CN106536738A - 抗体基因的表达‑分泌系统 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供在利用双歧杆菌属微生物产生抗体时，可以将上述抗体分泌到菌体外的信号序列信息，可以利用上述信号序列信息将抗体分泌到菌体外的抗体表达载体。作为解决课题的方案，制备通过有下述DNA插入物的载体转化的长双歧杆菌，所述DNA插入物是抗体基因的5’末端与编码信号肽‑接头连接体的DNA的3’末端连接而成，其接头连接编码包含序列号1所示的氨基酸序列的信号肽的DNA的C末端。

Description

抗体基因的表达-分泌系统
技术领域
本发明涉及抗体基因的表达-分泌系统，更具体地，涉及编码用于曲妥珠单抗(Trastuzumab)等抗体的分泌的特定信号肽、信号肽-接头连接体的DNA、上述DNA与抗体基因结合而成的DNA插入物、插入有该DNA插入物的载体、通过该载体转化了的双歧杆菌属(Bifidobacterium)微生物(双歧乳杆菌(Bifidus))等肠道细菌等。
背景技术
信号肽是处于蛋白质分子中的以短的(3～60个氨基酸左右)疏水性氨基酸作为中心的指示分泌(对内质网的输送)的序列的肽，也被称为信号序列、定位信号、输送(移动)信号等。
作为双歧乳杆菌的信号序列，例如报道了青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)的淀粉酶、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)的Sec1、Sec2、Sec3等分泌蛋白质中的信号序列。另外，本发明人等提出了能够适用于双歧乳杆菌的转化用质粒的信号序列(例如参照专利文献1及2)。
另外，也报道了长双歧杆菌的基因组分析(例如参照专利文献3)。
另外，提出了通过使用源自培养癌细胞的癌抗原库筛选源自癌症患者的B细胞中表达的抗体基因来鉴定不被B细胞的采集源限定的、更普遍的新型的癌抗原的抗体基因的方法(例如参照专利文献4)，提供包含免疫球蛋白的轻链可变区域基因和重链可变区域基因的组合的基因库的方法(例如参照专利文献5)，能够短时间内有效地制备单克隆抗体、并且通用性高的抗体的制作方法(例如参照专利文献6)等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2011/093465
专利文献2：WO2011/093467
专利文献3：EP1227152A1
专利文献4：日本特开2010-35472
专利文献5：日本特开2011-87586
专利文献6：日本特开2006-180708
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的在于，提供在利用双歧乳杆菌产生抗体时，可以将上述抗体分泌到菌体外的信号序列信息，可以利用上述信号序列信息将抗体分泌到菌体外的抗体表达载体，通过该抗体表达载体转化、能够分泌抗体的双歧乳杆菌。
用于解决课题的方案
熟知乳腺癌、胃癌、前列腺癌等中，由于基因扩增而导致HER2基因产物(刺激细胞分裂的存在于细胞表面的受体HER2)过量产生，形成癌症的恶化因子。本发明人等知道，在抗体治疗、特别是对于癌症的抗体治疗中，在癌中局部表达、分泌抗体是重要的，因此对于能够适用于双歧乳杆菌的转化用质粒载体的信号序列，使用具有前述专利文献1、2中公开的信号序列的双歧乳杆菌的转化用质粒，结果抗体的分泌不充分。因此，对于新的信号序列进行研究，发现通过插入有下述DNA插入物的载体转化的长双歧杆菌有效地将曲妥珠单抗分泌到菌体外，所述DNA插入物是在编码命名为SP27及SP7的信号序列、上述信号序列与接头序列连接而成的信号肽-接头连接体的DNA的3’末端结合曲妥珠单抗单链抗体(scFv)的基因而成的，从而完成了本发明。
即，本发明涉及：
[1]DNA，其编码包含以下a)或b)所示的氨基酸序列的信号肽，
a)序列号1(SP27)或序列号107(SP7)所示的氨基酸序列；
b)序列号1或序列号107所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、置换或增加而成的氨基酸序列，包含该1个或数个氨基酸缺失、置换或增加而成的氨基酸序列的肽在长双歧杆菌中作为信号肽发挥功能。
[2]根据上述[1]所述的DNA，其包含序列号2(编码SP27的DNA)或序列号108(编码SP7的DNA)所示的碱基序列。
[3]DNA，其编码在包含以下a)或b)所示的氨基酸序列的信号肽的C末端连接包含氨基酸序列的接头而成的信号肽-接头连接体，
a)序列号1或序列号107所示的氨基酸序列；
b)序列号1或序列号107所示的氨基酸序列中1个或2个氨基酸缺失、置换或增加而成的氨基酸序列，包含该1个或2个氨基酸缺失、置换或增加而成的氨基酸序列的肽在长双歧杆菌中作为信号肽发挥功能。
[4]根据上述[3]所述的DNA，其特征在于，信号肽-接头连接体包含序列号3(SP27L6)或序列号109(SP7L20)所示的氨基酸序列。
[5]根据上述[4]所述的DNA，其包含序列号4(编码SP27L6的DNA)或序列号110(编码SP7L20的DNA)所示的碱基序列。
[6]DNA插入物，其是在上述[1]～[5]中任一项所述的DNA的3’末端连接抗体基因的5’末端而成的。
[7]根据上述[6]所述的DNA插入物，其中，抗体基因是具有抗癌作用的抗体的基因。
[8]根据上述[7]所述的DNA插入物，其中，具有抗癌作用的抗体是曲妥珠单抗。
[9]根据上述[8]所述的DNA插入物，其中，曲妥珠单抗是曲妥珠单抗单链抗体。
[10]载体，其插入有上述[6]～[9]中任一项所述的DNA插入物。
[11]肠道细菌，其通过上述[10]所述的载体转化。
[12]根据上述[11]所述的肠道细菌，其是属于双歧杆菌属的微生物。
[13]根据上述[12]所述的肠道细菌，其中，属于双歧杆菌属的微生物是长双歧杆菌。
[14]抗体药物组合物，其是以上述[10]～[13]中任一项所述的肠道细菌作为有效成分。
[15]根据上述[14]所述的抗体药物组合物，其特征在于，其为抗癌剂组合物。
发明的效果
根据本发明，通过利用编码抗体分泌优异的信号肽、信号肽-接头连接体的DNA，可以得到能够有效地将抗体分泌到菌体外的双歧乳杆菌，上述抗体是曲妥珠单抗等具有抗癌作用的抗体时，上述双歧乳杆菌可以作为抗癌剂使用。
附图说明
图1是表示曲妥珠单抗scFv分泌质粒的结构的图。将曲妥珠单抗scFv编码序列插入到蛋白质表达用穿梭质粒、制作重组双歧乳杆菌。用于分泌时，在曲妥珠单抗scFv的上游连接分泌信号和接头序列，用于检测曲妥珠单抗scFv蛋白质时，在C末端连接组氨酸标签。质粒的结构如图1所示。使用这些质粒进行双歧乳杆菌长双歧杆菌105A株的转化。
图2是表示曲妥珠单抗scFv抗体的全碱基序列的图。
图3是表示质粒pSP1B-9的结构的图。
图4是表示以质粒pHuSP1-曲妥珠单抗scFv作为模板的PCR产物的结构的图。
图5是表示通过重组双歧乳杆菌的蛋白质印迹法解析检出的重组菌的曲妥珠单抗scFv结构的图。使用重组双歧乳杆菌的培养上清液进行蛋白质印迹解析。检测以组氨酸标签作为指标进行。利用三种重组菌(质粒名：HuSP27L0-曲妥珠单抗scFv、HuSP27L6-曲妥珠单抗scFv、HuSP3L22-曲妥珠单抗scFv)检测条带。
图6是表示对于两种双歧乳杆菌(HuSP27L6-曲妥珠单抗scFv、HuSP3L22-曲妥珠单抗scFv)中的曲妥珠单抗scFv表达利用蛋白质印迹法进行解析得到的结果的图。
图7是表示以His标签进行了纯化的蛋白质的SDS-PAGE的结果的图。培养上述重组双歧乳杆菌3株、由培养上清液使用组氨酸标签连接蛋白质纯化试剂盒(TALON Metal AffinityResin、TAKARA BIO INC.制)进行纯化。利用4-20％聚丙烯酰胺凝胶将纯化蛋白质进行电泳后、进行染色并切出条带。
图8是表示以His标签进行了纯化的蛋白质利用LC-MS/MS得到的分析结果的图。将所切出的凝胶脱色后，进行利用DTT进行的胱氨酸的还原、烷基化处理、胰岛素处理，由凝胶内抽提肽片段。使用该肽片段溶液进行LC-MS/MS解析。将所检出的肽与数据库(预先登记上述质粒的曲妥珠单抗scFv编码序列)对照。检出了一部分的与曲妥珠单抗scFv的氨基酸序列一致的肽片段。
图9是表示通过LC-MS/MS分析可知与曲妥珠单抗scFv氨基酸序列一致的肽片段的图。
图10是表示曲妥珠单抗scFv分泌载体的结构和通过大肠杆菌表达的图。
图11是表示曲妥珠单抗scFv和HER2胞外域通过Biacore X100得到的亲和性测定结果的图。
图12是表示曲妥珠单抗全身(full-body)抗体和HER2胞外域通过Biacore X100得到的亲和性测定结果的图。
图13是表示曲妥珠单抗scFv和曲妥珠单抗全身抗体的人乳腺癌细胞株结合能力FACS解析的结果的图。
图14是表示Cy5.5标记曲妥珠单抗scFv的体内动力学的图。
图15是表示Cy5.5标记曲妥珠单抗全身抗体的体内动力学的图。
图16是表示曲妥珠单抗scFv对于人乳腺癌MDA-MB-361细胞的原位移植肿瘤的增殖抑制效果的图。
图17是表示对于双歧乳杆菌长双歧杆菌105A/pHuSP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv中的曲妥珠单抗scFv表达进行SDS-PAGE分析得到的结果的图。
图18是通过免疫染色显示由长双歧杆菌105A/pHuSP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv纯化的曲妥珠单抗scFv和人乳腺癌细胞株(HER2阳性株：SK-BR-3、和BT-474/HER2阴性株：SK-MEL-28)的结合的图。
