CN100427503C

CN100427503C - 内皮抑制素小分子多肽及编码该多肽的核苷酸序列和互补链

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Publication number: CN100427503C
Application number: CNB2006100105263A
Authority: CN
Inventors: 刘兴汉; 赵炜明; 林雪松
Original assignee: Harbin Medical University
Current assignee: Harbin Engineering University; Harbin Medical University
Priority date: 2006-09-08
Filing date: 2006-09-08
Publication date: 2008-10-22
Anticipated expiration: 2026-09-08
Also published as: CN1916023A

Abstract

内皮抑制素小分子多肽及编码该多肽的核苷酸序列和互补链，它涉及一种小分子多肽及编码该多肽的核苷酸序列和互补链。它解决了现有内皮抑制素分子量大，只能用于肌肉和皮下注射，静脉用药不安全和用药剂量大的缺陷。内皮抑制素小分子多肽的氨基酸序列30个氨基酸。编码内皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列全长90bp。互补链核苷酸序列全长88bp。本发明中的内皮抑制素(内皮抑制素小分子多肽)分子量小，适合静脉、肌肉和皮下注射，不产生药物沉积。本发明设计的编码内皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列和互补链通过核苷酸自动合成仪合成，经重组转化后可用生物工程方法大规模生产内皮抑制素。

Description

内皮抑制素小分子多肽及编码该多肽的核苷酸序列和互补链

技术领域

本发明涉及一种小分子多肽及编码该多肽的核苷酸序列和互补链。

背景技术

通过抑制肿瘤组织新生血管的生成，切断肿瘤细胞的营养供应，迫使肿瘤细胞停止生长，甚至死亡是目前肿瘤药物治疗的一个新热点。内皮抑制素是目前国际上公认的活性最强的新生血管生成抑制剂，美国基因重组人的内皮抑制素已经完成了III期临床试验，试验结果证实内皮抑制素对多种肿瘤都有明显地抑制、治疗作用。内皮抑制素因其具有抗肿瘤谱广、毒性低和不产生抗药性等优点，备受瞩目。但目前生产的内皮抑制素均大于180个氨基酸，不适合静脉注射，只能用于肌肉和皮下注射，长期注射易产生硬结，影响药物吸收。又由于目前的内皮抑制素是通过抑制血管生成间接限制肿瘤生长，因此治疗时间长，用药剂量大，治疗中只有达到20mg/kg时，肿瘤方能退化到初始状态，肿瘤细胞休眠，停止生长。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有内皮抑制素分子量大，只能用于肌肉和皮下注射，静脉用药不安全和用药剂量大的缺陷，而提供的一种内皮抑制素小分子多肽及编码该多肽的核苷酸序列和互补链。内皮抑制素小分子多肽的氨基酸序列为：MetHisSerHisArgAspPheGlnProValLeuHisLeuValAlaLeuAsnSerProLeuSerGlyGlyMetArgGlyAspArgGlyAsp。编码上述内皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列为：ATGCACAGCCACCGTGACTTCCAGCCTGTTCTCCACCTGGTTGCTCTCAACAGCCCTCTGTCAGGTGGTATGCGTGGTGACCGTGGTGAC。本发明编码上述内皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列全长90bp，其中T、C、G、A分别为23bp(26％)、29bp(32％)、24bp(27％)、14bp(16％)。上述内皮抑制素小分子多肽核苷酸序列的互补链核苷酸序列为：GTCACCACGGTCACCACGCATACCACCTGACAGAGGGCTGTTGAGAGCAACCAGGTGGAGAACAGGCTGGAAGTCACGGTGGCTGTGC。本发明内皮抑制素小分子多肽核苷酸序列的互补链核苷酸序列全长88bp，其中T、C、G、A分别为13bp(15)、24bp(27％)、29bp(33％)、22bp(25％)，互补链3′端缺少与内皮抑制素小分子多肽核苷酸序列5′端AT互补的两个碱基。本发明编码内皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列和互补链根据大肠杆菌对密码的偏爱性设计，编码内皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列和互补链磷酸化退火后与经Nde I和Sma I双酶切的pTYB载体重组，再转化大肠杆菌BL21(DE3)。基因工程菌BL21(DE3)经IPTG诱导，用几丁质亲和层析柱便可提取纯化浓度≥95％的内皮抑制素小分子多肽。本发明设计的编码内皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列和互补链通过核苷酸自动合成仪合成，经重组转化后可用生物工程方法大规模生产内皮抑制素。本发明中的内皮抑制素(内皮抑制素小分子多肽)分子量小，仅为30个氨基酸，适合静脉、肌肉和皮下注射，易于吸收，用药安全。本发明的内皮抑制素小分子多肽可与细胞外基质竞争和肿瘤细胞膜上的整合素结合，直接抑制肿瘤细胞的生长和转移，具有双重的抗肿瘤活性，用于治疗肿瘤，疗效好，用药剂量小。体外细胞培养实验，本发明的内皮抑制素小分子多肽(内皮抑制素)抗肿瘤活性是现有其它内皮抑制素的2～3倍，动物体内抑瘤实验抑瘤率提高11个百分点以上。

