JPH0499793A - フェニトイン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、−形式 で表されるフェニトイン誘導体 （式中、ｍはＯ〜８、ｎは０〜８であって、ｍ十ｎは少
なくとも２以上を有する。Ｐｈはフェニル基、Ｘは　−
〇−、−Ｎ−又は−ＣＨ２−で表され（式中、 ｍはＯ〜８、 ｎは０〜８であって、 ｍ＋ ｎは少なくとも２以上を有する。ＰｈはフェニルＺは水
素原子又は水酸基であり、Ｍはアルカリ金属イオン、ア
ルカリ土類金属イオン又はアンモニウムイオンである）
で表されるフェニトイン誘導体に関する。

本発明の前記−形式（１）で表されるフェニトイン誘導
体で標識されたＤＮＡ又はＲＮＡは、特定の核酸（ＤＮ
Ａ又はＲＮＡ）配列検出に有効に利用できる。

【従来の技術〕

核酸を用いた診断は、遺伝子や感染症等の病因となる異
変や病原体を核酸のレベルで検出する方法であり、病気
の発症前の診断や早期診断に有効な手段である。この診
断には、標識ＤＮＡプローブ又は標識ＲＮＡプローブが
使用されており、この標識物を作るために３１ｐ、　　
１１５７等の放射性同位元素及び非放射性物質であるビ
オチン、ジコキシゲニン等の化合物が用いられている。

ここで放射性同位元素は微量な核酸を鋭敏に検出するた
めの方法に用いられるが、・特別な取扱い施設、設備が
必要であり、廃棄物の処理にも規制がなされている。ま
た放射性同位元素である３２Ｐ、Ｉｔ％Ｉは半減期が短
く短期間で使用できなくなるという欠点を有していた。

それらの欠点を克服するために放射性同位元素の代りに
非放射性のビオチン、ジコキシゲニン等を標識物として
用いる様になったものである。

より具体的には、ビオチンとデオキシウリジン誘導体と
を結合させたビオチンデオキシウリジントリホスフェー
ト誘導体（以下ビオチンｄＵＴＰと省略する）（Ｐ、Ｒ
，Ｌａｎｇｅｒ　ｅｔ　ｃｅｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｈ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７８．６６３３（１
９８１）、Ｂ、Ｒｉｇａｓ　ｅｔａｌ、、　１ｂｉｄ　
８３．９５９Ｈ１９８６）、Ｐ、Ｓ、　Ｎｅ１ｓｏｎ　
　ｅｔａｌ、＋　Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　３．２３３（１９８６）等参照
）及びジコキシゲニンとデオキシウリジン誘導体とを結
合させたジコキシゲニンデオキシウリジントリホスフエ
ート誘導体（以下ジコキシゲニンｄＵＴＰと省略する）
（特表平１５０３６４７号参照）が知られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

非放射性物質を標識物として導入する試薬であるビオチ
ンｄＵＴＰ及びジコキシゲニンｄＵＴＰは、特別な使用
設備がいらず、安定して保管し使用することができる試
薬である。

このビオチンｄＵＴＰは酵素反応によりＤＮＡに導入し
、酵素標識したアビジンを反応させたのち、酵素反応に
よる発色、発光等を検出する方法に用いることができる
。

具体的には検体中のウィルスＤＮＡ又はＲＮＡの直接検
出に対して用いられるが、測定中非特異反応がしばしば
みとめられ、実際の測定には充分な前処理操作を必要と
するなど問題点を有していた。

また、ジコキシゲニンｄＵＴＰは、酵素標識した抗ジコ
キシゲニン抗体とともに用いられ、ビオチンｄＵＴＰと
同様に測定に供することができる。

このジコキシゲニンｄＵＴＰを用いる方法はビオチン−
アビジン系にみられる非特異反応はあまり認められない
ものの、感度低下を起すことがある。一つの理由として
ジゴキシゲニンがハプテンとしては比較的高分子である
ためジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブと検体ＤＮＡの
ハイブリダイゼーションが阻害されて、結果として感度
の低下につながると考えられる。