图19是使用流式细胞仪显示由长双歧杆菌105A/pHuSP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv纯化的曲妥珠单抗scFv和人乳腺癌细胞株(HER2阳性株：SK-BR-3、和BT-474/HER2阴性株：SK-MEL-28)的结合的图。
图20是表示由长双歧杆菌105A/pP30SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv纯化的曲妥珠单抗scFv对于BT474乳腺癌细胞具有用量依赖性的细胞增殖抑制活性的图。
图21是表示长双歧杆菌105A/pP30SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv对于人胃癌细胞株NCI-N87的原位移植肿瘤的抗肿瘤效果的图。
图22是通过革兰氏染色显示人胃癌细胞株NCI-N87的原位移植肿瘤内的双歧杆菌属细菌的局部存在的图。
图23是通过使用了抗His-tag抗体的免疫组织染色显示人胃癌细胞株NCI-N87的原位移植肿瘤内曲妥珠单抗scFv的局部存在的图。
具体实施方式
作为本发明中的信号肽，只要是如下的信号肽则没有特别限制：包含a)序列号1(SP27)或序列号107(SP7)所示的氨基酸序列的信号肽，或者包含b)序列号1或序列号107所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、置换或增加而成的氨基酸序列的信号肽(突变信号肽)，包含该1个或数个氨基酸缺失、置换或增加而成的氨基酸序列的肽在长双歧杆菌中作为信号肽发挥功能。上述“1个或数个氨基酸缺失、置换或增加而成的氨基酸序列”指的是例如1～5个、优选1～3个、更优选1～2个、进一步优选1个的任意数的氨基酸缺失、置换或增加而成的氨基酸序列。上述突变信号肽，与序列号1或序列号107所示的氨基酸序列的序列同源性为90％以上、优选95％以上、更优选98％以上。
作为本发明的编码包含上述a)所示的序列号1(SP27)或序列号107(SP7)所示的氨基酸序列的信号肽的DNA，只要是具有对应于上述氨基酸序列的碱基序列的DNA则没有特别限制，因此也包括由于密码子的简并而不同的DNA，具体而言可例示出包含序列号2(编码SP27的DNA)或序列号108(编码SP7的DNA)所示的碱基序列的DNA。这些DNA可以通过化学合成、遗传工程学的方法等本领域技术人员已知的任意方法制作。
本发明的编码上述b)所示的突变信号肽的DNA(突变DNA)也可以通过化学合成、遗传工程学的方法、诱变等本领域技术人员已知的任意的方法制作。具体而言，采用使作为诱变剂的药物接触作用于包含序列号2(编码SP27的DNA)或序列号108(编码SP7的DNA)所示的碱基序列的DNA的方法，照射紫外线的方法，遗传工程学的方法等，向这些DNA中导入突变，由此可以获得突变DNA。作为遗传工程学的方法之一的定点诱变法，由于是可以在特定位置导入特定突变的方法而是有用的，可以根据Molecular Cloning:A laboratory Mannual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY.,1989.(以后简称为“Molecular Cloning第2版”)、Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1～38,John Wiley&Sons(1987-1997)等中记载的方法进行。
优选在本发明的信号肽的C末端连接接头(肽)。构成在信号肽的C末端连接接头而成的信号肽-接头连接体的接头指的是包含将上述信号肽的C末端、和作为目标蛋白质的抗体的N末端之间连接的氨基酸序列的肽，作为接头，例如可以由存在于信号肽的C末端的肽等中适当选择。另外，可以优选列举出包含氨基酸0～30个残基、优选3～25个残基、更优选5～15个残基的接头，可以特别优选列举出包含序列号3(SP27L6)或序列号109(SP7L20)所示的氨基酸序列的接头。
作为本发明的编码信号肽-接头连接体的DNA，只要是具有对应于信号肽-接头连接体的氨基酸序列的碱基序列的DNA，则没有特别限制，因此，也包括由于密码子的简并而不同的DNA，具体而言可例示出包含序列号4(编码SP27L6的DNA)或序列号110(编码SP7L20的DNA)所示的碱基序列的DNA。这些DNA也可以通过化学合成、遗传工程学的方法、诱变等本领域技术人员已知的任意方法制作。
作为本发明的DNA插入物，只要是在上述本发明的编码信号肽的DNA、编码信号肽-接头连接体的DNA的3’末端结合抗体基因的5’末端而成的DNA，则没有特别限制，上述DNA插入物被插入到表达质粒载体。作为上述抗体基因，可以优选列举出编码嵌合抗体、人源化抗体、完全人源化抗体类型的全身抗体、Fc、Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二硫键稳定化抗体(dsFv)等的DNA。这些抗体基因可以基于其氨基酸序列信息、碱基序列信息，通过化学合成、遗传工程学的方法等公知的方法制作(例如参照专利文献4～6)。
上述抗体基因之中，优选为具有抗癌作用的抗体的基因。在此，作为具有抗癌作用的抗体，可列举出在癌细胞膜上表达的被称为肿瘤相关抗原的分子、各种增殖因子的受体、或针对白细胞分化抗原组(CD)等分子制作的单克隆抗体等。作为主要的抗肿瘤作用的机理，已知通过提高起因于抗体-抗原结合的ADCC(抗体依赖性细胞损伤)细胞活性实现的NK细胞的癌杀伤能力增强。作为具有抗癌作用的抗体，具体而言可列举出抗人CD20人-小鼠嵌合单克隆抗体的利妥昔单抗(Rituximab)、抗HER2人源化单克隆抗体的曲妥珠单抗、抗人CD52人源化单克隆抗体的阿仑单抗(Alemtuzumab)、抗人上皮生长因子受体(EGFR)嵌合化单克隆抗体的西妥昔单抗(Cetuximab)、抗人血管内皮细胞增殖因子(VEGF)人源化单克隆抗体的贝伐单抗(Bevacizumab)等，可以优选地例示出这些抗体的单链抗体、特别是曲妥珠单抗单链抗体。
作为本发明的载体，只要是插入有上述本发明的DNA插入物的、适于宿主细胞的表达质粒载体，则没有特别限制，优选能够在肠道细菌、优选属于双歧杆菌属的微生物、特别是长双歧杆菌中表达本发明的DNA插入物的载体。另外，优选在两种或更多种不同的生物种类的宿主中可以自生复制的穿梭载体，进一步优选松村等人的文献[Matsumura et al.,Biosci.Biotechnol.Biochem.,61,1211-1212(1997)]中公开的由长双歧杆菌BK51的pTB6和大肠杆菌(E.coli)的pBR322构建的穿梭载体pBLES100、田中等人的文献[Tanaka etal.,Biosci Biotechnol Biochem.；69(2):422-425(2005,Feb)]中公开的穿梭载体pAV001和pBRASTA101、BIC法(Brevibacillus In vivo Cloning法)中使用的由大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)构建的、在革兰氏阳性菌中可以表达分子内具有S-S键的源自真核生物的分泌蛋白质的pBE-S DNA穿梭载体(TAKARA BIO INC.制)。另外，上述表达质粒载体也可以含有启动子、终止子、作为标记基因的耐药性基因。
另外，上述表达质粒载体可以利用目标抗体的高水平分泌表达体系用的信号肽的筛选系统、例如如下所述进行选择、评价。含有长双歧杆菌hup启动子(Hu启动子)、或长双歧杆菌105A P30启动子(P30启动子)等启动子，在其下游配置编码分泌信号肽的DNA，多克隆位点(MCS)和His标签序列，向MCS插入目标抗体基因后，用限制酶剪切进行线状化，使用该线状化物和Clontech公司的In-Fusion克隆系统等测定用插入有适于目标抗体的本发明的编码分泌信号肽的DNA等的载体转化的双歧乳杆菌的抗体的分泌量，由此可以选择能够使用的表达质粒载体。
作为本发明的肠道细菌，只要是通过上述本发明的载体转化的肠道细菌则没有特别限制，作为宿主细胞的肠道细菌是在人、动物的肠道内部生存的以专性厌氧菌为主的土著菌，具体而言可例示出乳芽孢杆菌、双歧乳杆菌等革兰氏阳性的乳酸菌，梭菌、大肠杆菌、类杆菌等革兰氏阴性菌，其中，可以优选列举出双歧乳杆菌。
