CN118146276A - 可用于核酸递送并具有抗原递呈细胞靶向功能的糖苷化的可电离脂质分子及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可用于核酸递送并具有抗原递呈细胞靶向功能的糖苷化的可电离脂质分子及其制备方法与应用。具体涉及一种通过掺杂甘露糖及其衍生糖苷的脂质体实现树突细胞靶向递送的脂质纳米粒。本发明所解决的技术问题是采用甘露糖及其衍生物修饰的脂质，通过微流控制备得到的纳米粒子，提高了纳米粒子树突细胞靶向能力，可用于mRNA疫苗递送。
Description
技术领域
本发明属于医药生物领域，具体涉及一种可用于核酸递送并具有抗原递呈细胞靶向的糖苷化的可电离脂质及纳米脂质颗粒的制备方法与应用。
背景技术
对mRNA疫苗开发为一种治疗癌症的策略，已经在临床试验中进行。这种新型疫苗技术具有两方面的内在优势：1)安全性：mRNA作为非整合平台，不存在插入或感染人类基因组的可能性，降解产物是天然产物(核糖核酸)；2)功效：mRNA转录过程的深入了解，为重组具有稳定和高翻译能力的人工RNA提供了广泛的内容。从免疫学的角度来看，mRNA疫苗可以刺激交叉表达，从而产生有效的协同免疫反应。
mRNA疗法的原理是将含有编码抗原蛋白的mRNA导入人体，直接进行翻译，形成相应的抗原蛋白，从而诱导机体产生特异性免疫应答,达到预防免疫的作用。mRNA疫苗的一个普遍优势是它们的开发相对较快。在鉴定保护性蛋白抗原并对相应基因进行测序后，可在数周内制备mRNA，且其安全性高，与蛋白质和病毒系统相比，mRNA的制造是无细胞的，速度更快的，而且蛋白质产物具有天然的糖基化和构象特性。与寡核苷酸和大多数小分子药物靶点相比，介导刺激和抑制作用模式的能力，以及表达或替代缺陷蛋白的能力，扩大了其潜在适应症的使用范围。与传统基因疗法相比，mRNA的表达由于无插入基因组的风险而较为安全，更重要的是，mRNA药物不局限于分裂细胞，没有整合宿主基因组的风险，且会在体内自动降解。目前mRNA疗法凭借其高效、安全、丰富的治疗特点已广泛应用于罕见病、肿瘤、感染性疾病等多种疾病的治疗。
目前，mRNA在体内应用面临多方面挑战，包括其固有的免疫原性、易受酶降解以及细胞对裸mRNA的吞噬能力较低。为了提高mRNA的递送效率和降低其降解率，需要使用合适的递送载体。目前常用的递送载体主要包括聚合物材料和脂质纳米粒(LNPs)。早期采用聚合物材料进行核酸递送，但由于其毒性和难以降解，应用受限。LNPs是一种常用的递送载体，其可离子化脂质分子可以通过静电相互作用的方式包裹有效成分mRNA，保护其在递送过程中不被降解。PEG分子的修饰可避免LNPs被肾脏和巨噬细胞清除，而胆固醇的加入则可以增强LNPs膜的稳定性和融合性，促进mRNA在细胞内的摄取和胞质进入。但是，LNPs的粒子大小和细胞类型对mRNA的释放和蛋白表达有着重要的影响。因此，在制备样品时，可以通过微流控设备等方式调节流速和流速比等参数，以有效控制颗粒直径并加速蛋白表达。
发明内容
本发明的主要目的是在于提供一种用于递送mRNA的基于糖类(糖苷)为骨架的可离子化脂质分子，以实现对核酸药物的高效装载和保护，通过对脂质体分子连接糖苷，修饰上疏水链段或者胺类分子，实现对mRNA的高效地稳定地包载，细胞内吞后在胞内更快地释放mRNA并表达出目标蛋白。
本发明的发明人提出特异性抗原呈递细胞(Antigen presenting cell,APC)靶向来解决mRNA传递系统中的这一关键问题。在各种APC细胞中，树突状细胞是免疫系统中最强大的，也是唯一可以启动整个适应性免疫反应的免疫细胞。因此，这个问题可以转化为针对淋巴器官中的树突状细胞的靶向递送在这里，我们描述了糖靶向脂质纳米颗粒(STLNP)，通过协同淋巴结富集和树突状细胞表面特异性受体介导的内吞作用，一步有效地将脂质纳米颗粒递送到淋巴结内的未成熟树突状细胞。
第一方面，本发明提供了式(1)所示的具有树突细胞靶向的脂质分子，
其中，
L1、L2和L3独立地选自：单键，C1-10亚烷基或C2-10亚烯基，所述亚烷基或亚烯基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代；优选地，L1、L2和L3独立地选自单键或C1-10亚烷基，所述亚烷基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代。
G1和G2独立地选自：单键、-O-、/>-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-OC(＝O)C(＝O)O-、/>或/>
L4、L5和L6独立地选自：单键、C1-10亚烷基或C2-10亚烯基，所述亚烷基或亚烯基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代；或者，L4、L5和L6独立地选自下述二十种氨基酸中去除苯丙氨酸后形成的氨基酸残基中的任意一种：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸；
G4和G5独立地选自：单键、-S-、-O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-SC(＝O)-、-C(＝O)S-、-OC(＝O)O-、-OC(＝O)C(＝O)O-、/>或
X选自N或CH；
R1和R2独立地选自：H、C1-10烷基、C2-10烯基、C3-8环烷基、5-8元杂环基、C6-10芳基或5-10元杂芳基，所述C1-10烷基、C2-10烯基、C3-8环烷基、5-8元杂环基、C6-10芳基或5-10元杂芳基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代；
优选的，R1和R2独立地选自
S1独立地选自甘露糖及其衍生物(包括但不限于甘露糖糖苷，半乳糖糖苷，葡萄糖糖苷，岩藻糖糖苷，N-乙酰葡糖胺糖苷，N-乙酰半乳糖胺糖苷，N-乙酰甘露糖胺糖苷和葡萄糖醛酸，以及寡聚糖苷)。
最优选地，S1独立地选自甘露糖单糖糖苷、甘露糖二糖糖苷、甘露糖三糖糖苷或甘露糖四糖糖苷。值得注意的是，糖苷连接具有α和β两种手性连接(式(3))，都被涵盖。例如：式(Ⅲ)中，a表示的是甘露糖和主链以α手性连接，而b表示以β手性连接。此外，针对单糖和脂质体分子主链(式I中除S1的剩余结构)的连接以及寡聚糖之间的连接，所有的糖苷键的手性都被涵盖。
G3对应点击化学反应生成的基团；优选地，所述点击化学反应选自基于炔基叠氮的点击反应(i)，基于逆电子需求Diels-Alder点击反应(ii)，巯基-烯点击化学(iii),基于应变促进的烯烃-叠氮化物环化反应(iv)，基于Diels-Alder点击反应(v)，基于巯基-炔基点击反应(vi)，基于酯化反应(vii)或基于酰胺化反应(ix)(如式(4)所示)；更优选地，基于巯基-烯的点击化学(iii)，基于炔基叠氮的点击反应(i)或基于巯基-炔基的点击反应(vi)；最优选地，基于巯基-烯的点击化学(iii)。
当糖苷基团(S1)指代式(4)中A基团(可点击官能团)时，则脂质骨架指代式(4)中B基团(可点击官能团)，优选地，糖苷基团(S1)末端连接为炔基，烯基，叠氮，巯基，环辛炔，1,3-丁二烯，1,2,4,5-四嗪，环或辛烯；脂质骨架末端连接为叠氮，巯基，环辛烯，烯基，环辛炔或炔基。更优选地，糖苷基团(S1)末端连接为炔基或烯基；脂质骨架末端连接为叠氮或巯基。最优选地，糖苷基团(S1)连接末端为烯基，脂质骨架末端连接为巯基。
当糖苷基团(S1)指代式(4)中B基团时，脂质骨架指代式(4)中A基团(叠氮，环辛烯，烯基，环辛炔，炔基)，反之亦然。
(i)炔烃-叠加物的点击反应
(ii)逆电子需求Diels-Alder点击反应
(iii)巯基-烯的点击反应
(iv)应变促进的烯烃-叠氮化物环化反应
(v)Diels-Alder点击反应
