CN117126696A - 一种蟾蜍油及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种蟾蜍油的制备方法，将蟾蜍内脏破碎加热后离心分离得到蟾蜍油。本发明的制备方法，使用采集完蟾酥、剥去蟾皮后的蟾蜍内脏为原料，进行提取加工制成蟾蜍油，变废为宝；本发明得到的蟾蜍油对皮肤病(炎症、湿疹等)具有明显的作用，根据其成分分析，本发明蟾蜍油还具有抗肿瘤活性。
Description
技术领域
本发明属于医药提取技术领域，具体涉及一种蟾蜍油的制备方法及其应用。
背景技术
蟾蜍作为重要的药用基原，可应用于“六神丸”、“麝香保心丸”、“梅花点舌丸”、“季德胜蛇药”、“蟾酥丸”、“蟾酥镇痛膏”、“蟾酥注射液”、“复方蟾皮胶囊”、“华蟾素”等百余种中成药中，在中医药临床治疗上应用广泛。蟾蜍的皮肤腺、耳后腺分泌出的白色浆液可加工成名贵中药蟾酥，蟾酥含多种生物成分，具有清热解毒、消肿止痛的功效，现代医学发现它有其他药物不可替代的强心、利尿、抗癌、麻醉、抗辐射、增加白血球的作用，是治疗冠心病良药，尤其是其中含有的蟾毒配基成分，具有很好的抗癌作用。蟾蜍还可加工成干蟾、蟾衣、蟾头、蟾舌、蟾肝、蟾胆等传统名贵中药，对治疗食道癌、肝癌、肾炎、白喉、流行性腮腺炎均有很好的疗效。
然而，随着科技的发展、社会的进步，造成生态环境的改变、农药化肥的过度使用、路网的分割，导致中华蟾蜍的生态环境遭到了破坏，使野生蟾蜍栖息地大大受到限制，加之人们对野生蟾蜍的滥捕，造成野生资源不断的减少，接近于枯竭，市场上以蟾蜍为原料的药材，例如蟾酥、蟾皮等，售价日见上扬，因此开展蟾蜍规模化养殖具有广阔的市场前景。
目前蟾蜍入药主要以蟾酥、蟾皮为主，采集完蟾酥、剥去蟾皮后的蟾蜍骨、肉、内脏即变为废料，造成资源的极大浪费。
但是没有任何报道提出蟾蜍油的药用价值和制备方法。因此，亟需一种蟾蜍油的制备方法将废弃的蟾蜍内脏变废为宝。
市面上常见的蛤蟆油为林蛙输卵管，如图1所示，与本发明中的蟾蜍油容易混淆。
发明内容
为了解决现有技术中的上述问题，本发明提出了一种蟾蜍油及其制备方法和应用。
第一方面，本发明提出了一种蟾蜍油的制备方法，该方法包括将蟾蜍内脏破碎加热分离得到蟾蜍油。
作为本发明的具体实施方式，该方法包括以下步骤：
S1：将蟾蜍内脏破碎，得到蟾蜍内脏糜；
S2：将步骤S1得到的蟾蜍内脏糜加热后离心分离得到蟾蜍油。
作为本发明的具体实施方式，所述步骤S1中，破碎至颗粒粒度≤5mm。
作为本发明的具体实施方式，所述步骤S2中，所述加热温度为≤95℃，优选为65℃；加热时间为≤60min，优选为30min。
作为本发明的具体实施方式，所述步骤S2中，将蟾蜍内脏糜隔水加热时还包括加入溶剂，所述溶剂包括水，优选为蒸馏水。
作为本发明的具体实施方式，所述步骤S2中，加入溶剂再加热，所述溶剂包括水，优选为蒸馏水。
作为本发明的具体实施方式，所述步骤S2中，将蟾蜍内脏糜隔水加热时还包括加入NaCl盐析，优选地，NaCl加入量为蟾蜍内脏糜质量的0.5-2％，更优选的为1％。
作为本发明的具体实施方式，所述步骤S2中，所述盐析时间为≤20min，优选为10min。
作为本发明的具体实施方式，所述步骤S2中，所述离心速率为≤10000r/min，优选为6000r/min。
作为本发明的具体实施方式，所述步骤S2中，所述离心时间为≤20min，优选为15min。
本发明中的上述原料均可自制，也可商购获得，本发明对此不作特别限定。
第二方面，本发明提供了第一方面所述的制备方法制备得到的蟾蜍油。
作为本发明的具体实施方式，本发明的蟾蜍油经高效液相色谱法可检测出含有蟾毒配基类成分，华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的总和小于100ug/g，该类成分具有公认的抗肿瘤活性。
第三方面，本发明提供了第一方面所述的制备方法制备得到的蟾蜍油或第二方面所述的蟾蜍油在皮肤病、抗肿瘤领域的应用。
