CN110559444A - 蟾酥多肽在作为药物促渗剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蟾酥多肽在作为蟾蜍二烯内酯等药物促渗剂的新应用。本发明通过体外Franz扩散池以及体内透皮实验测试蟾酥多肽对蟾蜍二烯内酯的促渗效果。通过LC‑MS/MS法检测发现加入蟾酥多肽后能够使六种主要的蟾蜍二烯内酯在豚鼠皮肤内的渗透增加36.99%~91.13%。通过von Frey纤维丝刺激法验证了蟾酥多肽能够提高蟾蜍二烯内酯的抗炎镇痛能力。给予蟾酥多肽后在豚鼠右后足注射2%福尔马林，测试结果表明添加蟾酥多肽的蟾蜍二烯内酯的豚鼠右后足机械缩足阈值明显升高，在注射福尔马林30min后，机械缩足阈值增加2‑3倍。蟾酥多肽能够促进甾烯在豚鼠皮内的渗透，进而能增强其抗炎镇痛效果。

Description

蟾酥多肽在作为药物促渗剂中的应用

技术领域

本发明涉及药物技术领域，具体涉及从蟾酥中分离得到的蟾酥多肽在作为药物促渗剂中的应用。

背景技术

近年来，人们对药物经皮渗透进行了许多研究。与其它给药途径比经皮给药系统具有避免肝脏首过代谢，减少潜在的不良副作用，改善生物利用度等优点。

然而，药物渗透需要通过皮肤屏障，皮肤最外层的角质层是阻碍药物透皮吸收的主要障碍。只有少数低分子量以及中等亲脂性的化合物能够部分通过角质层，然而其渗透效率仍有待继续提高。为了促进药物的透皮渗透，人们开发了各种各样的方法包括化学增强剂，电穿孔及离子导入和微针等。

细胞穿透肽是近年来发现的，能够穿透生物屏障和细胞膜的一种肽类。细胞穿透肽一般具有较短的5-30个氨基酸序列，能够穿过生物膜并传递一些化合物如小分子、蛋白质。CPPs的历史可以追溯到1988年，研究发现Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiency Virus,HIV)转录的反式激活蛋白(Trans-activatoroftranscription,Tat)具有跨细胞膜转运的能力。Sunny Kuma的研究表明，SPACE^TM肽是一种有效的皮肤穿透增强剂，可增强表面皮肤皮质类固醇的局部定位。许多研究表明细胞穿透肽在经皮给药应用方面有很大的前景。

蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的干燥分泌物。蟾酥在人类医学史上有着重要作用，蟾酥最早记载于《药性论》，并且在张仲景，孙思邈，华佗等人的古书中均有记载。一直到现在，以蟾酥为原料制成的产品被广泛使用，如六神丸，麝香保心丸等。蟾酥中主要代谢产物包括蟾蜍二烯内酯、生物碱、甾醇、多肽以及蛋白质类化合物。目前主要实验集中在对蟾蜍二烯内酯的研究，蟾酥中含有的大量多肽类物质的功效尚不明确。因此，本发明是在现有基础上对蟾酥中的多肽类物质进行深入研究，开发其新的功效。

发明内容

本发明的目的是在蟾酥现有药理作用的基础上，对蟾酥中的多肽类物质进行深入研究，开发其作为药物促渗剂的新功效。

蟾酥多肽在作为药物促渗剂中的应用。

蟾酥多肽在作为蟾蜍二烯内酯经皮给药的促渗剂中的应用。

所述的蟾酥多肽是通过以下方法制备得到的：

取蟾酥药材，加水，加热热回流提取1～3次，每次0.5～2小时，离心取上清，合并提取液，4℃下低温静置，去除上层油；水层加入二氯甲烷萃取，萃取剩余的水层浓缩，冷冻干燥，得蟾酥水提物；取蟾酥水提物，加水溶解上大孔吸附树脂柱，用10％乙醇洗脱，减压浓缩得蟾酥多肽。