〔問題を解決するための手段〕

そこで、前記した問題点である非特異反応を抑え、高感
度な測定を擾供するため、本発明者はＤＮＡ又はＲＮＡ
診断における標識物として使用することのできる前記−
形式（１）で表されるフェニトイン誘導体を見い出した
。

またこのフェニトイン誘導体で標識されたＤＮＡ又はＲ
ＮＡは、本願発明者が特開平２−１３８９９２号に開示
したフェニトインに対するモノクローナル抗体と組合せ
た測定法により発明を達成することができる。

前記−形式（１）で表されるフェニトイン誘導体は、例
えば式−Ｉに示す各反応工程により製造することができ
る。

（第５工程） （第２工程） （ＩＶ） （Ｖ） （Ｖｌ） （式中、Ｘｌは保護されたアミノ基又は保護された水酸
基であり、Ｘ２はハロゲン原子、ｐ−）ルエンスルホン
酸基又は、メタンスルホン酸であり、ｍ、ｎ、Ｘ、Ｙ、
Ａ、Ｚ及びＭは前記と同じである。） 〔第１工程〕 本工程は、前記−形式（ｎ）で表されるアルコール化合
物をハロゲン化、トシル化又はメシル化し一般式（Ｉ［
［）で表されるハロゲン化物、トシル化物又はメシル化
物を製造する工程である。

本工程を実施するためには、塩化チオニル、臭化チオニ
ル等のハロゲン化チオニル、五塩化リン、五臭化リン、
オキシ塩化リン等のハロゲン化リン誘導体、ｐ−トルエ
ンスルホニルクロライド、Ｐ−トルエンスルホニルブロ
マイド、メタンスルホニルクロライド、メタンスルホニ
ルブロマイド等のスルホン酸誘導体を用い、前記−形式
（ＩＩ）で表されるアルコールとの反応により製造する
ことができる。本反応は無溶媒又は不活性溶媒中行なう
ことが好ましく不活性溶媒を使用する場合には例えば塩
化メチル、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素、ベン
ゼン、トルエン等の芳香族炭化水素、等を挙げることが
できる。

反応は一５〜５０°Ｃの範囲で行うことができる。

この第１工程を実施するために用いられる原料である前
記−形式（ＩＩ）で表されるアルコール化合物は、アミ
ノアルコール又はジオール化合物、具体的にはエチレン
グリコール、プロピレンクリコール、ブタン−１，４−
ジオール、ペンタン−１，５−ジオール、ヘキサン−１
，６−ジオール、ヘプタン−１，７−ジオール、オクタ
ン−１，８−ジオール、アミノエタノール、３−アミノ
プロパツール、４−アミノプタノール、５−アミノペン
タノール、６−アミノヘキサノール、７−アミノアルコ
−ル、８−アミノオクタツールのアミノ基又は水酸基の
保護されたアルコール化合物である。ここでアミノ基の
保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジル
オキシカルボニル基、フタロイル基等を挙げることがで
きる。また水酸基の保護基としては、アセチル基、メト
キシエチル基、テトヒドロピラニル基等を挙げることが
できる。

前記−形式（ｎ）で表されるアルコール化合物は、不活
性溶媒中、前記アミノアルコール又はジオール化合物と
保護基となるアルコールとの縮合反応により製造するこ
とができる。

〔第２工程〕 本工程は、第１工程で得られた前記−形式（Ｉ［［）で
表されるハロゲン化物、トシル化物又はメシル化物とフ
ェニトイン（５，５−ジフェニル−２，４−イミダゾリ
ジンジオン）との反応により前記−形式（ＩＶ）で表さ
れるフェニトイン誘導体を製造する工程である。

本工程の反応は、溶媒中塩基の存在下行うことが好まし
く、塩基としては例えば炭酸カリウム、炭酸ナトリウム
、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナト
リウム、水酸化カリウム等を使用することができる。塩
基の使用量は、前記−形式（ＩＩＩ）の化合物に対して
少なくとも当量であり、１〜３当量の範囲であることが
好ましい。

