JP3031973B2

JP3031973B2 - フェニトイン誘導体

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Publication number: JP3031973B2
Application number: JP2215076A
Authority: JP
Inventors: 隆史内田; 博石川; 浩一小山; 義裕倉野; 好昭内田
Original assignee: Fujirebio Inc
Current assignee: Fujirebio Inc
Priority date: 1990-08-16
Filing date: 1990-08-16
Publication date: 2000-04-10
Anticipated expiration: 2015-04-10
Also published as: JPH0499793A; EP0471338A2; DE69114601D1; EP0471338B1; US5306617A; EP0471338A3; DE69114601T2

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、一般式（式中、ｍは０〜８、ｎは０〜８であって、ｍ＋ｎは少
なくとも２以上を有する。Phはフェニル基、Ｘはで表される基、Ｙはで表される基、Ｚは水素原子又は水酸基であり、Ｍはア
ルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン又はアンモ
ニウムイオンである）で表されるフェニトイン誘導体に
関する。

本発明の前記一般式（Ｉ）で表されるフェニトイン誘
導体で標識されたDNA又はRNAは、特定の核酸（DNA又はR
NA）配列検出に有効に利用できる。

〔従来の技術〕

核酸を用いた診断は、遺伝子や感染症等の病因となる
異変や病原体を核酸のレベルで検出する方法であり、病
気の発症前の診断や早期診断に有効な手段である。この
診断には、標識DNAプローブ又は標識RNAプローブが使用
されており、この標識物を作るために³²P,¹²⁵I等の放射
性同位元素及び非放射性物質であるビオチン、ジコキシ
ゲニン等の化合物が用いられている。

ここで放射性同位元素は微量な核酸を鋭敏に検出する
ための方法に用いられるが、特別な取扱い施設、設備が
必要であり、廃棄物の処理にも規制がなされている。ま
た放射性同位元素である³²P、¹²⁵Iは半減期が短く短期
間で使用できなくなるという欠点を有していた。それら
の欠点を克服するために放射性同位元素の代りに非放射
性のビオチン、ジコキシゲニン等を標識物として用いる
様になったものである。

より具体的には、ビチオンとデオキシウリジン誘導体
とを結合させたビオチンデオキシウリジントリホスフェ
ート誘導体（以下ビオチンdUTPと省略する）（P.R.Lang
er et cel.,Proc.Nath.Acad.Sci.USA,78,6633（198
1）、B,Rigas et al.,ibid 83,9591（1986）、P.S.Nels
on et al.,Nucleosides and Nucleotides ３,233（198
6）等参照）及びジコキシゲニンとデオキシウリジン誘
導体とを結合させたジコキシゲニンデオキシウリジント
リホスフェート誘導体（以下ジコキシゲニンdUTPと省略
する）（特表平１−503647号参照）が知られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕非放射性物質を標識物として導入する試薬であるビオ
チンdUTP及びジコキシゲニンdUTPは、特別な使用設備が
いらず、安定して保管し使用することができる試薬であ
る。

このビオチンdUTPは酵素反応によりDNAに導入し、酵
素標識したアビジンを反応させたのち、酵素反応による
発色、発光等を検出する方法に用いることができる。

具体的には検体中のウイルスDNA又はRNAの直接検出に
対して用いられるが、測定中非特異反応がしばしばみと
められ、実際の測定には充分な前処理操作を必要とする
など問題点を有していた。

また、ジコキシゲニンdUTPは、酵素標識した抗ジコキ
シゲニン抗体とともに用いられ、ビオチンdUTPと同様に
測定に供することができる。

このジコキシゲニンdUTPを用いる方法はビオチン−ア
ビジン系にみられる非特異反応はあまり認められないも
のの、感度低下を起すことがある。一つの理由としてジ
ゴキシゲニンがハプテンとしては比較的高分子であるた
めジゴキシゲニン標識DNAプローブと検体DNAのハイブリ
ダイゼーションが阻害されて、結果として感度の低下に
つながると考えられる。

〔問題を解決するための手段〕

そこで、前記した問題点である非特異反応を抑え、高
感度な測定を提供するため、本発明者はDNA又はRNA診断
における標識物として使用することのできる前記一般式
（Ｉ）で表されるフェニトイン誘導体を見い出した。