(vi)巯基-炔点击反应
根据本发明的实施例，所述式(1)所示的脂质分子选自下述任一结构所示的化合物：
第二方面，本发明提供了上述式(1)所示的具有树突细胞靶向的脂质分子的制备方法。
本发明所提供的式(1)所示的具有树突细胞靶向的脂质分子的制备方法，包括下述步骤：(A1)首先是糖苷(1)的合成：将全乙酰化己糖分子溶解在干燥的二氯甲烷中，向混合物中加入催化剂1，然后加入其他带有羟基的分子和可点击官能团A(以3-丁烯-1-醇为例)，得到糖苷化分子；再用甲醇钠的无水甲醇溶液进行去乙酰化反应；反应结束后，添加酸性离子树脂Amberlyst 15进行中和反应得到糖苷化产物；
糖苷化：
去乙酰化水解：
(A2)其次是在可电离骨架上进行可点击化学官能团的修饰：通过带有可点击官能团B的羧酸和可电离脂质在催化剂2和催化剂3的作用下在溶剂2下以一定温度反应一定时间，得到可点击官能团B修饰的可电离脂质骨架；
(A3)：通过脂肪酸与二氯亚砜在碱1的作用下在溶剂1中以一定温度反应一定时间，得到脂肪酰氯；本步骤中所述脂肪酸R1和R2与式I中的R1和R2相对应；选自C1-20脂肪烃基或者氢(至多一个)；
(A4)：将步骤(A3)中所获得的脂肪酰氯与修饰有可点击官能团的可电离位点(可点击官能团B修饰的可电离脂质骨架)在碱2的作用下在溶剂2中以一定温度反应一定时间，得到具有不同疏水链段的脂质分子。
上述步骤中，修饰有可点击位点的可电离位点可以N-(3-氨基丙基)二乙醇胺为例，通过控制投料比例，可获得取代数量不同的N-(3-氨基丙基)二乙醇胺脂质分子。
通过控制投料比例和反应顺序，可获得取代基不同的脂质分子。如先获得R2取代的N-(3-氨基丙基)二乙醇胺衍生物，再逐步获得R1，R2取代的N-(3-氨基丙基)二乙醇胺脂质分子。
(A5)：本发明所提供的式(1)所示的脂质分子，当式(1)中R2与氧原子形成醚键时的制备方法，包括下述步骤(以下反应方程仅用于方法示意，不限于以下结构，可通过调节投料比例和顺序得到不同取代基种类和不同取代基数量的脂质分子)：
将N-(3-氨基丙基)二乙醇胺在氢化钠的作用下在溶剂1中以一定温度反应一定时间，再加入对应的卤代脂肪烃(X-R2，X代表卤素，如溴代烃)反应一定时间，得到以醚键作为连接基团的脂质分子。本方法是采用氢化钠合成醚的方法，同类型的反应不再列举；
(A6)：本发明所提供的式(1)所示的脂质分子，当R2与氧原子形成碳酸酯或氨基甲酸酯时的制备方法，包括下述步骤(以下反应方程仅用于方法示意，不限于以下结构，可通过调节投料比例和顺序得到不同取代基种类和不同取代基数量的脂质分子)：
将N-(3-氨基丙基)二乙醇胺与N,N'-羰基二咪唑或者对硝基苯基氯甲酸酯混合，在溶剂3中反应一段时间，得到羟基被活化的N-(3-氨基丙基)二乙醇胺衍生物；
(A7)：将步骤(A6)得到的羟基被活化的N-(3-氨基丙基)二乙醇胺衍生物与含有氨基的脂肪烃(R1-NH2)反应一定时间，可以得到对应的连接基团为氨基甲酸酯的脂质分子；
或，将步骤(A6)得到的羟基被活化的N-(3-氨基丙基)二乙醇胺衍生物与含有羟基的脂肪烃(R2-OH)在碱性环境下加热反应一定时间，可以得到对应的连接基团为碳酸酯的脂质分子。
(A8)将步骤(A4)中羟基被二取代的以N-(3-氨基丙基)二乙醇胺为骨架的脂质与带有可点击官能团的羧酸在催化剂2和催化剂3的作用下进行反应，得脂质分子骨架。
(A9)通过对应组别(A-B)的点击化学方法将糖苷和可电离骨架进行偶联，所述偶联的方法，包括下述任意一种：针对巯基的基于炔基叠氮的点击反应(i)，基于炔基和巯基的点击反应(vi)，基于逆电子需求Diels-Alder点击反应(ii)，针对基于Diels-Alder点击反应(v)，针对硫醇点击化学(iii)，针对基于应变促进的烯烃-叠氮化物环化反应(iv)。
上述制备方法具有普适性，适合于不同的脂肪烃链(包括饱和脂肪烃链或者不饱和脂肪烃链)，可以得到不同疏水性的脂肪酸N-(3-氨基丙基)二乙醇胺酯和可离子化脂质分子。
在一实施方式中，步骤(A2)所述包括如R1定义的基团的脂肪酸和如R2定义的基团的脂肪酸独立地选自上述对应的可选结构。
上述方法中，所述溶剂1、溶剂2、溶剂3均独立地选自二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃；
碱1、碱2、碱3均独立地选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、异丙胺、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾。
上述方法，步骤(A2)的反应温度为25-120℃，反应时间为1-24h；步骤(A3)的反应温度为0-100℃，反应时间为1-24h；步骤(A4)的反应温度为0-100℃，反应时间为1-24h。
在一实施方式中，溶剂1选自二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃；优选地，选自二氯甲烷、甲苯或N，N-二甲基甲酰胺；更优选地，选自二氯甲烷或甲苯。
在一实施方式中，碱1选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、异丙胺、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾；优选地，选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺或异丙胺；更优选地，选自吡啶，N，N-二甲基甲酰胺、三乙胺或异丙胺。
在一实施方式中，步骤(A2)的反应温度为25-120℃；优选地，为25-80℃；更优选地，为25-60℃。
在一实施方式中，步骤(A2)的反应时间为1-24h；优选地，为2-12h；更优选地，为4-6h。
在一实施方式中，溶剂2选自二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃；优选地，选自二氯甲烷、四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺；更优选地，选自二氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺。
在一实施方式中，碱2选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、异丙胺、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾；优选地，选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺或异丙胺；更优选地，选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、三乙胺或异丙胺。
在一实施方式中，步骤(A3)中的反应温度为0-100℃；优选地，为25-80℃；更优选地，为25-60℃。
在一实施方式中，步骤(A3)的反应时间为1-48h；优选地，为6-24h；更优选地，为6-12h。
在一实施方式中，溶剂3选自二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃；优选地，选自二氯甲烷、四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺；更优选地，选自二氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺。
在一实施方式中，催化剂1是用来催化糖苷化反应的。
优选地，催化剂1选自三氟化硼乙醚，四氯化钛，三氟化硼，四氯化锡，三氯化铝，氯化锌，二甲基氯化铝，双噁唑啉，2,2'-联二苯基膦-1,1'-联萘或1,1'-联萘二酚。
最优选地，催化剂1选择三氟化硼乙醚。
