WO2023027082A1

WO2023027082A1 - ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム、ペプチド結合エクソソーム、これらを含む組成物及びその形成方法

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Publication number: WO2023027082A1
Application number: PCT/JP2022/031768
Authority: WO
Inventors: 哲立譚
Original assignee: 積水化学工業株式会社
Priority date: 2021-08-23
Filing date: 2022-08-23
Publication date: 2023-03-02
Also published as: EP4393957A1; JPWO2023027082A1

Abstract

標的細胞により高濃度の有効成分を送達可能な、ハイブリッドリポソームエクソソーム等を提供することを課題とする。　ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＣＤ９から選ばれるエクソソームマーカータンパク質と、複合脂質の親水性部位にペプチドが結合している、ペプチド結合脂質誘導体と、を脂質二重層中に含む、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームによれば、標的細胞のエンドソームに取り込まれた後のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームのエンドソーム脱出に関する付加的機能を付与することができ、以って標的細胞へのより高濃度の有効成分の送達が可能な、ドラッグデリバリーシステムのキャリアを提供できる。

Description

ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム、ペプチド結合エクソソーム、これらを含む組成物及びその形成方法

　本願は、日本国特許出願　特願２０２１－１３５８２８に優先権を主張するものであり、当該基礎出願の内容は、引用により本願明細書の一部として組み込まれるものである。

　本発明は、エクソソームとリポソームとを融合させて得られる、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム含有組成物、及びペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの形成方法に関する。

　薬理効果を有する薬剤を人体に投与する場合、その薬剤が本来予定している薬効以外に、望ましくない副作用を必然的に生じさせることが一般に知られている。このような薬剤による副作用を低減し、その効能を高めるため、近年、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）が提唱されている。ドラッグデリバリーシステムを利用することにより、注目される薬剤が選択的に病巣に送達されるため、より低い投与量で効能を発揮する上、当該薬剤が、病巣以外の身体部位に送達され、望まない副作用が生じる可能性を低減できる。ここで、有機高分子を用いたナノ構造体のドラッグデリバリーシステムへの応用に関しては、薬剤を内包したカプセル（「キャリア」と呼ばれる）に、血中でのコントロールドリリース機能（徐放性）や、ターゲティング機能（細胞指向性・親和性）をいかに付与するかが開発の鍵となる。

　このようなドラッグデリバリーシステムに利用されるキャリアとしては、リン脂質からなるナノ粒子であるリポソーム等の有用性が高いことが指摘されている。薬剤を内包するリポソームは、試験管内で薬剤及びリン脂質を混合することにより、比較的容易に形成できるという利点があるため、ドラッグデリバリーシステムの分野においては汎用される技術となっている。しかしながら、リポソームは試験管内で再構成される系であるため、リポソーム自身に、標的となる細胞へのターゲッティング機能を付与するには、相応の困難が伴う。

　ところで、近年、細胞から、エクソソームと呼ばれる一種の小胞が放出されることが知られている。図２は、エンドソームの形成と細胞の取り込みの様子を説明する図面である。エクソソームは、直径２０ｎｍから１５０ｎｍの脂質二重膜小胞である。図２に示すように、エクソソームは、その内部にタンパク質、及びｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ等の核酸を内包するとともに、その表面にもタンパク質を有している。エクソソームは、通常、細胞内に形成される多胞体（図２中のＡ）において、細胞質から多胞体内腔に向かう出芽により形成され、多胞体と細胞膜との融合により、細胞外に放出される（図２中のＢ）。図２中のＣに示されるように、エクソソームは、起源となった細胞由来の標識分子を含むとともに、起源となった細胞の特性に応じた指向性を有し、血液凝固や細胞間シグナル伝達等の生理作用に関与しているとされる。このようなエクソソームは、標的細胞に接触すると、標的細胞にて、エンドサイトーシスにより取り込まれ、エンドソームとエクソソームの脂質二重膜が融合することにより、エクソソームに内包されたタンパク質、及びｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ等の核酸を細胞質に放出する（図２中のＤ）。

　ここで、このエクソソームをドラッグデリバリーシステムに応用し、エクソソームの標的指向性を利用して、特定の細胞や組織に選択的に薬剤を送達することが試みられている。しかしながら、エクソソーム内にタンパク質や核酸分子を挿入する場合、エクソソームの壁を構成する脂質二重膜が、タンパク質や核酸等の親水性分子又は親水性表面を有する分子を透過しないため、効果的に有効成分をエクソソーム内腔に内包できない、という問題がある。このような問題に対処するために、例えば、特許文献１には、生理活性物質を内包するリポソームとエクソソームを複合化してなり、上記エクソソームは、細胞から放出される小胞であって、直径は３０ｎｍから２００ｎｍであり、リン脂質、コレステロ－ル、タンパク質及び核酸を含むものである、ハイブリッドリポソームエクソソームが開示されている。特許文献１に記載の発明によれば、リポソームとエクソソームを複合化することにより、リポソームに内包する物質をエクソソームにも内包させることができるものとされている。

特許第６１３７８９４号公報

　しかしながら、特許文献１に開示された発明は、ハイブリッドリポソームエクソソームを利用したドラッグデリバリーシステムの初期研究に関するものである。特許文献１に開示されたハイブリッドリポソームエクソソームは、標的指向性が相応に高いものと予測されるが、ドラッグデリバリーシステムの担体として実用化する上で、十分な濃度の有効成分を標的細胞に送達できない、という問題がある。

　したがって、本発明は、以上の課題に鑑みてなされたものであり、標的細胞により高濃度の有効成分を送達可能な、ハイブリッドリポソームエクソソーム等を提供することを目的とする。

　本発明の発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を行った。その結果、複合脂質の親水性部位にペプチドが結合している、ペプチド結合脂質誘導体を、脂質二重層中に含む、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームによれば、上記課題を解決できることを見出し、本発明を解決するに至った。具体的には、本発明は、以下のものを提供する。

　本発明の第１の態様は、ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＣＤ９から選ばれるエクソソームマーカータンパク質と、複合脂質の親水性部位にペプチドが結合している、ペプチド結合脂質誘導体と、を脂質二重層中に含む、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームである。

　本発明の第１の態様によれば、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームが、複合脂質の親水性部位にペプチドが結合した、ペプチド結合脂質誘導体を、脂質二重層中に含んでいる。このペプチド結合脂質誘導体は、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの外表面に露出しやすいので、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームに対して、標的細胞への取り込みに関する付加的機能を付与することができ、以って標的細胞へのより高濃度の有効成分の送達が可能な、ドラッグデリバリーシステムのキャリアを提供できる。

　本発明の第２の態様は、上記ペプチドは、１０残基以上３０残基以下のアミノ酸残基を有し、上記ペプチドが、アラニン残基、ロイシン残基、及びメチオニン残基から選択される少なくとも１種の疎水性アミノ酸残基と、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、グルタミン残基、及びアスパラギン残基から選択される少なくとも１種のアミノ酸残基と、を含む３から４アミノ酸残基で構成される繰り返し配列を含み、上記繰り返し配列を構成するアミノ酸残基の少なくとも１残基が、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、グルタミン残基、及びアスパラギン残基のうちの１つである、上記第１の態様のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームである。

　本発明の第２の態様によれば、所定の疎水性アミノ酸残基と、酸性アミノ酸残基及び／又は極性アミノ酸残基とを含む、３から４アミノ酸残基で構成される繰り返し配列を含んでおり、この繰り返し配列を構成するアミノ酸残基の少なくとも１残基が、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、グルタミン残基、及びアスパラギン残基のうちの１つである。このため、上記ペプチドが、酸性条件下で疎水性表面を有するα－ヘリックス構造を形成しやすくなり、この疎水性表面を有するα－ヘリックス構造の作用により、エンドソーム取り込み後のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームのエンドソーム脱出が惹起されやすくなり、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの内容物の細胞質への取り込みを促進できる。

　本発明の第３の態様は、上記ペプチドは、１０残基以上３０残基以下のアミノ酸残基を有し、上記ペプチドが、少なくとも１残基の塩基性アミノ酸残基を有する、上記第１の態様のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームである。

　本発明の第３の態様によれば、上記ペプチド結合脂質誘導体を構成するペプチドが、１０残基以上３０残基以下のアミノ酸残基を有し、少なくとも１残基の塩基性アミノ酸残基を有するので、この塩基性アミノ酸残基の塩基性基が酸性条件下で、脂質二重層の表層のリン酸基と相互作用することにより、エンドソーム取り込み後のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームのエンドソーム脱出が惹起されやすくなり、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの内容物の細胞内への取り込みを促進できる。

　本発明の第４の態様は、上記ペプチドが、２残基以上５残基以下の連続した塩基性アミノ酸残基を有する、上記第３の態様のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームである。

　本発明の第４の態様によれば、上記第３の態様における、上記ペプチド中の塩基性アミノ酸残基が２残基以上５残基以下連続しているので、この連続した塩基性アミノ酸残基の塩基性基が酸性条件下で、脂質二重層の表層のリン酸基とより強く相互作用することにより、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの細胞内への取り込みをより促進できる。

　本発明の第５の態様は、上記ペプチドが、酸性アミノ酸残基を含まない、上記第３又は第４の態様のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームである。

　本発明の第５の態様によれば、上記第３又は第４の態様における、上記ペプチド中に酸性アミノ酸残基が含まれないので、上記ペプチド中の塩基性アミノ酸残基と、脂質二重層の表層のリン酸基と相互作用が阻害されず、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの細胞内への取り込みをより促進できる。

　本発明の第６の態様は、上記ペプチドが、配列番号１から５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのうちのいずれかである、第１から第５のいずれかの態様のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームである。

　本発明の第６の態様によれば、上記第１から第５のいずれかの態様において使用されるペプチドが、配列番号１から５で表されるアミノ酸配列を有するので、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの細胞内への取り込みをより促進できる。

　本発明の第７の態様は、上記複合脂質が、末端に１級アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、リン酸基、チオール基からなる群から選ばれるいずれかの反応性基を有する複合脂質であり、上記複合脂質が、スフィンゴリン脂質、スフィンゴ糖脂質、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、エーテル型リン脂質、エーテル型糖脂質からなる群から選ばれる少なくとも１以上である、第１から第６のいずれかの態様のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームである。

　スフィンゴリン脂質、スフィンゴ糖脂質、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、エーテル型リン脂質、エーテル型糖脂質は、分子内にリン酸基に由来する極性基や、糖に由来する極性基を有する。本発明の第７の態様によれば、このようなリン酸基や極性基に由来する極性基とペプチドが有する極性基を反応させることができるので、複合脂質とペプチドを容易に結合させることができる。

　本発明の第８の態様は、上記ペプチドと、上記複合脂質と、を、カルボジイミド架橋反応、ＮＨＳエステル架橋反応、イミドエステル架橋反応で結合させる、第１から第７のいずれかの態様のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームである。

　本発明の第８の態様においては、ペプチドと、複合脂質と、を、カルボジイミド架橋反応、ＮＨＳエステル架橋反応、イミドエステル架橋反応で結合させる。これらの化学反応方法は、ペプチドのアミノ基と、複合脂質に含まれるアミノ基やカルボキシル基等の極性基を安定に結合させることができる。

　本発明の第９の態様は、上記エクソソームが、幹細胞から得られるエクソソーム、又は多能性幹細胞、間葉系幹細胞、外胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、内胚葉由来細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種から得られるエクソソームである、第１から第８のいずれかの態様のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームである。

　本発明の第９の態様においては、上記エクソソームが、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、外胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、内胚葉由来細胞からなる群から選ばれる。即ち、本発明の第１から第８のいずれかの態様のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームは、多様な性質の細胞に由来するエクソソームに対して、直接適用することができるので、当該エクソソームの特性に応じた、様々な細胞への標的指向性をペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームに付与することができる。

　本発明の第１０の態様は、複合脂質の親水性部位にペプチドを結合させ、ペプチド結合脂質誘導体を形成する工程と、リン脂質を含むリン脂質組成物及び上記ペプチド結合脂質誘導体を混合して、上記ペプチド結合脂質誘導体が組み込まれたリポソームを形成する工程と、エクソソームに、上記リポソームを融合させることで、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを形成する工程と、を含む、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの形成方法である。

　本発明の第１０の態様のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの形成方法においては、ペプチド結合脂質誘導体を形成し、これを、リン脂質を含むリン脂質組成物と混合して、上記ペプチド結合脂質誘導体が組み込まれたリポソームを形成するとともに、エクソソームに、上記リポソームを融合させることで、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを形成する。このため、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームに対して、強い負荷をかけずに、容易にペプチド結合脂質誘導体を導入できるとともに、リポソームを形成する際に、有効成分を容易に内包させることができる。

　本発明も第１１の態様は、第１０の態様のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの形成方法により形成される、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームである。

　本発明の第１１の態様によれば、本発明の第１の態様のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームと類似のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームが得られる。このため、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームに対して、標的細胞への取り込みに関する付加的機能を付与することができ、以って標的細胞へのより高濃度の有効成分の送達が可能な、ドラッグデリバリーシステムのキャリアを提供できる。