作为上述双歧乳杆菌，具体列举出长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、短双歧杆菌(B.breve)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、假长双歧杆菌(B.pseudolongum)、嗜热双歧杆菌(B.thermophirum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、动物双歧杆菌(B.animalis)、角形双歧杆菌(B.angulatum)、星状双歧杆菌(B.asteroides)、牛双歧杆菌(B.boum)、链状双歧杆菌(B.catenulatum)、猪双歧杆菌(B.choerinum)、棒状双歧杆菌(B.coryneforme)、家兔双歧杆菌(B.cuniculi)、龋齿双歧杆菌(B.denticolens)、齿双歧杆菌(B.dentium)、没食子双歧杆菌(B.gallicum)、鸡双歧杆菌(B.gallinarum)、球双歧杆菌(B.globosum)、印度双歧杆菌(B.indicum)、异形双歧杆菌(B.inopinatum)、乳酸双歧杆菌(B.lactis)、乳糖双歧杆菌(B.lactentis)、大双歧杆菌(B.magnum)、反刍动物双歧杆菌(B.merycicum)、最小双歧杆菌(B.minimum)、B.Mongolia Enns、微小粒双歧杆菌(B.parvulorum)、假链状双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)、嗜冷双歧杆菌(B.psychraerophilum)、小鸡双歧杆菌(B.pullorum)、栖瘤胃双歧杆菌(B.ruminale)、反刍双歧杆菌(B.ruminantium)、波伦亚双歧杆菌(B.saeculare)、苏卡鲁道维伊双歧杆菌(B.scardovii)、细长双歧杆菌(B.subtile)、猪双歧杆菌(B.suis)、萨玛茨德胡拉姆双歧杆菌(B.thermacidophilum)等。其中，优选使用已知与年龄无关地常驻于人的肠道内的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)作为宿主细胞，更优选使用长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。这些菌都有市售或者可以由保藏机构容易地获得，例如可以使用长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)ATCC-15707、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)ATCC-11863、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)ATCC-15697。
另外，对于各菌株，也没有特别限定，例如对于长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)，可列举出长双歧杆菌105A株、长双歧杆菌aE-194b株、长双歧杆菌bs-601株、长双歧杆菌M101-2株，其中优选为长双歧杆菌105A株。对于短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)，可列举出例如短双歧杆菌标准株(JCM1192)、短双歧杆菌aS-1株、短双歧杆菌I-53-8W株，其中，优选为短双歧杆菌标准株、短双歧杆菌aS-1株。对于婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)，可列举出例如婴儿双歧杆菌标准株(JCM1222)、婴儿双歧杆菌I-10-5株，其中，优选为婴儿双歧杆菌标准株、婴儿双歧杆菌I-10-5株。对于乳糖双歧杆菌(Bifidobacterium lactentis)的菌株，可列举出例如乳糖双歧杆菌标准株(JCM1210)。
作为本发明中的向肠道细菌内导入载体的方法，可列举出电穿孔法、In-Fusion克隆系统(Clontech公司)、脂质体法、脂质转染法、显微注射法、DEAE葡聚糖法、磷酸钙法等，优选为电穿孔法。另外可列举出使用Lipofectin Reagent(注册商标)、Lipofectamine(注册商标)、Lipofectamine(注册商标)2000Reagent(Invitrogen公司制)、SuperFect(注册商标)Transfection Reagent(QIAGEN公司制)、FuGENE(注册商标)HD Transfection Reagent(Roche Diagnostics K.K.制)、FuGENE(注册商标)6Transfection Reagent(RocheDiagnostics K.K.制)等市售转染试剂的本技术领域中广泛使用的方法。
上述本发明的肠道细菌可以作为抗体药物使用，用含有具有抗癌作用的抗体的基因的DNA插入物转化的本发明的肠道细菌可以用作抗癌剂。因此，作为本发明的抗体药物组合物，只要含有能够分泌抗体、优选具有抗癌作用的抗体的上述本发明的肠道细菌作为有效成分，则没有特别限制，只要不会阻碍所分泌的抗体的作用、效果，还可以含有作为任意成分的药理学上允许的载体、赋形剂、稀释剂等。
作为本发明的抗体药物组合物的剂型，可列举出液体制剂或固体制剂。液体制剂可以如下制备：将本发明的肠道细菌的培养液纯化，向其中根据需要加入适当的生理盐水或补液或者药物添加剂，填充到安瓿或小瓶等中。固体制剂可以如下制备：向液体制剂中添加适当的保护剂，填充到安瓿或小瓶等中后进行冷冻干燥，或者向液体制剂添加适当的保护剂进行冷冻干燥后将其填充到安瓿或小瓶等中。作为本发明的抗体药物组合物的给药方法，经口给药、非经口给药都可以，优选为非经口给药，例如可以进行静脉注射、皮下注射、局部注入、脑室内给药等，最优选为静脉注射。
本发明的抗体药物组合物的给药量，只要是对于在疾病部位可以生长并且表达有效治疗量的活性抗体而言充分的量则没有特别限制，可以根据疾病的程度、患者的体重、年龄、性别适当选择，根据改善的程度适当增减，从经济上的观点以及尽可能避免副作用的观点考虑，优选在得到必要的治疗效果的范围内尽可能少。
例如静脉内给药的情况下，特别要求降低由于菌块所导致的栓塞等危险，因此优选尽可能将低浓度的注射用制剂分为多次分注、或者用适当的补液稀释后持续注入。例如在成人的情况下，将本发明肠道细菌的菌体以每1kg体重106～1012cfu分为1天1次～多次、1天～多天连续或适当隔开间隔给药。更具体而言，对于含有本发明的双歧杆菌属微生物的菌体104～1010cfu/mL的制剂，每1个成人将1～1000mL直接或用适当的补液稀释后分为1天1次～数次连续给药1天～数天。
另外，对疾病组织直接给药的局部给药的情况下，要求尽可能使得菌体在整个疾病组织中植入、增殖，因此优选将高浓度的注射剂给予到疾病组织的多处。例如成人的情况下，对于本发明的双歧杆菌属微生物的菌体，每1kg体重将106～1012cfu以1天1次～多次根据需要1天～多天连续或适当隔开间隔给药。更具体而言，对于含有本发明的双歧乳杆菌的菌体104～1010cfu/mL的制剂，每1个成人将1～1000mL直接、1天数次、根据需要1天～数天连续给药。
本发明的抗体药物组合物或抗癌剂组合物可以适用于例如大肠癌、脑瘤、头颈部癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、胰腺癌、胰岛细胞癌、绒毛膜癌、结肠癌、肾细胞癌、肾上腺皮质癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、睾丸瘤、卵巢癌、子宫癌、绒毛癌、甲状腺癌、恶性类癌瘤、皮肤癌、黑色素癌、骨肉瘤、软组织肉瘤、成神经细胞瘤、维姆氏瘤、成视网膜细胞瘤、黑素瘤、鳞状上皮细胞癌等。
实施例
以下通过实施例更具体地说明本发明，但是本发明的技术范围不被这些例示所限定。
实施例1
1.分泌型曲妥珠单抗scFv表达质粒(pHuSPx-曲妥珠单抗scFv)的构建
利用双歧乳杆菌的组蛋白样启动子(Hu启动子)构建表达分泌型曲妥珠单抗scFv(抗HER2低分子化单链抗体[scFv])的质粒。首先制作在信号肽1(SP1)上连接曲妥珠单抗scFv而成的质粒pHuSP1-曲妥珠单抗scFv后，替换信号肽部分制作pHuSPx-曲妥珠单抗scFv。制作的概要如图1所示。详细如以下所述。
2.pHuSP1-曲妥珠单抗scFv制作中的插入物制备
曲妥珠单抗scFv插入物如下所述制备。首先，曲妥珠单抗全身抗体的氨基酸序列由RCSB蛋白质数据库(Protein data bank，PDB)(http://www.pdb.org/pdb/home/home.do)下载(PDB 1N8Z)。VH、VL和接头序列的DNA基于登记在PDB数据库的cDNA序列确定(图2)(序列号5～11)，以该曲妥珠单抗scFv编码序列(末端含有His-tag序列)插入到pOZ1载体而成的质粒pOZ曲妥珠单抗scFv-His作为模板进行PCR。使用曲妥珠单抗scFv_ins_F3引物(序列号14)和曲妥珠单抗scFv_ins_R2引物(序列号15)(表1中，各引物的5’侧的15个碱基具有与以下所示的载体相同的序列)作为引物，将曲妥珠单抗scFv编码区域扩增而得到777bp的插入物PCR产物。使用2.0％琼脂糖凝胶(1×TEB缓冲液、加入有溴化乙锭)将插入物PCR产物与DNA浓度标记物一起电泳，估计浓度。
小写字母为在In-Fusion克隆用中目标基因扩增用
与增加到引物的载体5'末端互补的15个碱基序列
3.pHuSP1-曲妥珠单抗scFv制作中的载体制备
载体如以下所述制备。以质粒pSP1B-9(含有GFPuv基因、大肠杆菌的复制起点、双歧乳杆菌的复制起点、壮观霉素抗性基因)(图3)(序列号16)作为模板进行PCR。使用SP1_Vec_F3引物(序列号12)和SP1_Vec_R2引物(序列号13)(表1)作为引物，将除去GFPuv基因的区域扩增而得到3983bp的载体PCR产物。(PrimeSTAR；注册商标HS Premix、TAKARA BIO INC.制)。使用0.8％琼脂糖凝胶(1×TEB缓冲液、加入有溴化乙锭)将载体PCR产物与DNA浓度标记物一起电泳，估计浓度。
4.pHuSP1-曲妥珠单抗scFv制作中通过In-Fusion反应进行的插入物和载体的连接
