KR20150037953A - 항종양제, 종양 검출용 마커 및 경구 백신제 - Google Patents

항종양제, 종양 검출용 마커 및 경구 백신제 Download PDF

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KR20150037953A
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각코호진 데이쿄 헤이세이 다이가쿠
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Abstract

침습성이 적고 부작용이 적고 또한 표적 특이성이 높은 항종양제 및/또는 종양 검출용 마커를 제공하는 것을 목적으로 한다.
시그널 펩티드, 저분자량의 단일쇄 항체 및 기능성 펩티드로 이루어진 분비형 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한 재조합 편성(偏性) 혐기성 그램 양성균을 유효 성분으로서 이용함으로써 표적 세포에 기능성 펩티드를 송달 가능한 항종양제 및/또는 치료 효과를 경시적으로 모니터링하는 것이 가능한 종양 검출용 마커를 제공한다.

Description

항종양제, 종양 검출용 마커 및 경구 백신제 {ANTI-TUMOUR AGENT, MARKER FOR TUMOUR DETECTION, AND ORAL VACCINE AGENT}
본 발명은 재조합 편성(偏性) 혐기성 그램 양성균을 유효 성분으로 하는 항종양제, 종양 검출용 마커 및 경구 백신제에 관한 것이다.
비피더스균을 비롯한 편성 혐기성균은 정맥 내에 투여한 경우 매우 높은 선택성을 가지고 종양에서만 증식한다(비특허문헌 1). 이것은 종양의 중심부가 저산소 영역이므로 혐기적 환경이 존재하여 편성 혐기성균이 생존 및 증식 가능하기 때문이라고 생각된다. 또 비피더스균은 그램 양성균이며, 사후에도 내독소(endotoxin)를 방출할 위험성이 없다는 이점도 있다. 한편 종양 조직의 중심부의 이 혐기적 환경은 종래의 화학 요법에 저항성을 일으키는 원인으로도 생각된다(비특허문헌 2). 따라서 비피더스균의 상기 특징을 이용하여 종양 조직에 대한 DDS(Drug Delivery System) 담체로서의 유용성이 주목되고 있다.
예를 들면, 특허문헌 1 및 비특허문헌 3에서는 고형암 치료를 목적으로 하여 프로드러그인 5-플루오로시토신(5-FC)을 5-플루오로우라실(5-FU)로 전환 가능한 대장균의 시토신디아미나제(CD: cytosine deaminase)를 발현하는 재조합 비피더스균을 만들어내고 이 재조합 비피더스균을 5-FC와 함께 투여함으로써 항종양 효과를 얻는 발명이 개시되어 있다. 그러나 이 방법은 재조합 비피더스균 외에 5-FC를 대량으로 생체에 투여할 필요가 있기 때문에 번잡하고, 부작용 등을 고려하면 임상 개발시에는 여러 제약이 발생하는 문제가 있었다.
또 특허문헌 2에는 생물 활성을 가진 폴리펩티드를 높은 수준으로 분비 발현시킬 수 있는 재조합 비피더스균을 만들어내어 재조합 비피더스균을 종양에 직접 주입하는 발명이 개시되어 있다. 그러나 이 방법은 종양의 위치를 정확하게 특정할 필요가 있기 때문에 적용 범위가 좁고, 또 체내 심부(深部)에 종양이 존재할 경우에는 침습성이 높기 때문에 범용성이 부족하다는 문제가 있었다.
다른 세균을 이용한 종양에 대한 치료법으로서는 특허문헌 3 및 비특허문헌 4 및 5에 기재된 클로스트리디움ㆍ노비균(Clostridium novyi)이나 비특허문헌 6 및 7에 기재된 살모넬라균(Salmonella typhimurium) 등이 보고되고 있으나 모두 병원성 세균 유래이며, 유해한 외독소를 분비하기 때문에 투여하는 생체의 안전면에서 큰 문제가 있었다.
특허문헌 1: 일본특허 제3642755 특허문헌 2: WO/2010/126073 특허문헌 3: 일본특개2009-541319
비특허문헌 1:　Kimura N.T., et al., 1980, Cancer Res., 40 (6): 2061-2068. 비특허문헌 2:　Tredan O, et al., 2007, J Natl Cancer Inst, 99: 1441-1454. 비특허문헌 3:　S. Taniguchi et al., 2010, Cancer. Sci., 101 (9): 1925. 비특허문헌 4:　Dang L.H., et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 15155-15160. 비특허문헌 5:　Ian C., et al., 2006, Science 314: 1308-1311. 비특허문헌 6:　Pawelek J.M., et al., 1997, Cancer Res., 57:4537-4544. 비특허문헌 7:　Toso J.F., et al., 2002, J. Clin. Oncol., 20:142-152.
본 발명의 과제는 기능성 펩티드를 코딩하는 핵산을 발현 및 분비 가능한 상태로 표적 세포 주변에까지 송달할 수 있는 약제 송달용 담체로서 기능하는 재조합 편성 혐기성 그램 양성균을 제공하는 것이다.
본 발명의 과제는 침습성이 낮고 부작용이 적고 또한 표적 특이성이 높은 항종양제 및/또는 치료 효과를 경시적(經時的)으로 모니터링할 수 있는 종양 검출용 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 과제는 비침습적이고 부작용이 낮고 또한 표적 특이성이 높은 경구 백신제를 제공하는 것이다.
약제 송달용 담체로서의 편성 혐기성균의 임상 응용을 고려하면 범용성이 높은 정맥내 투여에 의한 치료법이 유효하다. 그러나 그러기 위해는 암세포를 특이적으로 표적으로 하고, 또한 세포 상해 활성이 높은 생리 활성 펩티드를 구축할 필요가 있다. 그런데 비피더스균 내에서 면역 글로블린(IgG)을 발현시킨 경우, 기능성이 있는 항체가 발현하지 않는다는 큰 문제가 있었다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 시그널 펩티드, 단일쇄 항체로 구성되는 저분자량의 항종양 항체, 및 외독소로 이루어진 분비형 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한 유전자 조작 비피더스균을 제작하여 담암(擔癌) 마우스 Xenograft 모델에 정맥 내에 투여한 바, 해당 재조합 비피더스균은 매우 높은 선택성으로 종양 내에 축적되고 또한 생체에 큰 부작용을 미치지 않고 분비된 융합 단백질의 세포 상해 활성에 의해 그 종양 세포의 증식을 90% 이상 억제하는 데 성공했다. 본 발명은 해당 연구 결과에 기초한 것으로서, 구체적으로는 이하의 발명을 제공한다.
(1) 시그널 펩티드, 단일쇄 항체 및 1 또는 2 이상의 기능성 펩티드를 포함한 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 발현 가능한 상태로 포함한 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
(2) 편성 혐기성 그램 양성균이 비피도박테리움속(Bifidobacterium)인, (1)에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
(3) 상기 단일쇄 항체는 분자량 35kDa 이하의 저분자 항체인, (1) 또는 (2)에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
(4) 상기 핵산이 2 이상인 단일쇄 항체를 코딩하는, (1)∼(3) 중 어느 한 항에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
(5) 상기 단일쇄 항체가 표적 세포의 표면 항원을 인식하여 결합되는, (1)∼(4) 중 어느 한 항에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
(6) 상기 표적 세포가 종양 세포인 (5)에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
(7) 상기 기능성 펩티드가 외독소 및/또는 표지 단백질인, (5) 또는 (6)에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
(8) 상기 표지 단백질이 형광 단백질 또는 발광 단백질인, (7)에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
(9) 상기 기능성 펩티드가 백신 항원 펩티드인, (1)∼(5) 중 어느 한 항에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
(10) (7)에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균을 유효 성분으로 하는 항종양제.
(11) (7) 또는 (8)에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균을 유효 성분으로 하는 항종양제 및/또는 종양 검출용 마커.
(12) (9)에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균을 유효 성분으로 하는 경구 백신제.
본 명세서는 본원 우선권의 기초인 일본특허출원2012-158044호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1은 실험에 이용한 융합 단백질을 코딩하는 각 발현 카세트의 구조를 도시한 도면이다.
도 2는 구축한 융합 단백질의 면역 분석법(immuno-blot)을 도시한 도면이다.
도 3a는 각 융합 단백질에 의한 A431세포의 증식 저해를 도시한 도면이다.
도 3b는 각 융합 단백질에 의한 BxPC-3세포의 증식 저해를 도시한 도면이다.
도 3c는 각 융합 단백질에 의한 HT-29세포의 증식 저해를 도시한 도면이다.
도 4a는 A431세포와 Ec-8C7 EGFP의 결합을 도시한다. 왼쪽 칼럼은 버퍼만을 첨가한 음성 대조의 결과를, 오른쪽 칼럼은 Ec-8C7 EGFP를 첨가했을 때의 결과를 각각 도시한다. 각 칼럼의 상단은 형광상(像), 하단은 동일한 시야의 명(明)시야상이다.
도 4b는 HT-29세포와 Ec-8C7 EGFP의 결합을 도시한다. 왼쪽 칼럼은 버퍼만을 첨가한 음성 대조의 결과를, 오른쪽 칼럼은 Ec-8C7 EGFP를 첨가했을 때의 결과를 각각 도시한다. 각 칼럼의 상단은 형광상, 하단은 동시야의 명시야상이다.
도 4c는 A431세포에서의 EGFR 내재화(internalization)의 경시적 결과를 도시한다. 상단은 형광상, 하단은 동시야의 명시야상이다.
도 5는 Ec-8C7 EGFP와 재조합 인간 EGFR 세포외 도메인과의 결합 친화성을 도시한 도면이다.
도 6은 비피더스균과 대장균의 셔틀 벡터 pKKT427의 구조를 도시한 도면이다.
도 7은 MRS 선택 한천 배지상에 출현한 8C7 독소(toxin)를 발현하는 재조합 비피더스균의 콜로니수를 도시한 도면이다. 종양, 혈액 및 비장은 모두 인간 피부암 유래 세포 A431를 피하 이식한 담암 마우스로부터 채취한 샘플이다. 또 각 샘플에서 흰 동그라미, 검은 동그라미, 삼각형 등은 동일 개체 유래인 것을 도시한다. 각 샘플의 가로줄은 평균값을 도시한다.
도 8은 A431세포를 피하 이식한 담암 마우스에 대해, 8C7 독소를 발현하는 재조합 비피더스균을 정맥내 투여했을 때 해당 마우스에서의 간기능 변화를 도시한 도면이다.(n=5)
도 9는 A431세포 담암 마우스에서 재조합 비피더스균으로부터 분비된 8C7 EGFP의 EGFR 내재화를 도시한 도면이다.
도 10은 A431세포를 피하 이식한 담암 마우스에 대해 8C7 독소를 발현하는 재조합 비피더스균을 정맥내 투여했을 때의 항종양 효과를 도시한 도면이다.
도 11은 BxPC-3 세포를 피하 이식한 담암 마우스에 대해 8C7 독소를 발현하는 재조합 비피더스균을 정맥내 투여했을 때의 항종양 효과를 도시한 도면이다.
도 12는 인간 비소(非小)세포 폐암 유래 세포의 PC-9세포를 피하 이식한 담암 마우스에 8C7 독소를 발현하는 재조합 비피더스균을 정맥내 투여했을 때의 항종양 효과를 도시한 도면이다.
도 13은 8C7 EGFP를 발현하는 재조합 비피더스균을 경구 투여한 마우스(8C7 EGFP) 및 음성 대조가 되는 pKKT427 함유 재조합 비피더스균을 경구 투여한 마우스(pKKT427) 각각의 대변 중에서의 항EGFP 항체 생산량을 도시한 도면이다.
도 14는 colon26 세포를 피하 이식한 담암 마우스에 대해 8C7 독소를 발현하는 재조합 비피더스균을 정맥내 투여했을 때의 혈청중의 항8C7 EGFP 항체의 유도성을 도시한 도면이다. nlgG는 음성 대조의 Normal Mouse IgG를 도시한다. 항EGFP 항체는 양성 대조이다.
이하, 본 발명에 대해 구체적으로 설명하기로 한다.
1. 재조합 편성 혐기성 그램 양성균
1-1. 개요 및 정의
본 발명의 제1 형태는 재조합 편성 혐기성 그램 양성균(이하, 종종 「재조합 세균」으로 약칭한다)이다. 본 발명의 재조합 세균은 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 발현 가능한 상태로 포함한 약제 송달용 담체이다.
「편성 혐기성 그램 양성균」이란 그램 양성균으로 분류되는 편성 혐기성균을 말한다. 여기서 「편성 혐기성균」이란 절대 혐기성균이라고도 불리며, 고산소 존재하에서는 증식하지 못하고 사멸하는 성질을 가진 세균을 말한다. 따라서 포유동물의 체내에서는 저산소에서 혐기 상태의 소화기관내, 주로 장내에서는 증식 가능하지만, 용존 산소가 존재하는 혈액 등의 체액중이나 통상의 조직 내에서는 증식할 수 없다. 「그램 양성균」이란 그램 염색에 의해 보라색 또는 감색으로 염색되는 세균의 총칭이다. 그램 양성균에는 간균, 구균, 나선균이 알려져 있으나 본 명세서에서는 특별히 한정하지는 않는다. 그램 양성균은 내독소(endotoxin)를 포함하지 않기 때문에 사후에도 내독소를 방출하지 않는다. 따라서 안전성면에서 본 발명의 약제 송달용 담체로서 바람직하다. 본 발명의 재조합 세균으로서는, 예를 들면 비피도박테리움속(Bifidobacterium)(본 명세서에서는 이하 비피도박테리움속을 총칭하여 「비피더스균」이라고 부른다), 클로스트리듐속(Clostridium)이 해당할 수 있다. 바람직하게는 비피더스균이다. 이것은 비피더스균이 외독소(exotoxin)를 분비하지 않고 또 유산균으로서 일상적으로 이용되고 있으며 인체 등에 대한 안전성이 확인되었기 때문이다. 비피더스균은 어느 종이어도 무관하나 바람직하게는 인간의 장관 내에 생식하는 종류, 구체적으로는 B.비피듐(B. bifidum), B.롱검(B. longum), B.브레이브(B. brave), B.인판티스(B. infantis) 및 B.아돌레센티스(B. adolescentis)이다.
1-2. 구성
본 발명의 편성 혐기성 그램 양성균은 융합 단백질을 코딩하는 핵산(이하, 종종 「융합 유전자」라고 한다)을 발현 가능한 상태로 포함한다. 이하, 본 발명의 재조합 세균을 특징짓는 융합 유전자 및 그것을 발현 가능한 상태로 하는 발현 카세트의 구성에 대해 구체적으로 설명하기로 한다.
1-2-1. 융합 유전자의 구성
본 명세서에서 「융합 단백질을 코딩하는 핵산(융합 유전자)」이란 유전자 재조합 기술에 의해 복수의 유전자 등을 융합하여 구축된, 융합 단백질을 코딩하는 외래성 핵산을 말한다. 융합 유전자는 후술하는 발현 카세트 내에 삽입된 상태로 본 발명의 재조합 세균 내에 도입되어 있다.
