CN109394760A - 胡椒碱用于制备抗肿瘤药物的用途 - Google Patents

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陈临溪
李瑶
张涛
韩省力
王嗣岑
傅念
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Abstract

可靶向作用于APJ受体的中药单体胡椒碱。它能够抑制人肝癌SMMC‑7721细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人乳腺癌MDA‑MB‑231细胞和人肺腺癌A549细胞四种肿瘤细胞增殖，并对人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用最强。胡椒碱在新靶点的发现以及治疗肿瘤方面的用途。

Description

胡椒碱用于制备抗肿瘤药物的用途
技术领域
本发明涉及中药单体胡椒碱新靶点的发现以及抗肿瘤的功能和用途。
背景技术
1993年O’Dowd等利用同源性克隆的方法发现了一种血管紧张素II 1型受体相关蛋白，命名为APJ(AGTRL-1,APLNR)，是G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor，GPCR)家族成员。人APJ基因APLNR定位在11号染色体的q12区域，编码380个氨基酸残基组成的受体。APJ主要分布于肺部、心脏、肾脏、中枢神经系统和脂肪等组织，参与机体多种病理生理过程，包括炎症反应、血管生成、维持心肌收缩力、调节体液平衡等以及参与心血管疾病、肿瘤和代谢性疾病的发生发展，在多种疾病中发挥着重要作用，已经被证实成为一种新的多疾病治疗潜在靶点。目前发现有2种内源性配体(Apelin,ELABELA)可以激活APJ受体。到目前为止，虽然有越来越多的APJ先导化合物报道，但仍然没有研发出用于临床APJ受体药物。本实验室采用细胞膜色谱技术筛选出能与APJ结合的中药单体——胡椒碱。并利用Discovery Studio2.5软件，对胡椒碱进行类药性分析，结果显示，胡椒碱均具有ADME性质，属于类药性分子。胡椒碱是一种从胡椒属植物中提取的生物碱，是中国和印度常用的食品与传统药物之一，胡椒碱已被证实具有广泛的药理活性，包括抗惊厥，抗氧化，抗炎，保肝，抗菌和免疫调节。而对于它的作用靶点以及对人肝癌SMMC-7721细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人肺腺癌A549细胞这四种肿瘤细胞增殖的抑制作用，是没有被发现的。
发明内容
本申请的发明人经过多年的研究，意外地发现了中药单体胡椒碱可以结合APJ受体，并发现具有抗肿瘤的新功能。胡椒碱可以抑制人肝癌SMMC-7721细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人肺腺癌A549细胞四种肿瘤细胞增殖，并对人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用最强。
根据本发明的一个方面，提供胡椒碱用于制备药物的用途，其中该药物用于治疗人宫颈癌、人肝癌、人乳腺癌和人肺腺癌。
该药物用于抑制和治疗人宫颈癌HeLa细胞增殖、人肝癌SMMC-7721细胞增殖、人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、人肺腺癌A549细胞增殖所引起的肿瘤。
根据本发明的另一个方面，提供一种抗肿瘤药物组合物，它包含胡椒碱。该药物组合物用于治疗人宫颈癌、人肝癌、人乳腺癌和人肺腺癌。
中药单体胡椒碱可靶向作用于APJ受体。本申请还公开了所述胡椒碱在治疗肿瘤的基础研究和药物研究中的应用。
本发明涉及胡椒碱抗肿瘤新功能的发现及其相关机制的发现。本发明通过使用细胞膜色谱技术筛选出能与APJ受体结合的中药单体--胡椒碱，并发现其可以抑制人肝癌SMMC-7721细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人肺腺癌A549细胞四种肿瘤细胞增殖，并对人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用最强。本发明公开了所述胡椒碱在治疗肿瘤的基础研究和药物研究中的应用。
本发明的药物的体外实验：
优选浓度为：
本发明的有益技术效果
1、本发明的胡椒碱能够抑制人肝癌SMMC-7721细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人肺腺癌A549细胞四种肿瘤细胞增殖，并对人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用最强。
2、本发明的胡椒碱能够用于制备抗肿瘤药物组合物。
3、本发明的胡椒碱的新靶点(APJ受体)能够用于制备该靶点的结合剂或靶向药物。
附图说明：
图1-5为构建重组质粒pEGFP-N1-APJ的检测结果；
图1为PCR扩增APJ基因片段电泳图；
M为Marker DL2000，泳道1为PCR扩增的APJ基因；
图2为APJ和pEGFP-N1双酶切电泳图；
M为Marker DL2000，泳道1为双酶切后的APJ，泳道2为双酶切后的载体pEGFP-N1；
图3为重组质粒pEGFP-N1-APJ电泳图；
M1为Marker DL5000，泳道1-12为重组质粒，M2为Marker DL2000。
图4为重组质粒pEGFP-N1-APJ碱基序列；
图5为重组质粒pEGFP-N1-APJ序列比对；
图6-10为稳定转染重组质粒的检索结果；
图6为转染细胞筛选GFP荧光拍照图；
A为转染空载体pEGFP-N1的细胞，B为转染重组质粒pEGFP-N1-APJ的细胞；
图7为转染细胞总RNA电泳图；
M为Marker DL2000，泳道1-5为细胞APJ-HEK 293,泳道6为转染空载的pEGFP-N1-HEK 293细胞；