附图说明

图1是接种内皮抑制素小分子多肽30h后的鸡胚脲囊膜图，图2是接种生理盐水30h后的鸡胚脲囊膜图，图3是培养液中不加内皮抑制素小分子多肽的脐静脉内皮细胞图，图4是培养液中不加内皮抑制素小分子多肽的小鼠肝癌细胞图，图5是培养液中加入内皮抑制素小分子多肽的脐静脉内皮细胞图，图6是培养液中加入内皮抑制素小分子多肽的小鼠肝癌细胞图，图7是人肝癌细胞细胞周期图，图8是人脐静脉内皮细胞细胞周期图，图9是在培养液中加入内皮抑制素小分子多肽的人肝癌细胞细胞周期图，图10是在培养液中加入内皮抑制素小分子多肽的人脐静脉内皮细胞细胞周期图，图11是荷瘤小鼠经内皮抑制素小分子多肽治疗后的图，图12是荷瘤小鼠未经内皮抑制素小分子多肽治疗的图，图13是经内皮抑制素小分子多肽治疗的小鼠体内肿瘤的图，图14是不未经内皮抑制素小分子多肽治疗的小鼠体内肿瘤的图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式内皮抑制素小分子多肽的氨基酸序列如下所示：

MetHisSerHisArgAspPheGlnProValLeuHisLeuValAlaLeuAsnSerProLeuSerGlyGlyMetArgGlyAspArgGlyAsp。

本实施方式内皮抑制素小分子多肽(内皮抑制素)抗肿瘤活性高，为现有其它内皮抑制素的2～3倍，动物体内抑瘤实验抑瘤率提高11个百分点以上。本实施方式内皮抑制素小分子多肽(内皮抑制素)分子量只有内皮抑素的六分之一，更易于吸收，提高了用药的安全性；在保持内皮抑素通过抑制血管生成间接限制肿瘤生长活性的同时，还能直接抑制肿瘤细胞的生长和转移，提高了抗肿瘤活性，减少了用药剂量。

本实施方式内皮抑制素小分子多肽的抗肿瘤活性实验：

1、内皮抑制素小分子多肽抑制新生血管生成活性实验

用0.1μg浓度为95％的内皮抑制素小分子多肽和等体积的生理盐水分别接种9日龄鸡胚脲囊膜。30h后接种内皮抑制素小分子多肽的鸡胚脲囊膜如图1所示，没有新生血管生成；30h后接种生理盐水的鸡胚脲囊膜如图2所示，有大量新生血管生成。本实验证明本实施方式的内皮抑制素小分子多肽可有效的抑制新生血管的生成，抑制肿瘤吸收营养和生长。

2、TUNEL法检测内皮抑制素小分子多肽促进内皮细胞和小鼠肝癌细胞凋亡实验

在脐静脉内皮细胞和小鼠肝癌细胞培养液中分别加入终浓度44μg/mL的内皮抑制素小分子多肽后继续培养24小时。没有加入内皮抑制素小分子多肽的脐静脉内皮细胞如图3所示，没有加入内皮抑制素小分子多肽的小鼠肝癌细胞如图4所示，加入内皮抑制素小分子多肽的脐静脉内皮细胞如图5所示，加入内皮抑制素小分子多肽的小鼠肝癌细胞如图6所示。图3～6中凋亡细胞被荧光染成亮绿色，实验结果显示加入内皮抑制素小分子多肽凋亡细胞数明显增多，证实内皮抑制素小分子多肽对脐静脉内皮细胞和小鼠肝癌细胞都有促凋亡作用，可抑制血管生成和直接抑制肿瘤细胞的生长。