　本発明の第１２の態様は、ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＣＤ９から選ばれるエクソソームマーカータンパク質に対して特異的に結合する、第１の一次抗体と、配列番号１から５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのうちのいずれかに対して特異的に結合する、第２の一次抗体と、上記の第１の一次抗体に特異的に結合する、第１の蛍光色素が結合された第１の二次抗体と、上記の第２の一次抗体に特異的に結合する、第２の蛍光色素が結合された第２の二次抗体と、を添加し、ここで、上記の第１の一次抗体の添加量と抗体価の積と上記の第２の二次抗体の添加量と抗体価の積の比が１：１であり、上記の第１の一次抗体と、上記の第１の二次抗体と、の添加量比が２：１であり、上記の第２の一次抗体と、上記の第２の二次抗体と、の添加量比が２：１であり、エクソソーム中に含まれる複合脂質に特異的に結合する磁気ビーズに結合させたペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを、フローサイトメトリーを利用して分析した際に、以下の条件を満たす、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム含有組成物である。
　０．６≦Ａ／（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）≦１．０　　　　　　式（１）
（ただし、式（１）において、Ａは、第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素の両方で標識されたペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを示すピークの面積であり、Ｂは、第１の蛍光色素のみで標識されたエクソソームを示すピークの面積であり、Ｃは、第２の蛍光色素のみで標識されたリポソームを示すピークの面積である。）

　本発明の第１２の態様によれば、本発明の第１の態様のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームと類似のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを含む組成物が得られる。このため、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームに対して、標的細胞への取り込みに関する付加的機能を付与することができ、以って標的細胞へのより高濃度の有効成分の送達が可能な、ドラッグデリバリーシステムのキャリアを提供できる。

　本発明の第１３の態様は、ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＣＤ９から選ばれるエクソソームマーカータンパク質に対して特異的に結合する、第１の一次抗体と、配列番号１から５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのうちのいずれかに対して特異的に結合する、第２の一次抗体と、上記の第１の一次抗体に特異的に結合する、第１の蛍光色素が結合された第１の二次抗体と、上記の第２の一次抗体に特異的に結合する、第２の蛍光色素が結合された第２の二次抗体と、を添加し、ここで、上記の第１の一次抗体の添加量と抗体価の積と上記の第２の二次抗体の添加量と抗体価の積の比が１：１であり、上記の第１の一次抗体と、上記の第１の二次抗体と、の添加量比が２：１であり、上記の第２の一次抗体と、上記の第２の二次抗体と、の添加量比が２：１であり、エクソソーム中に含まれる複合脂質に特異的に結合する磁気ビーズに結合させたペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを、フローサイトメトリーを利用して分析した際に、以下の条件を満たす、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム含有組成物を選抜する、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム含有組成物の選抜方法である。
　０．６≦Ａ／（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）≦１．０　　　　　　式（１）
（ただし、式（１）において、Ａは、第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素の両方で標識されたペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを示すピークの面積であり、Ｂは、第１の蛍光色素のみで標識されたエクソソームを示すピークの面積であり、Ｃは、第２の蛍光色素のみで標識されたリポソームを示すピークの面積である。）

　本発明の第１３の態様によれば、本発明の第１の態様のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームと類似のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを含む組成物を選抜できる。このため、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームに対して、標的細胞への取り込みに関する付加的機能を付与することができ、以って標的細胞へのより高濃度の有効成分の送達が可能な、ドラッグデリバリーシステムのキャリアを提供できる。

　本発明の第１４の態様は、ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＣＤ９から選ばれるエクソソームマーカータンパク質を含む、エクソソームと、複合脂質の親水性部位にペプチドが結合している、ペプチド結合脂質誘導体と、を脂質二重層中に含む、ペプチド結合エクソソームである。

　本発明の第１４の態様によれば、ペプチド結合エクソソームが、複合脂質の親水性部位にペプチドが結合した、ペプチド結合脂質誘導体を、脂質二重層中に含んでいる。このペプチド結合脂質誘導体は、ペプチド結合エクソソームの外表面に露出しやすいので、ペプチド結合エクソソームに対して、標的細胞への取り込みに関する付加的機能を付与することができ、以って標的細胞へのより高濃度の有効成分の送達が可能な、ドラッグデリバリーシステムのキャリアを提供できる。

　本発明の第１５の態様は、上記ペプチドは、１０残基以上３０残基以下のアミノ酸残基を有し、上記ペプチドは、アラニン残基、ロイシン残基、及びメチオニン残基から選択される少なくとも１種の疎水性アミノ酸残基と、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、グルタミン残基、及びアスパラギン残基から選択される少なくとも１種のアミノ酸残基と、を含む３から４アミノ酸残基で構成される繰り返し配列を含み、上記繰り返し配列を構成するアミノ酸残基の少なくとも１残基は、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、グルタミン残基、及びアスパラギン残基のうちの１つである、第１４の態様に記載のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームである。

　本発明の第１５の態様は、上記ペプチドは、１０残基以上３０残基以下のアミノ酸残基を有し、上記ペプチドは、少なくとも１残基の塩基性アミノ酸残基を有する、第１４の態様に記載のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームである。

　本発明の第１７の態様は、上記ペプチドは、２残基以上５残基以下の連続した塩基性アミノ酸残基を有する、第１６の態様に記載のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームである。

　本発明の第１８の態様は、上記ペプチドは、酸性アミノ酸残基を含まない、第１６又は第１７の態様に記載のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームである。

　本発明の第１９の態様は、上記ペプチドは、配列番号１から５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのうちのいずれかである、第１４から第１８のいずれかの態様に記載のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームである。

　本発明の第１５から第１９の態様によれば、ペプチド結合エクソソームにおいて、本発明の第２から第６の態様と同等の効果を得ることができる。

　本発明の第２０の態様は、上記複合脂質は、末端に１級アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、リン酸基、チオール基からなる群から選ばれるいずれかの反応性基を有する複合脂質であり、上記複合脂質は、スフィンゴリン脂質、スフィンゴ糖脂質、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、エーテル型リン脂質、エーテル型糖脂質からなる群から選ばれる少なくとも１以上である、第１４から第１９のいずれかの態様に記載のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームである。

　本発明の第２０の態様によれば、ペプチド結合エクソソームにおいて、本発明の第７の態様と同等の効果を得ることができる。

　本発明によれば、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームが、複合脂質の親水性部位にペプチドが結合した、ペプチド結合脂質誘導体を、脂質二重層中に含んでいる。このペプチド結合脂質誘導体は、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの外表面に露出しやすいので、標的細胞のエンドソームに取り込まれた後のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームのエンドソーム脱出に関する付加的機能を付与することができ、以って標的細胞へのより高濃度の有効成分の送達が可能な、ドラッグデリバリーシステムのキャリアを提供できる。

実施形態に係るペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの形成方法の概略と、その利用方法を説明する図面である。エンドソームの形成と細胞の取り込みの様子を説明する図面である。ホスファチジルセリン結合たんぱく質Ｔｉｍ４を利用したエクソソームのフローサイトメトリーの概念図を示す図面である。実験例１の抗癌剤封入リポソームへのペプチド結合による細胞増殖抑制効果の検討の結果を示す図面である。実験例２のｓｉＲＮＡ封入リポソームによるＨｅｐＧ２細胞の増殖抑制効果の検証の結果を示す図面である。実験例３のｓｉＲＮＡ封入リポソームへのペプチド結合による細胞増殖抑制効果の検討の結果を示す図面である。実験例３のｓｉＲＮＡ封入リポソームへのペプチド結合による細胞増殖抑制効果の検討の結果を示す図面である。実験例３のｓｉＲＮＡ封入リポソームへのペプチド結合による細胞増殖抑制効果の検討の結果を示す図面である。実験例３のｓｉＲＮＡ封入リポソームへのペプチド結合による細胞増殖抑制効果の検討の結果を示す図面である。実験例３のｓｉＲＮＡ封入リポソームへのペプチド結合による細胞増殖抑制効果の検討の結果を示す図面である。実験例３のｓｉＲＮＡ封入リポソームへのペプチド結合による細胞増殖抑制効果の検討の結果を示す図面である。実験例４のＭＳＣ由来エクソソームが細胞増殖に与える影響の検討の結果を示す図面である。実験例５のペプチド結合ＭＳＣ由来エクソソーム溶液が細胞の増殖に与える影響の検討の結果を示す図面である。実験例５のペプチド結合ＨＥＫ２９３細胞由来エクソソーム溶液が細胞の増殖に与える影響の検討の結果を示す図面である。実験例６のペプチド結合ＭＳＣ由来エクソソーム溶液が細胞の増殖に与える影響の検討の結果を示す図面である。実験例６のペプチド結合ＭＳＣ由来エクソソーム溶液が細胞の増殖に与える影響の検討の結果を示す図面である。実験例６のペプチド結合ＭＳＣ由来エクソソーム溶液が細胞の増殖に与える影響の検討の結果を示す図面である。実験例６のペプチド結合ＭＳＣ由来エクソソーム溶液が細胞の増殖に与える影響の検討の結果を示す図面である。実験例６のペプチド結合ＭＳＣ由来エクソソーム溶液が細胞の増殖に与える影響の検討の結果を示す図面である。配列番号３で表されるペプチドを付与されたＬｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｕ　ＰＬとエクソソームとの、ハイブリッドリポソームエクソソームのフローサイトメトリーの結果を示す図面である。配列番号５で表されるペプチドを付与されたＬｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｕ　ＰＬとエクソソームとの、ハイブリッドリポソームエクソソームのフローサイトメトリーの結果を示す図面である。配列番号５で表されるペプチドを付与されたＬｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｓ　ＰＬとエクソソームとの、ハイブリッドリポソームエクソソームのフローサイトメトリーの結果を示す図面である。実験例８のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの細胞増殖抑制能の検討の結果を示す図面である。実験例８のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの細胞増殖抑制能の検討の結果を示す図面である。実験例８のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの細胞増殖抑制能の検討の結果を示す図面である。実験例８のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの細胞増殖抑制能の検討の結果を示す図面である。実験例８のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの細胞増殖抑制能の検討の結果を示す図面である。実施例８のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの細胞増殖抑制能の検討の結果を示す図面である。実施例８のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの細胞増殖抑制能の検討の結果を示す図面である。実施例８のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの細胞増殖抑制能の検討の結果を示す図面である。実施例８のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの細胞増殖抑制能の検討の結果を示す図面である。実施例８のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの細胞増殖抑制能の検討の結果を示す図面である。配列番号５で表されるペプチドを付与されたＬｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｕ　ＰＬとエクソソームとの、ハイブリッドリポソームエクソソームのフローサイトメトリーの結果を示す図面である。配列番号３で表されるペプチドを付与されたＬｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｕ　ＰＬとエクソソームとの、ハイブリッドリポソームエクソソームのフローサイトメトリーの結果を示す図面である。

　以下、本発明を実施するための形態について、図面を参照して詳細に説明する。なお、以下に示す本発明の実施形態は、例示による説明のために記載されたものであり、本発明は、以下に説明する実施形態に何ら限定されるものではない。

　＜ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム＞
　本発明の一例である、第１の実施形態のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＣＤ９から選ばれるエクソソームマーカータンパク質と、複合脂質の親水性部位にペプチドが結合している、ペプチド結合脂質誘導体と、を脂質二重層中に含んでいる。なお、本発明は、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームのみに限定されるものではなく、エクソソームがリポソームと融合されることなく、所定のペプチドが結合した、ペプチド結合エクソソームもまた、本発明の範囲内に含まれる。

　［エクソソームマーカータンパク質］
　ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＣＤ９は、エクソソームが有する脂質二重膜に局在し、エクソソームに特異的に認められる膜タンパク質である。本発明のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの形成方法は、特に、限定されるものではないが、本実施形態のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームは、所定のリポソームとエクソソームとを融合させることにより得られる。このため、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームは、エクソソームに由来する膜タンパク質を保持しており、ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＣＤ９から選ばれるエクソソームマーカータンパク質と、後述のペプチド結合脂質誘導体を構成するペプチドとを、共に標識することにより、エクソソーム及びリポソームそれぞれと明確に区別できる。

　（ＣＤ６３の特性）
　ＣＤ６３は、ＬＡＭＰ－３（Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３）としても知られ、免疫－生理学的機能において多くの重要な役割を果たすテトラスパニンファミリーに属する３０ｋＤａから６０ｋＤａのリソソーム膜タンパク質である。ＣＤ６３は、細胞の発生、活性化、増殖、及び運動性の調節に関連するシグナル伝達を媒介することが知られている。ＣＤ６３は、活性化血小板上に発現するため、血小板活性化マーカーとして機能する可能性が指摘されており、ＣＤ６３は、リソソーム膜糖タンパク質であり、血小板活性化後に細胞膜に移行することが知られている。ヒトＣＤ６３のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩの提供する配列情報データベースＧｅｎｂａｎｋにおいて、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｐ０８９６２．２の下、インターネット上で開示されている。当該ウェブページの内容は、引用により、本明細書の一部に組み込まれる。

　（ＣＤ８１の特性）
　ＣＤ８１は、４回膜貫通ドメインを有するテトラスパンファミリーに属する単鎖タンパク質である。細胞膜上において、ＣＤ８１は、Ｎ末端及びＣ末端の両方が細胞質内にあり、細胞外にはペプチドのループが２箇所で露出している。ＣＤ８１は糖鎖を含まず、分子量は２６ｋＤａである。ＣＤ８１は組織分布が広く、他のテトラスパンファミリーのメンバー等と会合して存在していると指摘されている。免疫Ｂ細胞においては、分化段階の全般に亘って比較的高いレベルのＣＤ８１を発現している。ヒトＣＤ８１のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩの提供する配列情報データベースＧｅｎｂａｎｋにおいて、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｐ６００３３．１の下、インターネット上で開示されている。当該ウェブページの内容は、引用により、本明細書の一部に組み込まれる。