본 명세서에서 「융합 단백질」이란 시그널 펩티드, 단일쇄 항체 및 기능성 펩티드를 포함하고 그것들을 연결한 세포외 분비성 단백질이다. 시그널 펩티드, 단일쇄 항체 및 기능성 펩티드는 직접 연결되어 있어도 되고, 링커 펩티드를 사이에 두고 간접적으로 연결되어 있어도 된다. 링커 펩티드의 길이나 아미노산 서열은 단일쇄 항체 및 기능성 펩티드 각각의 기능을 저해하지 않는다면 특별히 한정하지는 않는다. 예를 들면, 20아미노산 이하 또는 15아미노산 이하에서 자기 폴딩하지 않는 아미노산 서열 등이 적합하다. 이하, 융합 단백질을 구성하는 시그널 펩티드, 단일쇄 항체 및 기능성 펩티드에 대해 구체적으로 설명하기로 한다.
(1) 시그널 펩티드
시그널 펩티드는 세포 내에서 생합성된 단백질의 세포외 이행에 필요한 펩티드이다. 통상, N말단측에 Lys나 Arg와 같은 양전하를 가진 아미노산을 배치하고, 그에 이어서 Ala, Leu, Val, Ile, Val, 및 Phe와 같은 소수성이 높은 아미노산 서열을 배치한다. 또 시그널 펩티드의 C말단측에는 시그널 펩티드의 절단과 분비를 촉진하는 시그널 서열 후 삽입 서열 및/또는 융합 단백질로부터 시그널 펩티드를 절단하는 시그널 펩티다아제 인식 부위를 포함한 아미노산 서열을 가지고 있어도 된다. 시그널 펩티드는 본 발명의 세균 내에서 발현된 상기 융합 단백질을, 막에 존재하는 트랜스 로케이터 등을 사이에 두고 세포 외에 분비하는 기능을 담당한다. 시그널 펩티드의 아미노산 서열은 특별히 한정되지는 않는다. 편성 혐기성 그램 양성균 내에서 기능할 수 있는 공지의 여하한 시그널 서열의 아미노산 서열을 이용할 수 있다. 또 시그널 펩티드의 아미노산 길이도 특별히 한정되지는 않는다. 통상적으로는 3아미노산∼60아미노산의 범위 내에 있으면 된다. 단, 융합 단백질의 분자량이 지나치게 커지지 않도록 하기 위해 아미노산 길이가 짧은 시그널 펩티드가 바람직하다.
시그널 펩티드는 융합 단백질의 N 말단측에 배치한다.
(2) 단일쇄 항체
상기 융합 단백질에는 단일쇄 항체가 포함된다. 본 명세서에서 「단일쇄 항체」란, 단일쇄(一本鎖) 폴리펩티드로 구성되고 또한 단일체(單體)로 표적 물질을 인식하여 결합할 수 있는 항체를 말한다. 이중쇄(二本鎖) 이상으로 구성되는 항체는 분자량적으로 지나치게 크기 때문에 편성 혐기성 그램 양성균 내에서는 발현되지 않을 가능성이나 항체 기능을 가진 적절한 입체 구조가 구축되지 않을 가능성이 높기 때문이다. 따라서 본 발명의 단일쇄 항체는 1개당 분자량이 35kDa 이하인 저분자 항체인 것이 바람직하다. 천연 항체 및 인공 항체는 불문한다.
본 명세서에서 「천연 항체」란 여하한 척추동물이 생산하는 항체와 동일한 아미노산 서열을 가진 항체를 말한다. 천연 항체의 단일쇄 항체의 구체예로서는, 예를 들면 낙타과의 동물이 생산하는 단일쇄 항체를 들 수 있다(Zhang L., et al., 1993, Nature, 362: 446-448) (이하, 본 명세서에서는 「낙타과 단일쇄 항체」라고 한다). 낙타과 단일쇄 항체는 L쇄 없이 H쇄만으로 구성되는 항체이며, H쇄의 VH영역만으로 항원과 결합할 수 있기 때문에 분자량은 약 14kDa로 통상의 항체의 10분의 1 정도밖에 없다. 또 일반적으로 항원 친화성이 높아 열, 산 및 염기에 대한 내성이 높다는 성질이 있다 (Deffar, K., et al., 2009, African Journal of Biotechnology 8 (12): 2645-2652). 따라서 본 발명에서의 단일쇄 항체로서 매우 적합하다. 낙타과의 동물종은 낙타과 단일쇄 항체를 생산할 수 있다면 그 종류는 불문한다. 예를 들면 라마, 알파카, 낙타 등 어떠한 동물종 유래의 항체도 이용할 수 있다.
본 명세서에서 「인공 항체」란 인공적으로 구축된 항체이다. 예를 들면, 상기 천연 항체의 아미노산 서열에 적당한 변이를 도입한 단일쇄 항체 외에 천연계에는 원칙적으로 존재하지 않는 구조상의 개변을 행한 단일쇄 항체를 들 수 있다. 후자인 인공 항체의 단일쇄 항체의 구체예로서는, 단일쇄 Fv (scFv: single chain Fragment of variable region) (Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995, Pierce Chemical Co., Rockford, IL)를 들 수 있다. 단일쇄 Fv는 면역 글로블린 분자에서 L쇄과 H쇄에 위치하는 가변 영역(즉, 각각 VL 및 VH)을 충분한 길이의 유연성 링커에 의해 연결하여 1개의 폴리펩티드쇄에 포함시킨 구조를 가진 분자량 약 35kDa 이하의 합성 항체이다. 단일쇄 Fv 내에서 양 가변 영역은 서로 자기 집합하여 1개의 기능적인 항원 결합 부위를 형성할 수 있다.
상기 융합 단백질에서 단일쇄 항체는 2 이상 포함되어 있어도 된다. 단, 항체수가 많아지면 융합 단백질의 분자량이 커지기 때문에 단일쇄 항체는 여러 개, 예를 들면 2∼4개, 2∼3개 또는 2개가 바람직하다. 개개의 단일쇄 항체는 적당한 링커 펩티드로 연결되어 있는 것이 바람직하다. 링커 펩티드의 길이나 아미노산 서열은 각각의 단일쇄 항체의 항원 결합 활성을 저해하지 않는다면 특별히 한정되지는 않는다. 예를 들면, 전술한 단일쇄 항체와 외독소를 연결하는 링커 펩티드와 동일해도 좋다. 단일쇄 항체를 2 이상 포함한 경우 개개의 단일쇄 항체는 상이한 항원 에피토프를 인식해도 된다. 항원인 동일 표적 물질의 다른 에피토프를 인식하는 2 이상의 단일쇄 항체를 포함한 융합 단백질은 항원 친화성을 더욱 높일 수 있다.
단일쇄 항체의 표적 물질은 특별히 한정하지는 않지만, 바람직하게는 세포이다. 따라서 단일쇄 항체는 표적 세포의 표면 항원을 인식하여 결합하는 것이 바람직하다. 전술한 바와 같이 본 발명의 재조합 세균은 혐기성 환경하에서만 증식 가능하기 때문에 생체 내에서 혐기적 환경하가 되는 세포가 표적 세포로서 매우 적합하다. 구체적으로는 종양 세포 또는 장관(腸管) 상피 세포를 들 수 있다.
단일쇄 항체는 융합 단백질에서 시그널 펩티드의 C말단측이라면 후술하는 기능성 펩티드와의 순서는 특별히 제한되지는 않지만, 기능성 펩티드의 N말단측에 배치하는 것이 바람직하다.
(3) 기능성 펩티드
상기 융합 단백질에는 기능성 펩티드가 포함된다. 본 명세서에서 「기능성 펩티드」란 생체 내 또는 세포 내에서 특정 생물 활성, 예를 들면 효소 활성, 촉매 활성, 기질로서의 기능, 또는 생물학적 저해 혹은 항진 기능(예를 들면, 세포 상해 활성)을 가진 펩티드를 말한다. 구체적으로는, 예를 들면 외독소, 형광 단백질 또는 발광 단백질, 효소, 항원 펩티드를 들 수 있다.
기능성 펩티드 유래의 생물종은 불문한다. 또 기능성 펩티드는 천연형 또는 비천연형 중 어느 것이어도 된다. 천연형의 기능성 폴리펩티드란 천연계에 존재하는 펩티드를 말한다. 한편 비천연형의 기능성 폴리펩티드란 천연형의 기능성 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 그 기능성 펩티드가 가진 특유의 기능을 잃지 않는 범위에서 아미노산 서열에 적당한 변이(아미노산의 부가, 결실, 치환을 행한 것)를 도입한 개변 펩티드를 말한다.
상기 융합 단백질에서 기능성 펩티드는 2 이상 포함되어 있어도 된다. 단, 복수의 기능성 펩티드를 포함한 경우 융합 단백질 전체의 분자량이 지나치게 커지기 때문에 기능성 펩티드의 총분자량은 80kDa 이하, 바람직하게는 40kDa 이하로 하는 것이 좋다. 2 이상의 기능성 펩티드를 포함할 경우 각각의 기능성 펩티드는 동일 또는 다른 종류로 할 수 있다. 예를 들면 외독소와 효소, 또는 외독소와 형광 단백질 또는 발광 단백질을 조합한 기능성 펩티드를 들 수 있다. 2 이상의 기능성 펩티드를 포함할 경우, 개개의 기능성 펩티드는 직접 연결되어 있어도 되지만, 각각의 기능성 펩티드가 독자적인 기능을 효율적으로 발휘할 수 있도록 적당한 링커 펩티드로 연결되어 있는 것이 바람직하다. 링커 펩티드의 길이나 아미노산 서열은 기능성 펩티드의 기능을 저해하지 않는다면 특별히 한정되지는 않는다. 2 이상의 다른 기능성 펩티드를 1개의 융합 단백질에 포함시킴으로써 단일쇄 항체가 인식하는 표적 물질에 대해 다른 기능을 부여하는 것이 가능하게 된다.
기능성 펩티드는 융합 단백질에서 시그널 펩티드의 C 말단측이라면 특별히 제한하지는 않지만 상기 단일쇄 항체의 C말단측에 배치하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명의 재조합 세균에서 기능성 펩티드로서 작용할 수 있는 상술한 외독소, 효소, 형광 단백질 또는 발광 단백질, 항원 펩티드에 대해 구체적으로 설명하기로 한다.
(i) 외독소
「외독소」(exotoxin)이란 세균이 균체 외에 분비하는 독성 단백질이다. 외독소는 세포 상해 활성을 가지고 또한 그 염기서열이 기지(旣知)의 것이라면 종류는 불문한다. 예를 들면 녹농균 독소(Pseudomonas toxin; PT) 및 그 파생물, 예를 들면 PT에서 세포 접착 도메인을 제거한 외독소A(서열번호 9), 디프테리아 독소(Diphtheria toxin: DT) 및 그 파생물, 및 리신(Ricin) 및 그 파생물을 들 수 있다(Brinkmann U.& Pastan I., 1994, Biochimica et Biophysica Acta, 1198(1): 27-45). 녹농균 외독소A는 암세포 내에 수용된 후 EF-2를 ADP 리보실화하여 불활성화함으로써 단백질 합성을 저해하여 강한 살세포(殺細胞) 효과를 발휘하는 것이 알려져 있다. 상기 단일쇄 항체에 외독소가 연결된 융합 단백질은 이뮤노톡신(면역 독소)으로서 기능할 수 있다.
(ii) 효소
기능성 펩티드로서의 효소의 종류는 염기서열이 기지의 것이라면 특별히 불문한다. 표적 물질에 대해 직접 작용하는 효소여도 되고, 표적 물질에 대해 직접 작용은 하지 않고 그 주변에서 기능하는 효소여도 된다. 후자의 구체예로서는 발광에 기여하는 루시페라아제, 퍼옥시다아제 (예를 들면, 서양 와사비 퍼옥시다아제) 등을 들 수 있다. 상기 단일쇄 항체에 효소가 연결된 융합 단백질은 이뮤노엔자임(면역 효소)으로서 기능할 수 있다.
(iii) 형광 단백질 또는 발광 단백질(표지 단백질)
기능성 펩티드로서의 형광 단백질의 종류는 염기서열이 기지의 것이라면 특별히 불문한다. 상기 천연형 및 비천연형 중 어느 것이어도 된다. 단, 상기 이유로 인해 아미노산 길이가 짧은 것이 바람직하다. 또 여기 파장, 형광 파장도 특별히 한정되지는 않는다. 이러한 파장은 상황 및 필요에 따라 적절히 선택하면 된다. 구체적인 형광 단백질로서는, 예를 들면 CFP, RFP, DsRed, YFP, PE, PerCP, APC, GFP 등을 들 수 있다.
또 발광 단백질에 대해도 염기서열이 기지의 것이라면 그 종류는 특별히 불문한다. 상기 형광 단백질과 마찬가지로 천연형 및 비천연형 중 어느 것이어도 좋지만 아미노산 길이가 짧은 것이 바람직하다. 구체적인 발광 단백질로서는 예를 들면 에쿼린 등을 들 수 있다.
(ⅳ) 항원 펩티드
본 명세서에서 「항원 펩티드」란 1 이상의 에피토프(항원 결정기)를 포함하고 해당 펩티드를 투여한 개체에 대해 면역 응답을 유도할 수 있는 펩티드를 말한다. 항원 펩티드는 상기 면역 응답의 유도 활성을 가지고 있다면, 즉 항원 에피토프를 1 이상 포함하고 있다면 그 종류는 불문한다. 예를 들면, 바이러스(인플루엔자 바이러스, C형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 인간 T세포 백혈병 바이러스-1형, 에이즈 바이러스, 웨스트나일 열바이러스, 파피로마 바이러스, 로타 바이러스, 노워크 바이러스) 유래의 펩티드, HER2 단백질, 말라리아 원충, 트리파노소마 원충, 티푸스균 유래의 펩티드 등을 들 수 있다. 단, 융합 단백질 중의 단일쇄 항체가 인식하는 항원은 아니라는 것을 전제로 한다. 또 항원 펩티드의 아미노산 길이도 1 이상인 에피토프를 포함하고 있다면 특별히 한정되지는 않는다. 단, 전술한 바와 같이 기능성 펩티드의 총 분자량이 어느 정도 제한되기 때문에 상한은 800아미노산 이하, 바람직하게는 400아미노산 이하이다. 또 하한은 1에피토프를 포함할 수 있는 최소 아미노산 길이, 예를 들면 7아미노산 이상, 바람직하게는 8아미노산 이상, 보다 바람직하게는 9아미노산 이상이다. 상기 단일쇄 항체에 항원 펩티드가 연결된 융합 단백질은 이뮤노안티겐(면역 항원; 항체와 항원의 융합 펩티드)으로서 기능할 수 있다.
1-2-2. 발현 카세트의 구성
본 명세서에서 「발현 카세트」란 상기 융합 유전자를 포함하고 그것을 융합 단백질로서 발현 가능한 상태로 할 수 있는 발현 시스템을 말한다. 본 명세서에서 「발현 가능한 상태」란 해당 발현 카세트에 포함되는 융합 유전자가 재조합 세균 내에서 발현 가능하도록 유전자 발현에 필요한 엘리먼트의 제어하에 배치되어 있는 상태를 말한다. 유전자 발현에 필요한 엘리먼트에는 프로모터 및 터미네이터를 들 수 있다.
