CN111269289B - 从蟾酥中分离得到的肿瘤细胞亲和肽及其筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了从蟾酥中分离得到的肿瘤细胞亲和肽及其筛选方法。本发明通过蟾酥多肽与肿瘤细胞体外连续亲和作用以及多肽荧光标记法筛选出蟾酥中的肿瘤细胞亲和肽。通过Nano‑LC‑MS/MS法检测与肿瘤细胞生物亲和前后蟾酥多肽组分，发现蟾酥多肽亲和前后总离子流图发生显著改变。以转录组从头测序构建的蛋白序列库为模板，对质谱原始数据进行数据库检索，获得18条高亲和力肿瘤亲和肽。采用多肽荧光标记法定位方法，证明这些蟾酥亲和肽能够进入肿瘤细胞内，分散于细胞质内或聚集于细胞核、线粒体等细胞器。本发现筛选得到的多肽可用于制备治疗肿瘤疾病的药物或者作为靶向给药递送系统及肿瘤成像的新材料。

Description

从蟾酥中分离得到的肿瘤细胞亲和肽及其筛选方法
技术领域
本发明涉及药物技术领域，具体涉及蟾酥药材中的肿瘤细胞亲和肽。
背景技术
随着发病率和死亡率的逐年攀升，恶性肿瘤目前成为威胁人类健康的重大疾病，对于恶性肿瘤的高效治疗已成为医学领域的研究热点。手术切除联合细胞毒类化疗药物/抗体等蛋白类药物虽然在一定程度上降低癌症死亡率，但现有的化疗药物选择性低、毒副作用大，容易产生耐药性；免疫抗体复合物则体积较大，很难渗透进入肿瘤组织。与传统的药物相比，多肽具有特异性强、高度靶向专一性和选择性、毒副作用低、易于吸收、生物利用度高、不易产生耐药性以及易于修饰等特点，在抗肿瘤的实验研究及临床应用中得到广泛关注。特异性靶向多肽既可用于探测肿瘤细胞表型特征，又可将其与抗癌药物结合进行靶向治疗，同时还可作为体内肿瘤的成像制剂，用于肿瘤及肿瘤细胞微转移的早期探测。
噬菌体展示技术(生物淘选)是筛选肿瘤或癌细胞的靶向肽的一种手段。例如，从噬菌体展示肽库筛选获得LyP-1，能与肿瘤及肿瘤淋巴管内皮细胞结合，并穿透进入移植瘤内部，作为靶向制剂及造影剂在肿瘤治疗及检测中发挥作用。然而噬菌体展示技术有其固有弊端。大多数噬菌体展示肽库都是人工随机化学合成，不能对天然多肽样本进行筛选；就化学合成而论，其短肽序列与生物源序列匹配的概率在静态上是较低的，尤其缺乏有效的肽修饰(PTMs)。因此，开展基于天然肽库的筛选，对于发现天然肿瘤靶向多肽非常重要。
蟾酥是我国传统的名贵中药之一，为蟾蜍科动物中华大蟾蜍(Bufo bufogargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)的耳后腺及皮肤分泌的白色浆液,经干燥而成。具清热解毒，消痈止痛，开窍醒神的功效。现代药理学研究表明，蟾酥具有显著抗肿瘤作用，以蟾酥或蟾皮为原料的多种制剂(华蟾素注射液、蟾酥注射液、得力生注射液、安替可胶囊等)广泛用于淋巴癌、肝癌、胃癌、肺癌等的临床治疗。多个临床对照实验研究显示，蟾酥相关水溶性制剂在抑制肿瘤复发、延长癌症患者生存期、提高患者生存质量方面具有明显优势。而经水提工艺制备的制剂中，脂溶性组分蟾蜍甾烯含量较少，而水溶性大分子多肽含量非常高。表明蟾酥多肽是蟾酥抗肿瘤药效的一类关键效应物质。动物药蟾酥含有的种类丰富的多肽类物质，构成一种天然的多肽库，而当前从蟾酥中鉴定肿瘤靶向肽的研究极为缺乏。
因此，本发明基于多肽独特氨基酸序列和两亲性及跨膜性质，通过蟾酥天然多肽组与肝癌细胞(SMMC-7721)相互作用建立连续亲和筛选模型，采用液相-质谱(Nano-LC-MS/MS)法检测与肿瘤细胞生物亲和前后蟾酥多肽组分，结合实验室转录组测序构建的蛋白组序列自建库，对蟾酥中的肿瘤亲和多肽类物质进行鉴定，并采用多肽荧光标记法定位方法进一步验证蟾酥多肽的肿瘤亲和作用。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供从蟾酥中分离得到的肿瘤细胞亲和肽，所述的亲和肽序列为：
(1)S(+42)EADIKVKELEKR；(2)LGPIGSLENHYL；(3)VSKANELIEKYG；(4)LPFPIIADPKRDL；(5)FSGNTGHFTQ；(6)TVPFGTQFPSDIKVGTVF；(7)SEYQTM(+16)SNVSNVK；(8)LPATPLRVSL；(9)LSGGQ(+.98)SEEESTVHLN；(10)FKAWGWPIDDATTEKL；(11)S(+42)DKPDM(+16)AEIEK；(12)LTYERPLVT；(13)LANEDYASLTK；(14)VDLNPSNVGWNKTTFA；(15)IDIDGTTLDGDTWR；(16)SPAPAANSEGTKASEPTA；(17)YASLTKGIQNL；(18)IINGTVPPLSDRSYM(+16)N。
