明的药物组合物可以具有适合于无菌注射的形式。为了制备这样的组合物，将适宜的活性剂溶解或悬浮在肠外用液体载体中。在可以采用的可接受的载体和溶剂中有水、通过添加适量盐酸、氢氧化钠或适宜缓冲剂调节到适宜pH的水、1,3-丁二醇、林格氏液、葡萄糖溶液、以及等渗氯化钠溶液。含水配方还可以包含一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、或对羟基苯甲酸正丙酯)。在化合物之一仅微溶或略溶于水的情况下，可以添加溶解增强剂或增溶剂，或溶剂可以包括10-60％w/w的丙二醇等。

以下实施例用来说明而不是限制本发明。

实施例1

短效和长效PTH肽的鉴定

利用竞争性结合测定对配体的表征。为了鉴定PTHR配体，首先进行动力学解离实验以检查在PTH与PTHrP放射性配体类似物和人PTHR之间形成的复合物的稳定性，其中人PTHR表达在由HKRK-B7细胞制备的膜中。对于每种放射性配体，在有和没有GTPγS存在的情况下检查解离，以评估来自异三聚体G蛋白的功能上未偶联受体的影响(图1A-1C)。对于¹²⁵I-PTH(1-34)和¹²⁵I-PTHrP(1-36)(分别为图1A和图1B)，在没有和有GTPγS存在的情况下的解离数据(分别为实心和空心符号)，通过两相衰减方程比通过单相方程被更好地拟合。对于¹²⁵I-PTH(1-34)并在没有GTPγS存在的情况下，17％的复合物是不稳定的并且快速衰减(t_1/2<1分钟)，而剩余的83％则是稳定的并且缓慢衰减(t_1/2约4h)。在添加GTPγS以后，快速、不稳定的成分增加到21％，使得77％的复合物仍然是稳定的(t_1/2约2h)(图1A)。关于¹²⁵I-PTH(1-34)的这些发现紧密地与对该放射性配体进行的先前的解离研究一致，并且强调了PTH(1-34)以高亲和力结合于G蛋白未偶联PTHR构象(R⁰)的能力(Shimizu et al.,J.Biol.Chem.280:1797-807(2005)；Deanet al.,Mol.Endocrinol.20:931-43(2006))。¹²⁵I-PTHrP(1-36)和PTHR形成的复合物在没有GTPγS存在的情况下再次是最稳定的(68％衰减，其中t_1/2为约3h)。相反，在添加GTPγS以后，大多数复合物变得不稳定(72％衰减，其中t_1/2为约1分钟；图1B)。通过添加GTPγS所诱导的¹²⁵I-PTHrP(1-36)与PTHR的这种快速解离反映了，先前针对¹²⁵I-[Aib^1,3,M]PTH(1-15)所观测到的结果(Dean et al.,Mol.Endocrinol.20:931-43(2006))；因而这些放射性配体的每一种似乎主要结合于G蛋白偶联构象(RG)中的PTHR。

于是鉴定了PTH(1-34)和PTHrP(1-36)的结构差异，其构成在上述解离研究中对于两种配体所看到的功能差异的基础。在PTH和PTHrP中位置5处的不同的残基(分别为Ile和His)已显示出在确定亲和力(Shimizu et al.,J.Biol.Chem.280:1797-807(2005)；Gardella et al.,J.Biol.Chem.270:6584-6588(1995))和亚型选择性中(Gardella et al.,J.Biol.Chem.271:19888-19893(1996)；Behar et al.,Endocrinology137:4217-4224(1996))起重要作用，借此这些配体结合于受体。再次在没有和有GTPγS存在的情况下，检查了¹²⁵I-Ile⁵-PTHrP(1-36)的受体解离性能。在有和没有GTPγS存在的情况下，这种放射性配体均缓慢地解离自受体，并且，在每种情况下，具有单相动力学(t_1/2>2h；图1C)。因此，His⁵Ile取代显著增强了稳定性，借此PTHrP结合于PTHR，其处于G蛋白偶联状态，并且尤其处于G蛋白未偶联状态。

GTPγS对平衡结合的影响。在没有或存在不同浓度的GTPγS的情况下，通过用细胞膜温育90分钟，评估了在近似平衡条件下GTPγS对这些放射性配体与PTHR的结合的影响。¹²⁵I-PTH(1-34)和¹²⁵I-Ile⁵-PTHrP(1-36)与由HKRK-B7细胞制备的膜的结合在很大程度上不受GTPγS的影响(<约20％抑制，在1×10^-4M GTPγS下)，而¹²⁵I-PTHrP(1-36)的结合受到GTPγS强烈的抑制(约70％抑制，在1×10^-7M GTPγS；IC₅₀＝1×10^-9M；图2A)。为了评估与大鼠PTHR的结合，利用由大鼠成骨细胞细胞系ROS17/2.8(其内源性地表达大鼠PTHR)制备的膜进行了平行研究。与在HKRK-B7细胞膜中人PTHR一样，¹²⁵I-Ile⁵-PTHrP(1-36)与大鼠PTHR的结合同样在很大程度上对GTPγS不敏感(图2B)。¹²⁵I-PTH(1-34)与大鼠PTHR的结合似乎比它与人PTHR的结合对GTPγS更敏感(图2A与图2B)，虽然大部分的结合耐核苷酸类似物。关于人PTHR，GTPγS强烈抑制¹²⁵I-PTHrP(1-36)与大鼠PTHR的结合，其对于核苷酸类似物和¹²⁵I-[Aib^1,3,M]PTH(1-15)的结合同样敏感(图2B)。因此，PTH(1-34)和Ile⁵-PTHrP(1-36)比PTHrP(1-36)或[Aib^1,3,M]PTH(1-15)更有力地结合于PTHR的G蛋白未偶联构象(R⁰)。相反，后面两种肽优先结合于G蛋白偶联构象，RG。

然后竞争方法用来分析相对亲和力，借此PTH和PTHrP配体结合于PTHR的RG和R⁰受体构象。为了评估与RG的结合，使用¹²⁵I-[Aib^1,3,M]PTH(1-15)作为示踪放射性配体，因为这种肽主要结合于RG。膜制备自用hPTHR和负显性Gα_s亚单位(Gα_sND)共转染的COS-7细胞(其富集有RG，相对于R和R⁰)，如先前描述的(Deanet al.,Mol.Endocrinol.20:931-943(2006)；Berlot,C.H.,J.Biol.Chem.277:21080-21085(2002)；Dean et al.,J.Biol.Chem.281:32485-32495(2006))。为了评估与R⁰的结合，使用¹²⁵I-PTH(1-34)作为放射性配体(主要结合于R⁰)。膜由仅用hPTHR转染的COS-7细胞制备。将GTPγS(1×10^-5)加入到结合反应中，以便功能上未偶联受体-异三聚体G蛋白复合物，因而富集R⁰(和R)构象，相对于RG。然后在这两种测定中，比较相对于多个未标记PTH和PTHrP配体所获得的相对表观亲和力，以评估每种配体结合于R⁰与RG PTHR构象的选择性。

与结合于RG构象相比，PTH(1-34)以5倍更弱的亲和力结合于R⁰构象(IC₅₀＝4.2nM与0.86nM，P＝0.0002；图3A、表5)。PTHrP(1-36)呈现更大的选择性，因为与结合于RG相比，它以66倍更弱的亲和力结合于R⁰(P＝0.04；图3B；表5)。因此，它对于RG(相对于R⁰)的选择性比PTH(1-34)的选择性大13倍。在配体中残基5的相互交换会颠倒构象选择性的这种模式；因而，与结合于RG相比，His⁵-PTH(1-34)以750倍更弱的亲和力结合于R⁰，并且与结合于RG相比，Ile⁵-PTHrP(1-36)以仅3倍更弱的亲和力结合于R⁰(P<0.002；图3C和图3D；表5)。