在一实施方式中，催化剂2选自二环己基碳二亚胺(DCC)、和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)、碳鎓六氟磷酸盐(HATU)、N'N-羰基二咪唑(CDI)、对硝基苯基氯甲酸酯中的一种；
更优选地，催化剂2选自1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)、N'N-羰基二咪唑(CDI)、对硝基苯基氯甲酸酯中的一种。
在一实施方式中，催化剂3是用来促进酯化反应的。
优选地，催化剂3选自三乙胺、二甲氨基吡啶或吡啶中的一种；更优选地，催化剂3选自二甲氨基吡啶。
在一实施方式中，催化剂4是用来引发或者催化点击反应的。
优选地，当为基于炔基叠氮的点击反应(i)，可以选择催化剂4为CuBr或Cp*RuCl(PPh3)2；当基于Diels-Alder点击反应(v)时，可以选择催化剂4为AlCl3，BF3，SnCl4或TiCl4；当基于巯基-烯点击化学(iii)时，可以选择自由基引发剂偶氮二异丁腈，安息香二甲醚或过氧化二苯甲酰。
最优选地，当基于巯基-烯点击化学(iii)时可以选择自由基引发剂偶氮二异丁腈。
第三方面，本发明提供了一种含有上述式(1)所示的具有树突细胞靶向的脂质分子的脂质载体。
本发明所提供的脂质载体，其原料包括下述组分：式(1)所示的具有树突细胞靶向的脂质分子(作为可电离脂质)、聚乙二醇脂质分子、甾族脂质分子和辅助脂质分子。
优选的，本发明中所述聚乙二醇脂质分子选自下述至少一种：2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC-0159)、1,2-二肉豆醇-丙基-3-甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPC)、PEG-二甾醇基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘油酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。更优选的，所述聚乙二醇脂质选自：2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC-0159)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPC)。最优选的，所述聚乙二醇脂质选自：1,2-二肉豆醇-丙基-3-甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)。
优选的，本发明中所述甾族脂质分子选自下述至少一种：燕麦甾醇、β-谷甾醇、菜子甾醇、麦角骨化醇、菜油甾醇、胆甾烷醇、胆固醇、粪甾醇、脱氢胆固醇、链甾醇、二氢麦角骨化醇、二氢胆固醇、二氢麦角甾醇、黑海甾醇、表胆甾醇、麦角甾醇、岩藻甾醇、六氢光甾醇、羟基胆固醇、羊毛甾醇、光甾醇、海藻甾醇、谷甾烷醇、谷甾醇、豆甾烷醇、豆甾醇、胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸和石胆酸。更优选的，甾族脂质分子选自下述至少一种：胆固醇、胆甾烷醇、麦角骨化醇、二氢胆固醇、海藻甾醇、牛磺胆酸和脱氧胆酸。进一步优选的，甾族脂质分子选自下述至少一种：胆固醇、胆甾烷醇、二氢胆固醇、海藻甾醇和脱氧胆酸。最优选的，甾族脂质分子选自胆固醇和二氢胆固醇中的至少一种。
优选的，所述辅助脂质分子选自下述至少一种：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)、油酰磷脂酰胆碱(POPC)和1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)。更优选的，所述辅助脂质分子选自下述至少一种：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)。最优选的，所述辅助脂质分子选自1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)中的至少一种。
进一步的，所述脂质载体，其原料还包括：除式(1)外的其它可电离脂质分子，如商售可电离脂质ALC-0315等。
优选的，以摩尔百分含量计，所述脂质载体包含10％-70％的上述式(1)所示的脂质分子、0％-70％的其它可电离脂质分子、1％-60％的聚乙二醇脂质分子、5％-60％的甾族脂质分子和1％-30％的辅助脂质分子。
优选的，上述式(1)所示的脂质分子的摩尔百分含量为15％-65％。
更优选的，上述式(1)所示的化合物的摩尔百分含量为30％-60％。
最优选的，上述式(1)所示的化合物的摩尔百分含量为45％-55％。
优选的，上述其它可电离脂质分子的摩尔百分含量为0％-60％。
更优选的，上述其它可电离脂质分子的摩尔百分含量为0％-55％。
最优选的，上述其它可电离脂质分子的摩尔百分含量为4.5％-5.5％。
优选的，所述聚乙二醇脂质分子的摩尔百分含量为1％-30％。
更优选的，所述聚乙二醇脂质分子的摩尔百分含量为1％-10％。
最优选的，所述聚乙二醇脂质分子的摩尔百分含量为1％-5％。
优选的，所述甾族脂质分子的摩尔百分含量为10％-50％。
更优选的，所述甾族脂质分子的摩尔百分含量为25％-45％。
最优选的，所述甾族脂质分子的摩尔百分含量为30％-40％。
优选的，所述辅助脂质分子的摩尔百分含量为1％-25％。
更优选的，所述辅助脂质分子的摩尔百分含量为5％-15％。
最优选的，所述辅助脂质分子的摩尔百分含量为8％-12％。
第四方面，本发明提供了一种包载核酸的脂质纳米颗粒。
本发明所提供的包载核酸的脂质纳米颗粒，包括本发明第三方面所述的脂质载体和核酸。
优选的，所述核酸选自DNA、mRNA、rRNA、siRNA、tRNA、microRNA、反义核酸和环状RNA中的至少一种。
更优选的，所述核酸为mRNA，包括不同序列、不同长度的mRNA。
在一些实施方案中，所述核酸为萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)mRNA、绿色荧光蛋白(GFP)mRNA或鸡卵清白蛋白(OVA)mRNA。
本发明中的所述的“鸡卵清白蛋白(OVA)mRNA”可以为编码已知OVA蛋白序列的mRNA。其中，OVA蛋白可来源于现有生物机体中存在的OVA蛋白，或来源于现有的基因数据库中的OVA蛋白序列。
优选的，所述包载核酸的脂质纳米颗粒中脂质载体与核酸的质量比为5∶1-50∶1。
更优选的，所述包载核酸的脂质纳米颗粒中脂质载体与核酸的质量比为10∶1-30∶1。
最优选的，所述核酸为mRNA，所述包载核酸的脂质纳米颗粒中脂质载体与核酸的质量比为20∶1、25∶1或30∶1。
优选的，所述包载核酸的脂质纳米颗粒的粒径为30～500nm。
更优选的，所述包载核酸的脂质纳米颗粒的粒径为30～200nm。
最优选的，粒径可以为90nm～100nm。
优选的，核酸在所述包载核酸的脂质纳米颗粒中的包封率大于50％。示例性地，包封率可以为55％、60％、65％、70％、75％、79％、80％、85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等。
第五方面，本发明提供了本发明第四方面所述的包载核酸的脂质纳米颗粒的制备方法。
本发明提供所提供的包载核酸的脂质纳米颗粒的制备方法，其包括下述步骤：
(A1)将式(1)所示的具有树突细胞靶向的脂质分子(作为可电离脂质)、聚乙二醇脂质分子、甾族脂质分子和辅助脂质分子按上述记载的比例混合，用溶剂溶解，得到有机相脂质体溶液；
(A2)将核酸用适当pH值的缓冲溶液溶解，得到水相核酸溶液；
(A3)将所述有机相脂质体溶液与所述水相核酸溶液按照一定的质量比和体积比，用微流控设备均匀混合，制备出包载核酸的脂质纳米颗粒溶液。