反応は溶媒中行うことが好ましく、例えばジメチルホル
ムアミド（ＤＭＦ）等のアミド類、ジエチルエーテル、
テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン等
のエーテル類λベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香
族炭化水素類、等の不活性溶媒を単独又は混合して使用
することができる。

反応は０〜１５０°Ｃの範囲で効率よく行うことができ
る。

また、第１工程及び第２工程は、途中で前記−形式（ｎ
［）で表される化合物を単離することなく一連の反応と
して行うこともできる。

［第３工程〕 本工程は前記−形式（ＩＶ）で表されるフェニトイン誘
導体の保護基を除去し、前記−形式（Ｖ）で表されるフ
ェニトイン誘導体を製造するものである。保護基を除去
する反応は、不活性溶媒中酸の存在下行うことができ、
この酸として例えばトリフルオロ酢酸を挙げることがで
きる。

酸の使用量は、前記−形式（ＩＶ）で表されるフェニト
イン誘導体に対して１０−１００当量の範囲であること
が好ましい。

反応は、溶媒中行うことが好ましく、例えば塩化メチレ
ン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素
類、等の不活性溶媒を使用することができる。

反応は一５〜３０°Ｃの範囲で効率よく行うことができ
る。

（第４工程〕 本工程は前記−形式（Ｖ）で表されるフェニトイン誘導
体とカルボン酸化合物との反応により前記−形式（Ｖｌ
）で表されるカルボン酸誘導体を製造するものである。

前記−形式（Ｖｌ）で表されるカルボン酸誘導体カルボ
ン酸誘導体の製造の際には、カルボン酸化合物としてカ
ルボン酸無水物を用いることができる。カルボン酸無水
物としては、炭酸数２〜８の飽和脂肪族ジカルボン酸、
具体的には無水シュウ酸、無水マロン酸、無水コハク酸
、無水グルタル酸、無水アジピン酸等を挙げることがで
きる。

本工程の反応は溶媒中前記−形式（Ｖ）で表されるフェ
ニトイン誘導体とカルボン酸無水物を混合し実施するこ
とが好ましく、溶媒として例えばジメチルホルムアミド
、ジメチルアセトアミド等のアミド類等の不活性溶媒を
使用することができる。

反応は一５〜３０°Ｃの範囲で効率よく行うことができ
る。

前記−形式（Ｖｌ）で表されるカルボン酸誘導体におい
て、Ｙが−ＣＨｌ−で表される基であるカルボン酸誘導
体の製造の際には、カルボン酸化合物としてハロゲン化
カルボン酸を用いることができる。ハロゲン化カルボン
酸としては、炭素数２〜７のクロル原子、プロ広原子、
ヨード原子により置換されたカルボン酸であり、具体的
には、クロル酢酸、ブロム酢酸、ヨード酢酸、３−クロ
ルプロピオン酸、３−ブロムプロピオン酸、４−クロル
酪酸、４−ブロム酪酸、５−クロル吉草酸、５−フロム
吉草酸、６−クロルヘキサン酸、６−フロムヘキサン酸
、７−クロルへブタン酸、７−ブロムへブタン酸、等を
挙げることができる。

反応は、溶媒中塩基の存在下行うことが好ましく、塩基
としては、例えば炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸
水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カリウム、
水酸化ナトリウム等の無機塩基、ピリジン、トリエチル
アミン等の有機塩基等を使用することができる。

塩基の使用量は、前記−形式（ＩＩ［）の化合物に対し
て少なくとも当量であり、１〜３当量の範囲であること
が好ましい。反応は溶媒中行うことが好ましく、例えば
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等のアミド類、ジエチ
ルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメト
キシエタン等のエーテル類、ベンゼン、トルエン、キシ
レン等の芳香族炭化水素類、等の不活性溶媒を単独又は
混合して使用することができる。

反応は０〜１５０°Ｃの範囲で効率よく行うことができ
る。

また、ハロゲン化カルボン酸は、このカルボキシル基を
エステル結合により保護したのち、前記反応を同様に行
った後、脱保護反応により前記−形式（Ｖｌ）で表され
るカルボン酸誘導体を製造することもできる。