表5.与人PTH受体的RG和R⁰构象的竞争结合

在人PTH(1-34)和大鼠PTH(1-34)肽中，其缺乏我们的对照PTH(1-34)类似物的蛋氨酸^8,21→正亮氨酸和Phe³⁴Tyr³⁴取代，Ile⁵→His取代还强有力地减小对于R⁰的亲和力而没有大大影响对于RG的亲和力(图6A、图6B、图6D、和图6E以及表4)。因此，与PTHrP(1-36)相比，PTH(1-34)以更高亲和力结合于R⁰，而PTH(1-34)和PTHrP(1-36)均以高亲和力结合于RG PTHR构象。在配体中残基5在调节配体结合于R⁰与RG构象的能力中起重要作用。此外，在PTH(1-34)中位置15处的残基羧基末端有助于配体强有力地结合于R⁰的能力，如[Aib^1,3,M]PTH(1-15)所显示的，其仅无力地结合于R⁰但保持对于RG的强亲和力(图6C和表4)。

PTHR激活的直接记录。荧光共振能量转移(FRET)方式最近已用来实时和在完整细胞中评估对于PTHR的配体结合和受体激活的过程。因此这种方式用作独立的方式来比较PTH和PTHrP配体与PTHR相互作用的时间过程。所使用的方式利用了分子内FRET信号，其发生在人PTHR构建物、PTHR-CFP_IC3/YFP_CT中(前者称作PTHR-cam)。这种构建物包含在第三胞内环中的青色荧光蛋白(CFP)和在羧基末端尾部的黄色荧光蛋白(YFP)。通过处于基底状态的PTHR-CFP_IC3/YFP_CT来产生FRET信号，并且该信号在激动剂结合以后减弱，可能是由于在激活以后发生的构象变化。

hPTH(1-34)诱导由表达PTHR-CFP_IC3/YFP_CT的细胞产生的FRET信号的快速(t_1/2＝0.7秒)减弱(～13％)(图4A)。在配体施加的15秒期间、以及在含配体的缓冲液与无配体缓冲液交换以后的至少60秒期间，FRET信号仍然受到抑制(配体施加时间由图4A-4C中的图上方的黑色水平线标出)。针对hPTH(1-34)所获得的FRET反应轮廓(profile)相同于(replicate)在先前FRET研究中针对该配体所观察到的轮廓(Vilardaga et al.,Nat.Biotechnol.21:807-812(2003))。氨基末端肽，[Aib^1,3,M]PTH(1-14)，与由hPTH(1-34)产生的相比(图4B)，诱导这样的FRET反应，其具有稍微更快的动力学(t_1/2＝0.5秒)并具有较浅的幅度(约5％)。此外，由[Aib^1,3,M]PTH(1-15)产生的FRET反应在缓冲液交换无配体缓冲液以后立即开始衰减(图4B)。PTHrP(1-36)诱导相对缓慢的FRET反应(t_1/2＝约2至5秒)，并且信号在与无配体缓冲液交换以后立即开始衰减(图4C)。Ile⁵-取代的配体Ile⁵-PTHrP(1-36)诱导FRET信号，其显著类似于PTH(1-34)诱导的FRET信号，因为反应是快速的(t_1/2＝0.5-0.7秒)，并且在配体除去以后是稳定的(图4D)。这些动力学数据(来源于光谱方法)完全与在上述结合放射性配体解离测定中获得的那些动力学数据一致，因而表明PTH(1-34)和PTHrP(1-36)主要结合于PTHR的不同构象。它们还证实了配体中的残基5在有助于这种构象选择性方面的重要作用。

在HKRK-B7细胞中cAMP的测量。假定LR⁰复合物可以异构化成LRG复合物，相对于仅不良地稳定R⁰的配体，配体与R⁰的稳定结合的潜在后果是由该配体诱导的信号反应的延长。为了检查这种可能性，评估了在表达PTHR的细胞中PTH和PTHrP配体产生持续的cAMP反应的能力。因此用配体处理细胞10分钟，洗涤以除去游离配体(unbound ligand)。在洗涤后的不同时间，施加IBMX五分钟，然后测量所得的细胞内cAMP。利用这种方式，仅在最后5分钟IBMX温育时期产生的cAMP是可测量的。图5A的实验比较了在HKRK-B7细胞中由PTHrP(1-36)和Ile⁵-PTHrP(1-36)产生的cAMP反应的时间过程。紧接着在洗出步骤以后，用任何一种配体处理的细胞产生大约相同量的cAMP，其比在未处理细胞中的基底cAMP水平高约100倍。在洗出步骤后两小时，用Ile⁵-PTHrP(1-36)处理的细胞保持cAMP信号能力，其是在配体洗出后立即观测到的信号能力的约50％(图5A)。相反，用PTHrP(1-36)处理的细胞的信号能力在两小时时是初始反应的约19％，因而比针对Ile⁵-PTHrP(1-36)在两小时时所观测到的反应(P≤0.003)小约65％。在每个时间点PTH(1-34)产生反应，其几乎相同于由Ile⁵-PTHrP(1-36)产生的那些反应(P＝>0.05，数据未示出)。因此，由PTH(1-34)和Ile⁵-PTHrP(1-36)诱导的cAMP信号反应的衰减比PTHrP(1-36)诱导的cAMP信号反应的衰减慢约两倍(t_1/2＝约2h与约1h)。针对PTH和PTHrP类似物所观测到的在cAMP信号能力的持续时间方面的这些差异相似于在有GTPγS存在的情况下解离自PTHR的相应放射性配体的速率方面所观察到的差异(图1A-1C)。

在HKRK-B64细胞中的cAMP测量。在HKRK-B64细胞中进一步检查了配体产生持续(或延迟)cAMP信号反应的能力，其中HKRK-B64细胞在比HKRK-B7细胞更生理水平上表达hPTHR(90,000/细胞与950,000/细胞)。时间过程实验表明，在这些细胞中在配体洗出后的60分钟，可以最好地决定配体诱导信号反应的持续时间方面的差异(数据未示出)。在这些实验中，通过同时用配体和IBMX温育细胞10分钟(没有洗出期)来确定对于每种肽的最大响应；然后在配体洗出后60分钟观测到的cAMP反应表示为相应最大响应的百分比。

如在HKRK-B7细胞中，在洗出后的60分钟，PTH(1-34)和Ile⁵-PTHrP(1-36)产生cAMP反应，其分别是在HKRK-B64细胞中它们的相应最大反应的47％和40％(图5B)。在60分钟时，类似物His⁵-PTH(1-34)和PTHrP(1-36)产生反应，其是它们的最大反应的34％和19％。在两小时时由[Aib^1,3,M]PTH(1-15)诱导的反应是其最大反应的23％，因而可比于PTHrP(1-36)诱导的反应(P＝0.7)。当用急性剂量反应信号测定(图7；表6)评估时，呈现相同或可比较活性的不同PTH和PTHrP配体类似物可以在细胞中产生定量上不同累积的信号反应，其很可能是由于配体与受体形成稳定复合物的能力。

表6.PTH和PTHrP配体的cAMP和IP信号性能

a 数据是来自四个实验的平均值(±s.e.m.)；   b 基底camp(未减去)是5.2±0.9pmol/孔

c 数据是来自五个实验的平均值(±s.e.m.)；   d 基底IP值(未减去)是330±8cpm/孔

e，P与.[Nle^8，21，Tyr³⁴]rPTH(1-34)NH₂＝0.02.