またこのフェニトイン誘導体で標識されたDNA又はRNA
は、本願発明者が特開平２−138992号に開示したフェニ
トインに対するモノクローナル抗体と組合せた測定法に
より発明を達成することができる。

前記一般式（Ｉ）で表されるフェニトイン誘導体は、
例えば式−Ｉに示す各反応工程により製造することがで
きる。

（式中、X₁は保護されたアミノ基又は保護された水酸基
であり、X₂はハロゲン原子、ｐ−トルエンスルホン酸基
又は、メタンスルホン酸であり、m,n,X,Y,A,Z及びＭは
前記と同じである。）〔第１工程〕本工程は、前記一般式（II）で表されるアルコール化
合物をハロゲン化、トシル化又はメシル化し一般式（II
I）で表されるハロゲン化物、トシル化物又はメシル化
物を製造する工程である。

本工程を実施するためには、塩化チオニル、臭化チオ
ニル等のハロゲ化チオニル、五塩化リン、五臭化リン、
オキシ塩化リン等のハロゲン化リン誘導体、ｐ−トルエ
ンスルホニルクロライド、ｐ−トルエンスルホニルブロ
マイド、メタンスルホニルクロライド、メタンスルホニ
ルブロマイド等のスルホン酸誘導体を用い、前記一般式
（II）で表されるアルコールとの反応により製造するこ
とができる。本反応は無溶媒又は不活性溶媒中行なうこ
とが好ましく不活性溶媒を使用する場合には例えば塩化
メチル、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素、ベンゼ
ン、トルエン等の芳香族炭化水素、等を挙げることがで
きる。

反応は−５〜50℃の範囲で行うことができる。この第
１工程を実施するために用いられる原料である前記一般
式（II）で表されるアルコール化合物は、アミノアルコ
ール又はジオール化合物、具体的にはエチレングリコー
ル、プロピレングリコール、ブタン−1,4−ジオール，
ペンタン−1,5−ジオール、ヘキサン−1,6−ジオール、
ヘプタン−1,7−ジオール、オクタン−1,8−ジオール、
アミノエタノール、３−アミノプロパノール、４−アミ
ノブタノール、５−アミノペンタノール、６−アミノヘ
オキサノール、７−アミノヘプタノール、８−アミノオ
クタノールのアミノ基又は水酸基の保護されたアルコー
ル化合物である。ここでアミノ基の保護基としては、ｔ
−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル
基、フタロイル基等を挙げることができる。また水酸基
の保護基としては、アセチル基、メトキシエチル基、テ
トヒドロピラニル基等を挙げることができる。

前記一般式（II）で表されるアルコール化合物は、不
活性溶媒中、前記アミノアルコール又はジオール化合物
と保護基となるアルコールとの縮合反応により製造する
ことができる。

〔第２工程〕本工程は、第１工程で得られた前記一般式（III）で
表されるハロゲン化物、トシル化物又はメシル化物とフ
ェニトイン（5,5−ジフェニル−2,4−イミダゾリジンジ
オン）との反応により前記一般式（IV）で表されるフェ
ニトイン誘導体を製造する工程である。

本工程の反応は、溶媒中塩基の存在下行うことが好ま
しく、塩基としては例えば炭酸カリウム、炭酸ナトリウ
ム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナ
トリウム、水酸化カリウム等を使用することができる。
塩基の使用量は、前記一般式（III）の化合物に対して
少なくとも当量であり、１〜３当量の範囲であることが
好ましい。反応は溶媒中行うことが好ましく、例えばジ
メチルホルムアミド（DMF）等のアミド類、ジエチルエ
ーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシ
エタン等のエーテル類、ベンゼン、トルエン、キシレン
等の芳香族炭化水素類、等の不活性溶媒を単独又は混合
して使用することができる。

反応は０〜150℃の範囲で効率よく行うことができ
る。

また、第１工程及び第２工程は、途中で前記一般式
（III）で表される化合物を単離することなく一連の反
応として行うこともできる。

〔第３工程〕本工程は前記一般式（IV）で表されるフェニトイン誘
導体の保護基を除去し、前記一般式（Ｖ）表されるフェ
ニトイン誘導体を製造するものである。保護基を除去す
る反応は、不活性溶媒中酸の存在下行うことができ、こ
の酸として例えばトリフルオロ酢酸を挙げることができ
る。