图8为RT-PCR溶解曲线(APJ Tm＝84℃，GAPDH Tm＝90℃)；
图9为APJ-HEK 293细胞中APJ mRNA表达(n＝6,**p<0.01APJ-HEK 293 vs pEGFP-N1-HEK 293,control组为HEK 293细胞组)；
图10为APJ-HEK293细胞中APJ蛋白表达水平(A：Western Blot条带图，B：灰度扫描统计图；n＝3,**p<0.01 APJ-HEK 293 vs pEGFP-N1-HEK 293)；
图11为16种中药单体在APJ-HEK-293/CMC和HEK-293/CMC中的保留时间；
图12为胡椒碱在APJ-HEK-293/CMC和HEK-293/CMC的色谱图(RT胡椒碱＝13.67min)；
图13为胡椒碱抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖(Mean±SEM,n＝5，X轴为药物浓度(μM)，*p<0.05,**p<0.01)；
图14为胡椒碱抑制人肺腺癌A549细胞增殖(Mean±SEM,n＝5，X轴为药物浓度(μM)，*p<0.05,**p<0.01)；
图15为胡椒碱抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖(Mean±SEM,n＝5，X轴为药物浓度(μM)，*p<0.05,**p<0.01)；
图16为胡椒碱抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖(Mean±SEM,n＝5，X轴为药物浓度(μM)，*p<0.05,**p<0.01)。
具体实施方式
筛选能与APJ受体结合的中药单体胡椒碱并检测其功能，如下实施例所示。以下实施用于说明本发明，但不可用来限制本发明的范围。
实施例1筛选能与APJ结合的中药单体
细胞膜色谱技术利用药物与细胞膜受体结合时的特异性亲和力，将高效液相色谱、细胞生物学、分子生物学、生物化学和受体药理学结合，将药物在体内的作用在色谱柱上进行动态模拟。通过将活性细胞膜固定在固定载体表面，制备成细胞膜固定相(CMSP)，以缓冲溶液为流动相，用色谱分析的方法研究药物或化合物与固定相上细胞膜或细胞膜受体间的相互作用。
1.构建重组质粒pEGFP-N1-APJ
人源APJ基因片段为1143bp。以目的基因片段为模板进行PCR特异性扩增，通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到分子量为1100bp左右的目的条件，与APJ cDNA大小符合。载体pEGFP-N1是一种分子量为4733bp的真核表达载体，有多个克隆位点，方便目的基因的插入。用限制性内切酶Hind III和XhoI对pEGFP-N1和PCR扩增得到的APJ目的基因分别进行双酶切(37℃，4h)，分别得到分子量大小为4700bp和1100bp的目的条带。
在将载体pEGFP-N1和APJ进行连接(过夜，4℃)后，用大肠杆菌感受态DH5α对连接的质粒进行转化。经过转化、单克隆挑菌、扩增、质粒提取等步骤后，对所得到的质粒进行验证，得到含有分子量大小分别于载体和目的基因吻合的双条带。对提取质粒的菌液进行测序，将得到的序列与Blast基因库进行比对，重组质粒的基金序列与APJ cDNA序列完全一致，无碱基突变，表明目的基因片段已成功插入载体中，重组质粒pEGFP-N1-APJ构建成功。
2.稳定转染重组质粒
以脂质体lipofectamine 2000将重组质粒pEGFP-N1-APJ转染进HEK 293细胞，实验设两组：①pEGFP-N1，②pEGFP-N1-APJ。转染6h后，观察两组细胞荧光表达情况，检测到荧光，表明质粒成功转染进细胞。通过G418筛选半个月后，观察荧光表达，发现荧光定位在细胞膜表面，与APJ是细胞膜表面受体特征一致，提示成功得到APJ-HEK293细胞。经过G418药物筛选、单克隆挑选等处理后，最终得到稳定高表达APJ的转染细胞。
待细胞长至90％时，提取细胞总RNA。将总RNA逆转录，以cDNA为模板进行实时定量检测细胞中APJ mRNA的表达，溶解曲线出现单峰。与对照组比较，APJ-HEK293细胞中表达更高水平的APJ mRNA。对APJ-HEK293细胞中的APJ蛋白表达水平进行检测，发现APJ-HEK293细胞中APJ蛋白表达水平明显高于对照组。
3.细胞膜色谱技术筛选APJ受体药物
利用筛选得到的APJ高表达细胞，取细胞膜制备固定相，根据受体-药物之间的相互作用，用细胞膜色谱技术对100种中药标准品进行药物筛选。以水为流动相，以0.2mL/min的流速进行高效液相色谱进样分析，得到16种有保留的活性成分。而在这其中，有包括细辛脂素、白花钱胡甲素、柴胡皂苷A、通关藤苷H、五味子甲素和胡椒碱6种保留时间在10min以上的活性成分。以空白的HKE 293细胞膜制备固定相，对筛选得到的16种活性成分进行假阳性排除实验,实验结果与APJ-HEK 293/CMC进行比较。经过多次重复筛选、空细胞阴性对照实验，最终得到在APJ-HEK 293/CMC出现保留的活性成分胡椒碱。
实施例2APJ受体化合物胡椒碱的抑制肿瘤细胞增殖研究
探讨胡椒碱对肿瘤细胞的作用，分别用胡椒碱处理人肝癌细胞SMMC-7721细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人肺腺癌A549细胞四种肿瘤细胞。给药处理24h后，用MTT法检测细胞细胞吸光度值，计算药物对细胞增殖的抑制率。
胡椒碱有抑制SMMC-7721、HeLa、A549、MDA-MB-231四种肿瘤细胞增殖的作用，但作用强度和特异性存在差异。在这四种肿瘤细胞中，胡椒碱对HeLa细胞作用最强，IC50为26.27μM。剩下三种细胞中，对MDA-MB-231作用稍强一些，IC50为162.97μM；其次是SMMC-7721细胞，IC50＝244.01μM。
综上所述，本发明的胡椒碱有抑制SMMC-7721、HeLa、A549、MDA-MB-231四种肿瘤细胞增殖的作用，能够用于制备相关的药物。