在大鼠成骨细胞中cAMP的测量。利用大鼠成骨细胞(ROS17/2.8细胞系；图8)进一步体外检查了某些配体产生cAMP信号反应的能力。在室温和在有IBMX存在的情况下用hPTH(1-28)NH₂、Ala^1,12,Aib³,Gln¹⁰,Har¹¹,Trp¹⁴,Arg¹⁹-hPTH(1-28)NH₂；hPTH(1-34)NH₂、或r(大鼠)PTH(1-34)NH₂处理ROS 17/2.8细胞10分钟，然后通过放射免疫测定来量化所得到的细胞内cAMP。各种肽的EC₅₀值，对于hPTH(1-28)NH₂是7.39 nM；对于Ala^1,12,Aib³,Gln¹⁰,Har¹¹,Trp¹⁴,Arg¹⁹-hPTH(1-28)NH2是0.37 nM；对于hPTH(1-34)NH₂是0.31 nM；以及对于r(rat)PTH(1-34)NH₂是0.021nM。

在小鼠中cAMP的体内血浆测量。对野生型小鼠皮下注射载体(0.9％ NaCl/0.05％吐温-20)、或包含PTH肽的载体，以达到10至1000 nmol/kg体重的浓度。在注射后的指定时间，从尾静脉抽出血液，并通过放射免疫测定来量化在所得的血浆中cAMP的量(图9A-9D)。

对小鼠进一步分析血浆磷酸盐和血清离子化钙浓度的变化。对野生型小鼠皮下注射载体(0.9％ NaCl/0.05％吐温-20)，或包含Ala^1,12,Aib³,Gln¹⁰,Har¹¹,Trp¹⁴,Arg¹⁹-hPTH(1-28)NH₂或hPTH(1-34)NH₂的载体，剂量为50 nmol/kg体重。在注射后的指定时间，从尾静脉抽出血液并确定血浆磷酸盐(图10A)和血清离子化钙(图10B)的浓度。利用Chiron Diagnostics Model 634 Ca⁺⁺/pH分析仪来确定血清离子化钙浓度。利用Phosphorous Liqui-UV测定试剂盒(StanBio Laboratory, Boerne, TX)测量血浆磷酸盐浓度。两种肽导致类似的血清钙的最大增加和类似的血浆磷酸盐的最大减少，但对Ala^1,12,Aib³,Gln¹⁰,Har¹¹,Trp¹⁴,Arg¹⁹-hPTH(1-28)NH₂的反应比对hPTH(1-34)NH₂的反应更长久。

在负鼠肾细胞中的磷酸盐摄取抑制。利用来自肾近端小管的负鼠肾(OK)细胞系评估了磷酸盐摄取的抑制。这些细胞介导由PTH受体配体调节的钠依赖性磷酸盐转运功能。因此，用PTH(1-34)处理OK细胞可抑制它们从培养基摄取磷酸盐。

细胞短暂(10分钟)暴露于A¹,Aib³,M-PTH(1-28)导致对磷酸盐摄取的显著延长的抑制效应，而PTH(1-34)和hPTHrP(1-36)肽呈现磷酸盐摄取抑制的非常短的持续时间(图11)。

在正常大鼠中PTHR配体的药代动力学和高血钙作用。在正常大鼠中研究了iv注射PTHrP(1-36)和[I⁵]-PTHrP(1-36)的药物动力学分布(图12)。PTHrP(1-36)和[I⁵]-PTHrP(1-36)均从循环中快速消失，并且[I⁵]-PTHrP(1-36)的药物动力学分布可比于PTHrP(1-36)的药物动力学分布。

我们还测量了在正常大鼠中静脉内注射PTHrP(1-36)和[I⁵]-PTHrP(1-36)的血钙作用(图13)。在20和80nmol/kg下，PTHrP(1-36)和[I⁵]-PTHrP(1-36)在1小时时将血液离子化钙水平增加至相同程度。在注射PTHrP(1-36)后两小时，血液离子化钙水平下降，但在注射[I⁵]-PTHrP(1-36)后两小时则维持在高水平。因此，[I⁵]-PTHrP(1-36)和PTHrP(1-36)呈现出可比较的药物动力学分布(图12)，但[I⁵]-PTHrP(1-36)呈现出对R⁰PTHR构象更高的结合亲和力(图3和图6)。因此，体内观测到的[I⁵]-PTHrP(1-36)的长期血钙作用可以通过其高R⁰结合亲和力来最好解释。

借助于人PTH受体体外和体内筛选PTH或PTHrP类似物。我们设计并合成了天然PTH-PTHrP杂合类似物，和[A^1,3,12,Q¹⁰,R¹¹,W¹⁴](M修饰)PTH-PTHrP杂合类似物，然后在表达hPTH受体的HKRK-B7细胞中测试了它们的cAMP信号能力。每种天然和M修饰的PTH/PTHrP杂合类似物显示可比于hPTH(1-34)的cAMP信号活性(图25)。我们评估了在COS-7细胞膜中天然或M修饰的PTH和PTHrP杂合类似物对人PTH受体的R⁰和RG状态的亲和力(图26A和图26B)。

在正常和TPTX大鼠中PTH和PTHrP类似物的高血钙作用。利用PTH(1-34)和PTHrP(1-36)作为对照，在正常和TPTX大鼠中，评价了天然和M修饰的PTH-PTHrP杂合类似物的瞬时血钙作用(图13A、图14A、图15A、图15B、图16A、图17A、以及图18A)。I⁵-PTHrP(1-36)、MPTH(1-14)/PTHrP(15-36)、PTH(1-14)/PTHrP(15-36)、PTH(1-18)/PTHrP(19-36)、M-PTH(1-34)显示比PTH(1-34)更高的血钙作用；相反，PTH(1-22)/PTHrP(23-36)和PTH(1-26)/PTHrP(27-36)显示出比PTH(1-34)或PTHrP(1-36)对照肽更弱的血钙作用。还体外测量了与大鼠PTHR的结合。利用延迟cAMP测定证实了信号活性的长度(图13B-13C、图14B-14C、图15B、图16B-16C、图17B-17C、以及图18B)，其清楚地表明了来自体外所示的结合数据的R⁰/RG选择性与体内高血钙作用以及体外延迟cAMP反应之间的相关性。所有这些肽的cAMP信号并没有显著变化(图19A、图19B、图20A、以及图20B)。

材料和方法

以下材料和方法用来进行上述实验。

肽。在图1-3、以及图5-11中所使用的肽由M.G.H.BiopolymerCore facility合成，如在Shimizu et al.,J.Biol.Chem.276:49003-49012(2001)中所描述的。这些肽包括[Nle^8,21,Tyr³⁴]大鼠(r)PTH(1-34)NH₂(PTH(1-34)；[Aib^1,3,Nle⁸,Gln¹⁰,高精氨酸¹¹,Ala¹²,Trp¹⁴,Tyr¹⁵]rPTH(1-15)NH₂([Aib^1,3,M]PTH(1-15)；[Ala^1,12,Aib³,Gln¹⁰,高精氨酸¹¹,Trp¹⁴,Arg¹⁹]人(h)PTH(1-28)NH₂{[Ala¹,Aib³,M]PTH(1-28)}；[Tyr³⁶]hPTHrP(1-36)NH₂{(PTHrP(1-36)}；[Ile⁵,Tyr³⁶]hPTHrP(1-36)NH₂{Ile⁵-PTHrP(1-36)}；hPTH(1-34)NH₂；[His⁵]hPTH(1-34)NH₂；rPTH(1-34)NH₂以及[His⁵]rPTHrP(1-36)NH₂。在FRET分析中使用的hPTH(1-34)COOH肽(自由羧基)(图4)购买自Bachem California(Torrance,CA)。大鼠研究使用了由American Peptide Company,Inc.(California,USA)合成的人PTHRP(1-36)。人PTH(1-34)购买自Peptide Institute Inc(Osaka，日本)。PTH或PTHrP类似物由Sigma Aldrich Japan(Tokyo，日本)合成。将大鼠研究中所用的肽以1mM溶解在10mM乙酸中，然后贮存在-80℃冰箱中。