프로모터는 재조합 세균 내에서 작동 가능한 프로모터라면 특별히 제한하지는 않지만, 사용하는 편성 혐기성 그램 양성균 유래의 프로모터가 바람직하다. 예를 들면 편성 혐기성 그램 양성균에 비피더스균의 B.롱검을 사용할 경우에는 B.롱검의 hup 유전자 프로모터 (서열번호 4)를 들 수 있다. 또 프로모터에는 그 발현 제어의 성질에 의해 과잉 발현형 프로모터, 구성적 프로모터, 부위 특이적 프로모터, 단계 특이적 프로모터, 또는 유도성 프로모터 등이 알려져 있다. 본 발명에서의 발현 카세트에 사용하는 프로모터가 어느 프로모터일지는 특별히 한정되지는 않는다. 필요에 따라 적절히 선택하면 된다. 바람직하게는 과잉 발현형 프로모터 또는 구성적 프로모터이다. 상기 발현 카세트에서 프로모터는 상기 융합 유전자의 개시 코돈보다 상류의 5'측에 배치된다.
터미네이터는 재조합 세균 내에서 상기 프로모터에 의해 전사된 유전자의 전사를 종결할 수 있는 서열이라면 특별히 한정하지는 않는다. 예를 들면, 히스톤형 단백질 터미네이터(HUT)(서열번호 10)를 들 수 있다. 바람직하게는 프로모터와 동일 생물종 유래의 터미네이터이며, 보다 바람직하게는 프로모터가 유래하는 생물종의 게놈상에서 그 프로모터와 조를 이루고 있는 터미네이터이다. 상기 발현 카세트에서 터미네이터는 상기 융합 유전자의 종지 코돈보다 하류의 3'측에 배치된다.
상기 융합 단백질을 재조합 세균 내에서 안정적으로 발현시키기 위해 발현 카세트를 포함한 벡터를 발현 벡터로 하여 동일균체 내에 도입할 수 있다. 또는 상동성 재조합을 통하여 동일균의 게놈 내에 삽입해도 된다. 발현 벡터를 사용할 경우 벡터에는 플라스미드 등을 사용할 수 있다. 벡터는, 본 발명의 재조합 세균 내에서 복제 가능하며 또 균체 내에서 안정적으로 유지되는 적당한 선발 마커 유전자를 포함한 것을 이용한다. 벡터는 대장균 등의 다른 세균 내에서도 복제 가능한 셔틀 벡터여도 된다. 예를 들면 pKKT427, pBESAF2, pPSAB1 등을 들 수 있다. 재조합 세균의 게놈 내에 삽입할 경우 융합 유전자만을 재조합 세균의 게놈 중에 발현 가능한 상태가 되도록 삽입해도 된다. 즉, 재조합 세균의 내재성 프로모터나 터미네이터의 제어하에 융합 유전자를 삽입해도 된다.
발현 카세트는 1개의 발현 카세트 내에 1개의 융합 유전자를 포함한 모노시스트로닉이어도 되고 2 이상의 융합 유전자를 포함한 폴리시스트로닉이어도 된다.
1-3. 재조합 편성 혐기성 그램 양성균의 제조방법
본 발명의 재조합 세균은 해당 분야에서 공지의 분자 유전학적 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면 상기 융합 유전자라면 시그널 펩티드, 단일쇄 항체 및 외독소를 각각 코딩하는 핵산을, 예를 들면 Sambrook et al., Molecular Cloning, 3rd Ed., Current Protocols in Molecular Biology (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press나 Ausubelet al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Ed., A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley ＆ Sons에 기재된 수법을 이용하여 구축하면 된다.
상기 단일쇄 항체는 임의의 표적 물질을 항원으로 할 수 있다. 단, 그 경우 표적 물질을 특이적으로 인식하여 결합하는 항체를 코딩하는 유전자의 염기서열 정보가 필요하다. 이 항체의 염기서열 정보는 표적 물질에 대한 항체의 염기서열이 공지의 것이라면 그 서열 정보를 이용할 수 있다.
표적 물질에 대한 항체가 미지의 것인 경우에는 그 표적 물질에 대한 모노 클로날 항체의 제작은 해당 분야에서 공지의 방법에 따라 행하면 된다. 이하, 그 제작예를 나타낸다.
표적으로 하는 종양 세포 등을 면역원으로 하여 낙타과 동물에 투여하여 면역한다. 필요하다면 면역을 효과적으로 행하기 위해 아쥬반트를 첨가해도 된다. 아쥬반트의 예로서는, 시판되는 완전 프로인트 아쥬반트(FCA), 불완전 프로인트 아쥬반트(FIA) 등을 들 수 있으며 이들을 단독으로 또는 혼합하여 이용할 수 있다. 면역원 용액의 1회 투여량은 상기 동물 1마리당 약 50∼200㎛의 면역원을 포함하고 있으면 된다. 면역의 간격은 특별히 한정되지 않으며 첫회 면역 후 수일 내지 수주간 간격으로, 바람직하게는 1∼4주간 간격으로 2∼10회, 바람직하게는 5∼7회 추가 면역을 행한다. 첫회 면역 후 면역 동물의 혈청중의 항체값 측정을 ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)법 등에 의해 반복 실시한다. 계속해서 면역된 동물로부터 항체 생산 세포를 채취한다. 항체 생산 세포로는 비장 세포, 림프절 세포, 말초혈 세포 등을 들 수 있는데, 말초혈 세포가 바람직하다. 다음으로 말초혈 세포로부터 RNA를 추출하고 올리고 dT 프라이머 및 랜덤 6mer 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성한다. 이 cDNA로부터 낙타과 단일쇄 항체의 가변 영역(VHH영역)의 유전자를 PCR에 의해 증폭하고 pCANTAB6 등의 파지미드 벡터에 상기 유전자를 편입시켜 일렉트로포레이션법으로 대장균 TG1에 도입한다. 상기 대장균 TG1에 M13K07 헬퍼 파지를 감염시키고 파지를 회수함으로써 낙타과 단일쇄 항체 가변 영역(VHH영역) 발현 파지 라이브러리를 취득한다. 표준적으로는 1×107pfu종 이상의 라이브러리가 된다.
표적 항원에 대한 항체를 발현하는 파지를 선별하려면 바이오 패닝을 행한다. 이것은 고정화된 표적 항원에 항체 파지 라이브러리를 반응시켜 결합하지 않은 파지를 세정에 의해 제거한 후에, 결합한 파지를 용출하여 대장균에 감염시켜 증식시키는 조작을 3회 내지 5회 행함으로써 표적 항원에 특이적인 파지를 농축하는 방법이다. 패닝한 파지를 대장균 TG1에 재감염시킨 후 VHH 삽입 pCANTAB 파지미드 벡터를 포함한 TG1클론을 단리시키고 개개의 TG1클론에 KO7 헬퍼 파지를 감염시켜 VHH항체를 제시한 클론화 파지를 얻는다. 이들 중에서 항원에 반응하는 클론을 선택한다. 취득한 파지로부터 항체의 염기서열을 얻을 수 있다.
융합 유전자는 발현 가능하도록 상기 발현 카세트 내에 분자 유전학적 방법을 이용하여 삽입된다. 발현 카세트는 필요에 따라 예를 들면 플라스미드 등의 벡터에 편입시킨다. 벡터에 발현 카세트를 편입시키려면 발현 카세트의 5'말단 및 3'말단을 적당한 제한 효소로 절단하여 벡터 내의 멀티 클로닝 사이트 등의 대응하는 제한 부위에 삽입하는 방법 등을 채용할 수 있다. 또 벡터가 본 발명의 재조합 세균 내에서 발현 가능한 발현용 벡터인 경우, 상기 융합 유전자를 그 발현용 벡터의 발현 제어 영역 내(벡터 내의 프로모터 및 터미네이터간의 멀티 클로닝 부위 등)에 삽입함으로써 발현 카세트를 구축함과 동시에 목적의 발현 벡터를 구축하는 것도 가능하다. 이러한 구체적인 방법에 대해서는, 예를 들면 상기 Sambrook et al. (2001)에 기재된 방법을 참조하면 된다.
목적으로 하는 재조합 세균은 상기 발현 벡터, 발현 카세트 또는 융합 유전자를 약제 송달용 담체인 편성 혐기성 그램 양성균에 도입함으로써 제조할 수 있다. 발현 벡터 등을 목적으로 하는 편성 혐기성 그램 양성균 내에 도입하는 방법은 해당 분야에서 공지의 분자생물학적 방법을 이용하면 된다. 예를 들면, 전기 천공법(일렉트로포레이션법)이나 인산칼슘법 등 공지의 방법을 이용할 수 있다. 이러한 구체적인 방법에 대해서는, 예를 들면 상기 Sambrook et al., (2001)에 기재된 방법을 참조하면 된다.
2. 항종양제
2-1. 개요
본 발명의 제2 형태는 항종양제이다. 본 발명에서 「항종양제」란 종양 세포에 대해 세포 상해 활성을 가지고 해당 세포를 아포토시스에 이르게 하여 그 결과, 종양 세포의 증식을 억제할 수 있는 약제를 말한다. 단, 그 약효는 종양 세포의 증식을 억제할 수 있으면 되고 종양 세포를 근절시키지 않아도 된다.
본 발명의 항종양제는 제1 형태의 재조합 세균을 유효 성분으로 하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 항종양제에 따르면 유효 성분인 재조합 세균이 종양 내에서만 증식하고 종양 내에서 이뮤노톡신을 분비함으로써 효율적으로 종양의 증식을 억제하여 종양을 퇴축시킬 수 있다.
2-2. 구성
본 발명의 항종양제는 전술한 바와 같이 제1 형태의 재조합 세균을 유효 성분으로 한다. 이 경우의 재조합 세균은 융합 유전자가 표적 세포인 종양 세포의 표면 항원을 인식하여 결합하는 단일쇄 항체를 코딩하고, 또 기능성 펩티드가 외독소를 코딩하고 있다. 따라서 본 발명의 항종양제의 유효 성분인 재조합 세균은 세포외 분비성 항종양 세포 이뮤노톡신을 분비하게 된다.
일반적으로 종양 세포는 그 세포 표면에 암세포 표면 항원을 발현하고 있다. 예를 들면, 암태아성 항원, 메소테린을 들 수 있다. 융합 유전자에 코딩되는 단일쇄 항체는 이러한 표면 항원을 인식하여 결합하는 것이 바람직하다. 혹은 EGFR(상피 성장 인자 수용체)과 같은 세포의 증식 등을 제어하는 수용체가 기능 항진에 의해 암화(예시한 EGFR의 경우라면, 비소세포 폐암, 전립선암 등)된 경우에는 그 암화의 원인이 된 수용체 등(전술한 예시에서는 EGFR)의 세포외 도메인을 인식하여 결합하는 단일쇄 항체여도 된다. 이와 같이 유효 성분인 재조합 세균은 세포외 분비성 이뮤노톡신을 코딩하는 융합 유전자에서 단일쇄 항체 부분의 염기서열을 교환함으로써 모든 종양 항원에 대응할 수 있게 된다. 본 발명의 항종양제의 표적이 되는 종양은 종양을 형성하는 것이라면 양성, 악성을 불문하고 어느 종양이어도 좋다. 예를 들면 뇌종양, 갑상선암, 구강암, 식도암, 위암, 대장암, 인두암, 폐암, 간암, 신장암, 부신암, 췌장암, 담관암, 자궁경암, 자궁체암, 난소암, 유방암, 전립선암, 방광암, 선유육종, 비만세포종 또는 멜라노마를 표적 종양으로서 들 수 있다.
본 발명의 재조합 세균이 융합 유전자를 발현한 경우, 그 산물인 세포외 분비성 항종양 세포 이뮤노톡신은 세포 외에 분비된다. 분비된 그 이뮤노톡신은 단일쇄 항체 부분에서 표적 물질인 종양 세포에 결합하고, 그 세포는 외독소 부분의 세포 상해 활성에 의해 아포토시스가 유도된다.
본 발명의 유효 성분인 재조합 세균은 항종양제에서 생균 상태로 포함된다. 본 발명의 제1 형태에 기재된 재조합 세균은 고농도의 산소 존재하에서는 증식하지 못하고 곧 사멸한다. 따라서 생체 내에서는 산소 분압이 낮은 부위에서만 증식, 생존이 가능하다. 그러한 부위의 대표적인 예로서 진행암으로 보여지는 종양(고형암)의 중심 부위 또는 장관 내를 들 수 있다. 그러므로 본 발명의 항종양제는 주사 등에 의해 체내 투여한 경우 종양 선택적 송달성이 높은 항종양제가 될 수 있다.
또 본 발명의 항종양제는 유효 성분인 재조합 세균의 생존, 증식, 이뮤노톡신의 발현 및 분비를 저해 또는 억제하지 않는 범위에서 다른 항종양제와 병용할 수 있다.
본 발명의 항종양제는 재조합 세균을 생균 상태로 유지 또는 보존하는 것을 전제로 하여 원칙적으로 해당 분야에서 공지의 방법으로 제제화할 수 있다. 예를 들면 Remington＇s Pharmaceutical Sciences(Merck Publishing Co., Easton, Pa.)에 기재된 방법을 이용하면 된다. 구체적인 제제화 방법은 투여 방법에 따라 다르다. 투여 방법은 크게 경구 투여와 비경구 투여로 구분되는데, 본 발명의 항종양제의 경우 비경구 투여가 더욱 바람직하다.
본 발명의 항종양제를 비경구 투여할 경우 그 구체예로서는 주사에 의한 투여를 들 수 있다. 본 발명의 항종양제를 주사로 투여할 경우 재조합 세균을 제약상 허용 가능한 용매와 혼합하고 필요에 따라 제약상 허용 가능한 담체를 더한 현탁액제로서 조제할 수 있다.
「제약상 허용 가능한 용매」는 물 혹은 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 수용액 또는 유성액 중 어느 것이어도 된다. 수용액으로서는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조제를 포함한 등장액을 들 수 있다. 보조제로서는, 예를 들면 D-솔비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨, 그 외에도 저농도의 비이온성 계면활성제(예를 들면, 폴리솔베이트80(TM), HCO-60), 폴리옥시에틸렌솔비탄지방산 에스테르류 등을 들 수 있다. 유성액으로서는 참기름, 콩기름을 들 수 있으며, 용해 보조제로서 벤조산벤질, 벤질알코올과 병용할 수도 있다. 또 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 아세트산나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면 염산프로카인, 안정제, 예를 들면 벤질알코올, 페놀, 산화방지제와 배합해도 된다.
주사제에는 제약상 허용되는 부형제, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, pH조절제 등과 적절히 조합하여 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화함으로써 제재화하면 된다.
주사는, 예를 들면 혈관내 주사, 임파관내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등을 들 수 있는데, 본 발명의 항종양제의 유효 성분인 재조합 세균이 종양 내에서 증식하여 그 종양 세포의 증식을 억제한다는 메커니즘으로 인해 종양소(巢)의 위치가 명확하지 않은 경우에는 전신 투여인 혈관내 주사 또는 임파관내 주사 등의 순환기내 투여가 바람직하다. 혈관내 주사에는 정맥내 주사 및 동맥내 주사 등이 있는데, 본 발명의 항종양제를 투여할 경우 어느 것이어도 된다. 한편 종양소의 위치가 확정되어 있는 경우에는 상기 전신 투여 외에 종양에 직접적으로 투여하는 국소 투여여도 된다.
본 발명의 항종양제를 경구 투여하는 경우에 대해서는 후술하는 경구 백신제의 항에 기재된 방법에 준하면 되므로 여기에서는 그 설명을 생략하기로 한다.
