CN112007167B - 蟾酥多肽在作为蟾蜍甾烯促渗剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蟾酥多肽在作为药物促渗剂中的应用；所述的蟾酥多肽为KAGFAGDDAPR、RVAPEEHPVL、NDEELNKLLG、MLANEDYASLTKGIQNL、APAVLKE、KPQGASFT、FNPFR、ATVSARN。本发明通过大量实验筛选，通过体外Franz扩散池筛选出具有促进蟾蜍甾烯等药物促渗的功能多肽。本发明筛选实验表明：FNPFR等蟾酥多肽对豚鼠皮肤中脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、华蟾毒它灵等游离型或结合型蟾蜍甾烯具有显著的促渗作用，可以促进药物吸收，取得了很好的技术效果。
Description
技术领域
本发明涉及药物技术领域，具体涉及从蟾酥中分离得到的蟾酥多肽在作为蟾蜍甾烯等药物促渗剂中的应用。
背景技术
近年来，人们对药物经皮渗透进行了许多研究。与其它给药途径比经皮给药系统具有避免肝脏首过代谢，减少潜在的不良副作用，改善生物利用度等优点。
然而，药物渗透需要通过皮肤屏障，皮肤最外层的角质层是阻碍药物透皮吸收的主要障碍。只有少数低分子量以及中等亲脂性的化合物能够部分通过角质层，然而其渗透效率仍有待继续提高。为了促进药物的透皮渗透，人们开发了各种各样的方法包括化学增强剂，电穿孔及离子导入和微针等。
细胞穿透肽是近年来发现的，能够穿透生物屏障和细胞膜的一种肽类。细胞穿透肽一般具有较短的5-30个氨基酸序列，能够穿过生物膜并传递一些化合物如小分子、蛋白质。CPPs的历史可以追溯到1988年，研究发现Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiency Virus,HIV)转录的反式激活蛋白(Trans-activatoroftranscription,Tat)具有跨细胞膜转运的能力。Sunny Kuma的研究表明，SPACETM肽是一种有效的皮肤穿透增强剂，可增强表面皮肤皮质类固醇的局部定位。许多研究表明细胞穿透肽在经皮给药应用方面有很大的前景。
蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的干燥分泌物。蟾酥在人类医学史上有着重要作用，蟾酥最早记载于《药性论》，并且在张仲景，孙思邈，华佗等人的古书中均有记载。一直到现在，以蟾酥为原料制成的产品被广泛使用，如六神丸，麝香保心丸等。蟾酥中主要代谢产物包括蟾蜍二烯内酯、生物碱、甾醇、多肽以及蛋白质类化合物。目前主要实验集中在对蟾蜍二烯内酯的研究，蟾酥中含有的大量多肽类物质的功效尚不明确。因此，本发明是在现有基础上对蟾酥中的多肽类物质进行深入研究，筛选出明显具有促进蟾蜍甾烯等药物促渗的功能多肽。
发明内容
发明目的：本发明的目的是在蟾酥现有药理作用的基础上，对蟾酥中的多肽类物质进行深入研究，筛选出明显具有促进蟾蜍甾烯等药物促渗的功能多肽。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
蟾酥多肽在作为药物促渗剂中的应用；所述的蟾酥多肽为KAGFAGDDAPR、RVAPEEHPVL、NDEELNKLLG、MLANEDYASLTKGIQNL、APAVLKE、KPQGASFT、FNPFR、ATVSARN。
蟾酥多肽在作为蟾蜍甾烯经皮给药的促渗剂中的应用；所述的蟾酥多肽为KAGFAGDDAPR、RVAPEEHPVL、NDEELNKLLG、MLANEDYASLTKGIQNL、APAVLKE、KPQGASFT、FNPFR、ATVSARN。
本发明上述的序列KAGFAGDDAPR为Lys Ala Gly Phe Ala GlyAsp AspAla ProArg
RVAPEEHPVL为Arg ValAla Pro Glu Glu His Pro Val Leu；
NDEELNKLLG为AsnAsp Glu Glu LeuAsn Lys Leu Leu Gly；
MLANEDYASLTKGIQNL为Met Leu Ala Asn Glu Asp Tyr Ala Ser Leu Thr LysGly Ile Gln Asn Leu；
APAVLKE为Ala ProAla Val Leu Lys Glu；
KPQGASFT为Lys Pro Gln GlyAla Ser Phe Thr；
FNPFR为PheAsn Pro Phe Arg；
ATVSARN为Ala Thr Val SerAlaArgAsn。