在图12-16中所使用的肽购买自American Peptide Company,Inc.,California,USA(hPTHrP(1-36)COOH),Peptide Institute Inc.,Osaka，日本(hPTH(1-34)COOH)、或Sigma-Aldrich Japan,Tokyo，日本(PTH/PTHrP杂合类似物)。将所有肽溶解在10mM乙酸中至0.1mM到4mM之间的肽浓度；然后存储在-80℃。通过分析高效液相色谱法(HPLC)、基质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱来证实肽纯度和质量。通过氧化氯胺-T程序并利用Na¹²⁵I(特异性活性：2,200Ci/mmol,Perkin Elmer/NEN Life Science Products,Boston,MA)来制备放射性标记的肽变体，然后通过反相HPLC加以纯化。

细胞培养。在37℃下在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中并在包含5％CO₂的加湿气氛中培养细胞，其中上述培养基补充有10％胎牛血清(HyClone,Logan UT)、100单位/ml青霉素G、以及100μg/ml硫酸链霉素(Invitrogen Corp.Carlsbad,CA)。所使用的表达PTHR的细胞系是HKRK-B7、HKRK-B64、ROS17/2.8、以及HEK-PTHR-cam。借助于用编码人PTHR的质粒DNA(pCDNA1载体，Invitrogen Corp.)的稳定转染，HKRK-B7和HKRK-B64系衍生自猪肾细胞系，LLC-PK1，并且分别以950,000和90,000个PTH结合位点/细胞的近似表面密度表达PTHR(Takasu et al.,J.BoneMiner.Res.14:11-20(1999))。ROS17/2.8细胞是大鼠骨肉瘤细胞(Majeska et al.,Endocrinology107:1494-1503(1980))并且以70,000个PTH结合位点/细胞的近似表面密度表达内源性大鼠PTHR(Yamamoto,I.et al.,Endocrinology122:1208-1217(1988))。通过稳定DNA转染，HEK-PTHR-cam细胞源自HEK-293细胞并且表达人PTHR衍生物(PTHR-cam)，其包含插入在第三胞内环中的Gly³⁹⁵处的青色荧光蛋白(CFP)和插入在羧基末端尾部的黄色荧光蛋白(YFP)(Vilardaga et al.,Nat.Biotechnol.21:807-812(2003))。在T75烧瓶中增殖细胞，然后分到24孔板中用于用完整细胞进行测定，6孔板中用于膜标本，或分到玻璃盖片上用于FRET研究。在6孔板中利用Fugene-6(Roche Diagnostics,Indianapolis IN)和编码PTHR的CsCl纯化的质粒DNA(3μl Fugene，1μg DNA，每孔)瞬时转染COS-7细胞，或用编码PTHR的质粒和负显性Gα_s亚单位Gα_sND(6μl Fugene，1μg每种DNA/孔)共转染COS-7细胞。该Gα_sND亚单位比野生型Gα_s更有效但非生产性地结合于受体(Berlot,C.H.J.Biol.Chem.277:21080-21085(2002))，并且已发现可以增强¹²⁵I-[Aib^1,3,M]PTH(1-15)NH₂放射性配体与细胞膜中PTHR的结合(参见下文)(Dean,T.et al.,J.Biol.Chem.(2006))。

结合研究。利用细胞膜进行结合研究，如在(Dean et al.,MolEndocrinol20(4):931-43(2006))中所描述的。简单地说，在室温下并在膜测定缓冲液(20mM HEPES，pH7.4，0.1M NaCl，3mMMgSO₄，20％甘油，3mg/ml牛血清白蛋白，蛋白酶抑制剂混合物—最终浓度：1mM AEBSF，0.8μM抑肽酶(Aprotonin)，20μM亮肽素，40μM倍司他汀，15μM胃酶抑素A，14μME-64--Sigma-Aldrich Inc.,St.Louis,MO)中温育反应。反应包含20至100μg/mL的总膜蛋白浓度、以及大约150,000cpm/ml的总放射性浓度。如指出的，将未标记肽配体和/或GTPγS(Sigma-Aldrich Inc.St.Louis,MO)加入到反应中。在反应结束时，利用96孔真空过滤板和真空过滤装置(Multi-Screen系统，具有Durapore HV、0.65μM过滤器；Millipore Corp.,Milford,MA)，通过真空过滤来分离结合和自由的放射性配体；然后使空气干燥过滤器与平板脱离，并利用γ计数器来计数γ放射性。

放射性配体解离。在15mL圆底聚苯乙烯保护帽盖管(snap-captubes)(Falcon)(总反应容积＝5.0ml)中作为本体反应(bulk reaction)进行这些研究。预温育膜和放射性配体90分钟以便于复合物形成；然后在有或没有GTPγS(5×10^-5M)的条件下，通过添加过量放射性配体的未标记类似物(5×10^-7M最终浓度)来引发解离阶段。在上述添加以前(t＝0)、以及在其后的连续时间点，抽出0.2ml等分部分(约30,000cpm)并立即通过真空过滤加以处理(如上所述)。在预温育和解离阶段，在包含放射性配体的未标记类似物(5×10^-7M)的平行反应管中，确定非特异性结合。在每个时间点，特异性结合的放射性被计算为在t＝0时特异性地结合的放射性的百分比。

平衡竞争结合和GTPγS抑制。在96孔Multi-Screen真空过滤板的孔中装配和温育用¹²⁵I-[Aib^1,3,M]PTH(1-15)放射性配体进行的结合反应。在上述孔中温育膜、示踪放射性配体、以及各种浓度的未标记配体和/或GTPγS90分钟，其后，通过快速真空过滤来处理反应板以与自由的放射性配体分离(如上所述)。在96孔聚苯乙烯微量滴定板(Falcon，总反应容积＝230μl)中,装配和温育用¹²⁵I-PTH(1-34)放射性配体进行的结合反应，然后在温育结束时被转移到96孔、Multi-Screen真空过滤板的孔中并加以处理(如上所述)。对包含¹²⁵I-PTH(1-34)的反应进行该转移操作以最小化放射性配体与Multi筛选滤膜的非特异性结合。对于两种放射性配体，在包含饱和浓度的放射性配体的未标记类似物的反应中确定非特异性结合。特异性地结合的放射性被计算为在没有竞争配体或GTPγS的条件下特异性地结合的放射性的百分比。

为了评估各种未标记肽配体结合于G蛋白未偶联和G蛋白偶联PTHR构象(分别为R⁰和RG)的能力，膜制备自瞬时转染的COS-7细胞和以下测定条件。为了评估与R⁰的结合，膜制备自用PTHR转染的细胞，其中¹²⁵I-PTH(1-34)作为示踪放射性配体，然后将GTPγS(1×10^-5M)加入到结合反应中。这种结合格式(bindingformat)基于以下前提：通过存在GTPγS，¹²⁵I-PTH(1-34)主要结合于PTHR的R⁰构象，并且这种构象被富集在膜中(相对于RG)(Hoare et al.,J.Biol.Chem.276:7741-53(2001)；Dean et al.,MolEndocrinol(2006))。为了评估与RG的结合，使用了由用PTHR和负显性Gα_S亚单位(Gα_SND)共转染的细胞制备的膜，并且使用¹²⁵I-[Aib^1,3,M]PTH(1-15)作为示踪放射性配体。该结合格式是基于以下前提：通过存在Gα_S ^ND，¹²⁵I-[Aib^1,3,M]PTH(1-15)主要结合于PTHR的RG构象，并且这种构象被富集在膜中(相对于R或R⁰)(Hoare,S.J.Biol.Chem.(2001)；Berlot,C.H.J.Biol.Chem.(2002)；Dean,T.etal.,J Biol.Chem.(2006))。通过在反应中的低浓度(约25pM)的示踪放射性配体，与存在于膜标本中的任何低亲和力PTHR构象(R)的结合的分析被排除。