优选的，步骤(A1)中用于溶解脂质分子的溶剂为甲醇、乙醇、四氢呋喃、丙酮、二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺。
更优选的，步骤(A1)中的所述溶剂为乙醇、四氢呋喃或丙酮。
最优选的，步骤(A1)中的所述溶剂为乙醇。
优选的，步骤(A2)中的所述缓冲溶液为醋酸/醋酸钠溶液或柠檬酸/柠檬酸钠溶液。
更优选的，步骤(A2)中的所述缓冲溶液为柠檬酸/柠檬酸钠溶液。
优选的，步骤(A2)中的所述缓冲溶液的pH为3-9。
更优选的，步骤(A2)中的所述缓冲溶液的pH为4-6。
最优选的，步骤(A2)中的所述缓冲溶液的pH为5。
优选的，步骤(A2)中的所述缓冲溶液的浓度为1mM-1M。
更优选的，步骤(A2)中的所述缓冲溶液的浓度为20mM-500mM。
最优选的，步骤(A2)中的所述缓冲溶液的浓度为100mM。
优选的，步骤(A3)中的所述有机相脂质体溶液与水相核酸溶液的体积比为1:1-1:10。
更优选的，步骤(A3)中的所述有机相脂质体溶液与水相核酸溶液的体积比为1:1-1:5。
最优选的，步骤(A3)中的所述有机相脂质体溶液与水相核酸溶液的体积比为1:3。
优选的，步骤(A3)中的所述微流控设备可以为本领域常规使用的微流控设备，例如INanoTML/L+，迈安娜或者NanoBT，Precision NanoSystems。
第六方面，本发明提供了一种包载核酸的脂质纳米颗粒制剂。
本发明所提供的制剂，包括本发明第四方面所述的包载核酸的脂质纳米颗粒以及药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体包括但不限于：稀释剂、佐剂、赋形剂、防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂、香味剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂、分散剂、温敏材料、温度调节剂、黏附剂、稳定剂、助悬剂等。
第七方面，本发明提供了上述第一方面所述的式(1)所示的脂质分子或第二方面所述的脂质载体在制备用于递送核酸的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述核酸选自DNA、mRNA、rRNA、siRNA、tRNA、microRNA、反义核酸和环状RNA中的至少一种。
在一些实施方案中，所述核酸为mRNA，包括不同序列、不同长度的mRNA。
在一些实施方案中，所述核酸为萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)mRNA、绿色荧光蛋白(GFP)mRNA或鸡卵清白蛋白(OVA)mRNA。
在一些实施方案中，所述药物用于治疗和/或预防的疾病包括但不限于：炎性疾病、病毒感染以及癌症。
第八方面，本发明提供了上述第四方面所述的包载核酸的脂质纳米颗粒或第六方面所述的包载核酸的脂质纳米颗粒制剂在制备疫苗中的应用。
所述疫苗可为病毒疫苗(如冠状病毒疫苗)、肿瘤疫苗、狂犬疫苗等。
第九方面，本发明提供了利用上述第四方面所述的包载核酸的脂质纳米颗粒或第六方面所述的包载核酸的脂质纳米颗粒制剂治疗和/或预防受试者体内的疾病或病症的方法。
所述方法包括向有需要的受试者施用上述包载核酸的脂质纳米颗粒或上述包载核酸的脂质纳米颗粒制剂。
所述疾病包括但不限于炎性疾病、病毒感染以及癌症等。
本发明中，术语“炎性疾病”包括自身免疫性病症、过敏性病症和炎性病症，例如选自关节炎，强直性脊柱炎，炎性肠病，溃疡性结肠炎，胃炎，胰腺炎，克罗恩氏病，乳糜泻，多发性硬化，全身性红斑狼疮，类风湿性关节炎，风湿热，痛风，器官或移植排斥，急性或慢性移植物抗宿主病，慢性同种异体移植物排斥，贝切特氏病，葡萄膜炎，牛皮癣，皮炎，特异性皮炎，皮肌炎，重症肌无力，格雷夫氏病，桥本甲状腺炎，斯耶格伦综合征，和起泡病症(例如寻常天疱疮)，抗体介导的脉管炎综合征，包括ANCA-相关的血管炎，紫癜，和免疫复合血管炎(癌症或感染一期或二期)。所述过敏性病症可选自接触性皮炎，乳糜泻，哮喘，对屋尘螨的超敏性，花粉和相关的过敏原，铍中毒。
本发明中，术语“病毒感染”包括但不限于逆转录病毒感染，肝炎病毒感染，寨卡病毒感染，登革病毒感染等。
本发明中，术语“癌症”包括但不限于原发性肺癌(包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌)，转移性肺癌(肝癌肺转移、乳腺癌肺转移、结肠癌肺转移、黑色素瘤肺转移等)以及机体其他部位癌症。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、与核酸结合紧密，能够实现对核酸的高包载率和稳定保护。
2、形成的LNP生物相容性好，更加稳定。
3、静脉注射后，能够提高LNP在体内递送核酸的效率，实现核酸的高效表达。
4、由于甘露糖及其衍生物具有树突细胞靶向性等特殊的理化性质，提高了核酸在体内的表达效率以及抗原递呈效率。
5、该脂质体适合于不同核酸分子量长度，不同核酸序列的核酸递送，具有普适性。
6、本发明技术合成简单，原料价格低廉，适合大规模生产。
附图说明
图1为实施例1制备的以N-(3-氨基丙基)二乙醇胺为骨架的可电离脂质核磁验证结果图。
图2为以N-(3-氨基丙基)二乙醇胺为骨架的可电离脂质修饰有可点击官能团(巯基)后的核磁验证结果图。
图3为乙酰化甘露糖修饰有可点击化官能团(烯基)的核磁验证结果图。
图4为乙酰化甘露糖修饰有可点击化官能团(烯基)的质谱结果图。
图5为甘露糖修饰有可点击化官能团(烯基)的核磁验证结果图。
图6为甘露糖糖苷化可电离脂质的核磁验证结果图。
图7为甘露糖糖苷化可电离脂质的高分辨质谱结果图。
图8为基于不同摩尔比例甘露糖糖苷化可电离脂质组装成的脂质纳米粒子的动态光散射图。
图9为基于甘露糖糖苷化可电离脂质组装成的脂质纳米粒子的透射电镜图。
图10为基于5％-25％(摩尔浓度)甘露糖糖苷化可电离脂质组装成的脂质纳米粒子的GFP-mRNA转染DC2.4的细胞流式术图。
图11为基于15％摩尔浓度甘露糖糖苷化可电离脂质组装成的脂质纳米粒子的体内活体荧光STLNP@mRNA(Luciferase)表达图。
图12为基于15％摩尔浓度甘露糖糖苷化可电离脂质组装成的脂质纳米粒子(STLNP@OVA-peptide mRNA)的抗原呈递加强效果。
图13为基于15％摩尔浓度甘露糖糖苷化可电离脂质组装成的脂质纳米粒子(STLNP@Dir)增强淋巴结富集。
图14为基于15％摩尔浓度甘露糖糖苷化可电离脂质组装成的脂质纳米粒子(STLNP@OVA-peptide mRNA)对于DC细胞的激活作用。
图15为基于15％摩尔浓度甘露糖糖苷化可电离脂质组装成的脂质纳米粒子(STLNP@OVA-peptide mRNA)对小鼠主要器官的毒性分析结果。
具体实施方式
I.定义
在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
本公开化合物可以是不对称的，例如，具有一个或多个立体异构体。除非另有说明，所有立体异构体都包括，如对映异构体和非对映异构体。本公开的含有不对称碳原子的化合物可以以光学活性纯的形式或外消旋形式被分离出来。光学活性纯的形式可以从外消旋混合物拆分，或通过使用手性原料或手性试剂合成。外消旋体、非对映异构体、对映异构体都包括在本公开的范围之内。
在本公开中，以及/>是指取代基键合的位置。
术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。
本文中的数字范围，是指给定范围中的各个整数。例如，“C1-C6”是指该基团可具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子；“C3-C6”是指该基团可具有3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子。