使用In-Fusion(注册商标)HD Cloning Kit with Cloning Enhancer(Clontech公司制)进行插入物PCR产物和载体PCR产物的连接。首先，利用Clontech公司的网站In-Fusion(注册商标)Molar Ratio Calculator(http://bioinfo.clontech.com/infusion/molarRatio.do)算出必要的插入物量和载体量。将5×In-Fusion HD Enzymes premix 2μL、Cloning Enhancer 1μL、插入物和载体的必要量混合，用灭菌水使得反应系统的总量为10μL。在37℃反应15分钟后，在50℃反应15分钟，静置到4℃。
5.pHuSP1-曲妥珠单抗scFv制作中的大肠杆菌的转化、质粒抽提、测序
使用In-Fusion反应液2μL进行大肠杆菌TOP10化学感受态细胞(chemicallyCompetent Cell)(Invitrogen公司制)的转化，涂布于LB(75μg/mL、含有壮观霉素)板后，在37℃培养一晩。转化条件是依据产品说明书。将所转化的大肠杆菌菌落利用LB(75μg/mL、含有壮观霉素)液体培养基在37℃培养一晩，由此抽提质粒(QIAprep Spin Miniprep Kit、QIAGEN公司制)。确认该质粒的全碱基序列如所设计的那样，作为质粒pHuSP1-曲妥珠单抗scFv。
6.替换了信号肽的pHuSPx-曲妥珠单抗scFv(x＝2～10、12～16、19、21～27)制作中的插入物制备(SP2～SP10、SP12～SP16、SP19、SP21～SP27)
将各含有信号肽的质粒作为模板进行PCR，制备插入物。使用表2所示的引物(各引物的5’侧的15个碱基具有与以下所示的载体相同的序列)和模板进行PCR，得到插入物PCR产物。使用2.0％琼脂糖凝胶将插入物PCR产物与DNA浓度标记物一起电泳，估计浓度。
[表2]
小写字母为在In-Fusion克隆用中目标基因扩增用
与增加到引物的载体5'末端互补的15个碱基序列
7.替换了信号肽的pHuSPx-曲妥珠单抗scFv(x＝2～10、12～16、19、21～27)制作中的载体制备(SP2～SP10、SP12～SP16、SP19、SP21～SP27)
将质粒pHuSP1-曲妥珠单抗scFv作为模板进行PCR，制备载体。使用Hu-曲妥珠单抗_vec_F1引物(序列号17)和Hu-vec_R1引物(序列号18)(表2)作为引物，将除去信号肽部分(SP1)的区域扩增而得到4589bp的载体PCR产物(图4、含有曲妥珠单抗scFv基因、大肠杆菌的复制起点、双歧乳杆菌的复制起点、壮观霉素抗性基因)。利用0.8％琼脂糖凝胶将载体PCR产物与DNA浓度标记物一起电泳，估计浓度。
8.替换了信号肽的pHuSPx-曲妥珠单抗scFv(x＝2～10、12～16、19、21～27)制作中通过In-Fusion反应进行的插入物和载体的连接(SP2～SP10、SP12～SP16、SP19、SP21～SP27)
与上述同样地使用In-Fusion(注册商标)HD Cloning Kit with Cloning Enhancer(Clontech公司制)，进行插入物PCR产物和载体PCR产物的连接。
9.替换了信号肽的pHuSPx-曲妥珠单抗scFv(x＝2～10、12～16、19、21～27)制作中的大肠杆菌的转化、质粒抽提、测序(SP2～SP10、SP12～SP16、SP19、SP21～SP27)
使用In-Fusion反应液1μL进行大肠杆菌TOP10化学感受态细胞(chemicallyCompetent Cell)(Invitrogen公司)的转化，涂布于LB(75μg/mL、含有壮观霉素)板上后，在37℃培养一晩。转化条件是依据产品说明书。将所转化的大肠杆菌菌落利用LB(75μg/mL、含有壮观霉素)液体培养基在37℃培养一晩，由此抽提质粒(QIAprep Spin Miniprep Kit、QIAGEN公司制)。确认了从该质粒的Hu启动子附近到终止子附近的碱基序列如所设计的那样。表3示出所制作的质粒。
[表3]
所制作的质粒
*1：关于质粒的名称
例：pHuSP3L22-曲妥珠单抗scFv
·p为质粒的p
·Hu为Hu启动子
·SP为信号肽、有固有的连续编号。
·L为接头数。信号肽切断预测部位和目标蛋白质之间的氨基酸数
(此时切断预测部位和曲妥珠单抗scFv之间有22个氨基酸)
·最后为目标蛋白质的名称(此时为曲妥珠单抗scFv)
*2:利用分泌信号切断部位预测软件SignalP Ver4.0解析的切断预测部位。
没有切断预测部位的情况下，由于不能设定接头数，因此在质粒的名称中没有Lxx的记载。
10.替换了信号肽的pHuSPx-曲妥珠单抗scFv(x＝2～10、12～16、19、21～27)制作中的双歧乳杆菌的转化(SP2～SP10、SP12～SP16、SP19、SP21～SP27)
使用由所转化的大肠杆菌抽提的质粒DNA(表3)1.5～3μL，双歧乳杆菌长双歧杆菌105A的转化通过电穿孔系统(Gene pulser II、Bio-Rad Laboratories,Inc.制)进行。电击后，立即向小玻璃管中加入IMR液体培养基800μL和维生素C添加液50μL的混合液，将其回收到已经灭菌的2mL微管中。对各管进行同样的操作，将这些2mL管的盖子拧松与AnaeroPack(アネロパック)一起装入到密闭容器中，放入设定在37℃的培养箱中，保温3小时。将保温后的各菌悬浮液充分混合后，量取其100μL，分别涂抹于一块IMR琼脂培养基(含有75μg/mLSPCM)上。将这些琼脂培养基与脱氧-二氧化碳发生剂(アネロパック·ケンキ，MitsubishiGas Chemical Company,Inc.制)一起装入到密闭容器中，利用设定在37℃的培养箱培养2～3天。用接种环取生长了的板上的菌落，在BL-bS琼脂培养基(含有75μg/mL SPCM)上画线，与脱氧-二氧化碳发生剂(アネロパック·ケンキ，Mitsubishi Gas Chemical Company,Inc.制)一起装入到密闭容器中，利用设定在37℃的培养箱培养1天，形成画线培养物。
11.培养上清液和细胞内蛋白质的蛋白质印迹解析
将上述得到的重组双歧乳杆菌(长双歧杆菌105A/pHuSPx-曲妥珠单抗scFv(x＝2～10、12～16、19、21～27)的画线培养物接种于APS-2S-2.5SE(75μg/mL、壮观霉素)液体培养基中，在37℃厌氧培养24小时(活化培养液)。接着，在向DMEM(低葡萄糖、丙酮酸、HEPES)细胞培养用培养基(Life Technologies Corporation制、cat#12320-032):APS-2S-2.5SE＝9:1以75μg/mL添加壮观霉素而成的培养基中接种活化培养液0.5％。将其在37℃厌氧培养15小时。使用该培养液如下所述制备培养上清液和细胞内蛋白质。将培养液离心分离后，回收培养上清液。通过三氯乙酸(TCA)使该培养上清液中的蛋白质沉淀，利用丙酮洗涤后，溶解于电泳用缓冲液中，将培养上清液中的蛋白质浓缩。另外，如下所述抽提细胞内蛋白质。将培养液1mL与4mL的PBS混合，以12000rpm、在4℃离心分离5分钟后，去除上清液，向该沉淀加入5mL的PBS进行悬浮，离心分离去除上清液，将此作为一次操作，进行该操作两次。向洗涤后的菌体中加入PBS使得总量为1mL后，通过超声波处理将菌体破碎。将其离心分离后，回收上清液，将其作为细胞内抽提物。利用Mini-PROTEAN TGX凝胶4-20％(Bio-RadLaboratories,Inc.制)将上述培养上清液浓缩物(相当于培养液1mL)、细胞内蛋白质抽提物(相当于培养液1mL)电泳。使用iBlot Transfer Device(Invitrogen公司制)将其转录于PVDF膜(Invitrogen公司制、iBlot Transfer Stacks)上。将实施印迹法结束后的膜封闭后，一次抗体使用Anti-His抗体(GE Healthcare公司制)、二次抗体使用抗-小鼠Ab-HRP(GEHealthcare公司制)进行反应，利用Western Lightning Ultra(Perkin Elmer公司制)发光。对其利用Imaging Analyzer(Fluor S Max,Bio-Rad Laboratories,Inc.制)进行解析。结果是在三种菌(长双歧杆菌105A/pHuSP3L22-曲妥珠单抗scFv、长双歧杆菌105A/pHuSP27L0-曲妥珠单抗scFv、长双歧杆菌105A/pHuSP27L6-曲妥珠单抗scFv)中发现分泌(图5)。蛋白质印迹的结果中，长双歧杆菌105A/pHuSP27L6-曲妥珠单抗scFv和长双歧杆菌105A/pHuSP3L22-曲妥珠单抗scFv的结果如图6所示。在曲妥珠单抗scFv的尺寸附近(约25kDa)可以确认条带。
12.双歧乳杆菌培养上清液纯化物的SDS-PAGE
将利用分泌型曲妥珠单抗scFv的重组双歧乳杆菌(长双歧杆菌105A)的画线培养物接种于APS-2S-2.5SE(75μg/mL、壮观霉素)液体培养基中，在37℃厌氧培养24小时(活化培养液)。接着在向DMEM(低葡萄糖、丙酮酸、HEPES)细胞培养用培养基(Life TechnologiesCorporation制、cat#12320-032):APS-2S-2.5SE＝9:1中以75μg/mL添加壮观霉素而成的培养基中接种活化培养液0.5％。将其在37℃厌氧培养16小时。将培养液离心分离后，向培养上清液中添加硫酸铵(酶纯化用、和光纯药工业社制)形成80％饱和溶液，在4℃搅拌一晩。将其离心分离后，向沉淀物中加入1×PBS缓冲液(pH 7.4)，溶解沉淀。使用组氨酸标签蛋白质的纯化试剂盒(TALON Metal Affinity Resin、TAKARA BIO INC.制)将该溶液纯化。利用超滤(Amicon Ultra 10K、Merck Millipore公司制)将纯化溶液浓缩。在浓缩蛋白质溶液中混合等量的2×SDS样品缓冲液，在95℃加热3分钟，将其作为SDS-PAGE的试样。使用Mini-PROTEAN TGX凝胶(4-20％、BIO-RAD公司制)利用1×SDS缓冲液将上述试样电泳。将电泳结束后的凝胶用水洗涤后，利用染色液(SimplyBlueTM SafeStain)染色，用水脱色。结果如图7所示。对于没有接头的SP27L0而言，不能确认曲妥珠单抗scFv的尺寸附近(约25kDa)的条带(图中上段箭头)，对于整合了接头的SP27L6、SP3L22而言，确认了预想的曲妥珠单抗scFv的尺寸的条带(图7)。