荧光共振能量转移(FRET)。如所描述的，使稳定表达HEK-PTHR-CFP_IC3/YFP_CT的HEK-293细胞(先前称作HEK-PTHR-Cam细胞(Vilardaga et al.,Nat.Biotechnol.21:807-812(2003))生长在盖玻片上并加以处理用于FRET分析。借助于这些细胞，用紫外光(λ_max.ex＝436nm；λ_max.em.＝480nm)激发PTHR-CFP_IC3/YFP_CT中的CFP(供体)会产生分子内FRET至YFP(受体)，从而导致来自该YFP的发射(λ_max.ex.＝480nm，λ_max.em.＝535nm)。这种FRET反应可观测为在480nm处CFP光发射强度的降低，以及在535nm处YFP光发射强度的增加。FRET信号由在基态受体中的PTHR-CFP_IC3/YFP_CT产生并在激动剂的结合以后降低。将PTH配体加入细胞中，然后利用计算机辅助、电磁阀控制的快速过熔装置(ALA Scientific Instruments,Westbury,NY)从细胞加以洗涤；溶液交换时间为5ms至10ms。利用Zeiss倒置显微镜来监测荧光，其中倒置显微镜装备有100x物镜和双发射光度系统(Til Photonics)，并连接于雪崩光电二极管检测系统和模拟数字转换器(AxonInstruments)。在激发以后在436nm处检测的FRET信号被计算为归一化FRET比：F_YFP(535nm)/F_CFP(480nm)，其中F_YFP(535nm)是在535nm处的发射，校正CFP信号进入YFP通道的溢出，以及F_CFP(480nm)是在480nm处的发射，校正YFP发射进入CFP通道的溢出(最小)。减去由光致褪色引起的荧光发射的变化。

细胞内cAMP的刺激。在用配体处理细胞以后，通过放射免疫测定来测量细胞内cAMP水平，如在(Shimizu et al.,J.Biol.Chem.276:49003-49012(2001))中所描述的。如下评估了在短暂暴露于配体以后在细胞中配体产生延迟cAMP反应的能力。在24孔板中用结合缓冲液(50mM Tris-HCl、pH7.7、100mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl₂、5％热灭活马血清、0.5％热灭活胎牛血清)冲洗细胞然后在室温下并在有或没有肽配体(1×10^-7或3×10^-7M)的结合缓冲液中温育10分钟；然后除去缓冲液，用结合缓冲液洗涤细胞三次，进一步在结合缓冲液中温育不同时间(1至120分钟)；然后用包含IBMX(2mM)的结合缓冲液更换上述缓冲液，并在另外温育5分钟以后，量化细胞内cAMP。通过这种方式，其先前已用于PTH受体(Tawfeek,H.,and Abou-Samra,A.,J.Bone Miner.Res.14:SU444(1999)；Biselo et al.,J.Biol.Chem.277:38524-38530(2002))，仅在最后的包含IBMX的温育阶段产生的cAMP是可测量的，因为在IBMX添加以前产生的cAMP被细胞磷酸二酯酶降解。

在图14的cAMP实验中，以1×10⁵个细胞/孔将HKRK-B7接种在96孔板中并温育过夜。第二天，用200μl的结合缓冲液(50mMTris-HCl、pH7.7、100mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl₂、5％热灭活马血清、0.5％热灭活胎牛血清)洗涤细胞一次，接着在冰上添加100μl的cAMP测定缓冲液(DMEM、2mM IBMX、1mg/ml牛血清白蛋白、35mM Hepes-NaOH、pH7.4)。然后，将50μl的包含不同量的人PTH(1-34)、人PTHRP(1-36)、或PTH类似物(最终容积＝150μl)的结合缓冲液加入到每个孔中，并置于37℃的水浴中，然后温育15分钟。在除去培养基以后，将平板置于粉状干冰上以冻结细胞，然后从干冰去除。用50μl的50mM HCl融化细胞，然后在干冰上再次冻结。借助于商业上可获得的cAMP EIA试剂盒(Biotrack cAMP EIA系统，GE Healthcare)来测量细胞内cAMP的水平。

肌醇磷酸的刺激。在预标记(16小时)有³H-myo-D-肌醇(2μCi/ml)的瞬时转染COS-7细胞中测量细胞内肌醇磷酸(IP)的刺激。用在包含胎牛血清(10％)和LiCl(30mM)的DMEM中的配体处理细胞30分钟；用冰冷三氯乙酸(5％)溶解细胞并通过离子交换过滤从酸裂解液提取IP，如在(Shimizu et al.,J.Biol.Chem.276:49003-49012(2001))中所描述的。

OK细胞方法。在37℃下，用培养基(载体)或包含肽配体(1×10^-7M)的培养基处理细胞10分钟；然后(t＝0)，用培养基冲洗细胞三次并在37℃下单独温育不同时间。然后在每个时间点，将³²PO₄加入到培养基中，并在温育5分钟以后，对细胞进行洗涤，溶解，然后通过液体闪烁计数来计数裂解液的³²Pβ放射性。这些实验的结果示在图11中，作图为在仅用载体处理相同时间的细胞的裂解液中³²P放射性的量的百分比。

体外结合和信号测定的数据计算。处理数据以进行曲线拟合和参数测定，其中利用Microsoft Excel和GraphPad Prism4.0软件包。利用双指数衰减方程来分析解离时间过程数据，除非F检验分析表明单指数方程能提供更好的拟合(Palpha>0.02)。利用具有可变斜率的sigmoidal剂量反应方程来分析来自平衡结合、cAMP和IP剂量反应测定的数据。该分析产生数据的曲线和EC₅₀、IC₅₀(产生一半最大效应的配体浓度)以及E_max(通过配体获得的最大响应)的值。利用“学生”t检验(双尾)统计上比较了成对数据集，其中假设两个集具有不等方差。

在正常大鼠中PTHrP(1-36)和I5-PTHrP(1-36)的药代动力学分析。通过用25mmol/L磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液/100mmol/LNaCl/0.05％吐温80(pH.5.0)(PC缓冲液)进行稀释来调节原液中人PTHRP(1-36)和[I⁵]-PTHrP(1-36)的浓度。紧接着在给予以前，使两种肽静置在冰上。

测量8周龄的雌性SD-IGS大鼠(Charles River Japan,Inc.)的体重。大鼠以10nmol/1ml/kg的剂量接受静脉内给予人PTHRP(1-36)和[I⁵]-PTHrP(1-36)。对于每个肽剂量和/或时间点，将肽给予3只大鼠的组。在给予后的2.5、5、7.5、10、15、30、60、120分钟，通过尾静脉将血液收集在包含EDTA(最终0.2％)和抑肽酶(最终0.6TIU/ml)的管中，以监测在大鼠血浆中人PTHRP(1-36)和[I⁵]-PTHrP(1-36)的浓度的时间过程。对样品进行离心以收集血浆并存储在-80℃下，直到测定人PTHRP(1-36)和[I⁵]-PTHrP(1-36)水平。

利用PTH-RP1-34(人，大鼠)Enzyme Immunoassay试剂盒(Peninsula Laboratories Inc.)，通过EIA分析来确定人PTHRP(1-36)和[I⁵]-PTHrP(1-36)的水平。[I⁵]-PTHrP(1-36)与PTHrP EIA试剂盒交叉反应，并且使用[I⁵]-PTHrP(1-36)作为用于测量血浆中[I⁵]-PTHrP(1-36)水平的标准。