术语“疏水性脂肪烃基”是指不含羟基、醛基、羧基、和含氮的氨基等亲水性基团的脂肪烃基。
术语“被取代的”是指特定原子或基团上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，只要特定原子或基团的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为酮基(即＝O)时，意味着两个氢原子被取代。除非另有规定，取代基的种类和数目在化学上可以实现的基础上可以是任意的。
当任何变量(例如Rn)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被1-5个R所取代，则所述基团可以任选地至多被5个R所取代，并且每种情况下的R都有独立的选项。此外，取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。
术语“脂肪烃基”包括饱和或不饱和，直链或支链的链状或环状烃基，不含杂原子的和含有杂原子的脂肪烃基；所述杂原子指的是氮原子、氧原子、氟原子、磷原子、硫原子、和硒原子。所述脂肪烃基的类型可选自烷基、烯基、炔基等。如术语“C1-6脂肪烃基”包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基乙烯基、1-丁烯基、1-乙基乙烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-戊烯基、1-己烯基、乙炔基，1-丙炔基，2-丙炔基，1-丁炔基，1-甲基-2-丙炔基，3-丁炔基，1-戊炔基、1-己炔基、环丙基、环丁基、环戊基和环己基等。
术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，包括直链的或支链的饱和烃基，所述烃基具有所示出的碳原子数。如术语“C1-6烷基”包括C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基、C6烷基，实例包括，但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、正己基、2-己基、3-己基等。其可以是二价的，例如亚甲基、亚乙基。
术语“取代的”或“取代”是指特定原子或基团上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，只要特定原子或基团的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为酮基(即＝O)时，意味着两个氢原子被取代。除非另有规定，取代基的种类和数目在化学上可以实现的基础上可以是任意的。取代基可以选自以下的一个、两个或更多个取代基取代：氘、卤素基团、氰基、硝基、-C(＝O)R、-C(＝O)OR’、-OC(＝O)R”、酰亚胺基、酰胺基、羟基、经取代或未经取代的胺基、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的卤代烷基、经取代或未经取代的烷氧基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的芳氧基、经取代或未经取代的杂芳基等，但不限于此。
术语“药物组合物”意指包含本公开所述化合物或其药学上可接受的盐，以及依施用方式和剂型的性质而定的至少一种选自以下药学上可接受的成分的组合物，包括但不限于：载体、稀释剂、佐剂、赋形剂、防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂、香味剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂、分散剂、温敏材料、温度调节剂、黏附剂、稳定剂、助悬剂等。
本公开的药物或药物组合物可以经肠胃外递送，即，通过静脉内(i.v.)、脑室内(i.c.v.)、皮下(s.c.)、腹膜内(i.p.)、肌内(i.m.)、皮下(s.d.)或皮内(i.d.)施用，通过直接注射，经例如快速浓注或连续输液。用于注射的配制剂可以单位剂型呈现，例如在具有添加的保藏剂的安瓿瓶或多-剂量容器中。所述组合物可以采用赋形剂(excipient)的形状，在油或水性载体中的混悬液、溶液或乳液的形式，并可以包含配制试剂如防沉降剂、稳定剂和/或分散剂。备选地，所述活性成分可以以粉末形式在使用前用适宜的载体(例如无菌无热原水)重构。
术语“炎性疾病”包括所述自身免疫、过敏性病症和炎性病症，例如选自关节炎，强直性脊柱炎，炎性肠病，溃疡性结肠炎，胃炎，胰腺炎，克罗恩氏病，乳糜泻，多发性硬化，全身性红斑狼疮，类风湿性关节炎，风湿热，痛风，器官或移植排斥，急性或慢性移植物抗宿主病，慢性同种异体移植物排斥，贝切特氏病，葡萄膜炎，牛皮癣，皮炎，特异性皮炎，皮肌炎，重症肌无力，格雷夫氏病，桥本甲状腺炎，斯耶格伦综合征，和起泡病症(例如寻常天疱疮)，抗体介导的脉管炎综合征，包括ANCA-相关的血管炎，紫癜，和免疫复合血管炎(癌症或感染一期或二期)。所述过敏性病症可尤其选自接触性皮炎，乳糜泻，哮喘，对屋尘螨的超敏性，花粉和相关的过敏原，铍中毒。所述呼吸病症可尤其选自哮喘，支气管炎，慢性阻塞性肺病(COPD)，囊性纤维化，肺水肿，肺栓塞，肺炎，肺肉瘤病，硅肺病，肺纤维化，呼吸衰竭，急性呼吸窘迫综合征，原发性肺动脉高压和肺气肿等。
术语“病毒感染”包括但不限于逆转录病毒感染，肝炎病毒感染，寨卡病毒感染，登革病毒感染等。
II.具体实施例
下面通过实施例对本发明进行具体描述，本实施例只用于对本发明作进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，均属本发明保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：合成M1分子
1.肉豆蔻酸N-(3-氨基丙基)二乙醇胺酯可离子化脂质分子的制备
首先，将N-(3-氨基丙基)二乙醇胺(13.9g,61.0mmol)溶解在乙醇(1克相当于10毫升，50毫升)中，加入2毫升三乙胺(TEA)，搅拌5分钟，然后将系统冷却至0℃(通过冰水浴)。然后将Boc2O(13.9g,61.0mmol)缓慢滴加到乙醇中[逐滴，30滴/分钟]。反应6小时后，通过TLC检测反应。产品的极性将显著降低。旋转蒸发除去乙醇溶剂，得到剩余油态粗品。粗产物经快速色谱法(硅胶，EtOAc)纯化，得到化合物2(13.9g,61.0mmol)。
将肉豆蔻酸(13.9g,61.0mmol)溶在甲苯中与二氯亚砜(9.20g,78.0mmol)在60℃反应6h，随后真空除去溶剂和二氯亚砜，得到肉豆蔻酸酰氯。将上述全部肉豆蔻酸酰氯和化合物2(4.98g,19.0mmol)溶解在二氯甲烷中，加入三乙胺(3.85g,38.0mmol)，过夜反应。得到的反应液经洗涤、干燥和浓缩后用色谱柱分离纯化，得到化合物7(13.0g,yield:93.5％)。
将化合物7(3.20g)溶解在DCM(5克，1克/10mL DCM)中，并用冰水浴冷却系统。将CF3COOH溶解在DCM(CF3COOH 10ml，V(CF3COOH)：V(DCM)＝1：2)中，并缓慢将CF3COOH溶液(30滴/分钟)滴入化合物7溶液中。反应4小时后，用大量饱和碳酸氢钠水溶液中和，直至不产生气泡。用水洗涤3次，留下有机相。水相通过DCM提取，直到紫外下TLC上没有点。将合并的DCM溶液用无水Na2SO4干燥。然后过滤和浓缩。通过旋转蒸发除去溶剂，然后得到剩余的片状化合物8(3.20g,yield:79.5％)。核磁图谱如图1所示。
2.肉豆蔻酸N-(3-氨基丙基)二乙醇胺酯可离子化脂质分子偶联可点击官能团