　（ＣＤ９の特性）
　ＣＤ９は分子量２４ｋＤａの単鎖膜タンパクあり、テトラスパンファミリーに属する。ＣＤ９抗原は、４つの膜貫通ドメインを持ち、Ｎ末端とＣ末端がともに細胞内に存在する構造を有する。ＣＤ９は、血小板のα顆粒内、単球、ｐｒｅ－Ｂ細胞、好酸球、好塩基球、及び活性化したＴ細胞等に存在することが認められる。ＣＤ９は、ＶＬＡ（Ｖｅｒｙ　Ｌａｔｅ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）インテグリン分子やＨＬＡ－ＤＲ等の分子と関連しており、細胞間の接着やシグナル伝達、細胞の運動能に関与すると考えられている。ヒトＣＤ９のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩの提供する配列情報データベースＧｅｎｂａｎｋにおいて、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｐ２１９２６．４の下、インターネット上で開示されている。当該ウェブページの内容は、引用により、本明細書の一部に組み込まれる。

　（その他のエクソソームマーカータンパク質）
　なお、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームは、エクソソームが有する脂質二重膜に局在するエクソソームマーカータンパク質以外にも、エクソソームに内包されるエクソソームマーカータンパク質を標識として、識別することも可能である。そのようなエクソソームに内包されるエクソソームマーカータンパク質としては、例えば、Ａｌｉｘを挙げることができる。

　Ａｌｉｘ（ＡＬＧ－２－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｘ）は、ＡＩＰ１（ＡＬＧ－２－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１）又はＨｐ９５としても知られる、ＰＤＣＤ６ＩＰ遺伝子によってコードされるタンパク質である。Ａｌｉｘは、ＡＬＧ－２（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｌｉｎｋｅｄ　ｇｅｎｅ　２　ｐｒｏｄｕｃｔ）が関与する作用機序を介して、アポトーシス（細胞死）に関与することが知られている。なお、ＡＬＧ－２は、５つの反復ＥＦハンド構造を有する２２ｋＤａのタンパク質であり、小胞体（ＥＲ）ストレスに続く、カルシウム誘導性のアポトーシス調節因子として知られている。Ａｌｉｘは、Ｃ末端のプロリンリッチな領域を介してＡＬＧ－２と相互作用し、多胞体の形成に関与することが知られている。ヒトＡｌｉｘのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩの提供する配列情報データベースＧｅｎｂａｎｋにおいて、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｑ８ＷＵＭ４．１の下、インターネット上で開示されている。当該ウェブページの内容は、引用により、本明細書の一部に組み込まれる。

　［エクソソームの入手方法］
　本実施形態においては、エクソソームは、幹細胞に由来するものであり、より具体的には、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、外胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、内胚葉由来細胞からなる群から選ばれる幹細胞に由来するものである。このため、本実施形態のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームは、多様な性質の細胞に由来するエクソソームに対して直接適用することができるので、当該エクソソームの特性に応じた、様々な細胞への標的指向性をペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームに付与することができる。

　このような多能性幹細胞、間葉系幹細胞、外胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、内胚葉由来細胞としては、例えば、以下に例示する細胞を挙げることができる。

　（多能性幹細胞）
　多能性幹細胞とは、潜在的に、生体の多様な組織に分化する能力有する細胞であり、具体的には、内胚葉、中胚葉、外胚葉の全てに分化可能である細胞である。このような細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が挙げられる。

　（間葉系幹細胞）
　間葉系幹細胞とは、主として中胚葉由来の組織と、一部の外胚葉由来組織及び内胚葉系組織に分化する能力を有する幹細胞である。間葉系幹細胞のマーカーとしては、接着分子としてのＣＤ１０６、ＣＤ１６６、及びＣＤ２９、並びにＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、及びＣＤ７１が知られており、ネガティブマーカーとしては、接着分子ＣＤ３１、ＣＤ１８、及びＣＤ５６、造血性マーカーＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、及びＣＤ１１、並びに共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＣＤ４０が知られている。

　（外胚葉由来細胞）
　外胚葉由来細胞としては、角質化上皮細胞（表皮性ケラチン産生細胞、表皮基底細胞、爪ケラチン産生細胞、爪床基底細胞、髄様毛幹細胞、皮質毛幹細胞、クチクラ毛幹細胞、クチクラ毛根鞘細胞、ハクスリー層の毛根鞘細胞、ヘンレ層の毛根鞘細胞、外毛根鞘細胞、毛包細胞）、重層上皮細胞（角膜、舌、口腔、食道、肛門管、尿道、膣の単層扁平上皮細胞；角膜、舌、口腔、食道、肛門管、尿道、膣の基底細胞；膀胱表皮細胞）、コルチ器の内有毛細胞、コルチ器の外有毛細胞、嗅上皮の基底細胞、冷覚感覚神経細胞、熱覚感覚神経細胞、表皮のメルケル細胞、嗅覚受容神経、痛覚感覚ニューロン、網膜の光受容体細胞（桿体細胞、青色錐体細胞、緑色錐体細胞、赤色錐体細胞）、深部感覚ニューロン、触覚感覚ニューロン、Ｉ型頚動脈小体細胞、ＩＩ型頚動脈小体細胞、前庭系のＩ型有毛細胞、前庭系のＩＩ型有毛細胞、Ｉ型味蕾細胞、自律神経細胞（コリン作動性神経細胞、アドレナリン作動性神経細胞、ペプチド作動性神経細胞）、コルチ器の内柱細胞、コルチ器の外柱細胞、コルチ器の内指節細胞、コルチ器の外指節細胞、コルチ器の境界細胞、コルチ器のヘンゼン細胞、前庭器支持細胞、味蕾支持細胞、嗅上皮支持細胞、シュワン細胞、衛星細胞、腸グリア細胞、中枢神経系ニューロンとグリア細胞（アストロサイト、ニューロン、希突起膠細胞、紡錘形神経細胞）、レンズ細胞（前部レンズ表皮細胞、結晶性レンズ繊維細胞）が挙げられる。

　（中胚葉由来細胞）
　中胚葉由来細胞としては、肝細胞、脂肪細胞（白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞）、伊東細胞、腎臓傍細胞、糸球体上皮細胞、近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレのループ細いセグメントの細胞、遠位尿細管細胞、集合管細胞、Ｉ型肺胞上皮細胞、腺房中心細胞、平滑筋導管細胞（主細胞、間在細胞）、導管細胞、腸刷子縁細胞、外分泌腺線条導管細胞、胆嚢上皮細胞、精巣輸出管非線毛細胞、精巣上体主細胞、精巣上体基底細胞、エナメル芽細胞、半月面上皮細胞、コルチ器歯間上皮細胞、疎性結合組織線維芽細胞、角膜線維芽細胞、腱線維芽細胞、骨髄細網結合組織線維芽細胞、その他の非上皮線維芽細胞、周皮細胞、椎間板の髄核細胞、セメント芽細胞、象牙芽細胞、硝子軟骨軟骨細胞、線維軟骨軟骨細胞、弾性軟骨軟骨細胞、骨芽細胞、骨前駆細胞、硝子体の硝子体細胞、耳の星細胞、膵臓星細胞、収縮性細胞、骨格筋細胞（遅筋細胞、速筋細胞、中間筋細胞、筋紡錘の核袋線維、筋紡錘の核鎖線維）、筋衛星細胞、心筋細胞（心筋細胞、有節心筋細胞、プルキンエ線維細胞）、平滑筋細胞、虹彩の筋上皮細胞、外分泌腺の筋上皮細胞、巨核球、単球、結合組織マクロファージ、上皮ランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、小膠細胞、好中球、好酸球、好塩基球、ハイブリドーマ細胞、肥満細胞、Ｔｈ２細胞、制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、網赤血球、血液や免疫系の幹細胞および前駆細胞、赤芽球、骨髄球、卵母細胞、精子細胞、精母細胞、精原細胞、ナース細胞、卵巣濾胞細胞、セルトリ細胞、胸腺上皮細胞、間質腎臓細胞、及びこれらから誘導される任意の培養細胞が挙げられる。

　（内胚葉由来細胞）
　内胚葉由来細胞としては、唾液腺粘液細胞、唾液腺ｎ１細胞、味蕾のフォン・エブネル腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳道腺細胞、エクリン腺、腺暗細胞、エクリン腺明細胞、アポクリン腺細胞、睫毛腺細胞、皮脂腺細胞、鼻の上皮細胞のボーマン腺細胞、十二指腸のブルンナー腺細胞、精嚢細胞、前立腺細胞、尿道球腺細胞、バルトリン腺細胞、尿道腺細胞、子宮内膜細胞、杯細胞、胃粘膜細胞、胃の主細胞、壁細胞、膵腺房細胞、小腸のパネート細胞、肺のＩＩ型肺細胞、肺のクララ細胞、脳下垂体前葉細胞（成長ホルモン分泌細胞、プロラクチン分泌細胞、下垂体向甲状腺細胞、向生殖腺細胞、副腎皮質刺激ホルモン分泌細胞）、メラニン細胞刺激ホルモン産生細胞、大型神経分泌ニューロン、甲状腺細胞（瀘胞細胞、濾胞傍細胞）、副甲状腺細胞（主細胞、好酸性細胞）、副腎細胞（クロム親和性細胞等）、ライディッヒ細胞、内莢膜細胞、黄体細胞（顆粒層ルテイン細胞、卵胞膜ルテイン細胞）、傍糸球体細胞、緻密斑細胞、周極細胞、メサンギウム細胞、及びこれらから誘導される任意の培養細胞が挙げられる。

　これらの細胞からエクソソームを得るにあたっては、これらの細胞を細胞培養に慣用される通常の培地で１日間から３０日間培養し、その培養液を回収して、必要に応じ、ゲル濾過クロマトグラフィー、上述の、ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＣＤ９から選ばれる抗原に対する抗体を利用したアフィニティーカラムクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ホスファチジルセリンアフィニティークロマトグラフィー等の従来慣用されているカラムクロマトグラフィーや、フローサイトメトリーによって、直径２０ｎｍから１５０ｎｍの粒子径のエクソソームを分離・濃縮することにより得ることができる。なお、エクソソームを含む培養上清がエクソソーム以外の固形成分を含まないことが明白であり、かつ実施する操作の特性に応じ、エクソソームの濃縮操作を必要としない場合は、上記分離・濃縮操作を実施しなくてもよい。

　なお、エクソソームを得るための細胞培養において使用できる培地は、通常の細胞培養用培地を用いることができ、特に限定されるものではないが、エクソソームの産生能を高めるためには、例えば、エクソソームを含まない完全合成培地を用いることが好ましく、天然培地を用いる場合や、合成培地に血清等の天然由来成分を添加する場合でも、天然培地や天然由来原料からエクソソームが除去されていることが好ましい。

　［ペプチド結合脂質誘導体］
　本実施形態のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームは、複合脂質の親水性部位にペプチドが結合している、ペプチド結合脂質誘導体を脂質二重層中に含んでいる。本発明のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの形成方法は、特に限定されるものではないが、本実施形態のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームは、ペプチド結合脂質誘導体を含むリポソームを形成し、このリポソームをエクソソームと融合させることにより得られる。なお、本実施形態は、ペプチド結合脂質誘導体を、リポソームに組み込むことにより、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームに組み込む態様に限定されず、ペプチド結合脂質誘導体をエクソソームに組み込んでもよいし、ハイブリッドリポソームエクソソームに直接組み込んでもよい。このペプチド結合脂質誘導体は、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの外表面に露出しやすいので、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームに対して、標的細胞への取り込みに関する付加的機能を付与できる。これにより、標的細胞へのより高濃度の有効成分の送達が可能な、ドラッグデリバリーシステムのキャリアを提供できる。

　（ペプチド結合脂質誘導体に結合するペプチド）
　本実施形態において、ペプチド結合脂質誘導体に結合するペプチドは、１０残基以上３０残基以下のアミノ酸残基を有することが好ましい。上記ペプチドのアミノ酸残基数が上記の範囲内のものであることにより、ペプチド結合脂質誘導体に結合するペプチドの機能を十分に担保しつつも、嵩の大きなペプチドがペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの脂質二重膜と、エンドソームの脂質二重膜との融合を阻害しにくい。上記ペプチドのアミン酸配列は、例えば、１０以上２７以下、１５以上２０以下、１７以上１９以下等であってもよい。

　これらのペプチドについて、より具体的に説明すると、上記のペプチドは、エンドソーム内において、疎水性表面を有するα－ヘリックス構造を形成するペプチドや、塩基性残基を有するペプチドであることが好ましい。

　（疎水性表面を有するα－ヘリックス構造を形成するペプチド）
　エンドソーム内で、疎水性表面を有するα－ヘリックス構造を形成するペプチドは、通常、アミノ酸残基にして、３残基から４残基のピッチで、一定の繰り返し配列を有する場合がある。このような繰り返し配列には、嵩の小さな疎水性アミノ酸や、嵩の小さな酸性アミノ酸及び／又は極性アミノ酸が含まれていることが好ましい。本発明は理論により拘束されるものではないが、特に、酸性アミノ酸の側鎖に含まれる酸性基は、弱酸としての性質を有するので、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームがエンドソームに取り込まれ、周辺環境が酸性となった場合にプロトン化され、他の疎水性アミノ酸残基とともに疎水性表面を有するα－ヘリックス構造を形成しやすい。疎水性表面を有するα－ヘリックス構造を有する１０残基以上３０残基以下のアミノ酸残基が脂質二重膜の外表面に露出している場合、エンドソーム（リソソーム）を構成する脂質二重膜に貫通しやすくなり、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームと、エンドソーム（リソソーム）が融合しやすくなる。つまり、この疎水性表面を有するα－ヘリックス構造の作用により、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームがエンドソーム脱出を惹起されやすくなり、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの内容物が細胞質に取り込まれやすくなる。