13.利用LC-MS/MS进行的纯化蛋白质分析
培养重组双歧乳杆菌长双歧杆菌105A/pHuSP27L6-scFv，由培养上清液使用组氨酸标签连接蛋白质纯化试剂盒(TALON Metal Affinity Resin,TAKARA BIO INC.制)进行纯化。利用4-20％聚丙烯酰胺凝胶(Mini-PROTEAN TGX凝胶、Bio-Rad公司制)将纯化蛋白质电泳后，用Simply Blue Stain(Invitrogen公司制)染色，切出条带。由染色后的凝胶切出条带，形成1×1mm3尺寸的凝胶立方体，将凝胶用脱色液(含有30％乙腈(和光纯药社制)、25mM碳酸氢铵(SIGMA公司制)的水溶液)脱色后，用10mM DTT((±)-二硫苏糖醇、和光纯药社制)还原(56℃、45分钟)，空气冷却至室温后，用55mMICH2CONH2(碘乙酰胺、和光纯药社制)烷基化(室温、遮光、30分钟)。烷基化后，用12.5ng/mL胰岛素(Promega公司制)进行凝胶内消化(37℃、16h)，将消化肽片段由凝胶内抽提并进行浓缩。(Reference:Shevchenko A.etal.Anal.Chem.68,850-858,1996.)使用所得到的肽片段通过LC-MS/MS(Waters nanoACQUITY UPLC,Xevo QTOF公司制)进行分析及解析，将所鉴定的肽与曲妥珠单抗scFv氨基酸序列对照(图8)。通过LC-MS/MS分析，与曲妥珠单抗scFv氨基酸序列一致的肽片段如图9所示。
14.重组载体(pUC119质粒)的构建和曲妥珠单抗scFv的制作
基于与上述同样地由PDB数据库得到的曲妥珠单抗cDNA序列，将人工基因合成的DNA整合到pUC119质粒中制作载体，将其作为曲妥珠单抗scFv表达用载体。向Rosetta2E.coli(Merck Millipore,Darmstadt,Germany)中基因导入曲妥珠单抗-scFv-His质粒，用含有氨苄青霉素和氯霉素的琼脂(agar)选择菌落。菌落通过含有2％葡萄糖的含氨苄青霉素的LB培养基10mL在37℃增殖。然后转移到含有IPTG的200mL的LB培养基中，在25℃继续培养20小时。回收大肠杆菌，通过含有苯并核酸酶(benzonuclease)的BugBuster ProteinExtraction Reagent(Novagen公司制)抽提细胞裂解产物，然后以10000×g离心5分钟，回收含有抗体蛋白质的上清液。附加了His标签的抗体蛋白质通过HisTrap HP Ni Sepharose柱和Sephadex G25凝胶过滤纯化。纯化后，通过Tris-Glycine凝胶实施SDS-PAGE，确认了与30kDa一致的曲妥珠单抗scFv的条带(图10)。所纯化的scFv抗体用于流式细胞仪、Biacore的表面等离子体共振(SPR)分析。
15.使用了表面等离子体共振(SPR)法的利用Biacore X100进行的曲妥珠单抗scFv与HER2胞外域的亲和性测定
曲妥珠单抗scFv利用使用大肠杆菌Rozetta2株制作得到的物质，HER2胞外域蛋白质(HER2.ex.)和曲妥珠单抗全身抗体利用使用源自昆虫的HF细胞株制作得到的物质。SPR解析使用Biacore X100进行。测定中使用的全部试剂、传感器芯片由GE Healthcare公司购进。HER2.ex.到CM5传感器芯片上的固定使用pH 5.0的10mM醋酸溶液，曲妥珠单抗全身抗体的固定使用pH 5.5的溶液。测定使用0.05％或0.005％Tween-PBS(pH 7.4)的缓冲液，以流速30μL/mL、在25℃进行。通过以下两种方法求出曲妥珠单抗scFv与抗原的结合亲和性，所述两种方法为：在传感器芯片上，对于固定化了的HER2.ex.，观察与所添加的曲妥珠单抗scFv的相互作用后，用再生溶液完全去除所结合的曲妥珠单抗scFv，接着对于浓度不同的曲妥珠单抗scFv也重复同样的测定循环，汇总所得到的结果进行解析的多循环法，和仅通过在1次测定循环中依次添加5种浓度的曲妥珠单抗scFv，就可以得到解析所需要的信息，无需去除与HER2.ex.结合的曲妥珠单抗scFv的单循环法。关于结合、解离的动态常数的计算使用Biacore X100评估软件算出。解析结果如图11所示。
16.使用了表面等离子体共振(SPR)法的利用Biacore X100进行的Anti-HER2/neu抗体和HER2胞外域的亲和性测定
与上述同样地，固定侧使用曲妥珠单抗全身抗体、流路侧使用HER2.ex.，与HER2抗原的结合亲和性通过利用Biacore X100的单循环法进行解析，进行与所制作的曲妥珠单抗scFv中的结合亲和性的比较。为了方便，曲妥珠单抗scFv中的解析中，固定侧使用HER2.ex.、流路侧使用曲妥珠单抗scFv，因此流路和固定的关系与曲妥珠单抗全身抗体中的解析是反转的形式(图12)。结果可知，所制作的曲妥珠单抗scFv，与曲妥珠单抗全身抗体相比具有同等的结合亲和性。另外，由反应速率常数的ka值(越大则与抗原的亲和性越高)和kd值(越小则与抗原的结合越强)的值显示，所制作的曲妥珠单抗scFv是与曲妥珠单抗全身抗体相比与抗原的亲和性高、但是与抗原的结合弱的性质。
17.曲妥珠单抗scFv和曲妥珠单抗全身抗体与人乳腺癌细胞株的结合能力FACS解析
人乳腺癌细胞株使用HER2阳性株(SKBR-3)、阴性株(MDA-MD231、468)。FACS用的抗His抗体使用PE标记抗His抗体(CAT.130-092-691、Miltenyi公司制)。另外，作为曲妥珠单抗scFv的对照，使用人CMVpp65scFv。试剂是使用PBS(-)+0.1％BSA+0.1％叠氮化钠作为Ab缓冲液，使用PBS(-)+1％FBS+0.1％叠氮化钠+2mM EDTA作为FACS缓冲液，使用FACS缓冲液+0.5％PFA(低聚甲醛)作为固定缓冲液，曲妥珠单抗scFv和人CMVpp65scFv调整为10μg/mL。二次抗体使用PE-anti-His抗体。
将1～2×105个/孔的细胞悬浮于FACS缓冲液中，铺在96孔圆底板上，以1400rpm将板离心2分钟后，抽吸上清液。添加10μL的Ab缓冲液进行悬浮后，添加10μL的曲妥珠单抗scFv或对照用的人CMVpp65scFv(10μg/mL)。在4℃培养15分钟后，用150μL的FACS缓冲液洗涤两次。以1400rpm离心4分钟后，抽吸、去除上清液。添加10μL的Ab缓冲液后，加入10μL的PE-anti-His抗体(没有稀释)，4℃培养15分钟。用150μL的FACS缓冲液洗涤两次后，以1400rpm进行2分钟离心，抽吸上清液。加入400μL的固定缓冲液，通过移液转移到FACS管中，24小时以内利用流式细胞仪(Flow Cytometry)(FACSCanto、BD Biosciences公司制)进行测定。结果如图13所示。显示全身抗体稍差，但是曲妥珠单抗scFv是与阴性对照细胞的分离充分良好的抗体(图13中央和右侧)。另外，不能检出SKBR-3细胞的表达的HER2抗原，与对照的抗巨细胞病毒抗原scFv的比较中，显示曲妥珠单抗scFv与抗原特异性结合(图13左)。
18.使用了体内(in vivo)肿瘤模型的Cy5.5标记曲妥珠单抗scFv的体内动力学成像
将高水平地表达HER2抗原的人乳腺癌细胞株MDA-MB-361(5×106个细胞/个体[含有Matrigel])移植到免疫学上T细胞功能缺乏的BALB/cA-nu/nu小鼠(雌，7周龄，CLEA Japan,Inc.制)的乳腺上皮。向肿瘤体积达到约290mm3的MDA-MB-361带瘤的小鼠(1只)肿瘤内一次给予标记了荧光色素Cy5.5的曲妥珠单抗scFv的3.75mg/kg相当量(100μL)。为了确认Cy5.5标记曲妥珠单抗scFv的肿瘤内给药时的滞留性，在异氟烷吸入麻醉下，使用体内(in vivo)成像装置eXplore Optix(GE Healthcare公司制)测定一周(图14)。在第一周，进行安乐死处置后，摘除肿瘤、肝脏、脾脏、肺、以及小肠并测定成像能力。结果显示，肿瘤内给予Cy5.5标记曲妥珠单抗scFv后，即使在第7天后也能够检出。
19.使用了体内(in vivo)肿瘤模型的Cy5.5标记曲妥珠单抗全身抗体的体内动力学成像
与上述同样地，使用将4×106个细胞/个体的MDA-MB-361移植到乳腺上皮而成的带瘤的裸小鼠的系统，为了确认Cy5.5标记曲妥珠单抗全身抗体的肿瘤内给药时的滞留性，向移植后第56天的带瘤的小鼠(400mm3)肿瘤内给予Cy5.5标记曲妥珠单抗全身抗体3.75mg/kg。肿瘤内滞留性在异氟烷吸入麻醉下使用eXplore Optix测定至给药后第5天(图15)。即使肿瘤内给药后第5天后，也可以观察到小鼠机体内的荧光标记抗体，因此表示与Cy5.5标记曲妥珠单抗scFv同样地能够长期检出。
20.曲妥珠单抗scFv对于人乳腺癌MDA-MB-361细胞的原位移植肿瘤的抗肿瘤效果