酸の使用量は、前記一般式（IV）で表されるフェニト
イン誘導体に対して10〜100当量の範囲であることが好
ましい。

反応は、溶媒中行うことが好ましく、例えば塩化メチ
レン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水
素類、等の不活性溶媒を使用することができる。

反応は−５〜30℃の範囲で効率よく行うことができ
る。

〔第４工程〕本工程は前記一般式（Ｖ）で表されるフェニトイン誘
導体とカルボン酸化合物との反応により前記一般式（V
I）で表されるカルボン酸誘導体を製造するものであ
る。

前記一般式（VI）で表されるカルボン酸誘導体におい
てＹがカルボニル基で表されるカルボン酸誘導体の製造の際には、カルボン
酸化合物としてカルボン酸無水物を用いることができ
る。カルボン酸無水物としては、炭酸数２〜８の飽和脂
肪族ジカルボン酸、具体的には無水シュウ酸、無水マロ
ン酸、無水コハク酸、無水グルタル酸、無水アジピン酸
等を挙げることができる。

本工程の反応は溶媒中前記一般式（Ｖ）で表されるフ
ェニトイン誘導体とカルボン酸無水物を混合し実施する
ことが好ましく、溶媒として例えばジメチルホルムアミ
ド、ジメチルアセトアミド等のアミド類等の不活性溶媒
を使用することができる。

反応は−５〜30℃の範囲で効率よく行うことができ
る。

前記一般式（VI）で表されるカルボン酸誘導体におい
て、Ｙが−CH₂−で表される基であるカルボン酸誘導体
の製造の際には、カルボン酸化合物としてハロゲン化カ
ルボン酸を用いることができる。ハロゲン化カルボン酸
としては、炭素数２〜７のクロル原子、ブロム原子、ヨ
ード原子により置換されたカルボン酸であり、具体的に
は、クロル酢酸、ブロム酢酸、ヨード酢酸、３−クロル
プロピオン酸、３−ブロムプロピオン酸、４−クロル酪
酸、４−ブロム酪酸、５−クロル吉草酸、５−ブロム吉
草酸、６−クロルヘキサン酸、６−ブロムヘキサン酸、
７−クロルヘプタン酸、７−ブロムヘプタン酸、等を挙
げることができる。

反応は、溶媒中塩基の存在下行うことが好ましく、塩
基としては、例えば炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭
酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カリウ
ム、水酸化ナトリウム等の無機塩基、ピリジン、トリエ
チルアミン等の有機塩基等を使用することができる。

塩基の使用量は、前記一般式（III）の化合物に対し
て少なくとも当量であり、１〜３当量の範囲であること
が好ましい。反応は溶媒中行うことが好ましく、例えば
ジメチルホルムアミド（DMF）等のアミド類、ジエチル
エーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキ
シエタン等のエーテル類、ベンゼン、トルエン、キシレ
ン等の芳香族炭化水素類、等の不活性溶媒を単独又は混
合して使用することができる。

反応は０〜150℃の範囲で効率よく行うことができ
る。

また、ハロゲン化カルボン酸は、このカルボキシル基
をエステル結合により保護したのち、前記反応を同様に
行った後、脱保護反応により前記一般式（VI）で表され
るカルボン酸誘導体を製造することもできる。

〔第５工程〕本工程は、前記一般式（VI）で表されるカルボン酸誘
導体と前記一般式（VII）で表されるウリジン誘導体と
の縮合反応を行い、前記一般式（Ｉ）で表されるフェニ
トイン誘導体を製造するものである。

この縮合反応は、縮合剤の存在下行うことが好まし
く、例えばN,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド（DC
C）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸縁（WSC）等のカルボジイミド
試薬を使用することができる。

反応は溶媒中実施することが好ましく、例えばクロロ
ホルム、ジクロルメタン等のハロゲン化炭化水素類、酢
酸エチル等のエステル類、N,N−ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド等の極性有機溶媒、ジオキサ
ン、テトラヒドロフラン等のエーテル類、メタノール、
エタノール等のアルコール類、ピリジン、水等の溶媒、
又は、これらの混合物中で行うことができる。