在正常大鼠中人PTH(1-34)、PTHrP(1-36)以及PTH或PTHrP类似物的高血钙作用。如下在正常大鼠中研究了人PTH(1-34)、PTHrP(1-36)、以及PTH或PTHrP类似物的高血钙效应。通过用25mmol/L磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液/100mmol/L NaCl/0.05％吐温80(pH.5.0)(PC缓冲液)进行稀释来调节原液中肽的浓度。在紧接着给予以前，使所有肽静置在冰上。

测量8周龄的雌性SD-IGS大鼠(Charles River Japan,Inc.)的体重。通过尾静脉将血液收集到肝素化毛细管中并利用Ca⁺⁺/pH分析仪(Model634/Bayer Medical Ltd.)来测量血液离子化钙和pH值的基线水平，以给出在pH7.4时每种样品的离子化钙的校正水平。大鼠以1ml/kg的剂量接受静脉内给予每种肽。分别将每种肽给予6只大鼠的组。在给予后1、2、4、或6小时，通过尾静脉来收集血液，以监测经校正的血液离子化钙水平的时间过程。与载体相比，经校正的离子化钙水平的变化的时间过程被表示为平均值+/-标准误差。

统计分析。利用SAS软件通过分析方差(ANOVA)来进行统计分析。利用“学生”t-检验或Dunnett多重检验来确定差异显著性。P<0.05被认为是统计显著的。

在甲状腺甲状旁腺切除术(thyroparathyroidectomy)大鼠中[A^1,3,12,Q¹⁰,R¹¹,W¹⁴]-hPTH(1-14)/PTHrP(15-36)(MPTH14)的血钙作用。五周龄雄性Crl:CD(SD)大鼠获自Charles River LaboratoriesJapan,Inc.(Kanagawa，日本)并在20-26℃和35-75％湿度的标准实验室条件下被驯化1周。大鼠可以随意获得自来水和标准啮齿动物chow(CE-2)，其包含1.1％钙、1.0％磷酸盐以及250IU/100g的维生素D₃(Clea Japan,Inc.,Shizuoka，日本)。

对6周龄大鼠进行甲状腺甲状旁腺切除术(TPTX)。所用TPTX大鼠的选择是基于在利用电极法进行操作以后的24小时或72小时在获自尾静脉放血的样品中的血清离子化钙(iCa)水平(<1.0mM)。基于在手术以后48小时的iCa水平，TPTX大鼠被分为6组，每组5只动物。TPTX-载体组静脉内仅接受载体(10mM乙酸溶液)，以1ml/kg体重的剂量给予尾静脉。将人甲状旁腺激素(1-34)(hPTH(1-34))和M-PTH(1-14)/rP(15-36)(MPTH14)分别以1.25、5、20nmol/kg(3组)和1.25、5nmol/kg(2组)的剂量静脉内注射到TPTX大鼠中。

从尾静脉获得血液，用于检测每次注射以后1、2、4、6、以及24小时的iCa。利用自动分析仪(M-634,Chiba Corning DiagnosticsCo.Ltd.,Tokyo，日本)通过电极法来确定离子化钙水平。

小鼠研究。对野生型小鼠以10至1000nmol/kg体重的剂量水平皮下注射载体(0.9％NaCI/0.05％吐温-20)、或包含PTH肽的载体。在注射后的指定时间，从尾静脉抽出血液，然后通过放射免疫测定来量化在所得的血浆中的cAMP量。如上述测量血清中的离子化钙并通过U.V.光谱试剂盒测定来测量磷酸盐。

动物研究的统计分析。数据表示为平均值±标准误差(SE)。利用SAS(Ver.5.00.010720,SAS Institute Japan,Tokyo，日本)确定了统计显著性。<0.05的p值被认为是统计显著的。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，与TPTX-载体水平，通过Dunnett多重比较检验。

实施例2

在PTH和PTHrP中丙氨酸取代的表征

如上所示，PTH(1-34)具有比PTHrP(1-36)(其偏爱RG构象)更大的结合于R⁰受体构象的能力。为了探索这种差异结合和构象选择性的分子基础，我们比较了在PTH和PTHrP肽的N端和C端区的取代对配体与PTHR的相互作用的影响。不同于在PTH(1-14)中，其中,在位置1、3、10、11、12以及14处的丙氨酸取代会增加cAMP活性，在PTHrP(1-14)中的每个丙氨酸取代会消除在表达PTHR的细胞中的活性。因此，PTH和PTHrP的(1-14)区不同地与PTHR的膜并列(juxtamembrane)(J)区相互作用。PTHrP(1-14)和PTHrP(1-36)，与它们各自的PTH(1-14)和PTH(1-34)配对物相比，对于在表达PTHR(缺少细胞外N端(N)域(delNT))的细胞中的cAMP活性均是更少有效的。因此，与PTH(1-34)活性相比，PTHrP(1-36)活性更主要取决于C端配体区与PTHR N域之间的相互作用。因此我们研究了PTHrP序列的C端区，如在实施例3中所描述的。

实施例3

在PTH(1-28)和PTHrP(1-28)中的C端取代

利用丙氨酸扫描和类型取代策略，我们能够产生这样的肽，与天然PTHrP(1-28)序列相比，其对于RG受体构象具有更大的选择性。我们集中研究了PTHrP序列的C端区，因而对PTH(1-28)(数据未示出)和PTHrP(1-28)的15-28区进行了丙氨酸扫描。PTH(1-28)和PTHrP(1-28)的C端区的Ala扫描分析表明在位置Arg²⁰、Trp/Phe²³、Leu²⁴、以及Leu/Ile²⁸处每种肽的活性很大程度上减小，已知在PTH中形成核心N结构域结合基序。在每种脚手架的多个但不同位置发现了活性的增强：在PTHrP(1-28)中的Leu¹⁸、Phe²²、以及His²⁶，以及在PTH(1-28)中的Asn¹⁶、Glu¹⁹、以及Ala²²。在PTH中的位置16、19、以及22处的丙氨酸取代增加了与delNT(失去N端配体结合域的PTH受体)的结合，而在PTHrP中的位置18、22、26处的那些丙氨酸取代减小了与delNT的结合。因此，在PTH的位置16、19、以及22处的Ala取代的增强效应是经由PTHR J域加以介导的，而在PTHrP的位置18、22、26处的那些Ala取代的增强效应则需要PTHR N域。在PTHrP(1-28)中的位置16、19、22、以及25(对于Ala取代是中性的)处的进一步的类型取代分析导致类似物[Ala^18,22,Leu²⁵,Lys²⁶]-PTHrP(1-28)，与PTH(1-34)以及所观测到的任何PTH或PTHrP肽的最高的cAMP效力和RG结合亲和力相比，该类似物呈现更大的cAMP效力和RG结合亲和力。这种扫描表明了，在位置18、22、25、以及26处的丙氨酸取代均增强了在表达人和大鼠PTHR的细胞中的cAMP活性(图27A和图27B)。在丙氨酸扫描以后，单独用各种氨基酸进一步取代这些位置；发现其中一些会增加cAMP活性(图27C和图27D)。然后我们以不同组合来结合这些突变，从而获得多种具有显著增强活性的PTHrP类似物，如本文描述的。

实施例4

示例性的取代的PTHrP(1-28)肽的表征

使用PTHrP(1-36)、PTHrP(1-28)、A^18,22,K²⁶-PTHrP(1-28)、A^18,22,L²⁵,K²⁶(AALK)-PTHrP(1-28)、E¹⁸,A²²,K²⁶-PTHrP(1-28)、或E¹⁸,A²²,L²⁵,K²⁶(EALK)-PTHrP(1-28)，产生了在SaOS细胞中cAMP生产的剂量反应曲线(图28A)。与亲代PTHrP(1-28)相比，发现了A(E)^18,22,L²⁵,K²⁶-PTHrP(1-28)(AALK或EALK)具有显着增强的cAMP诱导活性。