以上亲和肽序列为的氨基酸表示方式为：
(1)Ser(+)GluAlaAspIleLysValLysGluLeuGluLysArg；
(2)LeuGlyProIleGlySerLeuGluAsnHisTyrLeu；
(3)ValSerLysAlaAsnGluLeuIleGluLysTyrGly；
(4)LeuProPheProIleIleAlaAspProLysArgAspLeu；
(5)PheSerGlyAsnThrGlyHisPheThrGln；
(6)ThrValProPheGlyThrGlnPheProSerAspIleLysValGlnThrValPhe；
(7)SerGluTyrGlnThrMet(+16)SerAsnValSerAsnValLys；
(8)LeuProAlaThrProLeuArgValSerLeu；
(9)LeuSerGlyGlyGln(+98)SerGluGluGluSerThrValHisLeuAsn；
(10)PheLysAlaTrpGlyTrpProIleAspAspAlaThrThrGluLysLeu；
(11)Ser(+42)AspLysProAspMet(+16)AlaGluIleGluLys；
(12)LeuThrTyrGluArgProLeuValThr；
(13)LeuAlaAsnGluAspTyrAlaSerLeuThrLys；
(14)ValAspLeuAsnProSerAsnValGlyTrpAsnLysThrThrPheAla；
(15)IleAspIleAspGlyThrThrLeuAspThrTrpArg；
(16)SerProAlaProAlaAlaAsnSerGluGlyThrLysAlaSerGluProThrAla；
(17)TyrAlaSerLeuThrLysGlyIleGlnAsnLeu；
(18)IleIleAsnGlyThrValProProLeuSerAspArgSerTyrMet(+16)Asn；
作为优选方案，以上所述的从蟾酥中分离得到的肿瘤细胞亲和肽，所述的亲和肽序列为：FKAWGWPIDDATTEKL、TVPFGTQFPSDIKVGTVF。
本发明提供的从蟾酥中筛选分离肿瘤细胞亲和肽的方法，其包括以下步骤：
(1)样本处理
取蟾酥粉末溶于超纯水中，涡旋混匀，超声破碎，冰水浴超声提取，离心，取出上清；用超滤管进行超滤，取下层溶液合并；取一定量样品挥干，PBS复溶；用双缩脲法测定多肽浓度，稀释后，得到细胞连续亲和实验的多肽样本；
(2)细胞连续亲和
将肝癌细胞接种于6孔板中，培养，吸出孔内液体，三个孔加入步骤(1)蟾酥多肽样品，另外三个孔加入PBS培养液用作对照，孵育；吸出上清液加入到另接种有肝癌细胞的6孔板中进行连续亲和，取出合并药液，离心备用；以Buforin IIb与细胞的亲和为阳性对照，以PBS与细胞亲和作空白对照，以多肽样本为亲和实验组，以上各组各取部分溶液，加二硫苏糖醇，恒温混匀仪中孵育，再加碘乙酰胺，避光孵育；使用oasis HLB脱盐柱拖延，离心浓缩仪挥干，加入甲酸水，离心，通过质谱分析，获得对肝癌细胞亲和能力强的多肽序列；
(3)蟾酥多肽序列解析
使用软件PEAKS Studio(生物信息学软件8.5版本，加拿大)软件对步骤(2)肽段的质谱原始数据进行数据库检索和多肽鉴定；设定de novo分析肽平均置信度评分≥50％，数据库搜索对前体蛋白和片段质量的误差范围分别为10ppm和0.1Da，选取氧化为+15.99、羟基化为+15.99、蛋白N端乙酰化为+42.01、去酰胺化为+0.98、去甲基化为+28.03修饰为可变修饰，乙酰烷基化为+57.02修饰作为固定修饰，以非特异性肽裂解；以实验室转录组测序构建的蛋白组序列自建库为数据库模板，对蟾酥亲和多肽序列进行筛选和鉴定。
作为优选方案，以上所述的从蟾酥中筛选分离肿瘤细胞亲和肽的方法，步骤(1)样本处理方法为：
取200mg蟾酥粉末溶于2ml超纯水中，涡旋混匀，超声破碎2min并重复2次。冰水浴超声提取30min，14000r离心，15min，4℃，取出上清；用10KD超滤管进行超滤，8000r/min离心，40min，4℃，取下层溶液合并；取1ml样品挥干，PBS复溶；并双缩脲法测定多肽浓度，得到细胞连续亲和实验的多肽样本。
作为优选方案，以上所述的从蟾酥中筛选分离肿瘤细胞亲和肽的方法，步骤(2)质谱分析的条件为：
Nano-LC Oribitrap Velos Pro条件
液相为DIONEXULTIMATE 3000系统，色谱柱：Thermo公司色谱柱：AcclaimPepMap100(100μm×2cm，NanoViper C18，5μm，