본 발명의 항종양제에서의 재조합 세균의 함유량은 원칙 1회의 투여로 그 균체가 표적의 종양에 생존하면서 증식 가능한 상태에 도달할 수 있는 양이며, 또한 그것을 적용하는 피검체에 대해 유해한 부작용을 거의 또는 전혀 부여하지 않는 양이면 된다. 이러한 함유량은 항종양제의 표적 세포의 종류, 암의 진행도, 종양의 크기, 전신의 종양소수, 항종양제의 제형 및 투여 방법에 따라 다르기 때문에 각각의 조건을 감안하여 적절히 정할 수 있다.
본 명세서의 항종양제의 투여 대상은, 종양을 가진 또는 가질 개연성이 높은 피검체이다. 본 명세서에서 「피검체」란 본 발명의 항종양제를 적용하는 동물을 말한다. 예를 들면 포유동물, 바람직하게는 인간, 개, 고양이, 말, 마우스, 래트, 토끼, 소, 원숭이 등, 보다 바람직하게는 인간이다.
2-3. 효과
본 발명의 항종양제에 따르면 유효 성분인 재조합 세균이 산소 분압이 낮은 종양 내에서만 생존 및 증식하여 항종양 세포 이뮤노톡신을 분비한다. 그로 인해 해당 이뮤노톡신을 종양 세포에까지 효율적으로 전달하고 또한 계속적으로 작용시킬 수 있다. 또 이뮤노톡신의 작용에 의해 종양 세포의 증식이 억제되어 종양이 퇴축함으로써 조직 중의 산소 분압이 높아지면 편성 혐기성 그램 양성균인 재조합 세균은 생존 불가능해지므로 생체 내로부터 자동적으로 배제할 수 있다. 이로써 종래의 세균 요법에 비교하여 고형암에 대해 비병원성인 편성 혐기성균으로 다른 항종양약을 투여하지 않고 단독의 정맥 내 투여에 의해 항종양 효과를 발휘할 수 있는 안전하면서 간편한 치료법을 제공할 수 있다.
또 본 발명의 항종양제는 정맥내 주사가 가능하기 때문에 피검체에 부여하는 침습성도 낮다는 이점을 가진다.
3. 종양 검출용 마커
3-1. 개요
본 발명의 제3 형태는 종양 검출용 마커이다. 본 발명에서 「종양 검출용 마커」란 생체 내에서 종양을 검출할 수 있는 마커이다.
본 발명의 종양 검출용 마커는 제1 형태의 재조합 세균을 유효 성분으로 하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 종양 검출용 마커에 의하면, 유효 성분인 재조합 세균이 종양 내에서만 증식하고 종양 내에서 효소, 형광 단백질 또는 발광 단백질을 분비함으로써 생체 내에서의 종양의 위치나 크기를 모니터링할 수 있다.
3-2. 구성
기본적인 구성은 제2 형태의 항종양제에 준한다. 그래서 여기에서는 주로 상기 항종양제와 다른 점에 대해 설명하고, 중복되는 구성에 대해서는 원칙적으로 생략하기로 한다.
본 발명의 종양 검출용 마커는 전술한 바와 같이 제1 형태의 재조합 세균을 유효 성분으로 한다. 이 경우의 재조합 세균은 융합 유전자가 표적 세포인 종양 세포의 표면 항원을 인식하여 결합하는 단일쇄 항체를 코딩하고, 기능성 펩티드가 표지 단백질 또는 표지화를 유도하는 단백질을 코딩한다. 표지 단백질로서는, 예를 들면 전술한 형광 단백질 또는 발광 단백질을 들 수 있다. 또 표지화를 유도하는 단백질로서는 루시페린이나 루미놀과 같은 발광소 또는 형광소를 기질(基質)로 한 효소(루시페라아제나 퍼옥시다아제)를 들 수 있다. 따라서 본 발명의 종양 검출용 마커의 유효 성분인 재조합 세균은 세포외 분비성 항종양 세포 이뮤노마커(면역 표지자)를 분비하게 된다.
본 발명의 재조합 세균이 융합 유전자를 발현한 경우 그 산물인 세포외 분비성 항종양 세포 이뮤노마커는 세포 외로 분비된다. 분비된 이뮤노마커는 단일쇄 항체 부분에서 표적 물질인 종양 세포에 결합하고 그 세포는 표지화된다. 구체적으로는 기능성 펩티드가 발광 단백질 또는 형광 단백질과 같은 표지 단백질인 경우 단일쇄 항체 부분과 연결된 그들 표지 단백질에 의해 종양 세포가 직접 표지화되게 된다. 한편 기능성 펩티드가 효소인 경우, 쇄항체 부분과 연결된 효소에 의해 종양 세포가 효소 표지된다.
본 발명의 종양 검출용 마커는 제2 형태의 항종양제와 병용할 수 있다. 이 경우 유효 성분인 재조합 세균이 종양 검출용 마커와 항종양제를 각각 독립된 분자로서 분비하는, 즉 동일 표적 물질을 인식하는 단일쇄 항체를 포함한 다른 융합 단백질을 분비하는 동일한 또는 다른 재조합 세균이어도 되고, 기능성 단백질 부분에 외독소와 표지 단백질 또는 효소를 포함한 1개의 융합 단백질을 분비하는 재조합 세균이어도 된다. 이러한 경우 동일한 종양 세포를 표지화함과 동시에 외독소의 작용에 의해 종양 세포에 세포 상해를 부여하는 것이 가능하게 된다.
또 유효 성분인 재조합 세균의 생존, 증식, 이뮤노마커의 발현 및 분비를 저해 또는 억제하지 않는 범위에서 다른 항종양제와 병용할 수도 있다.
3-3. 검출
본 발명의 종양 검출용 마커를 피검체에 투여한 경우, 그 개체가 종양을 가지고 있으면, 유효 성분인 재조합 세균이 그 종양 내에서 증식하여 항종양 세포 이뮤노마커가 분비된다. 분비된 이뮤노마커는 종양 세포를 표지화한다. 표지화된 종양 세포의 검출은 이뮤노마커가 발광 단백질 또는 형광 단백질과 같은 표지 단백질인 경우에는 그 표지 단백질 자신이 발하는 발광 또는 형광을, 또 효소 표지인 경우에는 생체 내에 투여된 루시페린 등 기질의 효소 반응에 의한 발광 또는 형광을 검출하면 된다. 이뮤노마커의 검출 방법은 특별히 한정되지는 않는다. 종양의 상당수는 생체 내부에 존재하기 때문에 개복 등의 수술에 의해 종양을 노출시킨 후 이뮤노마커를 검출해도 되고, 생체 내의 발광 또는 형광을 체외로부터 비침습적으로 검출해도 된다. 바람직하게는 체외로부터 검출하는 방법이다. 이뮤노마커 유래의 발광 또는 형광을 체외로부터 검출하는 방법으로서는 한정은 하지 않지만, 예를 들면 in vivo 바이오이미징법을 이용할 수 있다. 예를 들면 Katz, M.H. et al., 2003, Cancer Res. 63: 5521-5525, Schmitt, C.A. et al., 2002, Cancer Cell, 1: 289-298, Katz, M.H. et al., 2003, J. Surg. Res., 113: 151-160 등에 기재된 방법을 이용하여 검출할 수 있다. 시판되는 IVIS Imaging System(Caliper)이나 그와 유사한 장치에 의해 검출해도 된다.
3-4. 효과
본 발명의 종양 검출용 마커에 의하면 생체 내 종양의 위치 및 크기를 이뮤노마커에 기초하여 생체 외부로부터 모니터링할 수 있다. 또 본 발명의 종양 검출용 마커와 제2 형태의 항종양제를 병용함으로써 이뮤노톡신에 의해 종양 세포의 증식을 억제시킴과 동시에 이뮤노마커에 의해 생체 내 종양을 생체 외부로부터 검출함으로써 종양의 축퇴(縮退)나 치유 효과를 경시적으로 모니터링하는 것이 가능하게 된다.
4. 경구 백신제
4-1. 개요
본 발명의 제4 형태는 경구 백신제이다. 본 발명에서 「경구 백신제」란 경구 투여함으로써 그 투여 개체의 장관 면역 응답을 유도할 수 있는 백신제를 말한다.
본 발명의 경구 백신제는 제 1 형태의 재조합 세균을 유효 성분으로 하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 경구 백신제에 따르면 유효 성분인 재조합 세균이 소화기관내, 특히 장내에서 증식하여 세포외 분비성 항원 펩티드(이뮤노안티겐)를 분비함으로써 장관 점막을 사이에 두고 투여 개체에 항원 펩티드에 대한 면역 응답을 유도시킬 수 있다.
4-2. 구성
기본적인 구성은 제2 형태의 항종양제에 준한다. 그래서 여기에서는 주로 상기 항종양제와 다른 점에 대해 설명하고 중복되는 구성에 대해서는 원칙적으로 생략하기로 한다.
본 발명의 경구 백신제는 제 2 형태의 항종양제와 마찬가지로 제1 형태의 재조합 세균을 유효 성분으로 한다. 단, 제 2 형태의 항종양제와 달리 이 경우의 재조합 세균은 융합 유전자가 코딩하는 단일쇄 항체가 장관 상피 세포 등의 표면 항원, 또는 배상 세포로부터 분비되는 뮤틴 등을 인식하여 결합하는 점, 및 기능성 펩티드가 항원 펩티드를 코딩하고 있는 점에서 다르다. 상기 장관 상피 세포는 M세포, Paneth 세포, 배상 세포, 흡수 상피 세포, 장관 내분비 세포 중 어느 것이어도 된다. 바람직하게는 로포(爐胞) 피복 상피(FAE; follicle-associated epithelium)에 존재하는 M세포이다. 항원 펩티드는, 제1 형태에 기재된 것처럼 1개 이상의 에피토프를 가지고 또한 투여하는 개체에 면역 응답 유도해야 할 다양한 펩티드이다.
본 발명의 재조합 세균이 소화기관내에서 융합 유전자를 발현한 경우, 그 산물인 이뮤노안티겐이 장관 상피 세포 또는 장점막에 결합하여 장관 면역 응답을 유도할 수 있다.
본 발명의 경구 백신제는 경구 투여에 의해 투여 개체에 대해 면역 응답을 유도하는 것을 특징으로 한다. 따라서 본 발명의 경구 백신제는 경구 투여제이다.
본 발명의 경구 백신제는 유효 성분인 재조합 세균에 추가하여 제약상 허용 가능한 담체를 첨가해도 된다.
「제약상 허용 가능한 담체」란 약제의 제재화나 생체에 대한 적용을 용이하게 하고 또 유효 성분인 재조합 세균의 생존을 유지하기 위해 그 균체의 작용을 저해 또는 억제하지 않는 범위에서 첨가되는 물질을 말한다. 예를 들면 부형제, 결합제, 붕괴제, 충전제, 유화제, 유동 첨가 조절제 또는 윤활택제를 들 수 있다.
「부형제」로서는, 예를 들면 단당, 이당류, 시클로덱스트린 및 다당류와 같은 당(구체적으로는 한정하지 않지만, 글루코오스, 수크로오스, 락토스, 라피노스, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 덱스트린, 말토덱스트린, 전분 및 셀룰로오스를 포함한다), 금속염(예를 들면, 인산나트륨 혹은 인산칼슘, 황산칼슘, 황산마그네슘), 구연산, 주석산, 글리신, 저, 중, 고분자량의 폴리에틸렌글리콜(PEG), 플루로닉 혹은 그들의 조합을 들 수 있다.
「결합제」로서는, 예를 들면 옥수수, 밀, 쌀 혹은 감자의 전분을 이용한 전분풀, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨 및/또는 폴리비닐피롤리돈 등을 들 수 있다.
「붕괴제」로서는, 예를 들면 상기 전분이나 카르복시메틸전분, 가교 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 혹은 알긴산나트륨 또는 그들의 염을 들 수 있다.
「충전제」로서는, 예를 들면 상기 당 및/또는 인산칼슘(예를 들면, 인산삼칼슘 혹은 인산수소칼슘)을 들 수 있다.
「유화제」로서는, 예를 들면 소르비탄 지방산 에스테르, 글리세린 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르, 프로필렌글리콜 지방산 에스테르를 들 수 있다.
「유동 첨가 조절제」 및 「활택제」로서는, 예를 들면 규산염, 탈크, 스테아린산염 또는 폴리에틸렌글리콜을 들 수 있다.
기타 필요에 따라 교미교취제, 현탁제, 희석제, 계면활성제, 증량제, 부습제, 보습제(예를 들면, 글리세린, 전분 등), 흡착제(예를 들면, 전분, 유당, 카올린, 벤토나이트, 콜로이드형 규산 등), 붕괴 억제제(예를 들면, 백설탕, 스테아린, 카카오 버터, 수소 첨가유 등), 코팅제, 착색제, 보존제, 항산화제, 향료, 풍미제, 감미제, 완충제 등을 포함할 수도 있다. 상기와 같은 담체를 1 또는 2 이상, 필요에 따라 적절히 사용하면 된다.
경구 백신제의 제형으로서는, 예를 들면 고형제(정제, 환제, 설하제(舌下劑), 캅셀제, 드롭제를 포함한다), 과립제, 분제, 산제, 액제 등을 들 수 있다. 나아가 고형제는 필요에 따라 해당 분야에서 공지의 제피(劑皮)를 입힌 제형, 예를 들면, 당의정, 젤라틴 피포정, 장용정(腸溶錠), 필름 코팅정, 이중정, 다층정으로 할 수 있다. 제형의 구체적인 형상, 크기에 대해서는 모두 각각의 제형에서 해당 분야에서 공지의 제형 범위 내에 있으면 되고 특별히 한정하지는 않는다.
4-3. 효과
본 발명의 경구 백신제에 따르면, 종래 주사 등에 의해 생체에 투여한 백신제를 비침습적으로 경구로 투여할 수 있다.
본 발명의 경구 백신제에 따르면, 유효 성분인 재조합 세균이 장관 내에서 지속적으로 생존 및 증식 가능하기 때문에 백신으로서의 이뮤노안티겐을 계속적으로 투여 개체에 부여하는 것이 가능하게 된다.
＜실시예 1: 발현 카세트의 구축＞
이하에서 편성 혐기성 그램 양성균으로서 본 실시예에서 사용하는 비피더스균 도입용 발현 카세트의 구조 및 그 구축 방법에 대해 설명하기로 한다.
(1) 항EGFR 항체/녹농균 외독소A 융합 단백질 발현 카세트(이하, 「8C7 독소(toxin)」라고 한다) (도 1a; 서열번호 1/아미노산 서열: 서열번호 16)
본 발명의 제1 형태에 기재된 구조를 가진 융합 유전자를 포함한 융합 단백질 발현 카세트이다. 해당 발현 카세트는 HindⅢ 절단 부위, B.롱검 hup 유전자 유래의 프로모터 영역(서열번호 4), B.롱검 유래의 usp 분비 시그널 서열(서열번호 5), DTY (시그널 서열 후 삽입 서열), 링커 펩티드 (GGSGG)2 코드 서열(서열번호 6)로 연결한 2개의 항EGFR 라마 단일쇄 항체 코드 서열(PMP8C7; 서열번호 7 및 8; 일본특개2008-534933, 일본특표2009-511032), 외독소로서의 세포 접착에 관여하는 도메인을 제거한 녹농균 외독소A 코드 서열(서열번호 9; Brinkmann U., et al., 1994, Biochimica et Biophysica Acta, 1198: 27-45), 종지 코돈, SpeI 부위, 히스톤형 단백질 유래의 터미네이터(HUT) (서열번호 10), 그리고 NotI 절단 부위의 순서대로 연결된 융합 유전자를 디자인하고 DNA 합성을 하여 제작했다. 그 후 pBluescript 플라스미드(life technologies) 중에 클로닝하여 DNA 서열을 확인했다.