通过对C57BL/6小鼠(3月龄，雄性)静脉内注射载体、PTHrP(1-36)、PTHrP(1-28)、AALK-PTHrP(1-28)、或EALK-PTHrP(1-28)(n＝3)，体内研究证实了这些增强效应(图28B)。在注射以后10分钟抽出血液并通过RIA来测量cAMP的血浆水平。与wt PTHrP(1-28)相比，在针对AALK-PTHrP(1-28)和EALK-PTHrP(1-28)的小鼠测定中也观测到显着增强。在这些测定中PTHrP(1-36)肽的更大的明显的效力可以反映从血液中更长的肽的更慢的清除。

实施例5

RG选择性肽EALK-PTHrP(1-30)的表征

我们还表征了EALK-PTHrP(1-30)肽对cAMP生产的影响。对三月龄雄性C57BL/6小鼠静脉内注射载体、rPTH(1-34)、M-PTH(1-34)(M＝A¹,Aib³,Q¹⁰,Har¹¹,A¹²,W¹⁴,R¹⁹)、或E¹⁸,A²²,L²⁵,K²⁶-(EALK)-PTHrP(1-30)(5nmol/kg)。在cAMP实验中(图29A)，在注射以后10分钟抽出血液并通过RIA来测量cAMP的血浆水平。在钙实验中(图29B)，在注射前和注射以后1、2、4、以及6小时抽出血液。利用Ca⁺⁺/pH分析仪来测量离子化钙。配体诱导大约相同水平的血浆cAMP，但R⁰选择性配体，M-PTH(1-34)诱导比PTH(1-34)显著更有力和更持久的离子化钙反应。相相反，RG选择性配体，EALK-PTHrP(1-30)诱导的离子化钙反应类似于(如果不低于)PTH(1-34)诱导的离子化钙反应。

进行了第二组实验，其中小鼠每日接受5nmol/kg的rPTH(1-34)、M-PTH(1-34)、或EALK-PTHrP(1-30)的静脉内处理14天。在第6和第13天获取血液样品，并通过ELISA来评估骨转换(PINP、骨钙蛋白以及CTX)的标记。早在第6天，R⁰选择性配体，M-PTH(1-34)强烈诱导骨形成(PINP，图30A和图30B；骨钙蛋白，图30D)和骨吸收(CTX，图30E和图30F)的标记的增加。相反，RG选择性配体，EALK-PTHrP(1-30)增加骨形成标记，并对吸收标记具有相对更小的影响，如在第6天所明显看到的(图30A、图30C、以及图30E)。在所分析的剂量和时间条件下，PTH(1-34)对骨标记仅具有轻微影响。

与对骨标记的影响一致，M-PTH(1-34)强劲增加小梁骨，但还可察觉地减弱皮质骨(图31)，与它的严重的高血钙作用一致(图29B)。相反，EALK-PTHrP(1-30)增加了皮质骨厚度，其中在远端股骨(远端干骺端)中是显著的(图30和表xx)，而没有诱导严重的高钙血症。这些发现说明了，具有不同R⁰/RG选择性的修饰配体对骨代谢具有不同的影响。该发现还表明，RG选择性类似物，如EALK-PTHrP(1-30)，优先刺激骨形成(相对于骨吸收)，并对皮质骨具有有益影响，其中对血液钙水平具有最小影响。M-PTH(1-34)大大增加了在远端股骨干骺端处的小梁骨，但诱导在中股骨骨干处的皮质骨吸收，如通过骨内表面的侵蚀所指明的。

表7示出了在每日用上述肽进行治疗两周以后骨结构参数的量化。如上所述，每日静脉内用载体、rPTH(1-34)、M-PTH(1-34)、或EALK-PTHrP(1-30)对小鼠进行治疗14天。所有类似物显著增加在股骨和腰椎处的骨矿质密度。对于M-PTH(1-34)来说，在远端和中股骨区，皮质壁厚度均显著更低。相反，EALK-PTHrP(1-30)增加了皮质骨厚度，其中在远端股骨中是显著的。

表7.在每日治疗两周以后在小鼠中的骨结构参数

实施例6

EALK-PTHrP肽的最优化

为了最优化EALK-PTHrP肽的活性，我们借助于在29-33区中的取代产生了EALK-PTHrP(1-30)和PTHrP(1-34)变体。在1-30脚手架中，在位置29处Gly、Ser、Leu、Asn、Gln、Trp、Glu、以及Lys被取代；在位置30处Gly、Ser、Leu、Asn、Asp、Trp、以及Lys被取代；以及在位置31处Ser、Leu、Asn、Val、Trp、Glu、以及Lys被取代。在EALK-PTHrP(1-34)中，30-33区被丙氨酸取代，或C端6个氨基酸被PTH(1-34)的对应的区替换。这些更长的肽的预测优点(相对于PTHrP(1-30)脚手架)在于，它们在循环中由于更慢的清除将具有更长的半衰期。因此C端取代被设计成提供增加的链长度，但避免增加R⁰结合亲和力，当安装天然PTHrP(29-34)区时其会发生。测试这些肽在MC3T3-E1细胞中的cAMP活性。如图32A和图32B所示，这些肽中的多个呈现比未取代C端序列更大的活性。

实施例7

在肾磷酸盐转运中Trp¹-M-PTH的表征

为了有助于进一步阐明PTH配体调节肾磷酸盐转运的信号机制，我们开发了M-PTH(1-28)的衍生物，，其对于PLC/PKC信号来说是有缺陷的，然而保留有力的cAMP/PKA信号活性。这样的肽便于研究PKA和PKC信号途径在近端小管(PT)细胞中调节Pi转运蛋白NaPi-IIa和NaPi-IIc的功能和表面表达中的相对作用。类似物M-PTH(1-28)(M＝Ala¹,Aib³,Gln¹⁰,Har¹¹,Ala¹²,Trp¹⁴,Arg¹⁹)，一种有力的用于cAMP和IP₃信号途径的激动剂，当被注入到小鼠中时，会诱导延长的低磷酸盐血症和高血钙效应。该类似物还在经注射的小鼠的肾PT细胞的刷状缘膜和细胞质室中诱导NaPi-IIa免疫反应性的延长的减小。

为了损害PLC信号，我们在M-PTH(1-28)的位置1处用色氨酸替换丙氨酸，这是根据Bisello以及同事的发现(J Biol Chem277:38524-30,2002)，其表明在该位置这样的庞大的取代会选择性地损害PLC信号。在用大鼠PTHR瞬时转染的HEK-293细胞中，Trp¹-M-PTH(1-28)和M-PTH(1-28)大约同样有力地刺激cAMP形成，但与亲代肽相比至少100倍较小有力地刺激IP₃形成。Trp¹-M-PTH(1-28)保留在MC3T3-E1细胞中在配体洗出后产生延长的cAMP反应的能力，如在MPTH(1-28)的情况下所看到的。当被注入到小鼠(20nmol/kg)中时，与PTH(1-34)的影响相比，Trp¹-M-PTH(1-28)，与M-PTH(1-28)一样，会诱导血浆磷酸盐水平的延长的抑制：对于每种类似物，在2h具有最大抑制；恢复到载体对照水平，对于PTH(1-34)为4h，以及对于M-PTH(1-28)和Trp¹-M-PTH(1-28)为6h。在经每种肽治疗的小鼠中在2h时，在肾PT细胞中的尖端和细胞质NaPi-IIa染色被减少，但在6h时染色恢复到载体对照水平(借助于PTH(1-34))的情况下，在用M-PTH(1-28)或Trp¹-M-PTH(1-28)治疗的小鼠中，它仍然减少至少6小时。在用M-PTH(1-28)治疗的小鼠中，在4至6h的间隔期间，在肾PT细胞中NaPi-IIc的免疫染色被减少，但在用Trp¹-M-PTH(1-28)或PTH(1-34)治疗的小鼠中则没有变化。M-PTH(1-28)抑制在早期通道LLC-PK1细胞(NHERF-1/ezrin阳性)中的³²P摄取，其中上述细胞被病毒性转导以表达NaPi-IIc转运蛋白和大鼠PTHR(Mahon,AmJ Physiol Renal Physiol.294:F667-75(2008))，但Trp¹-M-PTH(1-28)未能抑制这种活性。该发现表明，肾Pi转运的PTHR介导调节涉及，作为一种成分，NaPi-IIa向下调节(down regulation)的cAMP/PKA依赖性控制，以及，作为另一种成分，也许更慢和次要的成分，NaPi-IIc向下调节的PLC依赖性控制。