Figure BDA0002390333410000031
)；自制柱：
Figure BDA0002390333410000032
流动相A：含0.1％甲酸的4％乙腈，流动相B：含0.1％甲酸的96％乙腈；流速300nL/min，自动进样，上样4μL；梯度洗脱条件为：0～10min，1％B；10～12min，1％～3％B；12～82min，3％～20％B；82～96min，20％～30％B；96～100min，30％～90％B；100～108min，90％B；108～109min，90％～1％B；109～120min，1％B；分析时间为120min；
质谱检测条件：LTQ Orbitrap Velos Pro高分辨质谱仪，正离子扫描方式，一级质谱扫描范围m/z 350～1800Da，分辨率60000。一级质谱里选取信号最强的15个母离子做二级质谱分析，动态排除功能开启，时间20s，动态排除宽度0.01，最小信号强度1500；二级质谱LTQ为CID碰撞模式，标准化碰撞能量35％，活化q值0.25，活化时间10ms。
本发明所述的从蟾酥中分离得到的肿瘤细胞亲和肽在制备防治肿瘤疾病的药物中的应用。
本发明所述的从蟾酥中分离得到的肿瘤细胞亲和肽在制备靶向给药递送系统载体中的应用。
本发明所述的从蟾酥中分离得到的肿瘤细胞亲和肽在制备肿瘤成像制剂中的应用。本发明通过多肽荧光标记法验证蟾酥多肽与肿瘤细胞跨膜亲和作用，本发明使用生物素小分子标记多肽，与肿瘤细胞生物亲和，采用FITC标记链霉亲和素荧光定位多肽。
有益效果：本发明通过对蟾酥多肽深入研究，筛选出与肿瘤细胞生物亲和作用的肿瘤亲和肽。本发明通过蟾酥多肽与肿瘤细胞体外连续亲和作用以及多肽荧光标记法筛选中药蟾酥来源的肿瘤细胞亲和肽。通过Nano-LC-MS/MS法检测与肿瘤细胞生物亲和前后蟾酥多肽组分，发现蟾酥多肽亲和前后总离子流图发生显著改变。以实验室转录组测序构建的自建库为序列模板，对质谱原始数据进行数据库检索，共鉴定313条蟾酥多肽，来源于50种前体蛋白。其中有76条肿瘤细胞亲和肽；而237条蟾酥多肽不能与肿瘤细胞发生亲和。进一步过滤掉低亲和力多肽，获得18条高亲和力肿瘤亲和肽。并且采用多肽荧光标记法定位方法，证明这些蟾酥亲和肽能够进入肿瘤细胞内，分散于细胞质内或聚集于细胞核、线粒体等细胞器。由于蟾酥多肽具有与肿瘤细胞的高度亲和性，所以可被开发并广泛应用于肿瘤疾病的治疗和作为新材料的靶向给药递送系统及肿瘤成像等用途。具有重要的应用价值。
附图说明
图1为LTQ Orbitrap Velos Pro高分辨质谱仪检测蟾酥多肽与肝癌细胞(SMMC-7721)亲和前总离子流图。
图2为LTQ Orbitrap Velos Pro高分辨质谱仪检测蟾酥多肽与肝癌细胞(SMMC-7721)亲和后总离子流图。
图3为来源于蛋白CL4590的蟾酥多肽总覆盖图。
图4为来源于蛋白Unigene2773的蟾酥多肽总覆盖图。
图5为来源于蛋白CL4590.蟾酥多肽FKAWGWPIDDATTEKL二级质谱MS/MS信息及序列解析图。
图6为来源于蛋白Unigene2773蟾酥多肽TVPFGTQFPSDIKVGTVF二级质谱MS/MS信息及序列解析图。
图7为荧光显微图像。用生物素标记buforin IIb(阳性对照)或者蟾酥多肽与Hela细胞共孵育后，采用FITC标记链霉亲和素处理后观察。(A)buforin IIb荧光显微图像。(B-E)蟾酥多肽荧光显微图像。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不应解释为限制本发明。
实施例1
1.材料与方法
1.1试剂与仪器
蟾酥(购买于江苏南京)经南京中医药大学中药鉴定教研室鉴定为蟾蜍属动物中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)的耳后腺分泌物。二硫苏糖醇(DTT)，碘乙酰胺(IAA)购自美国thermo公司，甲酸(色谱纯)，谷胱甘肽(分析纯)购自美国Sigma-Aldrich公司，氯仿(分析纯)购自南京化学试剂有限公司，乙腈(质谱纯)，甲醇(色谱纯，质谱纯)购自德国Merck公司，超纯水购自广州屈臣氏食品饮料有限公司，乙醇(分析纯)购自上海久亿化学试剂有限公司，氯化钠(分析纯)，五水合硫酸铜(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司，氢氧化钠(分析纯)购自西陇科学股份有限公司，曲拉通(分析纯)，生物素(3-磺酸基-N-羟基琥珀酰亚胺钠盐，分析纯)购自上海麦克林生化科技有限公司，FITC标记链霉亲和素购自北京索莱宝科技有限公司，OasisHLB脱盐柱购自美国waters公司等。