〔第５工程〕 本工程は、前記−形式（ＶＩ）で表されるカルボン酸誘
導体と前記−形式（■）で表されるウリジン誘導体との
縮合反応を行い、前記−形式（Ｉ）で表されるフェニト
イン誘導体を製造するものである。

この縮合反応は、縮合剤の存在下行うことが好ましく、
例えばＮ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣ
Ｃ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）等のカルボジイミド
試薬を使用することができる。

反応は溶媒中実施することが好ましく、例えばクロロホ
ルム、ジクロルメタン等のハロゲン化炭化水素類、酢酸
エチル等のエステル類、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
、ジメチルスルホキシド等の極性有機溶媒、ジオキサン
、テトラヒドロフラン等のエーテル類、メタノール、エ
タノール等のアルコール類、ピリジン、水等の溶媒、又
は、これらの混合物中で行うことができる。

反応温度は、一般に使用される約−３０°Ｃ〜約５０°
Ｃの範囲で行うことができる。

また本工程で使用するジカルボン酸無水物の代わりにジ
カルボン酸又は一つのカルボキシル基を保護基により保
護したジカルボン酸誘導体を用い前記−形式（Ｖ）で表
されるフェニトイン誘導体との反応を行い、前記−形式
（Ｖｌ）で表されるカルボン酸誘導体を製造することも
できる。この反応は縮合剤の存在下に行うことが好まし
く、Ｄｅｃ、ｗｓｃ等のカルボジイミド試薬を使用する
ことができ、各種不活性溶媒中で製造することができる
。

カルボキシル基の保護基としては、メチル基、エチル基
、ベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｔ−ブチル基、
シクロヘキシル基等を挙げることができる。保護したジ
カルボン酸誘導体を用い反応を行ったときには保護基を
脱離したのち、次の工程に用いることができる。

保護基の脱離方法としては、例えば、塩化水素、無水フ
ン化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスル
ホン酸、トリフルオロ酢酸、又は、これらの混合物等に
よる酸処理が挙げられるが、この他に、液体アンモニア
中ナトリウム、パラジウム炭素による還元等も挙げられ
る。

また本工程で使用する前記−形式（Ｖｌ）で表されるカ
ルボン酸誘導体は、各種カルボキシル基の活性体とした
後、前記−形式（■）で表されるウリジン誘導体との反
応を不活性溶媒中行い、前記−形式（１）で表されるフ
ェニトイン誘導体を製造することができる。

カルボキシル基の活性化誘導体としては、例えば、対応
する酸無水物、アジド化合物、活性エステル化合物であ
る。活性エステル化合物としては例えばペンタクロロフ
ェノール、２．４−ジニトロフェノール、シアノメチル
アルコール、Ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシ−
５−ノルボルネソー２．３−ジカルボキシイミド、Ｎ−
ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミ
ド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール等のアルコール
とのエステルが挙げられる。

本工程で使用する前記−形式（■）で表されるウリジン
誘導体は市販の化合物であり、Ｚが水素原子のときデオ
キシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）誘導体、Ｚ
が水酸基のときウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）誘
導体である。また、Ｍはアルカリ金属イオン、アルカリ
土類金属イオン又はアンモニウムイオンである。アルカ
リ金属イオンとして具体的には、リチウム、ナトリウム
、カリウム等を挙げることができ、アルカリ土類金属と
して具体的にはマグネシウム、カルシウム、バリウム等
を挙げることができる。前記−形式（■）で表されるデ
オキシウリジン誘導体及びウリジン誘導体として具体的
には５−（３−アミノ１−プロペニル）−２′−デオキ
シ−ウリジン−５’　−）リホスフエート　テトラアン
モニウム塩、５−（３−アミノ−１−プロペニル）−２
′デオキシ−ウリジン−５′−トリホスフェートテトラ
ナトリウム塩、５−（３−アミノ−１−プロペニル）−
２′−デオキシ−ウリジン−５′トリホスフエート　テ
トラカリウム塩、５−　（３−アミノ−１−プロペニル
）−２’−ウリジン−５′−トリホスフェート　テトラ
アンモニウム塩、５−（３−アミノ−１−プロペニル）
−２′−ウリジン−５′−トリホスフェート　テトラナ
トリウム塩、５−（３−アミノ−１−プロペニル）２′
−ウリジン−５′−トリホスフェート　テトラカリウム
塩等を挙げることができる。