将高水平地表达HER2抗原的人乳腺癌细胞株MDA-MB-361(5×106个细胞/个体[含有Matrigel])移植到上述的BALB/cA-nu/nu小鼠(n＝4～5/组)乳腺上皮。向平均肿瘤体积达到250mm3的MDA-MB-361带瘤的小鼠每隔1天肿瘤内给予曲妥珠单抗scFv的3.75mg/kg相当量5次(50μL)。曲妥珠单抗scFv给药开始后经日测定肿瘤体积，与无处理组(对照组)比较抗肿瘤活性。由每3～4天测定的肿瘤体积作为指标的结果可知，显示出了明确的肿瘤细胞的增殖抑制效果(图16)。
实施例2
21.对双歧乳杆菌的密码子最适化的分泌质粒(pHuSP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv)的制作
使曲妥珠单抗scFv基因的碱基序列最适于双歧乳杆菌的密码子(opt-曲妥珠单抗scFv基因：序列号92)。进而制作整合了opt-曲妥珠单抗scFv基因的分泌质粒(pHuSP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv：序列号94)。
opt-曲妥珠单抗scFv基因以亚克隆化到大肠杆菌用质粒pUC57中的质粒pUC57-opt-曲妥珠单抗scFv的形式人工基因合成(GenScript Japan Inc.制)。作为第一阶段，将现有的曲妥珠单抗scFv表达、分泌质粒的pHuSP27L0-曲妥珠单抗scFv(序列号93)的曲妥珠单抗scFv基因与opt-曲妥珠单抗scFv基因交换，制作质粒pHuSP27L0-opt-曲妥珠单抗scFv。作为第二阶段，将作为信号肽+接头序列的SP27L0交换为SP7L20，制作pHuSP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv(序列号94)。作为第三阶段，将pHuSP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv的Hu启动子交换为P30启动子，制作pP30SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv(序列号95)。详细说明如以下所述。
22.pHuSP27L0-opt-曲妥珠单抗scFv制作中的插入物制备
pHuSP27L0-曲妥珠单抗scFv的曲妥珠单抗scFv基因部分替换为opt-曲妥珠单抗scFv基因的步骤如以下所述。首先，opt-曲妥珠单抗scFv插入物如以下所述制备。以具有opt-曲妥珠单抗scFv编码序列(末端含有His-tag序列)的质粒pUC57-opt-曲妥珠单抗scFv作为模板进行PCR。使用opt-曲妥珠单抗scFv_ins_INF_F1引物(序列号96)、和opt-曲妥珠单抗scFv_ins_INF_R1引物(序列号97)(各引物的5’侧的15个碱基具有与以下所示的载体相同的序列)作为引物，将opt-曲妥珠单抗scFv编码区域扩增而得到777bp的插入物PCR产物。使用2.0％琼脂糖凝胶(1×TEB缓冲液、加入有溴化乙锭)将插入物PCR产物与DNA浓度标记物一起电泳，估计浓度。
23.pHuSP27L0-opt-曲妥珠单抗scFv制作中的载体制备
载体如下所述制备。以pHuSP27L0-曲妥珠单抗scFv(含有曲妥珠单抗scFv基因、大肠杆菌的复制起点、双歧乳杆菌的复制起点、壮观霉素抗性基因)作为模板进行PCR。使用SP1_Vec_F1引物(序列号98)和d0018_0aa_Vec_R3引物(序列号99)作为引物，将除去曲妥珠单抗scFv基因的区域扩增而得到约4kb的载体PCR产物。(PrimeSTAR；注册商标HS Premix、TAKARA BIO INC.制)。使用0.8％琼脂糖凝胶(1×TEB缓冲液、加入有溴化乙锭)将载体PCR产物与DNA浓度标记物一起电泳，估计浓度。
24.pHuSP27L0-opt-曲妥珠单抗scFv制作中通过In-Fusion反应进行的插入物和载体的连接
使用In-Fusion(注册商标)HD Cloning Kit with Cloning Enhancer(Clontech公司制)进行插入物PCR产物和载体PCR产物的连接。首先利用Clontech公司的网站In-Fusion(注册商标)Molar Ratio Calculator(http://bioinfo.clontech.com/infusion/molarRatio.do)算出必要的插入物量和载体量。将5×In-Fusion HD Enzymes premix 2μL、Cloning Enhancer 1μL、插入物和载体的必要量混合，用灭菌水使得反应系统的总量为10μL。在37℃反应15分钟后，在50℃反应15分钟，静置到4℃。
25.pHuSP27L0-opt-曲妥珠单抗scFv制作中的大肠杆菌的转化、质粒抽提、测序
使用In-Fusion反应液2μL进行大肠杆菌HST16CR Competent Cells(TAKARA BIO INC.制)的转化，涂布在LB(75μg/mL、含有壮观霉素)板上后在37℃培养一晩。转化条件是依据产品说明书。将所转化的大肠杆菌菌落利用LB(75μg/mL、含有壮观霉素)液体培养基在37℃培养一晩，抽提质粒(QIAprep Spin Miniprep Kit、QIAGEN公司制)。确认该质粒的全碱基序列如所设计的那样，形成质粒pHuSP27L0-opt-曲妥珠单抗scFv。
26.pHuSP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv制作中的插入物制备
pHuSP27L0-opt-曲妥珠单抗scFv的信号肽+接头序列(SP27L0)替换为SP7L20的步骤如以下所述。首先，将长双歧杆菌105A的基因组DNA作为模板进行PCR，如下所述制备信号肽插入物。使用SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv_ins_INF_F1引物(序列号100)和SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv_ins_INF_R1引物(序列号101)(各引物的5’侧的15个碱基具有与以下所示的载体相同的序列)进行PCR，得到189bp的插入物PCR产物(SP7L20)。使用2.0％琼脂糖凝胶将插入物PCR产物与DNA浓度标记物一起电泳，估计浓度。
27.pHuSP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv制作中的载体制备
以质粒pHuSP27L0-opt-曲妥珠单抗scFv作为模板进行PCR制备载体。使用Hu-opt-曲妥珠单抗_vec_F1引物(序列号102)和Hu-Vec_R1引物(序列号18)作为引物，将除去信号肽+接头部分的区域扩增而得到约4.5kb的载体PCR产物。利用0.8％琼脂糖凝胶使得载体PCR产物与DNA浓度标记物一起电泳，估计浓度。
28.pHuSP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv制作中通过In-Fusion反应进行的插入物和载体的连接
与上述同样地使用In-Fusion(注册商标)HD Cloning Kit with Cloning Enhancer(Clontech公司制)进行插入物PCR产物和载体PCR产物的连接。
29.pHuSP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv制作中的大肠杆菌的转化、质粒抽提、和测序
与上述同样地进行使用了In-Fusion反应液的大肠杆菌HST16CR Competent Cells的转化、培养、和质粒抽提，确认了该质粒的opt-曲妥珠单抗scFv表达盒(从Hu启动子到终止子)的碱基序列如所设计的那样。
30.pP30SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv制作中的插入物制备
将pHuSP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv的启动子交换为存在于长双歧杆菌105A的基因组中的基因的P30启动子。
首先，以长双歧杆菌105A的基因组DNA作为模板进行PCR，如下所述制备信号肽插入物。使用P30_ins_F1引物(序列号103)和P30_SP7_ins_R1引物(序列号104)(各引物的5’侧的15个碱基具有与以下所示的载体相同的序列)进行PCR，得到265bp的插入物PCR产物。使用2.0％琼脂糖凝胶将插入物PCR产物与DNA浓度标记物一起电泳，估计浓度。
31.pP30SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv制作中的载体制备
以质粒pHuSP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv作为模板进行PCR制备载体。使用SP7_Vec_F1引物(序列号105)和pUC_ori_Vec_R2引物(序列号106)作为引物，将除去opt-曲妥珠单抗scFv表达单元的启动子的区域扩增而得到约4.4kb的载体PCR产物。利用0.8％琼脂糖凝胶将载体PCR产物与DNA浓度标记物一起电泳，估计浓度。
32.pP30SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv制作中的利用In-Fusion反应进行的插入物和载体的连接
与上述同样地使用In-Fusion(注册商标)HD Cloning Kit with Cloning Enhancer(Clontech公司制)进行插入物PCR产物和载体PCR产物的连接。