反応温度は、一般に使用される約−30℃〜約50℃の範
囲で行うことができる。

また本工程で使用するジカルボン酸無水物の代わりに
ジカルボン酸又は一つのカルボキシル基を保護基により
保護したジカルボン酸誘導体を用い前記一般式（Ｖ）で
表されるフェニトイン誘導体との反応を行い、前記一般
式（VI）で表されるカルボン酸誘導体を製造することも
できる。この反応は縮合剤の存在下に行うことが好まし
く、DCC、WSC等のカルボジイミド試薬を使用することが
でき、各種不活性溶媒中で製造することができる。

カルボキシル基の保護基としては、メチル基、エチル
基、ベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｔ−ブチル
基、シクロヘキシル基等を挙げることができる。保護し
たジカルボン酸誘導体を用い反応を行ったときには保護
基を脱離したのち、次の工程に用いることができる。

保護基の脱離方法としては、例えば、塩化水素、無水
フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンス
ルホン酸、トルフルオロ酢酸、又は、これらの混合物等
による酸処理が挙げられるが、この他に、液体アンモニ
ア中ナトリウム、パラジウム炭素による還元等も挙げら
れる。

また本工程で使用する前記一般式（VI）で表されるカ
ルボン酸誘導体は、各種カルボキシル基の活性体とした
後、前記一般式（VII）で表されるウリジン誘導体との
反応を不活性溶媒中行い、前記一般式（Ｉ）で表される
フェニトイン誘導体を製造することができる。

カルボキシル基の活性化誘導体としては、例えば、対
応する酸無水物、アジド化合物、活性エステル化合物で
ある。活性エステル化合物としては例えばペンタクロロ
フェノール、2,4−ジニトロフェノール、シアノメチル
アルコール、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシ−
５−ノルボルネン−2,3−ジカルボキシイミド、Ｎ−ヒ
ドロキシコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミ
ド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール等のアルコール
とのエステルが挙げられる。

本工程で使用する前記一般式（VII）で表されるウリ
ジン誘導体は市販の化合物であり、Ｚが水素原子のとき
デオキシウリジントリホスフェート（dUTP）誘導体、Ｚ
が水酸基のときウリジントリホスフェート（UTP）誘導
体である。また、Ｍはアルカリ金属イオン、アルカリ土
類金属イオン又はアンモニウムイオンである。アルカリ
金属イオンとして具体的には、リチウム、ナトリウム、
カリウム等を挙げることができ、アルカリ土類金属とし
て具体的にはマグネシウム、カルシウム、バリウム等を
挙げることができる。前記一般式（VII）で表されるデ
オキシウリジン誘導体及びウリジン誘導体として具体的
には５−（３−アミノ−１−プロペニル）−２′−デオ
キシ−ウリジン−５′−トリホスフェートテトラアン
モニウム塩、５−（３−アミノ−１−プロペニル）−
２′−デオキシ−ウリジン−５′−トリホスフェート
テトラナトリウム塩、５−（３−アミノ−１−プロペニ
ル）−２′−デオキシ−ウリジン−５′−トリホスフェ
ートテトラカリウム塩、５−（３−アミノ−１−プロ
ペニル）−２′−ウリジン−５′−トリホスフェート
テトラアンモニウム塩、５−（３−アミノ−１−プロペ
ニル）−２′−ウリジン−５′−トリホスフェートテ
トラナトリウム塩、５−（３−アミノ−１−プロペニ
ル）−２′−ウリジン−５′−トリホスフェートテト
ラカリウム塩等を挙げることができる。

このように各工程により製造された各種化合物は、反
応後それ自体公知の分離手段、例えば抽出、再沈澱、再
結晶、各種クロマトグラフィー等によって得ることがで
きる。

また一般式（式中、Ph,m,n,X,Y,Z及びＭは前記と同じである）で表
されるフェニトイン誘導体において、フェニトイン分子
と核酸の塩基部分との結合鎖の長さｌは、フェニトイン
部分と対応する抗体との結合をしやすくするため、さら
には核酸へ導入し標識核酸プローブを効率よく製造する
ため、炭素原子、窒素原子、酸素原子を含んだ原子数と
して９〜23の範囲であり、好ましくは11〜17の範囲であ
る。