　上記ペプチドが疎水性表面を有するα－ヘリックス構造を形成するペプチドである場合、繰り返し配列に含まれる疎水性アミノ酸残基は、アラニン残基、ロイシン残基、及びメチオニン残基から選択される１種以上であることが好ましく、アラニン残基及びロイシン残基から選択される１種以上であることがより好ましい。また、この繰り返し配列を構成するアミノ酸残基の少なくとも１残基は、以下に説明する酸性アミノ酸残基及び極性アミノ酸残基から選ばれる１種以上であることが好ましい。繰り返し配列に含まれる酸性アミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基から選択される１種以上であることが好ましく、グルタミン酸残基であることがより好ましい。繰り返し配列に含まれる極性アミノ酸残基としては、アスパラギン残基及びグルタミン残基から選択される１種以上であることが好ましく、グルタミン残基であることがより好ましい。なお、繰り返し配列には、疎水性アミノ酸残基と酸性アミノ酸残基の組み合わせが含まれることが最も好ましい。

　このような条件を満たすペプチドの一例としては、例えば、配列番号１（ＷＥＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＨＬＡＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＡ）で表される３０残基のアミノ酸配列が挙げられる。

　（塩基性残基を有するペプチド）
　塩基性残基を有するペプチドとしては、少なくとも１残基の塩基性アミノ酸残基を有するペプチドが挙げられる。この塩基性アミノ酸残基の塩基性基が、エンドソーム（リソソーム）中の酸性環境下でプロトン化されることにより、脂質二重層の表層を構成する、リン酸基等の親水性部位と静電的に相互作用することにより、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの細胞内への取り込みを促進できる。上記ペプチドは、２残基以上５残基以下の連続した塩基性アミノ酸残基を有することが好ましく、３残基以上４残基以下の連続したアミノ酸残基を有することがより好ましい。上記のペプチドがこのように連続した塩基性アミノ酸残基を有することにより、プチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの細胞内への取り込みをより促進できる。

　さらに、上記ペプチドは、酸性アミノ酸残基を含まないことが好ましい。これにより、上記ペプチド中の塩基性アミノ酸残基と、脂質二重層の表層のリン酸基と相互作用が酸性アミノ酸残基により阻害されず、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの細胞内への取り込みをより促進できる。

　このような条件を満たすペプチドの一例としては、例えば、配列番号２（ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ）、配列番号３（ＣＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）、配列番号４（ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ）、及び配列番号５（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）で表される、それぞれ、１８残基、１１残基、２６残基、及び１６残基のアミノ酸配列が挙げられる。

　なお、本実施形態において、上記ペプチドを構成するアミノ酸残基は、天然アミノ酸に由来するアミノ酸残基に限定されるわけではなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、天然アミノ酸以外のアミノ酸に由来するアミノ酸残基や、光学異性体等、天然アミノ酸の各種異性体であるアミン酸に由来するアミノ酸残基を追加的に含んでいてもよい。上記のペプチドが有する、そのような非天然アミノ酸、又は天然アミノ酸の各種異性体は、上記のペプチド全体において、１残基から３残基程以下のみ含まれていることが好ましく、全てのアミノ酸残基が天然アミノ酸に由来するアミノ酸残基であることがより好ましい。

　（ペプチド結合脂質誘導体を構成する複合脂質）
　ペプチド結合脂質誘導体を構成する複合脂質としては、脂質二重膜を構成する、非極性溶媒に可溶な、生物由来の物質として公知の複合脂質を挙げることができ、より具体的には、末端に１級アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、リン酸基、チオール基からなる群から選ばれるいずれかの反応性基を有する複合脂質を挙げることができる。これらの複合脂質は、例えば、スフィンゴリン脂質、スフィンゴ糖脂質、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、エーテル型リン脂質、エーテル型糖脂質等から選択される。これらの複合脂質は、分子内にリン酸基に由来する極性基や、糖に由来する極性基等を有するので、そのような極性基とペプチドが有する極性基を反応させることができ、複合脂質とペプチドを容易に結合させることができる。

　スフィンゴリン脂質としては、スフィンゴミエリン等を挙げることができ、スフィンゴ糖脂質としては、セレブロシド（ガラクトセレブロシド、スルファチド、グルコセレブロシド等）、ガングリオシド、グロボシド、スルファチド等が挙げられる。また、グリセロリン脂質としては、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール等を挙げることができ、グリセロ糖脂質としては、モノガラクトシルジアシルグリセロール等の任意の単糖又はオリゴ糖とジアシルグリセロールの縮合体が挙げられる。また、グリセロリン脂質及びグリセロ糖脂質を構成するジアシルグリセロール部分の、疎水性基を構成する飽和脂肪族基及び不飽和脂肪族基は、通常、炭素数１２以上２０以下の飽和又は不飽和脂肪酸に由来する飽和脂肪族基及び不飽和脂肪族基が挙げられる。このうち、飽和脂肪酸としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、ヘプタデカン酸、ステアリン酸、アラキジン酸等を挙げることができ、不飽和脂肪酸としては、モノ不飽和脂肪酸（ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、パクセン酸、ガドレイン酸、エイコセン酸等）、ジ不飽和脂肪酸（リノール酸、エイコサジエン酸等）、トリ不飽和脂肪酸（リノレン酸、ピノレン酸等）、テトラ不飽和脂肪酸（ステアリドン酸、アラキドン酸等）、ペンタ不飽和脂肪酸（エイコサペンタエン酸等）、ヘキサ不飽和脂肪酸（ヘキサドコサエン酸等）が挙げられる。上記のグリセロリン脂質及びグリセロ糖脂質を構成する脂肪族基は、飽和脂肪族基及び不飽和脂肪族基が混在していてもよく、炭素数の異なる脂肪族基、不飽和基の数の異なる脂肪族基が混在していてもよい。

　エーテル型リン脂質及びエーテル型糖脂質としては、グリセロールに１つ又は２つの長鎖炭化水素基がエーテル結合すると共に、極性基としてリン酸基や糖を有する複合脂質であり、好熱性細菌に広く認められるとともに、血小板活性化因子等も類似の構造を有することが知られている。この場合、グリセロールに結合する２つの炭化水素基は、炭素数１２以上２０以下の飽和又は不飽和炭化水素基であることが好ましい。即ち、エーテル型リン脂質及びエーテル型糖脂質は、１分子又は２分子の炭素数１２以上２０以下の高級飽和又不飽和アルコールと、グリセロールがエーテル結合により結合しており、グリセロールの残る１つの水酸基にリン酸基、又は単糖若しくはオリゴ糖が結合した構造のモノであることが好ましい。

　複合脂質については、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０１９，２０，２１６７、及びＮａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，２０１８，１９，２８１に詳細が説明されており、その内容は、引用により本明細書の一部に組み込まれる。

　（ペプチド結合脂質誘導体を形成する方法）
　本実施形態において、ペプチド結合脂質誘導体を形成するにあたっては、ペプチドの有するＮ末端アミノ基、又はＣ末端カルボキシル基と、複合脂質が有する、リン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基等を共有結合的に結合させる任意の化学反応方法を採用できる。本実施形態においては、そのような化学反応方法の中でも、複合脂質が有する、リン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基等に対して、後述するリンカーにより複合脂質に導入されるカルボキシル基やアミノ基と、アミノ基とを反応させる化学反応方法を採用することが好ましい。そのような化学反応方法としては、カルボジイミド架橋反応、ＮＨＳエステル架橋反応、イミドエステル架橋反応等が挙げられる。これらの化学反応方法は、カルボキシル基やアミノ基を所定の化合物で活性化させ、次いで、これをアミノ基やカルボキシル基と共有結合的に結合させる。これらの化学反応方法を実施するための架橋剤は、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．等から市販されており、当業者はそのような市販品を利用して、上記化学反応方法を実施できる。

　複合脂質にカルボキシル基やアミノ基を導入するためのリンカーとしては、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコールや、これらのポリアルキレングリコールに１級アミノ基やカルボキシル基を導入した化合物が挙げられる。この場合、エチレングリコールやプロピレングリコールの重合度としては、例えば、２０以上５０以下、３０以上４５以下等の重合度が挙げられる。リンカーとして、より具体的には、ＨＯＯＣ－ＰＥＧ－ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ－ＰＥＧ－ＣＯＯＨ、Ｈ_２Ｎ－ＣＯＯＨ－ＮＨ_２等の化合物を例示できる。これらのリンカーは、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．等から市販されており、当業者はそのような市販品を適宜利用できる。さらに、Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ，　Ｉｎｃ．等から市販されている、複合脂質に、上記リンカーを介して、上記架橋剤が導入された複合脂質誘導体を使用して、ペプチド結合脂質誘導体を形成してもよい。

　［ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの検出方法］
　本発明のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＣＤ９から選ばれるエクソソームマーカータンパク質に対して特異的に結合する、第１の蛍光色素が結合された抗体と、ペプチド結合脂質誘導体を構成するペプチドのうちのいずれかに対して特異的に結合する、第２の蛍光色素が結合された抗体と、を添加したペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを、フローサイトメトリーを利用して分析した際に、第１の蛍光色素が結合された抗体、及び第２の蛍光色素が結合された抗体が、ともに結合する小胞として検出できる。

　（エクソソームマーカータンパク質、及びペプチド結合脂質誘導体を構成するペプチドに対する抗体の作製方法）
　エクソソームマーカータンパク質、及びペプチド結合脂質誘導体を構成するペプチドに対する抗体は、従来公知の方法を利用して作製できる。これらの抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。また、これらの抗体は、マウス抗体、ラット抗体、モルモット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体等、抗体作製において慣用されている動物の抗体、及びそれらのキメラ抗体であってもよい。以下、合成ペプチドを利用してウサギを免疫し、ポリクローナル抗体を取得する方法について、例示的に説明する。

　（ペプチドの合成）
　ペプチドの合成は、ペプチド合成に慣用されている方法を採用することができ、通常、固相法により合成され、ＢｏｃやＦｍｏｃ等を保護基として使用するＢｏｃ法、Ｆｍｏｃ法等が慣用される。これらの方法によりペプチドを合成した場合、最終的に脱保護したペプチド鎖は、精製して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により純度を確認するとともに、質量分析法により分子量を確認することにより、適切に合成・精製されていることを確認する。得られたペプチドは、凍結乾燥して保存してもよい。なお、特に、短鎖ペプチドを抗原として生成する場合、上記の化学合成法を利用して合成することが一般的であるが、より高分子量のたんぱく質を抗原として用いる場合、例えば、常法にしたがって、培養細胞等で過剰発現させ、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、ゲルろ過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー等、ペプチドの分離精製方法として慣用されている手法を適宜組み合わせて使用して、当該たんぱく質を精製することにより、抗原として提供してもよい。

　（ウサギの免疫及び抗体の取得）
　合成した抗原が、短鎖ペプチドである場合、その免疫原性を高めるため、キャリアたんぱく質と結合させる。キャリアたんぱく質としては、典型的には、キーホルリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）やウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等を挙げることができ、マレイミド法等の慣用の方法を利用して、上記抗原と結合させることができる。なお、免疫原となるたんぱく質が、高分子のものである場合、キャリアたんぱく質への結合は必ずしも必要ではない。これらのコンジュゲート済みの抗原又は未コンジュゲート抗原は、アジュバントと混合して、ウサギに免疫される。アジュバントとしては、沈降性アジュバント（水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン、ペペス、カルボキシビニルポリマー等）、及び油性アジュバント（流動パラフィン、ラノリン、フロイント、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント）等を用いることができる。

　コンジュゲート済みの抗原又は未コンジュゲート抗原をウサギに投与するにあたっては、０．１ｍｇから０．５ｍｇの抗原を、１週から４週の間隔で、４回から６回投与する。その後、抗血清の抗体価を確認し、抗体価が０．５以上となった場合には、ウサギの頸動脈から全血を採取し、血球成分を分離して抗血清を得る。この抗血清について、抗原となったペプチドやたんぱく質を利用したアフィニティークロマトグラフィー等、慣用の生成方法を適用し、モノクローナル抗体を得る。

　（蛍光色素）
　上述のようにして得られたポリクローナル抗体に対しては、蛍光色素を標識することができる。そのような蛍光色素については、抗体に結合させるものとして、慣用されている蛍光色素を挙げることができる。具体的には、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＴＡＭＲＡ、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ、ＦＡＭ、ＡＰＣ、ＰＥ、ＡＴＴＯ、ＤｙＬｉｇｈｔ等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

　（ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム含有組成物）
　本実施形態において、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを含むペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム含有組成物においては、ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＣＤ９から選ばれるエクソソームマーカータンパク質に対して特異的に結合する、第１の一次抗体と、上記のペプチド（例えば、配列番号１から５で表されるアミノ酸配列を有するペプチド）のうちのいずれかに対して特異的に結合する、第２の一次抗体と、第１の一次抗体に特異的に結合する、第１の蛍光色素が結合された第１の二次抗体と、第２の一次抗体に特異的に結合する、第２の蛍光色素が結合された第２の二次抗体と、を添加し、ここで、第１の一次抗体の添加量と抗体価の積と第２の二次抗体の添加量と抗体価の積の比が１：１であり、第１の一次抗体と、第１の二次抗体と、の添加量比が２：１であり、第２の一次抗体と、第２の二次抗体と、の添加量比が２：１であり、エクソソーム中に含まれる複合脂質に特異的に結合する磁気ビーズに結合させたペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを、フローサイトメトリーを利用して分析した際に、以下の条件を満たすことが好ましい。
　０．６≦Ａ／（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）≦１．０　　　　　　式（１）
（ただし、式（１）において、Ａは、第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素の両方で標識されたペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを示すピークの面積であり、Ｂは、第１の蛍光色素のみで標識されたエクソソームを示すピークの面積であり、Ｃは、第２の蛍光色素のみで標識されたリポソームを示すピークの面積である。）