纳升级液相色谱系统：DIONEXULTIMATE 3000液相(美国DIONEX公司)；高分辨质谱系统：LTQ-Orbitrap Velos Pro(美国Thermo公司)，色谱柱Acclaim Pepmap RSLC 50μm×15cm，NanoViper C18，2μm，100A(美国Thermo公司)；高速冷冻离心机(美国SCILOGEX公司)；超级恒温混匀仪(杭州奥盛仪器有限公司)；涡旋混匀仪(XW-80A海门市其林贝雨仪器制造有限公司)；超声波破碎仪(JY92-IIN宁波新芝生物科技股份有限公司)；超声仪(KW3200型昆山市超声仪器有限公司)；水浴锅(00105064常州国宇仪器制造有限公司)；超低温冰箱(-80)(海尔DW-86L62600100395南京庚辰科学仪器有限公司)；电子分析天平(上海精密仪器厂)，万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司，型号BSA124S-CW)，真空离心浓缩仪(湖南赫西仪器装备有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司，型号：DHG-9023A)，制冰机(格仕尼GSN-Z10011869格仕尼)高速冷冻离心机(SCILOGEX美国)，细胞培养箱。
2.实验方法
2.1试剂的配置
2.1.1二硫苏糖醇(DTT)的配制取1管DTT(7.7mg/tube，thermo)，溶于500μL超纯水，得到100mM DTT溶液，涡旋混匀。每管50μL分装后保存于-80℃保存待用。
2.1.2碘乙酰胺(IAA)的配制避光称量0.368g IAA，溶于4mL超纯水，涡旋混匀，分装每管35μL。保存于-80℃冰箱待用。
2.2样本处理
取200mg蟾酥粉末溶于2ml超纯水中，涡旋混匀，超声破碎2min并重复2次。冰水浴超声提取30min，14000r离心，15min，4℃，取出上清。用10KD超滤管进行超滤，8000r/min离心，40min，4℃，取下层溶液合并。取1ml样品挥干，PBS复溶。双缩脲法测定多肽浓度，分别稀释至蟾酥多肽浓度为3mg/mL及5mg/mL，用于细胞连续亲和实验。
2.3细胞连续亲和
肝癌细胞(SMMC-7721)接种于6孔板中，每孔1×105个，培养24h。吸出孔内液体，三个孔加入蟾酥多肽药液，另外三个孔加入PBS培养液用作对照，孵育2h。吸出上清液加入另接种有肝癌细胞的6孔板进行连续亲和，2h后取出合并药液，离心备用。以Buforin IIb与细胞的亲和为阳性对照，以PBS与细胞亲和作空白对照，以3mg/mL多肽为低剂量亲和实验组，以5mg/mL多肽为高剂量亲和实验组；各组分别取200μL，加DTT，恒温混匀仪中37℃，孵育1h，再加IAA，避光孵育45min。使用oasis HLB脱盐柱拖延，离心浓缩仪45℃挥干，加200μL0.1％甲酸水，离心(14000r，15min，4℃)，质谱分析。
2.4荧光标记实验
宫颈癌Hela细胞接种于细胞爬片，置于24孔板，每孔2×105个，过夜培养是细胞贴壁，弃上清液，PBS清洗三遍，加入生物素标记的多肽(浓度20μg/mL)培养24小时，弃上清，PBS清洗三遍，加入4％的多聚甲醛，37℃恒温孵育30min，弃上清，PBS清洗后加入0.1％的曲拉通，室温孵育10min，弃上清，PBS清洗3遍，加入2μg/mL FTTC标记的链霉亲和素避光培养两小时，取出细胞爬片，滴加一滴抗荧光猝灭剂置于荧光显微镜下观察。
2.5质谱分析
Nano-LC Oribitrap Velos Pro条件
液相为DIONEXULTIMATE 3000系统，色谱柱：Thermo公司色谱柱：AcclaimPepMap100(100μm×2cm，NanoViper C18，5μm，
Figure BDA0002390333410000061
)；自制柱：
Figure BDA0002390333410000062
流动相A：4％乙腈(0.1％甲酸)，B：96％乙腈(0.1％甲酸)；流速300nL/min，自动进样，上样4μL。梯度洗脱条件为：0～10min，1％B；10～12min，1％～3％B；12～82min，3％～20％B；82～96min，20％～30％B；96～100min，30％～90％B；100～108min，90％B；108～109min，90％～1％B；109～120min，1％B。分析时间为120min。
质谱检测条件：LTQ OrbitrapVelos Pro高分辨质谱仪，正离子扫描方式，一级质谱扫描范围m/z 350～1800Da，分辨率60000。一级质谱里选取信号最强的15个母离子做二级质谱分析，动态排除功能开启，时间20s，动态排除宽度0.01，最小信号强度1500。二级质谱LTQ为CID碰撞模式，标准化碰撞能量35％，活化q值0.25，活化时间10ms。