首先把巯基丙酸(3.20g,30.1mmol),N-羟基琥珀酰亚胺(4.0g,34.8mmol),1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(EDC)(4.0g,20.9mmol)溶解在干燥二氯甲烷中。然后再将化合物8(3.20g,yield:79.5％)和DAMP(0.1g,0,8mmol)溶解在二氯甲烷里面。再把装有巯基丙酸的体系缓慢滴入化合物8。反应12小时后，用水洗涤有机相(以除去巯基丙酸)，直到紫外下TLC上没有明显点。然后用无水硫酸钠干燥有机相。至于淋洗液，纯EtOAc用于快速色谱(硅胶)。得到剩余的片状化合物9(1.38g,yield:60.1％)。核磁图谱如图2所示。
3.基于三氟化硼乙醚的糖苷化反应
将甘露糖五乙酸酯(2g，5.1mmol)在氮气下溶解在二氯甲烷中，并用冰水浴冷却至0℃。然后超干BF3·OEt2(3.3mL，10.0mmol)非常缓慢地(10滴/分钟)滴加到封闭系统中。三氟化硼二乙醚活化体系10分钟后，将3-丁烯-1-醇滴入反应体系中。反应持续20小时后，将反应液倒入冰水中，用DCM萃取3次。将这些有机提取物合并，用饱和NaHCO3溶液(水溶液，15mL)洗涤，再次加入水(15mL)，并用硫酸镁干燥。得到的产物为粘稠的透明淡黄色粘稠物质。淋洗液采用乙醚：石油醚＝3：1(v/v)进行快速色谱(硅胶)得到化合物12(0.83g)。该化合物的核磁图谱如图3所示，质谱图如图4所示。
将化合物12(0.5克)溶于干甲醇(200毫升)中，并将甲醇钠加入甲醇中直至pH＝9。将反应混合物在室温下强烈搅拌4小时，然后用Amberlyst 15(H+)离子交换树脂中和甲醇钠。中和后，过滤琥珀色树脂颗粒，用无水硫酸钠干燥反应体系。最终得到粘性产物化合物13(0.23g)。该化合物的核磁图谱如图5所示。
4.通过点击化学实现糖苷和脂质体分子的连接
将化合物13(0.3g)、化合物9(0.1g)和安息香二甲醚(0.03g)溶解在去氧的THF(200ml)中。最终的粗品是在254nm和285nm的紫外波长下照射4小时得到的。最终产物通过HPLC纯化，得到目标产物M1(0.135g)。该化合物的核磁图谱如图6所示，质谱图如图7所示。
实施例2:包载mRNA的LNPs(LNPs@mRNA)的制备
LNP是通过挤出两相(水相和乙醇相)制成的。
乙醇相：以糖苷化可电离脂质(M1)、可电离脂质(ALC-0315)、胆固醇、1,2-二肉豆醇-丙基-3-甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)和DSPC为脂相来制备LNP。将四种组分溶解成纯乙醇。(注意：为便于溶解，溶液在使用前用热风枪(吹风机)稍微加热。DSPC和PEG-脂质将在4℃下与乙醇溶液分离)。
甘露糖糖苷化可电离脂质摩尔含量为5％的产品，各原料分别为：糖苷化可电离脂质、可电离脂质(ALC-0315)、胆固醇、PEG-脂质和DSPC的摩尔比分别为50mmol/mL、50mmol/mL、51.7mmol/mL、4.0mmol/mL和11.3mmol/mL。糖苷化可电离脂质,可电离脂质(ALC-0315)，胆固醇，PEG脂质和DSPC的体积分别为5μl,95μl，100μl，50μl和100μl。将四种组分加在一起后，加入100μl乙醇。乙醇相(含脂质的乙醇溶液)的最终体积为450μl。
甘露糖糖苷化可电离脂质摩尔含量为10％的产品，各原料分别为：糖苷化可电离脂质、可电离脂质(ALC-0315)、胆固醇、PEG-脂质和DSPC的摩尔比分别为50mmol/mL、50mmol/mL、51.7mmol/mL、4.0mmol/mL和11.3mmol/mL。糖苷化可电离脂质,可电离脂质(ALC-0315)，胆固醇，PEG脂质和DSPC的体积分别为10μl,90μl，100μl，50μl和100μl。将四种组分加在一起后，加入100μl乙醇。乙醇相(含脂质的乙醇溶液)的最终体积为450μl。
甘露糖糖苷化可电离脂质摩尔含量为15％的产品，各原料分别为：糖苷化可电离脂质、可电离脂质(ALC-0315)、胆固醇、PEG-脂质和DSPC的摩尔比分别为50mmol/mL、50mmol/mL、51.7mmol/mL、4.0mmol/mL和11.3mmol/mL。糖苷化可电离脂质,可电离脂质(ALC-0315)，胆固醇，PEG脂质和DSPC的体积分别为15μl,85μl，100μl，50μl和100μl。将四种组分加在一起后，加入100μl乙醇。乙醇相(含脂质的乙醇溶液)的最终体积为450μl。
甘露糖糖苷化可电离脂质摩尔含量为25％的产品，各原料分别为：糖苷化可电离脂质、可电离脂质(ALC-0315)、胆固醇、PEG-脂质和DSPC的摩尔比分别为50mmol/mL、50mmol/mL、51.7mmol/mL、4.0mmol/mL和11.3mmol/mL。糖苷化可电离脂质,可电离脂质(ALC-0315)，胆固醇，PEG脂质和DSPC的体积分别为25μl,75μl，100μl，50μl和100μl。将四种组分加在一起后，加入100μl乙醇。乙醇相(含脂质的乙醇溶液)的最终体积为450μl。
甘露糖糖苷化可电离脂质摩尔含量为30％的产品，各原料分别为：糖苷化可电离脂质、可电离脂质(ALC-0315)、胆固醇、PEG-脂质和DSPC的摩尔比分别为50mmol/mL、50mmol/mL、51.7mmol/mL、4.0mmol/mL和11.3mmol/mL。糖苷化可电离脂质,可电离脂质(ALC-0315)，胆固醇，PEG脂质和DSPC的体积分别为30μl,70μl，100μl，50μl和100μl。将四种组分加在一起后，加入100μl乙醇。乙醇相(含脂质的乙醇溶液)的最终体积为450μl。
水相：将mRNAGFP(SEQ ID No.1)溶解到浓度为100μg/900μL的50mM柠檬酸盐缓冲液(pH＝5)中。(注意：RNA对RNAzyme，热量和紫外线敏感。除了严格的无菌操作外，操作人员在制造过程中应小心呼吸)。此处使用的mRNA：报告基因_基因编辑_免疫抗原类现货mRNA-金斯瑞(genscript.com.cn)。
将两相装入相应的注射器后，以体积比1：3(乙醇相：水相)的速度挤出两个注射器。将挤出的LNP透析：PBS透析2小时，水透析3小时。透析过程后，为了检查LNP的质量，LNP的直径，多分散指数，zeta电位由Zetasizer Nano(英国马尔文马尔文仪器公司)测试至少5次。实验由新鲜包装的LNP进行(12小时内)。
基于不同比例甘露糖糖苷化可电离脂质组装成的脂质纳米粒子的动态光散射图如图8所示。STLNPs中最优的糖苷化脂质含量最初是通过使用0-25％的可离子化脂质的摩尔比来确定的，在此范围内，动态光散射(DLS)测量的STLNPs尺寸小于110nm，多分散性指数较低(<0.20)，对自组装没有明显影响。
基于甘露糖糖苷化可电离脂质(摩尔含量为15％)组装成的脂质纳米粒子的透射电镜图如图9所示。
表1为基于甘露糖糖苷化可电离脂质组装成的脂质纳米粒子的Zeta电位。
表1
实施例3：LNPs@mRNA的细胞内表达实验
将DC 2.4细胞以5×105密度接种在24孔板中，DMEM培养基(10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素双抗)，37℃下在含有5％CO2的气氛中孵育。细胞孵育24小时后更换新鲜培养基。将小鼠DC 2.4细胞与实施例2制备得到的LNPs@mRNAGFP(甘露糖糖苷化可电离脂质含量分别为5％、10％、15％、20％、25％的包载mRNA-GFP的LNPs)共孵育24h(每孔细胞mRNA剂量均为0.2μg)，PBS冲洗三次。使用流式细胞术观察细胞的荧光强度，细胞内绿色荧光信号来自于mRNA表达的GFP。
结果显示(图10)，可见超过50％的细胞均成功表达了绿色荧光蛋白。本发明制备的可离子化脂质体可高效递送编码GFP的mRNA并实现高效转染。
实施例4：STLNPs-Man@mRNALuciferase的体内表达实验