作为优选方案，所述的蟾酥多肽是通过以下方法制备得到的：

取蟾酥药材，加入10倍量的水，加热回流提取2次，每次1小时，离心取上清，合并提取液，4℃下低温静置，去除上层油；水层加入二氯甲烷萃取，少量多次，水层即为蟾酥多肽及色胺混合物，浓缩，冷冻干燥，得蟾酥水提物。取蟾酥水提物，加水溶解上DA201-C型大孔吸附树脂柱，用10％乙醇洗脱，减压浓缩得蟾酥多肽。

有益效果：本发明通过大量实验筛选，我们通过体外Franz扩散池以及体内透皮实验测试蟾酥多肽对蟾蜍二烯内酯的促渗效果。通过LC-MS/MS法检测发现加入蟾酥多肽后能够使六种主要的蟾蜍二烯内酯在豚鼠皮肤内的渗透增加36.99％～91.13％。最后，通过vonFrey纤维丝刺激法验证了蟾酥多肽能够提高蟾蜍二烯内酯的抗炎镇痛能力。给与蟾酥多肽后在豚鼠右后足注射2％福尔马林，测试结果表明添加蟾酥多肽的蟾蜍二烯内酯的豚鼠右后足机械缩足阈值明显升高，在注射福尔马林30min后，机械缩足阈值增加了2-3倍。表明，蟾酥多肽能够促进甾烯在豚鼠皮内的渗透，因而增强其抗炎镇痛效果。

附图说明

图1为正离子模式下皮肤样品的LC-MS/MS峰强度色谱。

图2为豚鼠皮肤中累积的游离型和结合型蟾蜍二烯内酯的量的柱状图。

图3为不同条件下经皮给药蟾蜍二烯内酯含量的多元分析图。

图4为局部用药1h大鼠皮肤样本中六种蟾蜍二烯内酯的含量的柱状图。

图5为采用Von Frey纤维丝刺激试验对豚鼠右后足机械缩足阈值进行评估的曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不应解释为限制本发明。

实施例1

1.材料与方法

1.1试剂与仪器

乙腈(HPLC级)和甲醇(HPLC级)购自德国Merck公司；甲酸购自美国Sigma-Aldrich公司。标准化合物,蟾毒灵(118981–201501，≥99.2％)，脂蟾毒配基(110718-201809,≥99.6％)，华蟾毒精(110803-201408年，≥99.6％)购自中国食品药品监督管理总局(中国，北京)，沙蟾毒精(180427，≥98％)，和蟾蜍他灵(180118，≥98％)，华蟾毒它灵(180318，≥98％)，蟾毒它灵(180419，≥98％)，远华蟾毒精(180427，≥98％)购自北京普天同创生物技术有限公司(中国，北京)。去离子水由Millipore公司的milliq水系统净化。

Agilent 1290型高效液相色谱仪，1290可变波长检测器(VWD)，美国Agilent公司；AB SCIEX三重四极杆质谱5500液质联用系统，美国AB SCIEX公司；TK-12D型透皮扩散试验仪；Von Frey纤维丝刺激针；D3024R冷冻离心机，美国SCJLOGEX公司；BSA124S-CW电子天平，德国Sartorius公司。

1.2药物制备

取蟾酥商品500g，加入十倍量的水热回流提取2次，每次1小时，离心取上清，合并提取液，4℃下低温静置，去除上层油。水层加入二氯甲烷萃取，少量多次，水层即为蟾酥多肽及色胺混合物，浓缩，冷冻干燥，得蟾酥水提物。取蟾酥水提物，加水溶解经DA201-C型大孔吸附树脂柱，用10％乙醇洗脱，减压浓缩得蟾酥多肽。

将上述提取后的残渣溶解于10倍的二氯甲烷中，加热回流两次提取。将提取的二氯甲烷合并后浓缩冷冻干燥，得到蟾蜍二烯内酯提取物。

1.3皮肤样本制备

所有实验中使用豚鼠(雄性，240-260g)均购自南京市青龙山动物繁殖厂(江苏，南京)。将实验豚鼠处死后，用宠物剃毛器剔除豚鼠身上的长毛，棉签蘸取8％硫化钠均匀涂抹于豚鼠身上，涂上后待毛变成微黄色后立即用温水擦洗干净，剥离豚鼠皮肤并除去皮下脂肪、血管，用蒸馏水反复冲洗干净，再用生理盐水冲洗数遍，置-80℃冰箱中冷藏备用，一周内用完。