2.6蟾酥多肽序列解析
使用商业软件PEAKS Studio(生物信息学软件8.5版本，加拿大)软件对肽段的质谱原始数据进行数据库检索和多肽鉴定。设定de novo分析肽平均置信度(ALC)评分≥50％，数据库搜索对前体蛋白和片段质量的误差范围分别为10ppm和0.1Da，选取氧化(+15.99)、羟基化(+15.99)、蛋白N端乙酰化(+42.01)、去酰胺化(+0.98)、去甲基化(+28.03)修饰为可变修饰，乙酰烷基化(+57.02)修饰作为固定修饰，以非特异性肽裂解。以实验室转录组测序构建的蛋白组序列自建库为数据库模板，对蟾酥亲和多肽序列进行筛选和鉴定。
3.实验结果
3.1蟾酥多肽与肝癌细胞(SMMC-7721)生物亲和前后总离子流
本实验通过钠升高效液相-双压线性离子肼高分辨组合型质谱仪(Nano-LC-OrbitrapVelos Pro)检测与肝癌细胞(SMMC-7721)连续亲和前后、分子质量小于10KD的蟾酥多肽变化。多肽样本经反相C18色谱柱分离，多肽出峰的先后顺序根据物质的脂溶性大小排列，脂溶性小的后出峰。质谱分析结果表明，水提蟾酥多肽连续亲和前在上述洗脱条件下，大多数高强度离子在32-64分钟，86-92分钟，101-104分钟和117-120分钟洗脱(图1)；蟾酥多肽连续亲和后总离子流图表明在相同洗脱条件下，大多数高强度离子洗脱时间出现显著变化，在72-86分钟，94-98分钟和112-116分钟均出现较多高强度离子(图2)；亲和后与亲和前样本相同出峰时间段相比，未出现相似强度的离子峰。
3.2蟾酥多肽二级质谱MS/MS序列解析
使用PEAKS Studio 8.5软件对质谱原始数据进行多肽鉴定，采用生物信息学手段，结合转录组测序构建的蛋白序列自建数据库，对多肽二级质谱分析并进行拼接、组装，从而获得多肽序列。对所获得多肽的蛋白来源进行整合，发现蟾酥中大量多肽主要来源于蛋白CL4590.Contig1_All，Unigene2773_All，Unigene2773_All等，来源于蛋白CL4590，Unigene2773的蟾酥多肽总覆盖图见图3，图4。此外，Peaks搜索得到的每一条多肽都可以通过二级质谱图进行解析。通常多肽肽段裂解产生的碎片离子可分为两种，其中一种含有氨基末端(a，b，c)，另一种含有羧基末端(x，y，z)。而在低能碰撞诱导裂解和高能碰撞诱导裂解中产生的离子中b离子与y离子是其中的主要离子，b-y离子在肽键位置，相邻的两个b-离子与y-离子之间相差1个氨基酸残基。peaks软件排除图谱噪音信号的干扰，通过谱图碎片离子正确标记b-y离子，由质量差值计算得到序列结果。蟾酥多肽FKAWGWPIDDATTEKL和TVPFGTQFPSDIKVGTVF及二级质谱MS/MS信息及序列解析图见图5，图6。
3.3基于自建库筛选多肽与肝癌细胞(SMMC-7721)生物亲和多肽
蟾酥多肽与肝癌细胞(SMMC-7721)亲和质谱原始数据使用PEAKS Studio 8.5软件进行数据库检索和多肽鉴定，检索时采用实验室自建数据库为模板，对蟾酥多肽序列进行筛选和鉴定，通过同源性搜索及多肽序列匹配、手动剔除重复多肽，共获得313条多肽来源于50种前体蛋白。采用连续多次肿瘤细胞亲和，使得药液中与细胞结合的物质水平不断减少，而不结合物质的水平变化较小，放大了亲和物质与非亲和物质间的浓度差，便于亲和多肽的筛选。根据细胞亲和实验前后多肽响应强度对所鉴定多肽进行挑选，设定细胞亲和前多肽响应强度是亲和后多肽强度三倍以上为潜在的亲和多肽，基于自建数据库检索共获得76条亲和后显著变化多肽，多肽连续亲和前后响应度强度及前体蛋白信息见下表1；此外，有237条多肽连续亲和前后响应度强度未表现出明显变化(亲和前多肽响应强度是亲和后多肽强度三倍内)。
3.4肿瘤细胞亲和多肽的荧光标记定位分析
为了进一步验证了蟾酥多肽与肿瘤细胞的跨膜亲和作用，采用多肽荧光标记法定位亲和肽。Buforin IIb及蟾酥多肽首先使用生物素进行标记，与Hela细胞共孵育后，采用FITC标记链霉亲和素处理后观察。结果表明，buforin IIb及蟾酥多肽与肿瘤细胞亲和后，分散于细胞质内或聚集于细胞核、线粒体等细胞器(图7)。蟾酥多肽可能与肿瘤细胞发生亲和作用发挥抗肿瘤作用。
表1蟾酥中与肝癌细胞(SMMC-7721)亲和多肽
Figure BDA0002390333410000081
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。