STLNPs-Man@mRNA-Luciferase(将实施例2制备的甘露糖糖苷化可电离脂质含量为15％的包载mRNAGFP的LNPs中的mRNAGFP替换为mRNA-Luciferase(SEQ ID No.2)，得到的产品)腿部肌肉注射给三只C57BL/6雄性小鼠25g(7周龄)(给药剂量为5μg mRNA/只小鼠给药)，6小时后测三维活体荧光成像，并测量局部注射部位的Lucifarase荧光表达情况。结果显示(图11)，小鼠体内成功表达了Luciferase蛋白。
实施例5：STLNPs@mRNA增强DC抗原呈递
按每1μg mRNA转染2×106细胞将LNP-mRNA复合物加至小鼠DC2.4细胞系中，培养24小时后，收集细胞，采用APC通道anti-mouse H-2Kb bound to SIINFEKL抗体(biolegend)对细胞染色，洗涤并用4％多聚甲醛固定，采用流式细胞仪分析DC细胞抗原提呈效率。
参照实施例2制备甘露糖糖苷化可电离脂质含量为15％的包载mRNA-OVA的STLNPs(STLNPs@OVA-peptide mRNA)与甘露糖糖苷化可电离脂质含量为0％的包载mRNA-OVA的LNPs(LNPs@OVA-peptide mRNA)。其中，mRNA-OVA的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
DC 2.4与STLNPs@OVA-peptide mRNA或LNPs@OVA-peptide mRNA共孵育24h，使用H2kb抗体染色后PBS冲洗三次。流式细胞术观察细胞的荧光强度。结果显示(图12)，与商售LNPs(ALC-0315-LNPs，脂质纳米粒(LNP)制剂服务-金斯瑞(genscript.com.cn))相比，STLNPs-Man抗原呈递能力提升5-8倍。
实施例6：STLNPs增强淋巴结富集
STLNPs@DiR的制备：
乙醇相：分别以7.5:42.5:10:38:2:0.5的摩尔比将M1、可电离脂质(ALC-0315)、1,2-硬脂酰-n-甘油-3-磷胆碱(DSPC)、胆固醇和1,2-二肉豆醇-丙基-3-甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)和1,1'-二十八烷基-3,3,3'-四甲基三碳氰碘化(DiR)溶于乙醇中。
水相：将mRNA(200μg/1mL)溶解于柠檬酸钠缓冲溶液(pH＝5)中。
将两相装入相应的注射器后，以体积比1：3(乙醇相：水相)的速度挤出两个注射器。将挤出的LNP透析：PBS透析2小时，水透析3小时。透析过程后，为了检查LNP的质量，LNP的直径，多分散指数，zeta电位由Zetasizer Nano(英国马尔文马尔文仪器公司)测试至少5次。实验由新鲜包装的LNP进行(12小时内)。
STLNPs@DiR与LNP@DiR肌肉注射100μL给C57BL/6雄性小鼠25g(7周龄)，8小时后测三维活体荧光成像。结果显示(图13)，纳米粒子主要富集在淋巴结，并且STLNP的淋巴结富集量更多。
实施例7：STLNPs@mRNA增强DCs成熟
采用实施例5中制备的STLNPs@OVA-peptide mRNA与LNPs@OVA-peptide mRNA，分别肌肉注射5μg mRNA/只给C57BL/6雄性小鼠25g(7周龄)，6小时后测DC激活因子CD80与CD86。结果显示(图14)，当运用STLNP(即STLNPs@OVA-peptide mRNA)时，CD80与CD86双阳性的高达84.79％，是空白对照组(PBS组)(26.61％)的3倍。
实施例8：STLNPs@mRNA的系统毒性分析
根据实施例7，对经过PBS和STLNPs@OVA-peptide mRNA处理的小鼠的主要器官：心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行H&E染色。
实验结果表明，经STLNPs@mRNA处理的小鼠的各主要器官均未出现明显的病变，其组织结构均与PBS保持相同(图15)。
前述对本公开的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本公开限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本公开的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本公开的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择。
Claims (19)
1.式(1)所示的具有树突细胞靶向的脂质分子：
其中，
L1、L2和L3独立地选自：单键，C1-10亚烷基或C2-10亚烯基，所述亚烷基或亚烯基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代；
G1和G2独立地选自：单键、-O-、/>-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-OC(＝O)C(＝O)O-、/>
L4、L5和L6独立地选自：单键、C1-10亚烷基或C2-10亚烯基，所述亚烷基或亚烯基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代；或者，L4、L5和L6独立地选自下述二十种氨基酸中去除苯丙氨酸后形成的氨基酸残基中的任意一种：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸；
G4和G5独立地选自：单键、-S-、-O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-SC(＝O)-、-C(＝O)S-、-OC(＝O)O-、-OC(＝O)C(＝O)O-、X选自N或CH；
R1和R2独立地选自：H、C1-10烷基、C2-10烯基、C3-8环烷基、5-8元杂环基、C6-10芳基或5-10元杂芳基，所述C1-10烷基、C2-10烯基、C3-8环烷基、5-8元杂环基、C6-10芳基或5-10元杂芳基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代；
S1独立地选自甘露糖及其衍生物中的至少一种，所述衍生物包括但不限于甘露糖糖苷，半乳糖糖苷，葡萄糖糖苷，岩藻糖糖苷，N-乙酰葡糖胺糖苷，N-乙酰半乳糖胺糖苷，N-乙酰甘露糖胺糖苷和葡萄糖醛酸，以及寡聚糖苷；
G3对应点击化学反应生成的基团。
2.根据权利要求1所述的具有树突细胞靶向的脂质分子，其特征在于：
所述L1、L2和L3独立地选自单键或C1-10亚烷基，所述亚烷基任选地被一个或多个OH、NH2或卤素取代；
或，R1和R2独立地选自
或，S1选自下述任一基团：
或，所述点击化学选自下述至少一种：基于炔基叠氮的点击反应(i)，基于逆电子需求Diels-Alder点击反应(ii)，巯基-烯点击化学(iii),基于应变促进的烯烃-叠氮化物环化反应(iv)，基于Diels-Alder点击反应(v)，基于巯基-炔基点击反应(vi)，基于酯化反应(vii)或基于酰胺化反应(ix)；
(i)炔烃-叠加物的点击反应
(ii)逆电子需求Diels-Alder点击反应
(iii)巯基-烯的点击反应
(iv)应变促进的烯烃-叠氮化物环化反应
(v)Diels-Alder点击反应
(vi)巯基-炔点击反应
3.根据权利要求2所述的具有树突细胞靶向的脂质分子，其特征在于：
所述S1独立地选自下述至少一种：甘露糖单糖糖苷、甘露糖二糖糖苷、甘露糖三糖糖苷或甘露糖四糖糖苷；
或，所述点击化学选自下述至少一种：基于巯基-烯的点击化学(iii)，基于炔基叠氮的点击反应(i)或基于巯基-炔基的点击反应(vi)；优选地，基于巯基-烯的点击化学(iii)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的具有树突细胞靶向的脂质分子，其特征在于：