1.4体外Franz扩散池实验

采用TK-12D药物透皮扩散仪(有效扩散面积为cm2)研究蟾酥的透皮渗透。接收室中含有8.4ml的加入10％乙醇的0.9％生理盐水。在实验开始前，皮肤样本在生理盐水中平衡半小时。准备好的皮肤样本用马蹄夹夹在扩散池之间，角质层朝上，真皮面向接收室。接收池用磁力搅拌器在以37±0.5℃，以400rpm恒速搅拌。蟾蜍二烯内酯组药物浓度4mg/ml，蟾酥多肽组蟾蜍二烯内酯药物浓度4mg/ml+蟾酥多肽3mg/ml。

1.5体内透皮实验

实验前给豚鼠ip.10％水合氯醛进行麻醉，(0.4ml/100g)，用8％硫化钠脱去豚鼠腹部鼠毛，用水洗净擦干，并检查皮肤完整性。将配制的药液(10mg/ml蟾蜍二烯内酯+6mg/ml蟾酥多肽)涂于豚鼠腹部两侧1.5cm×1.5cm的区域，每个区域内涂药100μl。在给药60min后，取下给药区域皮肤，用20％乙醇涮洗豚鼠皮肤表面的药物。将涮洗后的皮肤液氮研磨后用4ml甲醇超声提取，离心(14000rmp，4℃)取上清液过膜，测定皮肤内的蟾蜍二烯内酯的量。

2.6机械痛阈检测方法

采用von Frey纤维丝测定豚鼠右后足对机械性刺激缩足反应的阈值，豚鼠在实验前两天放置于距笼内提前适应刺激。实验前将豚鼠适应5-10min后处于安静状态。测定时，从低到高使用代表不同刺激力的纤维丝依次垂直作用于豚鼠右后足，直至纤维丝弯曲，持续2-4s，结束刺激。观察到豚鼠出现舔足、收回爪子、摇动爪子等任一行为时均认为时阳性反应。将能够产生阳性反应的最小力度纤维丝记为其机械缩足阈值。分别记录豚鼠给与福尔马林后30min，60min，90min和120min机械痛阈值。

2.7质谱分析

采用AB SCIEX Triple-QuadTM 5500测定皮肤样本内蟾酥二烯内酯含量。梯度洗脱:0～2min，80％～70％B，2～6min，70％～65％B，6～9min，65％～40％B，9～10min，40％～5％B，10～11min，5％～5％B，11～11.2min，5％～80％B，12min，停止。进样体积是5μL。质谱分析的最佳条件如下：扫描方式：正离子扫描；样品锥电压：30v；毛细管电压：3000v；源温：150℃；脱溶气体流量：998L/h；脱气温度：500℃。质量扫描范围为MS1:20Da～1974Da，MS2:2Da～2048Da。扫描时间为M1：100～2000amuc，M2：100～10000amuc。

2.8统计学处理

本实验数据采用统计分析软件Excel 2016和GraphPad Prism7软件进行统计分析和作图。数据以Mean±SEM的方式呈现，T检验用于两个独立样本的计量资料。P<0.05说明有显著性差异,P<0.01说明有极显著性差异。

2.实验结果

2.1蟾蜍二烯内酯中化学成分分析

LC-MS/MS分析得到的蟾蜍二烯内酯结果如图1所示。蟾蜍二烯内酯的主要化合物为Cinobufagin、Resibufogenin、Bufalin、Cinobufatalin、Arenobufagin、Bufotalin、Gamabufotalin。此外，还存在一些含量较低的结合型甾烯。