Claims (5)

1.胡椒碱用于制备药物的用途，其中该药物用于治疗人宫颈癌、人肝癌、人乳腺癌和人肺腺癌。
2.根据权利要求1所述的用途，其中该药物用于治疗人宫颈癌HeLa细胞增殖、人肝癌SMMC-7721细胞增殖、人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、人肺腺癌A549细胞增殖所引起的肿瘤。
3.一种抗肿瘤药物组合物，它包含胡椒碱。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，该药物组合物用于治疗人宫颈癌、人肝癌、人乳腺癌和人肺腺癌。
5.胡椒碱作为作用于APJ受体的靶向剂药物的用途。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111973621A (zh) * 2020-08-05 2020-11-24 山东陆海蓝圣生物科技股份有限公司 一种含壳寡糖的复合物及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102309484A (zh) * 2010-11-07 2012-01-11 林秀坤 胡椒碱的抗肺癌作用及其药物制剂
CN102309487A (zh) * 2010-11-07 2012-01-11 林秀坤 胡椒碱的抗肝癌作用及其药物制剂

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102309484A (zh) * 2010-11-07 2012-01-11 林秀坤 胡椒碱的抗肺癌作用及其药物制剂
CN102309487A (zh) * 2010-11-07 2012-01-11 林秀坤 胡椒碱的抗肝癌作用及其药物制剂

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MINH TRUONG DO等: "Antitumor efficacy fo piperine in the treatment of human HER2-overexpressing breast cancer cells" *
PADMAA M.PAARAKH等: "In vitro cytotoxic and in silico activity of piperine isolated from Piper nigrum fruits Linn" *
何含含等: "胡椒碱联合顺铂对肺腺癌A549细胞生长及MMP-2、VEGF的影响" *
阿荣等: "胡椒碱对诱导肝癌细胞凋亡的体外实验研究" *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111973621A (zh) * 2020-08-05 2020-11-24 山东陆海蓝圣生物科技股份有限公司 一种含壳寡糖的复合物及应用
CN111973621B (zh) * 2020-08-05 2024-01-30 山东陆海蓝圣生物科技股份有限公司 一种含壳寡糖的复合物及应用

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