所述式(1)所示的具有树突细胞靶向的脂质分选自下述任一结构所示的化合物：
5.一种含有权利要求1-4中任一项所述的具有树突细胞靶向的脂质分子的脂质载体，其原料包括下述组分：式(1)所示的具有树突细胞靶向的脂质分子、聚乙二醇脂质分子、甾族脂质分子和辅助脂质分子。
6.根据权利要求5所述的具有树突细胞靶向的脂质分子的脂质载体，其特征在于：
所述聚乙二醇脂质分子选自下述至少一种：2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC-0159)、1,2-二肉豆醇-丙基-3-甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPC)、PEG-二甾醇基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘油酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)；优选的，所述聚乙二醇脂质分子选自：2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC-0159)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPC)；更优选的，所述聚乙二醇脂质分子选自：1,2-二肉豆醇-丙基-3-甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)；
或，所述甾族脂质分子选自下述至少一种：燕麦甾醇、β-谷甾醇、菜子甾醇、麦角骨化醇、菜油甾醇、胆甾烷醇、胆固醇、粪甾醇、脱氢胆固醇、链甾醇、二氢麦角骨化醇、二氢胆固醇、二氢麦角甾醇、黑海甾醇、表胆甾醇、麦角甾醇、岩藻甾醇、六氢光甾醇、羟基胆固醇、羊毛甾醇、光甾醇、海藻甾醇、谷甾烷醇、谷甾醇、豆甾烷醇、豆甾醇、胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸和石胆酸；优选的，所述甾族脂质分子选自下述至少一种：胆固醇、胆甾烷醇、麦角骨化醇、二氢胆固醇、海藻甾醇、牛磺胆酸和脱氧胆酸；更优选的，甾族脂质分子选自下述至少一种：胆固醇、胆甾烷醇、二氢胆固醇、海藻甾醇和脱氧胆酸；最优选的，甾族脂质分子选自胆固醇和二氢胆固醇中的至少一种；
或，所述辅助脂质分子选自下述至少一种：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)、油酰磷脂酰胆碱(POPC)和1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)；优选的，所述辅助脂质分子选自下述至少一种：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)；更优选的，所述辅助脂质分子选自1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)中的至少一种。
7.根据权利要求5或6所述的具有树突细胞靶向的脂质分子的脂质载体，其特征在于：所述脂质载体，其原料还包括：除式(1)外的其它可电离脂质分子。
8.根据权利要求7所述的具有树突细胞靶向的脂质分子的脂质载体，其特征在于：以摩尔百分含量计，所述脂质载体包含10％-70％的上述式(1)所示的脂质分子、0％-70％的除式(1)外的其它可电离脂质分子、1％-60％的聚乙二醇脂质分子、5％-60％的甾族脂质分子和1％-30％的辅助脂质分子。
9.根据权利要求8所述的具有树突细胞靶向的脂质分子的脂质载体，其特征在于：
所述式(1)所示的脂质分子的摩尔百分含量为15％-65％，优选的，所述式(1)所示的化合物的摩尔百分含量为30％-60％，更优选的，所述式(1)所示的化合物的摩尔百分含量为45％-55％；
或，除式(1)外的其它可电离脂质分子的摩尔百分含量为0％-60％，优选的，所述除式(1)外的其它可电离脂质分子的摩尔百分含量为0％-55％，更优选的，所述除式(1)外的其它可电离脂质分子的摩尔百分含量为4.5％-5.5％；
或，所述聚乙二醇脂质分子的摩尔百分含量为1％-30％，优选的，所述聚乙二醇脂质分子的摩尔百分含量为1％-10％，，更优选的，所述聚乙二醇脂质分子的摩尔百分含量为1％-5％；
或，所述甾族脂质分子的摩尔百分含量为10％-50％，优选的，所述甾族脂质分子的摩尔百分含量为25％-45％，更优选的，所述甾族脂质分子的摩尔百分含量为30％-40％；
或，所述辅助脂质分子的摩尔百分含量为1％-25％，优选的，所述辅助脂质分子的摩尔百分含量为5％-15％，更优选的，所述辅助脂质分子的摩尔百分含量为8％-12％。
10.一种包载核酸的脂质纳米颗粒，包括权利要求5-9中任一项所述的具有树突细胞靶向的脂质分子的脂质载体和核酸。
11.根据权利要求10所述的包载核酸的脂质纳米颗粒，其特征在于：所述核酸选自DNA、mRNA、rRNA、siRNA、tRNA、microRNA、反义核酸和环状RNA中的至少一种。
12.根据权利要求10或11所述的包载核酸的脂质纳米颗粒，其特征在于：所述包载核酸的脂质纳米颗粒中脂质载体与核酸的质量比为5:1-50:1；优选质量比为10:1-30:1；
或，所述包载核酸的脂质纳米颗粒的粒径为30～500nm；优选粒径为30～200nm，更优选粒径为90nm～100nm。
13.权利要求10-12中任一项所述的包载核酸的脂质纳米颗粒的制备方法，包括下述步骤：
(A1)将式(1)所示的具有树突细胞靶向的脂质分子、聚乙二醇脂质分子、甾族脂质分子和辅助脂质分子按上述记载的比例混合，用溶剂溶解，得到有机相脂质体溶液；
(A2)将核酸用适当pH值的缓冲溶液溶解，得到水相核酸溶液；
(A3)将所述有机相脂质体溶液与所述水相核酸溶液按照一定的质量比和体积比，用微流控设备均匀混合，制备出包载核酸的脂质纳米颗粒溶液。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于：
所述步骤(A1)中用于溶解脂质分子的溶剂为甲醇、乙醇、四氢呋喃、丙酮、二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺；
或，所述步骤(A2)中的所述缓冲溶液为醋酸/醋酸钠溶液或柠檬酸/柠檬酸钠溶液；
或，所述步骤(A2)中的所述缓冲溶液的pH为3-9；
或，所述步骤(A2)中的所述缓冲溶液的浓度为1mM-1M；
或，所述步骤(A3)中的所述有机相脂质体溶液与水相核酸溶液的体积比为1:1-1:10。
15.一种包载核酸的脂质纳米颗粒制剂，包括权利要求10-12中任一项所述的包载核酸的脂质纳米颗粒以及药学上可接受的载体。
16.权利要求1-4中任一项所述的具有树突细胞靶向的脂质分子或权利要求5-9中任一项所述的具有树突细胞靶向的脂质分子的脂质载体在制备用于递送核酸的药物中的应用。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于：所述核酸选自DNA、mRNA、rRNA、siRNA、tRNA、microRNA、反义核酸和环状RNA中的至少一种；
或，所述药物用于治疗和/或预防的疾病包括但不限于：炎性疾病、病毒感染以及癌症。
18.权利要求10-12中任一项所述的包载核酸的脂质纳米颗粒或权利要求15所述的包载核酸的脂质纳米颗粒制剂在制备疫苗中的应用。
19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于：所述疫苗选自下述至少一种：病毒疫苗、肿瘤疫苗、狂犬疫苗。
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