(2) 항EGFR 항체/EGFP 융합 단백질 발현 카세트(이하, 「8C7 EGFP」라고 한다)(도 1b; 서열번호 2)
　본 발현 카세트는 외독소 대신에 형광 단백질 EGFP를 연결한 대조 및 국 재성 검출용 발현 카세트이다. 해당 발현 카세트는 HindⅢ 절단 부위로부터 2개의 항EGFR 알파카 단일쇄 항체까지는 상기 8C7 독소와 같은 구조를 가지고, 그에 이어서 다시 링커 펩티드(GGSGG)2 코드 서열, EGFP(Zhang G., et al., 1996, Biochem Biophys Res Commun, 227(3): 707-11), 종지 코돈, SpeI 절단 부위, HUT, His-Tag 서열, 그리고 NotI 절단 부위의 순서대로 연결된 유전자를 디자인하고 DNA 합성을 행하여 제작했다. 그 후 pBluescript 플라스미드에 클로닝하여 DNA 서열을 확인했다.
(3) 녹농균 외독소A 단백질 발현 카세트(이하, 「독소 대조군(Toxin control)」이라고 한다)(도 1c; 서열번호 3)
본 발현 카세트는 단일쇄 항체 부분을 포함하지 않는 외독소만으로 이루어진 대조용 발현 카세트이다. 해당 발현 카세트는, 8C7 독소으로부터 링커 펩티드를 포함한 2개의 항EGFR 라마 단일쇄 항체 코드 서열을 제거하고, 세포 접착 도메인을 제외한 녹농균 외독소A 코드 서열(서열번호 9)의 C말단에 His-Tag서열을 부가한 구조를 가지고 있으며 DNA 합성을 하여 제작했다. 그 후 pBluescript 플라스미드에 클로닝하여 DNA 서열을 확인했다.
＜실시예 2: 융합 단백질 8C7 독소의 세포 증식 저해 활성＞
본 실시예에서는 실시예 1에 기재된 8C7 독소등의 융합 단백질을 발현하는 재조합 E. coli BL21(DE3)의 조제와 그 융합 단백질의 세포 증식 저해 활성에 대해 검증했다.
(1) 대장균 발현용 Ec-8C7 독소, Ec-독소 대조군 및 Ec-8C7 EGFP의 발현 벡터의 구축
대장균 발현용 Ec-8C7 독소 발현 카세트는 pBluescript 플라스미드에 삽입된 8C7 독소를 주형으로 하고 서열번호 11 및 12의 primer 세트를 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR의 조건은 DNA 폴리메라아제로서 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(다카라 바이오, 오츠시, 일본)를 이용하여 95℃ 1분을 1사이클, 98℃ 10초, 60℃ 15초, 68℃ 2분을 25사이클로 실시했다. 증폭 산물은 MinElute 칼럼(Qiagen사)을 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 정제하고 NdeI 및 NotI에서 제한 효소 소화 후 1.2% 아가로스로 전기 영동을 하고, 겔로부터 목적으로 하는 밴드를 잘라내어 DNA겔 추출 키트(Qiagen사)를 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 정제 단리시켰다. 이것을 pET-22b(+)(Novagen사)의 멀티클로닝 사이트(MCS)의 대응하는 제한 부위에 삽입하고 Strep Tag(Schmidt T.G., Skerra A., 2007, Nat Protoc. 2(6): 1528-35), (GGSGG)2 링커 펩티드로 연결한 2개의 PMP8C7, 세포 접착에 관여하는 도메인을 제거한 녹농균 외독소A의 서열, His Tag를 가진 Ec-8C7 독소를 구축했다(도 1d).
대장균 발현용 Ec-8C7 EGFP 발현 카세트는 pBluescript 플라스미드에 삽입된 항EGFR 항체/EGFP 융합 단백질 발현 카세트를 주형으로 하고 서열번호 13 및 14의 primer 세트를 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR의 조건은 상기와 동일하게 했다. 증폭 산물은 MinElute 칼럼을 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 정제하고 NdeI 및 NotI에서 제한 효소 소화 후 1.2% 아가로스로 전기 영동을 하고, 목적으로 하는 밴드를 겔에서 잘라내어 DNA 겔 추출 키트를 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 정제 단리시켰다. 이것을 pET-22b(+)의 MCS의 대응하는 제한 부위에 삽입하여 Strep Tag, (GGSGG)2 링커 펩티드로 연결한 2개의 PMP8C7, (GGSGG)2 링커 펩티드, 녹색 형광 단백질(EGFP), His Tag를 가진 Ec-8C7 EGFP를 구축했다(도 1e).
대장균 발현용 Ec-독소 대조군 발현 카세트는 pBluescript 플라스미드에 삽입된 독소 대조군 발현 카세트를 주형으로 하고 서열번호 15 및 12의 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR의 조건은 상기와 동일하게 했다. 증폭 산물은 MinElute 칼럼을 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 정제시키고 NdeI 및 NotI에서 제한 효소 소화 후 1.5% 아가로스로 전기 영동을 하고, 목적으로 하는 밴드를 겔로부터 잘라내어 DNA 겔 추출 키트를 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 정제 단리시켰다. 이것을 pET-22b(+)의 MCS의 대응하는 제한 부위에 삽입하여 Strep Tag, 세포 접착에 관여하는 도메인을 제거한 녹농균 외독소A의 서열, His Tag를 가진 Ec-독소 대조군을 구축했다(도 1f).
(2) Ec-8C7 독소, Ec-독소 대조군 및 Ec-8C7 EGFP의 발현 및 정제
상기 (1)에서 구축한 각 발현 카세트를 포함한 pET-22b(+) 플라스미드 DNA를, E. coli BL21(DE3) 콤피턴트셀(Novage사) 또는 BL21StarTM(DE3) One Shot 콤피턴트셀(Invitrogen사)에 첨부한 프로토콜에 따라 도입했다. 각 형질 전환체로부터의 재조합 단백질의 발현은 이하의 조건으로 행했다. E.coli BL21(DE3) 형질 전환체 클론을 2YTA 배지(100㎍/mL의 ampicilliN을 포함한 2YT배지)에서 37℃에서 배양하고 OD600=0.5∼0.6에 도달한 시점에서 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, 다카라 바이오사)를 종(終)농도 1mM(BL21(DE3) StarTM주에서는 0.5mM)가 되도록 배지에 가하여 30℃에서 3시간 배양했다. 집균 후 100mL 배양액당 10mL의 추출 버퍼(50mM NaPhosphate pH7.8, 300mM NaCl, EDTA-Free protease inhibitor cockatail(Roche사))에 재현탁하고 얼음 중에서 Sonifier 250(Branson사)을 이용하여 Output Control 2, Duty cycle 50%의 조건에서 초음파 처리하고 균체를 파쇄했다. 처리 후의 현탁액을 15000rpm으로 4℃에서 15분 원심하여 상청액을 회수했다. 융합 단백질의 정제는 HisTrap 칼럼(GE Healthcare UK, Buckinghamshire, England)을 이용했다. 초음파 처리 현탁액의 원심 상청액을 그대로 HisTrap 칼럼에 걸고 결합 버퍼(20mM NaPhosphate, 0.5M NaCl, 20mM Imidazole pH7.4)로 칼럼을 세정한 후 500mM Imidazole을 포함한 용출액으로 융합 단백질을 용출시켰다.
정제의 결과를 모든 융합 단백질의 C말단에 위치한 His 태그에 대한 항HisTag 항체를 이용한 웨스턴 블로팅으로 검출하여 확인했다. 그 결과, 각각 예상되는 위치에 밴드가 검출되었다(데이터 미도시). 또 융합 단백질이 완전한 길이(完全長, full-length)이라는 것을 재조합 단백질의 N말단의 Strep Tag에 결합하는 스트렙타쿠틴 HRP(Bio-rad사)를 이용하여 막을 세정 후 화학 발광 시약 LuminataTM Forte를 가하고 ImageQuantLAS4000(후지필름/GE)를 사용하여 검출했다. 결과를 도 2에 도시한다. 이러한 결과로부터 완전한 길이의 Ec-8C7 독소, Ec-8C7 EGFP, Ec-독소 대조군을 정제할 수 있다는 것이 확인되었다. 얻어진 융합 단백질은 10% 글리세린을 첨가하여 4℃에서 보존했다.
(3) Ec-8C7 독소의 세포 증식 저해 활성
EGFR을 과잉 발현하는 A431세포(인간 피부암 유래 세포, 이화학 연구소 바이오 리소스 센터, 쓰쿠바시, 일본에서 입수), EGFR의 발현량이 적은 BxPC-3세포(인간 췌장암 유래 세포, ATCC, Manassas, US에서 입수)(Folia Pharmacol. Jpn. 2011, 137; 31-41), 및 HT-29 세포(인간 결장암 유래 세포, ATCC, Manassas, USA에서 입수)에 대한 각 융합 단백질의 증식 억제 작용을 검토했다. Falcon 96 웰 배양 플레이트(벡톤 디킨슨사)에 2.5×104cells/50μL 배지(0.2% 소(牛) 태아 혈청(Tissue Culture Biologicals, Tulare, USA)를 포함한 DMEM 배지)/well에서 세포를 가하여 3시간 배양 후, 상기 (2)에서 정제한 Ec-8C7 독소, Ec-8C7 EGFP, Ec-독소 대조군을 400, 200, 100, 50 및 25ng/mL로 포함한 배지를 50μL씩 첨가했다. 상기 3종의 세포주는 0.2% 소 태아 혈청을 포함한 DMEM 배지에서 3일간 배양하는 조건에서는 세포는 죽지 않지만 거의 증식하지 않는다. Ec-8C7 독소, Ec-8C7 EGFP, Ec-독소 대조군은 HisTrap 칼럼(GE Healthcare NJ, USA)에서 정제한 샘플을 사용했기 때문에 배지에 첨가시에 혼입되는 버퍼 성분을 고려하여 버퍼 컨트롤을 두었다. 배양 3일째에 10μL의 MTT시약(나카라이테스크사)을 더했다. 나아가 2시간 배양 후에 100μL/wel로 가용화액을 더하고 피펫팅으로 세포를 용해하여 OD570㎚의 흡광도를 측정했다. 세포 무첨가 배지의 웰의 측정값을 백그라운드값으로 하여 전측정값에서 감하였다. 각 희석의 버퍼 컨트롤의 웰을 100%로 하여 그 상대값으로 표시했다. 앗세이는 듀브리케이트에서 행하여 2웰의 평균값을 취했다.
결과를 도 3에 도시한다. 도 3a는 A431세포의, 도 3b는 BxPC-3 세포의, 도 3c는 HT-29 세포의 결과이다. 도 3a에 도시한 것처럼 Ec-8C7 독소는 A431세포에 대해 농도 의존의 증식 저해 활성이 검출되며, IC50은 0.68nmol/L(47.5ng/mL)이었다. 한편, 음성 대조인 Ec-독소 대조군에서는 증식 저해 활성이 검출되지 않았다. 따라서 Ec-8C7 독소의 표적 세포 특이적인 세포 증식 저해 활성이 입증되었다. 이 결과는 Ec-8C7 독소가 항EGFR 항체 부분에서 EGFR에 결합되며 EGFR 내재화(McClintock J.L. & Ceresa B.P., 2010, Invest Ophthalmol Vis Sci. 51(7) 3455-3461)가 발생하여 세포 내에 수용되고, 그 후 외독소 부분이 세포질 내에 트랜스 로케이션되고 EF-2를 ADP 리보실화하여 불활성화함으로써 A431세포의 단백질 합성이 저해된 것을 시사하고 있다. 또 음성 대조인 Ec-8C7 EGFP에서 세포 증식 저해 활성이 검출되지 않은 것은 Ec-8C7 EGFP가 항EGFR 항체 부분에서 EGFR에 결합해도 외독소 부분이 없기 때문에 EGFR의 시그널 전달을 저해할 수 없어 세포 증식에 영향을 미치지 않는다는 것이 시사되었다. 한편 도 3b에 도시한 바와 같이 EGFR의 발현량이 적은 BxPC-3세포에 대해 Ec-8C7 독소는 약한 증식 저해 활성(200ng/mL의 8C7 독소에서 약 40% 저해 활성) 밖에 검출되지 않았으며 또 도 3c에 도시한 바와 같이 HT-29세포에 대한 Ec-8C7 독소의 증식 저해 활성은 검출되지 않았다.
＜실시예 3: 8C7 EGFP의 종양 세포와의 결합 및 EGFR ECD와의 해리 정수의 측정＞
본 실시예에서는 실시예 2에 기재된 Ec-8C7 EGFP와 EGFR을 발현하는 생(生)세포와의 결합을 검토했다.
(1) Ec-8C7 EGFP의 종양 세포와의 결합
팔콘24 웰 플레이트(벡톤 디킨슨사)에 2.5×105cells/0.5mL 배지(0.2% 소 태아 혈청을 포함한 DMEM 배지)/well에 EGFR의 과잉 발현주 A431세포 및 저발현주 HT-29세포를 각각 파종하고 다음날 실시예 2에서 정제한 Ec-8C7 EGFP를 10㎍/mL 함유한 0.2% 소 태아 혈청을 포함한 DMEM 배지로 교환했다. 2시간 배양 후 상기 배지를 제거하고 PBS(Mg2 +, Ca2 + 프리 인산 완충 생리식염수)로 2회 세정하고 0.5mL/well에서 PBS를 더하여 형광 현미경(ECLIPS Ti, Nikon)으로 관찰했다. HisTrap 칼럼에서 정제한 Ec-8C7 EGFP를 사용했기 때문에 배지에 첨가시에 혼입되는 버퍼 성분을 고려하여 버퍼 컨트롤을 두었다.
결과를 도 4a 및 4b에 도시한다. 도 4a에서는 A431세포의 표면에 Ec-8C7 EGFP의 형광이 검출되어 Ec-8C7 EGFP와 A431세포의 결합을 검출할 수 있었다. 또 일부 세포에서는 EGFR의 내재화가 확인되었다. 한편 도 4b의 HT-29세포에서는 Ec-8C7 EGFP의 형광은 검출되지 않아 Ec-8C7 EGFP가 HT-29 세포와 결합하지 않는다는 것이 분명해졌다.
(2) Ec-8C7 EGFP의 EGFR 내재화의 검출
A431세포를 이용하여 EGFR 내재화를 경시적으로 관찰했다. A431세포를 1×106cells/2mL 배지(10% 소 태아 혈청을 포함한 DMEM 배지) /35㎜ Φdish에서 3매의 dish에 파종하고 1일 배양 후 10㎍/mL의 Ec-8C7 EGFP를 포함한 배지(10% 소 태아 혈청을 포함한 DMEM 배지)로 교환하여 1매는 4℃에서 1시간, 1매는 37℃에서 2시간, 또 1매는 37℃에서 4시간 인큐베이팅했다. 각각 2mL의 PBS/dish에서 2회 세정하고 형광 현미경으로 관찰했다.
