CN117741149A - 一种用于卵巢癌细胞叶酸受体α的检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于卵巢癌细胞叶酸受体α的检测试剂盒及其应用，包括以下组分：兔抗FRa抗体试剂、阳性质控品和阴性质控品，兔抗FRa抗体试剂包括以下按重量百分比计的各组分：40%~60%兔抗FRa单克隆抗体、10%~20%Tris、5%~10%BSA、5%~10%Proclin 300和5%~10%Tween‑20；阳性质控品包括以下按重量百分比计的各组分：60%~80%卵巢癌细胞、10%~20%多聚甲醛、10%~15%磷酸氢二钠和5%~10%磷酸二氢钾；阴性质控品包括以下按重量百分比计的各组分：60%~80%人胚肾细胞293T、10%~20%多聚甲醛、10%~15%磷酸氢二钠和5%~10%磷酸二氢钾。本发明用于定性检测中性福尔马林固定‑石蜡包埋的卵巢癌组织样本中叶酸受体α蛋白的表达状态，可作为BAT8006药物的伴随诊断试剂，以辅助临床医生筛选可使用该药物治疗的卵巢癌患者。

Description

一种用于卵巢癌细胞叶酸受体α的检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于卵巢癌细胞叶酸受体α的检测试剂盒及其应用。

背景技术

卵巢癌在妇科恶性肿瘤疾病中的发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌，而且由于缺乏有效的治疗手段，卵巢癌患者的死亡率还要超过宫颈癌及子宫内膜癌之和，高居妇科癌症首位。FRa是一种细胞膜表面的糖蛋白，可介导配体完成细胞膜的内吞作用。当前已有多项临床研究指出，近90%的晚期卵巢癌组织存在FRa的表达，而在非恶性组织中，FRa的表达几乎可以忽略不计。因此，BAT8006药物能够在FRa介导下进入FRa高表达的卵巢癌肿瘤细胞中释放Exatecan（依喜替康），抑制肿瘤细胞中DNA的复制，实现抗癌作用。目前关于BAT8006药物的伴随诊断试剂鲜有研究。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于卵巢癌细胞叶酸受体α的检测试剂盒，用于定性检测中性福尔马林固定-石蜡包埋的卵巢癌组织样本中叶酸受体α蛋白的表达状态，可作为BAT8006药物的伴随诊断试剂，以辅助临床医生筛选可使用该药物治疗的卵巢癌患者。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种用于卵巢癌细胞叶酸受体α的检测试剂盒，包括以下组分：兔抗FRa抗体试剂、阳性质控品和阴性质控品。

优选地，前述兔抗FRa抗体试剂、阳性细胞保存液和阴性细胞保存液的体积比为（10~20）：（1~3）：（1~3）。

优选地，前述兔抗FRa抗体试剂包括以下按重量百分比计的各组分：40%~60%兔抗FRa单克隆抗体、10%~20%Tris、5%~10%BSA、5%~10%Proclin 300和5%~10%Tween-20。

优选地，前述阳性质控品包括以下按重量百分比计的各组分：60%~80%卵巢癌细胞、10%~20%多聚甲醛、10%~15%磷酸氢二钠和5%~10%磷酸二氢钾。

优选地，前述阴性质控品包括以下按重量百分比计的各组分：60%~80%人胚肾细胞293T、10%~20%多聚甲醛、10%~15%磷酸氢二钠和5%~10%磷酸二氢钾。