フェニトイン標識された核酸プローブの製造方法は、
従来の標識核酸製造方法に前記一般式（Ｉ）で表される
フェニトイン誘導体と各種ポリメラーゼとを用いること
により製造することができる。

フェニトイン標識DNAプローブは、従来の標識DNA製造
方法に従い製造できる。

具体的にはニックトランスレーション法（例えばJ.Mol.
Biol.,113,237（1977）参照）、ランダム又はプライム
ドラベル法（Anal.Bio Chem.,132,6（1983）参照）、フ
ィルイン法等であり、ここで使用することのできるポリ
メラーゼはDNAポリメラーゼであり、例えば大腸菌のDNA
ポリメラーゼＩ、バクテリオファージT4 DNAポリメラ
ーゼ、マウスやヒトなどの細胞由来のDNAポリメラーゼ
α及びβ、単純ヘルペスDNAポリメラーゼ等を挙げるこ
とができる。

同様に、逆転写法（例えば、J.Biol.Chem.,253,2471
〜2482（1978）参照）に逆転写酵素、具体的にはラウス
関連ウイルス２、エビアンミエロブラストーシスウイル
ス等の酵素を用いる方法、テーリング法に例えばウシ胸
線由来のターミナルトランスフェラーゼ（ジエンザイ
ム（The Enzymes;Boger P.D.編）10,145〜171（1971）
参照）等の酵素を用いる方法により製造することができ
る。

また、フェニトイン標識RNAプローブは、従来の標識R
NA製造方法に従い製造することができる。具体的には転
写法（例えば、J.Mol.Biol.,166,477（1983）参照）で
ありここで使用することのできるポリメラーゼはファー
ジ・RNA・ポリメラーゼであり例えばファージSP−６、T
7又はT3のRNAポリメラーゼ等を挙げることができる。

フェニトイン標識DNAプローブを用いた測定は、例え
ば検体中のウイルス病原菌等のDNA鎖を一本鎖に変成
後、固相に固定し、製造したフェニトンイン標識DNAプ
ローブをハイブリダイゼーションし、前記フェニトイン
と結合可能な酵素標識抗フェニトイン抗体との反応を行
い、さらに酵素に対する基質を加え、その発色量、蛍光
量、発光量を測定する通常の酵素免疫測定法（石川栄治
著「酵素免疫測定法」共立出版等参照）の方法に従い行
うことができる。

前記抗体としては、フェニトインに対する抗体であ
り、この抗体を用いた酵素標識抗体は公知の方法（石川
栄治著、「酵素免疫測定法」共立出版等参照）によって
製造できる。フェニトインに対する抗体は、例えばモノ
クローナル抗体として特開平２−138992号に開示され、
微工研菌寄第10389号であるバイブリドーマより得るこ
とができる。また、この抗体は分解されたFab、Fab′等
であってもよい。

使用する酵素としてはアルカリホスファターゼ、β−
ガラクトシダーゼ、パーオキシダーゼ等を用いることが
できる。酵素に対する基質としては、使用する酵素に対
して種々選択することができ、例えば発色法ではアルカ
リホスファターゼに対して、５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリルホスフェートを用いることができ、化学
発光法ではアルカリホスファターゼに対し、３−（２′
−スピロアタマンタン）−４−メトキシ−４−（３″−
ホスホリロキシ）−フェニル−1,2−ジオキセタン二
ナトリウム塩（以下AMPPDと省略する）等を用いること
ができる。発色量、蛍光量及び発光量の測定は、フィル
ムを感光させ目視でもよく、さらに機器を使用する場合
には分光光度計、フォトンカウンター、デンシトメータ
ー、CLリーダー等を使用することができる。

測定対象物としては、Ａ型、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイル
ス、HTLV−1,HIV−Ｉ及びII型等のウイルス類、各種病
原菌、また遺伝子性疾患の遺伝子等を挙げることができ
る。