このように各工程により製造された各種化合物は、反応
後それ自体公知の分離手段、例えば抽出、再沈澱、再結
晶、各種クロマトグラフィー等によって得ることができ
る。

また−形式 （式中、Ｐｈ、ｍ、ｎ、Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＭは前記と同じ
である）で表されるフェニトイン誘導体において、フェ
ニトイン分子と核酸の塩基部分との結合鎖の長さｌは、
フェニトイン部分と対応する抗体との結合をしやすくす
るため、さらには核酸へ導入し標識核酸プローブを効率
よく製造するため、炭素原子、窒素原子、酸素原子を含
んだ原子数として９〜２３の範囲であり、好ましくは１
１〜１７の範囲である。

フェニトイン標識された核酸プローブの製造方法は、従
来の標識核酸製造方法に前記−形式（１）で表されるフ
ェニトイン誘導体と各種ポリメラーゼとを用いることに
より製造することができる。

フェニトイン標識ＤＮＡプローブは、従来の標識ＤＮＡ
製造方法に従い製造できる。具体的にはニックトランス
レーション法（例えばＪ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、■、　２３７（１９７７）参照）、ランダ
ム又はプライムトラベル法（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏ　Ｃｈ
ｅｍ、＋　１３２＋　６（１９８３）参照）、フィルイ
ン法等であり、ここで使用することのできるポリメラー
ゼはＤＮＡポリメラーゼであり、例えば大腸菌のＤＮＡ
ポリメラーゼ１１バクテリオフアージＴ４　　ＤＮＡポ
リメラーゼ、マウスやヒトなどの細胞由来のＤＮＡポリ
メラーゼα及びβ、単純ヘルペスＤＮＡポリメラーゼ等
を挙げることができる。

同様に、逆転写法（例えば、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｍ、。

■３　、２４７１〜２４Ｂ２　（１９７８）参照）に逆
転写酵素、具体的にはラウス関連ウィルス２、エビアン
ミニロブラスト−シスウィルス等の酵素を用いる方法、
テーリング法に例えばウシ胸腺由来のターミナルトラン
スフェラーゼ（ジ　エンザイム（ＴｈｅＥｎｚｙｍｅｓ
　　；　　Ｂｏｇｅｒ　　Ｐ、Ｄ、ｇ）　　１０．　　
１４５〜１７Ｈ１９７１）参照）等の酵素を用いる方法
により製造することができる。

また、フェニトイン標識ＲＮＡプローブは、従来の標＠
ＲＮＡ製造方法に従い製造することができる。具体的に
は転写法（例えば、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、。

１６６　、４７７（１９８３）参照）でありここで使用
することのできるポリメラーゼはファージ・ＲＮＡ・ポ
リメラーゼであり例えばファージ５Ｐ−６、Ｔ７又はＴ
３のＲＮＡポリメラーゼ等を挙げることができる。

フェニトイン標識ＤＮＡプローブを用いた測定は、例え
ば検体中のウィルス病原菌等のＤＮＡ鎖を一本鎖に変成
後、固相に固定し、製造したフェニトイン標識ＤＮＡプ
ローブをハイブリダイゼーションし、前記フェニトイン
と結合可能な酵素標識抗フェニトイン抗体との反応を行
い、さらに酵素に対する基質を加え、その発色量、蛍光
量、発光量等を測定する通常の酵素免疫測定法（石川栄
治著「酵素免疫測定法」弁室出版等参照）の方法に従い
行うことができる。