33.pP30SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv制作中的大肠杆菌的转化、质粒抽提、测序
与前述操作同样地进行使用了In-Fusion反应液的大肠杆菌HST16CRCompetent Cells的转化、培养和质粒抽提，确认了该质粒的opt-曲妥珠单抗scFv表达盒(从P30启动子到终止子)的碱基序列如所设计的那样。
34.双歧乳杆菌的转化
使用质粒pHuSP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv、和pP30SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv，如下所述实施双歧乳杆菌的转化。使用质粒DNA，双歧乳杆菌长双歧杆菌105A的转化通过电穿孔系统(Gene pulser II、Bio-Rad Laboratories,Inc.制)进行。电击后，立即向小玻璃管中加入IMR液体培养基800μL和维生素C添加液50μL的混合液，将其回收到已经灭菌的2mL微管中。对各管进行同样的操作，将这些2mL管的盖子拧松与AnaeroPack一起装入到密闭容器中，放入设定在37℃的培养箱中，保温3小时。将保温后的各菌悬浮液充分混合后，量取其100μL，分别涂抹于一块IMR琼脂培养基(含有75μg/mL SPCM)上。将这些琼脂培养基与脱氧-二氧化碳发生剂(アネロパック·ケンキ，Mitsubishi Gas Chemical Company,Inc.制)一起装入到密闭容器中，利用设定在37℃的培养箱培养2～3天。用接种环取生长了的板上的菌落，在BL-bS琼脂培养基(含有75μg/mL SPCM)上画线，与脱氧-二氧化碳发生剂(アネロパック·ケンキ，Mitsubishi Gas Chemical Company,Inc.制)一起装入到密闭容器中，利用设定在37℃的培养箱培养1天，作为画线培养物，得到重组双歧乳杆菌长双歧杆菌105A/pHuSP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv、和长双歧杆菌105A/pP30SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv。
35.由双歧乳杆菌的曲妥珠单抗scFv的纯化
使用上述制作的曲妥珠单抗scFv分泌双歧乳杆菌长双歧杆菌105A/pHuSP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv进行曲妥珠单抗scFv的纯化。
将长双歧杆菌105A/pHuSP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv接种到APS-2S-2.5SE培养基(含有75μg/mL壮观霉素)中，在37℃厌氧培养24小时。将该培养液以0.5％添加到向DMEM:APS-2S-2.5SE＝9:1中以75μg/mL添加了壮观霉素而成的培养基中，在37℃厌氧培养18小时。
对于将上述培养液离心分离得到的培养上清液进行搅拌的同时，一点一点地添加硫酸铵达到80％饱和，在4℃搅拌一晩，进行盐析。将其离心分离后，回收沉淀，利用带组氨酸标签的蛋白质的纯化试剂盒(TALON resin、TAKARA BIO INC.制)进行以组氨酸标签作为指标的纯化。利用超滤(Amicon Ultra-0.5、Merck Millipore公司制)将该纯化溶液浓缩。
使用上述纯化单链抗体的一部分进行SDS-PAGE后，进行考马斯蓝染色(LifeTechnologies Corporation制、SimplyBlueTM SafeStain)，确认了以约十分之九的纯度将曲妥珠单抗scFv纯化。纯化蛋白质的浓度通过Bradford法测定(Coomassie Plus ProteinAssay，Thermo Scientific公司制)。
SDS-PAGE分析的结果如图17所示。可以在曲妥珠单抗scFv的尺寸附近(约25kDa)确认条带。
36.利用荧光抗体法进行的曲妥珠单抗scFv和人乳腺癌细胞株的结合确认
使用由长双歧杆菌105A/pHuSP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv纯化的曲妥珠单抗scFv，确认了与人乳腺癌细胞株的结合。
人乳腺癌细胞株使用HER2阳性株(SK-BR-3、和BT-474)、和HER2阴性株(SK-MEL-28)(全部由American Type Culture Collection，ATCC购入)。免疫染色用的抗His抗体使用AlexaFluor 488标记抗His抗体(Cat.D291-A48、医学生物学研究所社制)。另外，添加抗HER2全身抗体(Cat.427041、NICHIREI BIOSCIENCE INC.制)，确认了细胞的HER2的表达。试剂是使用PBS(-)作为洗涤缓冲液，使用PBS(-)+1.5％BSA作为Ab缓冲液，使用4％PFA(低聚甲醛)-磷酸缓冲液(和光纯药工业社制)作为固定缓冲液，曲妥珠单抗scFv和抗HER2全身抗体用Ab缓冲液制成5μg/mL。曲妥珠单抗scFv的二次抗体使用Anti-His-tag mAb-Alexa Fluor 488，抗HER2全身抗体的二次抗体使用DyLight 594山羊抗-小鼠IgG(Cat.405311、BioLegend公司制)。封固剂使用VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI(Cat.H-1200、VECTORLaboratories公司制)。
在6孔板(NEST公司制)上放置18mm×18mm的盖玻片(松浪硝子工业社制)，进行聚-L-赖氨酸(Sigma-Aldrich Corporation制)涂覆，以1～2×104个细胞/块玻璃培养细胞。1天后将板静置于冰上，抽吸培养基，用洗涤缓冲液洗涤3次。向细胞中添加100μL的Ab缓冲液，在冰上进行30分钟培养。然后，添加100μL的曲妥珠单抗scFv或作为阴性对照的Ab缓冲液，在冰上培养1小时。scFv反应后，用洗涤缓冲液洗涤3次。洗涤后，加入100μL的Anti-His-tagmAb-Alexa Fluor 488(400倍稀释)，在冰上培养30分钟。培养后，用洗涤缓冲液洗涤3次，加入500μL的固定缓冲液，在冰上培养10分钟。然后用洗涤缓冲液洗涤3次，用含有DAPI的封固剂封固，利用荧光显微镜(DM5000B、Leica MICROSYSTEMS公司制)进行观察。
结果如图18所示。确认了在HER2阳性细胞中表达HER2，在HER2阴性细胞中没有表达HER2。进一步地，还显示了曲妥珠单抗scFv与HER2阳性细胞特异性结合，与细胞表面的HER2共同局部存在。
37.使用了流式细胞仪的曲妥珠单抗scFv和人乳腺癌细胞株的结合确认
使用由长双歧杆菌105A/pHuSP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv纯化的曲妥珠单抗scFv确认了与人乳腺癌细胞株的结合。
使用人HER2为阳性的BT-474细胞和SK-BR-3细胞、以及人HER2为阴性的SK-MEL-28细胞(全部由American Type Culture Collection，ATCC购入)。这些细胞利用100mm皮氏培养皿(NIPPON Genetics Co,Ltd制)培养。BT-474细胞使用Hybri-care培养基培养、SK-BR-3细胞使用McCoy’s 5A培养基培养、SK-MEL-28细胞使用E-MEM培养基培养。在这些培养基中全部混合灭活了的10％胎牛血清(EQUITECH-BIO公司制)、和青霉素/链霉素液(COSMO BIO co.,Ltd.制)。
在上述细胞某种程度密集的阶段去除培养基，用PBS(-)(和光纯药工业社制)洗涤，使用胰蛋白酶-EDTA(Life Technologies公司制)由皮氏培养皿剥离细胞，转移到15mL圆锥管(SANPLATEC CO.,Ltd.制)中。用台式小型离心机(久保田制作所制)以1000rpm离心5分钟后，去除上清液，加入培养基5mL。该细胞悬浮液内含有的细胞数利用血细胞计数板测定，以3×104个细胞/管分注到1.5mL管(Eppendorf公司制)中。将分注到1.5mL管中的上述细胞利用微量冷却离心机(TOMY公司制)以5000rpm、在4℃离心1分钟，离心后去除上清液。残留于管的细胞的颗粒使用1mL PBS(-)洗涤2次后，以10μg/mL的浓度添加100μL的所纯化的抗HER2scFv，在冰上静置30分钟。向其中加入荧光标记抗His-tag抗体(Anti-His-tag AlexaFluor 488、医学生物学研究所社制)20μL，通过移液充分混合，在冰上静置20分钟。静置后，将FACS缓冲液(含有1％BSA、0.1％NaN3的PBS)加入到500μL管中进行悬浮，利用微量冷却离心机以5000rpm、在4℃离心1分钟，去除上清液。再次进行该洗涤操作后，添加500μLFACS缓冲液将细胞悬浮，将细胞转移到5mL聚苯乙烯圆底管(Becton,Dickinson and Company制)中。
在即将解析之前添加碘化丙啶溶液(5μg/mL)5μL，通过BD FACS cantoII流式细胞仪(Becton,Dickinson and Company制)、和流式细胞仪解析软件Kaluza ver1.2(BeckmanCoulter,Inc制)进行解析。
结果如图19所示。在图19上段，确认了作为HER2阳性细胞的BT-474细胞、和SK-BR-3细胞与曲妥珠单抗scFv结合。在图19下段，没有发现作为HER2阴性细胞的SK-MEL-28细胞与曲妥珠单抗scFv结合。