                         序列表
<110>  南京中医药大学
<120>  从蟾酥中分离得到的肿瘤细胞亲和肽及其筛选方法
<141>  2020-02-24
<160>  18
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400>  1
Ser Glu Ala Asp Ile Lys Val Lys Glu Leu Glu Lys Arg
1               5                   10
<210>  2
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400>  2
Leu Gly Pro Ile Gly Ser Leu Glu Asn His Tyr Leu
1               5                   10
<210>  3
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400>  3
Val Ser Lys Ala Asn Glu Leu Ile Glu Lys Tyr Gly
1               5                   10
<210>  4
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400>  4
Leu Pro Phe Pro Ile Ile Ala Asp Pro Lys Arg Asp Leu
1               5                   10
<210>  5
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400>  5
Phe Ser Gly Asn Thr Gly His Phe Thr Gln
1               5                   10
<210>  6
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<212>  PRT
<213>  人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400>  6
Thr Val Pro Pro Gly Thr Gly Pro Pro Ser Ala Ile Leu Val Gly Thr
1               5                   10                  15
Val Pro
<210>  7
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<212>  PRT
<213>  人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400>  7
Ser Glu Tyr Gln Thr Met Ser Asn Val Ser Asn Val Lys
1               5                   10
<210>  8
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400>  8
Leu Pro Ala Thr Pro Leu Arg Val Ser Leu
1               5                   10
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<212>  PRT
<213>  人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400>  9
Leu Ser Gly Gly Gln Ser Glu Glu Glu Ser Thr Val His Leu Asn
1               5                   10                  15
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<213>  人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400>  10
Phe Lys Ala Trp Gly Trp Pro Ile Asp Asp Ala Thr Thr Glu Lys Leu