前記抗体としては、フェニトイン・に対する抗体であり
、この抗体を用いた酵素標識抗体は公知の方法（石川栄
治著、「酵素免疫測定法」弁室出版等参照）によって製
造できる。フェニトインに対する抗体は、例えばモノク
ローナル抗体として特開平２−１３８９９２号に開示さ
れ、微工研菌寄第１０３８９号であるパイブリドーマよ
り得ることができる。また、この抗体は分解されたＦａ
ｂ　、　Ｆａｂ’等であってもよい。

使用する酵素としてはアルカリホスファターゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、パーオキシダーゼ等を用いることがで
きる。酵素に対する基質としては、使用する酵素に対し
て種々選択することができ、例えば発色法ではアルカリ
ホスファターゼに対して、５−プロモー４−クロロ−３
−インドリルホスフェートを用いることができ、化学発
光法ではアルカリホスファターゼに対し、３−　（２’
−スピロアタマンタン）−４−メトキシ−４−（３“ホ
スホリロキシ）−フェニル−Ｌ２−ジオキセタン　ニナ
トリウム塩（以下ＡＭＰＰＤと省略する）等を用いるこ
とができる。発色量、蛍光量及び発光量の測定は、フィ
ルムを感光させ目視でもよく、さらに機器を使用する場
合には分光光度計、フォトンカウンター、デンシトメー
ター、ＣＬリーダー等を使用することができる。

測定対象物としては、Ａ型、Ｂ型及びＣ型肝炎ウィルス
、ＨＴＬＶ−１，ＨＩＶ−１及び■型等のウィルス類、
各種病原菌、また遺伝子性疾患の遺伝子等を挙げること
ができる。

〔実施例〕

以下本発明を実施例及び参考例によりさらに詳細に説明
する。

ｍ土　フェニトインｄＵＴＰの合成 （１）６−ｔ−ブトキシカルボニルアミノヘキサノール
の合成 ＨＪ−（ＣＨｚ）ｈ−ＯＨ＋　　ＢＯＣ−ＯＮ　　　−
一−−−→ｔ−ＢｕＯＣＮＨ−（ＣＨｚ）　６−０Ｒ６
−アミノ−１−ヘキサノール４ｇ（３４，１ｍｍｏｌ）
をクロロホルム３０Ｉｌｌに溶解し氷冷し、クロロホル
ム２０＋＋＋ｊ！に溶解した”ｔｇの２−（ｔブトキシ
カルボニルオキシイミノ）−２−フェニルアセドリル（
ＢＯＣ−ＯＮ）を加え水冷にて１６時間反応した。クロ
ロホルムを留去しシリカゲルカラムにて分離精製し、標
記化合物６．５９　ｇを得た。収率８９％。

（２）３−（６−ｔ−ブトキシカルボニルアミノヘキシ
ル）フェニトインの合成 ３−（６−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサノー
ル０．８７ｇ（４ｍｍｏ１）をピリジン３　ｖａｎに溶
かし氷冷し、塩化ｐ−トルエンスルホニル０．９１５　
ｇを加え２．５時間反応した。反応後、氷水１００ｍＮ
に入れ酢酸エチルで３回抽出し、有機層を５％炭酸水素
ナトリウム水溶液で３回、５％クエン酸水溶液で３回洗
浄し、乾燥後、溶媒を留去した。この生成物を２　ｖａ
１ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）に溶かし、フェニ
トイン（５，５−ジフェニル−２，４−イミダゾリジン
ジオン）　０．５０４、ｇを３ｍｆＤＭＦに溶かし混合
し炭酸カリウム０、４９　ｇを加え９０°Ｃで６０分反
応した。反応後、反応物を水に入れ酢酸エチルで３回抽
出し、有機層を５％クエン酸で１回、水で３回洗浄し乾
燥した。生成物の分離精製はシリカゲルカラムにより行
い標記化合物０．８ｇを得た。収率４４％。