〔実施例〕

以下本発明を実施例及び参考例によりさらに詳細に説
明する。

実施例１フェニトインdUTPの合成（１）６−ｔ−ブトキシカルボニルアミノヘキサノー
ルの合成６−アミノ−１−ヘキサノール4g（34.1mmol）をクロ
ロホルム30mlに溶解し氷冷し、クロロホルム20mlに溶解
した7gの２−（ｔ−ブトキシカルボニルオキシイミノ）
−２−フェニルアセトリル（BOC−ON）を加え氷冷にて1
6時間反応した。クロロホルムを留去しシリカゲルカラ
ムにて分離精製し、標記化合物6.59gを得た。収率89
％。

（２）３−（６−ｔ−ブトキシカルボニルアミノヘキ
シル）フェニトインの合成３−（６−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサノ
ール0.87g（4mmol）をピリジン3mlに溶かし氷冷し、塩
化ｐ−トルエンスルホニル0.915gを加え2.5時間反応し
た。反応後、氷水100mlに入れ酢酸エチルで３回抽出
し、有機層を５％炭酸水素ナトリウム水溶液で３回、５
％クエン酸水溶液で３回洗浄し、乾燥後、溶媒を留去し
た、この生成物を2mlジメチルフォルムアミド（DMF）に
溶かし、フェニトイン（5,5−ジフニル−2,4−イミダゾ
リジンジオン）0.504gを3mlDMFに溶かし混合し炭酸カリ
ウム0.49gを加え90℃で60分反応した。反応後、反応物
を水に入れ酢酸エチルで３回抽出し、有機層を５％クエ
ン酸で１回、水で３回洗浄し乾燥した。生成物の分離精
製はシリカゲルカラムにより行い標記化合物0.8gを得
た。収率44％。

nmr〔δ;1.31（m,4H）,1.41（s,9H）,1.61（m,4H）,3.0
5（m,2H）,3.57（t,2H）,4.50（bs,1H）,6.24（bs,1
H）,7.36（s,10H）〕（３）６−（5,5−ジフェニル−2,4−イミダゾリジン
ジオン−３−イル）ヘキシルスクシナミン酸の合成３−（６−ｔ−ブトキシカルボニルアミドヘキシル）
フェニトイン500mg（1.1mmol）を1mlの塩化メチレンに
溶解し、トリフルオロ酢酸1mlを加え室温で30分反応し
た。溶媒をエバポレーターで除きエーテル：ヘキサン1:
1で反応物を洗いカセイソーダ上真空デシケーター中で
乾燥した。乾燥した生成物を2mlDMFに溶かしトリエチル
アミンで中和し（pH8）170mg無水コハク酸を加え室温終
夜反応した。反応後80mlの水に入れpH3に調製し酢酸エ
チルで３回抽出し、有機層を５％クエン酸水溶液、水、
食塩水で洗浄後乾燥、溶媒留去し、標記化合物を得、次
の工程に用いた。

（４）６−（5,5−ジフェニル−2,4−イミダゾリジン
ジオン−３−イル）ヘキシルスクシナミン酸Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステルの合成６−（5,5−ジフェニル−2,4−イミダゾリジンジオン
−３−イル）ヘキシルスクシナミン酸0.45g（1mmol）を
2ml塩化メチレンに溶かし氷冷しＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミド（1.1mmol）及びＮ−ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド（1.1mmol）（50％塩化メチレン溶液）2.2mlを
加え反応する。反応後濾過により沈澱を除去し、溶媒を
除去した後、標記化合物を得、次の工程に用いた。

（５）フェニトインdUTPの合成デオキシウリジントリホスフェートテトラナトリウム
塩（AAdUTPナトリウム塩）を10mgを3mlのホウ酸バッフ
ァーに溶かし、６−（5,5−ジフェニル−2,4−イミダゾ
リジンジオン−３−イル）ヘキシルスクシナミン酸Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル40mgを2mlのDMFに溶
かし混合し室温にて３時間反応した。反応はHPLC（ジェ
ンパックDNAD,25mMリン酸バッファー）にてAAdUTPの消
失により確認した。反応後、溶媒を留去しDEAE−セファ
ーデックスA25カラムにてトリエチルアミンバッファー/
50％メタノールにより分離精製した。0.6−0.7Mトリエ
チルアミンバッファー/50％メタノールの分画を集め標
記化合物18mgを得た。収率90％。