具体地，皮肤病包括炎症、湿疹。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明的制备方法，采用采集完蟾酥、剥去蟾皮后的蟾蜍内脏为原料，进行提取加工制成蟾蜍油，变废为宝。
2、本发明得到的蟾蜍油对皮肤病(炎症、湿疹等)具有明显的作用，根据其成分分析，本发明蟾蜍油还具有抗肿瘤活性。
附图说明
图1为现有技术(《中国药典》)中的蛤蟆油即林蛙输卵管照片；
图2a为本发明实施例1得到的蟾蜍油照片；
图2b为本发明实施例8得到的蟾蜍油照片
图3为本发明实施例8得到的蟾蜍油显色反应测试开始的照片；
图4为本发明实施例8得到的蟾蜍油显色反应测试15min照片；
图5为本发明实施例8得到的蟾蜍油显色反应测试30min照片；
图6为石蛙油显色反应测试开始的照片；
图7为石蛙油显色反应测试10min照片；
图8为石蛙油显色反应测试20min照片；
图9为石蛙油显色反应测试30min后的照片；
图10为高效液相色谱法对本发明实施例8得到的蟾蜍油、对比例1得到的石蛙油以及蟾毒配基对照品成分指认谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但并不构成对本发明的任何限制。
本发明各实施例中所用的试剂信息为：
蟾蜍为蟾蜍科动物中华大蟾蜍(bufo bufo gargarzians cantor)；
氯化钠，分析纯，广东省精细化学品工程技术研究开发中心；
氢氧化钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
本发明各实施例中所用的仪器信息为：
CP423C电子天平，生产厂家：奥豪斯仪器(上海)有限公司；
SYG-1-2电热恒温水浴锅，生产厂家：天津市泰斯特仪器有限公司；
绞肉机九阳(Joyong)2L绞肉机S2-A808；
酸价过氧化值检测仪，型号HM-SG12，生产厂家：山东恒美电子科技有限公司；检测数据：过氧化值检测波长528nm，酸值检测波长620nm。
实施例1
本实施例提供了一种蟾蜍油的制备方法，具体细节如下：
S1：将蟾蜍内脏放入绞肉机中绞成颗粒度≤5mm的蟾蜍内脏糜；
S2：取30g蟾蜍内脏糜放入锥形瓶中，置于80℃恒温水浴锅中隔热加热45min，取出放置于室温，以6000r/min离心15min，分离得到蟾蜍油。
实施例1得到的蟾蜍油颜色金黄，如图2a所示，将蟾蜍油进行酸值、过氧化值和提油率测试，结果如表1所示。
实施例2
本实施例提供了一种蟾蜍油的制备方法，具体细节如下：
S1：将蟾蜍内脏放入绞肉机中绞成颗粒度≤5mm的蟾蜍内脏糜；
S2：取30g内脏放入锥形瓶中，按1：1物料比加入蒸馏水后，放入到80℃恒温水浴锅中45min，取出放置于室温，以6000r/min离心45min，分离蟾蜍油。
实施例2得到的蟾蜍油进行酸值、过氧化值和提油率测试，结果如表1所示。
实施例3
本实施例提供了一种蟾蜍油的制备方法，具体细节如下：
S1：将蟾蜍内脏放入绞肉机中绞成颗粒度≤5mm的蟾蜍内脏糜，
S2：取30g内脏糜放入锥形瓶中，按1:1物料比加入蒸馏水后，使用1mol/LNaOH调节PH＝8，将锥形瓶置于80℃恒温水浴锅中加热45min后，加入质量分数为1％ NaCl盐析10min，以6000r/min离心15min，分离蟾蜍油。
实施例3得到的蟾蜍油进行酸值、过氧化值和提油率测试，结果如表1所示。
表1
通过表1可以看出，实施例1中的隔水加热方法最优。
实施例4-11
实施例4-11采用实施例1的隔水加热法，制备蟾蜍油，其中，
实施例4-6中加热时间均为45min，离心转速均为6000r/min，离心时间均为15min，加热温度不同，加热温度分别为50℃、65℃、95℃；得到的蟾蜍油进行酸值、过氧化值和提油率测试，结果如表2所示。
表2
表2可以看出加热温度为65℃最优。