　また、本実施形態おペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを含むペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム含有組成物は、細胞の培養液から得られるエクソソームと、上記ペプチドを導入したリポソームとを融合させ、それによる組成物から、ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＣＤ９から選ばれるエクソソームマーカータンパク質に対して特異的に結合する、第１の一次抗体と、上記のペプチド（例えば、配列番号１から５で表されるアミノ酸配列を有するペプチド）のうちのいずれかに対して特異的に結合する、第２の一次抗体と、第１の一次抗体に特異的に結合する、第１の蛍光色素が結合された第１の二次抗体と、第２の一次抗体に特異的に結合する、第２の蛍光色素が結合された第２の二次抗体と、を添加し、ここで、第１の一次抗体の添加量と抗体価の積と第２の二次抗体の添加量と抗体価の積の比が１：１であり、第１の一次抗体と、第１の二次抗体と、の添加量比が２：１であり、第２の一次抗体と、第２の二次抗体と、の添加量比が２：１であり、エクソソーム中に含まれる複合脂質に特異的に結合する磁気ビーズに結合させたペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを、フローサイトメトリーを利用して分析した際に、以下の条件を満たす画分を選抜するペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム含有組成物の選抜方法にも関する。
　０．６≦Ａ／（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）≦１．０　　　　　　式（１）
（ただし、式（１）において、Ａは、第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素の両方で標識されたペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを示すピークの面積であり、Ｂは、第１の蛍光色素のみで標識されたエクソソームを示すピークの面積であり、Ｃは、第２の蛍光色素のみで標識されたリポソームを示すピークの面積である。）

　なお、以上のフローサイトメトリーを実施するに当たっては、以下の点に留意すべきである。
　（ａ）抗体価は、ＢｉｏＴｅｋ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製Ｓｙｎｅｒｇｙ　ＨＴＸ等のマイクロプレートリーダーを用い、従来公知のＥＬＩＳＡ法（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｋｃｒａｆｔ．ｃｏ．ｊｐ／ｐａｇｅ／ｅｌｉｓａ．ｈｔｍを参照）により酵素による発色に伴う吸光度変化を測定することにより決定される。
　（ｂ）第１の一次抗体としては、マウス抗体が用いられ、第１の二次抗体としては、ＰＥ－ＣＹ７標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体が用いられる。第２の一次抗体としては、ウサギ抗体が用いられ、第２の二次抗体としては、ＦＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体が用いられる。
　（ｃ）第１の一次抗体、及び第２の一次抗体の添加量は、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム含有組成物１００μＬに対して、０．１ｍｇから１ｍｇの範囲内で、添加量を変更させて蛍光強度を測定し、第１の一次抗体及び第２の一次抗体とも、特異的蛍光が添加量に応じて変化する添加量の条件下で、非特異的蛍光が観察されない添加量を決定することにより決められる。
　（ｄ）フローサイトメーターとしては、Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）　Ａｃｏｕｓｔｉｃ　Ｆｏｃｕｓｉｎｇ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．製）が用いられる。

　以上の、磁気ビーズを利用したフローサイトメトリーに関しては、富士フィルム和光純薬株式会社製社から販売しているＰＳ　Ｃａｐｔｕｒｅ　エクソソームフローサイトメトリーキットを用いることができ、このキットを利用したプロトコールの一部の詳細については、Ｎａｋａｉ，Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．，Ａ　ｎｏｖｅｌ　ａｆｆｉｎｉｔｙ－ｂａｓｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｉｇｈｌｙ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６，３３９３５にその詳細が記載されていて、その内容は、引用により、本明細書の一部に組み込まれるが、後述する具体的なフローの記載と矛盾する部分が存在する場合は、後述する具体的なフローの記載が優先する。

　ＰＳ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｍｅｔｏｒｙ　Ｋｉｔの原理を図３（ホスファチジルセリン結合たんぱく質Ｔｉｍ４を利用したエクソソームのフローサイトメトリーの概念図）に示すが、このキットでは、磁気ビーズ１に、ホスファチジルセリンへの結合能を有するたんぱく質２（Ｔｉｍ４）が結合しており、これが、カルシウムイオン３に依存的にエクソソーム４に結合する。磁気ビーズ１に結合したエクソソーム４に特異的な蛍光標識抗体５でエクソソーム５を染色することにより、磁気ビーズ１に結合したエクソソーム４に特異的な、フローサイトメトリーのピーク（ｙ）が観察されるようになる。なお、Ｔｉｍ４のホスファチジルセリンへの結合はカルシウムイオ３に依存性であるため、キレート剤を利用してカルシウムイオンを除去することにより、エクソソーム４は磁気ビーズ１から放出される。

　より具体的には、以下のフローが採用される。

　（ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの分離）
　（Ａ１）細胞培養上清を、３００×ｇ、４℃、５分；１，２００×ｇ、４℃、２０分；１０，０００×ｇ、４℃、３０分、それぞれ遠心分離することにより上清を回収する。
　（Ａ２）１５ｍＬ容遠沈管に０．５ｍＬのＷａｓｈｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（１０×）（キットに同封）と４．５ｍＬの超純水を加え、ボルテックスミキサーで混合する。ここに、５０μＬ（１／１００容量）のＥｘｏｓｏｍｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｅｎｈａｎｃｅｒ（キットに同封）を添加し、ボルテックスミキサーで混合する。
　（Ａ３）新しい１．５ｍＬ容マイクロチューブに２．を３００μＬ添加する。
　（Ａ４）ＰＳ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｍｅｔｏｒｙ　Ｋｉｔに同封されるＥｘｏｓｏｍｅ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｂｅａｄｓをボルテックスミキサーで１０秒以上攪拌する。
　（Ａ５）（Ａ４）から３０μＬのＥｘｏｓｏｍｅ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｂｅａｄｓを分取し、（３）に添加する。
　（Ａ６）（Ａ５）の１．５ｍＬ容マイクロチューブを５秒程度ボルテックスし、卓上遠心機でスピンダウンした後、磁気スタンドにセットして約１分間静置し、上清をピペットで取り除く。
　（Ａ７）（Ａ２）の３００μＬを、再度、（Ａ６）の１．５ｍＬ容マイクロチューブに加え、（６）を繰り返す。
　（Ａ８）（Ａ７）の１．５ｍＬ容マイクロチューブに、（Ａ１）の上清１００μＬを加え、５秒程度ボルテックスする。これに、１μＬ（１／１００容量）のＥｘｏｓｏｍｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｅｎｈａｎｃｅｒを添加し、５秒程度ボルテックスする。
　（Ａ９）（Ａ８）を室温で１時間静置する。その間、サンプル添加後、２０分、４０分、１時間で１．５ｍＬ容マイクロチューブを５秒程度ボルテックスする。
　（Ａ１０）（Ａ９）の１．５ｍＬ容マイクロチューブを卓上遠心機でスピンダウンした後、磁気スタンドにセットして約１分間静置し、上清をピペットで取り除く。
　（Ａ１１）（Ａ２）の３００μＬを、（Ａ１０）の１．５ｍＬ容マイクロチューブに加え、（Ａ６）を繰り返す。これをさらに１回繰り返す。
　（Ａ１２）（Ａ２）の３００μＬを、（Ａ１１）の１．５ｍＬ容マイクロチューブに加え、５秒程度ボルテックスする。

　（蛍光抗体染色及びフローサイトメトリー）
　（Ｂ１）２本の１．５ｍＬ容マイクロチューブに、（Ａ１２）で得られたペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム組成物１００μＬずつを分注する。
　（Ｂ２）第１の一次抗体及び第２の一次抗体を、上記（ｃ）で決めた添加量ずつ（Ｂ１）の１．５ｍＬ容マイクロチューブに添加し、３秒程度ボルテックスする。
　（Ｂ３）（Ｂ２）の１．５ｍＬ容マイクロチューブを室温で１時間静置する。その間、第１の一次抗体及び第２の一次抗体の添加後、２０分、４０分、１時間で１．５ｍＬ容マイクロチューブを５秒程度ボルテックスする。
　（Ｂ４）（Ｂ３）の１．５ｍＬ容マイクロチューブを卓上遠心機でスピンダウンした後、磁気スタンドにセットして約１分間静置し、上清をピペットで取り除く。
　（Ｂ５）（Ａ２）の３００μＬを、（Ｂ４）の１．５ｍＬ容マイクロチューブに加え、（Ｂ４）を繰り返す。これをさらに１回繰り返す。
　（Ｂ６）第１の二次抗体及び第２の二次抗体について、（Ｂ２）から（Ｂ５）を繰り返す。
　（Ｂ７）（Ａ２）の３００μＬを、（Ｂ６）の１．５ｍＬ容マイクロチューブに加え、５秒程度ボルテックスする。
　（Ｂ８）（Ｂ７）のサンプルをフローサイトメトリーに使用する。フローサイトメトリーを行うに当たっては、前方散乱と側方散乱のプロット図から磁気ビーズが凝集していない画分をゲーテイングし、ゲート内に含まれる磁気ビーズの蛍光強度を比較する。

　以上のような条件を満たす、又は以上のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム含有組成物の選抜方法により選抜されるペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム含有組成物においては、含まれる小胞の大半が、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームであるため、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームによる効果を十分に発揮する組成物となる。すなわち、このようなペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム含有組成物に含まれるこのようなペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームは、標的細胞への取り込みに関する付加的機能が付与されており、標的細胞へのより高濃度の有効成分の送達が可能なものである。

　なお、本実施形態においては、後述するペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの形成方法によりペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム含有組成物を調製した後、上記フローサイトメトリーを利用した方法を活用して、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを選抜してもよい。

　＜ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの形成方法＞
　本発明の一例である、第２の実施形態は、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの形成方法に関する。図１は、実施形態に係るペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの形成方法の概略を説明する図面である。本実施形態のプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの形成方法は、複合脂質の親水性部位にペプチドを結合させ、ペプチド結合脂質誘導体を形成する工程と、リン脂質を含むリン脂質組成物及び上記ペプチド結合脂質誘導体を混合して、上記ペプチド結合脂質誘導体が組み込まれたリポソーム（図１のＡ）を形成する工程と、エクソソーム（図１のＢ）に、上記リポソームを融合させる（図１のＣ）ことで、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム（図１のＤ）を形成する工程と、を含む。本実施形態の、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの形成方法によれば、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームに対して、強い負荷をかけずに、容易にペプチド結合脂質誘導体を導入できるとともに、リポソームを形成する際に、有効成分を容易に内包させることができる。なお、以下の第２の実施形態の説明においては、第１の実施形態に記載の説明と重複する説明については、一部省略することがある。

　（リポソームの形成）
　リポソームの形成に当たっては、例えば、市販のリポソーム調整用キットを利用することができる。具体的には、片山化学工業株式会社が製造する、Ｌｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｓ　ＰＥ、ＦＤ－Ｓ　ＭＡ、ＦＤ－Ｓ　ＰＬ、ＦＤ－Ｕ　ＰＥ、ＦＤ－Ｕ　ＰＬ等の凍結乾燥リポソームを、０．１ｍｇ／４０μｌから１０ｍｇ／４０μｌの濃度でＰＢＳ緩衝液等に溶解させ混合することにより、リポソームを形成することができ、この際に、上述のペプチド結合脂質誘導体を混合し、複合脂質の相転移温度以上の温度で加温すれば、ペプチド結合脂質誘導体がリポソームに組み込まれる。なお、この際、有効成分となる薬剤、核酸、ペプチド等を添加して混合することにより、有効成分が封入されたリポソームを調製することもできる。なお、上述のペプチド結合脂質誘導体は、リポソームに組み込まれることにより、後述するハイブリッドリポソームエクソソームに組み込まれる態様に限定されず、エクソソームとペプチド結合脂質誘導体を混合して、所要の処理をすることにより、ペプチド結合エクソソームを形成する態様についても、本発明の範囲内に含まれる。

　（ペプチド結合脂質誘導体が組み込まれたリポソームとエクソソームとの融合）
　ペプチド結合脂質誘導体が組み込まれたリポソームとエクソソームとの融合は、例えば、特許文献１に記載の方法を採用することができ、その内容は、引用により、本明細書の一部に組み込まれる。より具体的には、ペプチド結合脂質誘導体が組み込まれたリポソームとエクソソームをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下に混合すればよい。ＰＥＧの添加量は、リポソームとエクソソームの混合溶液中、０質量％以上４０重量％以下程度の濃度とすればよい。ここで、使用されるＰＥＧとしては、ＰＥＧ５００～ＰＥＧ１００００、好ましくはＰＥＧ１０００～ＰＥＧ８０００が挙げられる。

　＜ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム＞
　本発明の一例である、第３の実施形態のペプチド結合エクソソームは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＣＤ９から選ばれるエクソソームマーカータンパク質と、複合脂質の親水性部位にペプチドが結合している、ペプチド結合脂質誘導体と、を脂質二重層中に含んでいる。本実施形態のペプチド結合エクソソームは、リポソームと融合されていない点以外においては、第１の実施形態のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームとその構成及び特性が共通するため、本実施形態においては、第１の実施形態と共通する説明はその説明を省略する。