检测试剂盒的检测方法，包括以下具体步骤：

S1、对样本进行预处理，得到中性福尔马林固定-石蜡包埋的卵巢癌组织样本；

S2、使用试剂盒对组织样本进行FRa蛋白检测，根据以下公式获得TPS评分：

。

优选地，前述卵巢癌组织样本切片的厚度为4~5微米。

检测试剂盒用于作为BAT8006药物的伴随诊断试剂，BAT8006药物为注射用重组人源化抗FRa单克隆抗体-Exatecan偶联物。

本发明的有益之处在于：本试剂盒用于定性检测中性福尔马林固定-石蜡包埋的卵巢癌组织样本中叶酸受体α蛋白的表达状态，可作为BAT8006（注射用重组人源化抗FRa单克隆抗体-Exatecan偶联物）药物的伴随诊断试剂，以辅助临床医生筛选可使用该药物治疗的卵巢癌患者，TPS≥10%的卵巢癌患者，可从BAT8006药物治疗中获益更大。

附图说明

图1是染色后的肿瘤区域划分图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

一种用于卵巢癌细胞叶酸受体α的检测试剂盒，包括以下组分：兔抗FRa抗体试剂、阳性质控品和阴性质控品，抗FRa抗体试剂、阳性细胞保存液和阴性细胞保存液的体积比为（10~20）：（1~3）：（1~3）。兔抗FRa抗体试剂包括以下组分：40%~60%兔抗FRa单克隆抗体、10%~20%Tris、5%~10%BSA、5%~10%Proclin 300和5%~10%Tween-20。阳性质控品包括以下组分：60%~80%卵巢癌细胞、10%~20%多聚甲醛、10%~15%磷酸氢二钠和5%~10%磷酸二氢钾。阴性质控品包括以下组分：60%~80%人胚肾细胞293T、10%~20%多聚甲醛、10%~15%磷酸氢二钠和5%~10%磷酸二氢钾。

检测试剂盒的检测方法，包括以下具体步骤：

S1、对样本进行预处理：

（1） 样本处理：将样本放入10%中性缓冲福尔马林中固定12~72h，然后梯度酒精脱水、二甲苯透明，再用熔融石蜡包埋，石蜡温度不应超过60℃，得到中性福尔马林固定-石蜡包埋的卵巢癌组织样本，石蜡包埋组织中的肿瘤细胞含量不低于10%；

（2）组织切片：组织样本应切成4~5 µm的石蜡切片，并固定在防脱载玻片上，然后置于65±2℃烤箱中烤片1 h，石蜡切片样本应确保至少含有100个活的肿瘤细胞，并且常温保存时间不超过3个月。

S2、免疫染色：

本试剂盒应用于CATYS48全自动免疫组化仪和Leica（徕卡）全自动免疫组化平台（BOND）及其配套显色系统，将本试剂盒中的兔抗FRa抗体试剂上机识别，然后按表1设置免疫染色程序。每次染色运行前，从本试剂盒提供的阴性、阳性细胞保存液中吸取10-20 μL液体滴在载玻片上，等待自然晾干后放入95%乙醇溶液中固定15-30 min，然后和载玻片上的卵巢癌组织同时进行染色。

表1 叶酸受体α检测试剂盒（免疫组织化学法）免疫染色步骤

检测结果分析：

（1）试剂盒质控：每次染色运行前，从本试剂盒提供的阴性、阳性细胞保存液中吸取10-20 μL液体滴在载玻片上，等待自然晾干后放入95%乙醇溶液中固定15-30 min，然后和载玻片上的卵巢癌组织同时进行染色。

（2）实验室质控：使用新鲜的肾脏标本作为实验室阳性组织质控，使用新鲜的肝脏、皮肤或骨骼肌标本作为实验室阴性组织质控。质控组织尽快固定，并与患者组织使用相同的方式处理。质控组织可以监测从组织制备到染色的所有分析步骤。阳性和阴性染色组织成分可用于验证检测功能正常。

（3）分析验证：初次使用本试剂盒进行免疫染色前，应测试实验室提供的已知具有代表性FRa蛋白阳性和阴性的IHC染色结果的组织进行检测，来验证抗体的性能表现。

（4）染色解释：染色切片使用光学显微镜进行解读，解读结果之前，须评估上述试剂盒细胞质控和实验室组织质控。所有质控结果均符合下列中要求时，方可评估卵巢癌患者组织的染色结果。如果质控结果未能显示出适当的染色，患者组织标本的任何染色结果均视为不可评估，需排除潜在故障原因后重复染色程序，具体要求为：