以上所述的应用，所述的蟾蜍甾烯包括脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、华蟾毒它灵、日蟾毒它灵等。
有益效果：本发明通过大量实验筛选，通过体外Franz扩散池筛选出具有促进蟾蜍甾烯等药物促渗的功能多肽。本发明筛选实验表明：FNPFR是活性评分排名第一的多肽，分数为0.98，其次为KAGFAGDDAPR，潜在活性评分为0.64。蟾酥多肽KAGFAGDDAPR(P1)和蟾酥多肽NDEELNKLLG(P3)对豚鼠皮肤中脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、华蟾毒它灵等游离型蟾蜍甾烯促渗倍数在1.2倍以上；蟾酥多肽KAGFAGDDAPR(P1)和蟾酥多肽FNPFR(P8)对日蟾毒它灵促渗倍数在2倍以上。蟾酥多肽FNPFR(P8)和蟾酥多肽ATVSARN(P9)对大部分结合型甾烯促渗倍数在1.2倍以上。蟾酥多肽APAVLKE(P6)、KPQGASFT(P7)、FNPFR(P8)、ATVSARN(P9)对大部分游离型和结合型甾烯促渗作用达到2倍以上，取得了很好的技术效果。
附图说明
图1为9条合成蟾酥多肽质谱图。
图2为给予蟾酥多肽后豚鼠皮肤内蟾蜍甾烯含量变化。
图3为给予蟾酥多肽后接受液中蟾蜍甾烯含量变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不应解释为限制本发明。
实施例1
1材料
1.1药材与试剂
乙腈(色谱级，I1043930935)和甲醇(色谱级，I0972807837)购自德国Merck公司；甲酸(色谱纯，20180418)购自天津市科密欧化学试剂有限公司，氯化钠(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)。蟾酥多肽由金斯瑞生物科技公司合成提供。
1.2仪器
AB SCIEX三重四极杆质谱5500液质联用系统，美国AB SCIEX公司；WatersXbridge C18(100mm×4.6mm，3.5μm)色谱柱；BSA124S-CW电子天平，德国Sartorius公司；D3024R冷冻离心机，美国SCJLOGEX公司；TK-12D型透皮扩散试验仪，上海锴凯科技贸易有限公司；涡旋混匀仪(XW-80A)，海门市其林贝雨仪器制造有限公司。
1.3动物
白化雄性豚鼠240g左右，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，许可证号：SCXK(苏)2017-0011。
2实验方法
2.1蟾酥多肽的合成
选择数据库搜索结果中重复出现且响应度高且具有两亲性的多肽，如KAGFAGDDAPR、RVAPEEHPVL、NDEELNKLLG、MLANEDYASLTKGIQNL等序列片段进行合成，多肽序列信息见表1所示，9条多肽的质谱图如图1所示。
表1 9条合成蟾酥多肽的序列信息
2.2合成蟾酥多肽的促渗活性验证
取一定量的蟾蜍甾烯提取物，精密称定，溶于20％乙醇体系中，在透皮实验前加入不同的蟾酥多肽配制成：(1)2mg/mL蟾蜍甾烯；(2)2mg/mL蟾蜍甾烯+4.2mg/mL蟾酥多肽P1；(3)2mg/mL蟾蜍甾烯+4.2mg/mL蟾酥多肽P2；(4)2mg/mL蟾蜍甾烯+4.2mg/mL蟾酥多肽P3；(5)2mg/mL蟾蜍甾烯+4.2mg/mL蟾酥多肽P4；(6)2mg/mL蟾蜍甾烯+4.2mg/mL蟾酥多肽P5；(7)2mg/mL蟾蜍甾烯+4.2mg/mL蟾酥多肽P6；(8)2mg/mL蟾蜍甾烯+4.2mg/mL蟾酥多肽P7；(9)2mg/mL蟾蜍甾烯+4.2mg/mL蟾酥多肽P8；(10)2mg/mL蟾蜍甾烯+4.2mg/mL蟾酥多肽P9。
采用TK-12D药物透皮扩散仪研究蟾酥的透皮渗透。接收室中加入10％乙醇生理盐水。在实验开始前，皮肤样本在生理盐水中平衡半小时。准备好的皮肤样本用马蹄夹夹在扩散池之间，角质层朝上，真皮面向接收室。接收池用磁力搅拌器在以37±0.5℃，以400rpm恒速搅拌。蟾蜍甾烯组药物浓度2mg/mL，各组多肽浓度4.2mg/mL。在给药60min后，取下给药区域皮肤，用10％乙醇涮洗豚鼠皮肤表面的药物。将涮洗后的皮肤液氮研磨后用3mL甲醇超声提取，离心(14000rpm，4℃)取上清液过膜，测定皮肤内的蟾酥量。样品渗透1h时，取样置于离心管中，过0.22μm微孔滤膜，置于进样小瓶中，待测。
2.3质谱检测