결과를 도 4c에 도시한다. 37℃의 조건하에서는 대부분의 세포에서 EGFR 내재화를 관찰할 수 있었다.
(3) Ec-8C7 EGFP와 EGFR 세포외 도메인(ECD; extracellular domain)과의 해리 정수(KD)의 측정
Ec-8C7 EGFP와 재조합 인간 EGFR ECD(Sino Biological, Beijing, China)와의 결합 친화성을 Biacore 3000(GE Healthcare, NJ, USA)을 이용한 표면 플라즈몬 공명법으로 해석했다. 측정 수법은 싱글 사이클 카이네틱스법(Analytical Biochemistry Volume 349, Issue 1, 1 February 2006, Pages 136-147)으로 행하고 Ec-8C7 EGFP를 1.56nM(1회째), 3.13nM(2회째), 6.25nM(3번째), 12.5nM(4번째), 25nM(5번째)의 순서대로 연속 첨가하여 측정했다.
결과를 도 5에 도시한다. Ec-8C7 EGFP와 재조합 인간 EGFR ECD의 KD값은 11㎚였다.
＜실시예 4: 재조합 비피더스균의 종양 축적성과 마우스에 미치는 영향＞
누드 마우스 등부에 A431세포를 이식하여 고형암을 형성시킨 Xenograft 모델에서 8C7 독소를 발현하고, 분비되는 재조합 비피더스균을 정맥 내에 투여했을 때의 그 재조합 비피더스균의 종양 축적성과 마우스에 미치는 영향을 검증했다.
(1) 8C7 독소의 발현용 벡터 및 8C7 독소를 발현하는 재조합 비피더스균의 구축
벡터는 pTB6(Tanaka K, et al., 2005, Biosci Biotechnol Biochem. 69(2):422-425)의 레프리콘을 포함한 비피더스균과 대장균과의 셔틀 벡터 pKKT427(도 6; Yasui K, et al., 2009, Nucleic Acids Res., 37(1): e3)을 사용했다. pKKT427의 MCS(멀티 클로닝 사이트)에서의 HindⅢ와 NotI 사이에 비피더스균용 발현 카세트(도 1a)를 삽입했다. 구축한 발현 벡터를 비피더스균 B.롱검 105-A(원(元)교토 약과대학, 가노 야스노부 교수로부터 공여)에 일렉트로포레이션법을 이용하여 도입했다. 일렉트로포레이션의 조건은 2.4㎸/cm, 25μF, 200Ω 조건으로 행했다. 얻어진 재조합 비피더스균을 생리식염수에 재현탁하여 누드 마우스 투여액을 조제했다.
(2) 재조합 비피더스균의 종양 축적성
6주령 암컷의 KSN/Slc 누드 마우스(일본 에스엘시, 하마마츠, 일본)에 2×106의 A431세포를 피하 이식하고 고형암이 형성된 2주 후에 상기 (1)에서 조제한 재조합 비피더스균을 1.5×109개로 정맥 내에 투여했다. 음성 대조에는 재조합 비피더스균을 정맥 내에 투여하지 않은 누드 마우스를 사용했다. 체내의 재조합 비피더스균의 영양 보조를 위해 모든 마우스에 매일 1mL의 20% 락툴로오스(와코순약, 오사카, 일본)를 복강 내에 투여했다. 투여 후 1주 후에 마우스로부터 종양(n=5, 평균값 277.2㎣), 및 대조로서 혈액 및 비장을 회수하고, 혈액은 직접, 종양과 비장은 MRS 배지(Lactobacilli MRS Broth (Difco Laboratories, Detroit, MI), 50mM 자당, 3.4mg/mL L-아스코르빈산나트륨염, 및 0.2mg/mL L-시스테인염산염) 중에서 균질화한 후 100㎍/mL 스펙티노마이신을 포함한 MRS 한천 배지(상기 MRS 액체 배지에 1.5%의 Bacto Agar(Difco Laboratories)를 첨가하여 조제)에 도포하고 용기 또는 부대 안에 탈산소제인 아네로팩 켄키(미쓰비시 가스화학, 도쿄, 일본)를 넣어 비피더스균이 증식 가능한 정도의 저산소 상태로 한 혐기 환경하에서 37℃에서 2일간 배양하여 MRS 선택 한천 배지상에 출현한 콜로니를 계측했다.
결과를 도 7에 도시한다. 이 도면에 도시한 바와 같이 재조합 비피더스균은 혈액이나 비장과 비교하여 종양에 100배 내지 1,000배의 선택성으로 축적된다는 것이 밝혀졌다.
(3) 재조합 비피더스균의 정맥내 투여에 의한 체중 및 GPT값의 변화
(2)의 재조합 비피더스균을 투여한 누드 마우스에서 재조합 비피더스균의 정맥내 투여일(Day 0)과 종양 회수시의 투여 후 1주(Day 7)에 체중을 계측했다. 음성 대조로서는 재조합 비피더스균을 정맥 내에 투여하지 않은 A431세포 이식 마우스를 이용했다. 각 군은 n=5로 실시했다.
결과를 표 1에 나타낸다.
재조합 비피더스균 Day 0 Day 7
미투여 1.00±0.03 1.00±0.03
투여 1.00±0.03 1.08±0.04
표 1에 도시한 바와 같이 재조합 비피더스균의 정맥내 투여에 의한 마우스의 체중 감소는 검출되지 않았다.
또 (2)의 재조합 비피더스균을 투여한 누드 마우스와 음성 대조의 마우스 각각으로부터 채취한 혈액으로 혈청을 조제하고, 트랜스아밀라아제CⅡ·테스트 와코(와코순약)를 이용하여 간기능 장해의 유무를 조사하기 위해 GPT(ALT)값을 측정했다. 혈청은 채취한 혈액을 실온에서 30분, 4℃에서 하룻밤 인큐베이팅하여 1,000×g으로 원심분리한 후 상청액을 채취함으로써 얻었다.
결과를 도 8에 도시한다. 재조합 비피더스균의 정맥내 투여군(8C7 독소)에서는, 음성 대조(Vehicle, 운반체)에 비교하여 GPT값에 큰 변화를 볼 수 없었다.
이상의 결과는 살세포 활성을 가진 외독소를 포함한 융합 단백질 8C7 독소를 분비하는 재조합 비피더스균을 마우스의 정맥 내에 투여하더라도 생체에 대해 부작용을 거의 미치지 않는다는 것을 시사하고 있다.
＜실시예 5: 8C7 EGFP를 발현하는 재조합 비피더스균을 이용한 in vivo에서의 EGFR 내재화의 검출＞
(1) 8C7 EGFP의 발현 벡터 구축과 재조합 비피더스균의 조제
8C7 EGFP 발현 벡터는 실시예 4에 기재된 셔틀 벡터 pKKT427의 MCS에서의 HindⅢ와 NotI 사이에 비피더스균용 발현 카세트 8C7 EGFP(도 1b)를 삽입했다. 구축한 8C7 EGFP 발현 벡터를 B.롱검 105-A에 일렉트로포레이션법을 이용하여 도입했다. 일렉트로포레이션의 조건은, 2.4㎸/cm, 25μF, 200Ω의 조건으로 행했다. 얻어진 재조합 비피더스균을 생리식염수에 재현탁하여 누드 마우스 투여액을 조제했다.
(2) 재조합 비피더스균의 A431세포 담암 마우스에 대한 투여 및 EGFR 내재화의 검출
6주령 암컷의 KSN/Slc 누드 마우스에 2×106의 A431세포를 피하 이식하고 고형암이 형성된 2주 후에 상기 (1)에서 조제한 재조합 비피더스균을 1.5×109개로 정맥 내에 투여했다. 음성 대조에는 재조합 비피더스균을 정맥 내에 투여하지 않은 누드 마우스를 사용했다. 체내의 재조합 비피더스균의 영양 보조를 위해 모든 마우스에 매일 1mL의 20% 락툴로오스(와코순약, 오사카, 일본)를 복강 내에 투여했다. 투여 후 1주 후에 마우스로부터 종양(n=10, 평균값 450㎣)을 회수하고 동결 조직 절편 제작용 포매제 티슈텍 O.C.T. 콤파운드(사쿠라 파인텍 재팬, 도쿄, 일본) 중에서 동결 보존했다. 동결 절편은 동결 마이크로톰 Leica CM3050 S(Leica, Wetzlar, Germany)를 이용하여 10㎛의 두께로 제작했다. 봉입제는 Prolong Antifade Reagent with DAPI(Life Technologies, Carlsbad, CA)를 이용하여 봉입시에 DAPI(4',6-Diamidino-2-phenylindole)로 핵염색을 행했다. 슬라이드 유리는 Micro Slide Glass(마쓰나미 가라스, 오사카, 일본)를 이용하고, 커버 유리는 Neo Micro Cover Glass(마쓰나미 가라스)를 이용했다. 형광 현미경은 Eclipse 80i(니콘, 도쿄, 일본)를 사용했다. DAPI 염색한 세포핵을 파장 340∼380㎚의 여기광에 의해 400㎚ 부근의 형광으로서 검출하고, 8C7 EGFP는 파장 465∼495㎚의 여기광에 의해 505㎚ 부근의 형광으로서 검출했다.
결과를 도 9에 도시한다. 도 9a 및 도 9b는 8C7 EGFP를, 도 9c는 음성 대조를 도시한다. 이들 도면에서는 8C7 EGFP의 형광을 화살표로, DAPI의 형광은 화살표 머리로 도시한다. A431세포의 핵 주변에 점모양으로 EGFP의 녹색 형광이 확인되기 때문에 in vivo에서도 8C7 EGFP의 EGFR 내재화가 발생한다는 것이 밝혀졌다. 이것은 8C7 독소를 발현하여 분비되는 재조합 비피더스균을 정맥 내에 투여한 경우 in vivo에서도 녹농균 외독소A가 암세포 내에 수용되어 암세포에 대해 강한 살세포 효과를 발휘한다는 것을 시사하고 있다. 또 도 9b에서는 직선형의 형광상(화살표)이 보였으나 이것은 재조합 비피더스균이 직선형으로 나열되어 생식하고 있다는(Yazawa K, et al., 2000, Cancer Gene Therapy 7: 269-274) 것을 시사하고 있다. 동일한 결과는 인간 췌장암 유래 세포 BxPC-3 세포에서도 얻을 수 있었다(미도시).
＜실시예 6: 8C7 독소를 발현하는 재조합 비피더스균을 정맥내 투여한 경우의 항종양 효과(1)＞
A431세포의 Xenograft 모델에 8C7 독소를 발현하는 재조합 비피더스균을 정맥내 투여한 경우의 항종양 효과에 대해 검증했다.
(1) 음성 대조 독소 대조군의 발현용 벡터 구축과 재조합 비피더스균의 조제
항체 의존성의 항종양 효과를 검토하기 위해 음성 대조로서 도 1c에 기재된 독소 대조군을 이용했다. 실시예 4에 기재된 셔틀 벡터 pKKT427의 MCS에서의 HindⅢ와 NotI 사이에 비피더스균용 발현 카세트 독소 대조군(도 1c)을 삽입했다. 구축한 독소 대조군 발현 벡터를 B.롱검 105-A에 일렉트로포레이션법을 이용하여 도입했다. 일렉트로포레이션의 조건은 2.4㎸/cm, 25μF, 200Ω 조건으로 행했다. 얻어진 재조합 비피더스균을 생리식염수에 재현탁하여 누드 마우스 투여액을 조제했다.
(2) A431세포의 Xenograft 모델에서의 재조합 비피더스균의 항종양 효과 측정
6주령 암컷의 KSN/Slc 누드 마우스에 2×106의 A431세포를 피하 이식하고 8일 후에 각 군(운반체, 8C7 독소, 독소 대조군; 각 n=5)을 약 130㎣가 되도록 군을 나눈 후 실시예 4 (1)에서 조제한 8C7 독소를 발현하는 재조합 비피더스균 및 본 실시예(1)에서 조제한 독소 대조군을 발현하는 재조합 비피더스균을 1.5×109개로 정맥 내에 투여했다. 음성 대조(운반체)에는 재조합 비피더스균을 정맥 내에 투여하지 않은 누드 마우스를 사용했다. 체내의 재조합 비피더스균의 영양 보조를 위해 모든 마우스에 매일 1mL의 20% 락툴로오스(와코순약, 오사카, 일본)를 복강 내에 투여했다. 종양 직경은 A431세포를 피하 이식한 날로부터 8일, 10일, 15일, 18일, 20일 후에 노기스를 이용하여 계측했다. 종양 부피는 「(짧은 지름)2×(긴지름)/2」의 계산식으로 산출했다.
결과를 도 10에 도시하였다. 8C7 독소를 발현하는 재조합 비피더스균에서는 음성 대조의 운반체와 비교하여 93%의 종양 증식 억제 효과가 보였다. 한편 항EGFR 단일쇄 항체 PMP8C7을 포함하지 않는 음성 대조 독소 대조군을 발현하는 재조합 비피더스균에서는 종양 증식 억제 효과가 거의 보이지 않았다. 이러한 결과는 in vivo에서 재조합 비피더스균으로부터 분비된 8C7 독소가 항EGFR 단일쇄 항체 부분을 사이에 두고 A431세포 표면의 EGFR 수용체와 결합하여 녹농균 외독소A부분에 의해 살세포 효과를 발휘한 것을 시사하고 있다. 이번에 얻어진 항종양 효과는 EGFR의 티로신키나아제를 선택적으로 저해하는 저분자의 분자 표적약인 게피니티브와 동등한 종양 증식 억제 효과(James G., et al., 2001, Clin Cancer Res, 7: 4230-4238)를 가지고 있어 종양 증식 억제 효과로서는 충분하다는 것이 밝혀졌다.
＜실시예 7: 8C7 독소를 발현하는 재조합 비피더스균을 정맥내 투여한 경우의 항종양 효과(2)＞
BxPC-3세포의 Xenograft 모델에 8C7 독소를 발현하는 재조합 비피더스균을 정맥내 투여한 경우의 항종양 효과에 대해 검증했다.
(1) BxPC-3 세포의 Xenograft 모델에서의 재조합 비피더스균의 항종양 효과 측정
6주령 암컷의 KSN/Slc 누드 마우스에 2×106의 BxPC-3세포를 피하 이식하고, 12일 후에 각 군(운반체, 8C7 독소, 독소 대조군; n=5)을 약 95㎣가 되도록 나눈 후, 실시예 4 (1)에서 조제한 8C7 독소를 발현하는 재조합 비피더스균 및 본 실시예(1)에서 조제한 독소 대조군을 발현하는 재조합 비피더스균을 1.5×109개로 정맥 내에 투여했다. 나아가 27일 후에 1.5×109개의 재조합 비피더스균을 정맥 내에 재투여했다. 음성 대조(운반체)에는 재조합 비피더스균을 정맥 내에 투여하지 않은 누드 마우스를 사용했다. 체내의 재조합 비피더스균의 영양 보조를 위해 모든 마우스에 매일 1mL의 20% 락툴로오스(와코순약, 오사카, 일본)를 복강 내에 투여했다. 종양 직경은 BxPC-3 세포를 피하 이식한 날로부터 12일, 15일, 22일, 27일, 32일, 37일 후에 노기스를 이용하여 계측했다. 종양 부피는 「(짧은 지름)2×(긴 지름)/2」의 계산식으로 산출했다.