ｎｍｒ　　Ｃδ；　１．３１　（ｍ、　　４Ｈ）　、　
　１．４１　（ｓ。

９Ｈ）、１．６１　（ｍ、４Ｈ）、３．０５　（ｍ、２
Ｈ）。

３．５７　（ｔ、２Ｈ）、４．５０　（ｂｓ、ＩＨ）。

６．２４　（ｂｓ、ＬＨ）、７．３６　（ｓ、ｌ０Ｈ）
）（３）　　６−　（５，５−ジフェニル−２，４−イ
ミダゾリジンジオン−３−イル）へキシルスクシナミン
酸の合成 ３−（６−ｔ−ブトキシカルボニルアミドヘキシル）フ
ェニトイン５００ｍｇ　（１，１ｍｍｏｌ）をｌ輸！の
塩化メチレンに溶解し、トリフルオロ酢酸１　ｔａｒ！
を加え室温で３０分反応した。溶媒をエバポレーターで
除きエーテル：ヘキサン１＝１で反応物を洗いカセイソ
ーダ上真空デシケータ−中で乾燥した。乾燥した生成物
を２＋ｎｅＤＭＦに溶かしトリエチルアミンで中和しく
ｐＨ８）　　１７０ｍｇ無水コハク酸を加え室温終夜反
応した。反応後８０ｍｆｆ１の水に入れｐＨ３に調製し
酢酸エチルで３回抽出し、有機層を５％クエン酸水溶液
、水、食塩水で洗浄後乾燥、溶媒留去し、標記化合物を
得、次の工程に用いた。

（４）　　６−（５，５−ジフェニル−２，４−イミダ
ゾリジンジオン−３−イル）へキシルスクシナミン酸　
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの合成 ６−（５，５−ジフェニル−２，４−イミダゾリジンジ
オン−３−イル）へキシルスクシナミン酸０．４５　ｇ
　（１ｍｍｏｌ）を２　ｍｌ塩化メレチレンに溶かし水
冷しＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１，１ｆｆ１ｍｏ
ｌ）及ヒＮ−ジシクロへキシルカルボジイミド（１，１
ｍｍｏｌ）　（５０％塩化メチレン溶液）２．２ｍｆを
加え反応する。反応後濾過により沈澱を除去し、溶媒を
除去した後、標記化合物を得、次の工程に用いた。

（５）　　フェニトインｄＵＴＰの合成Ｏｆ（Ｈ デオキシウリジントリホスフェートテトラナトリウム塩
（ＡＡ　ｄ　ＵＴ　Ｐす）　ＩＪ　ラム塩）を１０ａ＋
ｇを３　ｍｌのホウ酸バッファーに溶かし、６−（５，
５ジフェニル−２，４−イミダゾリジンジオン−３イル
）へキシルスクシナミン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル４０ｍｇを２　ｍｌのＤＭＦに溶かし混合し
室温にて３時間反応した。反応はＨＰＬＣ（ジエンバッ
クＤＮＡ、２５ｍＭリン酸バッファー）にてＡＡｄＵＴ
Ｐの消失により確認した。反応後、溶媒を留去しＤＥＡ
Ｅ−セファ−テックスＡ２５カラムにてトリエチルアミ
ンバッファー１５０％メタノールにより分離精製した。

０、６−０．７　Ｍ　）ジエチルアミンバッファー１５
０％メタノールの分画を集め標記化合物１８ｍｇを得た
。収率９０％。

得られた標記化合物のＨＰＬＣ分析結果を第１図に示す
、測定条件は以下の通りである。

カラム：ＴＳＫ−ゲル、０ＤＳ−１２０７（東ソー社製
）、４．６閣ＩＤＸ１５０ｍｏＬ溶出溶媒：５０ｍＭ酢
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，６）ニアセトニトリル−
９：１〜 ４：６直線濃度勾配 カラム温度：５５℃ 検出波長：２８０ｎｍ 豊考■上 ランダムプライムラベルによるフェニトインｄＵＴＰの
ＤＮＡの標識 制限酵素により切断したＤＮＡＩμｇを１μＭｄＡＴＰ
、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、０．６５μＭｄＴＴＰ及び実施
例１で製造した０、３５μＭフェニトインｄＵＴＰ存在
下、クレノウフラッグメントにより、３７°Ｃ２−２０
時間標識する。標識後、エタノール沈澱により標識ＤＮ
Ａを精製する。