实施例8

在TPTX大鼠中M-PTH(1-14)/PTHrP(15-36)对血清和尿钙和磷酸盐的影响的表征

我们还研究了M-PTH(1-14)/PTHrP(15-36)杂合肽(SP-PTH)对血清和尿钙和磷酸盐的影响。将PTH(1-34)以1.25nmol/kg单次静脉内注入经受甲状腺甲状旁腺切除术的(TPTX)大鼠中会在1小时时瞬时增加血清钙(sCa)并降低血清磷(sPi)水平，但当到6小时时水平恢复到注射前条件时，不会达到正常范围(分别为图33和图35)。PTH(1-34)并没有在0-6小时内改变尿钙(图34)或尿磷酸盐水平(图36)。相比之下，以1.25nmol/kg给予SP-PTH会在6小时内增加sCa和降低sPi至正常水平，并且这些水平会保持24小时。在0-6小时，SP-PTH会降低尿钙并增加尿磷酸盐水平。这些结果表明，SP-PTH可以在TPTX大鼠中使低钙血症正常化而没有引起高钙尿症，因而表明，该肽可以用来治疗甲状旁腺功能减退并具有肾并发症的降低风险。

实施例9

利用PTH或PTHrP类似物进行cAMP刺激

HKRK-B，其是以9.5×10⁵/细胞的水平过度表达人PTH1受体的LLC-PK1细胞，用于cAMP信号测定。在37℃下，在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中并在包含5％CO₂的加湿气氛中，培养这些细胞，其中上述培养基补充有10％胎牛血清(Hyclone)、100单位/ml青霉素G、以及100μg/ml硫酸链霉素(Invitrogen Corp)。人PTHRP(1-36)由American Peptide Company,Inc.(California,USA)加以合成，人PTH(1-34)购买自Peptide Institute Inc.(Osaka，日本)，并且通过Sigma Aldrich Japan(Tokyo，日本)来合成PTH或PTHrP类似物(Mc-PTH(1-34)、[A¹,A³,A²³,Q¹⁰,R¹¹]-hPTH(1-34)、[A¹,A³,A²³]-hPTH(1-34)、以及[A¹⁸,A²²,L²⁵,K²⁶]-PTHrP(1-28))。以1mM将所有肽溶解在10mM乙酸中，并存储在-80℃。如以上针对HKRK-B7细胞所描述的，进行cAMP刺激测定。PTH(1-34)和PTHrP(1-36)用作对照。在37℃下并在有IBMX存在的情况下，用不同浓度的配体处理细胞15分钟。EC₅₀和Emax值报告在表8中。所有具有C端修饰的M修饰的PTH类似物显示与hPTH(1-34)可比较的cAMP信号(图37)。

表8

实施例10

短效PTH肽在治疗骨质疏松症中的应用

将短效肽，如上面所描述的那些短效肽，给予患有骨质疏松症的患者。通常，在通过间歇性i.v./i.m.或皮下注射来治疗骨质疏松症的情况下，给予的剂量在100至1200单位(μg)/天的范围内。

用于给予这些化合物和组合物的确切剂量和方案将必然取决于待治疗个体的需要、治疗类型、痛苦或需要的程度、以及，当然，医生的判断。通常，肠外给予需要比其它给予方法(其更依赖于吸收)更低的剂量。

实施例11

长效PTH肽在治疗PTH缺乏症中的应用

将长效肽，如上面所描述的那些长效肽，给予患有与PTH缺乏症有关的疾病的患者。这些疾病的实例包括与瘤样钙质沉着症有关的高磷酸盐血症、早期慢性肾疾病以及甲状旁腺功能减退。待给予的肽的每日剂量取决于适应症。通常，在每日i.v./i.m.或皮下注射的情况下，优选为300-2400单位(μg)/天。

用于给予这些化合物和组合物的确切剂量和方案将必然取决于待治疗个体的需要、治疗类型、痛苦或需要的程度、以及，当然，医生的判断。通常，肠外给予需要比其它给予方法(其更依赖于吸收)更低的剂量。

其它实施方式

本说明书中提及的所有专利、专利申请、以及出版物均以引用方式结合于本文，如每一个独立的专利、专利申请、或出版物明确并单独指出的相同程度以引用方式被结合。分别于2007年8月1日、2007年8月2日、以及2007年8月6日提交的美国临时申请第60/963,117、60/963,082、以及60/963,867号以引用方式结合于本文。

Claims (17)

1.一种多肽、或其药用盐，结合PTH受体并且对于所述PTH受体的R⁰形式具有高亲和力，包含式PTH(1-X)/PTHrP(Y-36)，其中X是11-30的整数而Y是X+1，其中所述PTH(1-X)表示人PTH序列的氨基酸1至X而所述PTHrP(Y-36)表示人PTHrP序列的氨基酸Y至36，且其中所述多肽可选地包括以下突变中的一个或多个：位置1处的Ala；位置3处的Ala或Aib；位置5处的His；位置10处的Gln；位置11处的Arg或高精氨酸；位置12处的Ala；位置14处的Trp；以及位置19处的Arg或Glu。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽在位置1和12处具有Ala；在位置3处具有Ala或Aib；在位置10处具有Gln；在位置11处具有Arg或高精氨酸；在位置14处具有Trp；以及在位置19处具有Arg。

3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述多肽在位置1、3和12处具有Ala；在位置10处具有Gln；在位置11和19处具有Arg；以及在位置14处具有Trp。

4.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽是M-PTH(1-14)/PTHrP(15-36)(#1161)。

5.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽是M-PTH(1-18)/PTHrP(19-36)(#1163)。

6.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽是M-PTH(1-17)/PTHrP(18-36)(#1162)。

7.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽是M-PTH(1-11)/PTHrP(12-36)(#1160)。

8.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽具有羟基基团或在其C端被酰胺化。

9.一种药物组合物，包括权利要求1-8所述的多肽和药用载体。

10.一种用于治疗受治疗者体内的疾病或病症的方法，所述疾病或病症选自由甲状旁腺功能减退、高磷酸盐血症、瘤样钙质沉着、以及骨质疏松症组成的组，所述方法包括以足以治疗所述疾病或病症的量将权利要求1-9中任一项所述的多肽给予需要其的受治疗者。

11.一种用于治疗需要骨折修复、或患有骨软化、关节炎、血小板减少、或需要干细胞转移的受治疗者的方法，包括以足以修复所述骨折、治疗所述疾病、或转移干细胞的量将权利要求1-9中任一项所述的多肽给予所述受治疗者。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，给予的途径选自由皮下、静脉内、鼻内、经肺、经皮、以及口服组成的组。

13.一种核酸，包括编码权利要求1-8中任一项所述的多肽的序列。

14.根据权利要求13所述的核酸，可操作性地连接于启动子。

15.一种载体，包括权利要求13所述的核酸。

16.一种细胞，包括权利要求15所述的载体。

17.一种制备多肽的方法，包括在表达所述多肽的条件下生长权利要求16所述的细胞。