　本実施形態のペプチド結合エクソソームは、リポソームとの融合過程を経ないため、ＤＤＳとして利用する際に、標的細胞・標的組織に送達すべき有効成分をペプチド結合エクソソームに内包させる際に、上記第１の実施形態とは異なる手法を採用する必要がある。

　本実施形態において、ペプチド結合エクソソームには、低分子化合物、ポリヌクレオチド、ポリペプチド及びタンパク質が内包されうるが、例えば、低分子化合物をペプチド結合エクソソームに内包させる場合には、エクソソームを供給する細胞に、トランスフォーメーション等の従来公知の手法により、当該低分子化合物の合成酵素を過剰発現させてもよいし、当該低分子化合物の輸送膜タンパク質を当該細胞に過剰発現させたり、必要に応じて、これをエクソソーム膜上に富化し、外部から添加した当該低分子化合物を当該細胞やエクソソームに取り込ませたりしてもよい。また、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及びタンパク質をエクソソームに内包させる場合、当該ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及びタンパク質を、必要に応じて、エクソソーム移行シグナルを付与した上で、エクソソームを供給する細胞で発現等させればよい。これらの手法は、当業者に広く一般に知られており、当業者はこれらの手法を適宜組み合わせて利用することができる。なお、エクソソーム特異的な各種生体分子の輸送機構については、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　９１（４）：５１４－５１８（２０１９）等の公知文献に説明されており、当該文献の記載は、参照により本願明細書の一部として組み込まれる。

　以下、本発明の実施例について、図面を参照して詳細に説明する。なお、以下に示す実施例は、例示による説明のために記載されたものであり、本発明は、以下に説明する実施形態に何ら限定されるものではない。

　＜実験例１：抗癌剤封入リポソームへのペプチド結合による細胞増殖抑制効果の検討＞
　アントラサイクリン系抗腫瘍性抗生物質である、ドキソルビシンを封入したリポソームに、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを結合したホスファチジルエタノールアミンであるペプチド結合複合脂質誘導体を導入して、細胞増殖抑制能の検証実験を行った。なお、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドとホスファチジルエタノールアミンとの結合に際しては、ＮＨＳエステル架橋反応を用い、ペプチドとホスファチジルエタノールアミンの間に介在するリンカーとしてＨＯＯＣ－ＰＥＧ－ＣＯＯＨを用いた。

　［ＨｅＧ２細胞の調製］
　ＲｅｐｒｏＣｏａｔ（培養容器コーティング剤、ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ　Ｉｎｃ．製）を５０μｌずつ、９６ウェルマイクロプレートへ添加した。これを、３７℃、５％　ＣＯ_２で１時間静置した。Ｔ２５フラスコで継代維持していたＨｅｐＧ２細胞（肝癌細胞由来の培養細胞）をトリプシン法で剥離して回収した。細胞数をカウント・希釈して、６×１０^５細胞／１２ｍｌ溶液を作成した。これを、９６ウェルマイクロプレートへ、２．５×１０^３細胞／１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように、１００μｌずつ播種した。２４時間培養し、ＨｅｐＧ２の底面への接着と増殖を確認した。

　［ドキソルビシン封入のペプチド結合リポソーム調製］
　血清不含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）中、５０μｇ／ｍｌのペプチド結合複合脂質誘導体（配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドがリンカーを介して結合したホスファチジルエタノールアミン）が含まれるよう、ペプチド結合複合脂質誘導体の溶液を調製した。これに、ドキソルビシンを封入したリポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ　ＨＣｌ、ＦｏｒｍｕＭａｘ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．社製）を、リポソーム濃度が２０μＭとなるように加えて混合した（「リポソーム－ペプチド混合溶液」）。１．５ｍｌエッペンドルフチューブに１０％　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）溶液（トランスフェクション用溶液、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．製）を調製した（「１０％　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）溶液」）。リポソーム－ペプチド混合溶液と１０％　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）溶液を体積比１：１で混合し、２０分間室温で静置した。これをＦＢＳ混合－ＤＭＥＭ－Ｇｌｃ培地と混合し、終濃度が１％ＦＢＳ、１％　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）となるように、サンプル培地を調整した。８連ピペットで９６ウェルマイクロプレート中の培地を除去した。８連ピペットを用いて血清不含有ＤＭＥＭ培地（Ｈ－Ｇｌｃ）１００μｌで２回洗浄を行った。サンプル培地を各群ｎ＝８で１００μｌ／ｗｅｌｌずつ添加した。サンプル培地の添加は、ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルマイクロプレートに播種した７２時間後に行った。

　［増殖能検定］
　サンプル培地添加の後４８時間培養し、８連ピペットを用いて血清不含有ＤＭＥＭ培地（Ｈ－Ｇｌｃ）１００μｌで２回洗浄した。１０％　ＦＢＳ（エクソソーム除去）ＤＭＥＭ（Ｈ－Ｇｌｃ）培地を１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように添加した。更に４８時間培養後、Ｐｒｅｍｉｘ　ＷＳＴ－１　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（細胞増殖測定用試薬、タカラバイオ株式会社製）を１０μｌ／ｗｅｌｌとなるように添加し、３７．５％ＣＯ_２条件下で２時間インキュベートすることにより発色させた。４４０ｎｍの吸光度を「Ｓｙｎｅｒｇｙ　ＨＴＸマルチモードプレートリーダー」（培養プレート用吸光光度計、Ｂｉｏ　Ｔｅｋ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，　Ｉｎｃ．製）で測定した。対照群（リポソーム不添加）の吸光度の平均を１００として、各ウェルの吸光度の割合を計算し、細胞増殖の度合いの指標とした。なお、多重比較検定はＴｕｋｅｙ　ｋｒａｍｅｒ法を用いた。

　［結果］
　以上の結果を表１及び図４に示す。表１及び図４の結果から明らかなように、リポソームを添加していない対照群と比較して、ドキソルビシンを添加した全ての群で細胞増殖の抑制が確認された。しかし、リポソームの調製にあたり、ドキソルビシンのみを添加した「添加剤なし」の群とドキソルビシンに、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに由来するペプチド結合複合脂質誘導体を添加した、「ペプチド＋Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）１％」の群を比較すると、ＧＡＬＡ　Ｐｅｐｔｉｄｅを付与しても増殖抑制効果が強化されていなかった。

　＜実験例２：ｓｉＲＮＡ封入リポソームによるＨｅｐＧ２細胞の増殖抑制効果の検証＞
　実験例１では、抗癌剤であるドキソルビシン封入リポソームを利用して初期検討を行ったが、本発明の一例であるペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームにおける性能評価スキームにおける利用のため、本発明の実施形態の１つにおいて利用が検討される、核酸医薬品による実験系の確立を試みた。

　実験例２では、ＨｅｐＧ２細胞の増殖を抑制するためのｓｉＲＮＡの選定を行った。ＨｅｐＧ２細胞の増殖に影響を与えると報告されているタンパク質を３種（ＶＤＡＣ１、ＳＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ１）選抜し、これらのタンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡを設計した。これにより、ｓｉＲＮＡはＨｅｐＧ２の増殖を抑制することが期待される。なお、ｓｉＲＮＡは、Ｍｅｒｃｋ　ＫＧａＡ社の合成したｓｉＲＮＡを使用した。

　［ＨｅｐＧ２細胞増殖抑制のためのｓｉＲＮＡサンプル調整と添加］
　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉ　ＭＡＸのプロトコールに準拠して、試料となるｓｉＲＮＡ溶液の調製を行った。すなわち、１０ｐｍｏｌ／μｌの濃度に調製したｓｉＲＮＡ　１μｌとＰＬＵＳ　Ｒｅａｇｅｎｔ（トランスフェクション促進試薬、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．製）　０．８μｌを１００μｌの血清不含有培地に混合した。さらに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉ　ＭＡＸ（トランスフェクション試薬、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．製）　２．４μＬを混合し、２５分間室温で静置した。１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ（Ｈ－Ｇｌｃ）にｓｉＲＮＡを添加し、試料培地とした。アアスピレーターを用いて、実験例１の［ＨｅＧ２細胞の調製］と同様にして調製し、９６ウェルマイクロプレートで培養していたＨｅｐＧ２細胞の培地を除去した。血清不含有ＤＭＥＭ（Ｈ－Ｇｌｃ）１００μｌ／ｗｅｌｌを用い、で各ウェルを２回洗浄した。次いで、１００μｌ／ｗｅｌｌとなるようにｓｉＲＮＡを含有する試料培地を添加した。このとき、ｓｉＲＮＡは１ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌとなるように添加した。これを３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。なお、ｓｉＲＮＡを含有する試料培地の添加は、ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルマイクロプレートに播種した７２時間後に行った。

　実験例１の［増殖能検定］と同様の手法により、各試料を添加した細胞増殖の度合いを検定した。

　［結果］
　以上の結果を表２及び図５に示す。なお、表２及び図５中の＃１、＃２、及び＃３は、それぞれ同一の遺伝子のｍＲＮＡの異なるＲＮＡ配列をターゲットとするｓｉＲＮＡを示す。表２及び図５の結果から明らかなように、ｓｉＲＮＡの添加を行わなかった対照群と比較して、ｓｉＲＮＡ添加群でＨｅｐＧ２細胞の増殖が抑制された。特に、再現性実験を行った際にも、顕著に増殖能の抑制効果を示したＶＤＡＣ１＃３とＳＰ１＃３を実験例３以降での検証に用いることとした。

　＜実験例３；ｓｉＲＮＡ封入リポソームへのペプチド結合による細胞増殖抑制効果の検討＞
　本実験例では、ｓｉＲＮＡをリポソームに封入してＨｅｐＧ２細胞に投与した際の増殖抑制効果を確認した。本実験例では、封入するｓｉＲＮＡとしてＳＰ１＃３を用いることとした。

　［リポソームの調製］
　凍結乾燥リポソームとして、Ｌｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｕ　ＰＬ（ジオレイルホスファチジルコリン：コレステロール＝７０：３０、片山化学工業株式会社製）、Ｌｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｓ　ＰＬ（ジステアロイルホスファチジルコリン：コレステロール＝７０：３０、片山化学工業株式会社製）を使用した。凍結乾燥リポソームが１ｍｇ／４０μｌ　ＰＢＳ（－）となるように溶液を調製した。これにｓｉＲＮＡ液を添加して、リポソーム溶液と混合した。さらに、この混合液の１．５倍のＲＮＡ封入液（リポソームカプセル化キット、Ｌｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ，株式会社ヒュギエイアバイオサイエンス製）を混合した。混合後、室温で３０分静置した。封入されていないｓｉＲＮＡを除去するため、ｓｉＲＮＡ封入リポソーム溶液を遠心濃縮チューブＶＩＶＡＳＰＩＮ５００（フナコシ株式会社製）に移し、１３，０００Ｇ×１０ｍｉｎ、２５℃の条件で遠心分離を行った。

　［ｓｉＲＮＡ封入のペプチド結合リポソーム調製］
　配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド溶液を２０ｍＭホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．６）を添加した。配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをリポソームに付与するために、下記の２つの付与プロセスを実施した。なお、粉末のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＮＨＳ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン－Ｎ－［カルボキシ（ポリエチレングリコール）２０００，ＮＨＳエステル］、８８０１３８、Ｃｒｏｄａ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐｌｃ．）はＰＢＳに溶解して使用した。

　（付与プロセス１：複合脂質をペプチドとの反応前にリポソームに付与）
　リポソームの脂質膜へＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＮＨＳを付与するため、ｓｉＲＮＡ封入リポソーム溶液にＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＮＨＳ溶液を添加した。ｓｉＲＮＡ封入Ｌｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｕ　ＰＬとＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＮＨＳの混合液は３７℃で３０分加温した。ｓｉＲＮＡ封入Ｌｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｓ　ＰＬとＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＮＨＳの混合液は６０℃で３０分加温した。ｓｉＲＮＡ封入Ｌｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｓ　ＰＬは、脂質の相転移温度が比較的高いため、６０℃まで温度を上昇させた。この混合液に、配列番号１、配列番号２、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの溶液を添加して２時間室温で静置し、ＮＨＳ基とペプチドのアミノ基を反応させた。

　（付与プロセス２：複合脂質をペプチドとの反応後リポソームに付与）
　配列番号１、配列番号２、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの溶液とＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＮＨＳ液を混合し、室温で２時間静置することでＮＨＳ基とペプチドのアミノ基とを反応させた。さらに、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ペプチド溶液をｓｉＲＮＡ封入リポソーム溶液と混合した。ｓｉＲＮＡ封入Ｌｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｕ　ＰＬと　ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ペプチドの混合液は３７℃で３０分加温した。ｓｉＲＮＡ封入Ｌｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｓ　ＰＬとＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ペプチドの混合液は６０℃で３０分加温した。

　［ペプチド結合リポソームへのＨｅＧ２細胞への添加］
　調製したペプチド結合ｓｉＲＮＡ封入リポソームをＤＭＥＭ（Ｈ－Ｇｌｃ）培地と混合した。エクソソーム除去ＦＢＳを用いて最終濃度１％　ＦＢＳ（エクソソーム除去）ＤＭＥＭ（Ｇ－Ｇｌｃ）となるように調整した。各群ｎ＝８で１ウェルあたり、１００μｌのペプチド結合リポソーム溶液となるように、実験例１の［ＨｅＧ２細胞の調製］と同様にして調製したＨｅｐＧ２細胞に添加した。なお、ｓｉＲＮＡ封入リポソーム溶液の添加は、ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルマイクロプレートに播種した７２時間後に行った。