样本一、阳性组织质控切片：

基本原理：用本试剂盒内的兔抗FRa抗体试剂处理阳性组织质控切片，以检测组织固定和抗原修复等过程是否正常。阳性质控组织只用于监测组织处理过程和检测试剂是否正确，而不能作为患者样本的辅助诊断。

要求：组织样本选用与患者样本具有相同肿瘤标志物的活检或外科手术样本，并以相同方式进行固定、包埋等前处理和FRa蛋白检测。通常坏死或降解的细胞会有非特异性染色，需要使用完好的样本来评估染色结果。阳性组织质控选用已知弱到中等的FRa阳性染色，以便发现检测体系的轻微变化。每轮染色应当至少包括1张阳性组织质控切片。

FRa抗体试剂染色结果：

观察到棕色的膜染色；

非特异性染色≤1+。

若阳性组织质控不符合这些条件，平行检测的患者样本的结果视为无效。

样本二、阴性组织质控切片：

基本原理：用本试剂盒内的兔抗FRa抗体试剂处理阴性组织质控切片，以验证抗原抗体结合反应的特异性。也可以使用阳性组织质控中的阴性表达部位作为阴性组织质控。

要求：组织样本选用与患者样本具有相同肿瘤标志物的活检或外科手术样本，并以相同方式进行固定、包埋等前处理和FRa蛋白检测。每轮染色包括两张阴性组织质控切片。

FRa抗体试剂染色结果：

无棕色的膜染色；

非特异性染色≤1+。

若阴性组织质控不符合这些条件，平行检测的患者样本的结果视为无效。

样本三、用FRa抗体试剂染色的患者组织切片：

基本原理：用本试剂盒内的兔抗FRa抗体试剂对患者样本进行染色。

要求：阳性染色的强度参照平行染色的阴性对照试剂切片中非特异性背景染色来评估。跟所有免疫组化检测一样，阴性结果表示FRa蛋白未检出，而不是表示检测的细胞或组织中没有FRa蛋白。整张患者组织FRa染色切片中的所有存活肿瘤细胞都需进行评估并计入FRa评分。样本中必须有至少100个肿瘤细胞，才能进行 FRa评估。

染色评分判读：

卵巢癌组织中FRa蛋白的表达水平通过肿瘤比例评分（TPS）来确定，评定TBS的指导原则和方法如下所述：先在低倍镜下检查所有保存完好的肿瘤区域。在评估阳性和阴性肿瘤细胞的整体区域时，需要记住的是部分膜染色或膜染色强度1+在低倍镜下可能很难看到。再在高倍镜下，包括10倍、20倍和40倍，观察所有存在或未见膜染色的肿瘤区域。最后，在膜染色强度≥2+的情况下，评估部分或完全膜染色的活的肿瘤细胞占肿瘤区域中所有活的肿瘤细胞的百分比，如以下公式所示：

。

特异性的染色，在进行部分或全部细胞膜染色评估时，应加以区分，不纳入染色强度的评估。正常细胞和肿瘤相关免疫细胞，如浸润性淋巴细胞或巨噬细胞，不纳入FRa阳性测定评估。表2中详细列出了组织成分进行肿瘤比例评分时纳入和/或排除的情况。

表2 卵巢癌组织TPS评分时纳入/排除标准

若活的肿瘤细胞呈现出膜染色强度≥2+且TPS ≥ 10%，则应判定标本存在FRa表达。如果活的肿瘤细胞呈现出膜染色强度≥2+，则TPS越高，应判定标本的FRa表达越高，见表3。