得られた標記化合物のHPLC分析結果を第１図に示す。
測定条件は以下の通りである。

カラム:TSK−ゲル,ODS−120T（東ソー社製）,4.6mmID
×150mmL 溶出溶媒:50mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.6）：アセ
トニトリル＝9:1〜4:6直線濃度勾配カラム温度:55℃ 検出波長:280nm 参考例１ランダムプライムラベルによるウェニトインdUTPのDNA
の標識制限酵素により切断したDNA1μｇを１μ MdATP,dCTP,
dGTP,0.65μM dTTP及び実施例１で製造した0.35μＭフ
ェニトインdUTP存在下、クレノウフラッグメントによ
り、37℃２−20時間標識する。標識後、エタノール沈澱
により標識DNAを精製する。

参考例２Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）DNAの検出プラスミドDNAにクローニングしたHBV・DNA（adr）を
超遠心により精製し制限酵素処理、アガロースゲル電気
泳動分離し、UV₂₆₀の測定により定量した。目的の濃度
に希釈しアルカリ溶液により変性後、ナイロンメンブラ
ンにドットブロットし中和溶液により中和しUVによりDN
Aを固定する。60℃４時間プレハイブリダイゼーション
後、フェニトイン標識HBV・DNA（参考例１）を50ng/ml
の濃度で60℃16時間ハイブリダイゼーションする。ハイ
ブリダイゼーション後２×SSC,0.1％SDSで洗浄、0.5×S
SC,0.1％SDSで60℃洗浄し非特異のプローブを除く。ア
ルカリフォスファターゼ標識フェニトイン抗体を反応し
洗浄後、AMPPDを加え発光をＸ線フィルムに感光し、ブ
ロットしたHBV・DNAをCLリーダー（ダイナテック社製、
マイクロライトML−1000）により検出した。各濃度のHB
V・DNAを第１表に示す。

参考例３血清検体からのＢ型肝炎ウイルス（HBV）DNAの検出陽性及び陰性の各血清検体300μをサンプルチュー
ブに入れ遠心分離（15Krpm,10分、４℃）し、血清中の
ゴミを除く。中間層の血清50μを別のサンプルチュー
ブに入れアルカリ変性液（0.5N−NaOH,1M−NaCl,0.3％N
P40）550μを加え、室温で10分間置く。あらかじめ２
×SSCにつけたナイロンメンブランにドットブロットし
中和溶液により中和しUVによりDNAを固定する。標準DNA
として超遠心により精製したプラスミドDNA（クローニ
ングしたHBV・DNAadr）を用いた。60℃、４時間プレハ
イブリダイゼーション後、フェニトイン標識HBV・DNA
（参考例１）を50ng/mlの濃度で60℃16時間ハイブリダ
イゼーションする。ハイブリダイゼーション後２×SSC,
0.1％SDSで洗浄、0.5×SSC,0.1％SDSで60℃洗浄し非特
異のプローブを除く。アルカリフォスファターゼ標識フ
ェニトイン抗体を反応し洗浄後、AMPPDを加え発光をＸ
線フィルムに感光し、ブロットしたHBV・DNAを参考例２
と同じCLリーダーにより検出した。陽性血清及び陰性血
清の測定結果を第２表及び第３表に示す。

〔発明の効果〕本発明で製造された前記一般式（Ｉ）で表されるフェ
ニトイン誘導体は、遺伝子や感染症等の病因となる異変
や病原体を核酸ベルで検出するための標識DNA又は標識R
NAの製造に用いられ、前処理操作のない血清中で高感度
な測定を可能にした。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明で製造されたフェニトインdUTPのODS
カラムを用いたHPLC分析結果を示す図である。

フロントページの続き (72)発明者内田好昭東京都新宿区下落合４丁目６番７号富士レビオ株式会社内審査官吉住和之 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07H 19/10 C12Q 1/68 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式で表されるフェニトイン誘導体（式中、ｍは０〜８、ｎは０〜８であって、ｍ＋ｎは少
なくとも２以上を有する。Phはフェニル基、Ｘはで表される基、Ｙはで表される基、Ｚは水素原子又は水酸基であり、Ｍはア
ルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン又はアンモ
ニウムイオンである。）。