实施例7-9中加热温度均为65℃、离心转速均为6000r/min，离心时间均为15min，仅加热时间不同，加热时间分别为20min、30min、60min；得到的蟾蜍油进行酸值、过氧化值和提油率测试，结果如表3所示。
表3
表3可以看出加热时间为30min最优。
实施例10-11中加热温度均为65℃、加热时间均为30min，离心转速均为6000r/min，离心时间不同，离心时间分别为10min、20min。得到的蟾蜍油进行酸值、过氧化值和提油率测试，结果如表4所示。
表4
表4可以看出离心时间为15min最优。
综上，实施例8为最优制备条件，实施例8得到的蟾蜍油如图2b所示。
对比例1
取石蛙内脏，按实施例8方法制备得到石蛙油。
测试例1
将实施例1-12得到的蟾蜍油进行显色反应测试，具体方法为：
取蟾蜍油0.1ml，添加醋酐0.1ml，涡旋混匀后，添加0.1ml浓硫酸-醋酐(其中硫酸-醋酐的体积比为1：20)溶液，立即观察。其中，实施例8得到的蟾蜍油显色反应：上层溶液均为橙黄色，透明或半透明，无异味；蟾蜍油与浓硫酸-醋酐分层位置显蓝绿色环，如图1所示；振摇后，下层溶液由蓝绿色变为绿色，如图3-5所示。
这说明实施例1-12得到的油均为蟾蜍油。
对比例1得到的石蛙油，经上述方法进行显色反应测试，石蛙油与浓硫酸-醋酐分层位置没有蓝绿色环，显著区别于蟾蜍油。如图3-5所示；振摇后放置超过30分钟，下层溶液变红棕色如图6-9所示。
测试例2
高效液相色谱法，以乙腈-0.3％乙酸水作为流动相，对实施例1得到的蟾蜍油进行检测。以蟾毒配基类成分日蟾毒它灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、3-表-酯蟾毒配基作为对照品对其中成分进行指认，且同时运用相同方法提取得到的石蛙内脏油进行比对，发现，本发明蟾蜍油中含有上述蟾毒配基类成分，明显区别于石蛙油，如图10所示。
蟾毒配基(bufogenin)是强心甾体类化合物，C17位连有一个α-吡喃酮基(α-pyrone)是其结构特点。此类成分具有强心、升血压、抗炎、抗肿瘤、镇痛等活性，是蟾蜍中公认的强活性成分。尤其是其抗肿瘤活性，被世界所认可。
应用例
本应用例采用实施例8得到的蟾蜍油对皮肤病(炎症、湿疹)领域的应用，具体实验细节如下：
实验动物：20-25g的雄性BALB/c小鼠35只。
实验药物：0.1％丁酸氢化可的松乳膏，实施例1得到的蟾蜍油，生理盐水。
造模用试剂：2-4-二硝基氯苯(DNCB)，丙酮，橄榄油，蒸馏水。
实验方法：建立特应性皮炎(AD)小鼠模型，按照以下分组给药7天后，观察。
分组情况：A组：正常小鼠组；B组：DNCB致敏模型组；C组：阳性药物组；D组：蟾蜍油组，D组中分别分成两部分：D1组采用低剂量1％蟾蜍油溶解于橄榄油中，D1、D2组采用高剂量10％的蟾蜍油溶解于橄榄油中；其中A、B、C、D1、D2每组使用7只小鼠，其中5只实验，2只备用。
实验步骤如下：
1、将收到的健康小鼠适应性饲养3d后，于实验前1d称重，随机分成5组，每组7只，用电动剃须刀剔除小鼠背部2cm×2.5cm毛发备用。
2、造模第1d，使用2％二硝基氯苯溶液(含有2％ DNCB的丙酮和橄榄油按照体积比3:1的混合液)涂抹在B、C、D1、D2组小鼠背部剃毛处涂抹量为200μL，以及小鼠左耳两侧，每侧涂抹量为50μL，进行致敏，A组涂等量的丙酮和橄榄油溶液。
第3d起，使用0.5％二硝基氯苯溶液(含有0.5％ DNCB的丙酮和橄榄油按照体积比3:1的混合液)涂抹在B、C、D1、D2组小鼠背部剃毛处，涂抹量为200μL，和左耳两侧，每侧涂抹量为50μL，A组涂等量的丙酮和橄榄油溶液，每2d涂抹1次，其中B、C、D1、D2组小鼠刺激28d。
28d后小鼠背部剃毛处和左耳两侧出现红肿、剥脱、结痂、渗液等现象判断造模成功即停止造模。
治疗干预：