결과를 도 11에 도시한다. 8C7 독소를 발현하는 재조합 비피더스균에서는, 음성 대조의 운반체와 비교하여 90%의 종양 증식 억제 효과가 보였다. 한편 항EGFR 단일쇄 항체 PMP8C7을 포함하지 않는 음성 대조 독소 대조군을 발현하는 재조합 비피더스균에서는 종양 증식 억제 효과가 거의 보이지 않았다. 이러한 결과는 실시예 6과 마찬가지로 in vivo에서 재조합 비피더스균으로부터 분비된 8C7 독소가 항EGFR 단일쇄 항체 부분을 사이에 두고 A431세포 표면의 EGFR 수용체와 결합하여 녹농균 외독소A부분에 의해 살세포 효과를 발휘한 것을 시사하고 있다. 이번에 얻어진 항종양 효과는 췌장암의 치료에 사용되는 대사 길항약 겜시타빈 및 EGFR을 표적으로 하는 모노크로날 항체 세툭시맙(Cetuximab)의 병용 효과(Clin Cancer Res. 2008; 14: 5142-5149)보다 종양 증식 억제 효과가 강하여 종양 증식 억제 효과로서는 충분하다는 것이 밝혀졌다.
(2) BxPC-3 세포의 Xenograft 모델에서의 재조합 비피더스균 투여시 체중 변화
(1)의 재조합 비피더스균을 투여한 누드 마우스에서 재조합 비피더스균의 정맥내 투여일(Day 0) 기준값으로 하여 투여 후 15일째(Day 15), 22일째(Day 22), 27일째(Day 27), 32일째(Day 32) 및 37일째(Day 37)에 체중을 계측했다. 각 군은 n=5로 실시했다.
결과를 표 2에 나타낸다.
재조합
비피더스균		 Day 12 Day 15 Day 22 Day 27 Day 32 Day 37
미투여 1.00±0.04 1.09±0.02 1.12±0.02 1.17±0.02 1.14±0.02 1.17±0.02
8C7 독소 1.00±0.03 1.08±0.02 1.08±0.02 1.10±0.03 1.12±0.03 1.13±0.03
독소
대조군		 1.00±0.02 1.10±0.03 1.12±0.02 1.15±0.02 1.18±0.01 1.19±0.02
BxPC-3 세포에서도 운반체, 독소 대조군과 비교하여 8C7 독소를 발현하는 재조합 비피더스균의 정맥내 투여에 의한 큰 체중 감소는 검출되지 않았다.
＜실시예 8: 8C7 독소를 발현하는 재조합 비피더스균을 정맥내 투여한 경우의 항종양 효과(3)＞
PC-9 세포(인간 비소세포 폐암 유래 세포, 면역 생물 연구소, 후지오카시, 일본에서 입수)의 Xenograft 모델에 8C7 독소를 발현하는 재조합 비피더스균을 정맥내 투여한 경우의 항종양 효과에 대해 검증했다.
(1) PC-9 세포의 Xenograft 모델에서의 재조합 비피더스균의 항종양 효과 측정
6주령 암컷의 KSN/Slc 누드 마우스에 1.7×106의 PC-9 세포를 피하 이식하고 8일 후에 각 군(운반체, 8C7 독소, 독소 대조군; n=5)을 약 95㎣가 되도록 나눈 후, 실시예 4 (1)에서 조제한 8C7 독소를 발현하는 재조합 비피더스균 및 실시예 6 (1)에서 조제한 독소 대조군을 발현하는 재조합 비피더스균을 1.5×109개로 정맥 내에 투여했다. 음성 대조(운반체)에는 재조합 비피더스균을 정맥 내에 투여하지 않은 누드 마우스를 사용했다. 체내의 재조합 비피더스균의 영양 보조를 위해 모든 마우스에 매일 1mL의 20% 락툴로오스(와코순약, 오사카, 일본)를 복강 내에 투여했다. 종양 직경은 PC-9 세포를 피하 이식한 날의 9일, 10일, 11일, 14일, 17일, 21일, 24일 후에 노기스를 이용하여 계측했다. 종양 부피는 「(짧은 지름)2×(긴 지름)/2」의 계산식으로 산출했다.
결과를 도 12에 도시한다. 8C7 독소를 발현하는 재조합 비피더스균에서는, 음성 대조의 운반체와 비교하여 77%의 종양 증식 억제 효과가 보였다. 한편 항EGFR 단일쇄 항체 PMP8C7을 포함하지 않는 음성 대조 독소 대조군을 발현하는 재조합 비피더스균에서는 종양 증식 억제 효과가 거의 보이지 않았다. 이러한 결과는 실시예 6, 7과 마찬가지로 in vivo에서 재조합 비피더스균으로부터 분비된 8C7 독소가 항EGFR 단일쇄 항체 부분을 사이에 두고 A431세포 표면의 EGFR 수용체와 결합하여 녹농균 외독소A부분에 의해 살세포 효과를 발휘한 것을 시사하고 있다.
＜실시예 9: 8C7 EGFP를 발현하는 재조합 비피더스균을 경구 투여한 경우의 장관 면역 응답 유도＞
8C7 EGFP를 발현하는 재조합 비피더스균을 경구 투여한 경우의 장관 면역 응답의 유도에 대해 검증했다
(1) 음성 대조가 되는 pKKT427 함유 재조합 비피더스균의 구축과 8C7 EGFP를 발현하는 재조합 비피더스균의 경구 투여
음성 대조가 되는 pKKT427 함유 재조합 비피더스균은 pKKT427을 그대로 B.롱검 105-A에 일렉트로포레이션법을 이용하여 도입하여 조제했다. 일렉트로포레이션의 조건은 2.4㎸/cm, 25μF, 200Ω 조건으로 행했다. 얻어진 재조합 비피더스균과 실시예 5 (1)에서 조제한 8C7 EGFP를 발현하는 재조합 비피더스균을 생리식염수에 재현탁하여 마우스 투여액을 조제하고 6주령 암컷의 BALB/cCrSlc 마우스(일본에스엘시, 하마마츠, 일본)의 각 군(pKKT427, 8C7 독소; n=4)에 6.0×109개의 재조합 비피더스균을 경구 투여했다. 장관 내의 재조합 비피더스균의 영양 보조를 위해 모든 마우스에 매일 0.2mL의 20% 락툴로오스를 2주간 경구 투여했다. 재조합 비피더스균을 경구 투여한 날로부터 31일 후에 대변을 회수하여 20%(w/v)가 되도록 얼린 complete mini(로슈 다이아그노스틱스, 바젤, 스위스)를 넣은 PBS로 현탁하여 원심분리 후 상청액을 0.22㎛ filter로 여과한 것을 시료로 했다. 장관 면역 응답의 유도는 시료 중의 EGFP에 대한 대변 중의 항체가를 ELISA법에 의해 측정했다. ELISA법은 96구멍 플레이트 상에서 행하고, 항원은 실시예 2 (2)에서 조제한 리콤비난트 8C7 EGFP(16㎍)를 이용하여 실온에서 1시간 이상 Superblock blocking TBS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)로 블로킹 후 3회 TBS-T로 세정 후 Superblock blocking TBS로 2배 희석한 시료를 50μL 첨가했다. 실온에서 2시간 인큐베이팅한 후 3회 TBS-T로 세정했다. 10000배 희석한 Goat polyclonal secondary antibody to mouse IgG+IgM+IgA-H&L HRP (abcam, Cambridge, UK) 50μL를 더하여 37℃에서 1시간 인큐베이팅한 후 TBS-T로 3회 세정했다. TMB용액(와코순약, 오사카, 일본)을 50μL 첨가하여 실온에서 2시간 인큐베이팅 후 발색 정지액인 황산을 50μL 첨가하여 흡광 광도계로 OD450의 값을 측정했다.
결과를 도 13에 도시한다. 8C7 EGFP를 발현하는 재조합 비피더스균군에서 대변 중의 항EGFP 항체 생산량이 유의(t검정, p=0.0047)하게 증가하였다. 이것은 8C7 EGFP를 발현하는 재조합 비피더스균을 경구 투여함으로써 장관 면역 응답이 유도된 것을 시사하고 있다.
＜실시예 10: 8C7 EGFP를 발현하는 재조합 비피더스균을 정맥내 투여했을 때의 혈중에서의 자기 항체의 비생산 확인＞
8C7 EGFP를 발현하는 재조합 비피더스균을 정맥내 투여한 경우에 혈중에 항 8C7 EGFP 항체가 유도되지 않는 것을 확인했다.
(1) colon26 세포의 Xenograft 모델의 구축과 재조합 비피더스균의 정맥내 투여
6주령 암컷의 BALB/cCrSlc 마우스(일본에스엘시, 하마마츠, 일본) 15마리에 colon26 세포(마우스 직장암 유래 세포, 이화학 연구소 바이오 리소스 센터, 쓰쿠바시, 일본에서 입수)를 1.0×106개로 피하 이식하여 7일 후에 평균 133㎣가 되도록 3군(8C7 EGFP; n=8, 8C7 EGFP(비피더스균 회수용); n=3, 무처리군용; n=4)으로 군을 나눈 후, 8C7 EGFP군 및 8C7 EGFP(비피더스균 회수)군 각각에 8C7 EGFP를 발현하는 재조합 비피더스균을 1.0×108개로 정맥 내에 투여했다. 8C7 EGFP(비피더스균 회수)군은 colon26 세포를 피하 이식한 마우스에 8C7 EGFP를 발현하는 재조합 비피더스균을 투여한 후 그 재조합 비피더스균의 종양 축적성을 확인하기 위해 다음의 (2)에서 사용하는 마우스군으로서, 실질적으로는 8C7 EGFP군과 같은 처리를 행하였다.
(2) colon26 세포에서의 재조합 비피더스균의 종양 축적성
8C7 EGFP(비피더스균 회수)군에서는 피하 이식으로부터 18일 후에 종양을 적출하여 1mL의 MRS 배지 중에서 균질화한 후 100㎍/mL의 스펙티노마이신을 포함한 MRS 한천 배지에 도포했다. 계속해서 용기 또는 부대 안에 탈산소제인 아네로팩 켄키(미쓰비시 가스화학, 도쿄, 일본)를 넣어 비피더스균이 증식 가능한 정도의 저산소 상태로 한 혐기 환경하에서 37℃에서 2일간 배양했다. MRS 선택 한천 배지상에 출현한 콜로니를 계측한 바, 평균 4.3×106개/마리의 비피더스균을 얻었다. 이 결과로부터 마우스 정맥 내에 투여된 8C7 EGFP를 발현하는 재조합 비피더스균이 종양에 생존 상태로 축적되는 것이 확인되었다.
(3) 혈청중의 항8C7 EGFP 항체의 비유도성 확인
피하 이식으로부터 28일, 35일 후에 8C7 EGFP를 발현하는 재조합 비피더스균군과 무처리군 각각으로부터 채취한 혈액으로부터 혈청을 조제했다. 면역 응답의 유도 유무를 조사하기 위해 EGFP에 대한 혈청중의 항체값을 ELISA법에 의해 측정했다. ELISA법은 96구멍 플레이트상에서 행하고, 항원은 실시예 2 (2)에서 조제한 리콤비난트 8C7 EGFP(16㎍)를 이용했다. 실온에서 1시간 이상 Superblock blocking TBS로 블로킹 후 TBS-T로 3회 세정하고 Superblock blocking TBS로 2000배 희석한 혈청을 50μL 첨가했다. 음성 대조로서 3mg/mL의 Normal Mouse IgG (Invitrogen, Carlsbad, USA)를 Superblock blocking TBS로 15000배 희석하여 사용했다. 양성 대조로서 1mg/mL의 항EGFP 항체(Clontech, Mountain View, USA)를 Superblock blocking TBS로 5000배 희석하여 사용했다. 실온에서 2시간 인큐베이팅하고 TBS-T로 3회 세정 후 10000배 희석한 Goat polyclonal secondary antibody to mouse IgG+IgM+IgA-H&L HRP의 50μL를 더하여 37℃에서 1시간 인큐베이팅했다. TBS-T로 3회 세정 후 TMB 용액을 50μL 첨가했다. 실온에서 2시간 인큐베이팅 후 발색 정지액인 황산을 50μL 첨가하고 흡광 광도계로 OD450의 값을 측정했다.
결과를 도 14에 도시한다. 8C7 EGFP 투여군은 무처리군 및 음성 대조의 nIgG와 비교하여 혈청중의 항EGFP 항체량이 우위로 증가하지 않았다. 이것은 colon26 세포의 Xenograft 모델에서 8C7 EGFP를 발현하는 재조합 비피더스균을 정맥내 투여해도 혈중에 항8C7 EGFP 항체가 유도되지 않는 것을 나타내고 있다. 임상시험에서 이뮤노톡신을 정맥 내에 투여한 경우 자기 항체의 생산이 치료상 문제가 되는데(James A. Posey, Mohammad B. Khazaeli, Michael A. Bookman, et al, 2002, Clin Cancer Res, 8: 3092-3099), 이 결과로부터 본 치료법에서는 자기 항체의 생산이 문제가 되지 않는 것으로 입증되었다.
<산업상 이용 가능성>
본 발명의 재조합 편성 혐기성 그램 양성균에 의하면 기능성 펩티드를 코딩하는 핵산을 발현 및 분비 가능한 상태로 표적 세포 주변에까지 송달할 수 있는 약제 송달용 담체를 제공할 수 있다.
본 발명의 항종양제 및/또는 종양 검출용 마커에 의하면 침습성이 낮고 부작용이 적고 또한 표적 특이성이 높은 고형암 증식 억제제 및/또는 종양 검출용 마커를 제공할 수 있다. 이 고형암 증식 억제제 및 종양 검출용 마커를 이용함으로써 고형암의 증식 억제에 의한 치료 효과를 경시적으로 모니터링할 수 있게 된다.