2.2蟾蜍二烯内酯体外透皮实验

为了测定蟾酥多肽对蟾蜍二烯内酯在体外透皮吸收的影响，通过Franz扩散池法检测蟾酥二烯内酯在豚鼠皮肤内的积累能力。用LC-MS/MS法测定给药1小时后豚鼠皮肤中蟾蜍二烯内酯的含量，用标准曲线法定量分析主要游离型蟾蜍二烯内酯(表1，2)和图2所示(图中化合物的含量(A)和相对含量(B)。数据以X±SEM表示，^*P<0.05。)，在给药1小时，在加入蟾酥多肽后，皮肤中7种主要蟾蜍二烯内酯的含量明显增加，增长率从36.99％至91.13％，其余蟾蜍二烯内酯类化合物的含量也略有增加。这些数据表明，蟾酥多肽可以改善蟾蜍二烯内酯在皮肤中的传递。

表1.皮肤中蟾蜍二烯内酯的相对含量(n＝4)

表2.蟾酥多肽对7种含量较高的游离型蟾蜍二烯内酯的含量(n＝4)。

2.3 样品中蟾蜍二烯内酯含量的多元分析

将LC-MS/MS结果进行PCA和OPLS-DA分析。主成分分析PCA可以对不同组样品的整体差异性进行初步判断，如图3不同条件下经皮给药蟾蜍二烯内酯含量的多元分析。图中A:主成分分析(PCA):●蟾蜍二烯内酯体外透皮应用1h；▲添加蟾酥多肽的蟾蜍二烯内酯体外应用1h。B:正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)，两组样品呈现明显的分离趋势，表明加入蟾酥多肽的蟾蜍二烯内酯后含量存在明显差异(R2×[1]＝0.451,R2×[2]＝0.167)。进一步采用正交偏最小二乘法OPLS-DA模型分析差异物质组成，有20个蟾蜍二烯内酯类成分VIP值＞1，包括Cinbufotalin，Cinobufagin Resibufogenin，Telocinobufagin，Bufotalin，Arenobufagin等，其中17个成分为游离型蟾蜍二烯内酯，表明蟾蜍多肽更有可能增加小分子化合物的渗透。

2.4体内透皮实验：本发明检测了蟾蜍二烯内酯在体内的皮肤积累能力。如图4所示，在体内给药1小时后，添加蟾酥多肽后皮肤中六种主要蟾蜍二烯内酯类化合物的含量有所增加。结果与体外实验结果一致，进一步证实了蟾肽可以促进丁二烯内酯的渗透。

3.5福尔马林致痛实验

为了确定蟾酥多肽在增加蟾蜍二烯内酯渗透的同时能否提高其的抗炎镇痛能力，本发明用Von Frey纤维丝刺激法对其进行了验证。当六次刺激中超过一半呈阳性时，VonFrey纤维丝的力就是机械缩足阈值。如图5(数据以X±SEM表示，^*P<0.05，^**P<0.01)结果发现，添加蟾酥多肽后豚鼠右后足机械缩足阈值明显升高。30min时，蟾蜍二烯内酯组的机械缩足阈值与模型组相似，而加入蟾酥多肽后机械缩足阈值明显升高。注射福尔马林30分钟后，加入蟾酥多肽后机械缩足阈值能够提高2-3倍(表3)。

表3.Von Frey纤维丝刺激试验测定的机械缩足阈值(n＝6)

以上实验结果表明，与单独给与蟾蜍二烯内酯相比，加入蟾酥多肽后蟾蜍二烯内酯表现出更好的经皮渗透特性，显著增强在皮肤内的累积。体内Von Frey纤维丝刺激实验表明，加入蟾酥多肽后豚鼠右后足机械缩足阈值明显升高2-3倍。这些实验表明，蟾酥多肽不但可以增强蟾蜍二烯内酯的经皮渗透，并且还能增强蟾蜍二烯内酯的抗炎镇痛能力，起到了协同增效的技术效果。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.蟾酥多肽在作为药物促渗剂中的应用。

2.蟾酥多肽在作为蟾蜍二烯内酯经皮给药的促渗剂中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，蟾酥多肽是通过以下方法制备得到的：

取蟾酥药材，加水，加热热回流提取1~3次，每次0.5~2小时，离心取上清，合并提取液，4℃下低温静置，去除上层油；水层加入二氯甲烷萃取，萃取剩余的水层浓缩，冷冻干燥，得蟾酥水提物；取蟾酥水提物，加水溶解上大孔吸附树脂柱，用10%乙醇洗脱，减压浓缩得蟾酥多肽。