造模成功的B、C、D1、D2组进行给药干预，A、B组小鼠在背部涂抹200μL和左耳每侧涂抹50μL橄榄油，C组小鼠背部涂抹1.3mg和左耳每侧涂抹0.5mg0.1％丁酸氢化可的松乳膏，D1、D2组小鼠涂抹等量的含有1％蟾蜍油的橄榄油、含有10％蟾蜍油的橄榄油。
给药量：每日1次，持续给药7d。
外观及行为学指标：
评分标准：根据皮肤严重程度评分，如表5所示，每天对5组小鼠的背部皮肤严重程度进行评分记录。评分指标为0(无症状)，1(轻度症状)，2(中度症状)，3(重度症状)。实验结束后计算评分总和，评估皮炎评分。
表5皮肤严重程度评分
实验结果如表6所示：
表6
应用例的实验结论表明，本发明制备得到的蟾蜍油对于特应性皮炎(AD)小鼠具有显著的治疗效果。
综上，本发明的蟾蜍油制备方法，采用采集完蟾酥、剥去蟾皮后的蟾蜍内脏为原料，进行提取加工制成蟾蜍油，变废为宝。本发明制备得到的蟾蜍油对皮肤病(炎症、湿疹等)具有明显的作用，并且在抗肿瘤领域，具有可推测的活性。
在本发明中的提到的任何数值，如果在任何最低值和任何最高值之间只是有两个单位的间隔，则包括从最低值到最高值的每次增加一个单位的所有值。例如，如果声明一种组分的量，或诸如温度、压力、时间等工艺变量的值为50-90，在本说明书中它的意思是具体列举了51-89、52-88……以及69-71以及70-71等数值。对于非整数的值，可以适当考虑以0.1、0.01、0.001或0.0001为一单位。这仅是一些特殊指明的例子。在本申请中，以相似方式，所列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能组合都被认为已经公开。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (10)
1.一种蟾蜍油的制备方法，其特征在于，将蟾蜍内脏破碎加热、分离得到蟾蜍油。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1：将蟾蜍内脏破碎，得到蟾蜍内脏糜；
S2：将步骤S1得到的蟾蜍内脏糜加热后离心分离得到蟾蜍油。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，破碎至颗粒粒度≤5mm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，
所述加热方式包括将蟾蜍内脏糜隔水加热、加水加热以及淡碱加热；所述加热温度为≤95℃，优选为65℃；加热时间为≤60min，优选为30min。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，将蟾蜍内脏糜隔水加热时还包括加入溶剂，所述溶剂包括水，优选为蒸馏水。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，将蟾蜍内脏糜隔水加热时还包括加入NaCl盐析，优选地，NaCl加入量为蟾蜍内脏糜质量的2％以内，更优选地为1％。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述盐析时间为≤20min，优选为10min。
8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述离心速率为≤10000r/min，优选为6000r/min；所述离心时间为＜30min，优选为15min。
9.权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到的蟾蜍油。
10.权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到的蟾蜍油或权利要求8所述的蟾蜍油在皮肤病、抗肿瘤领域应用。
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