38.曲妥珠单抗scFv的癌细胞增殖抑制活性
曲妥珠单抗scFv的生理活性是将长双歧杆菌105A/pP30SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv的培养上清液进行His标签纯化而得到曲妥珠单抗scFv(PBS置换)，将该曲妥珠单抗scFv(PBS置换)添加到HER2阳性细胞(BT474(乳腺癌)细胞)中，测定细胞增殖抑制活性。
将BT474细胞利用McCoy’s5A培养基(含有10％(v/v)FBS)在37℃、5％CO2的条件下培养后，在96孔板中各接种1×104个细胞，在37℃、5％CO2的条件下培养24小时。培养后，抽吸去除培养基，添加新的McCoy’s5A培养基(含有10％(v/v)FBS)各98μL。接着，作为测定试样，添加PBS(-)、抗曲妥珠单抗scFv调整到了244ng/mL～1mg/mL的试样各2μL。将该板在37℃、5％CO2的条件下培养5天。
将上述培养5天后的培养基抽吸去除后，添加向新的McCoy’s5A培养基(含有10％(v/v)FBS)9mL中添加Cell Counting kit-8 1mL而成的物质各100μL，进而在3小时、37℃、5％CO2的条件下保温，测定波长450nm和630nm(参照波长)下的吸光度，由此测定对于上述HER2阳性细胞的细胞增殖抑制活性。
结果如图20所示。由长双歧杆菌105A/pP30SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv纯化的曲妥珠单抗scFv，对于BT474乳腺癌细胞表现出用量依赖性的细胞增殖抑制活性，确认了曲妥珠单抗scFv具有生理活性。
39.曲妥珠单抗scFv分泌双歧乳杆菌长双歧杆菌105A/pP30SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv的抗肿瘤效果的确认
使用人胃癌细胞株NCI-N87的带瘤的裸小鼠，如以下所述确认了长双歧杆菌105A/pP30SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv的抗肿瘤效果。
将人胃癌细胞株NCI-N87(通过ATCC购入)利用添加有10％FBS(EQUITECH-BIO,Inc.制)的RPMI 1640培养基(和光纯药工业社制)培养，移植给裸小鼠(Japan SLC,Inc.制)制作带瘤的小鼠。实验使用肿瘤体积达到约200mm3的带瘤的小鼠。组构成为1组：无处置组(对照组)、2组：长双歧杆菌105A/pBEshuttle株(曲妥珠单抗scFv非表达菌)给药组、3组：长双歧杆菌105A/pP30SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv(曲妥珠单抗scFv表达菌)给药组。各组使用8只带瘤的小鼠。
双歧乳杆菌的给药是由尾静脉以6×108cfu的用量进行1周2次给药。另外，对于双歧乳杆菌给药组(2组及3组)，将10％麦芽糖溶液每1mL以1天2次的频率1周5次给予(5天给药2天休息)。试验期设为3周，经时地进行肿瘤体积的测定，在第22天摘除肿瘤，用于革兰氏染色和免疫组织染色。
肿瘤体积的经时变化、抗肿瘤效果的结果如图21所示。长双歧杆菌105A/pP30SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv给药组的肿瘤体积，在整个试验期与其它组相比低水平地推移。试验结束时(第22天)，与长双歧杆菌105A/pBEshuttle相比，肿瘤体积显著減少，确认了长双歧杆菌105A/pP30SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv的抗肿瘤效果。
40.肿瘤内的长双歧杆菌105A/pP30SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv的确认、以及所分泌的曲妥珠单抗scFv的确认
使用上述39中摘出的肿瘤，对肿瘤内的双歧杆菌属细菌的局部存在通过革兰氏染色进行确认，对于曲妥珠单抗scFv的局部存在通过使用了抗His-tag抗体的免疫组织染色进行确认。
所摘出的肿瘤用O.C.T.compound(Sakura Finetek Co.,Ltd.制)冷冻包埋，使用冷冻切片机Leica CM1900(Leica公司制)制作切片载片标本，用于各组织染色。
革兰氏染色的步骤如以下所示。将上述切片载片标本风干，在4％PFA(和光纯药工业社制)中浸渍10分钟进行固定。固定后，作为预染色，用バーミーM结晶紫溶液(武藤化学社制)染色2分钟后，在バーミーM碘-氢氧化钠溶液(武藤化学社制)中反应1分钟。用バーミーM丙酮-乙醇混合液(武藤化学社制)脱色后，用バーミーM0.1％品红液(武藤化学社制)染色1分钟。染色后，用纯化水洗涤，用99.5％乙醇(和光纯药工业社制)脱水，用Lemosol(和光纯药工业社制)使其清澈后，用ENTELLAN NEW(MERCK KGaA公司制)封固。
结果如图22所示。通过革兰氏染色，对于长双歧杆菌105A/pBEshuttle和长双歧杆菌105A/pP30SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv分别在肿瘤组织中确认了菌的存在(图22的箭头部分)。
利用抗组氨酸标签抗体进行的免疫组织染色的步骤如以下所示。将上述切片载片标本风干，在4％PFA(和光纯药工业社制)中浸渍约4小时进行固定。固定后，用纯化水洗涤1分钟，用1×PBS(-)实施5分钟的洗涤3次。拭去组织周边的水分，用Dako pen(Dako公司制)包围组织的周围，将3％BSA-PBS滴加到组织中进行60分钟反应，实施非特异性结合的抑制。将Anti-His-tag mAb-Alexa Fluor(注册商标)594(MBL公司制)用Can Get Signal(注册商标)immunostain(TOYOBO公司制)混合稀释，作为抗体反应液，滴加到组织，在4℃反应一晩。抗体反应后，用1×PBS(-)实施5分钟的洗涤3次，用VECTASHIELD(注册商标)MountingMedium with DAPI封固。对于上述的染色了的切片用显微镜DM5000B(Leica公司制)进行镜检，拍摄图像。
结果如图23所示。通过组氨酸标签的免疫组织染色，确认了组氨酸标签阳性图像(曲妥珠单抗scFv)(图23的箭头部分)。
由革兰氏染色和免疫组织染色的结果确认了若将长双歧杆菌105A/pP30SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv静脉内给予到人胃癌NCI-N87带瘤的小鼠，则其植入到肿瘤内，并且，由长双歧杆菌105A/pP30SP7L20-opt-曲妥珠单抗scFv分泌的曲妥珠单抗scFv存在于肿瘤内。
产业上的可利用性
本发明的载体、通过该载体转化的肠道细菌与现有物相比，在厌氧性疾病组织中可以将治疗剂有效地供给到疾病部位，因此在药物领域、治疗领域是有用的。

Claims (15)

1.DNA，其编码包含以下a)或b)所示的氨基酸序列的信号肽，
a)序列号1或序列号107所示的氨基酸序列；
b)序列号1或序列号107所示的氨基酸序列中1个或数个氨基酸缺失、置换或增加而成的氨基酸序列，包含该1个或数个氨基酸缺失、置换或增加而成的氨基酸序列的肽在长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)中作为信号肽发挥功能。
2.根据权利要求1所述的DNA，其包含序列号2或序列号108所示的碱基序列。
3.DNA，其编码在包含以下a)或b)所示的氨基酸序列的信号肽的C末端连接包含氨基酸序列的接头而成的信号肽-接头连接体，
a)序列号1或序列号107所示的氨基酸序列；
b)序列号1或序列号107所示的氨基酸序列中1个或2个氨基酸缺失、置换或增加而成的氨基酸序列，包含该1个或2个氨基酸缺失、置换或增加而成的氨基酸序列的肽在长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)中作为信号肽发挥功能。
4.根据权利要求3所述的DNA，其特征在于，信号肽-接头连接体包含序列号3或序列号109所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的DNA，其包含序列号4或序列号110所示的碱基序列。
6.DNA插入物，其是在权利要求1～5中任一项所述的DNA的3’末端连接抗体基因的5’末端而成的。
7.根据权利要求6所述的DNA插入物，其中，抗体基因是具有抗癌作用的抗体的基因。
8.根据权利要求7所述的DNA插入物，其中，具有抗癌作用的抗体是曲妥珠单抗。
9.根据权利要求8所述的DNA插入物，其中，曲妥珠单抗是曲妥珠单抗单链抗体。
10.载体，其插入有权利要求6～9中任一项所述的DNA插入物。
11.肠道细菌，其通过权利要求10所述的载体转化。
12.根据权利要求11所述的肠道细菌，其是属于双歧杆菌属的微生物。
13.根据权利要求12所述的肠道细菌，其中，属于双歧杆菌属的微生物是长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。
14.抗体药物组合物，其以权利要求10～13中任一项所述的肠道细菌作为有效成分。
15.根据权利要求14所述的抗体药物组合物，其特征在于，其是抗癌剂组合物。
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