　［結果］
　表３Ａ及び図６Ａに示すとおり、Ｌｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｕ　ＰＬに由来するリポソームにｓｉＲＮＡを封入してペプチドを付与することでＨｅＧ２細胞の増殖抑制が強化された。このような増殖抑制能は、付与プロセス１でも付与プロセス２でも、同程度で観察された。また、表４Ａ及び図６Ｄに示すとおり、Ｌｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｓ　ＰＬのリポソームにｓｉＲＮＡを封入してペプチドを付与することによっても、ＨｅＧ２細胞の増殖抑制が強化された。この場合、プロセス１で調製した試料の方が、より増殖抑制機能が高いことが示唆された。Ｌｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｓ　ＰＬは、リポソーム構成脂質の７０％が飽和脂質のジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＥ）であり、脂質二重層の流動性が低い。プロセス２ではＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＮＨＳとペプチドとを結合してからリポソームへの導入を試みている。しかし、嵩の大きなＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ペプチドは、流動性の低い膜に入り込めなかった可能性がある。結果として、リポソームへのペプチド付与率が低下し、細胞増殖の抑制機能も低下した可能性があると考察した。さらに、表３Ｂ、表３Ｃ、図６Ｂ、及び図６Ｃ、並びに表４Ｂ、表４Ｃ、図６Ｅ、及び図６Ｆに示されるように、配列番号２及び配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを付与することによっても、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを付与した場合と同様に、ＨｅＧ２細胞の増殖抑制が強化される結果となった。

　＜実験例４；ＭＳＣ由来エクソソームが細胞増殖に与える影響の検討＞
　エクソソームのＨｅｐＧ２細胞の増殖に与える影響を検討するため、市販のエクソソームを利用して、ＨｅｐＧ２の細胞増殖への影響を検証することとした。ここで、ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、他の細胞の増殖に影響を与えるとの結果が示されており、その効果の一部をエクソソームが担っている可能性が示唆されている。そこで、ＭＳＣ由来のエクソソームをＨｅｐＧ２細胞に取り込ませ、細胞増殖にどのような影響がでるかを検討した。

　［エクソソームの調製と添加］
　購入した骨髄（ＢＭ）由来のＭＳＣ由来エクソソーム（ＰＣＳ－５００－０１２，ＳＢＩ，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））をアッセイ用の培地（最終濃度１％　ＦＢＳ（エクソソーム除去）ＤＭＥＭ（Ｈ－Ｇｌｃ））に懸濁した。アアスピレーターを用いて、実験例１の［ＨｅＧ２細胞の調製］と同様にして調製し、９６ウェルマイクロプレートで培養していたＨｅｐＧ２細胞の培地を除去した。血清不添加ＤＭＥＭ（Ｈ－Ｇｌｃ）１００μｌ／ｗｅｌｌで各ウェルを２回洗浄した。各群ｎ＝６で５０μｌ／ｗｅｌｌでＭＳＣ由来エクソソーム溶液の添加を行った。なお、ＭＳＣ由来エクソソーム溶液の添加は、ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルマイクロプレートに播種した７２時間後に行った。

　［結果］
　表５及び図７に示すように、リポソームやエクソソームの添加を行っていない対照群と比較して、ＭＳＣ由来エクソソーム溶液４０μｇ／ｍｌを添加した群では、細胞の増殖が有意に抑制された。エクソソームには、タンパク質やｍｉＲＮＡなどの生理機能をもつ分子が含まれているため、それらの機能によりＨｅｐＧ２細胞の増殖が抑制されたものと考えられる。

　＜実験例５；ペプチド結合ＭＳＣ由来エクソソーム溶液が細胞の増殖に与える影響の検討＞
　実験例４でＭＳＣ由来エクソソームがＨｅｐＧ２細胞の増殖を抑制することが確認された。このＭＳＣ由来エクソソーム中に含まれる増殖抑制機能を有する分子を、所定のペプチドによってＨｅｐＧ２細胞の細胞質へ効率的に送達することで、よりＭＳＣ由来エクソソームの機能が強化されることが期待される。そこで、ＭＳＣ由来エクソソームに対して配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを付与し、ＨｅｐＧ２細胞の増殖への影響を検討した。

　更に、腎臓細胞に由来するＨＥＫ２９３細胞に由来するエクソソームに対して同様の手法を適用し、ＨＫＥ２９３細胞由来エクソソームに対して配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを付与し、ＨｅｐＧ２細胞の増殖への影響を検討した。

　［ペプチド結合ＭＳＣ由来エクソソーム溶液の調製と添加］
　配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの溶液を２０ｍＭホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．６）を添加した。さらに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（トランスフェクション用溶液）を血清不添加ＤＭＥＭに溶解して、１０％　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ溶液を調整した。脂肪由来幹細胞Ａｄｉｐｏ　ＭＳＣの分泌するエクソソームを含むエクソソーム溶液（ＳＣＲＣ－４０００－ＥＸＭ，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ））と上記ペプチド溶液、１０％　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ溶液を混合した。ボルテックスミキサーで混合した後、室温で２０分静置した。血清不添加ＤＭＥＭと１０％　ＦＢＳ（エクソソーム除去）ＤＭＥＭ（Ｈ－Ｇｌｃ）を添加して、培地の濃度が最終濃度１％のＦＢＳ（エクソソーム除去）ＤＭＥＭ（Ｇ－Ｇｌｃ）となるように調整した。アスピレーターを用いて、実験例１の［ＨｅＧ２細胞の調製］と同様にして調製したＨｅｐＧ２細胞の培地を除去した。血清不添加ＤＭＥＭ（Ｈ－Ｇｌｃ）１００μｌ／ｗｅｌｌで各ウェルを２回洗浄した。各群ｎ＝６で５０μｌ／ｗｅｌｌでペプチド結合ＭＳＣ由来エクソソーム溶液の添加を行った。なお、ペプチド結合ＭＳＣ由来エクソソーム溶液の添加は、ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルマイクロプレートに播種した２４時間後に行った。

　［ペプチド結合ＨＥＫ２９３細胞由来エクソソーム溶液の調製と添加］
　脂肪由来幹細胞Ａｄｉｐｏ　ＭＳＣに代えて、ヒト腎臓細胞に由来するＨＥＫ２９３細胞を用い、［ペプチド結合ＭＳＣ由来エクソソーム溶液の調製と添加］に記載の方法に準じて、同様の実験を行った。より具体的には、ＨＥＫ２９３細胞を１００ｍｍ培養ディッシュ中に５．０×１０^５となるように播種した。細胞培養のための培地としては、グルタミン、ペニシリン、及びストレプトマイシン溶液配合ＨＥ１００培地（ＧＭＥＰ）を用いて調製し、総量を１０ｍｌに調整して用いた。培養開始３日後に培地を吸引除去し、新たに上記ＨＥ１００培地を１０ｍｌ添加した。播種から７日後に上清を回収した。Ｃａｐｔｕｒｅｍ　Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ）（タカラバイオ株式会社製）のプロトコールに従って、エクソソームを回収した。

　［結果］
　脂肪由来幹細胞Ａｄｉｐｏ　ＭＳＣを用いた実験の結果を、表６Ａ及び図８Ａに示し、ＨＥＫ２９３細胞を用いた実験の結果を、表６Ｂ及び図８Ｂに示す。表６Ａ及び図８Ａに示すように、Ａｄｉｐｏ　ＭＳＣ由来エクソソーム４０μｇ／ｍｌを添加した群では、実験例４のＢＭ　ＭＳＣ由来エクソソームの結果とは異なり、ＨｅｐＧ２の細胞増殖が促進された。これは、由来する細胞の性質差によってエクソソームの機能に差があったためであると推察される。すなわち、同じＭＳＣ細胞であったとしても由来部位が異なることで細胞に性質の差が存在する。そのために、エクソソームに含まれるタンパク質や核酸の種類や構成が変化し、ＨｅｐＧ２細胞の増殖に対する影響が変化したものと考えられる。なお、類似の結果は、表６Ｂ及び図８Ｂにおいても見受けられ、ＨＥＫ２９３細胞に由来するエクソソームにも類似の作用があることが示唆された。

　しかしながら、このようなＡｄｉｐｏ　ＭＳＣ由来エクソソームの増殖促進能は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをエクソソームに付与することで機能が逆転した。すなわち、上記ペプチドを付与していないＡｄｉｐｏ　ＭＳＣ由来エクソソーム群ではＨｅｐＧ２の細胞増殖を促進したのに対し、上記ペプチドを付与したＡｄｉｐｏ　ＭＳＣ由来エクソソームではＨｅｐＧ２細胞の増殖を抑制した。

　＜実験例６；ペプチド結合ＭＳＣ由来エクソソーム溶液が細胞の増殖に与える影響の検討＞
　実験例５の細胞増殖促進能の逆転現象の再現性を検証するため、Ａｄｉｐｏ　ＭＳＣ由来エクソソーム（配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを付与したものに加えて、配列番号２から配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを付与したものも検討対象に追加）と実験例４のＢＭ　ＭＳＣ由来エクソソームを用いて、類似の検討を行った。エクソソームが送達される細胞の培養条件については、実験例１に記載の方法に準じた他、Ｈｅｌａ細胞の細胞播種数、及びＣａｃｏ２細胞の細胞播種数は、それぞれ、５０００細胞／１００μｌ／ｗｅｌｌ（９６ウェルマイクロプレート）及び５０００細胞／１００μｌ／ｗｅｌｌ（９６ウェルマイクロプレート）に調整した。結果を表７Ａから表７Ｅ及び図９Ａから図９Ｅに示す。ＢＭ　ＭＳＣ由来エクソソームを添加することでＨｅｐＧ２細胞の増殖が抑制され、Ａｄｉｐｏ　ＭＳＣ由来エクソソームの添加によりＨｅｐＧ細胞の増殖が促進された。また、配列番号１、２、及び５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを各エクソソームに付与することで、それぞれのエクソソームがＨｅｐＧ２細胞の増殖に対する影響がほぼ逆転した。よって、Ａｄｉｐｏ　ＭＳＣ由来エクソソームのみならず、ＢＭ　ＭＳＣ由来エクソソームでも、上記ペプチドの付与による同様の機能逆転現象が見られた。

　＜実験例７；蛍光標識を用いた膜融合の検証＞
　ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム１粒子ずつの解析を行うため、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）現象を起こす蛍光標識試薬を用いたフローサイトメトリーを実施した。本実験例では、エクソソームのマーカー分子であるＣＤ６３を検出する抗体である抗ＣＤ６３抗体ＰＥＣｙ７を用いた。また、エクソソームはＢＭ　ＭＳＣより回収し、膜融合の検証に供した。

　［リポソームの調製］
　ｓｉＲＮＡが封入されていない点を除き、実験例３の［ｓｉＲＮＡ封入のペプチド結合リポソーム調製］の付与プロセス２に準じた方法を用い、ＦＡＭ標識された、配列番号３に表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及びＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ　ＦＩＴＣ標識された、配列番号５に表されるアミノ酸配列を有するペプチド、並びにＬｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｕ　ＰＬ、及びＬｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｓ　ＰＬを用いて、ペプチド結合リポソームを調製した。

　［ＢＭ　ＭＳＣ由来エクソソームの調製］
　ＢＭ　ＭＳＣをＴ７５フラスコに１．２×１０^５となるように播種した。培地としては、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ　ＡＣＦ　Ｐｌｕｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｋｉｔ（株式会社ベリタス製）を用いて調製して総量を１５ｍｌとした。３日後に培地を吸引除去し、新たにＭｅｓｅｎＣｕｌｔ　ＡＣＦ　Ｐｌｕｓ　Ｍｅｄｉｕｍを　１５ｍｌ添加した。播種から７　日後に、上清を回収した。Ｃａｐｔｕｒｅｍ　Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ）（タカラバイオ株式会社製）のプロトコールに従って、エクソソームを回収した。

　［ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの調製］
　ペプチドを付与リポソームとエクソソームの各溶液を混合し、濃度が３０％となるようにＰＥＧ　８０００溶液を添加した。４０℃で２時間静置し、ペプチド結合リポソームとエクソソームとを融合させた。対照群においては、ＰＢＳ緩衝液をＰＥＧ　８０００溶液の代わりに添加した。

　［フローサイトメトリーによるペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの検出］
　ＰＳ　Ｃａｐｔｕｒｅ　エクソソームフローサイトメトリーキット（富士フィルム和光純薬株式会社製）のプロトコールに従い、フローサイトメトリー用の試料を調整した。また、フローサイトメトリーはＡｔｔｕｎｅ（登録商標）　Ａｃｏｕｓｔｉｃ　Ｆｏｃｕｓｉｎｇ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．製）を用いた。エクソソーム検出用の抗体としては、ＰＥ－Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ６３マウス抗体クローンＨ５Ｃ６　ＲＵＯ（Ｎｏｖｕｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）を用いた。