参考撚Ｉ Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）ＤＮＡの検出プラスミドＤ
ＮＡにクローニングしたＨＢＶ・ＤＮＡ　（ａ　ｄ　ｒ
）を超遠心により精製し制限酵素処理、アガロースゲル
電気泳動分離し、ＵＶｚａ。

の測定により定量した。目的の濃度に希釈しアルカリ溶
液により変性後、ナイロンメンプランにドツトプロット
し中和溶液により中和しＵＶによりＤＮＡを固定する。

６０°Ｃ４時間プレハイブリダイゼーション後、フェニ
トイン標識ＨＢＶ・ＤＮＡ（参考例１）を５０μｇ／＋
／！の濃度で６０°Ｃ１６時間ハイブリダイゼーション
する。ハイブリダイゼーション後２ＸＳＳＣ，０，１％
ＳＤＳで洗浄、０．５ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳで６０
°Ｃ洗浄し非特異のプローブを除く。アルカリフォスフ
ァターゼ標識フェニトイン抗体を反応し洗浄後、ＡＭＰ
ＰＤを加え発光をＸ線フィルムに感光し、プロットした
ＨＢＶ・ＤＮＡをＣＬリーダー（ダイナチック社製、マ
イクロライドＭ　Ｌ−１０００）により検出した。各濃
度のＨＢＶ・Ｄ−ＮＡを第１表に示す。

ｍ　　　ＨＢＶ・ＤＮＡの検出 童ｍ 血清検体からのＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）ＤＮＡの検
出 陽性及び陰性の各血清検体３００μ！をサンプルチュー
ブに入れ遠心分離（１５Ｋｒｐｓ、１０分、４℃）し、
血清中のゴミを除く。中間層の血清５０μ！を別のサン
プルチューブに入れアルカリ変性液（０，５Ｎ　−Ｎａ
ＯＨ，ＩＭ−ＮａＣｆ、　０．３％ＮＰ４０）５５０μ
ｌを加え、室温で１０分間置く。

あらかじめ２ＸＳＳＣにつけたナイロンメンプランにド
ツトプロットし中和溶液により中和しＵＶによりＤＮＡ
を固定する。標準ＤＮＡとして超遠心により精製したプ
ラスミドＤＮＡ　（クローニングしたＨＢＶ・ＤＮＡａ
ｄｒ）を用いた。６０°Ｃ１４時間プレパイプリダイゼ
ーション後、フェニトイン標識ＨＢＶ　・ＤＮＡ　（参
考例１）を５０　ｎｇ／ｍｌ。

の濃度で６０℃１６時間ハイブリダイゼーションする。

ハイブリダイゼーション後２ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ
で洗浄、０．５ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳで６０°Ｃ洗
浄し非特異のプローブを除く。アルカリフォスファター
ゼ標識フェニトイン抗体を反応し洗浄後、ＡＭＰＰＤを
加え発光をＸ線フィルムに感光し、プロットしたＨＢＶ
・Ｄ　Ｎ　Ａ−を参考例２と同じＣＬリーダーにより検
出した。陽性血清及び陰性血清の測定結果を第２表及び
第３表に示す。

〔発明の効果〕

本発明で製造された前記−形式（１）で表されるフェニ
トイン誘導体は、遺伝子や感染症等の病因となる異変や
病原体を核酸レベルで検出するための標識ＤＮＡ又は標
＠ＲＮＡの製造に用いられ、前処理操作のない血清中で
高感度な測定を可能にした。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明で製造されたフェニトインｄＵＴＰの
ＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣ分析結果を示す図である
。 第１図 時　　間

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表されるフェニトイン誘導体 （式中、ｍは０〜８、ｎは０〜８であって、ｍ＋ｎは少
   なくとも２以上を有する。Ｐｈはフェニル基、Ｘは−Ｏ
   −、▲数式、化学式、表等があります▼又は−ＣＨ＿２
   −で表される基、Ｙは▲数式、化学式、表等があります
   ▼又は−ＣＨ＿２−で表される基、Ｚは水素原子又は水
   酸基であり、Ｍはアルカリ金属イオン、アルカリ土類金
   属イオン又はアンモニウムイオンである。）。