表3 肿瘤比例评分

染色完成后，根据肿瘤的异质性等情况，可将肿瘤区域进行划分，详见图1，根据划分后的结果分别进行各区域染色比例的确定。

产品性能评价：

（1）灵敏性和特异性：用本试剂盒检测对含有各种正常和肿瘤组织的芯片进行染色，并评估是否存在免疫细胞染色（任何强度的任何免疫细胞染色），分别如表4和表5所示。

表4 通过正常组织芯片检测本试剂盒染色灵敏度/特异性

表5. 通过肿瘤组织芯片检测本试剂盒染色灵敏度/特异性

（2）精密度：采用FRa的不同TPS表达的卵巢癌组织，涵盖阴性、临界阳性和强阳性3种类型，对本试剂盒开展不同仪器之间、不同实验室（阅片者）之间、不同实验员之间、不同天之间、不同批次间、同一论检测内、同一天内的染色重复性研究。精密度的计算方式采用bootstrap法计算平均阴性百分比一致率（ANA）、平均阳性百分比一致率（APA）和总体一致率（OA），双侧95%置信区间。对于一致性结果为100%的研究，采用Wilson Score法计算TPS≥ 1%和 TPS ≥ 50%临界值的阴性百分比一致率（NPA）、阳性百分比一致率（PPA）和总体一致率（OA），双侧 95%置信区间，结果见表6和表7。

表6 室内精密度

表7 室间精密度

（3）平台间一致性：

采用FRa不同TPS表达的卵巢癌组织，在一台 CATYS48全自动免疫组化仪和一台Leica（徕卡）全自动免疫组化平台（BOND）上进行叶酸受体α免疫组织化学染色，对本试剂盒开展平台间一致性研究。所有切片使用盲法和随机化进行研究，然后根据本试剂盒染色判读标准进行TPS评分，一致性结果如表8所示。

表8 平台间一致性

（4）组织厚度

为确认最适的组织厚度，用本试剂盒对3、4、5、6和7微米厚的重复切片进行染色，并评估FRa的TPS表达。样本集包括8例卵巢癌标本，并涵盖不同FRa的TPS表达水平。

所有组织厚度均呈现了适当的FRa特异性染色和可接受的染色背景水平。在检测的厚度范围内，所有切片均未显示FRa的TPS表达明显变化。当使用本试剂盒染色时，卵巢癌标本的最佳厚度为4-5微米厚。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种用于卵巢癌细胞叶酸受体α的检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：兔抗FRa抗体试剂、阳性质控品和阴性质控品，所述兔抗FRa抗体试剂包括以下按重量百分比计的各组分：40%~60%兔抗FRa单克隆抗体、10%~20%Tris、5%~10%BSA、5%~10%Proclin 300和5%~10%Tween-20；所述阳性质控品包括以下按重量百分比计的各组分：60%~80%卵巢癌细胞、10%~20%多聚甲醛、10%~15%磷酸氢二钠和5%~10%磷酸二氢钾；所述阴性质控品包括以下按重量百分比计的各组分：60%~80%人胚肾细胞293T、10%~20%多聚甲醛、10%~15%磷酸氢二钠和5%~10%磷酸二氢钾。

2.根据权利要求1所述的一种用于卵巢癌细胞叶酸受体α的检测试剂盒，其特征在于，所述兔抗FRa抗体试剂、阳性细胞保存液和阴性细胞保存液的体积比为（10~20）：（1~3）：（1~3）。

3.一种权利要求1所述的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

S1、对样本进行预处理，得到中性福尔马林固定-石蜡包埋的卵巢癌组织样本，切片；

S2、使用试剂盒对组织样本切片进行FRa蛋白检测，根据以下公式获得TPS评分：

。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述卵巢癌组织样本切片的厚度为4~5微米。

5.权利要求1中所述的检测试剂盒的应用，其特征在于，用于作为BAT8006药物的伴随诊断试剂。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒的应用，其特征在于，所述BAT8006药物为注射用重组人源化抗FRa单克隆抗体-Exatecan偶联物。