1               5                   10                  15
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<212>  PRT
<213>  人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys
1               5                   10
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<212>  PRT
<213>  人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400>  12
Leu Thr Tyr Glu Arg Pro Leu Val Thr
1               5
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<212>  PRT
<213>  人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400>  13
Leu Ala Asn Glu Asp Tyr Ala Ser Leu Thr Lys
1               5                   10
<210>  14
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<212>  PRT
<213>  人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400>  14
Val Asp Leu Asn Pro Ser Asn Val Gly Trp Asn Lys Thr Thr Phe Ala
1               5                   10                  15
<210>  15
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<213>  人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400>  15
Ile Asp Ile Asp Gly Thr Thr Leu Asp Gly Asp Thr Trp Arg
1               5                   10
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<212>  PRT
<213>  人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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Ser Pro Ala Pro Ala Ala Asn Ser Glu Gly Thr Lys Ala Ser Glu Pro
1               5                   10                  15
Thr Ala
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<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400>  17
Tyr Ala Ser Leu Thr Lys Gly Ile Gln Asn Leu
1               5                   10
<210>  18
<211>  16
<212>  PRT
<213>  人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400>  18
Ile Ile Asn Gly Thr Val Pro Pro Leu Ser Asp Arg Ser Tyr Met Asn
1               5                   10                  15

Claims (1)

1.从蟾酥中分离得到的肿瘤细胞亲和肽在制备肝癌或宫颈癌靶向给药递送系统载体中的应用；或者在制备肝癌或宫颈癌成像制剂中的应用；
所述的肿瘤细胞亲和肽为FKAWGWPIDDATTEKL。
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