본 발명의 경구 백신제에 따르면 비침습적이고 부작용이 낮고 또한 표적 특이성이 높은 경구 백신제를 제공할 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로 본 명세서에 편입시키기로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Teikyo Heisei University <120> Antitumor medicament, Marker for detecting tumor and Oral vaccine <130> PH-5605-PCT <150> JP 2012-158044 <151> 2012-07-13 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2346 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA 8C7 toxin <400> 1 aagctttggg cgcggcggcc atgaagtggc ttgacaagca caatctcgtc tgatttttgc 60 ccttgccctc ccctcgaaaa aaacacataa atcctatata aaatgcgggt tttcgcagtc 120 acatgcgcta ttatcattga ttgaacgggc aaagcaacaa atgccgcccc ctgaccaaga 180 aggatgcttt atgaccaacg ttcgcgtgat caagcccgct ctggcggccc tcgtggccgc 240 cgccgcgtgc gtgggtgggc tggcctttag cagcgctcag cccgctcagg ccgacacgta 300 ccaggtcaag ctggaggaaa gcggaggcgg gctggtccaa gctggcggtt ccctgcggct 360 gtcctgcgcc gcctccggcc gtgcgttctc cagctacgtc atgggctggt ttcgccaggc 420 gccgggcaag gagcgcgaga tcgtcggcgc catcagctgg cgcggcggga gcacctacta 480 cgccgacagc gttaaggggc gcttcacgat cagccgcgac aacgcaaaga acactgtgta 540 cctccagatg aattccctta agcccgagga caccgccgtc tactactgcg ccgcggtcta 600 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ggtgctgtga cgtgttgtcc aaccgtatta ttccggacta gatcagcggc 2340 ggccgc 2346 <210> 2 <211> 2025 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA 8C7EGFP <400> 2 aagctttggg cgcggcggcc atgaagtggc ttgacaagca caatctcgtc tgatttttgc 60 ccttgccctc ccctcgaaaa aaacacataa atcctatata aaatgcgggt tttcgcagtc 120 acatgcgcta ttatcattga ttgaacgggc aaagcaacaa atgccgcccc ctgaccaaga 180 aggatgcttt atgaccaatg tgcgcgtcat caagcctgca ctggccgccc tggttgccgc 240 cgccgcatgc gtgggcgggc tggcctttag cagcgcgcag ccggcccagg ctgacaccta 300 tcaggtgaag ctggaagagt cgggtggcgg gttggtgcag gcgggcggct ccctccggtt 360 gagctgcgct gcctcgggcc gcgccttcag ctcctacgtc atggggtggt tcaggcaggc 420 gccgggcaag gaaagggaga tcgtcggggc catctcctgg aggggtggct ccacgtacta 480 cgccgactcc gtgaaaggtc gcttcactat ctcgcgcgac aacgcgaaga acaccgtgta 540 cctccagatg aactccctta agcccgaaga tacggcagtc tattactgcg cggcggtgta 600 tcgcgtcggc gccatctccg agtactccgg caccgactac tacacggatg agtacgatta 660 ctggggccag ggcacccagg tgacggtgag cagcggcggc agcggaggcg gcgggagcgg 720 cggtcaagtg aagttggaag agtccggcgg cggcctggtc caagccggcg gcagcctccg 780 tctgtcctgt gcggcctccg gacgtgcctt ctcgagctac gttatgggat ggtttcgcca 840 ggctccgggg aaagaacgcg aaattgtggg cgccattagc tggcgcggcg gatccaccta 900 ctacgccgat tcggttaagg gacgcttcac catctcccgt gacaacgcca agaacacggt 960 gtatctgcag atgaacagcc tgaagccgga ggataccgcc gtctactact gcgctgcggt 1020 ctatcgggtg ggcgcgatct ccgaatattc cggcaccgat tattacaccg acgagtatga 1080 ctactggggc caaggtaccc aggtcacggt ttcctccggc ggttcgggcg gaggtggctc 1140 cggcggtatg gtgtccaagg gcgaagagct gttcactggc gtggtgccga tcctggtgga 1200 gctcgacggg gacgtgaatg gccacaaatt cagcgtgtcg ggcgaaggcg aaggcgacgc 1260 cacctacggc aagctgacgc tgaaattcat ctgcaccacg ggcaaactcc ccgtcccgtg 1320 gcccaccctg gtcacgactc tcacctacgg ggtccagtgc ttctcccgtt accctgacca 1380 catgaagcaa cacgacttct tcaagtccgc gatgccggag ggctacgtgc aggaacgcac 1440 gatcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgggcc gaggtcaagt tcgagggtga 1500 cacccttgtg aatcgcatcg agctgaaggg aatcgacttc aaagaggacg gaaacattct 1560 ggggcataag ctcgagtaca actacaactc gcacaacgtg tacatcatgg ctgacaagca 1620 gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccataac atcgaggatg gctccgtcca 1680 gctcgcggac cattaccagc agaacacccc gattggcgat ggtcccgttc tcttgccgga 1740 caaccactat ctgtcgacgc agtccgcgct gtccaaggat ccgaacgaga agcgggacca 1800 catggtgctt ctcgagttcg tgaccgcagc cggcatcacc ctgggaatgg acgagctgta 1860 caagcaccac catcaccacc attgaactag tccttctgct cgtagcgatt acttcgagca 1920 ttactgacga caaagacccc gaccgagatg gtcggggtct ttttgttgtg gtgctgtgac 1980 gtgttgtcca accgtattat tccggactag atcagcggcg gccgc 2025 <210> 3 <211> 1539 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA Toxin control <400> 3 aagctttggg cgcggcggcc atgaagtggc ttgacaagca caatctcgtc tgatttttgc 60 ccttgccctc ccctcgaaaa aaacacataa atcctatata aaatgcgggt tttcgcagtc 120 acatgcgcta ttatcattga ttgaacgggc aaagcaacaa atgccgcccc ctgaccaaga 180 aggatgcttt atgaccaacg tccgcgttat caagcctgcc ctcgcagcgt tggtggccgc 240 agcggcgtgt gtgggcggac tggctttctc gtccgcacaa cccgcgcagg ctgagggcgg 300 ctcgctggcg gcactcaccg cgcatcaggc gtgccatctg ccgctcgaaa ccttcacgcg 360 tcacaggcaa ccgcgtgggt gggaacagct ggagcagtgc ggctatcccg tgcagaggct 420 cgtcgctctg tacctggccg ccaggctgtc ctggaaccag gtggaccagg tcatccggaa 480 cgcgcttgcc tccccgggct ccggcggcga tctgggcgag gccattcgcg aacagcccga 540 gcaagcccgt ctggctctca cgctcgcagc cgcggagtcc gagcgcttcg tccgccaggg 600 aaccggcaac gacgaggctg gtgcagccaa cgccgatgtc gtgtccctta cgtgcccggt 660 tgccgccggc gaatgcgccg ggccggcgga cagcggcgac gcccttctgg aacgcaacta 720 tccgaccggg gccgagtttc tcggcgatgg cggcgatgtg tccttctcca cccgcgggac 780 ccagaactgg acggtcgagc gcctcctgca ggcccaccgc cagctcgagg agcgcggcta 840 cgtgttcgtc gggtatcacg gcaccttcct ggaggccgcc cagagcatcg tgttcggtgg 900 cgtgcgcgcc cgctcccagg acctggacgc gatctggcgt ggcttctaca tcgcgggtga 960 tccggccctg gcctacggtt acgcccagga ccaggagcct gacgcccgtg gtcggatccg 1020 caatggcgcg ctcctgaggg tctacgttcc tcgctcgtcc ctgccgggct tctaccgcac 1080 ctccttgacc ctggccgccc cggaagccgc gggtgaagtg gagcggctga tcggacaccc 1140 cttgccgctg cgcctggacg ccatcacggg cccggaagaa gagggcggac gcctcgagac 1200 tatcctgggc tggccccttg ctgaacggac cgtggtgatt ccgagcgcca tcccgactga 1260 cccgcggaac gtgggcggag atttggaccc gagcagcatt ccggacaagg agcaggcgat 1320 cagcgctctg ccggactacg cctcgcaacc cggcaaaccg ccccgggagg acctgaagca 1380 ccaccatcac catcactgaa ctagtccttc tgctcgtagc gattacttcg agcattactg 1440 acgacaaaga ccccgaccga gatggtcggg gtctttttgt tgtggtgctg tgacgtgttg 1500 tccaaccgta ttattccgga ctagatcagc ggcggccgc 1539 <210> 4 <211> 184 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA derived from hup promoter of Bifidobacterium longum <400> 4 tgggcgcggc ggccatgaag tggcttgaca agcacaatct cgtctgattt ttgcccttgc 60 cctcccctcg aaaaaaacac ataaatccta tataaaatgc gggttttcgc agtcacatgc 120 gctattatca ttgattgaac gggcaaagca acaaatgccg ccccctgacc aagaaggatg 180 cttt 184 <210> 5 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA derived from usp secretory signal sequence of Bifidobacterium longum <400> 5 atgaccaacg ttcgcgtgat caagcccgct ctggcggccc tcgtggccgc cgccgcgtgc 60 gtgggtgggc tggcctttag cagcgctcag cccgctcagg cc 102 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA for linker <400> 6 ggtggatccg gcggtggcgg ctcgggcggg 30 <210> 7 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA PMP8C7 <400> 7 caggtcaagc tggaggaaag cggaggcggg ctggtccaag ctggcggttc cctgcggctg 60 tcctgcgccg cctccggccg tgcgttctcc agctacgtca tgggctggtt tcgccaggcg 120 ccgggcaagg agcgcgagat cgtcggcgcc atcagctggc gcggcgggag cacctactac 180 gccgacagcg ttaaggggcg cttcacgatc agccgcgaca acgcaaagaa cactgtgtac 240 ctccagatga attcccttaa gcccgaggac accgccgtct actactgcgc cgcggtctac 300 cgcgtcggcg cgatttcgga gtatagcggc accgactact acaccgatga gtatgactat 360 tggggccagg gcacccaggt gaccgtttcg tcc 393 <210> 8 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA PMP8C7 <400> 8 caagtgaaac tggaggagtc cggcggaggt ctggtgcaag ccggcggctc gctccggctc 60 agctgtgccg cgtccggccg cgctttcagc tcctatgtga tgggctggtt ccgtcaagcc 120 ccgggcaaag agcgggagat cgtgggcgcg atctcctggc gtggcggttc cacctattac 180 gcagattcgg tcaagggccg cttcaccatc tcgagggaca acgcgaagaa cacggtctat 240 ctccagatga actccctcaa gccggaagat accgccgtgt actactgcgc agccgtgtac 300 cgcgtgggcg caatctccga gtacagcgga accgattact acaccgacga atacgactac 360 tggggccaag gaacccaggt gacggtttcc agc 393 <210> 9 <211> 1086 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA derived from exotoxin A <400> 9 gagggcggat ccctggccgc cctgacggcc caccaggcct gccaccttcc cctggaaacc 60 ttcacgcgcc accgccaacc ccgtggctgg gagcagctcg aacagtgcgg ctatccggtg 120 cagcggctgg tcgccctcta cctcgccgct cgcctgtcct ggaaccaggt ggaccaggtg 180 atcaggaacg ctttggctag cccgggctcc ggcggtgatc tgggtgaggc catccgcgag 240 cagcctgagc aggctaggct ggccttgacc ttggccgccg cagagtccga acgcttcgtc 300 cgccagggca ccggaaacga tgaagccggg gccgcgaatg ccgacgtggt gtccctgacg 360 tgtccggtgg ccgcaggcga gtgcgccgga cctgccgatt ccggcgacgc actgctggag 420 cgcaactacc cgaccggcgc ggaattcctg ggcgacggcg gtgacgtgtc cttctccacg 480 aggggaacgc agaactggac tgtcgagcgg ttgctccagg cccatcgcca gctggaagag 540 cggggttacg ttttcgtggg ctaccacggg accttcctcg aagcggcgca gtccatcgtg 600 ttcggcgggg tgcgggcgag gtcgcaggac ctggacgcga tttggcgcgg cttctatatc 660 gcaggcgacc ccgccctggc gtacggttac gctcaggacc aggagccgga cgcgcgcggg 720 aggatccgca acggtgccct cctccgcgtg tatgtcccgc gctcctccct tcctggcttc 780 taccgtacct ccctgaccct tgccgcgccg gaagcggccg gcgaagtgga gcgtctgatt 840 gggcatccgc tgccgttgcg cctggatgcc atcactggcc cggaagagga gggcggccgg 900 ttggaaacga tcctcggctg gccgctggcg gaacggacgg tggtcatccc gtcggccatc 960 cccaccgacc cgcgcaacgt cggcggcgac ctggatccgt cgtccatccc ggataaggag 1020 caggccattt cggcgctgcc cgactacgcc agccagccgg gaaagccgcc ccgtgaggac 1080 ctcaag 1086 <210> 10 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA derived from HUT terminator <400> 10 ccttctgctc gtagcgatta cttcgagcat tactgacgac aaagaccccg accgagatgg 60 tcggggtctt tttgttgtgg tgctgtgacg tgttgtccaa ccgtattatt ccggactaga 120 tcagcg 126 <210> 11 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 11 cccatatgtg gtcccatccg cagtttgaaa aagacacgta ccaggtcaag ctggag 56 <210> 12 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 12 ttgcaagcaa ttgcggccgc cttcaggtcc tcccggggcg gttt 44 <210> 13 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 13 cccatatgtg gtcccatccg cagtttgaaa aagacaccta tcaggtgaag ctggaa 56 <210> 14 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 14 ttgcaagcaa ttgcggccgc cttgtacagc tcgtccattc ccag 44 <210> 15 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 15 cccatatgtg gtcccatccg cagtttgaaa aagagggcgg ctcgctggcg gcactc 56 <210> 16 <211> 671 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic amino acid <400> 16 Met Thr Asn Val Arg Val Ile Lys Pro Ala Leu Ala Ala Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Cys Val Gly Gly Leu Ala Phe Ser Ser Ala Gln Pro Ala 20 25 30 Gln Ala Asp Thr Tyr Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu 35 40 45 Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg 50 55 60 Ala Phe Ser Ser Tyr Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys 65 70 75 80 Glu Arg Glu Ile Val Gly Ala Ile Ser Trp Arg Gly Gly Ser Thr Tyr 85 90 95 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 100 105 110 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr 115 120 125 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Tyr Arg Val Gly Ala Ile Ser Glu 130 135 140 Tyr Ser Gly Thr Asp Tyr Tyr Thr Asp Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln 145 150 155 160 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 165 170 175 Gly Gly Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala 180 185 190 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Ser 195 200 205 Ser Tyr Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu 210 215 220 Ile Val Gly Ala Ile Ser Trp Arg Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 225 230 235 240 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 245 250 255 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 260 265 270 Tyr Cys Ala Ala Val Tyr Arg Val Gly Ala Ile Ser Glu Tyr Ser Gly 275 280 285 Thr Asp Tyr Tyr Thr Asp Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 290 295 300 Val Thr Val Ser Ser Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His 305 310 315 320 Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro 325 330 335 Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu 340 345 350 Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln 355 360 365 Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly 370 375 380 Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu 385 390 395 400 Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp 405 410 415 Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val 420 425 430 Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu 435 440 445 Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp 450 455 460 Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu 465 470 475 480 Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly 485 490 495 Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly 500 505 510 Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr 515 520 525 Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu 530 535 540 Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr 545 550 555 560 Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu 565 570 575 Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro 580 585 590 Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly 595 600 605 Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val 610 615 620 Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu 625 630 635 640 Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro 645 650 655 Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys 660 665 670

Claims (12)

  1. 시그널 펩티드, 단일쇄 항체 및 1 또는 2 이상의 기능성 펩티드를 포함한 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 발현 가능한 상태로 포함한 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
  2. 　청구항 1에 있어서, 편성 혐기성 그램 양성균이 비피도박테리움속인 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 단일쇄 항체는 분자량 35kDa 이하의 저분자 항체인 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 2 이상의 단일쇄 항체를 코딩하는 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일쇄 항체가 표적 세포의 표면 항원을 인식하여 결합하는 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 표적 세포가 종양 세포인 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
  7. 청구항 5 또는 청구항 6에 있어서, 상기 기능성 펩티드가 외독소 및/또는 표지 단백질인 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 표지 단백질이 형광 단백질 또는 발광 단백질인 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
  9. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 펩티드가 백신 항원 펩티드인 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
  10. 청구항 7에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균을 유효 성분으로 하는 항종양제.
  11. 청구항 7 또는 청구항 8에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균을 유효 성분으로 하는 종양 검출용 마커.
  12. 청구항 9에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균을 유효 성분으로 하는 경구 백신제.
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