　［結果］
　図１０は、配列番号３で表されるペプチドを付与されたＬｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｕ　ＰＬとエクソソームとの、ハイブリッドリポソームエクソソームのフローサイトメトリーの結果を示す図面であり、図１１は、配列番号５で表されるペプチドを付与されたＬｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｕ　ＰＬとエクソソームとの、ハイブリッドリポソームエクソソームのフローサイトメトリーの結果を示す図面であり、図１２は、配列番号５で表されるペプチドを付与されたＬｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｓ　ＰＬとエクソソームとの、ハイブリッドリポソームエクソソームのフローサイトメトリーの結果を示す図面である。図１０を例として説明すれば、図１０の（Ｄ）は、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームで行ったフローサイトメトリーを示し、対照群として、（Ａ）では、リポソームにペプチドを結合させておらず、かつリポソームとエクソソームの融合操作を行っていないもの、（Ｂ）では、リポソームにペプチドを結合させたが、リポソームとエクソソームの融合操作を行っていないもの、（Ｃ）は、リポソームにペプチドを結合させておらず、かつリポソームとエクソソームの融合操作を行ったものについて行ったフローサイトメトリーの結果を示す。これらのうち、（ａ）はエクソソーム標識蛍光色素の強度（横軸）とカウント数（縦軸）の関係、（ｂ）はペプチド標識蛍光色素の強度（横軸）とカウント数（縦軸）の関係、（ｃ）はペプチド標識蛍光色素の強度（横軸）とエクソソーム標識蛍光色素の強度（縦軸）との散布図を示す。（Ｄ）の（ｃ）における、ペプチド標識蛍光色素の強度（横軸）とエクソソーム標識蛍光色素の強度（縦軸）が共に強い画分の割合（６．５５１％）を、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）（それぞれ、０．０６３８％、０．０６９６％及び１．４０３％）と比較すれば明らかなように、（Ｄ）では、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームに由来する、ペプチド標識蛍光色素の強度（横軸）とエクソソーム標識蛍光色素の強度（縦軸）が共に強いベシクルの割合がより高くなった。

　なお、以上の実験を、上記のペプチドに特異的に結合するウサギポリクローナル抗体を上記のペプチドに対する一次抗体とし、これに、蛍光標識抗ウサギ抗体をもちいてペプチドを蛍光標識して同様に実験を行ったが、そのような場合にも上記の実験結果に準じた実験結果が得られた。結果を図１５及び図１６に示す。この場合において、上記ペプチドに特異的に結合するウサギポリクローナル抗体は、上述の（エクソソームマーカータンパク質、及びペプチド結合脂質誘導体を構成するペプチドに対する抗体の作製方法）に記載の方法に準じて行った。本発明は、如何なる理論にも拘束されるものではないが、ポリクローナル抗体は、ペプチドの複数の部位をエピトープとして認識する抗体の混合物であるため、通常の操作にしたがって、ポリクローナル抗体を調製すれば、上記試験結果と同等の試験結果が得られるものと推察される。なお、図中の符号の説明については、図１０を例とした符号の説明が準用される。

　＜実験例８；ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの細胞増殖抑制能の検討＞
　Ａｄｉｐｏ　ＭＳＣ由来エクソソームを、（ペプチド結合）ｓｉＲＮＡ封入リポソームとのハイブリッド化を行った。調製した（ペプチド結合）ハイブリッドリポソームエクソソームをＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｌａ細胞、及びＣａｃｏ２細胞に添加して、増殖への影響を検討した。なお、ペプチドの付与は、Ａｄｉｐｏ　ＭＳＣ由来エクソソームにではなく、リポソームに実施した。エクソソームが送達される細胞の培養条件については、実験例１に記載の方法に準じた他、Ｈｅｌａ細胞の細胞播種数、及びＣａｃｏ２細胞の細胞播種数は、それぞれ、５０００細胞／１００μｌ／ｗｅｌｌ（９６ウェルマイクロプレート）及び５０００細胞／１００μｌ／ｗｅｌｌ（９６ウェルマイクロプレート）に調整した。

　［ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの調製］
　ｓｉＲＮＡが封入されていない点を除き、実験例３の［ｓｉＲＮＡ封入のペプチド結合リポソーム調製］の付与プロセス２に準じた方法を用い、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号５に表されるアミノ酸配列を有するペプチド、並びにＬｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｕ　ＰＬ、及びＬｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ　ＦＤ－Ｓ　ＰＬを用いて、ペプチド結合リポソームを調製した。

　ペプチドが付与されたリポソームと、Ａｄｉｐｏ　ＭＳＣ由来エクソソーム溶液を混合した。濃度が３０％となるようにＰＥＧ　８０００溶液を添加して、４０℃で２時間静置し、ペプチドが付与されたリポソームと、Ａｄｉｐｏ　ＭＳＣ由来エクソソームを融合させた。対照群においては、ＰＢＳ緩衝液をＰＥＧ　８０００溶液の代わりに添加した。血清不添加ＤＭＥＭと１０％　ＦＢＳ（エクソソーム除去）ＤＭＥＭ（Ｈ－Ｇｌｃ）を添加して、培地の濃度が最終濃度１％のＦＢＳ（エクソソーム除去）ＤＭＥＭ（Ｇ－Ｇｌｃ）となるように調整した。アスピレーターを用いて、実験例１の［ＨｅＧ２細胞の調製］と同様にして調製したＨｅｐＧ２細胞の培地を除去した。血清不添加ＤＭＥＭ（Ｈ－Ｇｌｃ）１００μｌ／ｗｅｌｌで各ウェルを２回洗浄した。各群ｎ＝６で５０μｌ／ｗｅｌｌでペプチド結合ＭＳＣ由来エクソソーム溶液の添加を行った。なお、ペプチド結合ＭＳＣ由来エクソソーム溶液の添加は、ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルマイクロプレートに播種した４８時間後に行った。

　［結果］
　表８Ａから表８Ｅ、及び図１３Ａから図１３Ｅに示されるように、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームは、リポソームと融合していないエクソソームや、ペプチドを付与されていないハイブリットリポソームエクソソームと比較して、統計的に有意に増殖抑制効果が増強されていることが確認された。この結果は、ペプチドが付与されたリポソームに有効成分を内包させてエクソソームと融合させることにより、目的とする効果が増強されることを示している。

　なお、同様の操作を、［ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの調製］において、実験例３の［ｓｉＲＮＡ封入のペプチド結合リポソーム調製］の付与プロセス１に準じた方法により行って試験した結果を、表９Ａから表９Ｅ、及び図１４Ａから図１４Ｅに示した。

Claims

　ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＣＤ９から選ばれるエクソソームマーカータンパク質と、
　複合脂質の親水性部位にペプチドが結合している、ペプチド結合脂質誘導体と、
　を脂質二重層中に含む、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム。
　前記ペプチドは、１０残基以上３０残基以下のアミノ酸残基を有し、
　前記ペプチドは、アラニン残基、ロイシン残基、及びメチオニン残基から選択される少なくとも１種の疎水性アミノ酸残基と、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、グルタミン残基、及びアスパラギン残基から選択される少なくとも１種のアミノ酸残基と、を含む３から４アミノ酸残基で構成される繰り返し配列を含み、
　前記繰り返し配列を構成するアミノ酸残基の少なくとも１残基は、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、グルタミン残基、及びアスパラギン残基のうちの１つである、請求項１に記載のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム。
　前記ペプチドは、１０残基以上３０残基以下のアミノ酸残基を有し、
　前記ペプチドは、少なくとも１残基の塩基性アミノ酸残基を有する、請求項１に記載のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム。
　前記ペプチドは、２残基以上５残基以下の連続した塩基性アミノ酸残基を有する、請求項３に記載のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム。
　前記ペプチドは、酸性アミノ酸残基を含まない、請求項３又は４に記載のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム。
　前記ペプチドは、配列番号１から５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのうちのいずれかである、請求項１又は２に記載のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム。
　前記複合脂質は、末端に１級アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、リン酸基、チオール基からなる群から選ばれるいずれかの反応性基を有する複合脂質であり、
　前記複合脂質は、スフィンゴリン脂質、スフィンゴ糖脂質、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、エーテル型リン脂質、エーテル型糖脂質からなる群から選ばれる少なくとも１以上である、請求項１又は２記載のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム。
　前記ペプチドと、前記脂質誘導体と、を、ＮＨＳエステル架橋反応、カルボジイミド架橋反応、イミドエステル架橋反応法で結合させる、請求項１又は２に記載のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム。
　前記エクソソームが、幹細胞から得られるエクソソーム、又は多能性幹細胞、間葉系幹細胞、外胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、内胚葉由来細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種から得られるエクソソームである、請求項１又は２に記載のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム。
　脂質誘導体の親水性部位にペプチドを結合させ、ペプチド結合脂質誘導体を形成する工程と、
　リン脂質を含むリン脂質組成物及び前記ペプチド結合脂質誘導体を混合して、前記ペプチド結合脂質誘導体が組み込まれたリポソームを形成する工程と、
　エクソソームに、前記リポソームを融合させることで、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを形成する工程と、
　を含む、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの形成方法。
　請求項１０に記載のペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームの形成方法により形成される、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム。
　ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＣＤ９から選ばれるエクソソームマーカータンパク質に対して特異的に結合する、第１の一次抗体と、
　配列番号１から５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのうちのいずれかに対して特異的に結合する、第２の一次抗体と、
　前記の第１の一次抗体に特異的に結合する、第１の蛍光色素が結合された第１の二次抗体と、
　前記の第２の一次抗体に特異的に結合する、第２の蛍光色素が結合された第２の二次抗体と、
　を添加し、
　　ここで、前記の第１の一次抗体の添加量と抗体価の積と、前記の第２の二次抗体の添加量と抗体価の積の比が１：１であり、
　　前記の第１の一次抗体と、前記の第１の二次抗体と、の添加量比が２：１であり、
　　前記の第２の一次抗体と、前記の第２の二次抗体と、の添加量比が２：１であり、
　エクソソーム中に含まれる複合脂質に特異的に結合する磁気ビーズに結合させたペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを、フローサイトメトリーを利用して分析した際に、
　以下の条件を満たす、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム含有組成物。　０．６≦Ａ／（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）≦１．０　　　　　　式（１）
（ただし、式（１）において、Ａは、第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素の両方で標識されたペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを示すピークの面積であり、Ｂは、第１の蛍光色素のみで標識されたエクソソームを示すピークの面積であり、Ｃは、第２の蛍光色素のみで標識されたリポソームを示すピークの面積である。）
　ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＣＤ９から選ばれるエクソソームマーカータンパク質に対して特異的に結合する、第１の一次抗体と、
　配列番号１から５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのうちのいずれかに対して特異的に結合する、第２の一次抗体と、
　前記の第１の一次抗体に特異的に結合する、第１の蛍光色素が結合された第１の二次抗体と、
　前記の第２の一次抗体に特異的に結合する、第２の蛍光色素が結合された第２の二次抗体と、
　を添加し、
　　ここで、前記の第１の一次抗体の添加量と抗体価の積と、前記の第２の二次抗体の添加量と抗体価の積の比が１：１であり、
　　前記の第１の一次抗体と、前記の第１の二次抗体と、の添加量比が２：１であり、
　　前記の第２の一次抗体と、前記の第２の二次抗体と、の添加量比が２：１であり、
　エクソソーム中に含まれる複合脂質に特異的に結合する磁気ビーズに結合させたペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを、フローサイトメトリーを利用して分析した際に、
　以下の条件を満たす、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム含有組成物を選抜する、ペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソーム含有組成物の選抜方法。
　０．６≦Ａ／（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）≦１．０　　　　　　式（１）
（ただし、式（１）において、Ａは、第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素の両方で標識されたペプチド結合ハイブリッドリポソームエクソソームを示すピークの面積であり、Ｂは、第１の蛍光色素のみで標識されたエクソソームを示すピークの面積であり、Ｃは、第２の蛍光色素のみで標識されたリポソームを示すピークの面積である。）
　ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＣＤ９から選ばれるエクソソームマーカータンパク質を含む、エクソソームと、
　複合脂質の親水性部位にペプチドが結合している、ペプチド結合脂質誘導体と、
　を脂質二重層中に含む、ペプチド結合エクソソーム。
　前記ペプチドは、１０残基以上３０残基以下のアミノ酸残基を有し、
　前記ペプチドは、アラニン残基、ロイシン残基、及びメチオニン残基から選択される少なくとも１種の疎水性アミノ酸残基と、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、グルタミン残基、及びアスパラギン残基から選択される少なくとも１種のアミノ酸残基と、を含む３から４アミノ酸残基で構成される繰り返し配列を含み、
　前記繰り返し配列を構成するアミノ酸残基の少なくとも１残基は、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、グルタミン残基、及びアスパラギン残基のうちの１つである、請求項１４に記載のペプチド結合エクソソーム。
　前記ペプチドは、１０残基以上３０残基以下のアミノ酸残基を有し、
　前記ペプチドは、少なくとも１残基の塩基性アミノ酸残基を有する、請求項１４に記載のペプチド結合エクソソーム。
　前記ペプチドは、２残基以上５残基以下の連続した塩基性アミノ酸残基を有する、請求項１６に記載のペプチド結合エクソソーム。
　前記ペプチドは、酸性アミノ酸残基を含まない、請求項１６又は１７に記載のペプチド結合エクソソーム。
　前記ペプチドは、配列番号１から５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのうちのいずれかである、請求項１４又は１５に記載のペプチド結合エクソソーム。
　前記複合脂質は、末端に１級アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、リン酸基、チオール基からなる群から選ばれるいずれかの反応性基を有する複合脂質であり、
　前記複合脂質は、スフィンゴリン脂質、スフィンゴ糖脂質、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、エーテル型リン脂質、エーテル型糖脂質からなる群から選ばれる少なくとも１以上である、請求項１４又は１５に記載のペプチド結合エクソソーム。