3、用流式细胞仪检测细胞周期实验

人肝癌细胞细胞周期如图7所示，人脐静脉内皮细胞细胞周期如图8所示，在培养液中加入内皮抑制素小分子多肽的人肝癌细胞细胞周期如图9所示，在培养液中加入内皮抑制素小分子多肽的人脐静脉内皮细胞细胞周期如图10所示。人肝癌细胞G₀-G₁期细胞为58.09％，加入内皮抑制素小分子多肽的人肝癌细胞细胞G₀-G₁期细胞为85.42％，人脐静脉内皮细胞G₀-G₁期细胞为57.43％，加入内皮抑制素小分子多肽的人脐静脉内皮细胞G₀-G₁期细胞为59.72％。证明内皮抑制素小分子多肽具有将肿瘤细胞、内皮细胞周期阻滞在G₀-G₁期，限制肿瘤细胞和内皮细胞的生长活性。

4、动物体内的抑瘤实验

接种小鼠肝癌细胞的小鼠随机分为两组，一组每日皮下注射内皮抑制素小分子多肽0.44μg/kg，另一组每日注射等量生理盐水，在同等条件下饲养，21天后接受内皮抑制素小分子多肽治疗的小鼠如图11所示，注射生理盐水的小鼠如图12所示。图11～12中箭头所指位置为肿瘤。将小鼠解剖取出体内肿瘤，接受内皮抑制素小分子多肽治疗的小鼠体内肿瘤直径平均为14mm，如图13所示；注射生理盐水的小鼠体内肿瘤直径平均为21mm，如图14所示。证明本实施方式内皮抑制素小分子多肽(内皮抑制素)在动物体内具有明显抑制肿瘤细胞的生长的作用。

具体实施方式二：本实施方式编码内皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列如下所示：

ATGCACAGCCACCGTGACTTCCAGCCTGTTCTCCACCTGGTTGCTCTCAACAGCCCTCTGTCAGGTGGTATGCGTGGTGACCGTGGTGAC。

本实施方式编码内皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列根据大肠杆菌对密码的偏爱性设计，编码内皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列随重组载体转化进入生物工程菌大肠杆菌BL21(DE3)后可稳定、准确地转录和翻译成内皮抑制素小分子多肽(内皮抑制素)。

具体实施方式三：本实施方式内皮抑制素小分子多肽核苷酸序列的互补链核苷酸序列如下所示：

GTCACCACGGTCACCACGCATACCACCTGACAGAGGGCTGTTGAGAGCAACCAGGTGGAGAACAGGCTGGAAGTCACGGTGGCTGTGC。

本实施方式互补链核苷酸序列3′端缺少与内皮抑制素小分子多肽核苷酸序列5′端AT互补的两个碱基。两条链经磷酸化后退火，一端是多出AT两个碱基的粘端，另一端是平端，有利于与Nde I和Sma I酶切后与质粒载体pTYB重组。

序列表

<110>哈尔滨医科大学

<120>内皮抑制素小分子多肽及编码该多肽的核苷酸序列和互补链

<160>3

<210>1

<211>90

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(90)

<223>根据内皮抑制素小分子多肽氨基酸序列和大肠杆菌对密码的偏爱性而设计。

<400>1

atg cac agc cac cgt gac ttc cag cct gtt ctc cac ctg gtt gct ctc 16

Met His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu

1 5 10 15

aac agc cct ctg tca ggt ggt atg cgt ggt gac cgt ggt gac 30

Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Asp Arg Gly Asp

20 25 30

<210>2

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>根据内皮抑制素活性片段和可与细胞外基质竞争及与肿瘤细胞膜上整合素结合的氨基酸序列而设计。

<400>2

Met His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu

1 5 10 15

Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Asp Arg Gly Asp

20 25 30

<210>3

<211>88

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据编码内皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列而设计，用于与pTYB载体重组再转化大肠杆菌BL21(DE3)。

<400>3

gtcaccacgg tcaccacgca taccacctga cagagggctg ttgagagcaa ccaggtggag 60

aacaggctgg aagtcacggt ggctgtgc 88

Claims

1、内皮抑制素小分子多肽，其特征是内皮抑制素小分子多肽的氨基酸序列如下所示：

MetHisSerHisArgAspPheGlnProValLeuHisLeuValAlaLeuAsnSerProLeuSerGlyGlyMetArgGlyAspArgGlyAsp

2、编码如权利要求1所述内皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列，其特征是编码内皮抑制素小分子多肽的核苷酸序列如下所示：

ATGCACAGCCACCGTGACTTCCAGCCTGTTCTCCACCTGGTTGCTCTCAACAGCCCTCTGTCAGGTGGTATGCGTGGTGACCGTGGTGAC

3、如权利要求2所述内皮抑制素小分子多肽核苷酸序列的互补链，其特征是互补链核苷酸序列如下所示：

GTCACCACGGTCACCACGCATACCACCTGACAGAGGGCTGTTGAGAGCAACCAGGTGGAGAACAGGCTGGAAGTCACGGTGGCTGTGC