采用AB SCIEX Triple-QuadTM 5500测定皮肤样本内蟾蜍甾烯含量。梯度洗脱:0～2min，80％～70％B，2～6min，70％～65％B，6～9min，65％～40％B，9～10min，40％～5％B，10～11min，5％～5％B，11～11.2min，5％～80％B，12min，停止。进样体积是5μL。质谱分析的最佳条件如下：扫描方式：正离子扫描；样品锥电压：30v；毛细管电压：3000v；源温：150℃；脱溶气体流量：998L/h；脱溶剂气温度：500℃。质量扫描范围为MS1:20Da～1974Da，MS2:2Da～2048Da。扫描时间为M1：100～2000amuc，M2：100～10000amuc。
3实验结果
通过PeptideRanker工具对合成多肽的潜在生物活性进行评分，FNPFR是活性评分排名第一的多肽，分数为0.98，其次为KAGFAGDDAPR，潜在活性评分为0.64，这几条蟾酥多肽的活性评分越高表明该肽具有生物活性的概率越高。
质谱法测定体外透皮1h豚鼠皮肤内和接受液中蟾蜍甾烯的含量，将各多肽组测得蟾蜍甾烯的浓度与空白组比值做热图分析，见图2和图3。蟾酥多肽P1和蟾酥多肽P3对豚鼠皮肤中脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、华蟾毒它灵等游离型蟾蜍甾烯促渗倍数在1.2倍以上；蟾酥多肽P1和蟾酥多肽P8对日蟾毒它灵促渗倍数在2倍以上。蟾酥多肽P8和蟾酥多肽P9对大部分结合型甾烯促渗倍数在1.2倍以上。接受液中蟾蜍甾烯的含量变化见图3，合成的9种蟾酥多肽中，除蟾酥多肽P4外其余蟾酥多肽对蟾蜍甾烯透皮吸收均有促进作用，蟾酥多肽P6、P7、P8、P9对大部分游离型和结合型甾烯促渗作用达到2倍以上。给予蟾酥多肽后豚鼠皮肤内和接受液中五种蟾蜍甾烯总含量变化结果见表2，合成的9种蟾酥多肽中，蟾酥多肽P4没有促渗活性，其余8种蟾酥多肽对蟾蜍甾烯体外透皮吸收均有促进作用，增长率13.79％-119.26％
表2给予蟾酥多肽豚鼠皮肤内和接受液中蟾蜍甾烯含量变化(n＝4)
以上实验结果表明，并通过Franz扩散池法评价所合成的九条蟾酥多肽是否是具有促渗活性的透皮肽。细胞穿透肽一般具有5-30个氨基酸，而合成的蟾酥多肽氨基酸数在5-17，符合细胞穿透肽的一般规律。结果表明，所合成的九条蟾酥多肽中有8条蟾酥多肽对蟾蜍甾烯体外透皮吸收均有促进作用。蟾酥多肽P1和蟾酥多肽P3能够同时增加蟾蜍甾烯在豚鼠皮肤内和接受液中的渗透；蟾酥多肽P6、P7、P8、P9主要增加蟾蜍甾烯在接受液中的渗透。本研究使用高分辨质谱验证合成蟾酥多肽的促渗活性，最终合成的9条蟾酥多肽中有8条蟾酥多肽对蟾蜍甾烯体外经皮渗透有促进作用，取得了很好的技术效果。
序列表
<110> 南京中医药大学
<120> 蟾酥多肽在作为蟾蜍甾烯促渗剂中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys Leu Leu Gly
1 5 10
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Leu Ala Asn Glu Asp Tyr Ala Ser Leu Thr Lys Gly Ile Gln Asn
1 5 10 15
Leu
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Pro Ala Val Leu Lys Glu
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Lys Pro Gln Gly Ala Ser Phe Thr
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Phe Asn Pro Phe Arg
1 5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ala Thr Val Ser Ala Arg Asn
1 5
Claims (2)
1.蟾酥多肽在制备蟾蜍甾烯经皮给药的促渗剂中的应用；所述的蟾酥多肽为KAGFAGDDAPR、RVAPEEHPVL、NDEELNKLLG、MLANEDYASLTKGIQNL、APAVLKE、KPQGASFT、FNPFR或ATVSARN。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的蟾蜍甾烯选自脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、华蟾毒它灵或日蟾毒它灵。
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